宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くタンパク質および糖タンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を記載する。特に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ―マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１、３および４活性から選択される少なくとも１つの活性を示さない組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を使用して、組換えタンパク質および糖タンパク質を製造する製造方法を記載する。検出可能なα−マンノシダーゼ耐性β−マンノース残基を欠き、したがって、宿主細胞抗原に対する抗体に対する交差結合活性を欠くタンパク質および糖タンパク質を、これらの組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株は産生し得る。更に、宿主細胞抗原に対する抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く二シアル酸化ヒトエリスロポエチンの、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を記載する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法であって、
（ａ）Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される少なくとも１つの活性を示さず、該組換え糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えピチア・パストリス宿主細胞を提供し、
（ｂ）該組換え糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、
（ｃ）該組換え糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く該組換え糖タンパク質を得ることを含む、製造方法。
【請求項２】
宿主細胞が、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
宿主細胞が更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて測定される、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がウエスタンブロットにおいて測定される、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
該組換え糖タンパク質が治療用糖タンパク質である、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
該治療用糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
該宿主細胞が、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
該宿主細胞が、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２から選択されるＮ−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載の製造方法により得られる１以上の組換え糖タンパク質を含む組成物。
【請求項１１】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法であって、
（ａ）シアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された組換えピチア・パストリス宿主細胞であって、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される少なくとも１つの活性を示さず、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む、該組換えピチア・パストリス宿主細胞を提供し、
（ｂ）第１および第２融合タンパク質を発現させプロセシングするのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、
（ｃ）該成熟ヒトエリスロポエチンを該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む該成熟ヒトエリスロポエチンを得ることを含む、製造方法。
【請求項１２】
宿主細胞が、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
宿主細胞が更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
シグナルペプチドが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドまたはニワトリリゾチームシグナルペプチドである、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの核酸分子が、該エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしており、少なくとも１つの核酸分子が、該エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチド ニワトリリゾチームシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしている、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１６】
エリスロポエチンをコードする核酸分子の核酸配列のコドンがピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関して最適化されている、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１７】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて測定される、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１８】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がウエスタンブロットにおいて測定される、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１９】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収が、カチオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項１１記載の製造方法。
【請求項２０】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収が、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を含む、請求項１１記載の製造方法。
【請求項２１】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収が、アニオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項１１記載の製造方法。
【請求項２２】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む請求項１８記載の製造方法から得られる成熟ヒトエリスロポエチン、および医薬上許容される塩を含む組成物。
【請求項２３】
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンが、親水性ポリマーにコンジュゲート化されている、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
親水性ポリマーがポリエチレングリコールポリマーである、請求項２３記載の組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図１Ｇ】

【図１Ｈ】

【図１Ｉ】

【図１Ｊ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７Ａ】


【図２７Ｂ】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３３】

【図３４】

【図３５Ａ】

【図３５Ｂ】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９Ａ】

【図３９Ｂ】

【図４０Ａ】

【図４０Ｂ】

【公表番号】特表２０１３−５０７９２１（Ｐ２０１３−５０７９２１Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４２６２（Ｐ２０１２−５３４２６２）
【出願日】平成２２年１０月１１日（２０１０．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２１４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４６８５５
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】