安定性トロンビン組成物
【課題】安定したトロンビン組成物を提供する。
【解決手段】本発明の安定したトロンビン組成物は、精製トロンビン、ヒトのアルブミンおよび中性塩を含み、凍結乾燥または凍結させたものとして保存した場合に、得られた生成物は安定であり、溶液１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの公称強度に調節され、ヒトのアルブミンは０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【解決手段】本発明の安定したトロンビン組成物は、精製トロンビン、ヒトのアルブミンおよび中性塩を含み、凍結乾燥または凍結させたものとして保存した場合に、得られた生成物は安定であり、溶液１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの公称強度に調節され、ヒトのアルブミンは０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを保持するために二重ナノろ過にかけることができ、かつ凍結乾燥または凍結した状態で保存することができる、フィブリン接着剤の成分としての治療上の使用または他の止血用使用のための、溶液中で安定であるトロンビン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは、その不活性前駆体であるプロトロンビンの活性化によって、循環血液中で生成するセリンプロテアーゼである。凝固過程において、トロンビンは、フィブリン凝固体を形成しかつ止血を維持するために、フィブリノーゲン分子をフィブリンモノマーに分割するという基本的な役割を有している。したがって、トロンビンは、局所止血剤として、およびフィブリン接着剤（活性成分として主にフィブリノーゲンおよびトロンビンを含む化合物）の成分としての治療用途を有している。
【０００３】
通常使用されるトロンビンは動物由来（ウシまたはウマ）のものである。これらの調製物は多くの場合、異種タンパク質過負荷に起因する免疫反応をもたらしている。最近では、ヒトトロンビンは、ヒト血漿から相当な精製度で精製されている。より最近では、血漿由来［Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）２００４ Ｍａｙ；１３５（５）：５７７〜５８２頁］または遺伝子組み換え由来のトロンビンの活性と同一活性を有する工業規模での組換え由来のヒトトロンビンを得ることが可能になってきている。
【０００４】
その由来が何であれ、精製トロンビン溶液には、製造工程の最終段階および販売時の保管の間（最終製品の安定性）の両方で、安定性の問題が生じてくる。また、適切に安定化されていない場合、相当な活性の損失をきたす懸念がある。
【０００５】
これに加え、生物由来の生成物として、トロンビンを、トロンビンが由来する血漿中の出発材料に付随する、あるいは組換え生成物の場合の培地または遺伝子組み換え生成物の場合の生成有機体に付随する病原体を除去するために、特定の段階にかけなければならない。最近の傾向では、少なくとも２つの補足的なウイルス除去段階が含まれる。
【０００６】
血漿タンパク質の精製プロセスでウイルス負荷を低減させるために用いられる方法の中で、その広範囲の使用と顕著な効率のために、以下のものを挙げるべきであろう。
【０００７】
−熱処理。この熱処理は潜在的に、エンベロープ型ウイルスおよび裸のウイルスの両方の有効なウイルス量を低減させる。その効率はタンパク質の熱安定性と加えられた安定剤に直接関係し、新抗原性（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）の出現を誘発するタンパク質分子中におけるさらなる変化を回避する必要がある［ＣＰＭＰ／Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５ｒｅｖ．３）Ｊａｎｕａｒｙ ２００１］。
【０００８】
−有機溶媒（ＯＳＤ）処理。脂質エンベロープを有するウイルスを不活性化する効率が非常に高いことから、これは、広範に使用される処理形態であり、この種のウイルスのための標準的処理と見なすことができる。逆にこれは、パルボウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスなどの脂質エンベロープを有していないウイルスに対して効果はない［Ｂｕｒｎｏｕｆ Ｔ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）１４、９４〜１１０頁；Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｔｚ Ｕ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９６）３、３９５〜４０２頁］。
【０００９】
−ウイルス粒子を阻止することができる細孔径のフィルターによる溶液のろ過は、原理的に、タンパク質の構造を変える潜在能力を有しておらず、用いる細孔径に応じてウイルス量を除去するのに有効な能力を有する物理的方法なので、最近広く用いられてきている方法の１つである。この細孔径は特に、ろ過すべきタンパク質分子（これはフィルターを通過しなければならない）の空間的寸法によって選択される。１５ｎｍフィルターを通したろ過によって、２０〜３０ｎｍの範囲にあるＡ型肝炎ウイルスおよびパルボウイルスなどの小さい裸のウイルスの著しい削減が保証可能である。２つの１５ｎｍフィルターを直列に用いたろ過の実施が可能であることによって、ウイルス量の削減のレベル、したがってこれらのウイルスに関わる安全性のレベルを増大させることになる。このナノろ過を最終段階で実施した場合、続く溶液組成物の濃縮操作および濃度の調節が回避され、ナノフィルター製品を偶発的に汚染する可能性を排除することになる。
【００１０】
以下の文献も引用することができる：
トロンビンの調製のための方法を記載するスペイン特許第２１０８７３８号（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ）は、グルコン酸塩緩衝剤を、２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロースおよび６０ｍＭのＣａＣｌ２と一緒にした調合物を作製しており、これは、アルブミン、ショ糖およびカルシウムが、溶液中での取り扱い（２４時間安定性）、凍結およびそれに続く凍結乾燥の際の安定化に必須であることを示している。
【００１１】
フィブリン接着剤の成分としてのフィブリノーゲンおよびトロンビンを得るための方法を記載している国際出願ＰＣＴ ＷＯ９９／２３１１１（Ｈａｅｍａｃｕｒｅ）は、トロンビン活性を保持するためには、溶出後直ちにアルブミンを加えることが必須であることを明らかにしている。安定化および調合のために加えるアルブミンの濃度は２％である。
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）２００４ Ｍａｙ；１３５（５）：５７７〜５８２頁
【非特許文献２】ＣＰＭＰ／Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５ｒｅｖ．３）Ｊａｎｕａｒｙ ２００１
【非特許文献３】Ｂｕｒｎｏｕｆ Ｔ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）１４９４〜１１０頁
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｔｚ Ｕ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９６）３、３９５〜４０２頁
【特許文献１】スペイン特許第２１０８７３８号（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ）
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ９９／２３１１１（Ｈａｅｍａｃｕｒｅ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、安定したトロンビン組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、精製トロンビン、ヒトのアルブミンおよび中性塩を含み、得られる生成物を凍結乾燥するかまたは凍結して保存することを特徴とするトロンビン組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、トロンビンを、タンパク質１ｍｇ当たり１５００ＩＵ以上のトロンビンの比活性、および１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの強度まで精製し、その溶液を、ヒトのアルブミンおよび中性塩を加え、混合して安定化させ、続いて前記溶液を二重ナノろ過系にかけることを特徴とするトロンビン組成物の調製方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者等は、ヒトのアルブミンおよび中性塩、場合により可溶化剤およびｐＨ緩衝剤の存在下で、高度に精製されたトロンビン調合物を開発した。
【００１７】
この調合物は、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ナノメータ（ｎｍ）の公称細孔径（ｎｏｍｉｎａｌ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）の直列にした２つのフィルターによってナノろ過可能である。これらのフィルターは、高いろ過能力を有し、かつ製品回収率の低下およびナノろ過した材料の劣化がなく、それによって、単分散されたブタのパルボウイルスなどの最も小さいウイルス（ヒトＢ１９のモデルとして）でも、ｌｏｇ４（ベース１０）を超えるレベルに保持される。また、ナノろ過した材料は、処方（ｆｏｒｍｕｌａ）または最終組成の調節のため後続の処理を必要とせず、交差汚染の危険性が回避され、得られた生成物は後続の処理に対して十分安定しており、凍結乾燥または凍結状態で安定的に保存される。
【００１８】
この調合物においては、アルブミンは安定剤として働き、ナノろ過の過程での液体状態での操作の際および凍結乾燥または凍結の際のトロンビンの活性を保持する。また、アルブミンはｐＨ緩衝剤としての効果を有しており、凍結乾燥したペレットに稠密さを付与する。塩化ナトリウムなどの中性塩に関しては、トロンビンが非常に不溶性であり低いイオン強度では沈澱する場合のことを考えると、これは、トロンビンを溶解させ、溶液の等張性を維持するように働く。
【００１９】
ｐＨ減衰効果、また凍結乾燥物の稠密化および可溶化も、グリシン、またはクエン酸ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムなどの可溶化剤および／またはｐＨ緩衝剤の添加によって補うことができる。
【００２０】
本発明者等は０．０５％を超えるアルブミン濃度と塩化ナトリウムの存在が必要であることを明確にした。塩化ナトリウム濃度は少なくとも０．０５モルでなければならない。ほぼ等張性であるかまたは０．１５モルであればよりよい。このようにして、それ程の活性の損失もなく（トロンビン回収率＞９０％）、良好な生産性（ナノろ過面積１ｍ２当たり最大で１５００万ＩＵのトロンビン、またはより高い負荷）で、トロンビン溶液を、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径のフィルターよって二重ナノろ過することができる。ナノろ過した材料を、０．２μｍ膜を用いて殺菌し、適当な容器（バイアル、瓶、シリンジ等）中に無菌状態で量り込み、続く凍結乾燥のために−１８℃で凍結させ、凍結状態で保存する。後者の場合、凍結させる前に、塩化カルシウム溶液をトロンビンに加えて、その安定性にこれが影響を及ぼすことなく、処方を調節することができる。
【００２１】
本発明の組成物を得るための方法を以下の実施例で説明する。これは説明のためであって、限定しようとするものではない。
【００２２】
タンパク質１ｍｇ当たり１５００ＩＵ以上のトロンビンに等しい比活性特性と、１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの能力を有する生成物をもたらす方法で精製したトロンビン溶液を、０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）濃度のヒトのアルブミンと０．０５以上のモルの濃度の塩化ナトリウムとを５．０〜８．５のｐＨで加え、混合して安定化する。
【００２３】
このトロンビン溶液を、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径まで二重ナノろ過系を用いて処理する。使用したナノフィルターの種類はＰｌａｎｏｖａ１５Ｎ（登録商標）（Ａｓａｈｉ−Ｋａｓｅｉから）の商品名で市販されており、異なるろ過面積を有する再生セルロースでできた中空繊維カートリッジの構造を有している。特定の調合条件下で、第１のナノフィルターからのろ液を第２のナノフィルターに供給し、それによって、各ナノフィルター中での１．０バール未満、好ましくは０．２バール〜１．０バールの正の差圧に相当する、このナノフィルターの製造メーカーが推奨するナノろ過条件を変更することなく、２つのナノフィルターを直列に連結することによって、二重ナノろ過を同時に行うことができる。フィルター１個当たりのナノろ過能力は３０ｌ／ｍ２より大きくてよいが、最も小さいウイルス（パルボウイルス）の効果的な削減を達成するために、１ｍ２当たり３０リットル以下の溶液を用いることが好ましく、５〜３０ｌ／ｍ２を用いることがより好ましい。
【００２４】
ナノろ過した溶液は、それが凍結乾燥かまたは続く凍結のために最終処方にすでに調節されておれば、追加の操作を行うことなく、約５００ＩＵ／ｍｌの公称強度（ｎｏｍｉｎａｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を有することができる。
【００２５】
最終処方を調節するために、必要なら、例えば、０．０１〜０．１モルの濃度のグリシンなどのアミノ酸、例えば１０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなどのカルボン酸の塩、および塩化カルシウムまたは同等の塩（通常２０〜６０ｍＭ）を加えることができる。得られた調合物は引き続きナノろ過可能であり、この工程の間安定である。
【００２６】
凍結乾燥した場合でも凍結させた場合でも、得られる生成物は長期間安定である。凍結乾燥した生成物は、高温で短い曝露時間、例えば、９０〜１１５℃で０．５〜８時間、好ましくは約１００℃で１〜２時間加熱して、任意にウイルス不活性化にかけることができる。
【００２７】
本発明の特徴を以下の通りまとめることができる：
精製トロンビン組成物は、その処方がヒトのアルブミンおよび塩化ナトリウムなどの中性塩を含むものであって、凍結させるか凍結乾燥して保存した場合、得られた生成物は安定である。この組成物においては、トロンビンは溶液１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの公称強度に調節され、ヒトのアルブミンは０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）の濃度に調節される。塩化ナトリウム濃度は少なくとも０．０５モルにすべきであり、ほぼ等張性であるかまたは０．１５モルであればよりよい。
【００２８】
このトロンビン組成物は、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径までの直列にした二重ナノろ過によってろ過することができ、それぞれのナノフィルターで、ろ過面積１ｍ２当たり最大で３０リットルの溶液をろ過することができる。
【００２９】
この凍結乾燥したトロンビン組成物を、９０〜１１５℃で１／２時間〜８時間、好ましくは１００℃で１〜２時間乾燥加熱によって処理することができる。
本発明の非限定的な様々な実施例を以下に示す。
【実施例１】
【００３０】
全タンパク質のｍｇ当たり＞１５００ＩＵの比活性を有する精製トロンビン（ロットＴ−１００６）を、７５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグリシンおよび１０ｍＭの酢酸ナトリウムをｐＨ６．５で含む５容積部の溶液に対して、１０ｋＤａ限外ろ過膜を用いて透析し、最終的に６５４ＩＵのトロンビン／ｍｌ溶液に濃縮した。続いてこれを、最大で０．２５％のヒトのアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎａ Ｇｒｉｆｏｌｓ２０％）を加えて安定化させた。
【００３１】
この方法で安定化させた溶液を＜−２０℃で凍結させてナノろ過試験を開始した。最大で１５ｎｍ公称細孔径までの二重ナノろ過に対する先行予備ろ過（清澄化）の効果を、再生銅アンモニウムセルロースナノフィルター（Ａｓａｈｉ−ＫａｓｅｉからのＰｌａｎｏｖａ １５Ｎ（登録商標））を用いて検討した。この目的のために、３つの一定分量の安定化溶液を水浴中、２０±２℃で解凍させた。その結果、生成物の最終温度は２〜８℃であり、トロンビン活性は５９１．０〜６１４．５ＩＵ／ｍｌであり、全タンパク質は２．５４〜２．８０ｍｇ／ｍｌであった。溶液を、異なる細孔径：０．２２μｍ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＰＶＤＦ）、０．１μｍ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．からのＰＶＤＦ）および３５ｎｍ（Ａｓａｈｉ−Ｋａｓｅｉからの再生銅アンモニウムセルロース、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎ（登録商標））の３種類のフィルターを用いて個別に予備ろ過し、続いて二重の１５ｎｍのナノろ過（０．００１ｍ２からの、２×Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ（登録商標））で同時にろ過し、生成物の当初の容積の２０〜２８％相当量で最終的な後洗浄を行った。プロセスの実行可能性と予備ろ過の効果を、得られた適用比（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）（ｋｇ／ｍ２）、ナノろ過の間の膜貫通圧力（ＴＭＰ）の変化または増大、全タンパク質、トロンビン活性およびトロンビン回復率に関して試験を行った。
試験条件および得られた結果は以下の通りである：
【００３２】
【表１】
【００３３】
この検討から、ナノろ過の間のＴＭＰの増大に関しては、＜−２０℃で予め凍結させた調合済みの材料の予備ろ過は、ほぼ同じ適用比とろ液流量について、検討した０．２２μｍ〜３５ｎｍの細孔径範囲内の１５ｎｍでの二重ナノろ過に対して差分的効果を有していないことが認められよう。また、タンパク質、活性および回復率％に関しても、実施した試験の間で有意の差はなかった。同様に、塩化ナトリウム、グリシンおよび酢酸ナトリウムと一緒に、高度に精製したトロンビンとアルブミンとを含む開発した製品処方を用いた、１５ｎｍでの二重ナノろ過の実行可能性を検討したところ、すべての場合において、適用比値＞３０ｋｇ／ｍ２および９６％を超える回復率であり、その実行可能性が実証された。
【実施例２】
【００３４】
凍結乾燥で乾燥させた最終生成物を、非常に高温での短時間の曝露熱処理にかける可能性を検討した。同一ロットの精製生成物から出発して、調合物を２つの異なる組成で調製した。すなわち、処方Ａ：約５００ＩＵ／ｍｌのタンパク質トロンビン、１％アルブミン、１０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび７５ｍＭ塩化ナトリウム；処方Ｂ：約５００ＩＵ／ｍＬのトロンビン、２％マンニトール、１０ｍＭヒスチジン、０．０３％のＰＥＧ−３３５０および１７５ｍＭの塩化ナトリウムであった。
【００３５】
組成物を１５ｎｍでナノろ過し、ナノろ過した生成物を１０ｍｌバイアル中で凍結乾燥し、装置の最大真空条件下（＜０．１ｍバール）、３７℃で２４時間最終的な乾燥を実施した。残留水分は１％未満であった。
【００３６】
得られたバイアルを、１００℃、１０５℃、１１０℃および１１５℃で、１／２時間、１時間、２時間、４時間および８時間熱処理にかけ、続いてトロンビン活性を測定した。熱処理にかけていない元の生成物に対する活性回復率の割合は以下の通りである。
【００３７】
【表２】
【００３８】
上記の表に示す結果は、アルブミンの熱保護効果を示しており、かつ１００〜１０５℃の温度で概ね最大４時間まで、１１０℃で２時間まで、１１５℃で１時間まで熱をかけることができ、９０±５％の活性の回復率またはそれ以上が得られることを示している。
【実施例３】
【００３９】
凍結乾燥した生成物の安定性を評価するために、以下の最終生成物を調製した。
【００４０】
【表３】
【００４１】
これらの調製物を５℃と３０℃で保存し、サンプルを異なる保存時間で分析した。分析したパラメータにおいて不安定性を示す徴候は認められず、以下の活性回復率（％）を得た。
【００４２】
【表４】
【実施例４】
【００４３】
凍結生成物の安定性を評価するために以下の最終生成物を調製した。
【００４４】
【表５】
【００４５】
これらの調製物を−１８℃で保存し、サンプルを異なる保存時間で分析した。分析したパラメータにおいて不安定性を示す徴候は認められず、以下の活性回復率（％）を得た。
【００４６】
【表６】
【００４７】
これらの調製物のいくつかについて、５℃および２５℃での溶液の安定性も検討した。分析したパラメータにおいて不安定性を示す徴候は認められず、以下の活性回復率（％）を得た。
【００４８】
【表７】
【００４９】
例示した実施例をもとに、本発明をその本質的な特徴において説明してきたが、これらの説明は、上記特許請求の範囲で定義する本発明の範囲を制限しようとするものではないことを理解されたい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを保持するために二重ナノろ過にかけることができ、かつ凍結乾燥または凍結した状態で保存することができる、フィブリン接着剤の成分としての治療上の使用または他の止血用使用のための、溶液中で安定であるトロンビン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは、その不活性前駆体であるプロトロンビンの活性化によって、循環血液中で生成するセリンプロテアーゼである。凝固過程において、トロンビンは、フィブリン凝固体を形成しかつ止血を維持するために、フィブリノーゲン分子をフィブリンモノマーに分割するという基本的な役割を有している。したがって、トロンビンは、局所止血剤として、およびフィブリン接着剤（活性成分として主にフィブリノーゲンおよびトロンビンを含む化合物）の成分としての治療用途を有している。
【０００３】
通常使用されるトロンビンは動物由来（ウシまたはウマ）のものである。これらの調製物は多くの場合、異種タンパク質過負荷に起因する免疫反応をもたらしている。最近では、ヒトトロンビンは、ヒト血漿から相当な精製度で精製されている。より最近では、血漿由来［Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）２００４ Ｍａｙ；１３５（５）：５７７〜５８２頁］または遺伝子組み換え由来のトロンビンの活性と同一活性を有する工業規模での組換え由来のヒトトロンビンを得ることが可能になってきている。
【０００４】
その由来が何であれ、精製トロンビン溶液には、製造工程の最終段階および販売時の保管の間（最終製品の安定性）の両方で、安定性の問題が生じてくる。また、適切に安定化されていない場合、相当な活性の損失をきたす懸念がある。
【０００５】
これに加え、生物由来の生成物として、トロンビンを、トロンビンが由来する血漿中の出発材料に付随する、あるいは組換え生成物の場合の培地または遺伝子組み換え生成物の場合の生成有機体に付随する病原体を除去するために、特定の段階にかけなければならない。最近の傾向では、少なくとも２つの補足的なウイルス除去段階が含まれる。
【０００６】
血漿タンパク質の精製プロセスでウイルス負荷を低減させるために用いられる方法の中で、その広範囲の使用と顕著な効率のために、以下のものを挙げるべきであろう。
【０００７】
−熱処理。この熱処理は潜在的に、エンベロープ型ウイルスおよび裸のウイルスの両方の有効なウイルス量を低減させる。その効率はタンパク質の熱安定性と加えられた安定剤に直接関係し、新抗原性（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）の出現を誘発するタンパク質分子中におけるさらなる変化を回避する必要がある［ＣＰＭＰ／Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５ｒｅｖ．３）Ｊａｎｕａｒｙ ２００１］。
【０００８】
−有機溶媒（ＯＳＤ）処理。脂質エンベロープを有するウイルスを不活性化する効率が非常に高いことから、これは、広範に使用される処理形態であり、この種のウイルスのための標準的処理と見なすことができる。逆にこれは、パルボウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスなどの脂質エンベロープを有していないウイルスに対して効果はない［Ｂｕｒｎｏｕｆ Ｔ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）１４、９４〜１１０頁；Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｔｚ Ｕ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９６）３、３９５〜４０２頁］。
【０００９】
−ウイルス粒子を阻止することができる細孔径のフィルターによる溶液のろ過は、原理的に、タンパク質の構造を変える潜在能力を有しておらず、用いる細孔径に応じてウイルス量を除去するのに有効な能力を有する物理的方法なので、最近広く用いられてきている方法の１つである。この細孔径は特に、ろ過すべきタンパク質分子（これはフィルターを通過しなければならない）の空間的寸法によって選択される。１５ｎｍフィルターを通したろ過によって、２０〜３０ｎｍの範囲にあるＡ型肝炎ウイルスおよびパルボウイルスなどの小さい裸のウイルスの著しい削減が保証可能である。２つの１５ｎｍフィルターを直列に用いたろ過の実施が可能であることによって、ウイルス量の削減のレベル、したがってこれらのウイルスに関わる安全性のレベルを増大させることになる。このナノろ過を最終段階で実施した場合、続く溶液組成物の濃縮操作および濃度の調節が回避され、ナノフィルター製品を偶発的に汚染する可能性を排除することになる。
【００１０】
以下の文献も引用することができる：
トロンビンの調製のための方法を記載するスペイン特許第２１０８７３８号（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ）は、グルコン酸塩緩衝剤を、２ｇ／ｌのアルブミン、５ｇ／ｌのサッカロースおよび６０ｍＭのＣａＣｌ２と一緒にした調合物を作製しており、これは、アルブミン、ショ糖およびカルシウムが、溶液中での取り扱い（２４時間安定性）、凍結およびそれに続く凍結乾燥の際の安定化に必須であることを示している。
【００１１】
フィブリン接着剤の成分としてのフィブリノーゲンおよびトロンビンを得るための方法を記載している国際出願ＰＣＴ ＷＯ９９／２３１１１（Ｈａｅｍａｃｕｒｅ）は、トロンビン活性を保持するためには、溶出後直ちにアルブミンを加えることが必須であることを明らかにしている。安定化および調合のために加えるアルブミンの濃度は２％である。
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）２００４ Ｍａｙ；１３５（５）：５７７〜５８２頁
【非特許文献２】ＣＰＭＰ／Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６９／９５ｒｅｖ．３）Ｊａｎｕａｒｙ ２００１
【非特許文献３】Ｂｕｒｎｏｕｆ Ｔ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）１４９４〜１１０頁
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｔｚ Ｕ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９６）３、３９５〜４０２頁
【特許文献１】スペイン特許第２１０８７３８号（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ）
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ９９／２３１１１（Ｈａｅｍａｃｕｒｅ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、安定したトロンビン組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、精製トロンビン、ヒトのアルブミンおよび中性塩を含み、得られる生成物を凍結乾燥するかまたは凍結して保存することを特徴とするトロンビン組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、トロンビンを、タンパク質１ｍｇ当たり１５００ＩＵ以上のトロンビンの比活性、および１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの強度まで精製し、その溶液を、ヒトのアルブミンおよび中性塩を加え、混合して安定化させ、続いて前記溶液を二重ナノろ過系にかけることを特徴とするトロンビン組成物の調製方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者等は、ヒトのアルブミンおよび中性塩、場合により可溶化剤およびｐＨ緩衝剤の存在下で、高度に精製されたトロンビン調合物を開発した。
【００１７】
この調合物は、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ナノメータ（ｎｍ）の公称細孔径（ｎｏｍｉｎａｌ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）の直列にした２つのフィルターによってナノろ過可能である。これらのフィルターは、高いろ過能力を有し、かつ製品回収率の低下およびナノろ過した材料の劣化がなく、それによって、単分散されたブタのパルボウイルスなどの最も小さいウイルス（ヒトＢ１９のモデルとして）でも、ｌｏｇ４（ベース１０）を超えるレベルに保持される。また、ナノろ過した材料は、処方（ｆｏｒｍｕｌａ）または最終組成の調節のため後続の処理を必要とせず、交差汚染の危険性が回避され、得られた生成物は後続の処理に対して十分安定しており、凍結乾燥または凍結状態で安定的に保存される。
【００１８】
この調合物においては、アルブミンは安定剤として働き、ナノろ過の過程での液体状態での操作の際および凍結乾燥または凍結の際のトロンビンの活性を保持する。また、アルブミンはｐＨ緩衝剤としての効果を有しており、凍結乾燥したペレットに稠密さを付与する。塩化ナトリウムなどの中性塩に関しては、トロンビンが非常に不溶性であり低いイオン強度では沈澱する場合のことを考えると、これは、トロンビンを溶解させ、溶液の等張性を維持するように働く。
【００１９】
ｐＨ減衰効果、また凍結乾燥物の稠密化および可溶化も、グリシン、またはクエン酸ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムなどの可溶化剤および／またはｐＨ緩衝剤の添加によって補うことができる。
【００２０】
本発明者等は０．０５％を超えるアルブミン濃度と塩化ナトリウムの存在が必要であることを明確にした。塩化ナトリウム濃度は少なくとも０．０５モルでなければならない。ほぼ等張性であるかまたは０．１５モルであればよりよい。このようにして、それ程の活性の損失もなく（トロンビン回収率＞９０％）、良好な生産性（ナノろ過面積１ｍ２当たり最大で１５００万ＩＵのトロンビン、またはより高い負荷）で、トロンビン溶液を、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径のフィルターよって二重ナノろ過することができる。ナノろ過した材料を、０．２μｍ膜を用いて殺菌し、適当な容器（バイアル、瓶、シリンジ等）中に無菌状態で量り込み、続く凍結乾燥のために−１８℃で凍結させ、凍結状態で保存する。後者の場合、凍結させる前に、塩化カルシウム溶液をトロンビンに加えて、その安定性にこれが影響を及ぼすことなく、処方を調節することができる。
【００２１】
本発明の組成物を得るための方法を以下の実施例で説明する。これは説明のためであって、限定しようとするものではない。
【００２２】
タンパク質１ｍｇ当たり１５００ＩＵ以上のトロンビンに等しい比活性特性と、１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの能力を有する生成物をもたらす方法で精製したトロンビン溶液を、０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）濃度のヒトのアルブミンと０．０５以上のモルの濃度の塩化ナトリウムとを５．０〜８．５のｐＨで加え、混合して安定化する。
【００２３】
このトロンビン溶液を、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径まで二重ナノろ過系を用いて処理する。使用したナノフィルターの種類はＰｌａｎｏｖａ１５Ｎ（登録商標）（Ａｓａｈｉ−Ｋａｓｅｉから）の商品名で市販されており、異なるろ過面積を有する再生セルロースでできた中空繊維カートリッジの構造を有している。特定の調合条件下で、第１のナノフィルターからのろ液を第２のナノフィルターに供給し、それによって、各ナノフィルター中での１．０バール未満、好ましくは０．２バール〜１．０バールの正の差圧に相当する、このナノフィルターの製造メーカーが推奨するナノろ過条件を変更することなく、２つのナノフィルターを直列に連結することによって、二重ナノろ過を同時に行うことができる。フィルター１個当たりのナノろ過能力は３０ｌ／ｍ２より大きくてよいが、最も小さいウイルス（パルボウイルス）の効果的な削減を達成するために、１ｍ２当たり３０リットル以下の溶液を用いることが好ましく、５〜３０ｌ／ｍ２を用いることがより好ましい。
【００２４】
ナノろ過した溶液は、それが凍結乾燥かまたは続く凍結のために最終処方にすでに調節されておれば、追加の操作を行うことなく、約５００ＩＵ／ｍｌの公称強度（ｎｏｍｉｎａｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を有することができる。
【００２５】
最終処方を調節するために、必要なら、例えば、０．０１〜０．１モルの濃度のグリシンなどのアミノ酸、例えば１０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなどのカルボン酸の塩、および塩化カルシウムまたは同等の塩（通常２０〜６０ｍＭ）を加えることができる。得られた調合物は引き続きナノろ過可能であり、この工程の間安定である。
【００２６】
凍結乾燥した場合でも凍結させた場合でも、得られる生成物は長期間安定である。凍結乾燥した生成物は、高温で短い曝露時間、例えば、９０〜１１５℃で０．５〜８時間、好ましくは約１００℃で１〜２時間加熱して、任意にウイルス不活性化にかけることができる。
【００２７】
本発明の特徴を以下の通りまとめることができる：
精製トロンビン組成物は、その処方がヒトのアルブミンおよび塩化ナトリウムなどの中性塩を含むものであって、凍結させるか凍結乾燥して保存した場合、得られた生成物は安定である。この組成物においては、トロンビンは溶液１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの公称強度に調節され、ヒトのアルブミンは０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）の濃度に調節される。塩化ナトリウム濃度は少なくとも０．０５モルにすべきであり、ほぼ等張性であるかまたは０．１５モルであればよりよい。
【００２８】
このトロンビン組成物は、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径までの直列にした二重ナノろ過によってろ過することができ、それぞれのナノフィルターで、ろ過面積１ｍ２当たり最大で３０リットルの溶液をろ過することができる。
【００２９】
この凍結乾燥したトロンビン組成物を、９０〜１１５℃で１／２時間〜８時間、好ましくは１００℃で１〜２時間乾燥加熱によって処理することができる。
本発明の非限定的な様々な実施例を以下に示す。
【実施例１】
【００３０】
全タンパク質のｍｇ当たり＞１５００ＩＵの比活性を有する精製トロンビン（ロットＴ−１００６）を、７５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグリシンおよび１０ｍＭの酢酸ナトリウムをｐＨ６．５で含む５容積部の溶液に対して、１０ｋＤａ限外ろ過膜を用いて透析し、最終的に６５４ＩＵのトロンビン／ｍｌ溶液に濃縮した。続いてこれを、最大で０．２５％のヒトのアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎａ Ｇｒｉｆｏｌｓ２０％）を加えて安定化させた。
【００３１】
この方法で安定化させた溶液を＜−２０℃で凍結させてナノろ過試験を開始した。最大で１５ｎｍ公称細孔径までの二重ナノろ過に対する先行予備ろ過（清澄化）の効果を、再生銅アンモニウムセルロースナノフィルター（Ａｓａｈｉ−ＫａｓｅｉからのＰｌａｎｏｖａ １５Ｎ（登録商標））を用いて検討した。この目的のために、３つの一定分量の安定化溶液を水浴中、２０±２℃で解凍させた。その結果、生成物の最終温度は２〜８℃であり、トロンビン活性は５９１．０〜６１４．５ＩＵ／ｍｌであり、全タンパク質は２．５４〜２．８０ｍｇ／ｍｌであった。溶液を、異なる細孔径：０．２２μｍ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＰＶＤＦ）、０．１μｍ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．からのＰＶＤＦ）および３５ｎｍ（Ａｓａｈｉ−Ｋａｓｅｉからの再生銅アンモニウムセルロース、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎ（登録商標））の３種類のフィルターを用いて個別に予備ろ過し、続いて二重の１５ｎｍのナノろ過（０．００１ｍ２からの、２×Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ（登録商標））で同時にろ過し、生成物の当初の容積の２０〜２８％相当量で最終的な後洗浄を行った。プロセスの実行可能性と予備ろ過の効果を、得られた適用比（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）（ｋｇ／ｍ２）、ナノろ過の間の膜貫通圧力（ＴＭＰ）の変化または増大、全タンパク質、トロンビン活性およびトロンビン回復率に関して試験を行った。
試験条件および得られた結果は以下の通りである：
【００３２】
【表１】
【００３３】
この検討から、ナノろ過の間のＴＭＰの増大に関しては、＜−２０℃で予め凍結させた調合済みの材料の予備ろ過は、ほぼ同じ適用比とろ液流量について、検討した０．２２μｍ〜３５ｎｍの細孔径範囲内の１５ｎｍでの二重ナノろ過に対して差分的効果を有していないことが認められよう。また、タンパク質、活性および回復率％に関しても、実施した試験の間で有意の差はなかった。同様に、塩化ナトリウム、グリシンおよび酢酸ナトリウムと一緒に、高度に精製したトロンビンとアルブミンとを含む開発した製品処方を用いた、１５ｎｍでの二重ナノろ過の実行可能性を検討したところ、すべての場合において、適用比値＞３０ｋｇ／ｍ２および９６％を超える回復率であり、その実行可能性が実証された。
【実施例２】
【００３４】
凍結乾燥で乾燥させた最終生成物を、非常に高温での短時間の曝露熱処理にかける可能性を検討した。同一ロットの精製生成物から出発して、調合物を２つの異なる組成で調製した。すなわち、処方Ａ：約５００ＩＵ／ｍｌのタンパク質トロンビン、１％アルブミン、１０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび７５ｍＭ塩化ナトリウム；処方Ｂ：約５００ＩＵ／ｍＬのトロンビン、２％マンニトール、１０ｍＭヒスチジン、０．０３％のＰＥＧ−３３５０および１７５ｍＭの塩化ナトリウムであった。
【００３５】
組成物を１５ｎｍでナノろ過し、ナノろ過した生成物を１０ｍｌバイアル中で凍結乾燥し、装置の最大真空条件下（＜０．１ｍバール）、３７℃で２４時間最終的な乾燥を実施した。残留水分は１％未満であった。
【００３６】
得られたバイアルを、１００℃、１０５℃、１１０℃および１１５℃で、１／２時間、１時間、２時間、４時間および８時間熱処理にかけ、続いてトロンビン活性を測定した。熱処理にかけていない元の生成物に対する活性回復率の割合は以下の通りである。
【００３７】
【表２】
【００３８】
上記の表に示す結果は、アルブミンの熱保護効果を示しており、かつ１００〜１０５℃の温度で概ね最大４時間まで、１１０℃で２時間まで、１１５℃で１時間まで熱をかけることができ、９０±５％の活性の回復率またはそれ以上が得られることを示している。
【実施例３】
【００３９】
凍結乾燥した生成物の安定性を評価するために、以下の最終生成物を調製した。
【００４０】
【表３】
【００４１】
これらの調製物を５℃と３０℃で保存し、サンプルを異なる保存時間で分析した。分析したパラメータにおいて不安定性を示す徴候は認められず、以下の活性回復率（％）を得た。
【００４２】
【表４】
【実施例４】
【００４３】
凍結生成物の安定性を評価するために以下の最終生成物を調製した。
【００４４】
【表５】
【００４５】
これらの調製物を−１８℃で保存し、サンプルを異なる保存時間で分析した。分析したパラメータにおいて不安定性を示す徴候は認められず、以下の活性回復率（％）を得た。
【００４６】
【表６】
【００４７】
これらの調製物のいくつかについて、５℃および２５℃での溶液の安定性も検討した。分析したパラメータにおいて不安定性を示す徴候は認められず、以下の活性回復率（％）を得た。
【００４８】
【表７】
【００４９】
例示した実施例をもとに、本発明をその本質的な特徴において説明してきたが、これらの説明は、上記特許請求の範囲で定義する本発明の範囲を制限しようとするものではないことを理解されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製トロンビン、ヒトのアルブミンおよび中性塩を含み、得られる生成物を凍結乾燥するかまたは凍結して保存することを特徴とするトロンビン組成物。
【請求項２】
前記トロンビンを、溶液１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの公称強度に調節することを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項３】
前記ヒトのアルブミンが０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）を有することを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項４】
ｐＨ緩衝剤の添加を含むことを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項５】
前記ｐＨ緩衝剤が０．０１〜０．１のモルの濃度でグリシンを含むことを特徴とする請求項４に記載のトロンビン組成物。
【請求項６】
前記ｐＨ緩衝剤がクエン酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項４に記載のトロンビン組成物。
【請求項７】
前記ｐＨ緩衝剤が酢酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項４に記載のトロンビン組成物。
【請求項８】
２０〜６０ｍＭの塩化カルシウムまたは同等物を含むことを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項９】
前記中性塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１０】
前記塩化ナトリウムが少なくとも０．０５のモルの濃度を有することを特徴とする請求項９に記載のトロンビン組成物。
【請求項１１】
前記溶液を、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径までの直列にした二重ナノろ過によってろ過できることを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１２】
各ナノフィルターのろ過面積１ｍ２当たり、最大で３０リットルの溶液をろ過できることを特徴とする請求項１１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１３】
前記凍結乾燥した組成物を、９０〜１１５℃で１／２時間〜８時間、好ましくは１００℃で１〜２時間乾燥加熱処理にかけることを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１４】
トロンビンを、タンパク質１ｍｇ当たり１５００ＩＵ以上のトロンビンの比活性、および１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの強度まで精製し、その溶液を、ヒトのアルブミンおよび中性塩を加え、混合して安定化させ、続いて前記溶液を二重ナノろ過系にかけることを特徴とするトロンビン組成物の調製方法。
【請求項１５】
前記ナノろ過を最大で３５ｎｍの公称細孔径まで実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノろ過を１５ｎｍの細孔径まで実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ナノろ過を、各ナノフィルターについてろ過面積１平方メートル当たり５〜３０リットルの溶液で実施することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液を凍結プロセスにかけることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液を凍結乾燥にかけることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記凍結乾燥した生成物を、９０〜１１５℃の温度で１／２時間〜８時間乾燥加熱処理することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記凍結乾燥したトロンビン組成物を、１００℃で１〜２時間乾燥加熱処理することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
精製トロンビン、ヒトのアルブミンおよび中性塩を含み、得られる生成物を凍結乾燥するかまたは凍結して保存することを特徴とするトロンビン組成物。
【請求項２】
前記トロンビンを、溶液１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの公称強度に調節することを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項３】
前記ヒトのアルブミンが０．０５％（ｗ／ｖ）を超える濃度、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）を有することを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項４】
ｐＨ緩衝剤の添加を含むことを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項５】
前記ｐＨ緩衝剤が０．０１〜０．１のモルの濃度でグリシンを含むことを特徴とする請求項４に記載のトロンビン組成物。
【請求項６】
前記ｐＨ緩衝剤がクエン酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項４に記載のトロンビン組成物。
【請求項７】
前記ｐＨ緩衝剤が酢酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求項４に記載のトロンビン組成物。
【請求項８】
２０〜６０ｍＭの塩化カルシウムまたは同等物を含むことを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項９】
前記中性塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１０】
前記塩化ナトリウムが少なくとも０．０５のモルの濃度を有することを特徴とする請求項９に記載のトロンビン組成物。
【請求項１１】
前記溶液を、最大で３５ｎｍ、好ましくは１５ｎｍの公称細孔径までの直列にした二重ナノろ過によってろ過できることを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１２】
各ナノフィルターのろ過面積１ｍ２当たり、最大で３０リットルの溶液をろ過できることを特徴とする請求項１１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１３】
前記凍結乾燥した組成物を、９０〜１１５℃で１／２時間〜８時間、好ましくは１００℃で１〜２時間乾燥加熱処理にかけることを特徴とする請求項１に記載のトロンビン組成物。
【請求項１４】
トロンビンを、タンパク質１ｍｇ当たり１５００ＩＵ以上のトロンビンの比活性、および１ｍｌ当たり５００ＩＵ以上のトロンビンの強度まで精製し、その溶液を、ヒトのアルブミンおよび中性塩を加え、混合して安定化させ、続いて前記溶液を二重ナノろ過系にかけることを特徴とするトロンビン組成物の調製方法。
【請求項１５】
前記ナノろ過を最大で３５ｎｍの公称細孔径まで実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノろ過を１５ｎｍの細孔径まで実施することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ナノろ過を、各ナノフィルターについてろ過面積１平方メートル当たり５〜３０リットルの溶液で実施することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液を凍結プロセスにかけることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液を凍結乾燥にかけることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記凍結乾燥した生成物を、９０〜１１５℃の温度で１／２時間〜８時間乾燥加熱処理することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記凍結乾燥したトロンビン組成物を、１００℃で１〜２時間乾燥加熱処理することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【公開番号】特開２００６−１１７６７８（Ｐ２００６−１１７６７８Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０８５４８（Ｐ２００５−３０８５４８）
【出願日】平成１７年１０月２４日（２００５．１０．２４）
【出願人】（５０５３９５９７３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２４日（２００５．１０．２４）
【出願人】（５０５３９５９７３）
【Ｆターム（参考）】
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