宿主対移植片疾患の検査方法
【課題】 同種抗原認識を検出する方法，およびかかる方法に用いる検査薬を提供すること。
【解決手段】
同種抗原認識の成立とＣＣＬ８の発現量の増加とが有意に関連することが見いだされた。宿主対移植片疾患を検査するための方法であって，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする方法が開示される。また，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬も提供される。
【解決手段】
同種抗原認識の成立とＣＣＬ８の発現量の増加とが有意に関連することが見いだされた。宿主対移植片疾患を検査するための方法であって，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする方法が開示される。また，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，宿主対移植片疾患を検査するための方法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植は，他人の臓器，例えば，皮膚，腎臓，肝臓，心臓，肺，膵臓などを移植することにより，臓器の障害を治療する方法である。移植医療において，他人の臓器組織はすべて同種抗原（アロ抗原）として認識される。生物の細胞表面には自己と非自己を区別するための抗原（主要組織適合抗原：ＭＨＣ）が発現しており，その違いによって非自己の細胞，すなわち自己と異なるＭＨＣをもつ細胞を認識，攻撃，排除する自己防衛機構が備わっている。その中心的な役割を担っているのはＣＤ４陽性リンパ球であり，非自己の細胞を認識すると活性化，増殖し，種々の生理活性物質（サイトカイン，ケモカインなど）の産生といった免疫反応を引き起こす。このため，移植医療においては，移植拒絶を防止するために，ドナーと宿主とのＨＬＡ抗原のタイプが一致するようにドナーを選択し，かつ，宿主に薬剤を投与してこれらの免疫反応を抑制することが必要である。しかしながら，ＨＬＡ抗原にはきわめて多くのタイプがあり，完全に一致するドナーを見いだすことは非常に困難である。
【０００３】
同種抗原認識には抗原提示細胞とリンパ球などの免疫担当細胞の二者が少なくとも必要であり，両者の間にＭＨＣの不一致が存在することにより成立する。抗原提示細胞（樹状細胞：ＤＣなど）が発現する組織適合抗原ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）を同種ＣＤ４Ｔ細胞が認識することにより同種抗原認識が行われる。その結果，ＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化し，様々な生理活性物質（サイトカイン，ケモカイン）が産生される。それらの生理活性物質は宿主体内での炎症を惹起し，リンパ球，マクロファージなどの免疫担当細胞を増殖，活性化させる。
【０００４】
体内で起こっている同種抗原認識を血清などでモニターできれば，臓器拒絶などの移植免疫状態を客観的に観察可能となり，診断治療に大きな貢献ができると考えられる。過去の研究では，同種抗原認識の際に腫瘍崩壊因子アルファ（ＴＮＦ−α）やインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）といったサイトカインが産生されることがわかっている。しかし，ＩＦＮ−γは同種抗原認識の有無に関わらず，活性化されたリンパ球からも産生されるため，同種抗原認識の分子マーカーとしては不十分である。したがって，宿主対移植片疾患を早期に診断し，早期に治療を開始し，治療効果を客観的にモニターするために，同種抗原認識に特異的な分子マーカーを発見することが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2009/001545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は，同種抗原認識を検出する方法およびかかる方法に用いる検査薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは，ＭＨＣの異なるマウスからの免疫細胞を混合培養して解析したところ，同種抗原認識の成立とＣＣＬ８の発現量の増加とが有意に関連することを発見して，本発明を完成した。
【０００８】
すなわち，本発明は，宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）を検査するための方法を提供する。この方法は，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする。
【０００９】
好ましくは，ＣＣＬ８蛋白質の量は，抗ＣＣＬ８抗体を用いて測定される。また好ましくは，ＣＣＬ８蛋白質の量は，質量分析計，高速液体クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動からなる群より選択される方法を用いて測定される。
【００１０】
別の観点においては，本発明は，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬を提供する。
【００１１】
さらに別の観点においては，本発明は，宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質を選択する方法を提供する。この方法は，
宿主対移植片疾患のモデル動物に試験物質を投与し，
前記モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合に，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択する，
の各工程を含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明にしたがえば，臓器組織移植において，体内での移植臓器の同種抗原認識をモニターすることができ，宿主対移植片疾患の発症および進行を早期に診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は，同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図２】図２は，同種抗原認識における各種サイトカインの発現を示す。
【図３】図３は，中和抗体の存在下におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図４】図４は，樹状細胞と，ＣＤ４陽性Ｔ細胞および／またはマクロファージとの混合培養におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図５】図５は，樹状細胞と，ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞との混合培養におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図６】図６は，ＣＣＬ８の発現の用量応答性を示す。
【図７】図７は，同種抗原認識におけるＩＦＮγの発現を示す。
【図８】図８は，インビボ同種移植実験の結果を示す。
【図９】図９は，同種抗原認識におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化およびＣＣＬ８発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は，被験者の血液などの被検試料におけるＣＣＬ８の発現量を測定することにより，同種抗原認識を検出して，宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）を診断し，経過をモニタリングする方法を特徴とする。下記の実施例に具体的に示されるように，同種アロ抗原認識によってＣＣＬ８が発現することが明らかとなった。すなわち，ＣＣＬ８は同種抗原認識のバイオマーカーとして有用であることが明らかとなった。
【００１５】
ＣＣＬ８とは，ケモカイン・ファミリーに属する塩基性ヘパリン結合性分泌蛋白質であり，ＭＣＰ−２とも称される（GenBank Accession No. NP＿005614)。この蛋白質は，単球，線維芽細胞，上皮細胞などで産生され，レセプターとして，ＣＣＲ２，ＣＣＲ３，ＣＣＲ５およびＣＣＲ１１に結合することが知られている。ＣＣＬ８は，ＣＤ４陽性Ｔ細胞，ＣＤ８陽性Ｔ細胞，単球，ＮＫ細胞，好酸球，好塩基球などを標的細胞とすることが明らかにされている。しかしながら，生体内におけるＣＣＬ８の役割や免疫系の調節におけるその意義は十分に解明されていない。
【００１６】
本発明者らは先に，ＣＣＬ８を指標として造血幹細胞移植により生ずる移植片対宿主疾患の発症および経過を診断することができることを見いだした（WO/2009/001545：特許文献１）。しかし，このＣＣＬ８の発現と移植片対宿主疾患との相関のメカニズムは不明であった。また，骨髄移植における拒絶反応（移植片対宿主疾患；ＧＶＨＤ）と，臓器移植における拒絶反応（宿主対移植片疾患；ＨＶＧＤ）とは，免疫学的には大きく異なることが知られているが，その免疫反応の詳細は明らかになっていない。本発明にしたがって，ＣＣＬ８を同種抗原認識のバイオマーカーとして利用することにより，今後これらの免疫反応のメカニズムに関する研究が進むことが期待される。
【００１７】
ＣＣＬ８蛋白質の量を測定すべき被検試料としては，被験者または被検動物から得た体液，血液，血清，血漿などを用いることができる。また，被験者から採取された組織や細胞を用いてもよい。
【００１８】
被験者から得た試料におけるＣＣＬ８蛋白質の量は，抗ＣＣＬ８抗体を用いて，当該技術分野においてよく知られる免疫学的測定法を用いて測定することができる。抗ＣＣＬ８抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。各種の抗ＣＣＬ８ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が市販されており，それらのいずれの抗体も本発明において用いることができる。
【００１９】
あるいは，抗体は当該技術分野においてよく知られる方法により作成してもよい。ＣＣＬ８に結合するポリクローナル抗体は，ＣＣＬ８またはそのペプチド断片を感作抗原として用いて動物を免疫し，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し，ＥＬＩＳＡアッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，所望の特異性を有する抗体の存在を確認することにより得ることができる。
【００２０】
ＣＣＬ８に結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，ＣＣＬ８またはそのペプチド断片を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマを選択してクローニングし，このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
【００２１】
このようにして得られた抗体を用いて，免疫学的方法により，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質を測定する。測定は，定性的であっても定量的であってもよい。被験者から得たＣＣＬ８の発現の免疫学的測定は，例えば，ラジオイムノアッセイ，ＥＬＩＳＡ，免疫沈降法，免疫凝集法，ウエスタンブロット等を用いて行うことができる。
【００２２】
例えば，典型的な例として，以下のようにしてサンドイッチＥＬＩＳＡを行うことができる。被験者の末梢血を採血して血漿を調製し，これを抗ＣＣＬ８抗体を固定化したプレートまたはチップに加え，適当な時間インキュベートする。プレートまたはチップを洗浄して未結合成分を除去した後，別の抗ＣＣＬ８抗体を加える。この抗体は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等により検出可能なように標識することができる。適当な時間インキュベートした後，プレートまたはチップを洗浄し，蛍光，発光，放射活性等を測定することにより，標識を検出する。あるいは，抗ＣＣＬ８抗体を結合させた後，二次抗体（例えばヤギ抗マウス抗体）を加えてシグナルを増強してもよい。二次抗体は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等により検出可能なように標識することができる。このようにして，被験者から得た血漿におけるＣＣＬ８蛋白質の量を測定することができる。
【００２３】
別の態様においては，凝集反応を利用した検出方法を用いてＣＣＬ８蛋白質を検出することができる。この方法においては，抗ＣＣＬ８抗体を結合させた担体，例えばラテックス粒子を用いてＣＣＬ８を検出することができる。抗ＣＣＬ８抗体を結合させたラテックス粒子を試料と混合して一定時間インキュベートすると，試料中にＣＣＬ８が含まれる場合には粒子が凝集する。この凝集の程度を肉眼で観察するか，または分光光度計を用いて定量することにより，試料中のＣＣＬ８を検出することができる。
【００２４】
別の態様においては，表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いてＣＣＬ８蛋白質を検出することができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは，蛋白質−蛋白質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてモニターすることが可能である。例えば，ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることにより，ＣＣＬ８蛋白質と抗ＣＣＬ８抗体の結合を検出することができる。具体的には，抗ＣＣＬ８抗体を固定化したセンサーチップに，被検試料を接触させ，抗ＣＣＬ８抗体に結合するＣＣＬ８蛋白質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
【００２５】
あるいは，ＣＣＬ８蛋白質は，被検試料を金属キレート剤やヘパリン等のアフィニティー担体を用いて粗精製（濃縮）した後に，ＭＳにより検出および定量してもよい。また，HPLCにより検出および定量してもよく，２次元電気泳動をした後に銀染色により検出および定量してもよい。
【００２６】
本発明はまた，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患検査薬を提供する。本発明の宿主対移植片疾患検査薬は，検査キットの形で提供することができる。検査キットは，ＣＣＬ８の検出のための試薬，例えば，抗ＣＣＬ８抗体を有効成分として含む。また，このキットは，測定に必要な適当な試薬類，例えば緩衝液，希釈液，反応停止液，洗浄液，コントロール標品などをさらに含んでいてもよい。
【００２７】
本発明においては，このようにして測定されたＣＣＬ８蛋白質の量を指標として，宿主対移植片疾患の検査を行うことができる。本発明の方法にしたがえば，臨床症状の観察ではなく，ＣＣＬ８蛋白質をマーカーとして，宿主対移植片疾患を客観的に診断することができ，宿主対移植片疾患の発症および経過をモニタリングすることができる。本発明の検査方法は，例えば，宿主対移植片疾患の発症前の診断（早期診断），発症の確定診断，重篤度の判定，疾患の経過のモニタリング，治療効果の判定，および予後の予測に有用である。
【００２８】
さらに，本発明にしたがって，ＣＣＬ８の発現量を指標として，宿主対移植片疾患の治療薬の有力な候補物質をスクリーニングすることが可能である。スクリーニングは，宿主対移植片疾患のモデル動物，例えば同種臓器移植を受けた動物に試験物質を投与し，モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定することにより行う。試験物質としては，例えば，抗ＣＣＬ８抗体を用いることができる。あるいは，試験物質は，種々の合成又は天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから取得してもよい。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合には，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択することができる。すなわち，本発明の検査方法は，宿主対移植片疾患の新規治療法開発におけるプラットフォームを提供するものである。
【００２９】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現
ＭＨＣの異なるマウスの組み合わせ（Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢａｌｂ／ｃマウス）を用いて，Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞とＢａｌｂ／ｃマウス樹状細胞とを生体外混合培養した。樹状細胞は，Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞から磁気ビーズを用いて分離した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗原提示細胞として，１ｘ１０５個の樹状細胞を９６ウエルの培養プレートに播種し，Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓有核細胞１ｘ１０６個とともに混合培養した。培養開始後１，２，３，４，５日目の上清のＣＣＬ８濃度をＥＬＩＳＡにより定量した。その結果，培養開始後３〜４日目には培養上清中にＣＣＬ８蛋白質が発現していることが確認された（図１）。対照として同系（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）の細胞を用いた場合にはＣＣＬ８の発現は検出されなかった。
【００３１】
同種抗原認識における各種サイトカインの発現
同種抗原認識状態におけるＣＣＬ８発現機構を解析するために，Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗原提示細胞として樹状細胞を１ｘ１０５個と，種々の個数のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓有核細胞とを丸底９６穴プレートで，１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン，１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μ／ｍＬのストレプトマイシンとを補充したＲＰＭＩ１６４０中，３７℃，５％ＣＯ２下で混合培養した。培養開始後６時間で細胞からｍＲＮＡを抽出し，リアルタイムＰＣＲ法にて各種サイトカインの発現を定量した。結果を図２に示す。図２のグラフでは，ＧＡＰＤＨに対して標準化した値を，同系抗原における発現のレベルを１とした相対値で表されている。ＩＬ−２，ＴＮＦ−α，およびＩＦＮγがＣＣＬ８に先立って発現することが見いだされた。
【００３２】
次に，これらのサイトカインに対する中和抗体の存在下で，Ｂａｌｂ／ｃマウス樹状細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を４日間混合培養し，培養上清におけるＣＣＬ８の濃度を定量した。抗ＩＬ−２抗体および抗ＩＦＮγ抗体の添加によりＣＣＬ８発現は低下し，抗ＴＮＦα抗体でもＣＣＬ８発現の減少が見られた（図３）。このことから，同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現には，ＭＨＣクラスＩＩ，ＩＮＦγ，ＩＬ２，およびＴＮＦαが関与していることがわかる。
【００３３】
ＣＣＬ８産生に関与する細胞の同定
ＣＣＬ８産生に関与する細胞を明らかにする目的で，Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を磁気ビーズ法を用いて選別し，ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）を単離して，Ｂａｌｂ／ｃマウス樹状細胞と混合培養した。その結果，ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いたときに，脾細胞全体を用いた場合と同様のＣＣＬ８発現が見られた（図４）。またＣＤ４陽性Ｔ細胞にマクロファージを等量混合した場合では，ＣＣＬ８発現は２倍以上の高値を認めた。これらの結果より，抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の間で同種抗原認識が成立するとＣＣＬ８が発現し，更にマクロファージの存在下ではＣＣＬ８の発現が増強することが明らかになった。このことから，ＣＣＬ８はＴ細胞の同種抗原認識により初期発現し，同種抗原認識したＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されたＩＦＮγによりＣＤ１１ｂ＋細胞からの発現誘導が起こることがわかる。
【００３４】
次に，ＣＣＬ８産生のメカニズムを調べるために，細胞を同系または同種で混合して培養したときのＣＣＬ８濃度を測定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から樹状細胞を単離した。Ｂ６脾臓細胞はＡｕｔｏ ＭＡＣＳ ｓｙｓｔｅｍを用いて単離した。１ｘ１０５個のＢａｌｂ／ｃの樹状細胞を，１ｘ１０６個のＢ６マウス脾臓由来の，全脾臓細胞，ＣＤ４＋Ｔ細胞，ＣＤ８＋Ｔ細胞または対照としてＢａｌｂ／ｃ（同系）マウスの脾臓細胞とともに４日間培養し，培養上清中のＣＣＬ８を定量した。
【００３５】
図５に示されるように，Ｂａｌｂ／ｃ樹状細胞とＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞との混合培養において明らかなＣＣＬ８の発現が見られ，ＣＣＬ８の濃度はＢ６ ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞（同系）との混合培養の場合より有意に高かった（白色バー）。一方，混合培養開始時に抗マウスＭＨＣクラスＩＩ抗体を添加すると，ＣＣＬ８の発現レベルは顕著に低下し，この効果は，Ｂａｌｂ／ｃ樹状細胞およびＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞において有意であった（黒色バー）。このことから，ＣＣＬ８の誘導はＣＤ４＋Ｔ細胞によるクラスＩＩ認識を介していることがわかる。
【００３６】
さらに，上記と同じ系で，脾臓細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を変えて実験したところ，ＣＣＬ８の発現は用量応答性を示し，ＣＣＬ８の誘導が生物学的な反応であることが確認された（図６）。
【００３７】
ＩＦＮγの発現の分析
培養プレートでＢａｌｂ／ｃ由来樹状細胞（ＤＣ）とＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を混合培養し，継時的に培養上清のＩＦＮγ値を測定した。結果を図７に示す。ＩＦＮγのレベルは第２日より上昇したが，第５日には，同種抗原認識反応が続いているにも関わらず低下していた。このことは，ＩＦＮγの発現レベルは同種抗原認識の指標としては不適当であることを示す。
【００３８】
インビボ同種移植実験
４グレイの放射線を照射した拒絶モデルマウスの背部皮下に，同種脾臓由来Ｂ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植し，血中ＣＣＬ８濃度を測定した（図８）。白バーは０．１ｘ１０７個のＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したときの，黒バーは１．０ｘ１０７個を移植したときの，５日および７日後の平均ＣＣＬ８濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。＊および＊＊は，それぞれｐ値＜０．０５および＜０．０１を示す（ｎ＝４）。血漿ＣＣＬ８濃度は１．０ｘ１０７個の同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植した群において，０．１ｘ１０７個の群より有意に高かった。移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞の数とＣＣＬ８産生との間に明らかな用量依存性がみられた。一方，血漿ＣＣＬ８濃度は第５日に上昇したが，移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞数が拒絶反応によって減少する第７日までに急速に低下した。これらの結果は，血漿ＣＣＬ８濃度が同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を忠実に反映していることを示す。
【００３９】
ＴＣＲの関与の解析
ＣＤ４＋Ｔ細胞はＢ６マウスの脾臓から単離し，同種樹状細胞はＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離した。１ｘ１０６個のＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞を，培養プレートで，バッファー（対照），抗ＣＤ３ε抗体および抗ＣＤ２８抗体，またはＢａｌｂ／ｃマウス樹状細胞の存在下で培養した。上清中のＣＣＬ８濃度を測定したところ，同種樹状細胞刺激についてのみＣＣＬ８の産生が認められた（図９Ａ）。これらの結果は，ＣＤ３εおよびＣＤ２８のＣＤ４＋Ｔ細胞へのクロスリンクがインビトロでＣＣＬ８の発現を誘導しなかったことを示す。また，抗ＣＤ３ε抗体および抗ＣＤ２８抗体または同種樹状細胞で刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞において細胞増殖とＩＦＮ−γの分泌が認められた（図９Ｂ）。白色バーはミトコンドリア活性を反映する色素を用いて測定した細胞増殖（グラフ左数値）を，灰色バーはＩＦＮ−γの分泌量を表す（グラフ右数値）。同種抗原提示でもＴＣＲのクロスリンクでも，いずれもＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化が生じていることがわかる。
【００４０】
以上の結果より，同種抗原認識の分子マーカーとしてのＣＣＬ８の発現機序は，
１． 抗原提示細胞によるＭＨＣクラスＩＩを介した，ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する抗原提示ないしは活性化刺激；および
２． 同種抗原認識後のＴ細胞活性化に伴うＩＬ−２，ＩＦＮ−γの発現；
の両方が関与していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は，宿主対移植片疾患の診断および経過のモニタリング，ならびに治療に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，宿主対移植片疾患を検査するための方法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植は，他人の臓器，例えば，皮膚，腎臓，肝臓，心臓，肺，膵臓などを移植することにより，臓器の障害を治療する方法である。移植医療において，他人の臓器組織はすべて同種抗原（アロ抗原）として認識される。生物の細胞表面には自己と非自己を区別するための抗原（主要組織適合抗原：ＭＨＣ）が発現しており，その違いによって非自己の細胞，すなわち自己と異なるＭＨＣをもつ細胞を認識，攻撃，排除する自己防衛機構が備わっている。その中心的な役割を担っているのはＣＤ４陽性リンパ球であり，非自己の細胞を認識すると活性化，増殖し，種々の生理活性物質（サイトカイン，ケモカインなど）の産生といった免疫反応を引き起こす。このため，移植医療においては，移植拒絶を防止するために，ドナーと宿主とのＨＬＡ抗原のタイプが一致するようにドナーを選択し，かつ，宿主に薬剤を投与してこれらの免疫反応を抑制することが必要である。しかしながら，ＨＬＡ抗原にはきわめて多くのタイプがあり，完全に一致するドナーを見いだすことは非常に困難である。
【０００３】
同種抗原認識には抗原提示細胞とリンパ球などの免疫担当細胞の二者が少なくとも必要であり，両者の間にＭＨＣの不一致が存在することにより成立する。抗原提示細胞（樹状細胞：ＤＣなど）が発現する組織適合抗原ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）を同種ＣＤ４Ｔ細胞が認識することにより同種抗原認識が行われる。その結果，ＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化し，様々な生理活性物質（サイトカイン，ケモカイン）が産生される。それらの生理活性物質は宿主体内での炎症を惹起し，リンパ球，マクロファージなどの免疫担当細胞を増殖，活性化させる。
【０００４】
体内で起こっている同種抗原認識を血清などでモニターできれば，臓器拒絶などの移植免疫状態を客観的に観察可能となり，診断治療に大きな貢献ができると考えられる。過去の研究では，同種抗原認識の際に腫瘍崩壊因子アルファ（ＴＮＦ−α）やインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）といったサイトカインが産生されることがわかっている。しかし，ＩＦＮ−γは同種抗原認識の有無に関わらず，活性化されたリンパ球からも産生されるため，同種抗原認識の分子マーカーとしては不十分である。したがって，宿主対移植片疾患を早期に診断し，早期に治療を開始し，治療効果を客観的にモニターするために，同種抗原認識に特異的な分子マーカーを発見することが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2009/001545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は，同種抗原認識を検出する方法およびかかる方法に用いる検査薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは，ＭＨＣの異なるマウスからの免疫細胞を混合培養して解析したところ，同種抗原認識の成立とＣＣＬ８の発現量の増加とが有意に関連することを発見して，本発明を完成した。
【０００８】
すなわち，本発明は，宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）を検査するための方法を提供する。この方法は，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする。
【０００９】
好ましくは，ＣＣＬ８蛋白質の量は，抗ＣＣＬ８抗体を用いて測定される。また好ましくは，ＣＣＬ８蛋白質の量は，質量分析計，高速液体クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動からなる群より選択される方法を用いて測定される。
【００１０】
別の観点においては，本発明は，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬を提供する。
【００１１】
さらに別の観点においては，本発明は，宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質を選択する方法を提供する。この方法は，
宿主対移植片疾患のモデル動物に試験物質を投与し，
前記モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合に，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択する，
の各工程を含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明にしたがえば，臓器組織移植において，体内での移植臓器の同種抗原認識をモニターすることができ，宿主対移植片疾患の発症および進行を早期に診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は，同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図２】図２は，同種抗原認識における各種サイトカインの発現を示す。
【図３】図３は，中和抗体の存在下におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図４】図４は，樹状細胞と，ＣＤ４陽性Ｔ細胞および／またはマクロファージとの混合培養におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図５】図５は，樹状細胞と，ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞との混合培養におけるＣＣＬ８の発現を示す。
【図６】図６は，ＣＣＬ８の発現の用量応答性を示す。
【図７】図７は，同種抗原認識におけるＩＦＮγの発現を示す。
【図８】図８は，インビボ同種移植実験の結果を示す。
【図９】図９は，同種抗原認識におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化およびＣＣＬ８発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は，被験者の血液などの被検試料におけるＣＣＬ８の発現量を測定することにより，同種抗原認識を検出して，宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）を診断し，経過をモニタリングする方法を特徴とする。下記の実施例に具体的に示されるように，同種アロ抗原認識によってＣＣＬ８が発現することが明らかとなった。すなわち，ＣＣＬ８は同種抗原認識のバイオマーカーとして有用であることが明らかとなった。
【００１５】
ＣＣＬ８とは，ケモカイン・ファミリーに属する塩基性ヘパリン結合性分泌蛋白質であり，ＭＣＰ−２とも称される（GenBank Accession No. NP＿005614)。この蛋白質は，単球，線維芽細胞，上皮細胞などで産生され，レセプターとして，ＣＣＲ２，ＣＣＲ３，ＣＣＲ５およびＣＣＲ１１に結合することが知られている。ＣＣＬ８は，ＣＤ４陽性Ｔ細胞，ＣＤ８陽性Ｔ細胞，単球，ＮＫ細胞，好酸球，好塩基球などを標的細胞とすることが明らかにされている。しかしながら，生体内におけるＣＣＬ８の役割や免疫系の調節におけるその意義は十分に解明されていない。
【００１６】
本発明者らは先に，ＣＣＬ８を指標として造血幹細胞移植により生ずる移植片対宿主疾患の発症および経過を診断することができることを見いだした（WO/2009/001545：特許文献１）。しかし，このＣＣＬ８の発現と移植片対宿主疾患との相関のメカニズムは不明であった。また，骨髄移植における拒絶反応（移植片対宿主疾患；ＧＶＨＤ）と，臓器移植における拒絶反応（宿主対移植片疾患；ＨＶＧＤ）とは，免疫学的には大きく異なることが知られているが，その免疫反応の詳細は明らかになっていない。本発明にしたがって，ＣＣＬ８を同種抗原認識のバイオマーカーとして利用することにより，今後これらの免疫反応のメカニズムに関する研究が進むことが期待される。
【００１７】
ＣＣＬ８蛋白質の量を測定すべき被検試料としては，被験者または被検動物から得た体液，血液，血清，血漿などを用いることができる。また，被験者から採取された組織や細胞を用いてもよい。
【００１８】
被験者から得た試料におけるＣＣＬ８蛋白質の量は，抗ＣＣＬ８抗体を用いて，当該技術分野においてよく知られる免疫学的測定法を用いて測定することができる。抗ＣＣＬ８抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。各種の抗ＣＣＬ８ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が市販されており，それらのいずれの抗体も本発明において用いることができる。
【００１９】
あるいは，抗体は当該技術分野においてよく知られる方法により作成してもよい。ＣＣＬ８に結合するポリクローナル抗体は，ＣＣＬ８またはそのペプチド断片を感作抗原として用いて動物を免疫し，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し，ＥＬＩＳＡアッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，所望の特異性を有する抗体の存在を確認することにより得ることができる。
【００２０】
ＣＣＬ８に結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，ＣＣＬ８またはそのペプチド断片を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマを選択してクローニングし，このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
【００２１】
このようにして得られた抗体を用いて，免疫学的方法により，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質を測定する。測定は，定性的であっても定量的であってもよい。被験者から得たＣＣＬ８の発現の免疫学的測定は，例えば，ラジオイムノアッセイ，ＥＬＩＳＡ，免疫沈降法，免疫凝集法，ウエスタンブロット等を用いて行うことができる。
【００２２】
例えば，典型的な例として，以下のようにしてサンドイッチＥＬＩＳＡを行うことができる。被験者の末梢血を採血して血漿を調製し，これを抗ＣＣＬ８抗体を固定化したプレートまたはチップに加え，適当な時間インキュベートする。プレートまたはチップを洗浄して未結合成分を除去した後，別の抗ＣＣＬ８抗体を加える。この抗体は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等により検出可能なように標識することができる。適当な時間インキュベートした後，プレートまたはチップを洗浄し，蛍光，発光，放射活性等を測定することにより，標識を検出する。あるいは，抗ＣＣＬ８抗体を結合させた後，二次抗体（例えばヤギ抗マウス抗体）を加えてシグナルを増強してもよい。二次抗体は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等により検出可能なように標識することができる。このようにして，被験者から得た血漿におけるＣＣＬ８蛋白質の量を測定することができる。
【００２３】
別の態様においては，凝集反応を利用した検出方法を用いてＣＣＬ８蛋白質を検出することができる。この方法においては，抗ＣＣＬ８抗体を結合させた担体，例えばラテックス粒子を用いてＣＣＬ８を検出することができる。抗ＣＣＬ８抗体を結合させたラテックス粒子を試料と混合して一定時間インキュベートすると，試料中にＣＣＬ８が含まれる場合には粒子が凝集する。この凝集の程度を肉眼で観察するか，または分光光度計を用いて定量することにより，試料中のＣＣＬ８を検出することができる。
【００２４】
別の態様においては，表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いてＣＣＬ８蛋白質を検出することができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは，蛋白質−蛋白質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてモニターすることが可能である。例えば，ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることにより，ＣＣＬ８蛋白質と抗ＣＣＬ８抗体の結合を検出することができる。具体的には，抗ＣＣＬ８抗体を固定化したセンサーチップに，被検試料を接触させ，抗ＣＣＬ８抗体に結合するＣＣＬ８蛋白質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
【００２５】
あるいは，ＣＣＬ８蛋白質は，被検試料を金属キレート剤やヘパリン等のアフィニティー担体を用いて粗精製（濃縮）した後に，ＭＳにより検出および定量してもよい。また，HPLCにより検出および定量してもよく，２次元電気泳動をした後に銀染色により検出および定量してもよい。
【００２６】
本発明はまた，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患検査薬を提供する。本発明の宿主対移植片疾患検査薬は，検査キットの形で提供することができる。検査キットは，ＣＣＬ８の検出のための試薬，例えば，抗ＣＣＬ８抗体を有効成分として含む。また，このキットは，測定に必要な適当な試薬類，例えば緩衝液，希釈液，反応停止液，洗浄液，コントロール標品などをさらに含んでいてもよい。
【００２７】
本発明においては，このようにして測定されたＣＣＬ８蛋白質の量を指標として，宿主対移植片疾患の検査を行うことができる。本発明の方法にしたがえば，臨床症状の観察ではなく，ＣＣＬ８蛋白質をマーカーとして，宿主対移植片疾患を客観的に診断することができ，宿主対移植片疾患の発症および経過をモニタリングすることができる。本発明の検査方法は，例えば，宿主対移植片疾患の発症前の診断（早期診断），発症の確定診断，重篤度の判定，疾患の経過のモニタリング，治療効果の判定，および予後の予測に有用である。
【００２８】
さらに，本発明にしたがって，ＣＣＬ８の発現量を指標として，宿主対移植片疾患の治療薬の有力な候補物質をスクリーニングすることが可能である。スクリーニングは，宿主対移植片疾患のモデル動物，例えば同種臓器移植を受けた動物に試験物質を投与し，モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定することにより行う。試験物質としては，例えば，抗ＣＣＬ８抗体を用いることができる。あるいは，試験物質は，種々の合成又は天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから取得してもよい。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合には，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択することができる。すなわち，本発明の検査方法は，宿主対移植片疾患の新規治療法開発におけるプラットフォームを提供するものである。
【００２９】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現
ＭＨＣの異なるマウスの組み合わせ（Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢａｌｂ／ｃマウス）を用いて，Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞とＢａｌｂ／ｃマウス樹状細胞とを生体外混合培養した。樹状細胞は，Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞から磁気ビーズを用いて分離した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗原提示細胞として，１ｘ１０５個の樹状細胞を９６ウエルの培養プレートに播種し，Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓有核細胞１ｘ１０６個とともに混合培養した。培養開始後１，２，３，４，５日目の上清のＣＣＬ８濃度をＥＬＩＳＡにより定量した。その結果，培養開始後３〜４日目には培養上清中にＣＣＬ８蛋白質が発現していることが確認された（図１）。対照として同系（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）の細胞を用いた場合にはＣＣＬ８の発現は検出されなかった。
【００３１】
同種抗原認識における各種サイトカインの発現
同種抗原認識状態におけるＣＣＬ８発現機構を解析するために，Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗原提示細胞として樹状細胞を１ｘ１０５個と，種々の個数のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓有核細胞とを丸底９６穴プレートで，１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン，１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μ／ｍＬのストレプトマイシンとを補充したＲＰＭＩ１６４０中，３７℃，５％ＣＯ２下で混合培養した。培養開始後６時間で細胞からｍＲＮＡを抽出し，リアルタイムＰＣＲ法にて各種サイトカインの発現を定量した。結果を図２に示す。図２のグラフでは，ＧＡＰＤＨに対して標準化した値を，同系抗原における発現のレベルを１とした相対値で表されている。ＩＬ−２，ＴＮＦ−α，およびＩＦＮγがＣＣＬ８に先立って発現することが見いだされた。
【００３２】
次に，これらのサイトカインに対する中和抗体の存在下で，Ｂａｌｂ／ｃマウス樹状細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を４日間混合培養し，培養上清におけるＣＣＬ８の濃度を定量した。抗ＩＬ−２抗体および抗ＩＦＮγ抗体の添加によりＣＣＬ８発現は低下し，抗ＴＮＦα抗体でもＣＣＬ８発現の減少が見られた（図３）。このことから，同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現には，ＭＨＣクラスＩＩ，ＩＮＦγ，ＩＬ２，およびＴＮＦαが関与していることがわかる。
【００３３】
ＣＣＬ８産生に関与する細胞の同定
ＣＣＬ８産生に関与する細胞を明らかにする目的で，Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を磁気ビーズ法を用いて選別し，ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）を単離して，Ｂａｌｂ／ｃマウス樹状細胞と混合培養した。その結果，ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いたときに，脾細胞全体を用いた場合と同様のＣＣＬ８発現が見られた（図４）。またＣＤ４陽性Ｔ細胞にマクロファージを等量混合した場合では，ＣＣＬ８発現は２倍以上の高値を認めた。これらの結果より，抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の間で同種抗原認識が成立するとＣＣＬ８が発現し，更にマクロファージの存在下ではＣＣＬ８の発現が増強することが明らかになった。このことから，ＣＣＬ８はＴ細胞の同種抗原認識により初期発現し，同種抗原認識したＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されたＩＦＮγによりＣＤ１１ｂ＋細胞からの発現誘導が起こることがわかる。
【００３４】
次に，ＣＣＬ８産生のメカニズムを調べるために，細胞を同系または同種で混合して培養したときのＣＣＬ８濃度を測定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から樹状細胞を単離した。Ｂ６脾臓細胞はＡｕｔｏ ＭＡＣＳ ｓｙｓｔｅｍを用いて単離した。１ｘ１０５個のＢａｌｂ／ｃの樹状細胞を，１ｘ１０６個のＢ６マウス脾臓由来の，全脾臓細胞，ＣＤ４＋Ｔ細胞，ＣＤ８＋Ｔ細胞または対照としてＢａｌｂ／ｃ（同系）マウスの脾臓細胞とともに４日間培養し，培養上清中のＣＣＬ８を定量した。
【００３５】
図５に示されるように，Ｂａｌｂ／ｃ樹状細胞とＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞との混合培養において明らかなＣＣＬ８の発現が見られ，ＣＣＬ８の濃度はＢ６ ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞（同系）との混合培養の場合より有意に高かった（白色バー）。一方，混合培養開始時に抗マウスＭＨＣクラスＩＩ抗体を添加すると，ＣＣＬ８の発現レベルは顕著に低下し，この効果は，Ｂａｌｂ／ｃ樹状細胞およびＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞において有意であった（黒色バー）。このことから，ＣＣＬ８の誘導はＣＤ４＋Ｔ細胞によるクラスＩＩ認識を介していることがわかる。
【００３６】
さらに，上記と同じ系で，脾臓細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を変えて実験したところ，ＣＣＬ８の発現は用量応答性を示し，ＣＣＬ８の誘導が生物学的な反応であることが確認された（図６）。
【００３７】
ＩＦＮγの発現の分析
培養プレートでＢａｌｂ／ｃ由来樹状細胞（ＤＣ）とＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を混合培養し，継時的に培養上清のＩＦＮγ値を測定した。結果を図７に示す。ＩＦＮγのレベルは第２日より上昇したが，第５日には，同種抗原認識反応が続いているにも関わらず低下していた。このことは，ＩＦＮγの発現レベルは同種抗原認識の指標としては不適当であることを示す。
【００３８】
インビボ同種移植実験
４グレイの放射線を照射した拒絶モデルマウスの背部皮下に，同種脾臓由来Ｂ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植し，血中ＣＣＬ８濃度を測定した（図８）。白バーは０．１ｘ１０７個のＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したときの，黒バーは１．０ｘ１０７個を移植したときの，５日および７日後の平均ＣＣＬ８濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。＊および＊＊は，それぞれｐ値＜０．０５および＜０．０１を示す（ｎ＝４）。血漿ＣＣＬ８濃度は１．０ｘ１０７個の同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植した群において，０．１ｘ１０７個の群より有意に高かった。移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞の数とＣＣＬ８産生との間に明らかな用量依存性がみられた。一方，血漿ＣＣＬ８濃度は第５日に上昇したが，移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞数が拒絶反応によって減少する第７日までに急速に低下した。これらの結果は，血漿ＣＣＬ８濃度が同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を忠実に反映していることを示す。
【００３９】
ＴＣＲの関与の解析
ＣＤ４＋Ｔ細胞はＢ６マウスの脾臓から単離し，同種樹状細胞はＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離した。１ｘ１０６個のＢ６ ＣＤ４＋Ｔ細胞を，培養プレートで，バッファー（対照），抗ＣＤ３ε抗体および抗ＣＤ２８抗体，またはＢａｌｂ／ｃマウス樹状細胞の存在下で培養した。上清中のＣＣＬ８濃度を測定したところ，同種樹状細胞刺激についてのみＣＣＬ８の産生が認められた（図９Ａ）。これらの結果は，ＣＤ３εおよびＣＤ２８のＣＤ４＋Ｔ細胞へのクロスリンクがインビトロでＣＣＬ８の発現を誘導しなかったことを示す。また，抗ＣＤ３ε抗体および抗ＣＤ２８抗体または同種樹状細胞で刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞において細胞増殖とＩＦＮ−γの分泌が認められた（図９Ｂ）。白色バーはミトコンドリア活性を反映する色素を用いて測定した細胞増殖（グラフ左数値）を，灰色バーはＩＦＮ−γの分泌量を表す（グラフ右数値）。同種抗原提示でもＴＣＲのクロスリンクでも，いずれもＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化が生じていることがわかる。
【００４０】
以上の結果より，同種抗原認識の分子マーカーとしてのＣＣＬ８の発現機序は，
１． 抗原提示細胞によるＭＨＣクラスＩＩを介した，ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する抗原提示ないしは活性化刺激；および
２． 同種抗原認識後のＴ細胞活性化に伴うＩＬ−２，ＩＦＮ−γの発現；
の両方が関与していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は，宿主対移植片疾患の診断および経過のモニタリング，ならびに治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主対移植片疾患を検査するための方法であって，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
ＣＣＬ８蛋白質の量が抗ＣＣＬ８抗体を用いて測定される，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＣＬ８蛋白質の量が，質量分析計，高速液体クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動からなる群より選択される方法を用いて測定される，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬。
【請求項５】
宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質を選択する方法であって，
宿主対移植片疾患のモデル動物に試験物質を投与し，
前記モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合に，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法。
【請求項１】
宿主対移植片疾患を検査するための方法であって，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
ＣＣＬ８蛋白質の量が抗ＣＣＬ８抗体を用いて測定される，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＣＬ８蛋白質の量が，質量分析計，高速液体クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動からなる群より選択される方法を用いて測定される，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬。
【請求項５】
宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質を選択する方法であって，
宿主対移植片疾患のモデル動物に試験物質を投与し，
前記モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合に，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択する，
の各工程を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−２３３６９３（Ｐ２０１２−２３３６９３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９５９５１（Ｐ２００９−１９５９５１）
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度 文部科学省 科学技術試験研究委託事業「オール北海道先進医学・医療拠点形成」産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度 文部科学省 科学技術試験研究委託事業「オール北海道先進医学・医療拠点形成」産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０７０１４５５５）北海道公立大学法人 札幌医科大学 (31)
【Ｆターム（参考）】
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