好熱性リパーゼ産生菌およびその利用
【課題】コンポスト等の高温条件下においても生存可能なリパーゼ活性を有する好熱菌を提供すること。
【解決手段】生育可能温度が５５〜８０℃および生育至適温度が７０〜７５℃であり、リパーゼ活性を有するテルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）または生育可能温度が４５〜７５℃および生育至適温度が６０〜６５℃であり、リパーゼ活性を有するゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）。
【解決手段】生育可能温度が５５〜８０℃および生育至適温度が７０〜７５℃であり、リパーゼ活性を有するテルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）または生育可能温度が４５〜７５℃および生育至適温度が６０〜６５℃であり、リパーゼ活性を有するゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は好熱性リパーゼ産生菌およびその利用に関し、更に詳細には、８０℃程度の高温においても生育可能な好熱性リパーゼ産生菌およびこのリパーゼ産生菌ならびにその分泌物を含有する油脂分解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
油脂分解酵素であるリパーゼは、アミラーゼやプロテアーゼとともに三大消化酵素の１つとして重視され、医学、生理学、生化学など種々の視点から多くの研究が手がけられている。現在までに、リパーゼは動物のみならず、植物、微生物に至るまで広く存在することが知られている。
【０００３】
現在では、リパーゼは微生物から安定な状態で取得され、取り扱えるようになっており、各方面でリパーゼの工業的生産が行われ、その生産技術も次第に確立されてきている。
【０００４】
上記のようにリパーゼは油脂分解酵素であり、家庭、飲食店、工場等からの廃水中の油脂処理や、医療、洗剤あるいはエステル合成等に利用されているが、それらの用途に応じて特殊な用途を有するものも多数提供されている。
【０００５】
一方、近年ゴミ等の廃棄物処理方法の一つとして、コンポスト法が注目を浴びている。コンポスト法では、特に生ゴミ等を微生物の作用により分解し、最終的に肥料として利用しようとするものである。このコンポスト法では、コンポスト中の微生物が、ゴミに含まれる有機物をアルコール類、有機酸、二酸化炭素に分解し、その過程で発熱するが、従来のコンポスト法の場合、その発熱は、６０〜８０℃の温度が１日続く程度であった。
【０００６】
しかし、改良された最近のコンポスト法では、上記した発熱は、９０℃またはそれ以上の温度が１週間近く続くため、このような高温下において生育可能なコンポスト用微生物が求められており、これはリパーゼ生産菌についても例外でない。また、一般の油脂についても、常温で固体状のものも多いことから、これらが溶解する高温で生育し、リパーゼを産生するリパーゼ産生菌の提供も求められいるが、その様な菌はあまり報告されていないのが実情であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明はコンポスト等の高温条件下においても生育可能で、リパーゼ活性を有する好熱性のリパーゼ産生菌の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記した微生物を見出すべく、種々の検索を行った結果、高温コンポストにより得られた堆肥中からリパーゼ活性を有する新規好熱菌を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、生育可能温度が４５〜８０℃、生育至適温度が６０〜７５℃の範囲にある好熱性リパーゼ産生菌を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、生育可能温度が５５〜８０℃、生育至適温度が７０〜７５℃の範囲にあり、テルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）に属する上記好熱性リパーゼ産生菌を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、生育可能温度が４５〜７５℃、生育至適温度が６０〜６５℃の範囲にあり、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に属する上記好熱性リパーゼ産生菌を提供するものである。
【００１２】
更にまた、本発明は上記の好熱性リパーゼ産生菌の１種または２種以上、それらの培養外液およびそれらから採取される酵素を含有する油脂分解剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の好熱性リパーゼ産生菌は、高温条件下においても生育し、リパーゼを生産するものである。
【００１４】
従って、本発明の好熱性リパーゼ産生菌、それらの培養外液およびそれらから採取される酵素を、高温型コンポスト等や常温で固形の油脂の分解など、高温下における油脂分解が必要な場において好適に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の好熱性リパーゼ産生菌は、前記したようにその生育可能温度が４５〜８０℃で、生育至適温度が６０〜７５℃の範囲にあるものである。このような好熱性リパーゼ産生菌は、例えば、高温型コンポストより得られた堆肥から分離、取得することができる。より具体的には、例えば、滅菌した液状培地中に高温コンポスト堆肥を懸濁させ、これを７０℃以上の温度で所定時間培養させた後、この上清を固形培地上に接種し、生育したコロニー中からリパーゼ活性を有するものを選抜することにより得られる。
【００１６】
後記するように、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列により解析した結果、本発明者らがこのようにして得た本発明の好熱性リパーゼ産生菌には、テルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）に属するものとゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に属するものが含まれていることが明らかになった。
【００１７】
具体的に、本発明者が見出したテルモエロバクター・サブテラネウスの代表的なものとして、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５およびＣＬＰＴ０８と名付けた３種が、またゲオバシルス・ステアロテルモフィルスの代表的なものとして、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３と名付けた２種が挙げられるので、以下これらについて順次説明する。
【００１８】
テルモエロバクター・サブテラネウスに属する好熱性リパーゼ産生菌の菌学的性質：
【００１９】
＜形態＞
【表１】
【００２０】
＜生育状態＞
【表２】
【００２１】
＜生理学的性質＞
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】
＜リパーゼ活性＞
トリブチリン（Tribuyrin）、ｏ−ニトロフェニル ラウレート（o-Nitrophenyl laurate）、ｐ−ニトロフェニル パルミテート（p-nitrophenyl palmitate）の分解活性を有する。
【００２４】
上記したＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５およびＣＬＰＴ０８の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を近隣接合法（Saito et al., Mol. Biol. Evol., 4, 406-25.）により解析し、これに基づき記載した系統樹を図１に示す。この結果から上記各菌株はテルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）であると判断した。
【００２５】
なお、本出願人らはこれらを、各々２００４年７月２日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１１、ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１２およびＦＥＲＭ Ｐ−２０１１３）。
【００２６】
ゲオバシルス・ステアロテルモフィルスに属する好熱性リパーゼ産生菌の菌学的性質：
【００２７】
＜形態＞
【表５】
【００２８】
＜生育状態＞
【表６】
【００２９】
＜生理学的性質＞
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
＜リパーゼ活性＞
トリブチリン、ｏ−ニトロフェニル ラウレートの分解活性を有する。
【００３２】
上記したＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、近隣接合法（Saito et al., Mol. Biol. Evol., 4, 406-25.）により解析し、これに基づき記載した系統樹（図１）からこれら微生物はゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）であることが判明した。
【００３３】
なお、本出願人らはこれら微生物を、各々２００４年４月２２日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００１６およびＦＥＲＭ Ｐ−２００１７）。
【００３４】
以上説明した、本発明の好熱性リパーゼ産生菌は、これを培養することにより、その培養物中にリパーゼを産生させることができ、必要により、精製等をおこなって耐熱性リパーゼを採取することができる。また、好熱性リパーゼ産生菌の１種または２種以上もしくはそれらの培養外液や前記耐熱性リパーゼを使用し、必要に応じて適当な担体と組み合わせることにより、高温においても作用する油脂分解剤とすることができる。
【００３５】
上記油脂分解剤は、高温下での油脂分解の用途に使用でき、例えば、高温型コンポストや、常温で固体の油脂を加温し、液状として分解させる用途等に使用することが好ましい。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は何らこれらに制約されるものではない。
【００３７】
実 施 例 １
リパーゼを産生する好熱菌のスクリーニング：
液状の培地１（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２ ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ）を、水酸化ナトリウムでｐＨを８に調整した後、オートグレーブ（１２１℃、１５分）で加熱殺菌した。この培地に、−８０℃で保存していた堆肥（発酵温度９６℃の高温型コンポストで製造された）を約２００ｍｇ加え、懸濁させた。この懸濁物を７０℃で３時間インキュベートした。別途調製した培地１に１.５％の寒天を加えて固形の培地２を得た。この培地２のプレートに上記インキュベート物の上清の５０μｌまたは２００μｌを植菌し、７０℃で培養した。
【００３８】
プレート上にコロニーが形成された後、ランダムにコロニーを選択し、基質である０.５％（vol/vol）トリブチリン(Tributyrin：ナカライテスク株式会社)の入った培地３のプレートに白金針にて植菌し、７０℃で培養した。その結果を図２に示した。なお、前記培地３としては１.５％の寒天の入った培地１をオートクレーブした後、５０ｍｌのコーニングチューブにこの培地を２５ｍｌ、トリブチリンを１２５μｌ加え、蓋をしめ、トリブチリンの粒が見えなくなるまで振り、シャーレに注いで固まったものを使用した。トリブチリンの入ったプレートは白く濁っており、リパーゼを産生する菌の周辺はトリブチリンの分解により透明となるためハローが形成される。
【００３９】
上記培養により、ハローが形成されるか若しくは菌の増殖速度が高いものとして、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５、ＣＬＰＴ０８、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３を選択した。
【００４０】
実 施 例 ２
リパーゼ活性の測定：
直径１８ｍｍの試験管に、前記培地１を５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になったものを測定用に使用した。この培養液を１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管にとり、５,０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件で遠心し、上清を除いた。そこに同量の０.０５Ｍのリン酸バッファー（ｋｐｉ；ｐＨ７.６）を加え、菌を縣濁した。その菌溶液を１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管にそれぞれ１００μｌ分注した。１００μｌの菌溶液が入った１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管に、０.０５Ｍのｋｐｉ（ｐＨ７.６）を８００μｌ、０.０１Ｍの後記の基質１００μｌを加えて混合し、７０℃で０分、３０分、６０分、１２０分の時間でインキュベートした。基質としては、ｐ−ニトロフェニル パルミテート（ｐ−ＮＰＰ）およびｏ−ニトロフェニル ラウレート（ｏ−ＮＰＬ）（共にＳＩＧＭＡ製）を用いた。
【００４１】
インキュベート後、１００ｍＭの炭酸ナトリウムを１２５μｌ加え、混合した。次いで、１３,０００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件で遠心し、上清を新しい１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管に移した。上清の吸光度(Abs.)は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、ｐ−ＮＰＰは４３０ｎｍ、ｏ−ＮＰＬは４２０ｎｍで測定した。その結果をそれぞれ図３（ｐ−ＮＰＰ活性のなかったＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の結果は図示せず）および図４に示した。リパーゼ活性のあるものは、基質からフェニル基が生成されるため吸光度の値が高くなった。
【００４２】
上記測定により、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５、ＣＬＰＴ０８、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の何れにもリパーゼ活性があることが分かった。
【００４３】
実 施 例 ３
顕微鏡による観察：
＜グラム染色＞
グラム染色のため菌溶液１０μｌをスライドガラスにのせ、火炎固定した。グラム溶液Ａ（クリスタルバイオレット溶液：和光純薬工業製）の２μｌをスライドガラス上に滴下し、１分間染色した。ＭｉｌｌｉＱで洗浄後、グラム溶液Ｂ（ルゴール液：和光純薬工業製）の１０μｌを添加し、１分間放置した。最後にグラム溶液Ｃ（サフラン溶液：和光純薬工業製）を１０μｌ添加し、１分間染色した。ＭｉｌｌｉＱで洗浄、乾燥後、カバーガラスをかぶせ、マニキュアで封じ、微分干渉顕微鏡（ＢＸ６０（オリンパス製）：１,０００倍）で観察した。その結果を図５に示した。なお、ポジティブコントロールとしてバシルス・サブチルス（Bacillus subtills）、ネガティブコントロールとしてエシェリシア・コリ（Escherichia coli）を使用した。
【００４４】
グラム染色の結果、何れの菌株も染色されず、グラム陰性であった。
【００４５】
＜形態観察＞
各菌株の大きさおよびべん毛の有無を確認するため透過型電子顕微鏡で観察した（図６）。また、その結果を表９に示した。
【００４６】
【表９】
【００４７】
実 施 例 ４
至適生育条件等の検討：
＜生育ｐＨおよび至適生育ｐＨ＞
培地１のｐＨを塩酸または水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６〜９.５まで０.５刻みで調整して室温条件で使用した。直径１８ｍｍの試験管に各ｐＨの培地５ｍｌ、菌溶液１００μｌを加え７０℃で一晩振盪培養した。培養後の６６０ｎｍの吸光度を分光光度計（スペクトロニック２０Ａ：島津製作所製）で測定した。測定は各３回行い、その平均値から至適ｐＨを検討した。
【００４８】
上記測定の結果、ＣＬＰＴ０１の生育ｐＨは６.０〜９.０、至適生育ｐＨは８.０であり、ＣＬＰＴ０５の生育ｐＨは６.５〜８.５、至適生育ｐＨは８.０であり、ＣＬＰＴ０８の生育ｐＨは６.５〜９.０、至適生育ｐＨは８.０であった。また、ＣＬＰＴ１１の生育ｐＨは６.０〜８.５、至適生育ｐＨは７.０であり、ＣＬＰＴ１３の生育ｐＨは６.０〜８.５、至適生育ｐＨは７.５であった。
【００４９】
＜生育塩化ナトリウム濃度および至適生育塩化ナトリウム濃度＞
培地１に塩化ナトリウムを加えて、塩化ナトリウム濃度を０〜５質量％まで０.５質量％刻みで調整して室温条件で使用した。直径１８ｍｍの試験管に各塩化ナトリウム濃度の培地５ｍｌ、菌溶液１００μｌを加え７０℃で一晩振盪培養した。培養後の６６０ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。測定は各３回行い、その平均値から至適生育塩化ナトリウム濃度を検討した。
【００５０】
上記測定の結果、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５、ＣＬＰＴ０８、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の生育塩化ナトリウム濃度は３.５％以下であり、至適生育塩化ナトリウム濃度は０.５％であった。
【００５１】
＜生育温度、至適生育温度および世代時間＞
上記測定において、振盪培養時の温度を６０〜８０℃まで５℃刻みで調整して、それぞれ成長曲線を作成した（図７）。得られた曲線から対数増殖期での世代を計算した。
【００５２】
上記測定の結果、ＣＬＰＴ０１は１２０分（７０℃）、ＣＬＰＴ０５は（７０分）、ＣＬＰＴ０８は（６０分）ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３は１０分（６５℃）であった。
【００５３】
試 験 例 １
菌体培養上清のリパーゼ活性の測定：
＜温度耐性＞
エタノールに溶かした１０ｍＭのｏ−ニトロフェニルラウレートを１００μｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７.６）を８００μｌ、上清１００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、５,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、１２０分、５５−８０℃の範囲、５℃間隔でインキュベートを行った。インキュベート後、１０ｍＭの炭酸ナトリウムを２５０μｌ加え、１３,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心した。遠心後、その上清を新しい１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移した。上清の吸光度（Abs.）は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４０５ｎｍで測定した。その結果を図８に示した。なお、４０５ｎｍの時のＰＮは、１.４５７×１０５ｃｍ２ｍｏｌ−１で計算した。
【００５４】
上記測定の結果、分解活性が最も高い温度は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に７５℃であり、ＣＬＰＴ１１および１３が共に６０℃であった。温度範囲は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に６０−８０℃、ＣＬＰＴ１１および１３が共に５５−６０℃であった。
【００５５】
＜ｐＨ耐性＞
酵素反応を行うにあたり、ｐＨの調整に以下のバッファーを使用した。
ｐＨ４.０−６.０：酢酸ナトリウムバッファー
ｐＨ６.０−７.５：リン酸カルシウムバッファー
ｐＨ７.０−１０.０：トリス−塩酸バッファー
ｐＨ９.０−１０.０：グリシン−水酸化ナトリムバッファー
【００５６】
エタノールに溶かした１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルラウレートを１００μｌ、１０ｍＭの各バッファーを８００μｌ、上清の１００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、６,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で、３０分インキュベートを行った。インキュベート後、１０ｍＭの炭酸ナトリウムを２５０μｌ加え、１３,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心した。遠心後、上清を新しい１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移した。上清の吸光度は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４０５ｎｍで測定した。その結果を図９に示した。なお、４０５ｎｍの時のＰＮは、１.４５７×１０５ｃｍ２ｍｏｌ−１で計算した。
【００５７】
上記測定の結果、分解活性が最も高いｐＨは、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に８.０であり、ＣＬＰＴ１１は７.０であり、ＣＬＰＴ１３は７.５であった。ｐＨ範囲は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に６.０−９.０、ＣＬＰＴ１１および１３が共に６.０−８.０であった。
【００５８】
＜基質特異性＞
（１）ニトロフェニルエステル類
菌体培養上清の基質特異性を、基質として以下の炭素数を有するニトロフェニルエステル類を用いて検討した。
ｐ−ニトロフェニルアセテート（Ｃ２）
ｐ−ニトロフェニルブチレート（Ｃ４）
ｐ−ニトロフェニルカプリレート（Ｃ８）
ｐ−ニトロフェニルカプレート（Ｃ１０）
ｐ−ニトロフェニルラウレート（Ｃ１２）
ｏ−ニトロフェニルミリステート（Ｃ１４）
ｐ−ニトロフェニルパルミテート（Ｃ１６）
ｏ−ニトロフェニルステアレート（Ｃ１８）
【００５９】
エタノール、アセトニトリルまたはイソプロパノールに溶かした１０ｍＭの各基質を１００μｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７.６）を８００μｌ、上清の１００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、６,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、 ０５および０８は７０℃で６０分インキュベートを行った。インキュベート後、１０ｍＭの炭酸ナトリウムを２５０μｌ加え、１,３０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心した。遠心後、上清を新しい１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移した。上清の吸光度（Abs.）は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４２０ｎｍで測定した。その結果を図１０に示した。なお、菌体培養上清の基質特異性は、ｐ−ニトロフェニルカプレートの活性を１００％として計算した。
【００６０】
上記測定の結果、分解活性が最も高い基質は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共にＣ１２であり、ＣＬＰＴ１１および１３が共にＣ１０であった。分解活性があった鎖長は、ＣＬＰＴ０１および０５が共にＣ２−Ｃ１８であり、ＣＬＰＴ０８はＣ２−Ｃ１６であり、ＣＬＰＴ１１はＣ２−Ｃ１２であり、ＣＬＰＴ１３はＣ２−Ｃ１０であった。
【００６１】
（２）トリグリセロール類
菌体培養上清の基質特異性を、基質として以下の炭素数を有するトリグリセロール類を用いて検討した。
トリアセチン（Ｃ２）
トリブチリン（Ｃ４）
トリカプリリン（Ｃ８）
トリカプリン（Ｃ１０）
トリラウリン（Ｃ１２）
トリミリスチン（Ｃ１４）
トリパルミチン（Ｃ１６）
【００６２】
各基質、蒸留水および０.２ｍＭのアラビアゴムをＦａｓｔＰｒｅｐ、ＢＩＯ１０１（Qbiogene製）を用いてスピード６.０、２分で乳化させ、１００ｍＭの基質溶液をそれぞれ調製した。これらの基質溶液を１００μｌ、上清の９００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、６,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに混ぜ、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で、１８時間インキュベートを行った。インキュベート後、試験管に反応物の４５０μｌを移し、直ぐに３Ｍの塩酸を２５０μｌ加え、さらにｎ−ヘキサンを３ｍｌ加えた。ボルテックスを用いて２分で脂肪酸を抽出し、新しい試験管に抽出した有機層２.５ｍｌを移した。そこに、銅試薬（９０ｍＭの酢酸銅（II）１水和物溶液を調製し、ピリジンでｐＨを６.１に調製したもの）の０.５ｍｌを加え、ボルテックスを１.５分行い、更に、遠心後に有機層の２ｍｌを新しい試験管に移した。ジエチルジチオカルバミン酸を無水エタノールで溶かし、５.８ｍＭに調製したクロモジェニック試薬を０.４ｍｌ加え混ぜた。有機層の吸光度（Abs.）は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４３０ｎｍで測定した。その結果を図１１に示した。なお、菌体培養上清の基質特異性は、トリカプリリンの活性を１００％として計算した。
【００６３】
上記測定の結果、分解活性が最も高い基質は、ＣＬＰＴ０１、０５、０８、１１および１３が共にＣ８であった。分解活性があった鎖長は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共にＣ２−Ｃ１６であり、ＣＬＰＴ１１および１３はＣ２−Ｃ１４であった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の新規好熱菌は、高温条件下においてもリパーゼ活性を有するので、高温型コンポスト等に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、本発明微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列に基づく系統樹を示す図面である。
【図２】図２は、トリブチリンを基質とした培地上でのリパーゼ活性を有する好熱菌のスクリーニングの結果を示す写真である。
【図３】図３は、本発明微生物のｐ−ＮＰＰ活性を示す図面である。
【図４】図４は、本発明微生物のｏ−ＮＰＬ活性を示す図面である。
【図５】図５は、本発明微生物のグラム染色の結果を示す写真である。
【図６】図６は、本発明微生物の透過型電子顕微鏡写真である。
【図７】図７は、本発明微生物の振盪培養時の成長曲線を示す図面である。
【図８】図８は、本発明微生物の菌体培養上清の温度耐性を示す図面である。
【図９】図９は、本発明微生物の菌体培養上清のｐＨ耐性を示す図面である。
【図１０】図１０は、本発明微生物の菌体培養上清の基質特異性（ニトロフェニルエステル類）を示す図面である。
【図１１】図１１は、本発明微生物の菌体培養上清の基質特異性（トリグリセロール類）を示す図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は好熱性リパーゼ産生菌およびその利用に関し、更に詳細には、８０℃程度の高温においても生育可能な好熱性リパーゼ産生菌およびこのリパーゼ産生菌ならびにその分泌物を含有する油脂分解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
油脂分解酵素であるリパーゼは、アミラーゼやプロテアーゼとともに三大消化酵素の１つとして重視され、医学、生理学、生化学など種々の視点から多くの研究が手がけられている。現在までに、リパーゼは動物のみならず、植物、微生物に至るまで広く存在することが知られている。
【０００３】
現在では、リパーゼは微生物から安定な状態で取得され、取り扱えるようになっており、各方面でリパーゼの工業的生産が行われ、その生産技術も次第に確立されてきている。
【０００４】
上記のようにリパーゼは油脂分解酵素であり、家庭、飲食店、工場等からの廃水中の油脂処理や、医療、洗剤あるいはエステル合成等に利用されているが、それらの用途に応じて特殊な用途を有するものも多数提供されている。
【０００５】
一方、近年ゴミ等の廃棄物処理方法の一つとして、コンポスト法が注目を浴びている。コンポスト法では、特に生ゴミ等を微生物の作用により分解し、最終的に肥料として利用しようとするものである。このコンポスト法では、コンポスト中の微生物が、ゴミに含まれる有機物をアルコール類、有機酸、二酸化炭素に分解し、その過程で発熱するが、従来のコンポスト法の場合、その発熱は、６０〜８０℃の温度が１日続く程度であった。
【０００６】
しかし、改良された最近のコンポスト法では、上記した発熱は、９０℃またはそれ以上の温度が１週間近く続くため、このような高温下において生育可能なコンポスト用微生物が求められており、これはリパーゼ生産菌についても例外でない。また、一般の油脂についても、常温で固体状のものも多いことから、これらが溶解する高温で生育し、リパーゼを産生するリパーゼ産生菌の提供も求められいるが、その様な菌はあまり報告されていないのが実情であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明はコンポスト等の高温条件下においても生育可能で、リパーゼ活性を有する好熱性のリパーゼ産生菌の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記した微生物を見出すべく、種々の検索を行った結果、高温コンポストにより得られた堆肥中からリパーゼ活性を有する新規好熱菌を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、生育可能温度が４５〜８０℃、生育至適温度が６０〜７５℃の範囲にある好熱性リパーゼ産生菌を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、生育可能温度が５５〜８０℃、生育至適温度が７０〜７５℃の範囲にあり、テルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）に属する上記好熱性リパーゼ産生菌を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、生育可能温度が４５〜７５℃、生育至適温度が６０〜６５℃の範囲にあり、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に属する上記好熱性リパーゼ産生菌を提供するものである。
【００１２】
更にまた、本発明は上記の好熱性リパーゼ産生菌の１種または２種以上、それらの培養外液およびそれらから採取される酵素を含有する油脂分解剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の好熱性リパーゼ産生菌は、高温条件下においても生育し、リパーゼを生産するものである。
【００１４】
従って、本発明の好熱性リパーゼ産生菌、それらの培養外液およびそれらから採取される酵素を、高温型コンポスト等や常温で固形の油脂の分解など、高温下における油脂分解が必要な場において好適に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の好熱性リパーゼ産生菌は、前記したようにその生育可能温度が４５〜８０℃で、生育至適温度が６０〜７５℃の範囲にあるものである。このような好熱性リパーゼ産生菌は、例えば、高温型コンポストより得られた堆肥から分離、取得することができる。より具体的には、例えば、滅菌した液状培地中に高温コンポスト堆肥を懸濁させ、これを７０℃以上の温度で所定時間培養させた後、この上清を固形培地上に接種し、生育したコロニー中からリパーゼ活性を有するものを選抜することにより得られる。
【００１６】
後記するように、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列により解析した結果、本発明者らがこのようにして得た本発明の好熱性リパーゼ産生菌には、テルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）に属するものとゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に属するものが含まれていることが明らかになった。
【００１７】
具体的に、本発明者が見出したテルモエロバクター・サブテラネウスの代表的なものとして、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５およびＣＬＰＴ０８と名付けた３種が、またゲオバシルス・ステアロテルモフィルスの代表的なものとして、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３と名付けた２種が挙げられるので、以下これらについて順次説明する。
【００１８】
テルモエロバクター・サブテラネウスに属する好熱性リパーゼ産生菌の菌学的性質：
【００１９】
＜形態＞
【表１】
【００２０】
＜生育状態＞
【表２】
【００２１】
＜生理学的性質＞
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】
＜リパーゼ活性＞
トリブチリン（Tribuyrin）、ｏ−ニトロフェニル ラウレート（o-Nitrophenyl laurate）、ｐ−ニトロフェニル パルミテート（p-nitrophenyl palmitate）の分解活性を有する。
【００２４】
上記したＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５およびＣＬＰＴ０８の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を近隣接合法（Saito et al., Mol. Biol. Evol., 4, 406-25.）により解析し、これに基づき記載した系統樹を図１に示す。この結果から上記各菌株はテルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）であると判断した。
【００２５】
なお、本出願人らはこれらを、各々２００４年７月２日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１１、ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１２およびＦＥＲＭ Ｐ−２０１１３）。
【００２６】
ゲオバシルス・ステアロテルモフィルスに属する好熱性リパーゼ産生菌の菌学的性質：
【００２７】
＜形態＞
【表５】
【００２８】
＜生育状態＞
【表６】
【００２９】
＜生理学的性質＞
【表７】
【００３０】
【表８】
【００３１】
＜リパーゼ活性＞
トリブチリン、ｏ−ニトロフェニル ラウレートの分解活性を有する。
【００３２】
上記したＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、近隣接合法（Saito et al., Mol. Biol. Evol., 4, 406-25.）により解析し、これに基づき記載した系統樹（図１）からこれら微生物はゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）であることが判明した。
【００３３】
なお、本出願人らはこれら微生物を、各々２００４年４月２２日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００１６およびＦＥＲＭ Ｐ−２００１７）。
【００３４】
以上説明した、本発明の好熱性リパーゼ産生菌は、これを培養することにより、その培養物中にリパーゼを産生させることができ、必要により、精製等をおこなって耐熱性リパーゼを採取することができる。また、好熱性リパーゼ産生菌の１種または２種以上もしくはそれらの培養外液や前記耐熱性リパーゼを使用し、必要に応じて適当な担体と組み合わせることにより、高温においても作用する油脂分解剤とすることができる。
【００３５】
上記油脂分解剤は、高温下での油脂分解の用途に使用でき、例えば、高温型コンポストや、常温で固体の油脂を加温し、液状として分解させる用途等に使用することが好ましい。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は何らこれらに制約されるものではない。
【００３７】
実 施 例 １
リパーゼを産生する好熱菌のスクリーニング：
液状の培地１（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２ ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ）を、水酸化ナトリウムでｐＨを８に調整した後、オートグレーブ（１２１℃、１５分）で加熱殺菌した。この培地に、−８０℃で保存していた堆肥（発酵温度９６℃の高温型コンポストで製造された）を約２００ｍｇ加え、懸濁させた。この懸濁物を７０℃で３時間インキュベートした。別途調製した培地１に１.５％の寒天を加えて固形の培地２を得た。この培地２のプレートに上記インキュベート物の上清の５０μｌまたは２００μｌを植菌し、７０℃で培養した。
【００３８】
プレート上にコロニーが形成された後、ランダムにコロニーを選択し、基質である０.５％（vol/vol）トリブチリン(Tributyrin：ナカライテスク株式会社)の入った培地３のプレートに白金針にて植菌し、７０℃で培養した。その結果を図２に示した。なお、前記培地３としては１.５％の寒天の入った培地１をオートクレーブした後、５０ｍｌのコーニングチューブにこの培地を２５ｍｌ、トリブチリンを１２５μｌ加え、蓋をしめ、トリブチリンの粒が見えなくなるまで振り、シャーレに注いで固まったものを使用した。トリブチリンの入ったプレートは白く濁っており、リパーゼを産生する菌の周辺はトリブチリンの分解により透明となるためハローが形成される。
【００３９】
上記培養により、ハローが形成されるか若しくは菌の増殖速度が高いものとして、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５、ＣＬＰＴ０８、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３を選択した。
【００４０】
実 施 例 ２
リパーゼ活性の測定：
直径１８ｍｍの試験管に、前記培地１を５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になったものを測定用に使用した。この培養液を１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管にとり、５,０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件で遠心し、上清を除いた。そこに同量の０.０５Ｍのリン酸バッファー（ｋｐｉ；ｐＨ７.６）を加え、菌を縣濁した。その菌溶液を１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管にそれぞれ１００μｌ分注した。１００μｌの菌溶液が入った１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管に、０.０５Ｍのｋｐｉ（ｐＨ７.６）を８００μｌ、０.０１Ｍの後記の基質１００μｌを加えて混合し、７０℃で０分、３０分、６０分、１２０分の時間でインキュベートした。基質としては、ｐ−ニトロフェニル パルミテート（ｐ−ＮＰＰ）およびｏ−ニトロフェニル ラウレート（ｏ−ＮＰＬ）（共にＳＩＧＭＡ製）を用いた。
【００４１】
インキュベート後、１００ｍＭの炭酸ナトリウムを１２５μｌ加え、混合した。次いで、１３,０００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件で遠心し、上清を新しい１.５ｍｌ容量のマイクロ遠心分離管に移した。上清の吸光度(Abs.)は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、ｐ−ＮＰＰは４３０ｎｍ、ｏ−ＮＰＬは４２０ｎｍで測定した。その結果をそれぞれ図３（ｐ−ＮＰＰ活性のなかったＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の結果は図示せず）および図４に示した。リパーゼ活性のあるものは、基質からフェニル基が生成されるため吸光度の値が高くなった。
【００４２】
上記測定により、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５、ＣＬＰＴ０８、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の何れにもリパーゼ活性があることが分かった。
【００４３】
実 施 例 ３
顕微鏡による観察：
＜グラム染色＞
グラム染色のため菌溶液１０μｌをスライドガラスにのせ、火炎固定した。グラム溶液Ａ（クリスタルバイオレット溶液：和光純薬工業製）の２μｌをスライドガラス上に滴下し、１分間染色した。ＭｉｌｌｉＱで洗浄後、グラム溶液Ｂ（ルゴール液：和光純薬工業製）の１０μｌを添加し、１分間放置した。最後にグラム溶液Ｃ（サフラン溶液：和光純薬工業製）を１０μｌ添加し、１分間染色した。ＭｉｌｌｉＱで洗浄、乾燥後、カバーガラスをかぶせ、マニキュアで封じ、微分干渉顕微鏡（ＢＸ６０（オリンパス製）：１,０００倍）で観察した。その結果を図５に示した。なお、ポジティブコントロールとしてバシルス・サブチルス（Bacillus subtills）、ネガティブコントロールとしてエシェリシア・コリ（Escherichia coli）を使用した。
【００４４】
グラム染色の結果、何れの菌株も染色されず、グラム陰性であった。
【００４５】
＜形態観察＞
各菌株の大きさおよびべん毛の有無を確認するため透過型電子顕微鏡で観察した（図６）。また、その結果を表９に示した。
【００４６】
【表９】
【００４７】
実 施 例 ４
至適生育条件等の検討：
＜生育ｐＨおよび至適生育ｐＨ＞
培地１のｐＨを塩酸または水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６〜９.５まで０.５刻みで調整して室温条件で使用した。直径１８ｍｍの試験管に各ｐＨの培地５ｍｌ、菌溶液１００μｌを加え７０℃で一晩振盪培養した。培養後の６６０ｎｍの吸光度を分光光度計（スペクトロニック２０Ａ：島津製作所製）で測定した。測定は各３回行い、その平均値から至適ｐＨを検討した。
【００４８】
上記測定の結果、ＣＬＰＴ０１の生育ｐＨは６.０〜９.０、至適生育ｐＨは８.０であり、ＣＬＰＴ０５の生育ｐＨは６.５〜８.５、至適生育ｐＨは８.０であり、ＣＬＰＴ０８の生育ｐＨは６.５〜９.０、至適生育ｐＨは８.０であった。また、ＣＬＰＴ１１の生育ｐＨは６.０〜８.５、至適生育ｐＨは７.０であり、ＣＬＰＴ１３の生育ｐＨは６.０〜８.５、至適生育ｐＨは７.５であった。
【００４９】
＜生育塩化ナトリウム濃度および至適生育塩化ナトリウム濃度＞
培地１に塩化ナトリウムを加えて、塩化ナトリウム濃度を０〜５質量％まで０.５質量％刻みで調整して室温条件で使用した。直径１８ｍｍの試験管に各塩化ナトリウム濃度の培地５ｍｌ、菌溶液１００μｌを加え７０℃で一晩振盪培養した。培養後の６６０ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。測定は各３回行い、その平均値から至適生育塩化ナトリウム濃度を検討した。
【００５０】
上記測定の結果、ＣＬＰＴ０１、ＣＬＰＴ０５、ＣＬＰＴ０８、ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３の生育塩化ナトリウム濃度は３.５％以下であり、至適生育塩化ナトリウム濃度は０.５％であった。
【００５１】
＜生育温度、至適生育温度および世代時間＞
上記測定において、振盪培養時の温度を６０〜８０℃まで５℃刻みで調整して、それぞれ成長曲線を作成した（図７）。得られた曲線から対数増殖期での世代を計算した。
【００５２】
上記測定の結果、ＣＬＰＴ０１は１２０分（７０℃）、ＣＬＰＴ０５は（７０分）、ＣＬＰＴ０８は（６０分）ＣＬＰＴ１１およびＣＬＰＴ１３は１０分（６５℃）であった。
【００５３】
試 験 例 １
菌体培養上清のリパーゼ活性の測定：
＜温度耐性＞
エタノールに溶かした１０ｍＭのｏ−ニトロフェニルラウレートを１００μｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７.６）を８００μｌ、上清１００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、５,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、１２０分、５５−８０℃の範囲、５℃間隔でインキュベートを行った。インキュベート後、１０ｍＭの炭酸ナトリウムを２５０μｌ加え、１３,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心した。遠心後、その上清を新しい１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移した。上清の吸光度（Abs.）は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４０５ｎｍで測定した。その結果を図８に示した。なお、４０５ｎｍの時のＰＮは、１.４５７×１０５ｃｍ２ｍｏｌ−１で計算した。
【００５４】
上記測定の結果、分解活性が最も高い温度は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に７５℃であり、ＣＬＰＴ１１および１３が共に６０℃であった。温度範囲は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に６０−８０℃、ＣＬＰＴ１１および１３が共に５５−６０℃であった。
【００５５】
＜ｐＨ耐性＞
酵素反応を行うにあたり、ｐＨの調整に以下のバッファーを使用した。
ｐＨ４.０−６.０：酢酸ナトリウムバッファー
ｐＨ６.０−７.５：リン酸カルシウムバッファー
ｐＨ７.０−１０.０：トリス−塩酸バッファー
ｐＨ９.０−１０.０：グリシン−水酸化ナトリムバッファー
【００５６】
エタノールに溶かした１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルラウレートを１００μｌ、１０ｍＭの各バッファーを８００μｌ、上清の１００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、６,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で、３０分インキュベートを行った。インキュベート後、１０ｍＭの炭酸ナトリウムを２５０μｌ加え、１３,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心した。遠心後、上清を新しい１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移した。上清の吸光度は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４０５ｎｍで測定した。その結果を図９に示した。なお、４０５ｎｍの時のＰＮは、１.４５７×１０５ｃｍ２ｍｏｌ−１で計算した。
【００５７】
上記測定の結果、分解活性が最も高いｐＨは、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に８.０であり、ＣＬＰＴ１１は７.０であり、ＣＬＰＴ１３は７.５であった。ｐＨ範囲は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共に６.０−９.０、ＣＬＰＴ１１および１３が共に６.０−８.０であった。
【００５８】
＜基質特異性＞
（１）ニトロフェニルエステル類
菌体培養上清の基質特異性を、基質として以下の炭素数を有するニトロフェニルエステル類を用いて検討した。
ｐ−ニトロフェニルアセテート（Ｃ２）
ｐ−ニトロフェニルブチレート（Ｃ４）
ｐ−ニトロフェニルカプリレート（Ｃ８）
ｐ−ニトロフェニルカプレート（Ｃ１０）
ｐ−ニトロフェニルラウレート（Ｃ１２）
ｏ−ニトロフェニルミリステート（Ｃ１４）
ｐ−ニトロフェニルパルミテート（Ｃ１６）
ｏ−ニトロフェニルステアレート（Ｃ１８）
【００５９】
エタノール、アセトニトリルまたはイソプロパノールに溶かした１０ｍＭの各基質を１００μｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７.６）を８００μｌ、上清の１００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、６,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、 ０５および０８は７０℃で６０分インキュベートを行った。インキュベート後、１０ｍＭの炭酸ナトリウムを２５０μｌ加え、１,３０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心した。遠心後、上清を新しい１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移した。上清の吸光度（Abs.）は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４２０ｎｍで測定した。その結果を図１０に示した。なお、菌体培養上清の基質特異性は、ｐ−ニトロフェニルカプレートの活性を１００％として計算した。
【００６０】
上記測定の結果、分解活性が最も高い基質は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共にＣ１２であり、ＣＬＰＴ１１および１３が共にＣ１０であった。分解活性があった鎖長は、ＣＬＰＴ０１および０５が共にＣ２−Ｃ１８であり、ＣＬＰＴ０８はＣ２−Ｃ１６であり、ＣＬＰＴ１１はＣ２−Ｃ１２であり、ＣＬＰＴ１３はＣ２−Ｃ１０であった。
【００６１】
（２）トリグリセロール類
菌体培養上清の基質特異性を、基質として以下の炭素数を有するトリグリセロール類を用いて検討した。
トリアセチン（Ｃ２）
トリブチリン（Ｃ４）
トリカプリリン（Ｃ８）
トリカプリン（Ｃ１０）
トリラウリン（Ｃ１２）
トリミリスチン（Ｃ１４）
トリパルミチン（Ｃ１６）
【００６２】
各基質、蒸留水および０.２ｍＭのアラビアゴムをＦａｓｔＰｒｅｐ、ＢＩＯ１０１（Qbiogene製）を用いてスピード６.０、２分で乳化させ、１００ｍＭの基質溶液をそれぞれ調製した。これらの基質溶液を１００μｌ、上清の９００μｌ（直径１８ｍｍの試験管に培地５ｍｌ、−８０℃で保存してあるグリセロールストックの菌体を爪楊枝でかきとり加え、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で一晩培養後、ＯＤ６６０＝０.３になった培養液を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、６,０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し、上清を得た）を１.５ｍｌのマイクロ遠心チューブに混ぜ、ＣＬＰＴ１１および１３は６０℃、ＣＬＰＴ０１、０５および０８は７０℃で、１８時間インキュベートを行った。インキュベート後、試験管に反応物の４５０μｌを移し、直ぐに３Ｍの塩酸を２５０μｌ加え、さらにｎ−ヘキサンを３ｍｌ加えた。ボルテックスを用いて２分で脂肪酸を抽出し、新しい試験管に抽出した有機層２.５ｍｌを移した。そこに、銅試薬（９０ｍＭの酢酸銅（II）１水和物溶液を調製し、ピリジンでｐＨを６.１に調製したもの）の０.５ｍｌを加え、ボルテックスを１.５分行い、更に、遠心後に有機層の２ｍｌを新しい試験管に移した。ジエチルジチオカルバミン酸を無水エタノールで溶かし、５.８ｍＭに調製したクロモジェニック試薬を０.４ｍｌ加え混ぜた。有機層の吸光度（Abs.）は、吸光光度計（DU-640 Spectrophotometer：BECKMAN製）を用いて、４３０ｎｍで測定した。その結果を図１１に示した。なお、菌体培養上清の基質特異性は、トリカプリリンの活性を１００％として計算した。
【００６３】
上記測定の結果、分解活性が最も高い基質は、ＣＬＰＴ０１、０５、０８、１１および１３が共にＣ８であった。分解活性があった鎖長は、ＣＬＰＴ０１、０５および０８が共にＣ２−Ｃ１６であり、ＣＬＰＴ１１および１３はＣ２−Ｃ１４であった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の新規好熱菌は、高温条件下においてもリパーゼ活性を有するので、高温型コンポスト等に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、本発明微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列に基づく系統樹を示す図面である。
【図２】図２は、トリブチリンを基質とした培地上でのリパーゼ活性を有する好熱菌のスクリーニングの結果を示す写真である。
【図３】図３は、本発明微生物のｐ−ＮＰＰ活性を示す図面である。
【図４】図４は、本発明微生物のｏ−ＮＰＬ活性を示す図面である。
【図５】図５は、本発明微生物のグラム染色の結果を示す写真である。
【図６】図６は、本発明微生物の透過型電子顕微鏡写真である。
【図７】図７は、本発明微生物の振盪培養時の成長曲線を示す図面である。
【図８】図８は、本発明微生物の菌体培養上清の温度耐性を示す図面である。
【図９】図９は、本発明微生物の菌体培養上清のｐＨ耐性を示す図面である。
【図１０】図１０は、本発明微生物の菌体培養上清の基質特異性（ニトロフェニルエステル類）を示す図面である。
【図１１】図１１は、本発明微生物の菌体培養上清の基質特異性（トリグリセロール類）を示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生育可能温度が４５〜８０℃、生育至適温度が６０〜７５℃の範囲にある好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項２】
生育可能温度が５５〜８０℃、生育至適温度が７０〜７５℃の範囲にあり、テルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）に属するものである請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項３】
テルモエロバクター・サブテラネウス
ＣＬＰＴ０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１１）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項４】
テルモエロバクター・サブテラネウス
ＣＬＰＴ０５（ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１２）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項５】
テルモエロバクター・サブテラネウス
ＣＬＰＴ０８（ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１３）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項６】
生育可能温度が４５〜７５℃、生育至適温度が６０〜６５℃の範囲にあり、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に属するものである請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項７】
ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス
ＣＬＰＴ１１（ＦＥＲＭ Ｐ−２００１６）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項８】
ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス
ＣＬＰＴ１３（ＦＥＲＭ Ｐ−２００１７）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項９】
請求項第１項ないし第８項の何れかの項記載の好熱性リパーゼ産生菌の１種または２種以上、それらの培養外液およびそれらから採取される酵素を含有する油脂分解剤。
【請求項１０】
高温型コンポスト用である請求項第９項記載の油脂分解剤。
【請求項１】
生育可能温度が４５〜８０℃、生育至適温度が６０〜７５℃の範囲にある好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項２】
生育可能温度が５５〜８０℃、生育至適温度が７０〜７５℃の範囲にあり、テルモエロバクター・サブテラネウス（Thermaerobacter subterraneus）に属するものである請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項３】
テルモエロバクター・サブテラネウス
ＣＬＰＴ０１（ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１１）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項４】
テルモエロバクター・サブテラネウス
ＣＬＰＴ０５（ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１２）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項５】
テルモエロバクター・サブテラネウス
ＣＬＰＴ０８（ＦＥＲＭ Ｐ−２０１１３）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項６】
生育可能温度が４５〜７５℃、生育至適温度が６０〜６５℃の範囲にあり、ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に属するものである請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項７】
ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス
ＣＬＰＴ１１（ＦＥＲＭ Ｐ−２００１６）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項８】
ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス
ＣＬＰＴ１３（ＦＥＲＭ Ｐ−２００１７）である請求項第１項記載の好熱性リパーゼ産生菌。
【請求項９】
請求項第１項ないし第８項の何れかの項記載の好熱性リパーゼ産生菌の１種または２種以上、それらの培養外液およびそれらから採取される酵素を含有する油脂分解剤。
【請求項１０】
高温型コンポスト用である請求項第９項記載の油脂分解剤。
【図１】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２３０３０３（Ｐ２００６−２３０３０３Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０９４６（Ｐ２００５−５０９４６）
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（３０１０００２７３）アートエンジニアリング株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（３０１０００２７３）アートエンジニアリング株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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