安定したナノレポーター
本発明は、生体分子試料中の個々の標的分子の検出および定量のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、標的分子に結合することができ、プローブの固有に検出可能なシグナルに基づいて標的分子を同定することができる、改善された、安定したナノレポータープローブに関する。そのようなプローブを作製し、使用するための方法が提供されるように、プローブ中への包含のために標的特異的配列を同定するための方法もまた、提供される。ある種のナノレポーター成分のポリヌクレオチド配列もまた、提供される。プローブは、診断、予後、品質管理、およびスクリーニングの適用において使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固有に標識されたナノレポータープローブの集団であって、前記ナノレポータープローブが、
ｉ）固有の標的特異的領域および
ｉｉ）固有の、設計されたナノレポーターを含む領域
を含み、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、前記標識結合領域が、設計されたポリヌクレオチド配列の集団から選択され、前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列が、特異的な検出可能な分子を明示しており、それぞれのナノレポーターが、それを前記集団中の他のナノレポーターと区別する検出可能なシグナルを有する、集団。
【請求項２】
それぞれのバックボーンのそれぞれの標識結合領域がその同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、前記相補的ポリヌクレオチド配列が約１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項１に記載の集団。
【請求項４】
前記相補的ポリヌクレオチド配列が約３／２のＧ／Ｃ比を有する、請求項３に記載の集団。
【請求項５】
前記標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項１に記載の集団。
【請求項６】
前記ナノレポータープローブが定常領域をさらに含み、前記定常領域が複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項７】
前記標識結合領域が同様のアデニン含量を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項８】
アデニン塩基が、少なくとも平均８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項７に記載の集団。
【請求項９】
前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項１に記載の集団。
【請求項１０】
前記アデニン塩基が、約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項９に記載の集団。
【請求項１１】
前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項１２】
前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項１３】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項１３に記載の集団。
【請求項１５】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項１２に記載の集団。
【請求項１６】
前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項１５に記載の集団。
【請求項１７】
前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項１に記載の集団。
【請求項１８】
ナノレポータープローブの前記集団が、（ａ）少なくとも１つの標的分子および少なくとも１つのナノレポータープローブを含む、それぞれのナノレポータープローブとの少なくとも１つの分子複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）試料中の前記分子複合体のそれぞれの１つまたは複数の分子の存在を個々にカウントするステップを含む方法によって、前記試料中の標的分子の集団を検出するのに使用されるとき、前記試料の標準化の後の前記分子複合体のそれぞれのバックグラウンドを超えるカウント数が、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブと比較した場合、少なくとも２倍高い、請求項１に記載の集団。
【請求項１９】
その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列の融解温度（Ｔｍ）が約８０℃以上である、請求項１に記載の集団。
【請求項２０】
試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するための方法であって、
（１）（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに
（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１つの分子複合体を形成するステップであって、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列が、特異的な検出可能な分子を明示している、ステップと、
（２）１つまたは複数の分子複合体または前記少なくとも１つの分子複合体の少なくとも一部の存在を個々にカウントして、前記試料中の前記少なくとも１つの標的分子の存在を決定するステップとを含む、方法。
【請求項２１】
前記分子複合体の有効な分子カウントの百分率が約１２．５％よりも高い、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記カウント数が、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブを使用する場合に得られるカウントよりも少なくとも２倍高い、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｍ１３ ＤＮＡを含む前記ナノレポーターが、共に共有結合された複数のＭ１３ ＤＮＡ領域を含む一本鎖バックボーンを含み、それぞれの領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが、Ｍ１３ ＤＮＡを含む前記ナノレポータープローブにハイブリダイズした場合の、Ｍ１３ ＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列の融解温度よりも高い、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが約８０℃以上である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
それぞれの標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
それぞれの選択された標識結合領域が、前記バックボーン中の他の選択された標識結合領域とは異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
それぞれの標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブが定常領域をさらに含み、前記定常領域が複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識結合領域が同様のアデニン含量を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
アデニン塩基が、少なくとも平均８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記アデニン塩基が、約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で少なくとも平均８塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
それぞれの複合体が、（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、複数の分子複合体を形成することを含む方法によって、複数の標的分子の存在を決定するステップをさらに含み、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域が１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれのプローブが異なるナノレポーター領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、または５００の異なる標的分子の存在が決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的分子が核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸が、少なくとも１つの遺伝的突然変異、少なくとも１つの体細胞突然変異、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、少なくとも１つの点突然変異、少なくとも１つの欠失突然変異、少なくとも１つの挿入突然変異、少なくとも１つの染色体転座、またはその組合せを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的分子が診断の指標となる、請求項２０に記載の方法。
【請求項４６】
ｉ）固有の標的特異的領域および
ｉｉ）線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の設計された標識結合領域を含む領域
を含む、固有に標識されたナノレポータープローブであって、それぞれの標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、それぞれの選択される標識結合領域が他の選択される標識結合領域とは異なり、
それぞれの標識結合領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、ナノレポータープローブ。
【請求項４７】
前記相補的ポリヌクレオチド配列が約３／２のＧ／Ｃ比を有する、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項４８】
複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む定常領域をさらに含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項４９】
前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５０】
前記アデニン塩基が平均約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項４９に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５１】
前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５２】
前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５３】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項５２に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５４】
前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項５３に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５５】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項５２に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５６】
前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項５５に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５７】
前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５８】
前記複数の標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５９】
少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製する方法であって、
ｉ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基および約５０％のＧ／Ｃ含量を含む複数の標識結合領域を組み合わせるステップであって、それぞれの選択された標識結合領域が他の選択された標識結合領域とは異なるステップ、
ｉｉ）線状の組合せにおいて前記複数の標識結合領域を互いに共有結合させるステップ、ならびに
ｉｉｉ）前記標識結合領域に相補的ポリヌクレオチド配列をハイブリダイズさせるステップ
を含み、前記相補的ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加している、方法。
【請求項６０】
標的特異的領域に前記標識されたナノレポーターを付加させることによって、標識ナノレポータープローブを調製するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製するためのキットであって、
ａ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基、約５０％のＧ／Ｃ含量を含む少なくとも３つの標識結合領域、および
ｂ）検出可能な分子を付加した、少なくとも３つの相補的ポリヌクレオチド配列
を含み、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、キット。
【請求項６３】
少なくとも３つの標的特異的プローブをさらに含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項１】
固有に標識されたナノレポータープローブの集団であって、前記ナノレポータープローブが、
ｉ）固有の標的特異的領域および
ｉｉ）固有の、設計されたナノレポーターを含む領域
を含み、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、前記標識結合領域が、設計されたポリヌクレオチド配列の集団から選択され、前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列が、特異的な検出可能な分子を明示しており、それぞれのナノレポーターが、それを前記集団中の他のナノレポーターと区別する検出可能なシグナルを有する、集団。
【請求項２】
それぞれのバックボーンのそれぞれの標識結合領域がその同じバックボーン中の他の標識結合領域とは異なる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、前記相補的ポリヌクレオチド配列が約１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項１に記載の集団。
【請求項４】
前記相補的ポリヌクレオチド配列が約３／２のＧ／Ｃ比を有する、請求項３に記載の集団。
【請求項５】
前記標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項１に記載の集団。
【請求項６】
前記ナノレポータープローブが定常領域をさらに含み、前記定常領域が複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項７】
前記標識結合領域が同様のアデニン含量を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項８】
アデニン塩基が、少なくとも平均８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項７に記載の集団。
【請求項９】
前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項１に記載の集団。
【請求項１０】
前記アデニン塩基が、約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項９に記載の集団。
【請求項１１】
前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項１２】
前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の集団。
【請求項１３】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項１３に記載の集団。
【請求項１５】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項１２に記載の集団。
【請求項１６】
前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項１５に記載の集団。
【請求項１７】
前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項１に記載の集団。
【請求項１８】
ナノレポータープローブの前記集団が、（ａ）少なくとも１つの標的分子および少なくとも１つのナノレポータープローブを含む、それぞれのナノレポータープローブとの少なくとも１つの分子複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）試料中の前記分子複合体のそれぞれの１つまたは複数の分子の存在を個々にカウントするステップを含む方法によって、前記試料中の標的分子の集団を検出するのに使用されるとき、前記試料の標準化の後の前記分子複合体のそれぞれのバックグラウンドを超えるカウント数が、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブと比較した場合、少なくとも２倍高い、請求項１に記載の集団。
【請求項１９】
その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列の融解温度（Ｔｍ）が約８０℃以上である、請求項１に記載の集団。
【請求項２０】
試料中の少なくとも１つの標的分子の存在を決定するための方法であって、
（１）（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに
（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１つの分子複合体を形成するステップであって、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれの相補的ポリヌクレオチド配列が、特異的な検出可能な分子を明示している、ステップと、
（２）１つまたは複数の分子複合体または前記少なくとも１つの分子複合体の少なくとも一部の存在を個々にカウントして、前記試料中の前記少なくとも１つの標的分子の存在を決定するステップとを含む、方法。
【請求項２１】
前記分子複合体の有効な分子カウントの百分率が約１２．５％よりも高い、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記カウント数が、Ｍ１３ ＤＮＡを含むナノレポータープローブを使用する場合に得られるカウントよりも少なくとも２倍高い、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｍ１３ ＤＮＡを含む前記ナノレポーターが、共に共有結合された複数のＭ１３ ＤＮＡ領域を含む一本鎖バックボーンを含み、それぞれの領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが、Ｍ１３ ＤＮＡを含む前記ナノレポータープローブにハイブリダイズした場合の、Ｍ１３ ＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列の融解温度よりも高い、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
その標識結合領域にハイブリダイズした場合の前記相補的ポリヌクレオチド配列のＴｍが約８０℃以上である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
それぞれの標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
それぞれの選択された標識結合領域が、前記バックボーン中の他の選択された標識結合領域とは異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
それぞれの標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブが定常領域をさらに含み、前記定常領域が複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識結合領域が同様のアデニン含量を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
アデニン塩基が、少なくとも平均８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記アデニン塩基が、約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で少なくとも平均８塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
それぞれの複合体が、（ａ）少なくとも１つの標的分子ならびに（ｂ）固有の標的特異的領域および固有の設計されたナノレポーターを含む領域を含む少なくとも１つのプローブを含む、複数の分子複合体を形成することを含む方法によって、複数の標的分子の存在を決定するステップをさらに含み、前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが固有の線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の標識結合領域を含み、それぞれの標識結合領域が１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それぞれのプローブが異なるナノレポーター領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも５、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、または５００の異なる標的分子の存在が決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的分子が核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸が、少なくとも１つの遺伝的突然変異、少なくとも１つの体細胞突然変異、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、少なくとも１つの点突然変異、少なくとも１つの欠失突然変異、少なくとも１つの挿入突然変異、少なくとも１つの染色体転座、またはその組合せを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的分子が診断の指標となる、請求項２０に記載の方法。
【請求項４６】
ｉ）固有の標的特異的領域および
ｉｉ）線状の組合せにおいて共に共有結合された複数の設計された標識結合領域を含む領域
を含む、固有に標識されたナノレポータープローブであって、それぞれの標識結合領域が、約８００〜１３００ヌクレオチド塩基を含み、約５０％のＧ／Ｃ含量を有し、それぞれの選択される標識結合領域が他の選択される標識結合領域とは異なり、
それぞれの標識結合領域が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加した相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、ナノレポータープローブ。
【請求項４７】
前記相補的ポリヌクレオチド配列が約３／２のＧ／Ｃ比を有する、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項４８】
複数の繰り返しヌクレオチド配列を含む定常領域をさらに含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項４９】
前記標識結合領域が、アデニン塩基の規則的に繰り返されたパターンを含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５０】
前記アデニン塩基が平均約８〜１６ヌクレオチド塩基毎の間隔を置いて配置される、請求項４９に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５１】
前記標識結合領域が約３５〜４５％のチミン含量を含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５２】
前記相補的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５３】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項５２に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５４】
前記検出可能な分子が前記アミノアリル修飾ウラシル塩基に付加している、請求項５３に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５５】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列中で平均約８〜１６塩基毎の間隔を置いて配置される複数のアミノアリル修飾ウラシル塩基を含む、請求項５２に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５６】
前記検出可能な分子が前記アリル修飾ウラシル塩基のそれぞれに付加している、請求項５５に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５７】
前記検出可能な分子が蛍光色素である、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５８】
前記複数の標識結合領域が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択される鋳型配列から生成される、請求項４６に記載のナノレポータープローブ。
【請求項５９】
少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製する方法であって、
ｉ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基および約５０％のＧ／Ｃ含量を含む複数の標識結合領域を組み合わせるステップであって、それぞれの選択された標識結合領域が他の選択された標識結合領域とは異なるステップ、
ｉｉ）線状の組合せにおいて前記複数の標識結合領域を互いに共有結合させるステップ、ならびに
ｉｉｉ）前記標識結合領域に相補的ポリヌクレオチド配列をハイブリダイズさせるステップ
を含み、前記相補的ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の検出可能な分子を付加している、方法。
【請求項６０】
標的特異的領域に前記標識されたナノレポーターを付加させることによって、標識ナノレポータープローブを調製するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも１つの固有に標識されたナノレポーターを調製するためのキットであって、
ａ）それぞれが約８００〜１３００ヌクレオチド塩基、約５０％のＧ／Ｃ含量を含む少なくとも３つの標識結合領域、および
ｂ）検出可能な分子を付加した、少なくとも３つの相補的ポリヌクレオチド配列
を含み、前記相補的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１／１のＧ／Ｃ比を有する、キット。
【請求項６３】
少なくとも３つの標的特異的プローブをさらに含む、請求項６２に記載のキット。
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５００００７（Ｐ２０１２−５００００７Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３１８３（Ｐ２０１１−５２３１８３）
【出願日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３７９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９８２６
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５１１０３７３６６）ナノストリング テクノロジーズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３７９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９８２６
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（５１１０３７３６６）ナノストリング テクノロジーズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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