大腸菌シグナル配列を用いて抗体断片を分泌する発現ベクター及び抗体断片の大量生産方法
【課題】 本発明の目的は、大腸菌シグナル配列を用いて抗体断片を抗原−結合親和力を有する水溶性異型接合体形態で過剰発現させ得る組換え発現ベクター及び前記発現ベクターにより形質転換された微生物を提供することである。
【解決手段】 大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合された抗体断片を水溶性異型接合体タンパク質の形態に発現・分泌させ得る組換え発現ベクターは、前記発現ベクターにより形質転換された微生物を培養し、前記形質転換体から培地内に分泌された抗体断片を回収することによって抗体断片の大量生産に有効である。
【解決手段】 大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合された抗体断片を水溶性異型接合体タンパク質の形態に発現・分泌させ得る組換え発現ベクターは、前記発現ベクターにより形質転換された微生物を培養し、前記形質転換体から培地内に分泌された抗体断片を回収することによって抗体断片の大量生産に有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性異型接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）の形態で大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片を分泌的に発現する組換え発現ベクター；前記発現ベクターにより形質転換された微生物；及び前記形質転換された微生物を用いて抗体断片を大量生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、「抗体断片」は、抗体の抗原−結合領域またはその可変領域を含む、抗体の一部を意味するものである。抗体断片の例としては、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖ断片などがある。抗体をパパイン（ｐａｐａｉｎ）で切断すると、Ｆａｂ’断片と呼ばれる二つの同一の抗原−結合断片と残りのＦｃ断片とが生成する。抗体をペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）で処理すると、二つの抗原−結合部位を有し、抗原と依然として架橋結合を形成し得るＦ（ａｂ’）２断片が生成する。Ｆａｂ断片は、さらに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ断片と異なって、抗体ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域から一つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されている。
【０００３】
抗原結合能力の増加、抗原性の変化、または二重特異的抗体の製造などで抗体の固有性質を調制するために、遺伝子組換え方法を用いた抗体と抗体断片の生産が研究されている。その結果、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系を用いて抗体と抗体断片を生産する方法が開発された。大腸菌の発現系を用いた生産方法は既存の動物細胞を用いた方法に比べて次のようなメリットを提供する：１）発現ベクターの製作が容易であるため、発現可否を容易に検証することができる；２）大腸菌は、成長速度が速いため、低費用で抗体の大量生産が可能であるので、これは研究用試料確保の面で有利である；３）比較的に単純な発酵方法を適用することができ、他の宿主細胞を用いる場合よりも一層容易に商業化できる。
【０００４】
抗体−コード遺伝子を大腸菌内に導入して発現させた事例は多くの文献で報告されている(Cabilly et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA81: 3273-3277，1984，Boss et al．Nucleic Acids Res．12: 3791-3806，1984)。これらの文献は、抗体分子が多様な収率で細胞質内で発現され、また、大腸菌が免疫グロブリンの軽鎖を分泌的に発現させること (Zemel-Dreasen et al., Gene 315-322, 1984)、または抗体断片遺伝子をアルカリ・ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）あるいはベータラクタマーゼ（β−ｌａｃｔａｍａｓｅ）シグナル配列に融合された抗体断片をペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）に分泌させるための宿主細胞として使用可能であることを開示している(Pluckthun et al., Cold Spring Harbor Symposiua on Quantitative Biology Volume LII、105-112、1987)。国際出願公開第ＷＯ９２／０１０５９号は、癌細胞の特定部位を認識する抗体であるＦａｂ’−コード遺伝子を、大腸菌外膜タンパク質Ａ(ＯｍｐＡ)シグナル配列に融合された融合タンパク質の形態で発現されることを教示しており；米国特許第５，６４８，２３７号は、大腸菌のエンテロトキシンシグナル配列に融合されたＦａｂ’−コード遺伝子がＰｈｏＡプロモーターの調節下で発現されることを開示している。
【０００５】
発現された抗体断片は野生型抗体と類似した抗原−結合能を示すが、それは野生型抗体よりも小さいため、局所浸透力が高く(Blumenthal et al., Ad. DrugDel. Rev.4: 279, 1990)、またＦｃ領域を含んでいないため、人体に何等の副作用も引き起こさない。よって、抗体断片は診断試薬の製造や、治療用抗体の開発に利用可能であり、大腸菌からの大量生産は経済的な面で非常に有利である。野生型抗体から抗体断片を製造する場合、野生型抗体はタンパク質分解酵素で切断して精製しなければならないが、これは煩わしくて経済的にも不利である。
【０００６】
しかしながら、抗体断片を大腸菌で生産する場合には様々な問題点がある。まず、すべての抗体断片が意図した治療あるいは診断的目的を満たす程度の量で発現されず、場合によっては培養過程を何度も繰り返しなければならない。また、抗体断片に機能的活性を付与するためには、重鎖と軽鎖が単一細胞内で共に発現され、これらの間に形成されたジスルフィド結合によって異型接合体の形態を維持しなければならないが、この際抗体断片は、タンパク質が大腸菌で過剰発現される場合に頻繁に見られる封入体の形態ではなく、高水溶性の形態で発現されることが求められる。このような問題点を解決するため、シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いて発現された抗体断片をペリプラズム空間に分泌させる方法に関する研究が活発に行われてきた。しかし、シグナル配列に融合されたすべての抗体断片が大腸菌のペリプラズム空間に分泌的に過剰発現されるのではなく、発現させようとする抗体の遺伝子配列によって発現された抗体の量において大きく異なる(Kelly et，al．Biochemistry 31: 5434-5441，1992; Humphreys et，al．Protein Expression and Purification 26: 309-320，2002)。発現ベクター内の構造遺伝子の相違または重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子との距離などによって抗体断片の発現パターンが変動することが報告されている（国際特許公開第ＷＯ０１／９４５８５号）。このような事実から、標的抗体断片の発現のためには、標的抗体遺伝子と発現に必要な宿主の構造遺伝子との相互作用、及びシグナル配列を用いる場合における標的抗体遺伝子とシグナル配列との相互作用における適切なバランスが要求される。
【０００７】
ここに、本発明者らは、大腸菌で抗体断片を抗原結合を有する水溶性異型接合体の形態で過剰発現させるために鋭意研究に努めた結果、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列を用いて、目的抗体断片である腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）のヒト抗体Ｆａｂ’を分泌的に発現する組換え発現ベクターを製造することによって、目的とする抗原−結合親和力を有する水溶性異型接合体の形態で抗体断片を大腸菌内で発現する方法を開発することで本発明に至った。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、大腸菌シグナル配列を用いて抗体断片を抗原−結合親和力を有する水溶性異型接合体形態で過剰発現させ得る組換え発現ベクター及び前記発現ベクターにより形質転換された微生物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記形質転換された微生物を用いて抗体断片を大量に生産する方法を提供することである。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子と、第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子とを含む組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターから発現された抗体断片が培養培地内に分泌されることを特徴とする組換え発現ベクターを提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記組換え発現ベクターを製造する段階；前記発現ベクターで微生物を形質転換させる段階；前記微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物から培地内に分泌された抗体断片を回収する段階を含む、抗体断片の生産方法を提供する。
本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な説明によって明白になる。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
本発明は、第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子及び第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子を含み、発現ベクターから発現された抗体断片を培養培地内に分泌することを特徴とする組換え発現ベクター；及び前記発現ベクターにより形質転換された微生物を提供する。
【００１２】
野生型抗体と機能的に類似した抗体断片を分泌的に発現できる前記発現ベクターは、抗体断片の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子をそれぞれ大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合させて製造される。
【００１３】
本発明で抗体断片は、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２またはｓｃＦｖであり、好ましくはＦａｂ’である。Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域から一つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されている点がＦａｂ断片と異なる。また、Ｆ（ａｂ’）２断片は二つのＦａｂ’分子がジスルフィド結合によって連結されて製造され、ｓｃＦｖ断片は軽鎖と重鎖の可変領域だけがペプチドリンカー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）によって連結されて単一ポリペプチド鎖の形態で存在する。
【００１４】
本発明に使用可能な抗体断片は、抗原に選択的に結合できるすべての抗体を含み、この場合、抗原はＴ−細胞、内皮細胞あるいは癌細胞マーカーのような細胞表面に結合している抗原であるか、あるいは、細胞と結合していない水溶性抗原である。細胞表面に結合されている抗原としては、β１インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）、Ｐ−セレクチン（Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、Ｅ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＭＨＣクラスＩ、ＩＩ、ＶＥＧＦ、及びその他の受容体が含まれるが、これらに限定されない。水溶性抗原としては、ＩＬ−１、２、３、４、５、６、８及びＩＬ−１２のようなインターロイキン類；サイトメガロウイルス抗原のようなウイルス抗原；ＩｇＥのような免疫グロブリン；ＩＮＦ−α、β及びγのようなインターフェロン；及び腫瘍壊死因子−α及びβ、血小板由来成長因子−α及びβのような細胞の成長及び分化に影響を及ぼす因子が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施例で、本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の抗体断片の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を用いる。ＴＮＦ−αは、単球細胞や大食細胞(ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ)のような免疫関連細胞によって生成されて過剰発現時に炎症を引き起こすサイトカイン類として知られているＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８の生成を誘導し、軟骨組織を破壊するタンパク質分解酵素の分泌を促進して関節炎を起こす主な媒介体として知られている。関節炎治療剤としての抗−腫瘍壊死因子−アルファ抗体のＦａｂ’は、単クローン抗体から得られ、好ましくは、ヒト化抗体、より好ましくは、完全なヒト抗体から得られる。
【００１５】
抗−腫瘍壊死因子−アルファのいくつかのキメラ抗体あるいはヒト化抗体の相補性決定領域(complementarity determining regions，CDRs)をコードする遺伝子は既に報告されており、完全なヒト抗体の塩基配列も決まっている（国際特許第ＷＯ９７／２９１３号）。このような情報を参考に、ヌクレオチド合成器を用いて抗体断片をコードする遺伝子を人工的に合成し、一連のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）とリゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）の過程、またはリゲーション連鎖反応（LCR，ligation-chain reaction)とポリメラーゼ連鎖反応（PCR，polymerase chain reaction)を通じて、Ｆａｂの重鎖と軽鎖をコードする上で合成した遺伝子をクローニングできる。
【００１６】
好ましい実施例で、本発明は配列番号：１〜６に示される塩基配列を有するヒト抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖の可変領域をコードする遺伝子断片と、配列番号：７〜１２に示される塩基配列を有する重鎖の可変領域をコードする遺伝子断片とをヌクレオチド合成器で合成した後、これらの断片をＰＣＲによって連結させて軽鎖及び重鎖の可変領域を製造する。また、軽鎖の定常領域と、ＩｇＧ１のＣＨ１及びヒンジ領域を含む重鎖の定常領域とを含む遺伝子断片は、人の血液から抽出したＲＮＡ全体を鋳型とし、ヒト抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖および重鎖の定常領域に対して特異的なプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲによって製造される。このように製造された軽鎖及び重鎖の定常領域をコードする遺伝子断片のそれぞれを適当な発現ベクターにクローニングして、軽鎖の定常領域をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＢＬＣ及び重鎖の定常領域をコードする遺伝子を含むｐＢＨＣを製造する（図１及び２参照）。塩基配列分析の結果、前記プラスミドｐＢＬＣに挿入された重鎖の定常領域をコードする遺伝子は、配列番号：３２に示す塩基配列を有し、プラスミドｐＢＨＣに挿入された重鎖の定常領域をコードする遺伝子は、配列番号：３３に示す塩基配列を有することが確認された。
【００１７】
発現させようとする抗体断片は、重鎖と軽鎖で構成された二つの異なる種類のタンパク質間の異型接合体として存在する。よって、抗原−結合親和力を有する活性型の異型接合体としての抗体断片を得るためには、重鎖と軽鎖が同等の水準で発現されなければならず、発現ベクターから発現された重鎖と軽鎖との間の正確な位置でジスルフィド結合が形成されなければならない。また、抗体断片が大腸菌内で発現される時、細胞質内に発現されたタンパク質は封入体の形態で存在し得る。この場合、重鎖と軽鎖のジスルフィド結合が正確な位置で生成されないこともあり、水溶性状態で発現されても、精製段階で細胞を完全に破壊できないという問題が起こり得る。このような問題点を解決するために、本発明は、大腸菌シグナル配列を用いて、ベクターから発現された抗体断片を大腸菌のペリプラズム空間あるいは培養培地に分泌させる組換え発現ベクターを提供する。
【００１８】
発現されたタンパク質が培養培地内に存在すると、発現されたタンパク質が細菌細胞内に存在する際に要求される細胞を破壊しなければならないという煩わしい過程を行わなくても良い。また、発現されたタンパク質がペリプラズム空間に存在するため、回収した細胞の浸透圧衝撃のような過程を省略できる。
【００１９】
さらに、酸化環境は異型接合体を形成するようにするジスルフィド結合を容易にするため、発現されたタンパク質が細胞の細胞質内の非−酸化環境に存在するよりもペリプラズム空間あるいは培養培地内に存在するのが有利である。
【００２０】
本発明の組換え発現ベクターに使用可能な大腸菌シグナル配列は、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列、ベータラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列またはこれらの変異体などであり、好ましくは大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体またはＯｍｐＡシグナル配列であるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の好ましい実施例で、発現ベクターから発現された活性型の抗体断片Ｆａｂ’を培養培地内に分泌させるために用いられた大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体は、大腸菌で様々な異種タンパク質を分泌・発現させるために本発明者らが開発したものである。前記大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体は、配列番号：１７に示される塩基配列を有し、最適効率で大腸菌内で様々な異種タンパク質を発現・分泌できることが報告されている（韓国特許第３１６３４７号）。本発明で、発現ベクターから発現された活性型の抗体断片Ｆａｂ’を培養培地内に分泌させ得る組換え発現ベクターは、抗体断片の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれ大腸菌シグナル配列、例えば、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合させることによって製造される。
【００２２】
抗体断片の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を一つの発現ベクター内で発現させるために、本発明は、一つのプロモーターの下に二つのタンパク質を適切な間隔をおいて配置して同時に発現させるダイ−シストロニック体系（ｄｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）を用いる発現ベクターと、独立された各プロモーターに遺伝子を連結して二つのタンパク質を独立的に発現できる二重−プロモーター体系（ｄｕａｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いる発現ベクターとの二つの種類の発現ベクターを提供する。
【００２３】
まず、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする遺伝子断片を、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列及びｈＧＨを含む発現ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑ（韓国特許第３１６３４７号）から除去する。プラスミドｐＢＬＣから得た軽鎖をコードする遺伝子断片と、プラスミドｐＢＨＣから得た重鎖をコードする遺伝子断片とを、前記発現ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑに挿入し、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＨＣ、及び耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＬＣを製作する。重鎖と軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子の発現を調節するダイ−シストロニック発現ベクターを製作するために、プラスミドｐｍｓＨＣからＰＣＲによって得た重鎖をコードする遺伝子断片をプラスミドｐｍｓＬＣに挿入して発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿Ｂ及びｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐを製造する（図３及び４参照）。
【００２４】
また、本発明は前記のような方法によって、軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌ＯｍｐＡシグナル配列（配列番号：２４）に融合され、単一Ｔａｃプロモーターが軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節する発現ベクターｐｏＤＬＨＦを製作する（図５参照）。
【００２５】
前記で製作された発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿Ｂ、ｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐ及びｐｏＤＬＨＦはシグナル配列に融合された抗−腫瘍壊死因子−アルファの重鎖及び軽鎖のそれぞれが単一プロモーターの調節下で発現・分泌されるダイ−シストロニック発現ベクターである。前記発現ベクターのそれぞれを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて製造した大腸菌形質転換体BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)及びBL21/poDLHF(HM10922)はそれぞれ、特許手続きの目的のための微生物寄託の国際的認識に関するブダペスト条約に従って、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５０９、ＫＣＣＭ−１０５１０及びＫＣＣＭ−１０５１１として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付で寄託された。
【００２６】
上述したように、単一プロモーターの調節下で異なる二つのタンパク質を分泌的に発現させる場合、プロモーターに近いタンパク質の発現効率はプロモーターに遠いタンパク質の発現効率と異なり得る(Humphreys et, al. Protein Expression and Purification 26: 309-320, 2002)。本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖と軽鎖の発現及び分泌が独立したプロモーターによって個別的に調節可能な二重−プロモーターシステムを用いる発現ベクターを提供する。好ましい実施例で、本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれＯｍｐＡシグナル配列に融合して、Ｔａｃプロモーターが軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現及び分泌を調節する発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓを製作する（図６参照）。前記発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓにより大腸菌ＢＬ２１を形質転換させて製造した大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓ（ＨＭ１０９２３）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１２として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付に寄託された。
【００２７】
抗体断片のような異型接合体の形成は前記異型接合体の二つの断片の一方が過剰発現された時に抑制されるので、二つのタンパク質の断片は互いに同様の水準で発現されなければならない。ここに、本発明では、重鎖と軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれ互いに異なるシグナル配列に融合させて抗体断片を分泌的に発現させ得る組換え発現ベクターを提供する。
【００２８】
好ましい実施例で、本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、その重鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合され、単一Ｔ７プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節する発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓを製作する（図７参照）。また、本発明で、発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋは、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、その軽鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合され、単一Ｔａｃプロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節するように製作される（図８参照）。前記発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓ及びｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１に形質転換させて製造した大腸菌形質転換体BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)及びBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)のそれぞれは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１３及びＫＣＣＭ−１０５１６として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付で寄託された。
【００２９】
本発明は、前記のように製作された組換え発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して製造された組換え微生物を提供する。本発明で使用可能な宿主細胞としては、大腸菌W3110、RV308、BL21、BL21(DE3)などを含み、好ましくは大腸菌ＢＬ２１であるが、これらに限定されない。前記発現ベクターにより形質転換された組換え微生物を発酵槽を用いて高濃度で培養（ＯＤ６００＝１２０〜１５０）する場合、抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片は培養培地１Ｌ当たり１００〜５００ｍｇ以上の高収率で培養培地内に分泌的に生産されることが確認された（表１参照）。このように大量生産された抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片はタンパク質−Ｇアフィニティーカラムによって部分的に精製できる。精製された抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片を還元条件下及び非−還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、抗体断片が水溶性異型接合体形態で形成されたことを確認した（図９参照）。また、結合抗原として抗−腫瘍壊死因子−アルファを用いたＥＬＩＳＡは、抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片が腫瘍壊死因子−アルファ抗原に対して優れた結合親和力を有することを示した（図１０参照）。
【００３０】
本発明は、第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子及び第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階；前記発現ベクターで微生物を形質転換させる段階；前記微生物を培地で培養する段階；及び 前記微生物から培地内に分泌された抗体断片を回収する段階を含む、抗体断片の生産方法を提供する。
【００３１】
本発明の組換え発現ベクターで使用可能な大腸菌シグナル配列としては、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列、ベータラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列またはこれらの変異体を含み、好ましくは配列番号：１７に示される塩基配列を有する大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または配列番号：２３に示される塩基配列を有する大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列を用いるが、これらに限定されない。
【００３２】
前記組換え発現ベクターにより形質転換された微生物を適当な培地で予備培養した後、この予備培養液を発酵槽に接種して３０〜３５℃範囲の温度で空気と接触させながら本−培養を実施する。６００ｎｍでＯＤ値が８０に達すると、誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）を発酵槽に添加して標的抗体断片の発現を誘導する。本発明で使用可能な誘導物質としては、ＩＰＴＧが好ましいが、これに限定されない。６００ｎｍでＯＤ値が１２０〜１４０に逹するまで、４０〜４５時間更に培養する。前記培養液を遠心分離して上澄液を分離した後、これをアフィニティーカラムクロマトグラフィーで抗体断片を精製する。前記形質転換された微生物は、大腸菌BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)(KCCM-10509)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)(KCCM-10510)、BL21/poDLHF(HM10922)(KCCM-10511)、BL21/poDLHF_B/S(HM10923)(KCCM-10512)、BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)(KCCM-10513)、好ましくはBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)(KCCM-10516)であるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明によって発現された抗体断片は宿主細胞のペリプラズム空間または培養培地内に分泌されるため、抗体断片は浸透圧ショック処理のような工程を経なとも回収できる。
【００３４】
本発明の方法によって発現され得る目標抗体断片は、好ましくはＦａｂ’、Ｆａｂ’Ｆ(ａｂ’)２またはｓｃＦｖなどであるが、抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片に限定されるものではなく、よって、診断または治療を目的とする任意のすべての抗体、例えば、抗癌効果がある抗体断片または過剰−発現された場合、人体に致命的なダメージを与える様々なサイトカインに対する抗体断片の生産に適用できる。
【００３５】
前述したように、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列を含む本発明の組換え発現ベクターは、抗体断片を抗原−結合親和力を有する水溶性異型接合体の形態で発現させ得る。前記発現ベクターにより形質転換された微生物は抗体断片を宿主細胞のペリプラズム空間または培養培地に分泌させることが可能であるため、発現された抗体断片は大量生産に適する方法で容易に回収できる。従って、本発明による方法は診断試薬または治療用抗体の製造に有効に利用可能である。
【００３６】
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００３７】
実施例１：抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’をコードする遺伝子のクローニング
国際特許第ＷＯ９７／２９１３１号に記載された塩基配列を参考にして、ヒト抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖と軽鎖の可変領域をヌクレオチド合成器を用いて合成した。軽鎖の可変領域をクローニングするための遺伝子断片は配列番号：１〜６の塩基配列を有し、重鎖の可変領域をクローニングするための遺伝子断片は配列番号：７〜１２の塩基配列を有した。この後のクローニング過程を容易にするために、前記重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれの一番目である遺伝子断片（即ち、配列番号：１及び７）にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｕｖＩ制限酵素認識部位を挿入した。前記合成した重鎖及び軽鎖の遺伝子断片のそれぞれを一つのチューブに混ぜた後、これらを一つの遺伝子配列で連結させるために通常的なＰＣＲを行って、軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする遺伝子を製造した。前記ＰＣＲ反応で、遺伝子断片のそれぞれは鋳型のみならずプライマーとして作用可能であり、従って、これらは互いにアニーリングされ、約３２０ｍｅｒ程度の断片を形成した。前記ＰＣＲ反応混合物は、それぞれの遺伝子断片１００ｐｍｏｌｅ、５ｕｌの２ｍＭｄＮＴＰ混合液、２．５単位のｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）及び５ｕｌのｐｆｕ反応緩衝溶液(100mM Tris-HCl(pH8.3), 15mM MgCl2, 500mM KCl)を含み、蒸留水を加えて最終体積が５０ｕｌになるようにした。前記ＰＣＲはＤＮＡサーマルサイクラー(DNA thermocycler, Perkin-Elmer社)を用いて９４℃で５分間初期変性させた後、９４℃で６０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で６０秒の反応を３０回行った。
【００３８】
ヒト項−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖の定常領域とＩｇＧ１のＣＨ１とヒンジ領域とを含んだ重鎖の定常領域をクローニングするため，ヒト血液の血球細胞からＲＮＡを抽出した後、次のようにＲＴ−ＰＣＲを行った。すべてのＲＮＡは、ＱｉａｍｐＲＮＡ血液キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて約６ｍｌの血液から抽出されて、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いられた。前記重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれは、重鎖増幅のための配列番号：１３及び１４に示されるプライマー対と、軽鎖増幅のための配列番号：１５及び１６に示されるプライマー対を用いたＯｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて増幅された。この際、この後のクローニング過程を容易にするために、配列番号：２６の重鎖５’−プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｔｕＩ制限酵素認識部位を挿入し、配列番号：２７の重鎖３’−プライマーには終止コドンを含むＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入し；配列番号：２８の軽鎖５’−プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｒｕＩ制限酵素認識部位を挿入し、配列番号：２９の軽鎖３’−プライマーには終止コドンを含むＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入した。これから増幅された重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＰＣＲ産物をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断した後、同一制限酵素で処理されたプラスミドpBluscriptSK(-)(Stratagen社)に挿入してプラスミドｐＢＨ及びｐＢＬを製造した（図１）。ＤＮＡ塩基配列の分析によって、プラスミドｐＢＨ及びｐＢＬにそれぞれの重鎖及び軽鎖の定常領域が正確に挿入されたことが確認された。
【００３９】
前記重鎖及び軽鎖の可変領域をこれらに相応する定常領域に連結するため、前記でＰＣＲによって合成された重鎖及び軽鎖の可変領域それぞれをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断した。酵素処理された重鎖の可変領域は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｔｕＩで予め処理されたプラスミドｐＢＨに挿入され、酵素処理された軽鎖の可変領域は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｒｕＩで予め処理されたプラスミドｐＢＬに挿入されて、重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれがこれらに相応する定常領域に連結されたプラスミドｐＢＨＣ及びｐＢＬＣを製作した（図２）。前記プラスミドｐＢＨＣ及びｐＢＬＣにそれぞれ挿入された重鎖と軽鎖はそれぞれ配列番号：３２及び３３に示された塩基配列を有する。
【００４０】
実施例２：抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’遺伝子発現ベクターの製作
＜２−１＞ 大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体及び抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’遺伝子を含む発現ベクターの製作
大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体を用いた発現ベクターを製作するため、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現する発現ベクターpT14S1SH-4T20V22Q（韓国特許第３１６３４７号）を用いた。前記発現ベクターは配列番号：１７に示される塩基配列を有する耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体を含む。この発現ベクターからｈＧＨを除去し前記実施例１で製造された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子断片を挿入するために、配列番号：１８及び１９のプライマー対を用いた部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutagenesis)によってプラスミドpT14S1SH-4T20V22Qの耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体とｈＧＨ遺伝子の融合部位にＳｔｕＩ制限酵素認識部位を挿入した。塩基配列分析法によってＳｔｕＩ制限酵素認識部位が成功的に標的位置に生成されたことが確認した。前記プラスミドpT14S1SH-4T20V22Q内のＳｔｕＩ制限酵素認識部位を有するプラスミドをｐｍＳＴＩＩと命名した。
【００４１】
前記プラスミドｐｍＳＴＩＩをＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行って、ｈＧＨ部位が除去され大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体を含む大きい断片（４.７ｋｂ）をゲルから回収した。前記実施例１で製造された軽鎖をコードする遺伝子断片を有するプラスミドｐＢＬＣをＰｕｖＩ制限酵素で処理した後、これらの両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。これから得たプラスミドをＢａｍＨＩ制限酵素で処理して約７２０ｂｐの軽鎖をコードする遺伝子断片を回収した。また、重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐＢＨＣを鋳型として配列番号：１及び２０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。これから増幅されたＰＣＲ産物を、前記軽鎖をコードする遺伝子断片の製造に用いられた同一酵素で処理して約７００ｂｐの重鎖をコードする遺伝子断片を回収した。配列番号：２０のプライマー対は重鎖ヒンジ領域の一部を含む変形されたヒンジ配列であるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＡＡ−終止コドンが重鎖をコードする遺伝子断片に挿入されてＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含むように考案されているため、この後の過程でＦａｂ’発現ベクターの製作に有用に利用できる。このように用意された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子断片のそれぞれをプラスミドｐｍＳＴＩＩ断片に挿入し、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＬＣのみならず、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＨＣを製作した（図３）。
【００４２】
重鎖と軽鎖が一つのプロモーターによって調節されて発現・分泌されるダイ−シストロニック(ｄｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ)発現ベクターを製作するために、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｍｓＨＣを鋳型とし、配列番号：２１及び２０のプライマー対と配列番号：２２及び２３のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。配列番号：２１の５’−プライマーは重鎖をコードする遺伝子断片の発現に必要であるシャインダルガノ(Shine-Dalgarno，SD)配列からＰＣＲ反応が開始するように考案されており、増幅された産物を容易にクローニングするためにＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含んでいる。また、配列番号：２２及び２３のプライマー対は、クローニング部位を異ならせるために、ＢａｍＨＩではなくＢｐｕＩ制限酵素認識部位を含むことを除けば、配列番号：２１及び２０のプライマー対と同一の塩基配列を有している。各プライマー対を用いて増幅された重鎖をコードする遺伝子断片（一方はＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含み、他方はＢｐｕＩ制限酵素認識部位を含む）をＢａｍＨＩとＢｐｕＩ制限酵素でそれぞれ処理した。
【００４３】
耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｍｓＬＣでＢａｍＨＩとＢｐｕＩ制限酵素認識部位はすべて軽鎖遺伝子の終止コドンの下流に位置し、ＢｐｕＩの制限酵素認識部位はＢａｍＨＩより約６０ヌクレオチド以上下流に存在するようにした。前記プラスミドｐｍｓＬＣをＢａｍＨＩとＢｐｕＩ制限酵素で処理した後、その部位にＢａｍＨＩまたはＢｐｕＩ制限酵素で処理された重鎖をコードする遺伝子断片を挿入した。プラスミドｐｍｓＬＣのＢａｍＨＩ制限酵素部位内に挿入された重鎖遺伝子を含むＦａｂ’発現ベクターをｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐと命名した（図４）。これらの発現ベクターの場合、重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子はそれぞれ、大腸菌エンテロトキシンシグナル配列に融合され、単一Ｔ７プロモーターがこれらの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子の発現を調節する。前記発現ベクターそれぞれを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21(DE3)/ psDLHF_B (HM10920) 及び BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)を製造し、これらを特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５０９及びＫＣＣＭ−１０５１０として韓国微細物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付で寄託した。
【００４４】
＜２−２＞ 大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列及び抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を含む発現ベクター製作
大腸菌ＯｍｐＡシグナル配列（配列番号：２４）を用いて抗−腫瘍壊死因子−アルファの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を分泌的に発現する発現ベクターを次のように製作した。
【００４５】
まず、ＴａｃプロモーターとＯｍｐＡシグナル配列とを含むプラスミドｐＦｌａｇ.ＣＴＳ(Eastman Chemical Company)をＨｉｎｄＩＩＩで処理し、前記プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位をクレノウ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Klenow DNA polymerase, NEB, New Egland Biolab USA）で処理して平滑末端にした後、ＢｇｌＩＩ制限酵素で切断して５’−末端は平滑末端を、３’−末端は付着端を有するベクター断片を製作した。また、ＯｍｐＡシグナル配列と、重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子断片とを連結するため、重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐＢＨＣを鋳型とし、配列番号：２５及び２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行って重鎖の可変領域と定常領域、そして変形されたヒンジ配列と終止コドンを含むＰＣＲ産物を増幅した。この際、３’−末端に相応する配列番号：２６のプライマー対はＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を挿入するように考案された。このように増幅された重鎖をコードする遺伝子断片を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断した後、この断片を前記でＢｇｌＩＩによって予め切断されたプラスミドｐＦｌａｇ．ＣＴＳに挿入してＯｍｐＡシグナル配列に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｏＨＣを製作した。前記記載の同一方法に従って、軽鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐＢＬＣを鋳型とし、配列番号：２７及び２８のプライマー対を用いたＰＣＲを行った後、このように増幅されたＰＣＲ産物を同一制限酵素処理過程を経ってプラスミドｐＦｌａｇ．ＣＴＳに挿入してＯｍｐＡシグナル配列に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｏＬＣを製作した。
【００４６】
それぞれＯｍｐＡシグナル配列に融合された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子が単一Ｔａｃプロモーターによって調節されて、発現分泌されるようにダイ−シストロニック発現ベクターを製造するため、鋳型としてプラスミドｐｏＨＣを用い、配列番号：２９及び３０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。これから増幅されたＰＣＲ産物は、両末端にＳａｌＩ制限酵素認識部位を有し、プロモーター領域を除いた重鎖の発現に必要であるシャインダルガノ配列とＯｍｐＡシグナル配列とを含む。このＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩで切断してから回収した遺伝子断片を同一制限酵素で予め処理されたプラスミドｐｏＬＣに挿入してＦａｂ’遺伝子を発現する発現ベクターｐｏＤＬＨＦを製作した（図５）。前記発現ベクターｐｏＤＬＨＦで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ（ＨＭ１０９２２）を製造し、これを韓国微細物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１１として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００４７】
＜２−３＞ 二重プロモーター（ｄｕａｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によって調節される発現ベクターの製作
抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖と軽鎖をそれぞれ独立したプロモーターによって個別的に発現・分泌させ得る二重−プロモーターシステムを有する発現ベクターを次のように製作した。ＯｍｐＡシグナル配列に融合された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の 重鎖をコードする遺伝子断片を含む実施例＜２−２＞のプラスミドｐｏＨＣをＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した。前記酵素−処理されたプラスミドのアガロースゲル電気泳動を行い、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖をコードする遺伝子断片、Ｔａｃプロモーター及びＯｍｐＡシグナル配列を含む、より小さな断片（１.２ｋｂ）をゲルから回収した。前記断片の両末端をクレノウ ＤＮＡ ポリメラーゼで処理して平滑末端にした。また、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖をコードする遺伝子断片を含む実施例＜２−２＞のプラスミドｐｏＬＣをＳａｌＩで処理した後、両末端を前記と同一の方法によって平滑末端に作った。それから、重鎖をコードする遺伝子断片をここに挿入してＯｍｐＡシグナル配列に融合された軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが独立的にＴａｃプロモーターの調節によって発現分泌される発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓを製作した（図６）。前記発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/poDLHF_B/S(HM10923)を製造し、これを韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１２として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００４８】
＜２−４＞ 各鎖の発現及び分泌が互いに異なるシグナル配列によって調節される発現ベクターの製作
＜２−４−１＞
抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’α軽鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、重鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合されて、これらの発現及び分泌が単一プロモーターによって調節される発現ベクターを次のように製作した。
【００４９】
単一Ｔａｃプロモーターの調節によってＯｍｐＡシグナル配列に融合された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子がそれぞれ発現される実施例＜２−２＞の発現ベクターｐｏＤＬＨＦをＮｄｅＩとＳａｃＩで処理した後、このベクターのアガロースゲル電気泳動を行って、比較的に大きな遺伝子断片（６.６ｋｂ）をゲルから回収した。ＮｄｅＩの認識部位はＯｍｐＡシグナル配列の一番目のアミノ酸であるメチオニンに位置し、ＳａｃＩの認識部位は軽鎖の定常領域に位置した。従って、前記発現ベクターをＮｄｅＩ及びＳａｃＩで処理すると、ＯｍｐＡシグナル配列は含まないが、軽鎖の可変領域の全部と軽鎖の定常領域の一部を含む遺伝子断片が回収できる。
【００５０】
重鎖をコードする遺伝子断片が耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合されたプラスミドであるｐｍｓＬＣを鋳型とし、配列番号：３１及び２０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。配列番号：３１の５’−プライマーはＮｄｅＩ認識部位を含み、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列の一番目のアミノ酸に結合して、配列番号：２０の３’−プライマーはＳａｃＩ認識部位を含む。これから増幅されたＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＳａｃＩで処理した後、欠失した軽鎖領域を有するプラスミドｐｏＤＬＨＦに挿入して発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓを製作した（図７）。前記発現ベクター ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓを大腸菌ＢＬ２１に形質組転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓ（ＨＭ１０９２４）を製造し、これを韓国微細物保存センターに寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１３として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００５１】
＜２−４−２＞
前記実施例＜２−４−１＞で製造された発現ベクターとは異なって、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、軽鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合されて、単一プロモーターによってこれらの発現及び分泌が調節される発現ベクターを次のように製作した。
【００５２】
実施例＜２−１＞の発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿ＢｐをＳａｃＩとＫｐｎＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って小さな遺伝子断片（０．６ｋｂ）をゲルから回収した。ＳａｃＩの認識部位は軽鎖の定常領域に存在し、ＫｐｎＩの認識部位は重鎖の定常領域に存在するため、回収された断片は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖遺伝子断片を含んでいた。重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれがＯｍｐＡシグナル配列に融合され、単一Ｔａｃプロモーターによって発現されるように製作された発現ベクターｐｏＤＬＨＦを同一制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。次いで、サイズが大きい遺伝子断片（７．４ｋｂ）をゲルから回収し、これを上で回収した軽鎖をコードする遺伝子断片に連結して発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋを製作した（図８）。前記発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋを大腸菌ＢＬ２１に形質組転換させて大腸菌形質転換体BL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)を製造し、これを韓国微生物保存センターに寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１６として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００５３】
実施例３：抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’遺伝子の発現
前記実施例２で製造された大腸菌形質転換体ＨＭ１０９２０〜ＨＭ１０９２５をそれぞれ５Ｌ体積の発酵槽（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ）に接種して発酵させた後、大腸菌形質転換による抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の発現有無を次のように調査した。
【００５４】
ＬＢ培地１００ｍｌに前記形質転換体それぞれを一晩中振盪予備培養してから、発酵槽に接種して培養を進めた。発酵槽の温度は３５℃あるいは３０℃に維持し、嫌気状態で進むのを防止するために空気を２０ｖｖｍで投入し、培地を５００ｒｐｍで撹拌した。微生物の成長のために補助エネルギー源としてグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）と酵母エキス（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）を微生物の発酵状態によって供給した。６００ｎｍでＯＤ値が８０に達した時、誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）であるＩＰＴＧを発酵槽に添加した。６００ｎｍでＯＤ値が１２０〜１４０に達するまで、前記発酵を４０〜４５時間行った。
【００５５】
前記醗酵培養液を遠心分離（２０，０００ｇ、３０分）して上澄液のみを取って、それぞれの形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の量を測定するために前記上澄液をＥＬＩＳＡで分析した。ヒト抗体ＣＨ１に対する単クローン抗体(MAB1304,Chemicon international)を１０ｍＭカーボネイト緩衝溶液（ｐＨ ９．６）に１ｕｇ／ｍｌの濃度で溶解させた後、９６−ウェルプレートをウェル当たり２００ｎｇの量で前記抗体溶液で４℃で一晩中コーティングした後、 ＰＢＳ−Ｔ溶液(137mM NaCl, 2mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 0.05% トゥイーン20)で３回洗浄した。ウシ血清アルブミンを１％の濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液に溶解させたブロッキング溶液を用意した。前記ブロッキング溶液２５０ｕｌを各ウェルに点滴した後、前記ウェルプレートを常温で１時間放置しておいて、同一のＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。標準液と試料液を、適当な濃度にＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈した後、抗体がコーティングされたウェルに添加した。前記ウェルプレートを常温で１時間放置させて反応させてから、再度ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。標準液は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩＢ−グロブリンＡ、緑十字 ＰＢＭ）をタンパク質分解酵素であるパパインで切断し、一連のカラムを用いてＦａｂを精製し、前記ＦａｂをＰＢＳ−Ｔ溶液に１ｎｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、二倍ずつ希釈して製造した。ヒト軽鎖の定常領域に対する多クローン抗体にパラクサイドが共有結合された、コンジュゲート試料（Ａ７１６４、Ｓｉｇｍａ社）は、ブロッキング溶液で１０００：１に希釈して用いた。希釈された２００ｕｌの試料を各ウェルに点滴した後、前記ウェルプレートを１時間常温で反応させた。反応が完了した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。発色溶液ＡとＢ（カラー−Ａ−安定化パラクサイド溶液及びカラーＢ−安定化クロモゲン溶液、ＤＹ ９９９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を同量で混合した後、各ウェルに前記発色溶液混合物を２００ｕｌずつ添加して前記ウェルプレートを３０分間放置した。次いで、２Ｍ硫酸を各ウェルに５０ｕｌずつ添加して反応を停止させた。４５０ｎｍの標準液と試料液の吸光度を測定するために、前記ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）で分析した。その結果を下記表１に示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
実施例４；タンパク質発現の確認
＜４−１＞ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
前記実施例３で製造された大腸菌形質転換体それぞれから発現された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を検出するために，発現されたタンパク質を、Ｆａｂに親和力を有するタンパク質−Ｇカラムを用いて、次の方法で部分的に精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。
【００５８】
ハイトラップタンパク質Ｇ ＨＰカラム(Hitrap Protein G HP、Amersharm Bioscience社)に１０カラム体積の平衡緩衝溶液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を１分当たり１ｍｌの流速で流し、充分に平衡化させた後、前記実施例３から得た醗酵培養上澄液を前記カラムにローディングした。試料のローディングが完了した後、前記カラムを１０カラム体積の平衡緩衝溶液で洗浄してから、カラムに吸着された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を５カラム体積の溶出液（０．１Ｍ グリシン ＨＣｌｐＨ２．７）で溶出した。
【００５９】
このように溶出された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’は、二つの異なるタンパク質、即ち、ジスルフィド結合によって連結された重鎖と軽鎖の結合によって形成された異型接合体であるため、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと非−還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥとにおける移動様式が異なるようになる。図９は、前記と同様に精製された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を１５％クライテリオンゲル（criteriongel、Bio-Rad社)を用いて非−還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開させてその移動様式を比べたものである。図９で、レーン２及び３は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したものであり、レーン４及び５は非−還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したものである。レーン１は、予め染色された低い範囲標準タンパク質マーカー(prestained low-range standard marker, Bio-Rad社)であり；レーン２及び４は、実施例３で用いられたＦａｂ標準タンパク質であり；レーン３及び５は、大腸菌形質転換体ＨＭ１０９２２（ＫＣＣＭ−１０５１１）を醗酵させ生産された精製試料である。
【００６０】
図９に示すように，還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては重鎖と軽鎖との結合が還元的に切断され、重鎖及び軽鎖は略同一大きさの個別的な単量体として移動する（重鎖の分子量［約２４ｋＤａ］は軽鎖の分子量［約２３ｋＤａ］と類似しており，これらはゲル上で一つの分子のように見える）。一方、重鎖及び軽鎖は、非−還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてはジスルフィド結合で連結された異型接合体として存在し、その結果、約４７ｋＤａの移動距離を示した。
【００６１】
＜４−２＞ Ｎ−末端配列分析
前記実施例＜４−１＞のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された約４７ｋＤａの分子量を有する異型接合体のアミノ酸配列を分析するため、基礎科学支援研究所ソウル支店に前記タンパク質のＮ−末端配列分析を依頼し、分析する試料は次のように用意した。
【００６２】
ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社）をメタノールに約２−３秒間漬けて活性化させてから、ブロッキング溶液（１７０ｍＭ グリシン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８），２０％ メタノール）に充分に濡らした。実施例＜４−１＞の非−還元条件下で展開されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを前記と同様に用意されたＰＶＤＦ膜にブロッティングキット(HoeferSemi-Dry Transfer unit, Amersham)を用いて１時間程度ブロッティングを行った。ＰＶＤＦ膜へ移動されたタンパク質をクマシーブルーＲ−２５０（Ａｍｎｅｓｃｏ社）で３−４秒間染色してから、脱色液（水：酢酸：メタノール＝５：１：４）で洗浄した。洗浄された膜からタンパク質を含む部位をはさみで切り取って、Ｎ−末端配列分析に用いた。
【００６３】
抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖のアミノ酸配列はAsp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser（配列番号：３４）であり、重鎖のアミノ酸配列はGlu-Val-Gln-Leu-Glu-Val-Asp-Ser（配列番号：３５）である。アミノ酸配列分析の結果、本発明の大腸菌形質転換体から分泌的に発現された約４７ｋＤａの分子量を有する異型接合体のＮ−末端は、Asp/Glu-Ile/Val-Gln-Met/Leu-Thr/Val-Gln/Asp-Ser（配列番号：３６）であった。前記結果は、本発明によって生産された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖及び重鎖が正常な異型接合体形態で存在することを明確にするものである。
【００６４】
＜４−３＞活性酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）
前記実施例３で、大腸菌形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’が腫瘍壊死因子−アルファ抗原と結合するか否かを確認するため、次のように、活性酵素免疫測定分析法（ＥＬＩＳＡ）を行った。
【００６５】
実施例＜４−１＞から得た抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の濃度を２８０ｎｍでの吸収係数(extinction coefficient=1.43, Humphreys et,al. Protein Expression and Purification 26: 309-320, 2002)を決めることにより測定し、その後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝溶液に１０ｎｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。また、腫瘍壊死因子−アルファに結合する標準抗体として、腫瘍壊死因子−アルファと結合し関節炎治療剤としての商業的効能が立証されたヒューミラ（ｈｕｍｉｒａ，Ａｂｂｏｔｔ社）を同一緩衝溶液を用いて同一濃度で製造した。実施例３に記述と同一の方法でウェルプレートを腫瘍壊死因子−アルファにコーティングした後、動物細胞から生産された標準抗体と本発明の大腸菌形質転換体から生産されたＦａｂ’とが同一の濃度で同一の結合親和力を現わすかどうかを調査した。この際、標準抗体（対照群）はヒト免疫グロブリンＧをタンパク質分解酵素であるパパインで切断した後、一連のカラムで精製して用意したＦａｂを用いた。
【００６６】
図１０に示したように、対照群として用いられたＦａｂ標準タンパク質は、抗−腫瘍壊死因子−アルファに対して結合親和力を全く示さないのに対して，本発明によって大腸菌形質転換体から生産された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’希釈倍数に比例して腫瘍壊死因子−アルファと結合し、標準抗体と同一又はより高い吸光度を現わした。
【００６７】
本発明を前記具体的な実施例と関連して記述しましたが、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内で当分野の熟練者が本発明を多様に変形及び変化させ得ることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、重鎖と軽鎖の定常領域のそれぞれをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）に挿入して、プラスミドｐＢＨ及びｐＢＬの製作過程を示す図である。
【図２】図２は、重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれプラスミドｐＢＨ及びｐＢＬに挿入してプラスミドｐＢＨＣ及びｐＢＬＣの製作過程を示す図である。
【図３】図３は、Ｔ７プロモーターと大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列に融合された抗体の軽鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターｐｍｓＬＣ、及びＴ７プロモーターと大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列に融合された抗体の重鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターｐｍｓＨＣのそれぞれの製作過程を示す図である。
【図４】図４は、単一Ｔ７プロモーターの調節によって軽鎖と重鎖を個別的に発現・分泌するダイ−シストロニック発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿Ｂ及びｐｓＤＬＨＦ−Ｂｐの製作過程を示す図である。
【図５】図５は、Ｔａｃプロモーターと大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合された抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターｐｏＤＬＨＦの製作過程を示す図である。
【図６】図６は、個別のＴａｃプロモーターの調節によって重鎖及び軽鎖を発現して分泌する発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓの製作過程を示す図である。
【図７】図７は、抗体の軽鎖をコードする遺伝子が大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、抗体の重鎖をコードする遺伝子が大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合されており、これらの発現及び分泌が単一のＴａｃプロモーターによって調節される発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓの製作過程を示す図である。
【図８】図８は、抗体の軽鎖をコードする遺伝子が大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列変異体に融合されており、抗体の重鎖をコードする遺伝子が大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列に融合され、これらの発現及び分泌が単一のＴａｃプロモーターによって調節される、発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋの製作過程を示す図である。
【図９】図９は、還元条件下及び非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって得られた大腸菌形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−αＦａｂ’の発現パターンを比較した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、大腸菌形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−αＦａｂ’が腫瘍壊死因子−αと結合するか否かを調べるためのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性異型接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）の形態で大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片を分泌的に発現する組換え発現ベクター；前記発現ベクターにより形質転換された微生物；及び前記形質転換された微生物を用いて抗体断片を大量生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、「抗体断片」は、抗体の抗原−結合領域またはその可変領域を含む、抗体の一部を意味するものである。抗体断片の例としては、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖ断片などがある。抗体をパパイン（ｐａｐａｉｎ）で切断すると、Ｆａｂ’断片と呼ばれる二つの同一の抗原−結合断片と残りのＦｃ断片とが生成する。抗体をペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）で処理すると、二つの抗原−結合部位を有し、抗原と依然として架橋結合を形成し得るＦ（ａｂ’）２断片が生成する。Ｆａｂ断片は、さらに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ断片と異なって、抗体ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域から一つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されている。
【０００３】
抗原結合能力の増加、抗原性の変化、または二重特異的抗体の製造などで抗体の固有性質を調制するために、遺伝子組換え方法を用いた抗体と抗体断片の生産が研究されている。その結果、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系を用いて抗体と抗体断片を生産する方法が開発された。大腸菌の発現系を用いた生産方法は既存の動物細胞を用いた方法に比べて次のようなメリットを提供する：１）発現ベクターの製作が容易であるため、発現可否を容易に検証することができる；２）大腸菌は、成長速度が速いため、低費用で抗体の大量生産が可能であるので、これは研究用試料確保の面で有利である；３）比較的に単純な発酵方法を適用することができ、他の宿主細胞を用いる場合よりも一層容易に商業化できる。
【０００４】
抗体−コード遺伝子を大腸菌内に導入して発現させた事例は多くの文献で報告されている(Cabilly et al．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA81: 3273-3277，1984，Boss et al．Nucleic Acids Res．12: 3791-3806，1984)。これらの文献は、抗体分子が多様な収率で細胞質内で発現され、また、大腸菌が免疫グロブリンの軽鎖を分泌的に発現させること (Zemel-Dreasen et al., Gene 315-322, 1984)、または抗体断片遺伝子をアルカリ・ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）あるいはベータラクタマーゼ（β−ｌａｃｔａｍａｓｅ）シグナル配列に融合された抗体断片をペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）に分泌させるための宿主細胞として使用可能であることを開示している(Pluckthun et al., Cold Spring Harbor Symposiua on Quantitative Biology Volume LII、105-112、1987)。国際出願公開第ＷＯ９２／０１０５９号は、癌細胞の特定部位を認識する抗体であるＦａｂ’−コード遺伝子を、大腸菌外膜タンパク質Ａ(ＯｍｐＡ)シグナル配列に融合された融合タンパク質の形態で発現されることを教示しており；米国特許第５，６４８，２３７号は、大腸菌のエンテロトキシンシグナル配列に融合されたＦａｂ’−コード遺伝子がＰｈｏＡプロモーターの調節下で発現されることを開示している。
【０００５】
発現された抗体断片は野生型抗体と類似した抗原−結合能を示すが、それは野生型抗体よりも小さいため、局所浸透力が高く(Blumenthal et al., Ad. DrugDel. Rev.4: 279, 1990)、またＦｃ領域を含んでいないため、人体に何等の副作用も引き起こさない。よって、抗体断片は診断試薬の製造や、治療用抗体の開発に利用可能であり、大腸菌からの大量生産は経済的な面で非常に有利である。野生型抗体から抗体断片を製造する場合、野生型抗体はタンパク質分解酵素で切断して精製しなければならないが、これは煩わしくて経済的にも不利である。
【０００６】
しかしながら、抗体断片を大腸菌で生産する場合には様々な問題点がある。まず、すべての抗体断片が意図した治療あるいは診断的目的を満たす程度の量で発現されず、場合によっては培養過程を何度も繰り返しなければならない。また、抗体断片に機能的活性を付与するためには、重鎖と軽鎖が単一細胞内で共に発現され、これらの間に形成されたジスルフィド結合によって異型接合体の形態を維持しなければならないが、この際抗体断片は、タンパク質が大腸菌で過剰発現される場合に頻繁に見られる封入体の形態ではなく、高水溶性の形態で発現されることが求められる。このような問題点を解決するため、シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いて発現された抗体断片をペリプラズム空間に分泌させる方法に関する研究が活発に行われてきた。しかし、シグナル配列に融合されたすべての抗体断片が大腸菌のペリプラズム空間に分泌的に過剰発現されるのではなく、発現させようとする抗体の遺伝子配列によって発現された抗体の量において大きく異なる(Kelly et，al．Biochemistry 31: 5434-5441，1992; Humphreys et，al．Protein Expression and Purification 26: 309-320，2002)。発現ベクター内の構造遺伝子の相違または重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子との距離などによって抗体断片の発現パターンが変動することが報告されている（国際特許公開第ＷＯ０１／９４５８５号）。このような事実から、標的抗体断片の発現のためには、標的抗体遺伝子と発現に必要な宿主の構造遺伝子との相互作用、及びシグナル配列を用いる場合における標的抗体遺伝子とシグナル配列との相互作用における適切なバランスが要求される。
【０００７】
ここに、本発明者らは、大腸菌で抗体断片を抗原結合を有する水溶性異型接合体の形態で過剰発現させるために鋭意研究に努めた結果、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列を用いて、目的抗体断片である腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）のヒト抗体Ｆａｂ’を分泌的に発現する組換え発現ベクターを製造することによって、目的とする抗原−結合親和力を有する水溶性異型接合体の形態で抗体断片を大腸菌内で発現する方法を開発することで本発明に至った。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、大腸菌シグナル配列を用いて抗体断片を抗原−結合親和力を有する水溶性異型接合体形態で過剰発現させ得る組換え発現ベクター及び前記発現ベクターにより形質転換された微生物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記形質転換された微生物を用いて抗体断片を大量に生産する方法を提供することである。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子と、第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子とを含む組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターから発現された抗体断片が培養培地内に分泌されることを特徴とする組換え発現ベクターを提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記組換え発現ベクターを製造する段階；前記発現ベクターで微生物を形質転換させる段階；前記微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物から培地内に分泌された抗体断片を回収する段階を含む、抗体断片の生産方法を提供する。
本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な説明によって明白になる。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
本発明は、第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子及び第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子を含み、発現ベクターから発現された抗体断片を培養培地内に分泌することを特徴とする組換え発現ベクター；及び前記発現ベクターにより形質転換された微生物を提供する。
【００１２】
野生型抗体と機能的に類似した抗体断片を分泌的に発現できる前記発現ベクターは、抗体断片の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子をそれぞれ大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合させて製造される。
【００１３】
本発明で抗体断片は、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２またはｓｃＦｖであり、好ましくはＦａｂ’である。Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域から一つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されている点がＦａｂ断片と異なる。また、Ｆ（ａｂ’）２断片は二つのＦａｂ’分子がジスルフィド結合によって連結されて製造され、ｓｃＦｖ断片は軽鎖と重鎖の可変領域だけがペプチドリンカー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）によって連結されて単一ポリペプチド鎖の形態で存在する。
【００１４】
本発明に使用可能な抗体断片は、抗原に選択的に結合できるすべての抗体を含み、この場合、抗原はＴ−細胞、内皮細胞あるいは癌細胞マーカーのような細胞表面に結合している抗原であるか、あるいは、細胞と結合していない水溶性抗原である。細胞表面に結合されている抗原としては、β１インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）、Ｐ−セレクチン（Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、Ｅ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＭＨＣクラスＩ、ＩＩ、ＶＥＧＦ、及びその他の受容体が含まれるが、これらに限定されない。水溶性抗原としては、ＩＬ−１、２、３、４、５、６、８及びＩＬ−１２のようなインターロイキン類；サイトメガロウイルス抗原のようなウイルス抗原；ＩｇＥのような免疫グロブリン；ＩＮＦ−α、β及びγのようなインターフェロン；及び腫瘍壊死因子−α及びβ、血小板由来成長因子−α及びβのような細胞の成長及び分化に影響を及ぼす因子が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施例で、本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の抗体断片の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を用いる。ＴＮＦ−αは、単球細胞や大食細胞(ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ)のような免疫関連細胞によって生成されて過剰発現時に炎症を引き起こすサイトカイン類として知られているＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８の生成を誘導し、軟骨組織を破壊するタンパク質分解酵素の分泌を促進して関節炎を起こす主な媒介体として知られている。関節炎治療剤としての抗−腫瘍壊死因子−アルファ抗体のＦａｂ’は、単クローン抗体から得られ、好ましくは、ヒト化抗体、より好ましくは、完全なヒト抗体から得られる。
【００１５】
抗−腫瘍壊死因子−アルファのいくつかのキメラ抗体あるいはヒト化抗体の相補性決定領域(complementarity determining regions，CDRs)をコードする遺伝子は既に報告されており、完全なヒト抗体の塩基配列も決まっている（国際特許第ＷＯ９７／２９１３号）。このような情報を参考に、ヌクレオチド合成器を用いて抗体断片をコードする遺伝子を人工的に合成し、一連のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）とリゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）の過程、またはリゲーション連鎖反応（LCR，ligation-chain reaction)とポリメラーゼ連鎖反応（PCR，polymerase chain reaction)を通じて、Ｆａｂの重鎖と軽鎖をコードする上で合成した遺伝子をクローニングできる。
【００１６】
好ましい実施例で、本発明は配列番号：１〜６に示される塩基配列を有するヒト抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖の可変領域をコードする遺伝子断片と、配列番号：７〜１２に示される塩基配列を有する重鎖の可変領域をコードする遺伝子断片とをヌクレオチド合成器で合成した後、これらの断片をＰＣＲによって連結させて軽鎖及び重鎖の可変領域を製造する。また、軽鎖の定常領域と、ＩｇＧ１のＣＨ１及びヒンジ領域を含む重鎖の定常領域とを含む遺伝子断片は、人の血液から抽出したＲＮＡ全体を鋳型とし、ヒト抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖および重鎖の定常領域に対して特異的なプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲによって製造される。このように製造された軽鎖及び重鎖の定常領域をコードする遺伝子断片のそれぞれを適当な発現ベクターにクローニングして、軽鎖の定常領域をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＢＬＣ及び重鎖の定常領域をコードする遺伝子を含むｐＢＨＣを製造する（図１及び２参照）。塩基配列分析の結果、前記プラスミドｐＢＬＣに挿入された重鎖の定常領域をコードする遺伝子は、配列番号：３２に示す塩基配列を有し、プラスミドｐＢＨＣに挿入された重鎖の定常領域をコードする遺伝子は、配列番号：３３に示す塩基配列を有することが確認された。
【００１７】
発現させようとする抗体断片は、重鎖と軽鎖で構成された二つの異なる種類のタンパク質間の異型接合体として存在する。よって、抗原−結合親和力を有する活性型の異型接合体としての抗体断片を得るためには、重鎖と軽鎖が同等の水準で発現されなければならず、発現ベクターから発現された重鎖と軽鎖との間の正確な位置でジスルフィド結合が形成されなければならない。また、抗体断片が大腸菌内で発現される時、細胞質内に発現されたタンパク質は封入体の形態で存在し得る。この場合、重鎖と軽鎖のジスルフィド結合が正確な位置で生成されないこともあり、水溶性状態で発現されても、精製段階で細胞を完全に破壊できないという問題が起こり得る。このような問題点を解決するために、本発明は、大腸菌シグナル配列を用いて、ベクターから発現された抗体断片を大腸菌のペリプラズム空間あるいは培養培地に分泌させる組換え発現ベクターを提供する。
【００１８】
発現されたタンパク質が培養培地内に存在すると、発現されたタンパク質が細菌細胞内に存在する際に要求される細胞を破壊しなければならないという煩わしい過程を行わなくても良い。また、発現されたタンパク質がペリプラズム空間に存在するため、回収した細胞の浸透圧衝撃のような過程を省略できる。
【００１９】
さらに、酸化環境は異型接合体を形成するようにするジスルフィド結合を容易にするため、発現されたタンパク質が細胞の細胞質内の非−酸化環境に存在するよりもペリプラズム空間あるいは培養培地内に存在するのが有利である。
【００２０】
本発明の組換え発現ベクターに使用可能な大腸菌シグナル配列は、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列、ベータラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列またはこれらの変異体などであり、好ましくは大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体またはＯｍｐＡシグナル配列であるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の好ましい実施例で、発現ベクターから発現された活性型の抗体断片Ｆａｂ’を培養培地内に分泌させるために用いられた大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体は、大腸菌で様々な異種タンパク質を分泌・発現させるために本発明者らが開発したものである。前記大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体は、配列番号：１７に示される塩基配列を有し、最適効率で大腸菌内で様々な異種タンパク質を発現・分泌できることが報告されている（韓国特許第３１６３４７号）。本発明で、発現ベクターから発現された活性型の抗体断片Ｆａｂ’を培養培地内に分泌させ得る組換え発現ベクターは、抗体断片の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれ大腸菌シグナル配列、例えば、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合させることによって製造される。
【００２２】
抗体断片の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を一つの発現ベクター内で発現させるために、本発明は、一つのプロモーターの下に二つのタンパク質を適切な間隔をおいて配置して同時に発現させるダイ−シストロニック体系（ｄｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）を用いる発現ベクターと、独立された各プロモーターに遺伝子を連結して二つのタンパク質を独立的に発現できる二重−プロモーター体系（ｄｕａｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いる発現ベクターとの二つの種類の発現ベクターを提供する。
【００２３】
まず、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする遺伝子断片を、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列及びｈＧＨを含む発現ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑ（韓国特許第３１６３４７号）から除去する。プラスミドｐＢＬＣから得た軽鎖をコードする遺伝子断片と、プラスミドｐＢＨＣから得た重鎖をコードする遺伝子断片とを、前記発現ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑに挿入し、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＨＣ、及び耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＬＣを製作する。重鎖と軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子の発現を調節するダイ−シストロニック発現ベクターを製作するために、プラスミドｐｍｓＨＣからＰＣＲによって得た重鎖をコードする遺伝子断片をプラスミドｐｍｓＬＣに挿入して発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿Ｂ及びｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐを製造する（図３及び４参照）。
【００２４】
また、本発明は前記のような方法によって、軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌ＯｍｐＡシグナル配列（配列番号：２４）に融合され、単一Ｔａｃプロモーターが軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節する発現ベクターｐｏＤＬＨＦを製作する（図５参照）。
【００２５】
前記で製作された発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿Ｂ、ｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐ及びｐｏＤＬＨＦはシグナル配列に融合された抗−腫瘍壊死因子−アルファの重鎖及び軽鎖のそれぞれが単一プロモーターの調節下で発現・分泌されるダイ−シストロニック発現ベクターである。前記発現ベクターのそれぞれを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて製造した大腸菌形質転換体BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)及びBL21/poDLHF(HM10922)はそれぞれ、特許手続きの目的のための微生物寄託の国際的認識に関するブダペスト条約に従って、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５０９、ＫＣＣＭ−１０５１０及びＫＣＣＭ−１０５１１として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付で寄託された。
【００２６】
上述したように、単一プロモーターの調節下で異なる二つのタンパク質を分泌的に発現させる場合、プロモーターに近いタンパク質の発現効率はプロモーターに遠いタンパク質の発現効率と異なり得る(Humphreys et, al. Protein Expression and Purification 26: 309-320, 2002)。本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖と軽鎖の発現及び分泌が独立したプロモーターによって個別的に調節可能な二重−プロモーターシステムを用いる発現ベクターを提供する。好ましい実施例で、本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれＯｍｐＡシグナル配列に融合して、Ｔａｃプロモーターが軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現及び分泌を調節する発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓを製作する（図６参照）。前記発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓにより大腸菌ＢＬ２１を形質転換させて製造した大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓ（ＨＭ１０９２３）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１２として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付に寄託された。
【００２７】
抗体断片のような異型接合体の形成は前記異型接合体の二つの断片の一方が過剰発現された時に抑制されるので、二つのタンパク質の断片は互いに同様の水準で発現されなければならない。ここに、本発明では、重鎖と軽鎖をコードする遺伝子をそれぞれ互いに異なるシグナル配列に融合させて抗体断片を分泌的に発現させ得る組換え発現ベクターを提供する。
【００２８】
好ましい実施例で、本発明は、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、その重鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合され、単一Ｔ７プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節する発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓを製作する（図７参照）。また、本発明で、発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋは、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、その軽鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合され、単一Ｔａｃプロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節するように製作される（図８参照）。前記発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓ及びｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１に形質転換させて製造した大腸菌形質転換体BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)及びBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)のそれぞれは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１３及びＫＣＣＭ−１０５１６として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付で寄託された。
【００２９】
本発明は、前記のように製作された組換え発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して製造された組換え微生物を提供する。本発明で使用可能な宿主細胞としては、大腸菌W3110、RV308、BL21、BL21(DE3)などを含み、好ましくは大腸菌ＢＬ２１であるが、これらに限定されない。前記発現ベクターにより形質転換された組換え微生物を発酵槽を用いて高濃度で培養（ＯＤ６００＝１２０〜１５０）する場合、抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片は培養培地１Ｌ当たり１００〜５００ｍｇ以上の高収率で培養培地内に分泌的に生産されることが確認された（表１参照）。このように大量生産された抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片はタンパク質−Ｇアフィニティーカラムによって部分的に精製できる。精製された抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片を還元条件下及び非−還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、抗体断片が水溶性異型接合体形態で形成されたことを確認した（図９参照）。また、結合抗原として抗−腫瘍壊死因子−アルファを用いたＥＬＩＳＡは、抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片が腫瘍壊死因子−アルファ抗原に対して優れた結合親和力を有することを示した（図１０参照）。
【００３０】
本発明は、第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子及び第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階；前記発現ベクターで微生物を形質転換させる段階；前記微生物を培地で培養する段階；及び 前記微生物から培地内に分泌された抗体断片を回収する段階を含む、抗体断片の生産方法を提供する。
【００３１】
本発明の組換え発現ベクターで使用可能な大腸菌シグナル配列としては、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列、ベータラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列またはこれらの変異体を含み、好ましくは配列番号：１７に示される塩基配列を有する大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または配列番号：２３に示される塩基配列を有する大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列を用いるが、これらに限定されない。
【００３２】
前記組換え発現ベクターにより形質転換された微生物を適当な培地で予備培養した後、この予備培養液を発酵槽に接種して３０〜３５℃範囲の温度で空気と接触させながら本−培養を実施する。６００ｎｍでＯＤ値が８０に達すると、誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）を発酵槽に添加して標的抗体断片の発現を誘導する。本発明で使用可能な誘導物質としては、ＩＰＴＧが好ましいが、これに限定されない。６００ｎｍでＯＤ値が１２０〜１４０に逹するまで、４０〜４５時間更に培養する。前記培養液を遠心分離して上澄液を分離した後、これをアフィニティーカラムクロマトグラフィーで抗体断片を精製する。前記形質転換された微生物は、大腸菌BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)(KCCM-10509)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)(KCCM-10510)、BL21/poDLHF(HM10922)(KCCM-10511)、BL21/poDLHF_B/S(HM10923)(KCCM-10512)、BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)(KCCM-10513)、好ましくはBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)(KCCM-10516)であるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明によって発現された抗体断片は宿主細胞のペリプラズム空間または培養培地内に分泌されるため、抗体断片は浸透圧ショック処理のような工程を経なとも回収できる。
【００３４】
本発明の方法によって発現され得る目標抗体断片は、好ましくはＦａｂ’、Ｆａｂ’Ｆ(ａｂ’)２またはｓｃＦｖなどであるが、抗−腫瘍壊死因子−アルファの抗体断片に限定されるものではなく、よって、診断または治療を目的とする任意のすべての抗体、例えば、抗癌効果がある抗体断片または過剰−発現された場合、人体に致命的なダメージを与える様々なサイトカインに対する抗体断片の生産に適用できる。
【００３５】
前述したように、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体または大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列を含む本発明の組換え発現ベクターは、抗体断片を抗原−結合親和力を有する水溶性異型接合体の形態で発現させ得る。前記発現ベクターにより形質転換された微生物は抗体断片を宿主細胞のペリプラズム空間または培養培地に分泌させることが可能であるため、発現された抗体断片は大量生産に適する方法で容易に回収できる。従って、本発明による方法は診断試薬または治療用抗体の製造に有効に利用可能である。
【００３６】
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００３７】
実施例１：抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’をコードする遺伝子のクローニング
国際特許第ＷＯ９７／２９１３１号に記載された塩基配列を参考にして、ヒト抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖と軽鎖の可変領域をヌクレオチド合成器を用いて合成した。軽鎖の可変領域をクローニングするための遺伝子断片は配列番号：１〜６の塩基配列を有し、重鎖の可変領域をクローニングするための遺伝子断片は配列番号：７〜１２の塩基配列を有した。この後のクローニング過程を容易にするために、前記重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれの一番目である遺伝子断片（即ち、配列番号：１及び７）にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｕｖＩ制限酵素認識部位を挿入した。前記合成した重鎖及び軽鎖の遺伝子断片のそれぞれを一つのチューブに混ぜた後、これらを一つの遺伝子配列で連結させるために通常的なＰＣＲを行って、軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする遺伝子を製造した。前記ＰＣＲ反応で、遺伝子断片のそれぞれは鋳型のみならずプライマーとして作用可能であり、従って、これらは互いにアニーリングされ、約３２０ｍｅｒ程度の断片を形成した。前記ＰＣＲ反応混合物は、それぞれの遺伝子断片１００ｐｍｏｌｅ、５ｕｌの２ｍＭｄＮＴＰ混合液、２．５単位のｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）及び５ｕｌのｐｆｕ反応緩衝溶液(100mM Tris-HCl(pH8.3), 15mM MgCl2, 500mM KCl)を含み、蒸留水を加えて最終体積が５０ｕｌになるようにした。前記ＰＣＲはＤＮＡサーマルサイクラー(DNA thermocycler, Perkin-Elmer社)を用いて９４℃で５分間初期変性させた後、９４℃で６０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で６０秒の反応を３０回行った。
【００３８】
ヒト項−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖の定常領域とＩｇＧ１のＣＨ１とヒンジ領域とを含んだ重鎖の定常領域をクローニングするため，ヒト血液の血球細胞からＲＮＡを抽出した後、次のようにＲＴ−ＰＣＲを行った。すべてのＲＮＡは、ＱｉａｍｐＲＮＡ血液キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて約６ｍｌの血液から抽出されて、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いられた。前記重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれは、重鎖増幅のための配列番号：１３及び１４に示されるプライマー対と、軽鎖増幅のための配列番号：１５及び１６に示されるプライマー対を用いたＯｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて増幅された。この際、この後のクローニング過程を容易にするために、配列番号：２６の重鎖５’−プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｔｕＩ制限酵素認識部位を挿入し、配列番号：２７の重鎖３’−プライマーには終止コドンを含むＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入し；配列番号：２８の軽鎖５’−プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｒｕＩ制限酵素認識部位を挿入し、配列番号：２９の軽鎖３’−プライマーには終止コドンを含むＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入した。これから増幅された重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＰＣＲ産物をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断した後、同一制限酵素で処理されたプラスミドpBluscriptSK(-)(Stratagen社)に挿入してプラスミドｐＢＨ及びｐＢＬを製造した（図１）。ＤＮＡ塩基配列の分析によって、プラスミドｐＢＨ及びｐＢＬにそれぞれの重鎖及び軽鎖の定常領域が正確に挿入されたことが確認された。
【００３９】
前記重鎖及び軽鎖の可変領域をこれらに相応する定常領域に連結するため、前記でＰＣＲによって合成された重鎖及び軽鎖の可変領域それぞれをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断した。酵素処理された重鎖の可変領域は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｔｕＩで予め処理されたプラスミドｐＢＨに挿入され、酵素処理された軽鎖の可変領域は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｒｕＩで予め処理されたプラスミドｐＢＬに挿入されて、重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれがこれらに相応する定常領域に連結されたプラスミドｐＢＨＣ及びｐＢＬＣを製作した（図２）。前記プラスミドｐＢＨＣ及びｐＢＬＣにそれぞれ挿入された重鎖と軽鎖はそれぞれ配列番号：３２及び３３に示された塩基配列を有する。
【００４０】
実施例２：抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’遺伝子発現ベクターの製作
＜２−１＞ 大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体及び抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’遺伝子を含む発現ベクターの製作
大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体を用いた発現ベクターを製作するため、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現する発現ベクターpT14S1SH-4T20V22Q（韓国特許第３１６３４７号）を用いた。前記発現ベクターは配列番号：１７に示される塩基配列を有する耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体を含む。この発現ベクターからｈＧＨを除去し前記実施例１で製造された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子断片を挿入するために、配列番号：１８及び１９のプライマー対を用いた部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutagenesis)によってプラスミドpT14S1SH-4T20V22Qの耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体とｈＧＨ遺伝子の融合部位にＳｔｕＩ制限酵素認識部位を挿入した。塩基配列分析法によってＳｔｕＩ制限酵素認識部位が成功的に標的位置に生成されたことが確認した。前記プラスミドpT14S1SH-4T20V22Q内のＳｔｕＩ制限酵素認識部位を有するプラスミドをｐｍＳＴＩＩと命名した。
【００４１】
前記プラスミドｐｍＳＴＩＩをＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行って、ｈＧＨ部位が除去され大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体を含む大きい断片（４.７ｋｂ）をゲルから回収した。前記実施例１で製造された軽鎖をコードする遺伝子断片を有するプラスミドｐＢＬＣをＰｕｖＩ制限酵素で処理した後、これらの両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。これから得たプラスミドをＢａｍＨＩ制限酵素で処理して約７２０ｂｐの軽鎖をコードする遺伝子断片を回収した。また、重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐＢＨＣを鋳型として配列番号：１及び２０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。これから増幅されたＰＣＲ産物を、前記軽鎖をコードする遺伝子断片の製造に用いられた同一酵素で処理して約７００ｂｐの重鎖をコードする遺伝子断片を回収した。配列番号：２０のプライマー対は重鎖ヒンジ領域の一部を含む変形されたヒンジ配列であるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＡＡ−終止コドンが重鎖をコードする遺伝子断片に挿入されてＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含むように考案されているため、この後の過程でＦａｂ’発現ベクターの製作に有用に利用できる。このように用意された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子断片のそれぞれをプラスミドｐｍＳＴＩＩ断片に挿入し、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＬＣのみならず、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含む発現ベクターｐｍｓＨＣを製作した（図３）。
【００４２】
重鎖と軽鎖が一つのプロモーターによって調節されて発現・分泌されるダイ−シストロニック(ｄｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ)発現ベクターを製作するために、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｍｓＨＣを鋳型とし、配列番号：２１及び２０のプライマー対と配列番号：２２及び２３のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。配列番号：２１の５’−プライマーは重鎖をコードする遺伝子断片の発現に必要であるシャインダルガノ(Shine-Dalgarno，SD)配列からＰＣＲ反応が開始するように考案されており、増幅された産物を容易にクローニングするためにＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含んでいる。また、配列番号：２２及び２３のプライマー対は、クローニング部位を異ならせるために、ＢａｍＨＩではなくＢｐｕＩ制限酵素認識部位を含むことを除けば、配列番号：２１及び２０のプライマー対と同一の塩基配列を有している。各プライマー対を用いて増幅された重鎖をコードする遺伝子断片（一方はＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含み、他方はＢｐｕＩ制限酵素認識部位を含む）をＢａｍＨＩとＢｐｕＩ制限酵素でそれぞれ処理した。
【００４３】
耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｍｓＬＣでＢａｍＨＩとＢｐｕＩ制限酵素認識部位はすべて軽鎖遺伝子の終止コドンの下流に位置し、ＢｐｕＩの制限酵素認識部位はＢａｍＨＩより約６０ヌクレオチド以上下流に存在するようにした。前記プラスミドｐｍｓＬＣをＢａｍＨＩとＢｐｕＩ制限酵素で処理した後、その部位にＢａｍＨＩまたはＢｐｕＩ制限酵素で処理された重鎖をコードする遺伝子断片を挿入した。プラスミドｐｍｓＬＣのＢａｍＨＩ制限酵素部位内に挿入された重鎖遺伝子を含むＦａｂ’発現ベクターをｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐと命名した（図４）。これらの発現ベクターの場合、重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子はそれぞれ、大腸菌エンテロトキシンシグナル配列に融合され、単一Ｔ７プロモーターがこれらの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子の発現を調節する。前記発現ベクターそれぞれを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体BL21(DE3)/ psDLHF_B (HM10920) 及び BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)を製造し、これらを特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５０９及びＫＣＣＭ−１０５１０として韓国微細物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年１０月２日付で寄託した。
【００４４】
＜２−２＞ 大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列及び抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を含む発現ベクター製作
大腸菌ＯｍｐＡシグナル配列（配列番号：２４）を用いて抗−腫瘍壊死因子−アルファの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を分泌的に発現する発現ベクターを次のように製作した。
【００４５】
まず、ＴａｃプロモーターとＯｍｐＡシグナル配列とを含むプラスミドｐＦｌａｇ.ＣＴＳ(Eastman Chemical Company)をＨｉｎｄＩＩＩで処理し、前記プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位をクレノウ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Klenow DNA polymerase, NEB, New Egland Biolab USA）で処理して平滑末端にした後、ＢｇｌＩＩ制限酵素で切断して５’−末端は平滑末端を、３’−末端は付着端を有するベクター断片を製作した。また、ＯｍｐＡシグナル配列と、重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子断片とを連結するため、重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐＢＨＣを鋳型とし、配列番号：２５及び２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行って重鎖の可変領域と定常領域、そして変形されたヒンジ配列と終止コドンを含むＰＣＲ産物を増幅した。この際、３’−末端に相応する配列番号：２６のプライマー対はＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を挿入するように考案された。このように増幅された重鎖をコードする遺伝子断片を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断した後、この断片を前記でＢｇｌＩＩによって予め切断されたプラスミドｐＦｌａｇ．ＣＴＳに挿入してＯｍｐＡシグナル配列に融合された重鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｏＨＣを製作した。前記記載の同一方法に従って、軽鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐＢＬＣを鋳型とし、配列番号：２７及び２８のプライマー対を用いたＰＣＲを行った後、このように増幅されたＰＣＲ産物を同一制限酵素処理過程を経ってプラスミドｐＦｌａｇ．ＣＴＳに挿入してＯｍｐＡシグナル配列に融合された軽鎖をコードする遺伝子断片を含むプラスミドｐｏＬＣを製作した。
【００４６】
それぞれＯｍｐＡシグナル配列に融合された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子が単一Ｔａｃプロモーターによって調節されて、発現分泌されるようにダイ−シストロニック発現ベクターを製造するため、鋳型としてプラスミドｐｏＨＣを用い、配列番号：２９及び３０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。これから増幅されたＰＣＲ産物は、両末端にＳａｌＩ制限酵素認識部位を有し、プロモーター領域を除いた重鎖の発現に必要であるシャインダルガノ配列とＯｍｐＡシグナル配列とを含む。このＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩで切断してから回収した遺伝子断片を同一制限酵素で予め処理されたプラスミドｐｏＬＣに挿入してＦａｂ’遺伝子を発現する発現ベクターｐｏＤＬＨＦを製作した（図５）。前記発現ベクターｐｏＤＬＨＦで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ（ＨＭ１０９２２）を製造し、これを韓国微細物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１１として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００４７】
＜２−３＞ 二重プロモーター（ｄｕａｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によって調節される発現ベクターの製作
抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖と軽鎖をそれぞれ独立したプロモーターによって個別的に発現・分泌させ得る二重−プロモーターシステムを有する発現ベクターを次のように製作した。ＯｍｐＡシグナル配列に融合された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の 重鎖をコードする遺伝子断片を含む実施例＜２−２＞のプラスミドｐｏＨＣをＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した。前記酵素−処理されたプラスミドのアガロースゲル電気泳動を行い、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖をコードする遺伝子断片、Ｔａｃプロモーター及びＯｍｐＡシグナル配列を含む、より小さな断片（１.２ｋｂ）をゲルから回収した。前記断片の両末端をクレノウ ＤＮＡ ポリメラーゼで処理して平滑末端にした。また、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖をコードする遺伝子断片を含む実施例＜２−２＞のプラスミドｐｏＬＣをＳａｌＩで処理した後、両末端を前記と同一の方法によって平滑末端に作った。それから、重鎖をコードする遺伝子断片をここに挿入してＯｍｐＡシグナル配列に融合された軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが独立的にＴａｃプロモーターの調節によって発現分泌される発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓを製作した（図６）。前記発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させて大腸菌形質転換体BL21/poDLHF_B/S(HM10923)を製造し、これを韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１２として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００４８】
＜２−４＞ 各鎖の発現及び分泌が互いに異なるシグナル配列によって調節される発現ベクターの製作
＜２−４−１＞
抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’α軽鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、重鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合されて、これらの発現及び分泌が単一プロモーターによって調節される発現ベクターを次のように製作した。
【００４９】
単一Ｔａｃプロモーターの調節によってＯｍｐＡシグナル配列に融合された重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子がそれぞれ発現される実施例＜２−２＞の発現ベクターｐｏＤＬＨＦをＮｄｅＩとＳａｃＩで処理した後、このベクターのアガロースゲル電気泳動を行って、比較的に大きな遺伝子断片（６.６ｋｂ）をゲルから回収した。ＮｄｅＩの認識部位はＯｍｐＡシグナル配列の一番目のアミノ酸であるメチオニンに位置し、ＳａｃＩの認識部位は軽鎖の定常領域に位置した。従って、前記発現ベクターをＮｄｅＩ及びＳａｃＩで処理すると、ＯｍｐＡシグナル配列は含まないが、軽鎖の可変領域の全部と軽鎖の定常領域の一部を含む遺伝子断片が回収できる。
【００５０】
重鎖をコードする遺伝子断片が耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合されたプラスミドであるｐｍｓＬＣを鋳型とし、配列番号：３１及び２０のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。配列番号：３１の５’−プライマーはＮｄｅＩ認識部位を含み、耐熱性エンテロトキシンシグナル配列の一番目のアミノ酸に結合して、配列番号：２０の３’−プライマーはＳａｃＩ認識部位を含む。これから増幅されたＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＳａｃＩで処理した後、欠失した軽鎖領域を有するプラスミドｐｏＤＬＨＦに挿入して発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓを製作した（図７）。前記発現ベクター ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓを大腸菌ＢＬ２１に形質組転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓ（ＨＭ１０９２４）を製造し、これを韓国微細物保存センターに寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１３として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００５１】
＜２−４−２＞
前記実施例＜２−４−１＞で製造された発現ベクターとは異なって、抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の重鎖をコードする遺伝子は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、軽鎖をコードする遺伝子はＯｍｐＡシグナル配列に融合されて、単一プロモーターによってこれらの発現及び分泌が調節される発現ベクターを次のように製作した。
【００５２】
実施例＜２−１＞の発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿ＢｐをＳａｃＩとＫｐｎＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動を行って小さな遺伝子断片（０．６ｋｂ）をゲルから回収した。ＳａｃＩの認識部位は軽鎖の定常領域に存在し、ＫｐｎＩの認識部位は重鎖の定常領域に存在するため、回収された断片は耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合された軽鎖遺伝子断片を含んでいた。重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のそれぞれがＯｍｐＡシグナル配列に融合され、単一Ｔａｃプロモーターによって発現されるように製作された発現ベクターｐｏＤＬＨＦを同一制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。次いで、サイズが大きい遺伝子断片（７．４ｋｂ）をゲルから回収し、これを上で回収した軽鎖をコードする遺伝子断片に連結して発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋを製作した（図８）。前記発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋを大腸菌ＢＬ２１に形質組転換させて大腸菌形質転換体BL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)を製造し、これを韓国微生物保存センターに寄託番号ＫＣＣＭ−１０５１６として２００３年１０月２日付で寄託した。
【００５３】
実施例３：抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’遺伝子の発現
前記実施例２で製造された大腸菌形質転換体ＨＭ１０９２０〜ＨＭ１０９２５をそれぞれ５Ｌ体積の発酵槽（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ）に接種して発酵させた後、大腸菌形質転換による抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の発現有無を次のように調査した。
【００５４】
ＬＢ培地１００ｍｌに前記形質転換体それぞれを一晩中振盪予備培養してから、発酵槽に接種して培養を進めた。発酵槽の温度は３５℃あるいは３０℃に維持し、嫌気状態で進むのを防止するために空気を２０ｖｖｍで投入し、培地を５００ｒｐｍで撹拌した。微生物の成長のために補助エネルギー源としてグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）と酵母エキス（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）を微生物の発酵状態によって供給した。６００ｎｍでＯＤ値が８０に達した時、誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）であるＩＰＴＧを発酵槽に添加した。６００ｎｍでＯＤ値が１２０〜１４０に達するまで、前記発酵を４０〜４５時間行った。
【００５５】
前記醗酵培養液を遠心分離（２０，０００ｇ、３０分）して上澄液のみを取って、それぞれの形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の量を測定するために前記上澄液をＥＬＩＳＡで分析した。ヒト抗体ＣＨ１に対する単クローン抗体(MAB1304,Chemicon international)を１０ｍＭカーボネイト緩衝溶液（ｐＨ ９．６）に１ｕｇ／ｍｌの濃度で溶解させた後、９６−ウェルプレートをウェル当たり２００ｎｇの量で前記抗体溶液で４℃で一晩中コーティングした後、 ＰＢＳ−Ｔ溶液(137mM NaCl, 2mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 0.05% トゥイーン20)で３回洗浄した。ウシ血清アルブミンを１％の濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液に溶解させたブロッキング溶液を用意した。前記ブロッキング溶液２５０ｕｌを各ウェルに点滴した後、前記ウェルプレートを常温で１時間放置しておいて、同一のＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。標準液と試料液を、適当な濃度にＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈した後、抗体がコーティングされたウェルに添加した。前記ウェルプレートを常温で１時間放置させて反応させてから、再度ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。標準液は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩＢ−グロブリンＡ、緑十字 ＰＢＭ）をタンパク質分解酵素であるパパインで切断し、一連のカラムを用いてＦａｂを精製し、前記ＦａｂをＰＢＳ−Ｔ溶液に１ｎｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、二倍ずつ希釈して製造した。ヒト軽鎖の定常領域に対する多クローン抗体にパラクサイドが共有結合された、コンジュゲート試料（Ａ７１６４、Ｓｉｇｍａ社）は、ブロッキング溶液で１０００：１に希釈して用いた。希釈された２００ｕｌの試料を各ウェルに点滴した後、前記ウェルプレートを１時間常温で反応させた。反応が完了した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。発色溶液ＡとＢ（カラー−Ａ−安定化パラクサイド溶液及びカラーＢ−安定化クロモゲン溶液、ＤＹ ９９９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を同量で混合した後、各ウェルに前記発色溶液混合物を２００ｕｌずつ添加して前記ウェルプレートを３０分間放置した。次いで、２Ｍ硫酸を各ウェルに５０ｕｌずつ添加して反応を停止させた。４５０ｎｍの標準液と試料液の吸光度を測定するために、前記ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）で分析した。その結果を下記表１に示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
実施例４；タンパク質発現の確認
＜４−１＞ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
前記実施例３で製造された大腸菌形質転換体それぞれから発現された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を検出するために，発現されたタンパク質を、Ｆａｂに親和力を有するタンパク質−Ｇカラムを用いて、次の方法で部分的に精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。
【００５８】
ハイトラップタンパク質Ｇ ＨＰカラム(Hitrap Protein G HP、Amersharm Bioscience社)に１０カラム体積の平衡緩衝溶液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を１分当たり１ｍｌの流速で流し、充分に平衡化させた後、前記実施例３から得た醗酵培養上澄液を前記カラムにローディングした。試料のローディングが完了した後、前記カラムを１０カラム体積の平衡緩衝溶液で洗浄してから、カラムに吸着された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を５カラム体積の溶出液（０．１Ｍ グリシン ＨＣｌｐＨ２．７）で溶出した。
【００５９】
このように溶出された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’は、二つの異なるタンパク質、即ち、ジスルフィド結合によって連結された重鎖と軽鎖の結合によって形成された異型接合体であるため、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと非−還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥとにおける移動様式が異なるようになる。図９は、前記と同様に精製された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を１５％クライテリオンゲル（criteriongel、Bio-Rad社)を用いて非−還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開させてその移動様式を比べたものである。図９で、レーン２及び３は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したものであり、レーン４及び５は非−還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したものである。レーン１は、予め染色された低い範囲標準タンパク質マーカー(prestained low-range standard marker, Bio-Rad社)であり；レーン２及び４は、実施例３で用いられたＦａｂ標準タンパク質であり；レーン３及び５は、大腸菌形質転換体ＨＭ１０９２２（ＫＣＣＭ−１０５１１）を醗酵させ生産された精製試料である。
【００６０】
図９に示すように，還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては重鎖と軽鎖との結合が還元的に切断され、重鎖及び軽鎖は略同一大きさの個別的な単量体として移動する（重鎖の分子量［約２４ｋＤａ］は軽鎖の分子量［約２３ｋＤａ］と類似しており，これらはゲル上で一つの分子のように見える）。一方、重鎖及び軽鎖は、非−還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてはジスルフィド結合で連結された異型接合体として存在し、その結果、約４７ｋＤａの移動距離を示した。
【００６１】
＜４−２＞ Ｎ−末端配列分析
前記実施例＜４−１＞のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された約４７ｋＤａの分子量を有する異型接合体のアミノ酸配列を分析するため、基礎科学支援研究所ソウル支店に前記タンパク質のＮ−末端配列分析を依頼し、分析する試料は次のように用意した。
【００６２】
ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社）をメタノールに約２−３秒間漬けて活性化させてから、ブロッキング溶液（１７０ｍＭ グリシン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８），２０％ メタノール）に充分に濡らした。実施例＜４−１＞の非−還元条件下で展開されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを前記と同様に用意されたＰＶＤＦ膜にブロッティングキット(HoeferSemi-Dry Transfer unit, Amersham)を用いて１時間程度ブロッティングを行った。ＰＶＤＦ膜へ移動されたタンパク質をクマシーブルーＲ−２５０（Ａｍｎｅｓｃｏ社）で３−４秒間染色してから、脱色液（水：酢酸：メタノール＝５：１：４）で洗浄した。洗浄された膜からタンパク質を含む部位をはさみで切り取って、Ｎ−末端配列分析に用いた。
【００６３】
抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖のアミノ酸配列はAsp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser（配列番号：３４）であり、重鎖のアミノ酸配列はGlu-Val-Gln-Leu-Glu-Val-Asp-Ser（配列番号：３５）である。アミノ酸配列分析の結果、本発明の大腸菌形質転換体から分泌的に発現された約４７ｋＤａの分子量を有する異型接合体のＮ−末端は、Asp/Glu-Ile/Val-Gln-Met/Leu-Thr/Val-Gln/Asp-Ser（配列番号：３６）であった。前記結果は、本発明によって生産された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の軽鎖及び重鎖が正常な異型接合体形態で存在することを明確にするものである。
【００６４】
＜４−３＞活性酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）
前記実施例３で、大腸菌形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’が腫瘍壊死因子−アルファ抗原と結合するか否かを確認するため、次のように、活性酵素免疫測定分析法（ＥＬＩＳＡ）を行った。
【００６５】
実施例＜４−１＞から得た抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’の濃度を２８０ｎｍでの吸収係数(extinction coefficient=1.43, Humphreys et,al. Protein Expression and Purification 26: 309-320, 2002)を決めることにより測定し、その後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝溶液に１０ｎｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。また、腫瘍壊死因子−アルファに結合する標準抗体として、腫瘍壊死因子−アルファと結合し関節炎治療剤としての商業的効能が立証されたヒューミラ（ｈｕｍｉｒａ，Ａｂｂｏｔｔ社）を同一緩衝溶液を用いて同一濃度で製造した。実施例３に記述と同一の方法でウェルプレートを腫瘍壊死因子−アルファにコーティングした後、動物細胞から生産された標準抗体と本発明の大腸菌形質転換体から生産されたＦａｂ’とが同一の濃度で同一の結合親和力を現わすかどうかを調査した。この際、標準抗体（対照群）はヒト免疫グロブリンＧをタンパク質分解酵素であるパパインで切断した後、一連のカラムで精製して用意したＦａｂを用いた。
【００６６】
図１０に示したように、対照群として用いられたＦａｂ標準タンパク質は、抗−腫瘍壊死因子−アルファに対して結合親和力を全く示さないのに対して，本発明によって大腸菌形質転換体から生産された抗−腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’希釈倍数に比例して腫瘍壊死因子−アルファと結合し、標準抗体と同一又はより高い吸光度を現わした。
【００６７】
本発明を前記具体的な実施例と関連して記述しましたが、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内で当分野の熟練者が本発明を多様に変形及び変化させ得ることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、重鎖と軽鎖の定常領域のそれぞれをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）に挿入して、プラスミドｐＢＨ及びｐＢＬの製作過程を示す図である。
【図２】図２は、重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれプラスミドｐＢＨ及びｐＢＬに挿入してプラスミドｐＢＨＣ及びｐＢＬＣの製作過程を示す図である。
【図３】図３は、Ｔ７プロモーターと大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列に融合された抗体の軽鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターｐｍｓＬＣ、及びＴ７プロモーターと大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列に融合された抗体の重鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターｐｍｓＨＣのそれぞれの製作過程を示す図である。
【図４】図４は、単一Ｔ７プロモーターの調節によって軽鎖と重鎖を個別的に発現・分泌するダイ−シストロニック発現ベクターｐｓＤＬＨＦ＿Ｂ及びｐｓＤＬＨＦ−Ｂｐの製作過程を示す図である。
【図５】図５は、Ｔａｃプロモーターと大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合された抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターｐｏＤＬＨＦの製作過程を示す図である。
【図６】図６は、個別のＴａｃプロモーターの調節によって重鎖及び軽鎖を発現して分泌する発現ベクターｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓの製作過程を示す図である。
【図７】図７は、抗体の軽鎖をコードする遺伝子が大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、抗体の重鎖をコードする遺伝子が大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列に融合されており、これらの発現及び分泌が単一のＴａｃプロモーターによって調節される発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓの製作過程を示す図である。
【図８】図８は、抗体の軽鎖をコードする遺伝子が大腸菌外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）シグナル配列変異体に融合されており、抗体の重鎖をコードする遺伝子が大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列に融合され、これらの発現及び分泌が単一のＴａｃプロモーターによって調節される、発現ベクターｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋの製作過程を示す図である。
【図９】図９は、還元条件下及び非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって得られた大腸菌形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−αＦａｂ’の発現パターンを比較した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、大腸菌形質転換体から発現された抗−腫瘍壊死因子−αＦａｂ’が腫瘍壊死因子−αと結合するか否かを調べるためのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子と第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターを製作する段階；
２）前記発現ベクターにより微生物を形質転換する段階；
３）前記形質転換された微生物を培地で培養する段階；及び
４）前記培地内に分泌された抗体断片を回収する段階を含む抗体断片を生産する方法。
【請求項２】
前記抗体断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、外膜タンパク質Ａシグナル配列、βラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列及びこれらの変異体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載方法。
【請求項５】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、配列番号：１７に示される塩基配列を有する大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体、または配列番号：２３に示される塩基配列を有する大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合されて、前記単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが、大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、２つのプロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターがＴ７またはＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項６ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファ(anti-tumor necrosis factor-alpha, anti-TNF-α)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現ベクターがpsDLHF_B、psDLHF_Bp、poDLHF、pmsoDLHF_B/S、pmsoDLHF_N/S及びpmsoDLHF_S/Kからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現ベクターにより形質転換された微生物が大腸菌BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)(KCCM-10509)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)(KCCM-10510)、BL21/poDLHF(HM10922)(KCCM-10511)、BL21/poDLHF_B/S(HM10923)(KCCM-10512)、BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)(KCCM-10513)及びBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)(KCCM-10516)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子は第１大腸菌シグナル配列に融合され、抗体断片の重鎖をコードする遺伝子は第２大腸菌シグナル配列に融合され、発現ベクターから発現された抗体断片が培養培地内に分泌される発現ベクター。
【請求項１７】
前記抗体断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、外膜タンパク質Ａシグナル配列、ベータラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列及びこれらの変異体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、配列番号：１７に示される塩基配列を有する大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体、または配列番号：２３に示される塩基配列を有する大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列であることを特徴とする請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記単一プロモーターがＴ７プロモーターであることを特徴とする請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ｐｓＤＬＨＦ＿ＢまたはｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐであることを特徴とする請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
前記単一プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
ｐｏＤＬＨＦであることを特徴とする請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、二つのプロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を独立的に調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項２９に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
前記プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項３０に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
ｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓであることを特徴とする請求項３１に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記単一プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項３４に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓであることを特徴とする請求項３５に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項３７に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
前記単一プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋであることを特徴とする請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
請求項１６に記載の発現ベクターにより形質転換された微生物。
【請求項４２】
大腸菌であることを特徴とする請求項４１記載の微生物。
【請求項４３】
大腸菌BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)(KCCM-10509)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)(KCCM-10510)、BL21/poDLHF(HM10922)(KCCM-10511)、BL21/poDLHF_B/S(HM10923)(KCCM-10512)、BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)(KCCM-10513)、及びBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)(KCCM-10516)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項４２記載の微生物。
【請求項１】
１）第１大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子と第２大腸菌シグナル配列に融合された抗体断片の重鎖をコードする遺伝子とを含む発現ベクターを製作する段階；
２）前記発現ベクターにより微生物を形質転換する段階；
３）前記形質転換された微生物を培地で培養する段階；及び
４）前記培地内に分泌された抗体断片を回収する段階を含む抗体断片を生産する方法。
【請求項２】
前記抗体断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、外膜タンパク質Ａシグナル配列、βラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列及びこれらの変異体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載方法。
【請求項５】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、配列番号：１７に示される塩基配列を有する大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体、または配列番号：２３に示される塩基配列を有する大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合されて、前記単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが、大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、２つのプロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターがＴ７またはＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項６ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファ(anti-tumor necrosis factor-alpha, anti-TNF-α)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現ベクターがpsDLHF_B、psDLHF_Bp、poDLHF、pmsoDLHF_B/S、pmsoDLHF_N/S及びpmsoDLHF_S/Kからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現ベクターにより形質転換された微生物が大腸菌BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)(KCCM-10509)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)(KCCM-10510)、BL21/poDLHF(HM10922)(KCCM-10511)、BL21/poDLHF_B/S(HM10923)(KCCM-10512)、BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)(KCCM-10513)及びBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)(KCCM-10516)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子は第１大腸菌シグナル配列に融合され、抗体断片の重鎖をコードする遺伝子は第２大腸菌シグナル配列に融合され、発現ベクターから発現された抗体断片が培養培地内に分泌される発現ベクター。
【請求項１７】
前記抗体断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列、外膜タンパク質Ａシグナル配列、ベータラクタマーゼシグナル配列、ＧｅｎｅＩＩＩシグナル配列、ＰｅｌＢシグナル配列及びこれらの変異体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記第１及び第２大腸菌シグナル配列のそれぞれが、配列番号：１７に示される塩基配列を有する大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体、または配列番号：２３に示される塩基配列を有する大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列であることを特徴とする請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記単一プロモーターがＴ７プロモーターであることを特徴とする請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ｐｓＤＬＨＦ＿ＢまたはｐｓＤＬＨＦ＿Ｂｐであることを特徴とする請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
前記単一プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
ｐｏＤＬＨＦであることを特徴とする請求項２７に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のそれぞれが大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、二つのプロモーターが前記軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の発現を独立的に調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項２９に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
前記プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項３０に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
ｐｏＤＬＨＦ＿Ｂ／Ｓであることを特徴とする請求項３１に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記単一プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項３４に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｎ／Ｓであることを特徴とする請求項３５に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
前記軽鎖をコードする遺伝子は大腸菌外膜タンパク質Ａシグナル配列に融合され、前記重鎖をコードする遺伝子は大腸菌耐熱性エンテロトキシンシグナル配列変異体に融合され、単一プロモーターが前記軽鎖及び重鎖遺伝子の発現を調節することを特徴とする請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
前記抗体断片が抗−腫瘍壊死因子−アルファの断片であることを特徴とする請求項３７に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
前記単一プロモーターがＴａｃプロモーターであることを特徴とする請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
ｐｍｓｏＤＬＨＦ＿Ｓ／Ｋであることを特徴とする請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
請求項１６に記載の発現ベクターにより形質転換された微生物。
【請求項４２】
大腸菌であることを特徴とする請求項４１記載の微生物。
【請求項４３】
大腸菌BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)(KCCM-10509)、BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921)(KCCM-10510)、BL21/poDLHF(HM10922)(KCCM-10511)、BL21/poDLHF_B/S(HM10923)(KCCM-10512)、BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924)(KCCM-10513)、及びBL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925)(KCCM-10516)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項４２記載の微生物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５０８０３２（Ｐ２００７−５０８０３２Ａ）
【公表日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３５２６４（Ｐ２００６−５３５２６４）
【出願日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２６２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３８０３１
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２６２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３８０３１
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
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