大腸菌群検査用培地、該培地の製造方法及び大腸菌群の判定方法
【課題】 沈殿が発生せず、保存安定性に優れた大腸菌群検査用の濃縮培地を提供することを主たる目的とする。
【解決手段】 （Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有する。
【解決手段】 （Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の被検体中に大腸菌群が存在するか否かを判定するための大腸菌群検査用培地、該培地の製造方法及び大腸菌群の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲料水，食品等の衛生管理においては、これらの被検体中における大腸菌群の存否を判定する検査が必要不可欠となっている。大腸菌群の迅速検査方法としては、発色基質を添加した培地を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。また、社団法人日本水道協会発行の「上水試験方法 解説編 ２００１年度版」には、上記方法を特定酵素基質培地法と規定しており、発色基質としてＸＧａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加した大腸菌群検査用培地として、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地とピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地が収載されている。
【０００３】
しかし、上述のような発色基質を添加した培地を用いた大腸菌群の検査は、経験を積んだ検定者の手作業により実施され、作業が煩雑である。そこで、被検体中の大腸菌群の存否を自動的に判定する大腸菌群判定装置の開発も行われている（例えば、特許文献４，５参照）
【０００４】
特許文献４，５に記載された大腸菌群判定装置は、上述した特定酵素基質培地法における各工程を自動化して行う手段を備えており、例えば、被検体を貯留するための容器、上記被検体の温度を調節するための温度調節装置、大腸菌群検査用培地の保存タンク、上記培地を上記容器へ供給するための供給装置及び透過率測定手段等を備えており、上記各手段を用いて被検体の培養を行い、培養後の上記培地の透過率を測定して被検体中の大腸菌群の存否を判定するように構成されている。
【０００５】
特許文献４では、大腸菌群検査用培地としてピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いており、上記培地の保存中における雑菌の繁殖を抑制することで、大腸菌群判定装置による判定結果の信頼性を確保するため、上記培地の標準規定濃度の少なくとも２倍〜１１倍に設定された濃縮培地を保存タンクに保存し、使用時に所定量を上記容器へ供給して標準規定濃度に希釈して用いることが好ましい旨記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−４６８９１号公報
【特許文献２】特開平８−３１７７８７号公報
【特許文献３】特開２００５−１７６６４０号公報
【特許文献４】特開２００３−１８９８４４号公報
【特許文献５】特開２００４−２２９６５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、本発明者がＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を規定濃度より１１倍高く設定した濃縮培地を用いて検討したところ、培地の作製後直ちに使用すれば何ら問題が生じないものの、室温で１日保存すると沈殿が発生し、商品価値が低下してしまうことが分かった。
【０００８】
したがって、本発明の主たる目的は、上記のような沈殿が発生せず、保存安定性に優れた大腸菌群検査用の濃縮培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、プロピレングリコールを含む培地を用いれば、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕 （Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有することを特徴とする、大腸菌群検査用培地、
〔２〕 （Ｃ）成分１．５〜２．２％（w/v）と（Ｄ）成分６．０〜８．８％（w/v）に代えて、（Ｃ）成分０．１〜０．８％（w/v）と（Ｄ）成分０．４〜３．２％（w/v）を含有する、前記〔１〕記載の大腸菌群検査用培地、
〔３〕 （Ｋ）成分として（Ｆ）成分がβ−ガラクトシダーゼと反応して生成する発色物質の示す波長領域に吸収ピークを示さない色素をさらに含有する、前記〔１〕又は〔２〕記載の大腸菌群検査用培地、
〔４〕 （Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分及び（Ｊ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕記載の大腸菌群検査用培地の製造方法、
〔５〕 （Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分，（Ｊ）成分及び（Ｋ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、前記〔３〕記載の大腸菌群検査用培地の製造方法、
〔６〕 培養手段及び透過率測定手段を備えた装置を用いて、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の培地を水で１５〜２２倍希釈して得られる標準濃度培地に被検体を加えて培養し、培養後の前記培地の透過率を検出することで、前記培地の発色の有無を判定することを特徴とする大腸菌群の判定方法。
【発明の効果】
【００１１】
上記〔１〕記載の培地によれば、長期間室温で保存した場合でも、沈殿を生じることなく安定して保存することができる。上記〔２〕記載の培地によれば、長期間低温で保存した場合でも、沈殿を生じることなく安定して保存することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の大腸菌群検査用培地は、（Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明において、（Ａ）成分は塩化ナトリウム，（Ｂ）成分は硝酸カリウム，（Ｃ）成分はリン酸二水素カリウム，（Ｄ）成分はリン酸水素二カリウム，（Ｅ）成分はペプトン，（Ｆ）成分は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＸＧａｌ），（Ｇ）成分はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ），（Ｈ）成分はピルビン酸ナトリウム、（Ｉ）成分はプロピレングリコール，（Ｊ）成分は水であり、これらはいずれも必須成分である。
【００１４】
本発明では、（Ａ）〜（Ｉ）の各成分濃度を特定範囲に設定することにより、室温で４ヶ月程度は沈殿が発生せず、保存安定性に優れた液体培地とすることができる。ここで、本明細書において「室温」とは、具体的には、１〜３０℃をいい、通常は２０℃前後をいう。
【００１５】
すなわち、培地中の（Ａ）成分の濃度は、好ましくは７．５〜１１．０％（w/v）であり、より好ましくは７．５〜１０．０％（w/v）である。培地中の（Ｂ）成分の濃度は、好ましくは１．５〜２．２％（w/v）であり、より好ましくは１．５〜２．０％（w/v）である。培地中の（Ｃ）成分の濃度は、好ましくは１．５〜２．２％（w/v）であり、より好ましくは１．５〜２．０％（w/v）である。培地中の（Ｄ）成分の濃度は、好ましくは６．０〜８．８％（w/v）であり、より好ましくは６．０〜８．０％（w/v）である。培地中の（Ｅ）成分の濃度は、好ましくは７．５〜１１．０％（w/v）であり、より好ましくは７．５〜１０．０％（w/v）である。培地中の（Ｆ）成分の濃度は、好ましくは０．１５〜０．２２％（w/v）であり、より好ましくは０．１５〜０．２０％（w/v）である。培地中の（Ｇ）成分の濃度は、好ましくは０．１５〜０．２２％（w/v）であり、より好ましくは０．１５〜０．２０％（w/v）である。培地中の（Ｈ）成分の濃度は、好ましくは１．５〜２．２％（w/v）であり、より好ましくは１．５〜２．０％（w/v）である。培地中の（Ｉ）成分の濃度は、好ましくは２０〜３０％（w/v）であり、より好ましくは２０〜２５％（w/v）である。
【００１６】
上記（Ａ）〜（Ｈ）の各成分濃度は、それぞれ標準規定濃度に比べて、好ましくは１５〜２２倍高濃度に設定されており、より好ましくは１５〜２０倍高濃度に設定されている。ここで、本明細書において「標準規定濃度」とは、表１のピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地に含まれる上記（Ａ）〜（Ｈ）の各成分について規定された濃度をいう。すなわち、上記（Ａ）〜（Ｈ）成分については、濃縮倍率として１５〜２２倍が好ましく、１５〜２０倍がより好ましい。
【００１７】
本発明において（Ｊ）成分は水であり、上述した培地成分の溶剤としての役割を有する。本発明に使用される水の種類は、液体培地用に通常用いられるものであれば特に限定されず、例えば、イオン交換水、蒸留水などの精製水等を使用することができる。
【００１８】
本発明の培地は、好ましくは、（Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分及び（Ｈ）成分を水（Ｊ）中に溶解させた組成物Ａと、（Ｆ）成分を（Ｉ）成分中に溶解させた組成物Ｂとを混合し、これを高温（例えば、９０℃程度）で加温溶解させ、次いで室温に戻すことにより作製することができる。すなわち、ＸＧａｌは水溶性が低いため水に溶けにくいので、ＸＧａｌの溶剤としてプロピレングリコールを使用している。また、上記のように組成物Ａと組成物Ｂとを混合して培地を作製すると、室温保存中における培地の着色を抑制することができる。
【００１９】
また、組成物Ｂに代えて、（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液と（Ｉ）成分からなる組成物に（Ｆ）成分を溶解させた組成物Ｃを用いるようにすれば、上記組成物Ａと該組成物Ｃとは室温で溶解させることができるので、本発明に係る培地を容易に製造することができる。（Ｉ）成分であるｐＨ約８のｐＨ緩衝液としては特に限定されないが、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を例示することができる。上記培地中における（Ｌ）成分の濃度は特に限定されないが、通常１％(w/v)程度である。
【００２０】
本発明による大腸菌群の判定方法を実施するには、本発明の培地のうち、所定量を水で１５〜２２倍希釈した標準濃度培地を作製し、この標準濃度培地に所定量の被検体を加えて３０〜４０℃で数時間〜４０時間培養し、培養後の培地の透過率を調べて、被検体中の大腸菌群の存否を判定する。すなわち、被検体中に大腸菌群が存在すると、これが産生するβ−ガラクトシダーゼの作用によってＸＧａｌが分解され、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルを遊離し、これが酸化反応を経て青〜青緑色に呈色するインジゴを生成するので、培地の呈色を検出することにより被検体中に大腸菌群が存在することを判定することができる。
【００２１】
本発明の培地は、大腸菌群の検出選択性についてピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地（表１を参照）と同等以上である。また、被検体中に酸消費量（ｐＨ４．８）が多く含まれている場合でも、大腸菌群の検出選択性は影響を受けない。
【００２２】
また、本発明の培地は、上記（Ａ）〜（Ｊ）成分（さらに必要に応じて（Ｌ）成分）のうち、（Ｃ）成分と（Ｄ）成分の含有量を特定範囲に設定することにより、低温で２ヶ月程度は沈殿が発生せず、保存安定性に優れた液体培地とすることができる。ここで、本明細書において「低温」とは、−５〜０℃をいう。低温での保存安定性に優れた培地を得るにあたっては、（Ｃ）成分の濃度は０．１〜０．８％(w/v)が好ましく、０．１〜０．６％(w/v)がより好ましい。また、（Ｄ）成分の濃度は０．４〜３．２％(w/v)が好ましく、０．４〜２．４％(w/v)がより好ましい。すなわち、上述した標準規定濃度を基準にした場合、（Ｃ）成分については、濃縮倍率として１〜８倍が好ましく、１〜６倍がより好ましい。また、（Ｄ）成分については、濃縮倍率として１〜８倍が好ましく、１〜６倍がより好ましい。
【００２３】
本発明による大腸菌群検査用培地及び該培地を用いた大腸菌群の判定方法は、被検体中の大腸菌群の存否を自動的に判定するように設計された大腸菌群判定装置に適用される。
大腸菌群判定装置の構成としては、上述した特許文献４，５に記載されたものを挙げることができるが、大腸菌群の存否を自動的に判定できる装置として供され、少なくとも培養手段（例えば、被検体を貯留するための容器，温度調節装置等）及び透過率測定手段を備えた装置であれば適用可能である。
【００２４】
上記装置を用いて大腸菌群の判定を行う場合、本発明の培地のうち所定量が被検体に添加される。このため、所定量の培地が添加されたことを判定するため、（Ｋ）成分として（Ｆ）成分がβ−ガラクトシダーゼと反応して生成する発色物質の示す波長領域に吸収ピークを示さない色素をさらに含有させるようにしてもよい。（Ｆ）成分としての色素は、緑色光の透過率が低下するように被検体を着色させることができるものであり、かつ青〜青緑色の波長領域（６００〜７００ｎｍ）に吸収ピークを示さないものが好ましい。このような色素としては、例えば、５２０ｎｍ付近に極大吸収ピークを示す赤色の色素を用いることができる。該赤色の色素としては、例えばエオシンＹ等を挙げることができる。
【００２５】
（Ｋ）成分を用いる場合において、室温で本発明の培地を作製するときは、上述した組成物Ｃに（Ｋ）成分を含有させるようにすればよい。
【実施例】
【００２６】
以下、試験例などにより本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
【００２７】
表１は、公定法として定められている特定酵素基質培地法のうち、発色基質としてＸＧａｌを用いたＸＧａｌ−ＭＵＧ培地とピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の成分組成を示したものである。ここで、表１に示された各成分の濃度は、公定法で定められた標準規定濃度である。以下では、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いて大腸菌群を検出する方法を「公定法Ｉ」といい、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いて大腸菌群を検出する方法を「公定法II」という。また、後述する培地の濃縮倍率は、上記標準規定濃度を基準とした値である。以後、濃縮倍率をいう場合、単に「（×濃縮倍率）」と表示する場合がある。
【００２８】
【表１】
【００２９】
（参考例１：培地Ａ（×１１）の作製）
まず、表２に示すように、表１に記載した２種類の培地のうち、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の各成分濃度よりも１１倍高くなるように、室温で各成分に水を添加・混合し、９０℃で加温溶解を行い、次いで室温に戻すことで培地Ａ（１００ミリリットル）を作製した。そして、培地Ａを２０℃で１日間保存し、沈殿が生じるか否かを調べた。この結果、沈殿として、ＳＤＳ，リン酸二水素カリウム及びリン酸水素二カリウムが生じることが確認された。
【００３０】
【表２】
【００３１】
（参考例２：培地Ｂ（×１１）の作製）
沈殿成分の一つであるＳＤＳ及び大腸菌検出用の発色基質であるＭＵＧを配合成分から除いた培地Ｂを用いて保存試験を行った。すなわち、表３に示すように、表２の培地成分のうち、ＳＤＳとＭＵＧを除いた各成分について、各成分濃度が標準規定濃度の１１倍高くなるように、室温で各成分に水を添加・混合し、９０℃で加温溶解を行い、次いで室温に戻すことで培地Ｂ（１００ミリリットル）を作製した。そして、培地Ｂを２０℃で保存した場合、何日後に沈殿が生じるかを調べた。この結果、４〜７日後に沈殿を生じることが確認された。
【００３２】
【表３】
【００３３】
（参考例３：培地１〜４（×１１）の作製）
表４に示すように、上記「参考例２」で用いた培地Ｂを基準として、トリプトースとＸＧａｌのうち、いずれか一の成分または両成分を除いた培地１〜４を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存した場合、７日後，３０日後及び６０日後に各培地の状態を調べた。また、培地１と培地４は、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）にＸＧａｌを溶解させた組成物と、水に上記以外の成分を溶解させた組成物とを混合し、９０℃で加温溶解を行い、次いで室温に戻すことで作製した。これはＸＧａｌの水溶性が低いためである。この結果、培地１と培地３はそれぞれ３０日後に沈殿を生じること、培地４は６０日後でも沈殿を生じないが７日後に着色すること、培地２は６０日後でも沈殿を生じず、かつ着色もしないことが確認された。培地１〜培地３の結果から、沈殿の原因はトリプトースとＸＧａｌであることが分かる。また、培地１と培地４の結果から、ＤＭＦを増量すると沈殿は抑制されるが、着色が激しくなることが確認された。したがって、ＸＧａｌを１１倍濃度溶解させる場合、他の溶剤を用いる必要があることが分かった。
【００３４】
【表４】
【００３５】
（参考例４：培地５（×１１）と培地６（×２２）の作製）
表５に示すように、上記「参考例２」で用いた培地Ｂを基準として、栄養源をソルビトール，トリプトース及びトリプトファンに代えてピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地で配合されるペプトンを使用するとともに、ＸＧａｌを配合成分から除いた培地５（×１１）と培地６（×２２）を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存して、１日後，７日後，３０日後及び６０日後に各培地の状態を調べた。この結果、培地５は、６０日後でも沈殿を生じず、かつ着色もしないことが確認された。一方、培地６は、６０日後に沈殿を生じることが確認された。
【００３６】
【表５】
【００３７】
（参考例５：ＸＧａｌの着色を抑制する溶剤の検討）
表５に示すように、ＤＭＦ，ＰＧ（プロピレングリコール）及び１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液のうち一種以上を溶剤としてＸＧａｌを溶解させた溶液７〜１０を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存して、１日後，７日後，３０日後及び６０日後に各溶液の状態を調べた。この結果、表５から明らかなように、ＸＧａｌの着色を抑制するには、溶剤としてＤＭＦよりＰＧの方が適していること、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加して溶液のｐＨを上昇させることが好ましいことが分かった。
【００３８】
（実施例１：ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を基準とした配合処方の検討）
表１に記載したピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の配合成分のうち、ＳＤＳとＭＵＧを除くとともに、ＰＧとＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を配合し、濃縮倍率を１１〜２５倍，ＰＧ濃度を２０〜４０％（w/v）に設定した培地７〜１６を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存して、３０日後，６０日後及び１２０日後に各培地の状態を調べた（表６参照）。上記各培地は、塩化ナトリウム，硝酸カリウム，リン酸二水素カリウム，リン酸水素二カリウム，ペプトン，ＩＰＴＧ及びピルビン酸ナトリウムを水に溶解させた組成物と、ＸＧａｌをＰＧと１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の混液に溶解させた組成物とを２０℃で混合して作製した。この結果、ＰＧ濃度が２０％(w/v)及び３０％（w/v）で、濃縮倍率１１〜２０倍の培地では、１２０日後でも沈殿を生じないことが確認された。
【００３９】
【表６】
【００４０】
（実施例２：低温での保存安定性に優れた培地処方の検討）
表６のうち、濃縮倍率が２０倍，ＰＧ濃度が２０％(w/v)の培地１１の配合処方を基準として、リン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムの濃縮倍率を２０倍，１０倍及び５倍に設定した培地１７〜１９（培地１７は培地１１と同一の成分組成である）を作製し（いずれも１００ミリリットル）、−５℃で保存して、６０日後に各培地の状態を調べた(表７参照)。この結果、培地１９（上記リン酸塩の濃縮倍率：５倍）は６０日後でも沈殿を生じなかったのに対し、培地１７（上記リン酸塩の濃縮倍率：２０倍）及び培地１８（上記リン酸塩の濃縮倍率：１０倍）は６０日後に沈殿を生じることが確認された。したがって、低温における保存安定性を高めるには、リン酸塩の濃縮倍率を５倍程度に設定することが好ましいといえる。
【００４１】
【表７】
【００４２】
（実施例３：標準濃度培地Ａの選択性、発色性の検討）
表７に示した培地のうち、低温保存性に優れる培地１９を水で２０倍希釈した標準濃度培地Ａを用いて表８に示す各種菌株Ａ〜Ｌを培養した（なお、菌株Ｌは水のみからなるブランクである）。具体的には、水７ミリリットルに培地１９を３５０マイクロリットル添加し、オートクレーブ（１２１℃，１５分）した後、Ａ〜Ｌ溶液を添加し（菌数は１０個で、これは溶液の添加量にてコントロールした）、３６℃で３８時間培養し、２０時間後，２４時間後及び３８時間後における各培地の発色の程度を目視観察した。対照として、表１に記載のピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用い、該培地７ミリリットルをオートクレーブ（１２１℃，１５分）した後、Ａ〜Ｌ溶液を添加し（菌数は１０個で、これは溶液の添加量にてコントロールした）、３６℃で３８時間培養し、２０時間後，２４時間後及び３８時間後における各培地の発色の程度を目視観察した。表９に結果を示す。
【００４３】
【表８】
【００４４】
【表９】
【００４５】
表９から明らかなとおり、菌株Ｆ（K.pneumoniae）を除く全ての菌株について、標準濃度培地Ａはピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地と同じ選択性を示した。菌株Ｆは大腸菌群であるが、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地では偽陰性を示す一方、標準濃度培地Ａでは陽性を示した。このことから、標準濃度培地Ａは大腸菌群に対する選択性に優れていることがいえる。また、培養時間毎の発色性についても標準濃度培地Ａはピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地と同等だった。
【００４６】
（実施例４：雑菌が存在する場合の選択性評価）
標準濃度培地Ａには、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地に添加されているＳＤＳ（グラム陽性菌の抑制剤）が配合されていない。そこで、グラム陽性菌等の雑菌が過剰量存在する場合でも、標準濃度培地Ａがピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地と同程度に大腸菌群を検出できるか否か調べた。具体的には、上記菌株Ａ〜Ｌのうち、菌株Ｇ（P.aeruginosa；グラム陰性菌）と菌株Ｉ（S.aureus；グラム陽性菌）を雑菌とし、菌株Ｇと菌株Ｉをそれぞれ１００００個、及び上記菌株Ａ〜Ｆ，Ｈ及びＪ〜Ｌのうち１種を１０個共存させ、上記「実施例３」と同様に培養した。表１０に結果を示す。
【００４７】
【表１０】
【００４８】
表１０から、培養時間２０時間では多少の相違はあるものの、２４時間及び３８時間では、菌株Ｆを含む雑菌を培養した場合を除き、標準濃度培地Ａとピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は同等の選択性、発色性を示した。
【００４９】
（実施例５：酸消費量（ｐＨ４．８）の影響）
表７に示す培地１９について、大腸菌群の検出選択性に及ぼす酸消費量（ｐＨ４．８）の影響を調べるため、培地１９を水で２０倍希釈した標準濃度培地Ａと培地１９を酸消費量（ｐＨ４．８）が２５０mg／リットルの水溶液で２０倍希釈した標準濃度培地Ｂを作製し、添加時の菌数が２０個であること以外は上記「実施例３」と同様に菌株Ａ〜Ｆ，Ｈ，Ｊ，Ｋ及びＬを培養した。表１１に結果を示す。上述した酸消費量（ｐＨ４．８）が２５０mg／リットルの水溶液は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）に水を加えて調製したものである。表１１から、標準濃度培地Ａを用いた場合と標準濃度培地Ｂを用いた場合とを対比すると、本試験に供した菌株の全てについて培養３８時間後の発色性に両者間で有意差は認められなかった。したがって、培地１９は、被検体中に酸消費量（ｐＨ４．８）が多く含まれている場合でも、大腸菌群の検出選択性は影響されないことが分かった。
【００５０】
【表１１】
【００５１】
（実施例６：エオシンＹ配合培地の作製）
培地１９を基準として、さらにエオシンＹを配合した培地２０を作製し（表１２参照）、実施例３と同様の方法で培地２０を用いて表８に示す菌株Ｅ（E.coli；大腸菌）を３６℃で２２時間培養した。そして、得られた培地のうち、１０ミリリットルを分光光度計用セルに移し、このセルを分光光度計（株式会社日立製作所製Ｕ−２０１０，石英セル長：２５mm）にセットし、室温下、波長４００〜８００nmの吸収スペクトルを測定した。図１に得られた吸収スペクトルを示す。また、対照として、培地１９を上記と同様の方法で培養し、得られた培地の吸収スペクトルを測定した。さらに、図１には、培地２０中のエオシンＹと同濃度になるように、エオシンＹを純水に溶解させたエオシンＹ溶解液の吸収スペクトルも併せて示した。
【００５２】
【表１２】
【００５３】
図１から、培養後の培地２０の吸収スペクトルのうち、エオシンＹの吸収ピーク（４５０〜５６０ｎｍ）は、培地２０に含まれるＸＧａｌがβ−ガラクトシダーゼと反応して生成した青〜青緑色の発色物質の吸収ピーク（６００〜７００ｎｍ）と重ならないことが確認された。したがって、大腸菌群判定装置に本発明の培地を適用する場合、培地２０のようにエオシンＹを含有させたものを用いるようにすれば、培養前に所定量の培地が添加されたか否かを確実に判定することができるとともに、大腸菌群の判定結果にも影響を与えないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、被検体中の大腸菌群の有無を自動的に判定する装置に適用される大腸菌群検査用濃縮培地、該培地の製造方法及び大腸菌群の判定方法として広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】エオシンＹを含有する培地を用いて、大腸菌群の判定結果に与えるエオシンＹの影響を調べた吸収スペクトルである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の被検体中に大腸菌群が存在するか否かを判定するための大腸菌群検査用培地、該培地の製造方法及び大腸菌群の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲料水，食品等の衛生管理においては、これらの被検体中における大腸菌群の存否を判定する検査が必要不可欠となっている。大腸菌群の迅速検査方法としては、発色基質を添加した培地を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。また、社団法人日本水道協会発行の「上水試験方法 解説編 ２００１年度版」には、上記方法を特定酵素基質培地法と規定しており、発色基質としてＸＧａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加した大腸菌群検査用培地として、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地とピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地が収載されている。
【０００３】
しかし、上述のような発色基質を添加した培地を用いた大腸菌群の検査は、経験を積んだ検定者の手作業により実施され、作業が煩雑である。そこで、被検体中の大腸菌群の存否を自動的に判定する大腸菌群判定装置の開発も行われている（例えば、特許文献４，５参照）
【０００４】
特許文献４，５に記載された大腸菌群判定装置は、上述した特定酵素基質培地法における各工程を自動化して行う手段を備えており、例えば、被検体を貯留するための容器、上記被検体の温度を調節するための温度調節装置、大腸菌群検査用培地の保存タンク、上記培地を上記容器へ供給するための供給装置及び透過率測定手段等を備えており、上記各手段を用いて被検体の培養を行い、培養後の上記培地の透過率を測定して被検体中の大腸菌群の存否を判定するように構成されている。
【０００５】
特許文献４では、大腸菌群検査用培地としてピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いており、上記培地の保存中における雑菌の繁殖を抑制することで、大腸菌群判定装置による判定結果の信頼性を確保するため、上記培地の標準規定濃度の少なくとも２倍〜１１倍に設定された濃縮培地を保存タンクに保存し、使用時に所定量を上記容器へ供給して標準規定濃度に希釈して用いることが好ましい旨記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−４６８９１号公報
【特許文献２】特開平８−３１７７８７号公報
【特許文献３】特開２００５−１７６６４０号公報
【特許文献４】特開２００３−１８９８４４号公報
【特許文献５】特開２００４−２２９６５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、本発明者がＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を規定濃度より１１倍高く設定した濃縮培地を用いて検討したところ、培地の作製後直ちに使用すれば何ら問題が生じないものの、室温で１日保存すると沈殿が発生し、商品価値が低下してしまうことが分かった。
【０００８】
したがって、本発明の主たる目的は、上記のような沈殿が発生せず、保存安定性に優れた大腸菌群検査用の濃縮培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、プロピレングリコールを含む培地を用いれば、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕 （Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有することを特徴とする、大腸菌群検査用培地、
〔２〕 （Ｃ）成分１．５〜２．２％（w/v）と（Ｄ）成分６．０〜８．８％（w/v）に代えて、（Ｃ）成分０．１〜０．８％（w/v）と（Ｄ）成分０．４〜３．２％（w/v）を含有する、前記〔１〕記載の大腸菌群検査用培地、
〔３〕 （Ｋ）成分として（Ｆ）成分がβ−ガラクトシダーゼと反応して生成する発色物質の示す波長領域に吸収ピークを示さない色素をさらに含有する、前記〔１〕又は〔２〕記載の大腸菌群検査用培地、
〔４〕 （Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分及び（Ｊ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕記載の大腸菌群検査用培地の製造方法、
〔５〕 （Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分，（Ｊ）成分及び（Ｋ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、前記〔３〕記載の大腸菌群検査用培地の製造方法、
〔６〕 培養手段及び透過率測定手段を備えた装置を用いて、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の培地を水で１５〜２２倍希釈して得られる標準濃度培地に被検体を加えて培養し、培養後の前記培地の透過率を検出することで、前記培地の発色の有無を判定することを特徴とする大腸菌群の判定方法。
【発明の効果】
【００１１】
上記〔１〕記載の培地によれば、長期間室温で保存した場合でも、沈殿を生じることなく安定して保存することができる。上記〔２〕記載の培地によれば、長期間低温で保存した場合でも、沈殿を生じることなく安定して保存することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の大腸菌群検査用培地は、（Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明において、（Ａ）成分は塩化ナトリウム，（Ｂ）成分は硝酸カリウム，（Ｃ）成分はリン酸二水素カリウム，（Ｄ）成分はリン酸水素二カリウム，（Ｅ）成分はペプトン，（Ｆ）成分は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＸＧａｌ），（Ｇ）成分はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ），（Ｈ）成分はピルビン酸ナトリウム、（Ｉ）成分はプロピレングリコール，（Ｊ）成分は水であり、これらはいずれも必須成分である。
【００１４】
本発明では、（Ａ）〜（Ｉ）の各成分濃度を特定範囲に設定することにより、室温で４ヶ月程度は沈殿が発生せず、保存安定性に優れた液体培地とすることができる。ここで、本明細書において「室温」とは、具体的には、１〜３０℃をいい、通常は２０℃前後をいう。
【００１５】
すなわち、培地中の（Ａ）成分の濃度は、好ましくは７．５〜１１．０％（w/v）であり、より好ましくは７．５〜１０．０％（w/v）である。培地中の（Ｂ）成分の濃度は、好ましくは１．５〜２．２％（w/v）であり、より好ましくは１．５〜２．０％（w/v）である。培地中の（Ｃ）成分の濃度は、好ましくは１．５〜２．２％（w/v）であり、より好ましくは１．５〜２．０％（w/v）である。培地中の（Ｄ）成分の濃度は、好ましくは６．０〜８．８％（w/v）であり、より好ましくは６．０〜８．０％（w/v）である。培地中の（Ｅ）成分の濃度は、好ましくは７．５〜１１．０％（w/v）であり、より好ましくは７．５〜１０．０％（w/v）である。培地中の（Ｆ）成分の濃度は、好ましくは０．１５〜０．２２％（w/v）であり、より好ましくは０．１５〜０．２０％（w/v）である。培地中の（Ｇ）成分の濃度は、好ましくは０．１５〜０．２２％（w/v）であり、より好ましくは０．１５〜０．２０％（w/v）である。培地中の（Ｈ）成分の濃度は、好ましくは１．５〜２．２％（w/v）であり、より好ましくは１．５〜２．０％（w/v）である。培地中の（Ｉ）成分の濃度は、好ましくは２０〜３０％（w/v）であり、より好ましくは２０〜２５％（w/v）である。
【００１６】
上記（Ａ）〜（Ｈ）の各成分濃度は、それぞれ標準規定濃度に比べて、好ましくは１５〜２２倍高濃度に設定されており、より好ましくは１５〜２０倍高濃度に設定されている。ここで、本明細書において「標準規定濃度」とは、表１のピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地に含まれる上記（Ａ）〜（Ｈ）の各成分について規定された濃度をいう。すなわち、上記（Ａ）〜（Ｈ）成分については、濃縮倍率として１５〜２２倍が好ましく、１５〜２０倍がより好ましい。
【００１７】
本発明において（Ｊ）成分は水であり、上述した培地成分の溶剤としての役割を有する。本発明に使用される水の種類は、液体培地用に通常用いられるものであれば特に限定されず、例えば、イオン交換水、蒸留水などの精製水等を使用することができる。
【００１８】
本発明の培地は、好ましくは、（Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分及び（Ｈ）成分を水（Ｊ）中に溶解させた組成物Ａと、（Ｆ）成分を（Ｉ）成分中に溶解させた組成物Ｂとを混合し、これを高温（例えば、９０℃程度）で加温溶解させ、次いで室温に戻すことにより作製することができる。すなわち、ＸＧａｌは水溶性が低いため水に溶けにくいので、ＸＧａｌの溶剤としてプロピレングリコールを使用している。また、上記のように組成物Ａと組成物Ｂとを混合して培地を作製すると、室温保存中における培地の着色を抑制することができる。
【００１９】
また、組成物Ｂに代えて、（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液と（Ｉ）成分からなる組成物に（Ｆ）成分を溶解させた組成物Ｃを用いるようにすれば、上記組成物Ａと該組成物Ｃとは室温で溶解させることができるので、本発明に係る培地を容易に製造することができる。（Ｉ）成分であるｐＨ約８のｐＨ緩衝液としては特に限定されないが、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を例示することができる。上記培地中における（Ｌ）成分の濃度は特に限定されないが、通常１％(w/v)程度である。
【００２０】
本発明による大腸菌群の判定方法を実施するには、本発明の培地のうち、所定量を水で１５〜２２倍希釈した標準濃度培地を作製し、この標準濃度培地に所定量の被検体を加えて３０〜４０℃で数時間〜４０時間培養し、培養後の培地の透過率を調べて、被検体中の大腸菌群の存否を判定する。すなわち、被検体中に大腸菌群が存在すると、これが産生するβ−ガラクトシダーゼの作用によってＸＧａｌが分解され、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルを遊離し、これが酸化反応を経て青〜青緑色に呈色するインジゴを生成するので、培地の呈色を検出することにより被検体中に大腸菌群が存在することを判定することができる。
【００２１】
本発明の培地は、大腸菌群の検出選択性についてピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地（表１を参照）と同等以上である。また、被検体中に酸消費量（ｐＨ４．８）が多く含まれている場合でも、大腸菌群の検出選択性は影響を受けない。
【００２２】
また、本発明の培地は、上記（Ａ）〜（Ｊ）成分（さらに必要に応じて（Ｌ）成分）のうち、（Ｃ）成分と（Ｄ）成分の含有量を特定範囲に設定することにより、低温で２ヶ月程度は沈殿が発生せず、保存安定性に優れた液体培地とすることができる。ここで、本明細書において「低温」とは、−５〜０℃をいう。低温での保存安定性に優れた培地を得るにあたっては、（Ｃ）成分の濃度は０．１〜０．８％(w/v)が好ましく、０．１〜０．６％(w/v)がより好ましい。また、（Ｄ）成分の濃度は０．４〜３．２％(w/v)が好ましく、０．４〜２．４％(w/v)がより好ましい。すなわち、上述した標準規定濃度を基準にした場合、（Ｃ）成分については、濃縮倍率として１〜８倍が好ましく、１〜６倍がより好ましい。また、（Ｄ）成分については、濃縮倍率として１〜８倍が好ましく、１〜６倍がより好ましい。
【００２３】
本発明による大腸菌群検査用培地及び該培地を用いた大腸菌群の判定方法は、被検体中の大腸菌群の存否を自動的に判定するように設計された大腸菌群判定装置に適用される。
大腸菌群判定装置の構成としては、上述した特許文献４，５に記載されたものを挙げることができるが、大腸菌群の存否を自動的に判定できる装置として供され、少なくとも培養手段（例えば、被検体を貯留するための容器，温度調節装置等）及び透過率測定手段を備えた装置であれば適用可能である。
【００２４】
上記装置を用いて大腸菌群の判定を行う場合、本発明の培地のうち所定量が被検体に添加される。このため、所定量の培地が添加されたことを判定するため、（Ｋ）成分として（Ｆ）成分がβ−ガラクトシダーゼと反応して生成する発色物質の示す波長領域に吸収ピークを示さない色素をさらに含有させるようにしてもよい。（Ｆ）成分としての色素は、緑色光の透過率が低下するように被検体を着色させることができるものであり、かつ青〜青緑色の波長領域（６００〜７００ｎｍ）に吸収ピークを示さないものが好ましい。このような色素としては、例えば、５２０ｎｍ付近に極大吸収ピークを示す赤色の色素を用いることができる。該赤色の色素としては、例えばエオシンＹ等を挙げることができる。
【００２５】
（Ｋ）成分を用いる場合において、室温で本発明の培地を作製するときは、上述した組成物Ｃに（Ｋ）成分を含有させるようにすればよい。
【実施例】
【００２６】
以下、試験例などにより本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
【００２７】
表１は、公定法として定められている特定酵素基質培地法のうち、発色基質としてＸＧａｌを用いたＸＧａｌ−ＭＵＧ培地とピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の成分組成を示したものである。ここで、表１に示された各成分の濃度は、公定法で定められた標準規定濃度である。以下では、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いて大腸菌群を検出する方法を「公定法Ｉ」といい、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用いて大腸菌群を検出する方法を「公定法II」という。また、後述する培地の濃縮倍率は、上記標準規定濃度を基準とした値である。以後、濃縮倍率をいう場合、単に「（×濃縮倍率）」と表示する場合がある。
【００２８】
【表１】
【００２９】
（参考例１：培地Ａ（×１１）の作製）
まず、表２に示すように、表１に記載した２種類の培地のうち、ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の各成分濃度よりも１１倍高くなるように、室温で各成分に水を添加・混合し、９０℃で加温溶解を行い、次いで室温に戻すことで培地Ａ（１００ミリリットル）を作製した。そして、培地Ａを２０℃で１日間保存し、沈殿が生じるか否かを調べた。この結果、沈殿として、ＳＤＳ，リン酸二水素カリウム及びリン酸水素二カリウムが生じることが確認された。
【００３０】
【表２】
【００３１】
（参考例２：培地Ｂ（×１１）の作製）
沈殿成分の一つであるＳＤＳ及び大腸菌検出用の発色基質であるＭＵＧを配合成分から除いた培地Ｂを用いて保存試験を行った。すなわち、表３に示すように、表２の培地成分のうち、ＳＤＳとＭＵＧを除いた各成分について、各成分濃度が標準規定濃度の１１倍高くなるように、室温で各成分に水を添加・混合し、９０℃で加温溶解を行い、次いで室温に戻すことで培地Ｂ（１００ミリリットル）を作製した。そして、培地Ｂを２０℃で保存した場合、何日後に沈殿が生じるかを調べた。この結果、４〜７日後に沈殿を生じることが確認された。
【００３２】
【表３】
【００３３】
（参考例３：培地１〜４（×１１）の作製）
表４に示すように、上記「参考例２」で用いた培地Ｂを基準として、トリプトースとＸＧａｌのうち、いずれか一の成分または両成分を除いた培地１〜４を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存した場合、７日後，３０日後及び６０日後に各培地の状態を調べた。また、培地１と培地４は、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）にＸＧａｌを溶解させた組成物と、水に上記以外の成分を溶解させた組成物とを混合し、９０℃で加温溶解を行い、次いで室温に戻すことで作製した。これはＸＧａｌの水溶性が低いためである。この結果、培地１と培地３はそれぞれ３０日後に沈殿を生じること、培地４は６０日後でも沈殿を生じないが７日後に着色すること、培地２は６０日後でも沈殿を生じず、かつ着色もしないことが確認された。培地１〜培地３の結果から、沈殿の原因はトリプトースとＸＧａｌであることが分かる。また、培地１と培地４の結果から、ＤＭＦを増量すると沈殿は抑制されるが、着色が激しくなることが確認された。したがって、ＸＧａｌを１１倍濃度溶解させる場合、他の溶剤を用いる必要があることが分かった。
【００３４】
【表４】
【００３５】
（参考例４：培地５（×１１）と培地６（×２２）の作製）
表５に示すように、上記「参考例２」で用いた培地Ｂを基準として、栄養源をソルビトール，トリプトース及びトリプトファンに代えてピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地で配合されるペプトンを使用するとともに、ＸＧａｌを配合成分から除いた培地５（×１１）と培地６（×２２）を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存して、１日後，７日後，３０日後及び６０日後に各培地の状態を調べた。この結果、培地５は、６０日後でも沈殿を生じず、かつ着色もしないことが確認された。一方、培地６は、６０日後に沈殿を生じることが確認された。
【００３６】
【表５】
【００３７】
（参考例５：ＸＧａｌの着色を抑制する溶剤の検討）
表５に示すように、ＤＭＦ，ＰＧ（プロピレングリコール）及び１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液のうち一種以上を溶剤としてＸＧａｌを溶解させた溶液７〜１０を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存して、１日後，７日後，３０日後及び６０日後に各溶液の状態を調べた。この結果、表５から明らかなように、ＸＧａｌの着色を抑制するには、溶剤としてＤＭＦよりＰＧの方が適していること、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加して溶液のｐＨを上昇させることが好ましいことが分かった。
【００３８】
（実施例１：ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を基準とした配合処方の検討）
表１に記載したピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地の配合成分のうち、ＳＤＳとＭＵＧを除くとともに、ＰＧとＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を配合し、濃縮倍率を１１〜２５倍，ＰＧ濃度を２０〜４０％（w/v）に設定した培地７〜１６を作製し（いずれも１００ミリリットル）、２０℃で保存して、３０日後，６０日後及び１２０日後に各培地の状態を調べた（表６参照）。上記各培地は、塩化ナトリウム，硝酸カリウム，リン酸二水素カリウム，リン酸水素二カリウム，ペプトン，ＩＰＴＧ及びピルビン酸ナトリウムを水に溶解させた組成物と、ＸＧａｌをＰＧと１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の混液に溶解させた組成物とを２０℃で混合して作製した。この結果、ＰＧ濃度が２０％(w/v)及び３０％（w/v）で、濃縮倍率１１〜２０倍の培地では、１２０日後でも沈殿を生じないことが確認された。
【００３９】
【表６】
【００４０】
（実施例２：低温での保存安定性に優れた培地処方の検討）
表６のうち、濃縮倍率が２０倍，ＰＧ濃度が２０％(w/v)の培地１１の配合処方を基準として、リン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムの濃縮倍率を２０倍，１０倍及び５倍に設定した培地１７〜１９（培地１７は培地１１と同一の成分組成である）を作製し（いずれも１００ミリリットル）、−５℃で保存して、６０日後に各培地の状態を調べた(表７参照)。この結果、培地１９（上記リン酸塩の濃縮倍率：５倍）は６０日後でも沈殿を生じなかったのに対し、培地１７（上記リン酸塩の濃縮倍率：２０倍）及び培地１８（上記リン酸塩の濃縮倍率：１０倍）は６０日後に沈殿を生じることが確認された。したがって、低温における保存安定性を高めるには、リン酸塩の濃縮倍率を５倍程度に設定することが好ましいといえる。
【００４１】
【表７】
【００４２】
（実施例３：標準濃度培地Ａの選択性、発色性の検討）
表７に示した培地のうち、低温保存性に優れる培地１９を水で２０倍希釈した標準濃度培地Ａを用いて表８に示す各種菌株Ａ〜Ｌを培養した（なお、菌株Ｌは水のみからなるブランクである）。具体的には、水７ミリリットルに培地１９を３５０マイクロリットル添加し、オートクレーブ（１２１℃，１５分）した後、Ａ〜Ｌ溶液を添加し（菌数は１０個で、これは溶液の添加量にてコントロールした）、３６℃で３８時間培養し、２０時間後，２４時間後及び３８時間後における各培地の発色の程度を目視観察した。対照として、表１に記載のピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地を用い、該培地７ミリリットルをオートクレーブ（１２１℃，１５分）した後、Ａ〜Ｌ溶液を添加し（菌数は１０個で、これは溶液の添加量にてコントロールした）、３６℃で３８時間培養し、２０時間後，２４時間後及び３８時間後における各培地の発色の程度を目視観察した。表９に結果を示す。
【００４３】
【表８】
【００４４】
【表９】
【００４５】
表９から明らかなとおり、菌株Ｆ（K.pneumoniae）を除く全ての菌株について、標準濃度培地Ａはピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地と同じ選択性を示した。菌株Ｆは大腸菌群であるが、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地では偽陰性を示す一方、標準濃度培地Ａでは陽性を示した。このことから、標準濃度培地Ａは大腸菌群に対する選択性に優れていることがいえる。また、培養時間毎の発色性についても標準濃度培地Ａはピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地と同等だった。
【００４６】
（実施例４：雑菌が存在する場合の選択性評価）
標準濃度培地Ａには、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地に添加されているＳＤＳ（グラム陽性菌の抑制剤）が配合されていない。そこで、グラム陽性菌等の雑菌が過剰量存在する場合でも、標準濃度培地Ａがピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地と同程度に大腸菌群を検出できるか否か調べた。具体的には、上記菌株Ａ〜Ｌのうち、菌株Ｇ（P.aeruginosa；グラム陰性菌）と菌株Ｉ（S.aureus；グラム陽性菌）を雑菌とし、菌株Ｇと菌株Ｉをそれぞれ１００００個、及び上記菌株Ａ〜Ｆ，Ｈ及びＪ〜Ｌのうち１種を１０個共存させ、上記「実施例３」と同様に培養した。表１０に結果を示す。
【００４７】
【表１０】
【００４８】
表１０から、培養時間２０時間では多少の相違はあるものの、２４時間及び３８時間では、菌株Ｆを含む雑菌を培養した場合を除き、標準濃度培地Ａとピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は同等の選択性、発色性を示した。
【００４９】
（実施例５：酸消費量（ｐＨ４．８）の影響）
表７に示す培地１９について、大腸菌群の検出選択性に及ぼす酸消費量（ｐＨ４．８）の影響を調べるため、培地１９を水で２０倍希釈した標準濃度培地Ａと培地１９を酸消費量（ｐＨ４．８）が２５０mg／リットルの水溶液で２０倍希釈した標準濃度培地Ｂを作製し、添加時の菌数が２０個であること以外は上記「実施例３」と同様に菌株Ａ〜Ｆ，Ｈ，Ｊ，Ｋ及びＬを培養した。表１１に結果を示す。上述した酸消費量（ｐＨ４．８）が２５０mg／リットルの水溶液は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）に水を加えて調製したものである。表１１から、標準濃度培地Ａを用いた場合と標準濃度培地Ｂを用いた場合とを対比すると、本試験に供した菌株の全てについて培養３８時間後の発色性に両者間で有意差は認められなかった。したがって、培地１９は、被検体中に酸消費量（ｐＨ４．８）が多く含まれている場合でも、大腸菌群の検出選択性は影響されないことが分かった。
【００５０】
【表１１】
【００５１】
（実施例６：エオシンＹ配合培地の作製）
培地１９を基準として、さらにエオシンＹを配合した培地２０を作製し（表１２参照）、実施例３と同様の方法で培地２０を用いて表８に示す菌株Ｅ（E.coli；大腸菌）を３６℃で２２時間培養した。そして、得られた培地のうち、１０ミリリットルを分光光度計用セルに移し、このセルを分光光度計（株式会社日立製作所製Ｕ−２０１０，石英セル長：２５mm）にセットし、室温下、波長４００〜８００nmの吸収スペクトルを測定した。図１に得られた吸収スペクトルを示す。また、対照として、培地１９を上記と同様の方法で培養し、得られた培地の吸収スペクトルを測定した。さらに、図１には、培地２０中のエオシンＹと同濃度になるように、エオシンＹを純水に溶解させたエオシンＹ溶解液の吸収スペクトルも併せて示した。
【００５２】
【表１２】
【００５３】
図１から、培養後の培地２０の吸収スペクトルのうち、エオシンＹの吸収ピーク（４５０〜５６０ｎｍ）は、培地２０に含まれるＸＧａｌがβ−ガラクトシダーゼと反応して生成した青〜青緑色の発色物質の吸収ピーク（６００〜７００ｎｍ）と重ならないことが確認された。したがって、大腸菌群判定装置に本発明の培地を適用する場合、培地２０のようにエオシンＹを含有させたものを用いるようにすれば、培養前に所定量の培地が添加されたか否かを確実に判定することができるとともに、大腸菌群の判定結果にも影響を与えないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、被検体中の大腸菌群の有無を自動的に判定する装置に適用される大腸菌群検査用濃縮培地、該培地の製造方法及び大腸菌群の判定方法として広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】エオシンＹを含有する培地を用いて、大腸菌群の判定結果に与えるエオシンＹの影響を調べた吸収スペクトルである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有することを特徴とする、大腸菌群検査用培地。
【請求項２】
（Ｃ）成分１．５〜２．２％（w/v）と（Ｄ）成分６．０〜８．８％（w/v）に代えて、（Ｃ）成分０．１〜０．８％（w/v）と（Ｄ）成分０．４〜３．２％（w/v）を含有する、請求項１記載の大腸菌群検査用培地。
【請求項３】
（Ｋ）成分として（Ｆ）成分がβ−ガラクトシダーゼと反応して生成する発色物質の示す波長領域に吸収ピークを示さない色素をさらに含有する、請求項１又は２記載の大腸菌群検査用培地。
【請求項４】
（Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分及び（Ｊ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、請求項１又は２記載の大腸菌群検査用培地の製造方法。
【請求項５】
（Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分，（Ｊ）成分及び（Ｋ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、請求項３記載の大腸菌群検査用培地の製造方法。
【請求項６】
培養手段及び透過率測定手段を備えた装置を用いて、請求項１〜３のいずれかに記載の培地を水で１５〜２２倍希釈して得られる標準濃度培地に被検体を加えて培養し、培養後の前記培地の透過率を検出することで、前記培地の発色の有無を判定することを特徴とする大腸菌群の判定方法。
【請求項１】
（Ａ）塩化ナトリウム７．５〜１１．０％（w/v），（Ｂ）硝酸カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｃ）リン酸二水素カリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｄ）リン酸水素二カリウム６．０〜８．８％（w/v），（Ｅ）ペプトン７．５〜１１．０％（w/v），（Ｆ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｇ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド０．１５〜０．２２％（w/v），（Ｈ）ピルビン酸ナトリウム１．５〜２．２％（w/v），（Ｉ）プロピレングリコール２０〜３０％（w/v）及び（Ｊ）水を含有することを特徴とする、大腸菌群検査用培地。
【請求項２】
（Ｃ）成分１．５〜２．２％（w/v）と（Ｄ）成分６．０〜８．８％（w/v）に代えて、（Ｃ）成分０．１〜０．８％（w/v）と（Ｄ）成分０．４〜３．２％（w/v）を含有する、請求項１記載の大腸菌群検査用培地。
【請求項３】
（Ｋ）成分として（Ｆ）成分がβ−ガラクトシダーゼと反応して生成する発色物質の示す波長領域に吸収ピークを示さない色素をさらに含有する、請求項１又は２記載の大腸菌群検査用培地。
【請求項４】
（Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分及び（Ｊ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、請求項１又は２記載の大腸菌群検査用培地の製造方法。
【請求項５】
（Ａ）〜（Ｅ）成分，（Ｇ）成分，（Ｈ）成分，（Ｊ）成分及び（Ｋ）成分が混合されてなる組成物と、（Ｆ）成分，（Ｉ）成分及び（Ｌ）成分としてｐＨ約８のｐＨ緩衝液が混合されてなる組成物と、を室温で混合することを特徴とする、請求項３記載の大腸菌群検査用培地の製造方法。
【請求項６】
培養手段及び透過率測定手段を備えた装置を用いて、請求項１〜３のいずれかに記載の培地を水で１５〜２２倍希釈して得られる標準濃度培地に被検体を加えて培養し、培養後の前記培地の透過率を検出することで、前記培地の発色の有無を判定することを特徴とする大腸菌群の判定方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−３０６９３０（Ｐ２００８−３０６９３０Ａ）
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３７４０２（Ｐ２００７−１３７４０２）
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（０００１７５２７２）三浦工業株式会社 (1,055)
【出願人】（５０４１４３５２２）株式会社三浦プロテック (488)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（０００１７５２７２）三浦工業株式会社 (1,055)
【出願人】（５０４１４３５２２）株式会社三浦プロテック (488)
【Ｆターム（参考）】
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