子宮頸がん検査用マーカー及び子宮頸がんの検査方法
【課題】ＤＮＡのメチル化異常を指標とする子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーを提供する。さらに、当該マーカーを検出することによる、子宮頸がん発症高リスク群の検査方法を提供する。
【解決手段】ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなり、ＭＩＫ３についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡが脱メチル化された遺伝子からなるいずれかの遺伝子をマーカーとする。またこれらのマーカーのうち、いずれかを検出することによる。
【解決手段】ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなり、ＭＩＫ３についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡが脱メチル化された遺伝子からなるいずれかの遺伝子をマーカーとする。またこれらのマーカーのうち、いずれかを検出することによる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡのメチル化異常を指標とする子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーに関する。さらに、当該マーカーを検出することによる、子宮頸がん発症高リスク予測検査方法に関する。より詳しくは、当該マーカーを検出することによる、ヒトパピローマウイルス（以下、「ＨＰＶ」という。）に感染した場合の子宮頸がん発症リスクを予測するための検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸がんは、女性特有のがんとしては罹患率及び死亡率ともに世界で第一位であり、約500,000人が発症し、約270,000人が死亡すると推計されている。子宮頸がんは、殆どの場合ＨＰＶ感染が原因で引き起こされる。発がん性ＨＰＶには１５種類ほどの型があり、中でもＨＰＶ１６型と１８型は子宮頸がんから多く検出される型である。発がん性ＨＰＶは８割もの女性が一生のうちに一度は感染するという、ありふれたウイルスであるが、ほとんどの場合は感染してもウイルスが自然に排除されるため、子宮頸がんを発症するのは感染した女性の１％未満と考えられている。すなわち、ＨＰＶ感染を高額の検査で明らかにしても、子宮頸がん発症に至る頻度が低いことから、細胞診やＨＰＶ検査のみでは子宮頸がん発症高リスク群の同定には不十分である。細胞診検体で検出可能な子宮頸がん高リスク診断マーカーが望まれている。
【０００３】
近年、遺伝子の異常なメチル化、即ち特定の遺伝子についてのＣｐＧに富む領域（以下「ＣｐＧ領域」又は「ＣｐＧ島」という。）でのメチル化シトシンを検出することによるがんの検査について、数多く報告されている。高等真核生物において、ＤＮＡは、ＣＧジヌクレオチド中のグアノシンの5'側に位置するシトシンでのみメチル化される。ＣｐＧ領域が、遺伝子のプロモーター領域に存在する場合に、ＣｐＧ領域でのシトシンのメチル化による修飾が、遺伝子発現において重要な制御効果を有する。常染色体では殆ど全ての遺伝子関連のＣｐＧ領域がメチル化から保護されているが、ＣｐＧ領域の広範にわたるメチル化は、刷込み遺伝子の転写の不活性化及び雌の不活性Ｘ染色体上の遺伝子の転写の不活性化などと関連している。
【０００４】
ＣｐＧ領域におけるシトシンの異常なメチル化は、不死化細胞又は形質転換細胞では頻繁に見られる事象であり、ヒトがんにおける特定のがん抑制遺伝子の転写の不活性化と関連すると考えられている。そして、幾つかの生物学的機能は、ＤＮＡ中のメチル化された塩基に起因している。最も確立された生物学的機能は、コグネイト制限酵素による消化からのＤＮＡの保護である。制限修飾現象は細菌でしか見られないと考えられていたが、その後哺乳動物細胞にも別のメチラーゼがあり、これはＣｐＧのグアニンの5'側に隣接するＤＮＡ上のシトシン残基だけを限定的にメチル化することが明らかになった。このメチル化は、遺伝子活性、細胞分化、腫瘍発生、Ｘ染色体の不活性化、遺伝子刷込み、及びその他の主要な生物学的プロセスにおいて或る役割を担っていることが報告されている(Razin,A.,H.,及びRiggs,R.D.編，DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance,Springer-Verlag,New York,1984)。
【０００５】
例えば、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ｈＭＬＨ１、ＨＳＰＡ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＴＩＭＰ３、ｈＴＥＲＴ、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５及びＣＣＮＤ２及び／又はそれらのプロモーター、イントロン、第１エクソン、制御因子及び／又はエンハンサーからなる群から選択される１つ又はそれ以上の遺伝子におけるＣｐＧ領域でのメチル化を検出することによる婦人科細胞増殖障害の分析方法について開示がある（特許文献１）。また、ＨＰＶの存在と、特定の遺伝子におけるＣｐＧ領域でのメチル化状態を確認した内容が開示されている（特許文献２）。例えば、特許文献２の段落番号００５５において、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、ＳＴＡＴ１の各ゲノム領域のメチル化状態が、がんのマーカーとなりうる可能性があるとして列挙されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５３１５１２号公報
【特許文献２】特表２００９−５０７４９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＤＮＡのメチル化異常を指標とする子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーを提供することを課題とする。さらに、当該マーカーを検出することによる、子宮頸がん発症高リスク予測のための検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、ヒト子宮頸がん細胞株、子宮頸がん症例、子宮頸部細胞診検体において、がん関連遺伝子等のＣｐＧ領域部位でのメチル化状態を確認したところ、特定の遺伝子のメチル化とＨＰＶ感染との関連において、がん発症高リスクを予測可能なことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３から選択されるいずれかの遺伝子を含む子宮頸がん検査用マーカー。
２．遺伝子が、ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなり、ＭＩＫ３についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡが脱メチル化された遺伝子からなるものである、前項１に記載の子宮頸がん発症高検査用マーカー。
３．さらに、ＲＡＲＢ、ＦＨＩＴ、ＴＥＲＣ、ｐ１６、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＰＴＥＮから選択される少なくとも２種の遺伝子を含む、前項１又は２に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
４．前項２に記載の各遺伝子が、プロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなる、前項３に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
５．子宮頸がん検査用マーカーが、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測するマーカーである、前項１〜４のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
６．被検者から取得した検体から、前項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを検出することを特徴とする、子宮頸がんの検査方法。
７．以下の工程を含む、子宮頸がんの検査方法：
１）被検者から取得した検体から、ＤＮＡを抽出する工程；
２）抽出したＤＮＡについて、前項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを構成するＤＮＡを増幅しうるプライマーを用いて、ＤＮＡを増幅させる工程；
３）増幅産物を検出する工程。
８．子宮頸がんの検査が、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測する検査である、前項６又は７に記載の子宮頸がんの検査方法。
９．各遺伝子マーカー検出用のプライマーを含む、子宮頸がん検査用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーによれば、ハイリスクＨＰＶに感染した場合の子宮頸がん発症高リスク群を検出することができる。本発明の検査方法は、子宮頸部細胞診を行なった患者について、膣洗浄液を検体として利用できることから、一度採取した検体を有効に活用することができ、被検者に対しても低い負担で検査を行うことができる。また、本発明の検査方法により検出された子宮頸がん発症高リスク群では、ＨＰＶに感染に対して予防的に対応することができ、また感染後であっても、より効果的な治療方法を提供することができる。一方、高リスク群ではないと判断された場合には、不必要な処理を行うことなく、効果的に治療を施すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト子宮頸がん細胞株９種について、ＨＰＶ感染の有無を確認し、各細胞株におけるがん関連遺伝子１０種について、ＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例１）
【図２】ヒト子宮頸がん細胞株９種について、各細胞株における独自のエピジェネティクスマーカー３種のＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態又は脱メチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例２）
【図３】ヒト子宮頸がん７症例について、エピジェネティクスマーカー３種のＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態又は脱メチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例３）
【図４】子宮頸部細胞診により得た検体のうち、異常を認めた２３症例について、エピジェネティクスマーカー３種のＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態又は脱メチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、子宮頸がん検査用マーカーとは、子宮頸がん発症高リスク群を検出するためのマーカーをいう。より具体的には、発がん性ＨＰＶに感染した場合の子宮頸がん発症リスクの高い者を検出するためのマーカーをいう。背景技術の欄でも説明したように、発がん性ＨＰＶは８割もの女性が一生のうちに一度は感染するという、ありふれたウイルスであるが、ほとんどの場合は感染してもウイルスが自然に排除されるため、子宮頸がんを発症するのは感染した女性の１％未満と考えられている。従来では、ＨＰＶ感染を高額の検査で明らかにしても、子宮頸がん発症にいたる頻度が低いことから、細胞診やＨＰＶ検査のみでは子宮頸がん発症高リスク群の同定には不十分である。本発明の子宮頸がん検査用マーカーにより、発がん性ＨＰＶに感染した場合に、子宮頸がん発症リスクを予測することができる。
【００１３】
本発明における子宮頸がん検査用マーカーの対象となる遺伝子は、ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３である。具体的には、ＭＩＫ１及び／又はＭＩＫ２のいずれかの遺伝子においてメチル化（Ｍ）、あるいはＭＩＫ３遺伝子の脱メチル化（Ｕ）が、子宮頸がん検査用マーカーとなりえる。ＭＩＫ１はheparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 (HS3ST2)遺伝子、ＭＩＫ２はREC8 homolog（REC8）遺伝子、ＭＩＫ３はserpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 5（SERPINB5）遺伝子であり、これらの遺伝子におけるプロモーター領域のＣｐＧ領域がメチル化又は脱メチル化を検出することにより、子宮頸がん発症高リスク群を検査することができる。
【００１４】
本発明において、被検者は、子宮頸がん発症しているか、又は発症の可能性を有するものを対象とし、それらのうち特にＨＰＶに感染しているか、又は感染していると疑われる者を対象とすることができる。本発明の検査用マーカーを用いて検査することにより、ＨＰＶ感染による子宮頸がんの発症リスクを予測することができる。本発明の検査用マーカーが検出された場合、被検者は、ＨＰＶ感染した場合に、子宮頸がん発症リスクが高いと予測することができる。
【００１５】
本発明において、被検者から取得した検体とは、被検者由来であってがん組織が混入していると考えられる検体が好ましく、具体的には膣洗浄液が好適である。例えば、子宮頚部から採取した検体、又は当該検体取得の際や、膣分泌液等の塗抹標本検査の際の膣洗浄液を用いるのが好適である。被検者から検体を取得する方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。
【００１６】
本発明において、特定遺伝子のメチル化検出の前処理として、ＤＮＡを抽出することが必要である。ＤＮＡの抽出方法は、自体公知の方法を適用することができ、具体的にはMagExtractor（東洋紡製）やQIAamp Stool DNA Isolation Kit(QIAGEN製)などの市販品を用いることができる。次に、重亜硫酸塩(disulfite)などの処理により生体検体中に存在するＤＮＡの全ての非メチル化シトシンをウラシルに転換させることが必要である。前記重亜硫酸塩処理後、本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の必要な領域、例えばＣｐＧ領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、該増幅したＤＮＡについて非メチル化シトシンがウラシルへ転換されたか否かを確認することができる。
【００１７】
該増幅したＤＮＡ中の非メチル化シトシンがウラシルへ転換されたか否かの確認は、遺伝子又は遺伝子座の必要な領域、例えばＣｐＧ領域、プロモーター領域若しくは5'領域などについて、重亜硫酸塩処理によってもメチル化シトシンがウラシルに転換されない配列、及び非メチル化シトシンがウラシルに転換した配列を増幅しうる各プライマーを用いてＤＮＡを増幅させ、該増幅産物を確認することにより行うことができる。検体材料の性質上、増幅される遺伝子は250bp以下が好ましく、より好ましくは230bp以下である。
【００１８】
本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の塩基配列は、HS3ST2遺伝子についてはGenebank Accession No.AC003661に示す如くである。これらの遺伝子のプロモーター領域又は5'領域に存在するＣｐＧ領域の核酸増幅用プライマーとして、以下のものを使用することができる。
【００１９】
HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー１：5'-GTCGGTAGCGCGTTTCGTTC（配列番号１）
プライマー２：5'-GACGACGACGCGACTATAC（配列番号２）
プライマー３：5'- GAGTTGGTAGTGTGTTTTGTTT（配列番号３）
プライマー４：5'- CACTCACAAAACACTCAACA（配列番号４）
【００２０】
プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンを検出する104bpの増幅産物が得られる。
一方、プライマー３（配列番号３）とプライマー４（配列番号４）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならばこれらのプライマーにより、122bpの増幅産物が得られる。
【００２１】
すなわち、HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンにメチル化が認められる場合は104bpの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するプロモーター領域のシトシンにメチル化が認められない場合は122bpの遺伝子増幅産物が認められることになる。HS3ST2遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号１〜４のプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンのメチル化に応じて塩基数の異なるＤＮＡの増幅を確認することができる。
【００２２】
本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の塩基配列は、REC8遺伝子についてはGenebank Accession No. AL136295に示す如くである。これらの遺伝子のプロモーター領域又は5'領域に存在するＣｐＧ領域の核酸増幅用プライマーとして、以下のものを使用することができる。
【００２３】
REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー５：5'- GGATATTTGGCGTTTTCGATTC（配列番号５）
プライマー６：5'- GAACGCTTCGAAACACCG（配列番号６）
プライマー７：5'- GGATATTTGGTGTTTTTGATTT（配列番号７）
プライマー８：5'- ACAAACACTTCAAAACACCA（配列番号８）
【００２４】
プライマー５（配列番号５）とプライマー６（配列番号６）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンを検出する99bpの増幅産物が得られる。
一方、プライマー７（配列番号７）とプライマー８（配列番号８）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならば、これらのプライマーにより、100bpの増幅産物が得られる。
【００２５】
すなわち、REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンにメチル化が認められる場合は99bpの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するプロモーター領域のシトシンにメチル化が認められない場合は100bpの遺伝子増幅産物が認められることになる。REC8遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号５〜８のプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンのメチル化に応じて塩基数の異なるＤＮＡの増幅を確認することができる。
【００２６】
本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の塩基配列は、SERPINB5遺伝子についてはGenebank Accession No. AC0903071に示す如くである。これらの遺伝子のプロモーター領域又は5'領域に存在するＣｐＧ領域の核酸増幅用プライマーとして、以下のものを使用することができる。
【００２７】
SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー９：5'- ATTTTTCGGTTTTGCGTGGGTC（配列番号９）
プライマー１０：5'- ACCCAACTCCACGCCCCG（配列番号１０）
プライマー１１：5'- TATTTTTTGGTTTTGTGTGGGTT（配列番号１１）
プライマー１２：5'- CCCAACTCCACACCCCA（配列番号１２）
【００２８】
プライマー９（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１０）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンを検出する228bpの増幅産物が得られる。
一方、プライマー１１（配列番号１１）とプライマー１２（配列番号１２）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならば、これらのプライマーにより脱メチル化を検出する122bpの増幅産物が得られる。
【００２９】
すなわち、SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンにメチル化が認められる場合は228bpの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するプロモーター領域のシトシンにメチル化が認められない場合は122bpの遺伝子増幅産物が認められることになる。SERPINB5遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号９〜１２のプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンのメチル化に応じて塩基数の異なるＤＮＡの増幅を確認することができる。
【実施例】
【００３０】
本発明の理解を助けるために、実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３１】
（実施例１）がん関連種遺伝子における特定ゲノムのメチル化について
本実施例では、ヒト子宮頸がん細胞株９種について、ＨＰＶ感染の有無を確認し、各細胞株におけるがん関連遺伝子１０種について、ＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した。ヒト子宮頸がん細胞株としては、ＣＸ−８、ＣＸ−１、ＣＸ−６、ＥＭ−１、ＥＭ−２、ＣＸ−７、ＣＸ−２、ＣＸ−５、ＣＸ−３を用い、遺伝子としてはＲＡＲＢ、ＦＨＩＴ、ＴＥＲＣ、ｐ１６、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＰＴＥＮについて解析を行なった。
【００３２】
その結果、図１のパネルに示すように、ＥＭ−２、ＣＸ−７及びＣＸ−２については、ＨＰＶの感染は認められず、その他の細胞についてはＨＰＶ感染を認めた。各遺伝子において２種以上、好ましくは４種以上においてメチル化異常が認められた場合、子宮頸がんと判断できるものと考えられた。なお、図１において、「Ｍ」とは、各遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域におけるメチル化を認めたことを意味し、「なし」とは満ちるかを認めないことを意味する。
【００３３】
（実施例２）３種のエピジェネティクスマーカーのメチル化について（１）
実施例では、実施例１で用いたヒト子宮頸がん細胞株９種について、３種のエピジェネティクスマーカーＭＩＫ１及びＭＩＫ２の遺伝子についてはメチル化を、ＭＩＫ３遺伝子については脱メチル化について確認した。
【００３４】
本発明における子宮頸がん検査用マーカーの対象となる遺伝子は、ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３である。具体的には、ＭＩＫ１及び／又はＭＩＫ２のいずれかの遺伝子においてメチル化（Ｍ）、あるいはＭＩＫ３遺伝子の脱メチル化（Ｕ）が、子宮頸がん検査用マーカーとなりえる。ＭＩＫ１はheparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 (HS3ST2)遺伝子、ＭＩＫ２はREC8 homolog（REC8）遺伝子、ＭＩＫ３はserpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 5（SERPINB5）遺伝子であり、これらの遺伝子におけるプロモーター領域のＣｐＧ領域がメチル化又は脱メチル化を検出することにより、子宮頸がん発症高リスク群を検査することができる。
【００３５】
HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー１：5'-GTCGGTAGCGCGTTTCGTTC（配列番号１）
プライマー２：5'-GACGACGACGCGACTATAC（配列番号２）
プライマー３：5'- GAGTTGGTAGTGTGTTTTGTTT（配列番号３）
プライマー４：5'- CACTCACAAAACACTCAACA（配列番号４）
【００３６】
プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、プライマー３（配列番号３）とプライマー４（配列番号４）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されている。
【００３７】
REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー５：5'- GGATATTTGGCGTTTTCGATTC（配列番号５）
プライマー６：5'- GAACGCTTCGAAACACCG（配列番号６）
プライマー７：5'- GGATATTTGGTGTTTTTGATTT（配列番号７）
プライマー８：5'- ACAAACACTTCAAAACACCA（配列番号８）
【００３８】
プライマー５（配列番号５）とプライマー６（配列番号６）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、プライマー７（配列番号７）とプライマー８（配列番号８）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されている。
【００３９】
SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー９：5'- ATTTTTCGGTTTTGCGTGGGTC（配列番号９）
プライマー１０：5'- ACCCAACTCCACGCCCCG（配列番号１０）
プライマー１１：5'- TATTTTTTGGTTTTGTGTGGGTT（配列番号１１）
プライマー１２：5'- CCCAACTCCACACCCCA（配列番号１２）
【００４０】
プライマー９（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１０）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、プライマー１１（配列番号１１）とプライマー１２（配列番号１２）はメチル化シトシンの存在しないアレル、即ち脱メチル化のみにハイブリダイズするように設計されている。
【００４１】
その結果、図２のパネルに示すように、ＨＰＶの感染を認めないＥＭ−２を除き、ＨＰＶ感染を認めたその他の細胞について、いずれの場合もＭＩＫ１及びＭＩＫ２については、メチル化（Ｍ）を認め、ＭＩＫ３については脱メチル化（Ｕ）を示し、脱メチル化を認めた。
【００４２】
（実施例３）３種のエピジェネティクスマーカーのメチル化について（２）
本実施例では、子宮頸がん７症例から採取した膣洗浄液について、３種のエピジェネティクスマーカーＭＩＫ１及びＭＩＫ２各遺伝子のメチル化、並びにＭＩＫ３の脱メチル化を確認した。
【００４３】
その結果、図３のパネルに示すように、各検体のうち１７３ＴについてはＨＰＶの感染を認めず、その他については感染を認めた。ＨＰＶの感染を認めない１７３Ｔ及び、ＨＰＶ感染を認めたその他の検体について、いずれの場合もＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてメチル化（Ｍ）を認め、ＭＩＫ３については、脱メチル化（Ｕ）を示した。ＭＩＫ３のＵについても、マーカーとなりえるものと思われた。なお、発がんの過程ではＨＰＶが関与していても、臨床検体ではＨＰＶが陰性化してしまう可能性も考えられる。
【００４４】
（実施例４）３種のエピジェネティクスマーカーのメチル化について（３）
本実施例では、子宮頸部細胞診７１株のうち、異常を認めた２３症例について、３種のエピジェネティクスマーカーについてメチル化の有無を確認した。各検体は全てＨＰＶ感染を認めた。
【００４５】
その結果、図４のパネルに示すように、被検者４、５、１０、１４及び１８についてはＭＩＫ１のメチル化を認めなかったが、細胞診で異常を認めなかった被検者４、５を除き、ＭＩＫ２でメチル化を認めるか、又はＭＩＫ３で脱メチル化を認めた。以上の結果、ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはメチル化を認めるか、あるいはＭＩＫ３について、脱メチル化を認めることで、ＨＰＶ感染者における子宮頸がんが発症する子宮頸がん発症高リスク群を検出しうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上詳述したように、本発明の子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーによれば、ハイリスクＨＰＶに感染した場合の子宮頸がん発症高リスク群を検出することができる。本発明の検査方法は、子宮頸部細胞診を行なった患者について、膣洗浄液を検体として利用できることから、一度採取した検体を有効に活用することができ、被検者に対しても低い負担で検査を行うことができる。また、本発明の検査方法により検出された子宮頸がん発症高リスク群では、ＨＰＶに感染に対して予防的に対応することができ、また感染後であっても、より効果的な治療方法を提供することができる。一方、高リスク群ではないと判断された場合には、不必要な処理を行うことなく、効果的に治療を施すことができ、医療経済の軽減化の一助ともなりうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡのメチル化異常を指標とする子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーに関する。さらに、当該マーカーを検出することによる、子宮頸がん発症高リスク予測検査方法に関する。より詳しくは、当該マーカーを検出することによる、ヒトパピローマウイルス（以下、「ＨＰＶ」という。）に感染した場合の子宮頸がん発症リスクを予測するための検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸がんは、女性特有のがんとしては罹患率及び死亡率ともに世界で第一位であり、約500,000人が発症し、約270,000人が死亡すると推計されている。子宮頸がんは、殆どの場合ＨＰＶ感染が原因で引き起こされる。発がん性ＨＰＶには１５種類ほどの型があり、中でもＨＰＶ１６型と１８型は子宮頸がんから多く検出される型である。発がん性ＨＰＶは８割もの女性が一生のうちに一度は感染するという、ありふれたウイルスであるが、ほとんどの場合は感染してもウイルスが自然に排除されるため、子宮頸がんを発症するのは感染した女性の１％未満と考えられている。すなわち、ＨＰＶ感染を高額の検査で明らかにしても、子宮頸がん発症に至る頻度が低いことから、細胞診やＨＰＶ検査のみでは子宮頸がん発症高リスク群の同定には不十分である。細胞診検体で検出可能な子宮頸がん高リスク診断マーカーが望まれている。
【０００３】
近年、遺伝子の異常なメチル化、即ち特定の遺伝子についてのＣｐＧに富む領域（以下「ＣｐＧ領域」又は「ＣｐＧ島」という。）でのメチル化シトシンを検出することによるがんの検査について、数多く報告されている。高等真核生物において、ＤＮＡは、ＣＧジヌクレオチド中のグアノシンの5'側に位置するシトシンでのみメチル化される。ＣｐＧ領域が、遺伝子のプロモーター領域に存在する場合に、ＣｐＧ領域でのシトシンのメチル化による修飾が、遺伝子発現において重要な制御効果を有する。常染色体では殆ど全ての遺伝子関連のＣｐＧ領域がメチル化から保護されているが、ＣｐＧ領域の広範にわたるメチル化は、刷込み遺伝子の転写の不活性化及び雌の不活性Ｘ染色体上の遺伝子の転写の不活性化などと関連している。
【０００４】
ＣｐＧ領域におけるシトシンの異常なメチル化は、不死化細胞又は形質転換細胞では頻繁に見られる事象であり、ヒトがんにおける特定のがん抑制遺伝子の転写の不活性化と関連すると考えられている。そして、幾つかの生物学的機能は、ＤＮＡ中のメチル化された塩基に起因している。最も確立された生物学的機能は、コグネイト制限酵素による消化からのＤＮＡの保護である。制限修飾現象は細菌でしか見られないと考えられていたが、その後哺乳動物細胞にも別のメチラーゼがあり、これはＣｐＧのグアニンの5'側に隣接するＤＮＡ上のシトシン残基だけを限定的にメチル化することが明らかになった。このメチル化は、遺伝子活性、細胞分化、腫瘍発生、Ｘ染色体の不活性化、遺伝子刷込み、及びその他の主要な生物学的プロセスにおいて或る役割を担っていることが報告されている(Razin,A.,H.,及びRiggs,R.D.編，DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance,Springer-Verlag,New York,1984)。
【０００５】
例えば、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ｈＭＬＨ１、ＨＳＰＡ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＴＩＭＰ３、ｈＴＥＲＴ、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５及びＣＣＮＤ２及び／又はそれらのプロモーター、イントロン、第１エクソン、制御因子及び／又はエンハンサーからなる群から選択される１つ又はそれ以上の遺伝子におけるＣｐＧ領域でのメチル化を検出することによる婦人科細胞増殖障害の分析方法について開示がある（特許文献１）。また、ＨＰＶの存在と、特定の遺伝子におけるＣｐＧ領域でのメチル化状態を確認した内容が開示されている（特許文献２）。例えば、特許文献２の段落番号００５５において、ＣＤ１４、ＥＮＤＲＢ、ＨＩＣ、ＲＡＲＢ１、ＰＧＲ、ＳＦＲＳ８、ＴＭＳＢ１０、ＡＢＣＧ２、ＭＦＮＧ、ＬＡＭＲ１、ＲＡＧＥ、ＡＢＬ１、ＣＲＢＰ、ＧＰＲ３７、ＨＲＫ、ＲＡＲＡ、ＳＹＫ、ＥＣＥ１、ＭＭＥ、ＴＥＭ、ＮＦ２、ＸＩＡＰ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＦＬＩ１、ＨＴＬＦ、ＬＤＨＢ、ＲＢ１、ＴＧＤ、ＣＤＫ４、ＭＭＰ１４、ＲＡＢ３２、ＢＡＲＤ１、ＮＦ１、ＬＩＭ２、ＭＭＰ２、ＤＡＢ２、ＢＭＰ６、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＬＭＮＢ１、ＭＭＰ２８、ＨＡＩ２、ＳＯＣＳ１、ＨＩＣ２、ＭＳＨ６、ＲＩＮ２、ＨＭＧＡ１、ＪＵＮ、Ｓ１００Ｐ＊、ＳＲＦ、ＶＤＲ、ＤＫＫ３、ＫＲＡＳ２、ＰＬＡＵ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＣＤＨ１、ＭＡＣ３０、ＤＤＢ２、ＰＡＸ６、ＡＸＬ、ＥＩＦ４Ａ２、ＳＬＩＴ２、ＲＥＣＫ、ＴＥＲＣ、ＧＡＴＡ５、ＳＴＡＴ１の各ゲノム領域のメチル化状態が、がんのマーカーとなりうる可能性があるとして列挙されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５３１５１２号公報
【特許文献２】特表２００９−５０７４９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＤＮＡのメチル化異常を指標とする子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーを提供することを課題とする。さらに、当該マーカーを検出することによる、子宮頸がん発症高リスク予測のための検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、ヒト子宮頸がん細胞株、子宮頸がん症例、子宮頸部細胞診検体において、がん関連遺伝子等のＣｐＧ領域部位でのメチル化状態を確認したところ、特定の遺伝子のメチル化とＨＰＶ感染との関連において、がん発症高リスクを予測可能なことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３から選択されるいずれかの遺伝子を含む子宮頸がん検査用マーカー。
２．遺伝子が、ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなり、ＭＩＫ３についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡが脱メチル化された遺伝子からなるものである、前項１に記載の子宮頸がん発症高検査用マーカー。
３．さらに、ＲＡＲＢ、ＦＨＩＴ、ＴＥＲＣ、ｐ１６、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＰＴＥＮから選択される少なくとも２種の遺伝子を含む、前項１又は２に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
４．前項２に記載の各遺伝子が、プロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなる、前項３に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
５．子宮頸がん検査用マーカーが、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測するマーカーである、前項１〜４のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
６．被検者から取得した検体から、前項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを検出することを特徴とする、子宮頸がんの検査方法。
７．以下の工程を含む、子宮頸がんの検査方法：
１）被検者から取得した検体から、ＤＮＡを抽出する工程；
２）抽出したＤＮＡについて、前項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを構成するＤＮＡを増幅しうるプライマーを用いて、ＤＮＡを増幅させる工程；
３）増幅産物を検出する工程。
８．子宮頸がんの検査が、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測する検査である、前項６又は７に記載の子宮頸がんの検査方法。
９．各遺伝子マーカー検出用のプライマーを含む、子宮頸がん検査用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーによれば、ハイリスクＨＰＶに感染した場合の子宮頸がん発症高リスク群を検出することができる。本発明の検査方法は、子宮頸部細胞診を行なった患者について、膣洗浄液を検体として利用できることから、一度採取した検体を有効に活用することができ、被検者に対しても低い負担で検査を行うことができる。また、本発明の検査方法により検出された子宮頸がん発症高リスク群では、ＨＰＶに感染に対して予防的に対応することができ、また感染後であっても、より効果的な治療方法を提供することができる。一方、高リスク群ではないと判断された場合には、不必要な処理を行うことなく、効果的に治療を施すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト子宮頸がん細胞株９種について、ＨＰＶ感染の有無を確認し、各細胞株におけるがん関連遺伝子１０種について、ＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例１）
【図２】ヒト子宮頸がん細胞株９種について、各細胞株における独自のエピジェネティクスマーカー３種のＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態又は脱メチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例２）
【図３】ヒト子宮頸がん７症例について、エピジェネティクスマーカー３種のＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態又は脱メチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例３）
【図４】子宮頸部細胞診により得た検体のうち、異常を認めた２３症例について、エピジェネティクスマーカー３種のＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態又は脱メチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した結果を示すパネルである。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、子宮頸がん検査用マーカーとは、子宮頸がん発症高リスク群を検出するためのマーカーをいう。より具体的には、発がん性ＨＰＶに感染した場合の子宮頸がん発症リスクの高い者を検出するためのマーカーをいう。背景技術の欄でも説明したように、発がん性ＨＰＶは８割もの女性が一生のうちに一度は感染するという、ありふれたウイルスであるが、ほとんどの場合は感染してもウイルスが自然に排除されるため、子宮頸がんを発症するのは感染した女性の１％未満と考えられている。従来では、ＨＰＶ感染を高額の検査で明らかにしても、子宮頸がん発症にいたる頻度が低いことから、細胞診やＨＰＶ検査のみでは子宮頸がん発症高リスク群の同定には不十分である。本発明の子宮頸がん検査用マーカーにより、発がん性ＨＰＶに感染した場合に、子宮頸がん発症リスクを予測することができる。
【００１３】
本発明における子宮頸がん検査用マーカーの対象となる遺伝子は、ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３である。具体的には、ＭＩＫ１及び／又はＭＩＫ２のいずれかの遺伝子においてメチル化（Ｍ）、あるいはＭＩＫ３遺伝子の脱メチル化（Ｕ）が、子宮頸がん検査用マーカーとなりえる。ＭＩＫ１はheparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 (HS3ST2)遺伝子、ＭＩＫ２はREC8 homolog（REC8）遺伝子、ＭＩＫ３はserpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 5（SERPINB5）遺伝子であり、これらの遺伝子におけるプロモーター領域のＣｐＧ領域がメチル化又は脱メチル化を検出することにより、子宮頸がん発症高リスク群を検査することができる。
【００１４】
本発明において、被検者は、子宮頸がん発症しているか、又は発症の可能性を有するものを対象とし、それらのうち特にＨＰＶに感染しているか、又は感染していると疑われる者を対象とすることができる。本発明の検査用マーカーを用いて検査することにより、ＨＰＶ感染による子宮頸がんの発症リスクを予測することができる。本発明の検査用マーカーが検出された場合、被検者は、ＨＰＶ感染した場合に、子宮頸がん発症リスクが高いと予測することができる。
【００１５】
本発明において、被検者から取得した検体とは、被検者由来であってがん組織が混入していると考えられる検体が好ましく、具体的には膣洗浄液が好適である。例えば、子宮頚部から採取した検体、又は当該検体取得の際や、膣分泌液等の塗抹標本検査の際の膣洗浄液を用いるのが好適である。被検者から検体を取得する方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。
【００１６】
本発明において、特定遺伝子のメチル化検出の前処理として、ＤＮＡを抽出することが必要である。ＤＮＡの抽出方法は、自体公知の方法を適用することができ、具体的にはMagExtractor（東洋紡製）やQIAamp Stool DNA Isolation Kit(QIAGEN製)などの市販品を用いることができる。次に、重亜硫酸塩(disulfite)などの処理により生体検体中に存在するＤＮＡの全ての非メチル化シトシンをウラシルに転換させることが必要である。前記重亜硫酸塩処理後、本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の必要な領域、例えばＣｐＧ領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、該増幅したＤＮＡについて非メチル化シトシンがウラシルへ転換されたか否かを確認することができる。
【００１７】
該増幅したＤＮＡ中の非メチル化シトシンがウラシルへ転換されたか否かの確認は、遺伝子又は遺伝子座の必要な領域、例えばＣｐＧ領域、プロモーター領域若しくは5'領域などについて、重亜硫酸塩処理によってもメチル化シトシンがウラシルに転換されない配列、及び非メチル化シトシンがウラシルに転換した配列を増幅しうる各プライマーを用いてＤＮＡを増幅させ、該増幅産物を確認することにより行うことができる。検体材料の性質上、増幅される遺伝子は250bp以下が好ましく、より好ましくは230bp以下である。
【００１８】
本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の塩基配列は、HS3ST2遺伝子についてはGenebank Accession No.AC003661に示す如くである。これらの遺伝子のプロモーター領域又は5'領域に存在するＣｐＧ領域の核酸増幅用プライマーとして、以下のものを使用することができる。
【００１９】
HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー１：5'-GTCGGTAGCGCGTTTCGTTC（配列番号１）
プライマー２：5'-GACGACGACGCGACTATAC（配列番号２）
プライマー３：5'- GAGTTGGTAGTGTGTTTTGTTT（配列番号３）
プライマー４：5'- CACTCACAAAACACTCAACA（配列番号４）
【００２０】
プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンを検出する104bpの増幅産物が得られる。
一方、プライマー３（配列番号３）とプライマー４（配列番号４）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならばこれらのプライマーにより、122bpの増幅産物が得られる。
【００２１】
すなわち、HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンにメチル化が認められる場合は104bpの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するプロモーター領域のシトシンにメチル化が認められない場合は122bpの遺伝子増幅産物が認められることになる。HS3ST2遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号１〜４のプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンのメチル化に応じて塩基数の異なるＤＮＡの増幅を確認することができる。
【００２２】
本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の塩基配列は、REC8遺伝子についてはGenebank Accession No. AL136295に示す如くである。これらの遺伝子のプロモーター領域又は5'領域に存在するＣｐＧ領域の核酸増幅用プライマーとして、以下のものを使用することができる。
【００２３】
REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー５：5'- GGATATTTGGCGTTTTCGATTC（配列番号５）
プライマー６：5'- GAACGCTTCGAAACACCG（配列番号６）
プライマー７：5'- GGATATTTGGTGTTTTTGATTT（配列番号７）
プライマー８：5'- ACAAACACTTCAAAACACCA（配列番号８）
【００２４】
プライマー５（配列番号５）とプライマー６（配列番号６）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンを検出する99bpの増幅産物が得られる。
一方、プライマー７（配列番号７）とプライマー８（配列番号８）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならば、これらのプライマーにより、100bpの増幅産物が得られる。
【００２５】
すなわち、REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンにメチル化が認められる場合は99bpの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するプロモーター領域のシトシンにメチル化が認められない場合は100bpの遺伝子増幅産物が認められることになる。REC8遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号５〜８のプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンのメチル化に応じて塩基数の異なるＤＮＡの増幅を確認することができる。
【００２６】
本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の塩基配列は、SERPINB5遺伝子についてはGenebank Accession No. AC0903071に示す如くである。これらの遺伝子のプロモーター領域又は5'領域に存在するＣｐＧ領域の核酸増幅用プライマーとして、以下のものを使用することができる。
【００２７】
SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー９：5'- ATTTTTCGGTTTTGCGTGGGTC（配列番号９）
プライマー１０：5'- ACCCAACTCCACGCCCCG（配列番号１０）
プライマー１１：5'- TATTTTTTGGTTTTGTGTGGGTT（配列番号１１）
プライマー１２：5'- CCCAACTCCACACCCCA（配列番号１２）
【００２８】
プライマー９（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１０）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、この２つのプライマーにより、メチル化シトシンを検出する228bpの増幅産物が得られる。
一方、プライマー１１（配列番号１１）とプライマー１２（配列番号１２）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もしメチル化シトシンが存在しないならば、これらのプライマーにより脱メチル化を検出する122bpの増幅産物が得られる。
【００２９】
すなわち、SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンにメチル化が認められる場合は228bpの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するプロモーター領域のシトシンにメチル化が認められない場合は122bpの遺伝子増幅産物が認められることになる。SERPINB5遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号９〜１２のプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域のシトシンのメチル化に応じて塩基数の異なるＤＮＡの増幅を確認することができる。
【実施例】
【００３０】
本発明の理解を助けるために、実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３１】
（実施例１）がん関連種遺伝子における特定ゲノムのメチル化について
本実施例では、ヒト子宮頸がん細胞株９種について、ＨＰＶ感染の有無を確認し、各細胞株におけるがん関連遺伝子１０種について、ＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲ法で解析した。ヒト子宮頸がん細胞株としては、ＣＸ−８、ＣＸ−１、ＣＸ−６、ＥＭ−１、ＥＭ−２、ＣＸ−７、ＣＸ−２、ＣＸ−５、ＣＸ−３を用い、遺伝子としてはＲＡＲＢ、ＦＨＩＴ、ＴＥＲＣ、ｐ１６、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＰＴＥＮについて解析を行なった。
【００３２】
その結果、図１のパネルに示すように、ＥＭ−２、ＣＸ−７及びＣＸ−２については、ＨＰＶの感染は認められず、その他の細胞についてはＨＰＶ感染を認めた。各遺伝子において２種以上、好ましくは４種以上においてメチル化異常が認められた場合、子宮頸がんと判断できるものと考えられた。なお、図１において、「Ｍ」とは、各遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域におけるメチル化を認めたことを意味し、「なし」とは満ちるかを認めないことを意味する。
【００３３】
（実施例２）３種のエピジェネティクスマーカーのメチル化について（１）
実施例では、実施例１で用いたヒト子宮頸がん細胞株９種について、３種のエピジェネティクスマーカーＭＩＫ１及びＭＩＫ２の遺伝子についてはメチル化を、ＭＩＫ３遺伝子については脱メチル化について確認した。
【００３４】
本発明における子宮頸がん検査用マーカーの対象となる遺伝子は、ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３である。具体的には、ＭＩＫ１及び／又はＭＩＫ２のいずれかの遺伝子においてメチル化（Ｍ）、あるいはＭＩＫ３遺伝子の脱メチル化（Ｕ）が、子宮頸がん検査用マーカーとなりえる。ＭＩＫ１はheparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 (HS3ST2)遺伝子、ＭＩＫ２はREC8 homolog（REC8）遺伝子、ＭＩＫ３はserpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 5（SERPINB5）遺伝子であり、これらの遺伝子におけるプロモーター領域のＣｐＧ領域がメチル化又は脱メチル化を検出することにより、子宮頸がん発症高リスク群を検査することができる。
【００３５】
HS3ST2遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー１：5'-GTCGGTAGCGCGTTTCGTTC（配列番号１）
プライマー２：5'-GACGACGACGCGACTATAC（配列番号２）
プライマー３：5'- GAGTTGGTAGTGTGTTTTGTTT（配列番号３）
プライマー４：5'- CACTCACAAAACACTCAACA（配列番号４）
【００３６】
プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、プライマー３（配列番号３）とプライマー４（配列番号４）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されている。
【００３７】
REC8遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー５：5'- GGATATTTGGCGTTTTCGATTC（配列番号５）
プライマー６：5'- GAACGCTTCGAAACACCG（配列番号６）
プライマー７：5'- GGATATTTGGTGTTTTTGATTT（配列番号７）
プライマー８：5'- ACAAACACTTCAAAACACCA（配列番号８）
【００３８】
プライマー５（配列番号５）とプライマー６（配列番号６）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、プライマー７（配列番号７）とプライマー８（配列番号８）はメチル化シトシンの存在しないアレルのみにハイブリダイズするように設計されている。
【００３９】
SERPINB5遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。
プライマー９：5'- ATTTTTCGGTTTTGCGTGGGTC（配列番号９）
プライマー１０：5'- ACCCAACTCCACGCCCCG（配列番号１０）
プライマー１１：5'- TATTTTTTGGTTTTGTGTGGGTT（配列番号１１）
プライマー１２：5'- CCCAACTCCACACCCCA（配列番号１２）
【００４０】
プライマー９（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１０）はメチル化シトシンの存在するアレルにハイブリダイズするように設計されており、プライマー１１（配列番号１１）とプライマー１２（配列番号１２）はメチル化シトシンの存在しないアレル、即ち脱メチル化のみにハイブリダイズするように設計されている。
【００４１】
その結果、図２のパネルに示すように、ＨＰＶの感染を認めないＥＭ−２を除き、ＨＰＶ感染を認めたその他の細胞について、いずれの場合もＭＩＫ１及びＭＩＫ２については、メチル化（Ｍ）を認め、ＭＩＫ３については脱メチル化（Ｕ）を示し、脱メチル化を認めた。
【００４２】
（実施例３）３種のエピジェネティクスマーカーのメチル化について（２）
本実施例では、子宮頸がん７症例から採取した膣洗浄液について、３種のエピジェネティクスマーカーＭＩＫ１及びＭＩＫ２各遺伝子のメチル化、並びにＭＩＫ３の脱メチル化を確認した。
【００４３】
その結果、図３のパネルに示すように、各検体のうち１７３ＴについてはＨＰＶの感染を認めず、その他については感染を認めた。ＨＰＶの感染を認めない１７３Ｔ及び、ＨＰＶ感染を認めたその他の検体について、いずれの場合もＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてメチル化（Ｍ）を認め、ＭＩＫ３については、脱メチル化（Ｕ）を示した。ＭＩＫ３のＵについても、マーカーとなりえるものと思われた。なお、発がんの過程ではＨＰＶが関与していても、臨床検体ではＨＰＶが陰性化してしまう可能性も考えられる。
【００４４】
（実施例４）３種のエピジェネティクスマーカーのメチル化について（３）
本実施例では、子宮頸部細胞診７１株のうち、異常を認めた２３症例について、３種のエピジェネティクスマーカーについてメチル化の有無を確認した。各検体は全てＨＰＶ感染を認めた。
【００４５】
その結果、図４のパネルに示すように、被検者４、５、１０、１４及び１８についてはＭＩＫ１のメチル化を認めなかったが、細胞診で異常を認めなかった被検者４、５を除き、ＭＩＫ２でメチル化を認めるか、又はＭＩＫ３で脱メチル化を認めた。以上の結果、ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはメチル化を認めるか、あるいはＭＩＫ３について、脱メチル化を認めることで、ＨＰＶ感染者における子宮頸がんが発症する子宮頸がん発症高リスク群を検出しうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上詳述したように、本発明の子宮頸がん発症高リスク群の検査用マーカーによれば、ハイリスクＨＰＶに感染した場合の子宮頸がん発症高リスク群を検出することができる。本発明の検査方法は、子宮頸部細胞診を行なった患者について、膣洗浄液を検体として利用できることから、一度採取した検体を有効に活用することができ、被検者に対しても低い負担で検査を行うことができる。また、本発明の検査方法により検出された子宮頸がん発症高リスク群では、ＨＰＶに感染に対して予防的に対応することができ、また感染後であっても、より効果的な治療方法を提供することができる。一方、高リスク群ではないと判断された場合には、不必要な処理を行うことなく、効果的に治療を施すことができ、医療経済の軽減化の一助ともなりうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３から選択されるいずれかの遺伝子を含む子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項２】
遺伝子が、ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなり、ＭＩＫ３についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡが脱メチル化された遺伝子からなるものである、請求項１に記載の子宮頸がん発症高検査用マーカー。
【請求項３】
さらに、ＲＡＲＢ、ＦＨＩＴ、ＴＥＲＣ、ｐ１６、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＰＴＥＮから選択される少なくとも２種の遺伝子を含む、請求項１又は２に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項４】
請求項２に記載の各遺伝子が、プロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなる、請求項３に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項５】
子宮頸がん検査用マーカーが、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測するマーカーである、請求項１〜４のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項６】
被検者から取得した検体から、請求項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを検出することを特徴とする、子宮頸がんの検査方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、子宮頸がんの検査方法：
１）被検者から取得した検体から、ＤＮＡを抽出する工程；
２）抽出したＤＮＡについて、請求項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを構成するＤＮＡを増幅しうるプライマーを用いて、ＤＮＡを増幅させる工程；
３）増幅産物を検出する工程。
【請求項８】
子宮頸がんの検査が、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測する検査である、請求項６又は７に記載の子宮頸がんの検査方法。
【請求項９】
各遺伝子マーカー検出用のプライマーを含む、子宮頸がん検査用キット。
【請求項１】
ＭＩＫ１、ＭＩＫ２及びＭＩＫ３から選択されるいずれかの遺伝子を含む子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項２】
遺伝子が、ＭＩＫ１及びＭＩＫ２についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなり、ＭＩＫ３についてはプロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡが脱メチル化された遺伝子からなるものである、請求項１に記載の子宮頸がん発症高検査用マーカー。
【請求項３】
さらに、ＲＡＲＢ、ＦＨＩＴ、ＴＥＲＣ、ｐ１６、ＴＩＭＰ３、ＣＤＨ１、ＧＳＴＰ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＰＴＥＮから選択される少なくとも２種の遺伝子を含む、請求項１又は２に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項４】
請求項２に記載の各遺伝子が、プロモーター領域のＣｐＧ領域におけるＤＮＡがメチル化された遺伝子からなる、請求項３に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項５】
子宮頸がん検査用マーカーが、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測するマーカーである、請求項１〜４のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカー。
【請求項６】
被検者から取得した検体から、請求項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを検出することを特徴とする、子宮頸がんの検査方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、子宮頸がんの検査方法：
１）被検者から取得した検体から、ＤＮＡを抽出する工程；
２）抽出したＤＮＡについて、請求項１〜５のいずれか１に記載の子宮頸がん検査用マーカーを構成するＤＮＡを増幅しうるプライマーを用いて、ＤＮＡを増幅させる工程；
３）増幅産物を検出する工程。
【請求項８】
子宮頸がんの検査が、ヒトパピローマウイルス感染後の子宮頸がんの発症リスクを予測する検査である、請求項６又は７に記載の子宮頸がんの検査方法。
【請求項９】
各遺伝子マーカー検出用のプライマーを含む、子宮頸がん検査用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−４４９２４（Ｐ２０１２−４４９２４Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９００８９（Ｐ２０１０−１９００８９）
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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