安定同位体元素を有するポリペプチド混合物の合成方法
【課題】 改良された蛋白質のＮＭＲ測定法で利用可能な安定同位体元素でラベル化されたポリペプチド混合物の製造法を提供する。
【解決手段】下記の工程を含む、安定同位体元素でラベル化されたペプチド混合物の製造方法。１）ｎ個のアミノ酸残基からなるペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用意する工程３）２）で用意した合成用アミノ酸カクテルを用いて１）で決定したアミノ酸配列からなるペプチドを合成する工程。 従来の方法のようにアミノ酸残基の個数分のポリペプチドを、ラベル化するアミノ酸残基を変えながら用意する必要がなく、タンパク質のＮＭＲによる測定作業を著しく簡便化する、タンパク質の新たなＮＭＲ測定法を可能にするポリペプチドを製造することができる。
【解決手段】下記の工程を含む、安定同位体元素でラベル化されたペプチド混合物の製造方法。１）ｎ個のアミノ酸残基からなるペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用意する工程３）２）で用意した合成用アミノ酸カクテルを用いて１）で決定したアミノ酸配列からなるペプチドを合成する工程。 従来の方法のようにアミノ酸残基の個数分のポリペプチドを、ラベル化するアミノ酸残基を変えながら用意する必要がなく、タンパク質のＮＭＲによる測定作業を著しく簡便化する、タンパク質の新たなＮＭＲ測定法を可能にするポリペプチドを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質（ポリペプチド）の立体構造に関する情報をＮＭＲを用いて獲得する方法に有用な、新規なポリペプチドの製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の立体構造に関する情報、例えばタンパク質の立体構造、酵素タンパク質の反応触媒機構、あるいはタンパク質とそれに結合するリガンドとの構造活性相関などを解析する手法として広く用いられている方法に、溶液中のタンパク質を対象とするＮＭＲ法がある。
【０００３】
多くの場合、タンパク質を対象にしたＮＭＲによる解析は、タンパク質中の窒素原子や炭素原子をＮＭＲでの観測が容易な安定同位体元素である１５Ｎや１３Ｃとし、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ（heteronuclear single quantum coherence）スペクトルや１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル等の観測をすることで行われる。さらに測定されたシグナルについて、タンパク質を構成するアミノ酸の構成原子に対応させるいわゆるシグナルの帰属を行い、タンパク質の立体構造情報が得られる。
【０００４】
ＮＭＲ法は、溶液状態のタンパク質を測定対象とするため、より自然な（あるいは天然の）状態にあるタンパク質の構造やその動きを測定することができること、また一般に難しい作業として理解されているタンパク質の結晶の調製が不要であることなどが、同じくタンパク質の立体構造に関する情報を解析する有効な手段であるＸ線回折法と比較したときの利点として考えられている。
【０００５】
一方、ＮＭＲ法には、タンパク質というヘテロな高分子を測定対象とすることに伴う幾つかの問題があることもまた事実である。例えば、測定対象とするタンパク質の高濃度溶液が必要となること、現状の解析技術並びに装置では、Ｘ線回折法による解析に比べて小さな（低分子量の）タンパク質に測定対象が限られてしまうこと、等がある。
【０００６】
また、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法は、非常に感度の高いＮＭＲ測定法ではあるが、この１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法で得られるシグナルのアミノ酸残基への帰属を行うためには、通常、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法とは別に感度の低い複数種類の３次元ＮＭＲスペクトル等の測定を行い、さらに熟練者がこれらのスペクトルを組み合わせた複雑な解析を行わねばならない。この場合における３次元ＮＭＲスペクトルの測定は長時間を要するものであり、その間のタンパク質の失活、変性も重大な問題であった。
【０００７】
係る問題に対して、１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣ測定法のみを用いてＮＭＲ測定を行い、得られるシグナルをアミノ酸残基に帰属する方法も提案されている（特許文献１、非特許文献１など）。しかしながら、この方法は、一つのアミノ酸残基のみを安定同位体元素でラベル化したタンパク質を、シグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基の個数に相当する数だけ調製し、それぞれについて１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法等を行って測定しなければならないことから、実際的な方法であるとは言い難いものであった。
【０００８】
より簡便なＮＭＲ法による蛋白質の測定方法として、１５Ｎ／１３Ｃ標識アミノ酸と１５Ｎ標識アミノ酸等を組み合わせて合成した蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行なう方法が報告されている（特許文献２）。しかし、かかる方法もラベル化されたポリペプチドを何種類も調製する必要がある他、測定しようとするアミノ酸残基を含んだ前後のアミノ酸配列の種類によっても制限を受けているのが現状である。
【非特許文献１】Yabuki, T. et al., J. Biomol. NMR,、１９９８年、第１１巻、第２９５−３０６頁
【特許文献１】ＷＯ２００２／０３３４０６
【特許文献２】ＷＯ２００５／０７３７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＮＭＲ法によるタンパク質の解析において、上記のような煩わしさを解消することの出来る新しい測定方法と、その方法を可能にするＮＭＲ測定に好適なポリペプチドの合成法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、測定対象となるポリペプチドを構成するアミノ酸残基への安定同位体元素による従来のラベリング方法を改め、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基のラベル化比率（ラベリング比率とする）を互いに異なる比率となるように安定同位体元素でラベル化することによって、もしくはシグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基を他のアミノ酸残基とは異なるラベル化比率となるように安定同位体元素でラベル化することによって、原理的にわずか２種類のポリペプチド混合物を合成し、測定対象とするだけで、ＮＭＲシグナルのアミノ酸残基への帰属を可能にする方法を確立した。下記の（１）〜（５）の各発明は、この新しいシグナル帰属方法で必要となる、安定同位体元素でラベルされたポリペプチドの合成法に関する。
【００１１】
（１）下記の工程を含む、安定同位体元素でラベル化されたポリペプチド混合物の製造方法。
【００１２】
１）ｎ個のアミノ酸残基からなるペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、ここでＸは任意のアミノ酸を、ｎは２以上の任意の整数を示す、
２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用意する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ペプチドを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なり、及び
３）２）で用意した合成用アミノ酸カクテルを用いて１）で決定したアミノ酸配列からなるペプチドを合成する工程。
【００１３】
（２）安定同位体元素が１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈよりなる群から選ばれる一以上の安定同位体元素である、（１）に記載の製造方法。
【００１４】
（３）アミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子が、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、（２）に記載の製造方法。
【００１５】
（４）ペプチド結合を形成する窒素原子、炭素原子もしくは水素原子が選択的にそれぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、（２）に記載の製造方法。
【００１６】
（５）アミノ酸カクテルが化学合成用の保護基によって修飾されたアミノ酸のカクテルである、（１）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法により製造されるポリペプチド混合物は、次に概略を述べる本発明者らによって同時に考案されたＮＭＲ測定法において利用されることで、極めて高い有用性を有している。
【００１８】
この別発明に係るＮＭＲ測定法は、ポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基を互いに異なる比率で安定同位体元素を含む様にラベル化するか、またはシグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基を他のアミノ酸残基とは異なる比率で安定同位体元素を含む様にラベル化すること、前記ポリペプチドと同一のアミノ酸配列からなり、かつ全てのアミノ酸残基もしくはシグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基が同一の比率で前記安定同位体元素と同種の安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチド混合物を別途製造すること、前記２種類のポリペプチド混合物についてＮＭＲ測定を行ってそれぞれのシグナルを測定すること、および得られたシグナル強度の比から各シグナルをアミノ酸残基に帰属させること、を含む方法である。
【００１９】
この別発明に掛かるＮＭＲ測定法では、ＮＭＲ測定に必要なポリペプチド混合物は２種類で足り、ＨＳＱＣ測定法のみでシグナル帰属を行うことを目的とする従来の方法のように、アミノ酸残基の個数分のポリペプチドを、ラベル化するアミノ酸残基を変えながら用意する必要がない点で、タンパク質のＮＭＲによる測定作業を著しく簡便化する方法である。本発明の製造方法は、この新規なＮＭＲ測定法を可能とするポリペプチド混合物を供給するという点において、極めて重要な意義を有する発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（１）本発明のポリペプチドの製造法
以下、Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０（Ｘ１〜Ｘ１０はそれぞれ任意のアミノ酸を示す）というアミノ酸配列からなる１０残基のポリペプチドＰ１０の混合物を例にし、Ａ）１０アミノ酸残基の全てについてシグナル帰属を行う場合に必要となるポリペプチド混合物の製造方法と、Ｂ）幾つかの、ここでは例として４つのアミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８についてのシグナル帰属を行う場合に必要となるポリペプチド混合物の製造方法とに分けて、本発明の製造法の詳細を説明する。
【００２１】
Ａ）１０アミノ酸残基の全てについてシグナル帰属を行う場合
１）アミノ酸配列の決定
まず、ポリペプチドＰ１０のアミノ酸配列を、Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０の様に決定する。アミノ酸配列は、ＮＭＲによって測定しようとするポリペプチドを構成するアミノ酸配列をそのまま再現すればよい。
【００２２】
なお、Ｘ１〜Ｘ１０は互いに同じアミノ酸であってもよい。この場合のポリペプチドは、一種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドとなる。またＸ１〜Ｘ１０が全て互いに異なるアミノ酸であってもよい。この場合のポリペプチドは１０種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドである。また、同じアミノ酸が２残基以上存在し、かつその様なアミノ酸が１種以上存在するポリペプチドであっても良い。この場合のポリペプチドは、２〜９種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドである。
【００２３】
この様に、本発明においてポリペプチドを構成するアミノ酸残基の種類には制限がなく、またアミノ酸配列にも制限がない。従って、どの様なアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、本発明の方法により製造することができる。このことは、ＮＭＲによって測定しようとするポリペプチドのアミノ酸配列にも一切の制限はなく、いかなるアミノ酸配列からなるポリペプチドでも、本発明に関連する別発明である新たなＮＭＲシグナル帰属法の測定対象物となり得ることを意味する。
【００２４】
２）ラベリング比率の決定
次に、このアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０の各アミノ酸残基について、安定同位体元素によるラベリング比率を、例えば１０％、２０％、・・・９０％及び１００％と、互いに異なるように設定する。
【００２５】
本発明にいうアミノ酸残基についての安定同位体元素によるラベリング比率とは、本発明の方法によって製造されるポリペプチド混合物中の、安定同位体元素でラベリングされている特定のアミノ酸残基を有するポリペプチドの存在比率（％）を意味する。なお、本発明にいうポリペプチド混合物とは、アミノ酸配列が異なるポリペプチドの混合物ではなく、同一のアミノ酸配列からなるがアミノ酸残基間の安定同位体元素の含有量が異なるポリペプチドの混合物、換言すればアミノ酸残基間の安定同位体元素によるラベル化の程度という点で異なるポリペプチドの混合物を意味する。
【００２６】
例えば、アミノ酸残基Ｘ１のラベリング比率を１０％に設定することは、ポリペプチドＰ１０の混合物中に、安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１を有しているポリペプチドを１０％存在させることを意味する。同様にアミノ酸残基Ｘ１０のラベリング比率を１００％に設定することは、安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１０を有しているポリペプチドを１００％存在させること、換言すればポリペプチドＰ１０の混合物中のポリペプチドは全て安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１０を有しているポリペプチドとすることを意味する。
【００２７】
本発明では、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基が互いに異なるラベリング比率（％）を有するように、すなわち同一のラベリング比率を有するアミノ酸残基が２以上存在しないように設定する必要がある。
【００２８】
ただし、この条件を維持する他には格別の制限はない。例えば、上記の例では残基間のラベリング比率の差を１０％づつ異なる値に設定したが、その差を１０％と一定にすることも、アミノ酸配列に沿って漸次的に増加あるいは減少させることも必ずしも必要ではなく、ラベリング比率はその値ならびに変動パターンにおいて全く任意に設定することができる。
【００２９】
また、ポリペプチド中の１アミノ酸残基だけ安定同位体元素を含まないように、すなわちラベリング比率を０％と設定してもよい。ただし、正確に言えば、ラベリング比率０％とは、用いる安定同位体元素の天然存在比（例えば１５Ｎでは０．４％）と同じ値のラベリング比率であるが、本発明では、便宜上、用いる安定同位体元素の各天然存在比をラベリング比率０％として表すことにする。
【００３０】
またポリペプチド中の１アミノ酸残基だけラベリング比率１００％と設定してもよい（１アミノ酸残基だけをラベル化するという意味ではない）。すなわち、ＮＭＲによって全てのアミノ酸残基のシグナル帰属を行おうとするときのポリペプチドの製造におけるラベリング比率は、用いる安定同位体元素の天然比率〜１００％の範囲内の、任意の値として設定することができる。
【００３１】
３）アミノ酸カクテルの調製とポリペプチド混合物の製造
次に、Ｘ１〜Ｘ１０それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、２）で設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ１〜ｘ１０（以下、アミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０と表す）を調製する。ただし、本発明においては、「安定同位体元素を有しない」とは「当該安定同位体元素を天然存在比で有する」ことを意味するものとする。
【００３２】
ポリペプチドＰ１０の混合物に即して具体的に言えば、ラベリング比率が１０％であるＸ１に対するアミノ酸カクテルｘ１としては、安定同位体元素を有するＸ１’の１重量部と当該安定同位体元素を含まないＸ１の９重量部とを混合して、安定同位体元素を有するＸ１’の含有率が１０％であるアミノ酸カクテルｘ１を調製することである。Ｘ２〜Ｘ１０についても同様に、それぞれのラベリング比率と同じ値の含有率でそれぞれ安定同位体元素を有するアミノ酸を含むアミノ酸カクテルｘ２〜ｘ１０を用意する。
【００３３】
このアミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０を原料として用いて、既に決定したアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるポリペプチドＰ１０の混合物を、当業者に公知の方法を用いて合成する。
【００３４】
以上の操作によって、先に決定されたアミノ酸配列ならびに設定されたラベリング比率を各アミノ酸残基について有するポリペプチドＰ１０の混合物を製造することができる。このポリペプチドＰ１０の混合物を一本のポリペプチドＰ１０として眺めれば、そのポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０というアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２・・・Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ１０％、２０％・・・９０％、１００％というラベリング比率に比例した強度のＮＭＲシグナルを与えるポリペプチドということができる。
【００３５】
Ｂ）４アミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８についてのシグナル帰属を行う場合
１）アミノ酸配列の決定
上記Ａと同じである。なお、シグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基の種類、配列上の位置には特に制限はない。
【００３６】
２）ラベリング比率の決定
ポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基ではなく、幾つかの特定のアミノ酸残基に関してのみＮＭＲによる測定対象とするときは、その特定対象とするアミノ酸残基のラベル化比率が他の全てのアミノ酸残基のラベル化比率と異なるように設定する必要がある。例えば、シグナル帰属を行おうとする４つのアミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８について、安定同位体元素によるラベリング比率を、例えばＸ２：２０％、Ｘ４：４０％、Ｘ６：６０％、Ｘ８：８０％等のように設定する。ラベリング比率は前記Ａ）の３）と同義である。
【００３７】
この様に、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の幾つかのみを対象とする場合、安定同位体元素によるラベル化は、対象とするアミノ酸残基だけについて行えばよく、対象ではないアミノ酸残基をラベル化する必要はない。また、上記の例では残基間のラベリング比率の差を２０％づつ異なる様に設定したが、その様に設定することも、アミノ酸配列に沿って漸次的に増加あるいは減少させることも必ずしも必要ではなく、ラベリング比率はその値ならびに変動パターンにおいて全く任意に設定することができる。
【００３８】
なお、対象とするアミノ酸残基に対して設定したラベリング比率とは異なるラベリング比率であれば、対象外のアミノ酸残基をラベル化するのは差し支えない。例えば、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９全部についてラベリング比率１０％としてもよく、２０％、４０％、６０％、８０％以外のラベリング比率をそれぞれ違えて設定してもよい。
【００３９】
３）アミノ酸カクテルの調製とポリペプチド混合物の製造
次に、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、２）で設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ２、ｘ４、ｘ６、ｘ８を調製する。この調製は上記Ａ）の３）と同様に行えばよい。
【００４０】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９ならびにＸ１０についてラベリング比率０％（用いる安定同位体元素の天然存在比）と設定したときは、当該安定同位体元素を有しないアミノ酸のみからなるアミノ酸カクテルを調製する。なお、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９ならびにＸ１０についてもラベリング比率を設定したときに、その設定に基づいて上記と同様にアミノ酸カクテルｘ１、ｘ３、ｘ５、ｘ７、ｘ９、ｘ１０を用意すればよい。なお、「当該安定同位体元素を有しない」の意味は、前記Ａ）の３）と同じである。
【００４１】
このアミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０を原料として用いて、既に決定したアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるポリペプチドＰ１０を、当業者に公知の方法を用いて合成する。
【００４２】
以上の操作によって、先に決定されたアミノ酸配列ならびに設定されたラベリング比率を各アミノ酸残基について有するポリペプチドＰ１０の混合物を製造することができる。このポリペプチドＰ１０の混合物を一本のポリペプチドとして眺めれば、そのポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０というアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８はそれぞれ２０％、４０％、６０％、８０％というラベリング比率に比例した強度のＮＭＲシグナルを与えるポリペプチドということができる。
【００４３】
上記Ａ）Ｂ）に説明した本発明の製造方法において利用可能な安定同位体元素としては、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈなどを挙げることができる。タンパク質等の立体構造解析の基本として多用されることや、スペクトル上でのシグナルの単純さ、さらには安価であること等を勘案すれば、安定同位体元素としては１５Ｎの利用が好ましい。
【００４４】
また一アミノ酸（アミノ酸残基）における安定同位体元素によるラベル化のの位置にも特別の制限はなく、一つのアミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子を、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化してもよいし、特定の位置にある窒素原子等だけをラベル化してもよい。例えば、ペプチド結合を構成する窒素原子、炭素原子あるいは水素原子を選択的にラベル化してもよい。
【００４５】
本発明では、ＮＭＲ測定によって得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基は、少なくとも全て同じ安定同位体元素を用いてラベル化する必要がある。上記Ａ）で言えば、Ｘ１、Ｘ２・・・Ｘ９、Ｘ１０は全て、例えば各残基中の窒素原子（窒素原子を側鎖に持たないアミノ酸ではペプチド結合を構成する窒素原子）を１５Ｎでラベル化する必要があり、また上記Ｂ）ではＸ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８は全て、例えば各残基中の炭素原子を１３Ｃでラベル化する必要がある。言い換えれば、測定対象とするアミノ酸残基は必ず共通する少なくとも一種の安定同位体元素でラベル化されている必要がある。ただし、同時に別種の安定同位体元素が一つのアミノ酸残基中にあるいはポリペプチド中に共存（二重標識化）していてもよい。例えば、一部あるいは全てのアミノ酸が、１５Ｎによるラベル化に加えて、１３Ｃや２Ｈでラベル化されていてもよい。
【００４６】
１５Ｎや１３Ｃでラベル化されたアミノ酸は既に市販されており、本発明はかかる市販のラベル化されたアミノ酸を利用することができる。また安定同位体元素を有する適当な化合物から、当業者に公知の方法に従って新たに所望のラベリングされたアミノ酸を合成し、これを用いても良い。また、１５Ｎや１３Ｃを唯一の窒素源あるいは炭素源とする培地で適当な微生物を培養して、ラベル化されたアミノ酸を製造させてもよい。
【００４７】
アミノ酸カクテルを用いたポリペプチド混合物の製造自体は、無細胞蛋白合成系や有機化学的手法などの当業者に公知の方法のいずれも利用することができるが、本発明では有機化学合成的手法、特にペプチドシンセサイザーを用いた合成が好ましい。
【００４８】
ペプチドシンセサイザーを用いたポリペプチドの合成では、原料となるアミノ酸はＦｍｏｃやｔＢｏｃなどの保護基によって修飾されたアミノ酸を用いることとなるが、かかる保護基を有する修飾アミノ酸においても、安定同位体元素でラベル化された修飾アミノ酸などは既に市販されており、当業者が容易に入手可能である。
【００４９】
（２）本発明により製造されるポリペプチド混合物の利用
本発明の方法により製造されるポリペプチド混合物は、別発明に係るタンパク質の新たなＮＭＲ測定法において利用される。ここでは、前記（１）のＡ）で例示したポリペプチドＰ１０の混合物の、別方法に係るタンパク質の新たなＮＭＲ測定法における使用例を説明する。
【００５０】
本発明の方法により製造されるポリペプチドＰ１０の混合物について、ある所定の条件下でＮＭＲ測定、典型的には１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを測定し、シグナルを得る。
【００５１】
このポリペプチドＰ１０の混合物の他に、同じアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなり、かつＸ１〜Ｘ１０のラベリング比率が全て同じ、例えば１０％であるポリペプチドＰ１０’の混合物を用意し、ポリペプチドＰ１０の混合物と同じＮＭＲ測定条件下でこのポリペプチドＰ１０’の混合物についての１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを測定し、シグナルを得る。
【００５２】
ここで、上記の２種類の混合物についてのＮＭＲスペクトルの測定を、各ポリペプチド量を等量となるように調節してそれぞれについて行うと、２種類の混合物から得られる各ＮＭＲシグナルは、いずれも同一アミノ酸配列からなるポリペプチドであるために、合計１０個のＨＳＱＣスペクトルのパターンは両者で同一となる。一方、２つのスペクトルパターンでそれぞれ対応するシグナル間のシグナル強度は、ポリペプチドＰ１０におけるラベリング比率に比例して異なっているはずである。具体的には、ポリペプチドＰ１０とポリペプチドＰ１０’との間の１０個の各対応スペクトル間のシグナル強度の比は、１：１〜１０：１になる。
【００５３】
このシグナル強度の比率は、ポリペプチドＰ１０とポリペプチドＰ１０’における各対応アミノ酸残基のラベリング比率の相違と同一となる。従って、シグナル強度の比が１：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ１由来のシグナルであり、シグナル強度の比が２：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ２由来のシグナルであり、同様の計算を繰り返せば、ＮＭＲスペクトルのＸ１〜Ｘ１０のアミノ酸残基への帰属を、シグナル強度の比をもって一義的に帰属させることができる。この方法において、ポリペプチドＰ１０’の混合物について得られるＮＭＲシグナルは、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるタンパク質の、ポリペプチドＰ１０の混合物と同じＮＭＲ測定条件下で得られるシグナル強度に関するコントロール値の役割を果たすものとなる。
【００５４】
上記の通り、別発明に係るＮＭＲ測定法では、本発明の方法により製造されるポリペプチド混合物を含むわずか２種類のポリペプチド混合物を用意するだけで、そのポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基のＮＭＲシグナルを一度に帰属させることができる。本発明の製造法は、この新たなＮＭＲ測定法において利用されるポリペプチド混合物を製造することのできる、有用な発明である。
【００５５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
アワヨトウ由来の成長因子機能を有するポリペプチド（Growth-Blocking Peptide、ＧＢＰ、Tada M. et al., J. Biol.Chem., 2003年、第278巻、第10778−10783頁）を合成する目的で、そのアミノ酸配列を次の様に決定した。
【００５７】
ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱ（配列番号１）
次に、上記アミノ酸配列において４つのグリシン（Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１０、Ｇ１７）の各アミノ酸残基のシグナル帰属を目的として、ラベリング比率をＧ５：２０％、Ｇ６：４０％、Ｇ１０：６０％、Ｇ１７：８０％とそれぞれ設定した。
【００５８】
グリシンのアミノ基のＮが１５Ｎでラベル化された化学合成用Ｆｍｏｃ修飾グリシン（Canbridge Isotope Laboratories社製）と、１５Ｎでラベル化されていない化学合成用Ｆｍｏｃ修飾グリシン（島津製作所製）を用意し、両者を混合して、ラベル化されたグリシンの含有量が２０％、４０％、６０％、８０％である４つのアミノ酸カクテルをそれぞれ調製した。また、上記アミノ酸配列における４つのグリシン残基以外のアミノ酸残基それぞれに対するアミノ酸カクテルは、いずれも１５Ｎでラベル化されていないＦｍｏｃ修飾各アミノ酸を用意した。
【００５９】
これらのアミノ酸カクテルをセットしたペプチドシンセサイザー（島津製作所製）を用いて、上記アミノ酸配列からなるポリペプチド混合物を調製し、定法に従って精製し、保護基を外して、４つのグリシン残基のみがそれぞれ異なるラベリング比率で１５Ｎでラベル化されたＧＢＰ混合物を得た。
【００６０】
＜試験例＞
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質ＧＢＰをコードする遺伝子をプラスミドベクターｐＥＴ３２のBglII/HindIIIサイトに組み込んだ発現ベクターを用いて、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。この発現ベクターは、BglII/HindIIIサイトに組み込まれたＧＢＰをコードする遺伝子をＴ７プロモーターの機能下において発現し、それにより組換え宿主にＧＢＰを生産させることができる。
【００６１】
上記の形質転換体を、１５Ｎを唯一の窒素源とするＭ９培地でＯＤ＝０．６となるまで培養した後に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加してＧＢＰを誘導、発現させた。Tadaら（前記）の方法に従って組み換え体ＧＢＰを宿主細胞から回収、精製した。組換え宿主を１５Ｎを唯一の窒素源とした培地で培養したことにより、該宿主が生産する組み換え体ＧＢＰの１５Ｎによるラベリング比率は、全てのアミノ酸残基で１００％となる。
【００６２】
実施例１で調製したＧＢＰ混合物と上記の組み換え体ＧＢＰを０．３ｍMとなるよう１０％重水水溶液にそれぞれ別に溶解して、ＮＭＲ測定用試料を用意し、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルをBruker社製ＮＭＲ測定装置（500Ｍｚ）を利用して測定した。ＧＢＰ混合物の１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを図１に、組み換え体ＧＢＰの１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを図２にそれぞれ示す。
【００６３】
図１では、１５Ｎでラベル化した４つのグリシン残基に由来するシグナルが4種類（Ａ〜Ｄ）観察されている。一方、図２は組み換え体ＧＢＰを構成するアミノ酸残基のうちプロリンを除く他のアミノ酸残基に由来するシグナルが観察されている。このうち、シグナルのイ〜ニが、図１のＡ〜Ｄにそれぞれ対応していることが分かる。
【００６４】
図２のイ〜ニのシグナル強度を計算した結果を図３に、図１のＡ〜Ｄのシグナル強度を計算した結果を図４に、Ａ〜Ｄとイ〜ニでそれぞれ対応するシグナル間の強度比を算出した結果を図５に示す。この結果から、図１のシグナル強度に対して約２０％の強度を示すシグナルＤがＧ５、約４０％の強度を示すシグナルＣがＧ６、約６０％の強度を示すシグナルＡがＧ１０、約８０％の強度を示すシグナルＤがＧ１７と決定された。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＧＢＰ混合物についての１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
【図２】組み換え体ＧＢＰについての１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
【図３】図２のシグナルイ〜ニそれぞれのシグナル強度を示す。
【図４】図１のシグナルＡ〜Ｄそれぞれのシグナル強度を示す。
【図５】シグナルイ〜ニとシグナルＡ〜Ｄのそれぞれのシグナル強度比を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質（ポリペプチド）の立体構造に関する情報をＮＭＲを用いて獲得する方法に有用な、新規なポリペプチドの製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の立体構造に関する情報、例えばタンパク質の立体構造、酵素タンパク質の反応触媒機構、あるいはタンパク質とそれに結合するリガンドとの構造活性相関などを解析する手法として広く用いられている方法に、溶液中のタンパク質を対象とするＮＭＲ法がある。
【０００３】
多くの場合、タンパク質を対象にしたＮＭＲによる解析は、タンパク質中の窒素原子や炭素原子をＮＭＲでの観測が容易な安定同位体元素である１５Ｎや１３Ｃとし、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ（heteronuclear single quantum coherence）スペクトルや１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル等の観測をすることで行われる。さらに測定されたシグナルについて、タンパク質を構成するアミノ酸の構成原子に対応させるいわゆるシグナルの帰属を行い、タンパク質の立体構造情報が得られる。
【０００４】
ＮＭＲ法は、溶液状態のタンパク質を測定対象とするため、より自然な（あるいは天然の）状態にあるタンパク質の構造やその動きを測定することができること、また一般に難しい作業として理解されているタンパク質の結晶の調製が不要であることなどが、同じくタンパク質の立体構造に関する情報を解析する有効な手段であるＸ線回折法と比較したときの利点として考えられている。
【０００５】
一方、ＮＭＲ法には、タンパク質というヘテロな高分子を測定対象とすることに伴う幾つかの問題があることもまた事実である。例えば、測定対象とするタンパク質の高濃度溶液が必要となること、現状の解析技術並びに装置では、Ｘ線回折法による解析に比べて小さな（低分子量の）タンパク質に測定対象が限られてしまうこと、等がある。
【０００６】
また、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法は、非常に感度の高いＮＭＲ測定法ではあるが、この１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法で得られるシグナルのアミノ酸残基への帰属を行うためには、通常、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法とは別に感度の低い複数種類の３次元ＮＭＲスペクトル等の測定を行い、さらに熟練者がこれらのスペクトルを組み合わせた複雑な解析を行わねばならない。この場合における３次元ＮＭＲスペクトルの測定は長時間を要するものであり、その間のタンパク質の失活、変性も重大な問題であった。
【０００７】
係る問題に対して、１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣ測定法のみを用いてＮＭＲ測定を行い、得られるシグナルをアミノ酸残基に帰属する方法も提案されている（特許文献１、非特許文献１など）。しかしながら、この方法は、一つのアミノ酸残基のみを安定同位体元素でラベル化したタンパク質を、シグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基の個数に相当する数だけ調製し、それぞれについて１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法等を行って測定しなければならないことから、実際的な方法であるとは言い難いものであった。
【０００８】
より簡便なＮＭＲ法による蛋白質の測定方法として、１５Ｎ／１３Ｃ標識アミノ酸と１５Ｎ標識アミノ酸等を組み合わせて合成した蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行なう方法が報告されている（特許文献２）。しかし、かかる方法もラベル化されたポリペプチドを何種類も調製する必要がある他、測定しようとするアミノ酸残基を含んだ前後のアミノ酸配列の種類によっても制限を受けているのが現状である。
【非特許文献１】Yabuki, T. et al., J. Biomol. NMR,、１９９８年、第１１巻、第２９５−３０６頁
【特許文献１】ＷＯ２００２／０３３４０６
【特許文献２】ＷＯ２００５／０７３７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＮＭＲ法によるタンパク質の解析において、上記のような煩わしさを解消することの出来る新しい測定方法と、その方法を可能にするＮＭＲ測定に好適なポリペプチドの合成法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、測定対象となるポリペプチドを構成するアミノ酸残基への安定同位体元素による従来のラベリング方法を改め、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基のラベル化比率（ラベリング比率とする）を互いに異なる比率となるように安定同位体元素でラベル化することによって、もしくはシグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基を他のアミノ酸残基とは異なるラベル化比率となるように安定同位体元素でラベル化することによって、原理的にわずか２種類のポリペプチド混合物を合成し、測定対象とするだけで、ＮＭＲシグナルのアミノ酸残基への帰属を可能にする方法を確立した。下記の（１）〜（５）の各発明は、この新しいシグナル帰属方法で必要となる、安定同位体元素でラベルされたポリペプチドの合成法に関する。
【００１１】
（１）下記の工程を含む、安定同位体元素でラベル化されたポリペプチド混合物の製造方法。
【００１２】
１）ｎ個のアミノ酸残基からなるペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、ここでＸは任意のアミノ酸を、ｎは２以上の任意の整数を示す、
２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用意する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ペプチドを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なり、及び
３）２）で用意した合成用アミノ酸カクテルを用いて１）で決定したアミノ酸配列からなるペプチドを合成する工程。
【００１３】
（２）安定同位体元素が１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈよりなる群から選ばれる一以上の安定同位体元素である、（１）に記載の製造方法。
【００１４】
（３）アミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子が、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、（２）に記載の製造方法。
【００１５】
（４）ペプチド結合を形成する窒素原子、炭素原子もしくは水素原子が選択的にそれぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、（２）に記載の製造方法。
【００１６】
（５）アミノ酸カクテルが化学合成用の保護基によって修飾されたアミノ酸のカクテルである、（１）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法により製造されるポリペプチド混合物は、次に概略を述べる本発明者らによって同時に考案されたＮＭＲ測定法において利用されることで、極めて高い有用性を有している。
【００１８】
この別発明に係るＮＭＲ測定法は、ポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基を互いに異なる比率で安定同位体元素を含む様にラベル化するか、またはシグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基を他のアミノ酸残基とは異なる比率で安定同位体元素を含む様にラベル化すること、前記ポリペプチドと同一のアミノ酸配列からなり、かつ全てのアミノ酸残基もしくはシグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基が同一の比率で前記安定同位体元素と同種の安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチド混合物を別途製造すること、前記２種類のポリペプチド混合物についてＮＭＲ測定を行ってそれぞれのシグナルを測定すること、および得られたシグナル強度の比から各シグナルをアミノ酸残基に帰属させること、を含む方法である。
【００１９】
この別発明に掛かるＮＭＲ測定法では、ＮＭＲ測定に必要なポリペプチド混合物は２種類で足り、ＨＳＱＣ測定法のみでシグナル帰属を行うことを目的とする従来の方法のように、アミノ酸残基の個数分のポリペプチドを、ラベル化するアミノ酸残基を変えながら用意する必要がない点で、タンパク質のＮＭＲによる測定作業を著しく簡便化する方法である。本発明の製造方法は、この新規なＮＭＲ測定法を可能とするポリペプチド混合物を供給するという点において、極めて重要な意義を有する発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（１）本発明のポリペプチドの製造法
以下、Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０（Ｘ１〜Ｘ１０はそれぞれ任意のアミノ酸を示す）というアミノ酸配列からなる１０残基のポリペプチドＰ１０の混合物を例にし、Ａ）１０アミノ酸残基の全てについてシグナル帰属を行う場合に必要となるポリペプチド混合物の製造方法と、Ｂ）幾つかの、ここでは例として４つのアミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８についてのシグナル帰属を行う場合に必要となるポリペプチド混合物の製造方法とに分けて、本発明の製造法の詳細を説明する。
【００２１】
Ａ）１０アミノ酸残基の全てについてシグナル帰属を行う場合
１）アミノ酸配列の決定
まず、ポリペプチドＰ１０のアミノ酸配列を、Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０の様に決定する。アミノ酸配列は、ＮＭＲによって測定しようとするポリペプチドを構成するアミノ酸配列をそのまま再現すればよい。
【００２２】
なお、Ｘ１〜Ｘ１０は互いに同じアミノ酸であってもよい。この場合のポリペプチドは、一種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドとなる。またＸ１〜Ｘ１０が全て互いに異なるアミノ酸であってもよい。この場合のポリペプチドは１０種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドである。また、同じアミノ酸が２残基以上存在し、かつその様なアミノ酸が１種以上存在するポリペプチドであっても良い。この場合のポリペプチドは、２〜９種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドである。
【００２３】
この様に、本発明においてポリペプチドを構成するアミノ酸残基の種類には制限がなく、またアミノ酸配列にも制限がない。従って、どの様なアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、本発明の方法により製造することができる。このことは、ＮＭＲによって測定しようとするポリペプチドのアミノ酸配列にも一切の制限はなく、いかなるアミノ酸配列からなるポリペプチドでも、本発明に関連する別発明である新たなＮＭＲシグナル帰属法の測定対象物となり得ることを意味する。
【００２４】
２）ラベリング比率の決定
次に、このアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０の各アミノ酸残基について、安定同位体元素によるラベリング比率を、例えば１０％、２０％、・・・９０％及び１００％と、互いに異なるように設定する。
【００２５】
本発明にいうアミノ酸残基についての安定同位体元素によるラベリング比率とは、本発明の方法によって製造されるポリペプチド混合物中の、安定同位体元素でラベリングされている特定のアミノ酸残基を有するポリペプチドの存在比率（％）を意味する。なお、本発明にいうポリペプチド混合物とは、アミノ酸配列が異なるポリペプチドの混合物ではなく、同一のアミノ酸配列からなるがアミノ酸残基間の安定同位体元素の含有量が異なるポリペプチドの混合物、換言すればアミノ酸残基間の安定同位体元素によるラベル化の程度という点で異なるポリペプチドの混合物を意味する。
【００２６】
例えば、アミノ酸残基Ｘ１のラベリング比率を１０％に設定することは、ポリペプチドＰ１０の混合物中に、安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１を有しているポリペプチドを１０％存在させることを意味する。同様にアミノ酸残基Ｘ１０のラベリング比率を１００％に設定することは、安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１０を有しているポリペプチドを１００％存在させること、換言すればポリペプチドＰ１０の混合物中のポリペプチドは全て安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１０を有しているポリペプチドとすることを意味する。
【００２７】
本発明では、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基が互いに異なるラベリング比率（％）を有するように、すなわち同一のラベリング比率を有するアミノ酸残基が２以上存在しないように設定する必要がある。
【００２８】
ただし、この条件を維持する他には格別の制限はない。例えば、上記の例では残基間のラベリング比率の差を１０％づつ異なる値に設定したが、その差を１０％と一定にすることも、アミノ酸配列に沿って漸次的に増加あるいは減少させることも必ずしも必要ではなく、ラベリング比率はその値ならびに変動パターンにおいて全く任意に設定することができる。
【００２９】
また、ポリペプチド中の１アミノ酸残基だけ安定同位体元素を含まないように、すなわちラベリング比率を０％と設定してもよい。ただし、正確に言えば、ラベリング比率０％とは、用いる安定同位体元素の天然存在比（例えば１５Ｎでは０．４％）と同じ値のラベリング比率であるが、本発明では、便宜上、用いる安定同位体元素の各天然存在比をラベリング比率０％として表すことにする。
【００３０】
またポリペプチド中の１アミノ酸残基だけラベリング比率１００％と設定してもよい（１アミノ酸残基だけをラベル化するという意味ではない）。すなわち、ＮＭＲによって全てのアミノ酸残基のシグナル帰属を行おうとするときのポリペプチドの製造におけるラベリング比率は、用いる安定同位体元素の天然比率〜１００％の範囲内の、任意の値として設定することができる。
【００３１】
３）アミノ酸カクテルの調製とポリペプチド混合物の製造
次に、Ｘ１〜Ｘ１０それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、２）で設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ１〜ｘ１０（以下、アミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０と表す）を調製する。ただし、本発明においては、「安定同位体元素を有しない」とは「当該安定同位体元素を天然存在比で有する」ことを意味するものとする。
【００３２】
ポリペプチドＰ１０の混合物に即して具体的に言えば、ラベリング比率が１０％であるＸ１に対するアミノ酸カクテルｘ１としては、安定同位体元素を有するＸ１’の１重量部と当該安定同位体元素を含まないＸ１の９重量部とを混合して、安定同位体元素を有するＸ１’の含有率が１０％であるアミノ酸カクテルｘ１を調製することである。Ｘ２〜Ｘ１０についても同様に、それぞれのラベリング比率と同じ値の含有率でそれぞれ安定同位体元素を有するアミノ酸を含むアミノ酸カクテルｘ２〜ｘ１０を用意する。
【００３３】
このアミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０を原料として用いて、既に決定したアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるポリペプチドＰ１０の混合物を、当業者に公知の方法を用いて合成する。
【００３４】
以上の操作によって、先に決定されたアミノ酸配列ならびに設定されたラベリング比率を各アミノ酸残基について有するポリペプチドＰ１０の混合物を製造することができる。このポリペプチドＰ１０の混合物を一本のポリペプチドＰ１０として眺めれば、そのポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０というアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２・・・Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ１０％、２０％・・・９０％、１００％というラベリング比率に比例した強度のＮＭＲシグナルを与えるポリペプチドということができる。
【００３５】
Ｂ）４アミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８についてのシグナル帰属を行う場合
１）アミノ酸配列の決定
上記Ａと同じである。なお、シグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基の種類、配列上の位置には特に制限はない。
【００３６】
２）ラベリング比率の決定
ポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基ではなく、幾つかの特定のアミノ酸残基に関してのみＮＭＲによる測定対象とするときは、その特定対象とするアミノ酸残基のラベル化比率が他の全てのアミノ酸残基のラベル化比率と異なるように設定する必要がある。例えば、シグナル帰属を行おうとする４つのアミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８について、安定同位体元素によるラベリング比率を、例えばＸ２：２０％、Ｘ４：４０％、Ｘ６：６０％、Ｘ８：８０％等のように設定する。ラベリング比率は前記Ａ）の３）と同義である。
【００３７】
この様に、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の幾つかのみを対象とする場合、安定同位体元素によるラベル化は、対象とするアミノ酸残基だけについて行えばよく、対象ではないアミノ酸残基をラベル化する必要はない。また、上記の例では残基間のラベリング比率の差を２０％づつ異なる様に設定したが、その様に設定することも、アミノ酸配列に沿って漸次的に増加あるいは減少させることも必ずしも必要ではなく、ラベリング比率はその値ならびに変動パターンにおいて全く任意に設定することができる。
【００３８】
なお、対象とするアミノ酸残基に対して設定したラベリング比率とは異なるラベリング比率であれば、対象外のアミノ酸残基をラベル化するのは差し支えない。例えば、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９全部についてラベリング比率１０％としてもよく、２０％、４０％、６０％、８０％以外のラベリング比率をそれぞれ違えて設定してもよい。
【００３９】
３）アミノ酸カクテルの調製とポリペプチド混合物の製造
次に、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、２）で設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ２、ｘ４、ｘ６、ｘ８を調製する。この調製は上記Ａ）の３）と同様に行えばよい。
【００４０】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９ならびにＸ１０についてラベリング比率０％（用いる安定同位体元素の天然存在比）と設定したときは、当該安定同位体元素を有しないアミノ酸のみからなるアミノ酸カクテルを調製する。なお、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９ならびにＸ１０についてもラベリング比率を設定したときに、その設定に基づいて上記と同様にアミノ酸カクテルｘ１、ｘ３、ｘ５、ｘ７、ｘ９、ｘ１０を用意すればよい。なお、「当該安定同位体元素を有しない」の意味は、前記Ａ）の３）と同じである。
【００４１】
このアミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０を原料として用いて、既に決定したアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるポリペプチドＰ１０を、当業者に公知の方法を用いて合成する。
【００４２】
以上の操作によって、先に決定されたアミノ酸配列ならびに設定されたラベリング比率を各アミノ酸残基について有するポリペプチドＰ１０の混合物を製造することができる。このポリペプチドＰ１０の混合物を一本のポリペプチドとして眺めれば、そのポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０というアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８はそれぞれ２０％、４０％、６０％、８０％というラベリング比率に比例した強度のＮＭＲシグナルを与えるポリペプチドということができる。
【００４３】
上記Ａ）Ｂ）に説明した本発明の製造方法において利用可能な安定同位体元素としては、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈなどを挙げることができる。タンパク質等の立体構造解析の基本として多用されることや、スペクトル上でのシグナルの単純さ、さらには安価であること等を勘案すれば、安定同位体元素としては１５Ｎの利用が好ましい。
【００４４】
また一アミノ酸（アミノ酸残基）における安定同位体元素によるラベル化のの位置にも特別の制限はなく、一つのアミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子を、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化してもよいし、特定の位置にある窒素原子等だけをラベル化してもよい。例えば、ペプチド結合を構成する窒素原子、炭素原子あるいは水素原子を選択的にラベル化してもよい。
【００４５】
本発明では、ＮＭＲ測定によって得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基は、少なくとも全て同じ安定同位体元素を用いてラベル化する必要がある。上記Ａ）で言えば、Ｘ１、Ｘ２・・・Ｘ９、Ｘ１０は全て、例えば各残基中の窒素原子（窒素原子を側鎖に持たないアミノ酸ではペプチド結合を構成する窒素原子）を１５Ｎでラベル化する必要があり、また上記Ｂ）ではＸ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８は全て、例えば各残基中の炭素原子を１３Ｃでラベル化する必要がある。言い換えれば、測定対象とするアミノ酸残基は必ず共通する少なくとも一種の安定同位体元素でラベル化されている必要がある。ただし、同時に別種の安定同位体元素が一つのアミノ酸残基中にあるいはポリペプチド中に共存（二重標識化）していてもよい。例えば、一部あるいは全てのアミノ酸が、１５Ｎによるラベル化に加えて、１３Ｃや２Ｈでラベル化されていてもよい。
【００４６】
１５Ｎや１３Ｃでラベル化されたアミノ酸は既に市販されており、本発明はかかる市販のラベル化されたアミノ酸を利用することができる。また安定同位体元素を有する適当な化合物から、当業者に公知の方法に従って新たに所望のラベリングされたアミノ酸を合成し、これを用いても良い。また、１５Ｎや１３Ｃを唯一の窒素源あるいは炭素源とする培地で適当な微生物を培養して、ラベル化されたアミノ酸を製造させてもよい。
【００４７】
アミノ酸カクテルを用いたポリペプチド混合物の製造自体は、無細胞蛋白合成系や有機化学的手法などの当業者に公知の方法のいずれも利用することができるが、本発明では有機化学合成的手法、特にペプチドシンセサイザーを用いた合成が好ましい。
【００４８】
ペプチドシンセサイザーを用いたポリペプチドの合成では、原料となるアミノ酸はＦｍｏｃやｔＢｏｃなどの保護基によって修飾されたアミノ酸を用いることとなるが、かかる保護基を有する修飾アミノ酸においても、安定同位体元素でラベル化された修飾アミノ酸などは既に市販されており、当業者が容易に入手可能である。
【００４９】
（２）本発明により製造されるポリペプチド混合物の利用
本発明の方法により製造されるポリペプチド混合物は、別発明に係るタンパク質の新たなＮＭＲ測定法において利用される。ここでは、前記（１）のＡ）で例示したポリペプチドＰ１０の混合物の、別方法に係るタンパク質の新たなＮＭＲ測定法における使用例を説明する。
【００５０】
本発明の方法により製造されるポリペプチドＰ１０の混合物について、ある所定の条件下でＮＭＲ測定、典型的には１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを測定し、シグナルを得る。
【００５１】
このポリペプチドＰ１０の混合物の他に、同じアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなり、かつＸ１〜Ｘ１０のラベリング比率が全て同じ、例えば１０％であるポリペプチドＰ１０’の混合物を用意し、ポリペプチドＰ１０の混合物と同じＮＭＲ測定条件下でこのポリペプチドＰ１０’の混合物についての１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを測定し、シグナルを得る。
【００５２】
ここで、上記の２種類の混合物についてのＮＭＲスペクトルの測定を、各ポリペプチド量を等量となるように調節してそれぞれについて行うと、２種類の混合物から得られる各ＮＭＲシグナルは、いずれも同一アミノ酸配列からなるポリペプチドであるために、合計１０個のＨＳＱＣスペクトルのパターンは両者で同一となる。一方、２つのスペクトルパターンでそれぞれ対応するシグナル間のシグナル強度は、ポリペプチドＰ１０におけるラベリング比率に比例して異なっているはずである。具体的には、ポリペプチドＰ１０とポリペプチドＰ１０’との間の１０個の各対応スペクトル間のシグナル強度の比は、１：１〜１０：１になる。
【００５３】
このシグナル強度の比率は、ポリペプチドＰ１０とポリペプチドＰ１０’における各対応アミノ酸残基のラベリング比率の相違と同一となる。従って、シグナル強度の比が１：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ１由来のシグナルであり、シグナル強度の比が２：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ２由来のシグナルであり、同様の計算を繰り返せば、ＮＭＲスペクトルのＸ１〜Ｘ１０のアミノ酸残基への帰属を、シグナル強度の比をもって一義的に帰属させることができる。この方法において、ポリペプチドＰ１０’の混合物について得られるＮＭＲシグナルは、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるタンパク質の、ポリペプチドＰ１０の混合物と同じＮＭＲ測定条件下で得られるシグナル強度に関するコントロール値の役割を果たすものとなる。
【００５４】
上記の通り、別発明に係るＮＭＲ測定法では、本発明の方法により製造されるポリペプチド混合物を含むわずか２種類のポリペプチド混合物を用意するだけで、そのポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基のＮＭＲシグナルを一度に帰属させることができる。本発明の製造法は、この新たなＮＭＲ測定法において利用されるポリペプチド混合物を製造することのできる、有用な発明である。
【００５５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
アワヨトウ由来の成長因子機能を有するポリペプチド（Growth-Blocking Peptide、ＧＢＰ、Tada M. et al., J. Biol.Chem., 2003年、第278巻、第10778−10783頁）を合成する目的で、そのアミノ酸配列を次の様に決定した。
【００５７】
ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱ（配列番号１）
次に、上記アミノ酸配列において４つのグリシン（Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１０、Ｇ１７）の各アミノ酸残基のシグナル帰属を目的として、ラベリング比率をＧ５：２０％、Ｇ６：４０％、Ｇ１０：６０％、Ｇ１７：８０％とそれぞれ設定した。
【００５８】
グリシンのアミノ基のＮが１５Ｎでラベル化された化学合成用Ｆｍｏｃ修飾グリシン（Canbridge Isotope Laboratories社製）と、１５Ｎでラベル化されていない化学合成用Ｆｍｏｃ修飾グリシン（島津製作所製）を用意し、両者を混合して、ラベル化されたグリシンの含有量が２０％、４０％、６０％、８０％である４つのアミノ酸カクテルをそれぞれ調製した。また、上記アミノ酸配列における４つのグリシン残基以外のアミノ酸残基それぞれに対するアミノ酸カクテルは、いずれも１５Ｎでラベル化されていないＦｍｏｃ修飾各アミノ酸を用意した。
【００５９】
これらのアミノ酸カクテルをセットしたペプチドシンセサイザー（島津製作所製）を用いて、上記アミノ酸配列からなるポリペプチド混合物を調製し、定法に従って精製し、保護基を外して、４つのグリシン残基のみがそれぞれ異なるラベリング比率で１５Ｎでラベル化されたＧＢＰ混合物を得た。
【００６０】
＜試験例＞
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質ＧＢＰをコードする遺伝子をプラスミドベクターｐＥＴ３２のBglII/HindIIIサイトに組み込んだ発現ベクターを用いて、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。この発現ベクターは、BglII/HindIIIサイトに組み込まれたＧＢＰをコードする遺伝子をＴ７プロモーターの機能下において発現し、それにより組換え宿主にＧＢＰを生産させることができる。
【００６１】
上記の形質転換体を、１５Ｎを唯一の窒素源とするＭ９培地でＯＤ＝０．６となるまで培養した後に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加してＧＢＰを誘導、発現させた。Tadaら（前記）の方法に従って組み換え体ＧＢＰを宿主細胞から回収、精製した。組換え宿主を１５Ｎを唯一の窒素源とした培地で培養したことにより、該宿主が生産する組み換え体ＧＢＰの１５Ｎによるラベリング比率は、全てのアミノ酸残基で１００％となる。
【００６２】
実施例１で調製したＧＢＰ混合物と上記の組み換え体ＧＢＰを０．３ｍMとなるよう１０％重水水溶液にそれぞれ別に溶解して、ＮＭＲ測定用試料を用意し、１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルをBruker社製ＮＭＲ測定装置（500Ｍｚ）を利用して測定した。ＧＢＰ混合物の１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを図１に、組み換え体ＧＢＰの１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを図２にそれぞれ示す。
【００６３】
図１では、１５Ｎでラベル化した４つのグリシン残基に由来するシグナルが4種類（Ａ〜Ｄ）観察されている。一方、図２は組み換え体ＧＢＰを構成するアミノ酸残基のうちプロリンを除く他のアミノ酸残基に由来するシグナルが観察されている。このうち、シグナルのイ〜ニが、図１のＡ〜Ｄにそれぞれ対応していることが分かる。
【００６４】
図２のイ〜ニのシグナル強度を計算した結果を図３に、図１のＡ〜Ｄのシグナル強度を計算した結果を図４に、Ａ〜Ｄとイ〜ニでそれぞれ対応するシグナル間の強度比を算出した結果を図５に示す。この結果から、図１のシグナル強度に対して約２０％の強度を示すシグナルＤがＧ５、約４０％の強度を示すシグナルＣがＧ６、約６０％の強度を示すシグナルＡがＧ１０、約８０％の強度を示すシグナルＤがＧ１７と決定された。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＧＢＰ混合物についての１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
【図２】組み換え体ＧＢＰについての１Ｈ−１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルである。
【図３】図２のシグナルイ〜ニそれぞれのシグナル強度を示す。
【図４】図１のシグナルＡ〜Ｄそれぞれのシグナル強度を示す。
【図５】シグナルイ〜ニとシグナルＡ〜Ｄのそれぞれのシグナル強度比を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、安定同位体元素でラベル化されたポリペプチド混合物の製造方法。
１）ｎ個のアミノ酸残基からなるペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、ここでＸは任意のアミノ酸を、ｎは２以上の任意の整数を示す、
２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用意する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ペプチドを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なり、及び
３）２）で用意した合成用アミノ酸カクテルを用いて１）で決定したアミノ酸配列からなるペプチドを合成する工程。
【請求項２】
安定同位体元素が１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈよりなる群から選ばれる一以上の安定同位体元素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
アミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子が、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
ペプチド結合を形成する窒素原子、炭素原子もしくは水素原子が選択的にそれぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
アミノ酸カクテルが化学合成用の保護基によって修飾されたアミノ酸のカクテルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１】
下記の工程を含む、安定同位体元素でラベル化されたポリペプチド混合物の製造方法。
１）ｎ個のアミノ酸残基からなるペプチドのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、ここでＸは任意のアミノ酸を、ｎは２以上の任意の整数を示す、
２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用意する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ペプチドを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なり、及び
３）２）で用意した合成用アミノ酸カクテルを用いて１）で決定したアミノ酸配列からなるペプチドを合成する工程。
【請求項２】
安定同位体元素が１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈよりなる群から選ばれる一以上の安定同位体元素である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
アミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子が、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
ペプチド結合を形成する窒素原子、炭素原子もしくは水素原子が選択的にそれぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
アミノ酸カクテルが化学合成用の保護基によって修飾されたアミノ酸のカクテルである、請求項１に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−２５４２９５（Ｐ２００７−２５４２９５Ａ）
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７６９５８（Ｐ２００６−７６９５８）
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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