対立遺伝子排除
本発明は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類におけるＶＨ重鎖のみ抗体の生成方法に関する。特に、本発明は、複数の異種ＶＨ重鎖遺伝子座を哺乳類において発現させる段階を含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類におけるＶＨ重鎖のみ抗体の産生方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における、抗原曝露に応答する親和性成熟した機能性重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの改良された製造方法およびその使用に関する。本発明はまた、複数の遺伝子座からのクラス特異的重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの製造に関する。
【０００２】
特に、本発明は、任意のクラスまたは複数のクラスの混合物のヒト抗原特異的な高親和性の重鎖のみ抗体の生成、ならびに十分に機能性のＶＨ抗原結合ドメインの単離および発現のための方法に関する。
【０００３】
本発明の方法を用いて生成された重鎖のみ抗体も記載される。
【０００４】
以下の説明において、全てのアミノ酸残基位置番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．により考案された番号付け方式に従って示される［１］。
【背景技術】
【０００５】
＜抗体＞
抗体の構造は当技術分野で周知である。大部分の天然抗体は四量体であり、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む。重鎖はそれぞれの重鎖に沿ってほぼ中間に位置するヒンジドメイン間のジスルフィド結合を介して相互に連結されている。軽鎖はそれぞれの重鎖とヒンジドメインのＮ末端側で会合している。それぞれの軽鎖は、通常、各重鎖とヒンジドメインに近いジスルフィド結合により結合している。
【０００６】
抗体分子が正常に折り畳まれると、それぞれの鎖は、より線状のポリペプチド配列により連結された多数の別個の球状のドメインに折り畳まれる。例えば、軽鎖は、可変（ＶＬ）および定常（ＣＬ）ドメインに折り畳まれる。重鎖は、単一の可変ドメインＶＨ、第１の定常ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジドメインおよび２または３個のさらなる定常ドメインを有する。重鎖定常ドメインおよびヒンジドメインは一体となって抗体重鎖の定常領域として一般に公知な構造を形成する。重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖可変ドメインの相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。重鎖および軽鎖の相互作用は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣκまたはＣλドメインにより促進される。一般に、ＶＨおよびＶＬの両方は抗原結合に必要とされるが、重鎖二量体およびアミノ末端断片は軽鎖の不在下で活性を保持することが示されている［２］。
【０００７】
重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖の両方の可変ドメインの中で、一部の短いポリペプチドセグメントは例外的な可変性を示す。これらのセグメントは超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。間にあるセグメントはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬドメインのそれぞれの中に、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）がある。
【０００８】
哺乳類において、５つのクラスの抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が存在し、ヒトには４つのＩｇＧサブタイプと２つのＩｇＡサブタイプが存在する。
【０００９】
【表１】
抗体クラスはその生理学的機能において異なる。例えば、ＩｇＧは、成熟した免疫応答において主要な役割を果たす。ＩｇＭは、補体結合および凝集に関与する。ＩｇＡは、分泌物（涙、唾液、初乳、粘液）中の抗体の主要なクラスであり、従って局所免疫に役割を果たす。天然抗体のエフェクター機能は、重鎖定常領域によってもたらされる。
【００１０】
ＩｇＡは、粘液を含有する部位（例えば、腸内、気道内または泌尿生殖器路内）に見出すことができ、病原体による粘膜部位のコロニー形成を防ぐ。ＩｇＤは主にＢ細胞上の抗原受容体として機能する。ＩｇＥはアレルゲンと結合して肥満細胞からのヒスタミン放出（アレルギーの基礎をなす機構）を誘発し、また、蠕虫（虫）に対する保護をもたらす。ＩｇＧは（その４つのアイソタイプにおいて）、侵入してくる病原体に対して抗体に基づく免疫性の大部分をもたらす。ＩｇＭは、Ｂ細胞の表面に発現され、Ｂ細胞の媒介する免疫性初期段階において（すなわち、病原体を排除するために十分なＩｇＧが存在する前に）病原体を排除するための非常に高い親和性を有する分泌型としても存在する。
【００１１】
正常なヒトＢ細胞は、単一の重鎖遺伝子座を１４番染色体上に含有し、その遺伝子座から重鎖をコードする遺伝子が再構成により形成される。マウスにおいて、重鎖遺伝子座は１２番染色体に位置する。正常な重鎖遺伝子座は、複数のＶ遺伝子セグメント、多数のＤ遺伝子セグメントおよび多数のＪ遺伝子セグメントを含む。ＶＨドメインの大部分はＶ遺伝子セグメントによってコードされるが、それぞれのＶＨドメインのＣ末端はＤ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントによってコードされる。Ｂ細胞におけるＶＤＪの再構成と、その後の親和性成熟は、それぞれのＶＨドメインにその抗原結合特異性をもたらす。正常なＨ２Ｌ２四量体の配列解析は、多様性が主にＶＤＪ再構成と体細胞超変異の組合せに起因することを実証する［３］。ヒトゲノムには５０個を超えるヒトＶ遺伝子セグメントが存在し、そのうちの３９個のみが機能性である。
【００１２】
完全なヒト抗体（Ｈ２Ｌ２）は、現在、トランスジェニックマウスから抗原曝露に応答して導くことができる。そのようなトランスジェニックマウスは単一のヒト重鎖遺伝子座および別個の軽鎖遺伝子座を含む。対応するマウス重鎖および軽鎖遺伝子座は、マウス抗体の不在下でヒト抗体のみが産生されるように欠失または抑制される（［４〜１０］）。
【００１３】
新しい分子生物学技法の出現で、重鎖のみ抗体（軽鎖を欠く）の存在が、人におけるＢ細胞増殖性障害において同定され（重鎖疾患）、さらにマウスモデル系においても同定された。分子レベルでの重鎖疾患の分析により、ゲノムレベルでの突然変異および欠失が重鎖ＣＨ１ドメインの不適切な発現をもたらし、軽鎖と結合する能力を欠く重鎖のみ抗体の発現を引き起こしたことが示された［１１、１２］。
【００１４】
ラクダ科動物が、遺伝子の自然突然変異の結果として、軽鎖との結合を媒介するＣＨ１ドメインが存在しないために軽鎖と結合することのできない機能性ＩｇＧ２およびＩｇＧ３重鎖のみ二量体を生成することが示された［１３］。ラクダ科動物重鎖のみ抗体の特性を特徴付けるのは、ヒトおよび正常なラクダ科動物ＶＨドメインに対して改良された溶解度をもたらすラクダ科動物ＶＨドメインの特定のサブセットである。この特定のサブセット中のラクダ科動物ＶＨドメインは通常ＶＨＨドメインと称される。
【００１５】
サメなどの種が、おそらく哺乳類Ｔ細胞受容体または抗体軽鎖に類縁であり、重鎖のみ様結合タンパク質ファミリーを生成することも示されている［１４］。
【００１６】
ラクダ科動物重鎖のみ抗体の産生のために、ラクダ科動物生殖細胞系列の重鎖遺伝子座は、可能性のある重鎖定常領域の一部または全部をコードする遺伝子セグメントを含む。成熟の間、再構成されたＶＨＨＤＪ結合ドメインは、ヒンジドメインをコードする遺伝子セグメントの５’末端上にスプライスされて、ＣＨ１ドメインを欠き、従って軽鎖と会合することのできない重鎖をコードする、再構成された遺伝子がもたらされる。
【００１７】
ラクダ科動物ＶＨＨドメインは、特徴的な多数のアミノ酸を３７、４４、４５および４７の位置に含有する［４９］。これらの保存されたアミノ酸は、重鎖のみ抗体に溶解性を付与するために重要であると考えられる。特定のラクダ科動物ＶＨドメインだけが、改良された溶解度特性を有するＶＨＨドメインである。それらはＶＨサブファミリーに限定され、そのため限定された範囲の抗原だけに増殖的に応答する。
【００１８】
重鎖のみモノクローナル抗体は、標準的なクローニング技術によりラクダ科動物脾臓のＢ細胞から、またはファージもしくはその他のディスプレイ技術によりＢ細胞ｍＲＮＡから回復することができる［１８］。ラクダ科動物に由来する重鎖のみ抗体は高親和性である。重鎖のみ抗体をコードするｍＲＮＡの配列解析は、正常な四量体抗体の産生においても観察されるように、多様性が主にＶＨＨＤＪ再構成と体細胞超変異の組合せに起因することを実証する［４９］。
【００１９】
天然のラクダ科動物およびヒトＶＨドメインの重要かつ共通する特徴は、それぞれのドメインが、最適な溶解度および結合親和性のためにＶＬドメインでの二量化に依存することなく、モノマーとして結合することである。
【００２０】
近年、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における重鎖のみ抗体の産生のための方法が開発された（ＷＯ０２／０８５９４５号およびＷＯ０２／０８５９４４号参照）。潜在的に任意のクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥ）の、任意の哺乳類に由来する機能性重鎖のみ抗体は、抗原曝露の結果としてヒトを除くトランスジェニック哺乳類（好ましくはマウス）から生成することができる。これらの初期研究は２つのラマＶ遺伝子セグメントの使用に頼り、抗体応答の限定されたレパートリーに悩まされた。
【００２１】
Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．［１５］は、トランスジェニックマウスにおける重鎖のみ抗体の誘導のための方法を開発した。Ｂ細胞での抗体成熟の結果として高い結合親和性を有するこれらの重鎖のみ抗体は、抗原曝露の結果として誘導され、確立されたハイブリドーマ技術を用いて選択され、軽鎖（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）の不在下で任意のクラスの抗体として、またはＶＨ結合ドメイン単独として生成され得る。これらの重鎖のみ抗体は、全てのヒトＤおよびＪ遺伝子セグメントと結合した２つのラマＶＨＨ（クラス３）遺伝子セグメントならびに全てのヒト定常領域をコードする遺伝子セグメントを含有する生殖細胞系列（すなわち非再構成）配置中の抗体重鎖遺伝子座から誘導された。それぞれの定常領域をコードする遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの欠失を有し、軽鎖の結合を妨げた。さらに、この遺伝子座は、３’末端に抗体ＬＣＲを含有し、Ｂ系列の細胞における高いレベルの発現を確保する。この遺伝子座を受精卵のマイクロインジェクションによりマウスに導入した。
＜抗体を原料とした産物の製造＞
抗体を原料とした産物の遺伝子工学による製造、特にヒトまたはヒト化抗体を原料とした産物の製造は、新規なクラスの医薬、診断法および試薬の生成をもたらすと同時に、新規な産業、雇用および富の創造の機会の創出をもたらした（ｗｗｗ．ｄｒｕｇｒｅｓｅａｒｃｈｅｒ．ｃｏｍ、ｗｗｗ．ｌｅａｄｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏ．ｕｋ参照）。抗体を原料とした産物は通常、天然の四量体抗体から導かれる。抗体を原料とした産物の製造に関する特許および特許出願は多くある。これらの特許および特許出願は、（例えばトランスジェニックマウスからの）誘導の経路、製造の経路および産物に特異的な物質の事柄に関する。そのような抗体を原料とした産物は、抗体断片を介して完全な四量体抗体から一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子までさまざまである。
【００２２】
抗体を原料とした産物は、２１世紀に着手される新規な医薬品の高い割合を占める。モノクローナル抗体療法は、関節リウマチおよびクローン病の治療のための好ましい経路として既に容認され、癌の治療において見事な進展がある。また、抗体を原料とした産物は、心血管疾患および感染症の治療のために開発中である。大部分の販売されている抗体を原料とした産物は、標的リガンド（例えばＴＮＦα）上の単一の明確なエピトープを認識し、結合する。
【００２３】
近年、高親和性ＶＨドメインは、ディスプレイライブラリー中の無作為化されたヒトＶＨドメインから選択されるか、またはラクダ科動物の抗原曝露によって自然に産生された重鎖のみ抗体から誘導されるか、またはラクダ科動物で作られたＶＨドメインライブラリーから誘導されている。これらの高親和性ＶＨドメインは抗体を原料とした産物に組み込まれている。これらのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインとも呼ばれ、多数の古典的なＶＨドメインとは違い、特に、軽鎖の不在下で重鎖の改良された溶解度および安定性を確保する多数の突然変異を提示する。これらの変化の中で最も顕著なものは、荷電アミノ酸が４５位に存在することである［１６］。
【００２４】
多数のグループが、天然の四量体抗体から誘導される重鎖のみ抗体の作製に取り組んできた。Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．は（同文中に２およびその他の参照文献が引用される）、親和性精製された、特性が十分明らかであるウサギ抗体の縮小された重鎖成分の分離、それに続いてその後の個々の重鎖の再生を記載している。再生された重鎖の免疫学的特性解析により、軽鎖を含まない重鎖ホモ二量体が、単独で、能力のある結合抗原であることが実証された。
【００２５】
その後、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．［１８］は、クローン化されたマウスＶＨ領域が、大腸菌発現系で可溶性タンパク質モノマーとして発現されると、高い親和性で抗原と結合する能力を保持することを明白に実証した。Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．［１８］は、ＶＨドメインの単離および特性解析を記載し、古典的なモノクローナル抗体産生（最後の段落参照）と比較した場合のこのアプローチの潜在的な商業上の利益を示した。彼らはまた、通常は軽鎖と会合する重鎖から単離されたＶＨドメインが天然の四量体抗体の溶解性に欠けていることを認めている。従って、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．［１８］は、これらの分子を表現するために「粘着性のある」という用語を用い、この「粘着性」は改良された溶解度特性を有するＶＨドメインの設計によって対処することができると提案した。
【００２６】
ＶＨ溶解度の改良は、その後、ファージディスプレイを用いる無作為化された部位特異的なアプローチの組合せを用いて対処されてきた。例えば、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ［１７］は（ＷＯ９２／０１０４７号参照）、溶解度を改良すると同時に結合特異性を維持するためにラクダ科動物重鎖のみ抗体のＶＨドメインの特徴の一部をファージディスプレイと組み合わせて組み込んだ。
【００２７】
ファージライブラリーに由来する単離されたヒトＶＨドメインに関する複数の独立した研究により、ＶＨドメインの抗原特異的な結合が実証されたが、これらのＶＨドメインは溶解度が低いことが分かった。さらに、ファージアレイに提示される特異的結合特性を有するヒトＶＨドメインの選択が操作された抗体のためのビルディングブロックを形成することが示唆された［１８］。
【００２８】
ヒトＶＨドメインは改良された溶解度特性のために操作されてよく［１９、２０］、または溶解度はインビボで自然選択により獲得されてもよい［２１］。しかし、ＶＨ結合ドメインがファージライブラリーから誘導されている場合、例えば親和性ホットスポットのランダム化を含む親和性改善策の適用にもかかわらず、抗原に対する固有の親和性は低マイクロモルから高ナノモルの範囲のままである［２２］。
【００２９】
ファージまたは代替ディスプレイ技術により生成されたヒトＶＨまたはラクダ科動物ＶＨドメインは、体細胞突然変異の結果としての改良された特性の利点および正常な抗体結合部位のＣＤＲ３領域におけるＤおよびＪ遺伝子セグメントの組換えにより提供されるさらなる多様性を欠く。一部のラクダ科動物ＶＨ（ＶＨＨ）ドメインは、ヒトＶＨに対して溶解度の点で利点を示すものの、ヒトにおいて抗原性であることが判明し、さらに、ラクダ科動物ＶＨがラクダ科動物の免疫化またはファージディスプレイ技術により生成されねばならないという不利点を被る可能性がある。
【００３０】
ファージ由来ヒトＶＨ領域は、高い親和性結合特性を達成するためにそれらが多くの回のパニングおよびその後の変異誘発を必要とするので、使用することが困難である。ラクダ科動物ＶＨＨドメインは、ファージもしくは類似のディスプレイライブラリーから単離された場合に同じ困難な手順を必要とするか、または、古典的なハイブリドーマ技術に従わない大型動物（同様に古典的な抗体を作成するラマまたはラクダ）の免疫化を必要とする。さらに、ラクダ科動物の結合ドメインは抗原性であることが分かり、ヒト化を必要とし得る。
【００３１】
抗原曝露の結果としてのヒトを除くトランスジェニック哺乳類における重鎖のみ抗体の産生（ＷＯ０２／０８５９４５号およびＷＯ０２／０８５９４４号参照）は、これらの多くの問題を克服する。
【００３２】
しかし、当技術分野において、重鎖のみ抗体の多様性およびインビボでＢ細胞の応答を最大化する、特に、クラス特異的ヒト重鎖のみ抗体の機能性レパートリーおよび多様な臨床、工業および研究用途で使用するための最大の抗原結合可能性を保持する機能性ＶＨ重鎖のみ結合ドメインを生成する必要性が残っている。
【発明の開示】
【００３３】
本発明者らは、驚くべきことに、先行技術の制限を克服し、クラス特異的な重鎖のみ抗体を生成するために用いられるヒトを除くトランスジェニック哺乳類に存在する重鎖のみの遺伝子座の数を増加させることにより、抗体応答のレパートリーを大いに増大させることができることを示した。
【００３４】
本発明は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類が複数の重鎖のみの遺伝子座を有する場合、それらの遺伝子座は対立遺伝子排除の対象となるという発見に依存する。その結果、ただ１つの遺伝子座が確率的に選択され、首尾よく組換えられ、結果として重鎖のみ抗体の産生がもたらされる。従って、複数のＶＨ重鎖遺伝子座を同じヒトを除くトランスジェニック哺乳類に用いて、哺乳類から入手可能な抗体レパートリーおよび多様性を最大化することができる。抗原に曝露された場合、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、残りの遺伝子座を除いて特異的抗原曝露に応答するために最も適しているＶ遺伝子セグメントを含む遺伝子座を「選択する」。
【００３５】
本発明の方法により生成され得る重鎖のみ抗体は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類が一連の遺伝子座から「選択する」ことが可能であることの結果として高い結合親和性を示し、それから一般に伸張されたＣＤＲ３ループの不在下でＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの再構成ならびに体細胞突然変異が起こり得る。本質的に正常なＢ細胞の成熟は、高いレベルの重鎖のみ抗体が（ＣＨ１ドメインが組換え遺伝子座に存在する全ての抗体クラスから排除されているという条件で）単離された血漿中に存在する状態で観察される。Ｂ細胞の成熟および構築された二量体（例えばＩｇＧ）または多量体（例えばＩｇＭ）の分泌は、軽鎖遺伝子の存在または発現に依存しない。
【００３６】
従って、本発明の第１の態様では、その哺乳類に複数の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を供与する段階を含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類におけるＶＨ重鎖のみ抗体の産生のための方法が提供され、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、１個以上のＶ遺伝子セグメント、１個以上のＤ遺伝子セグメント、１個以上のＪ遺伝子セグメント、および発現した場合、ＣＨ１ドメインを含まず、前記遺伝子座の少なくとも１つからＶＨ重鎖のみ抗体を発現する重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含む。
【００３７】
好ましくは、それぞれのＶＨ重鎖遺伝子座は、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０または６０個のＶ遺伝子セグメントを含み、それは任意の脊椎動物種に由来してもよい。
【００３８】
一実施形態では、各遺伝子座は、ただ１つのＶ遺伝子セグメントを含んでよい。本実施形態の一つの代替形態では、各Ｖ遺伝子セグメントは他の全てのＶ遺伝子セグメントとは異なっている。第２の代替形態では、各Ｖ遺伝子セグメントは、他の全てのＶ遺伝子セグメントと同一である。この第２の代替形態では、各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントは、他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００３９】
従って、非ヒト哺乳類は単一のＶＨ重鎖遺伝子座の複数のコピーを含有し得ることが想定される。これは、Ｂ細胞において生産的な再構成が起こり、従って有用な重鎖のみ抗体の産生を可能にする機会を最適化するという利点を有する。
【００４０】
非ヒト哺乳類が、多数の異なるＶＨ重鎖遺伝子座を含有するならば、これは、所望の特異性を有する重鎖のみ抗体を得る機会をさらに最適化する。
【００４１】
もう１つの実施形態では、それぞれの遺伝子座は複数のＶ遺伝子セグメントを含む。本実施形態では、任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントは、全て同じ種の生物に由来してよい、例えば、全てのＶ遺伝子セグメントがヒト起源であってよい。あるいは、任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントは異なる種の生物に由来してよい。例えば、一部のＶ遺伝子セグメントがヒトに由来し、他のものはラクダ科動物またはサメに由来してよい。
【００４２】
好ましくは、Ｖ遺伝子セグメントはヒト起源である。
【００４３】
用語「Ｖ遺伝子セグメント」は、ラクダ科動物およびヒトを含む脊椎動物に由来する任意の天然のＶ遺伝子セグメントを包含する。Ｖ遺伝子セグメントは、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、および重鎖定常（エフェクター）領域（ＣＨ１エキソン以外の数個のエキソンを含み得る）をコードする遺伝子セグメントと組み換えて、核酸が発現されるとＶＨ重鎖のみ抗体を生成できなければならない。
【００４４】
Ｖ遺伝子セグメントはまた、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、および重鎖定常領域（１個以上のエキソンを含むがＣＨ１エキソンは含まない）をコードする遺伝子セグメントと組み換えて、本明細書に定義される重鎖のみ抗体を生成できる相同体、誘導体またはタンパク質断片をコードする任意の遺伝子配列をその範囲内に含む。Ｖ遺伝子セグメントは、例えばＴ細胞受容体遺伝子座または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に由来してよい。
【００４５】
好ましくは、本発明の複数の重鎖遺伝子座は、複数の遺伝子座に分散された、改良された溶解度特性を有する３９個の機能性ヒトＶ遺伝子セグメントおよび操作された前記ヒトＶ遺伝子セグメントの変異体のうちの、任意の数または任意の組合せを含む。これらは、任意の数の遺伝子座、例えば８つのＶ遺伝子セグメントを含む４つの遺伝子座に加えて７つのＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；４つのＶ遺伝子セグメントを含む７つの遺伝子座に加えて３つのＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；またはそれぞれ１つのＶ遺伝子セグメントを含む３９の遺伝子座上であってよい。
【００４６】
ヒトＶ遺伝子は７つのファミリー、ＶＨ１〜ＶＨ７に分類され、各ファミリー内の個々の遺伝子に番号が付けられている。それぞれの遺伝子が使用される頻度は、特定の免疫応答の変動する要件に依存する。例えば、ファミリーＶＨ３の遺伝子は、細菌性抗原に応答する際にファミリーＶＨ５の遺伝子と比較して選択的に使用され得る。従って、本発明のさらに好ましい実施形態では、特定の抗原に対する抗体応答を生成するために有用であることが示されたＶ遺伝子セグメントのグループを別々のヒトを除くトランスジェニック哺乳類の系へ分類する。Ｖ遺伝子セグメントはファミリーに従って分類されるか、またはそれらは個々の機能に従って分類される。例えば、ファミリーＶＨ３のＶ遺伝子が細菌性抗原に対する抗体応答を生成するために有用であることが示されるならば、細菌性抗原に対する重鎖のみ抗体を生成するために特に有用であるヒトを除くトランスジェニック哺乳類を生成するためにファミリーＶＨ３のＶ遺伝子を用いることができる。あるいは、ファミリーＶＨ３およびＶＨ５の数個の個別の遺伝子が細菌性抗原に対する免疫応答を生成するために有用であることが示されるならば、それらは一緒に分類されて、細菌性抗原に対する重鎖のみ抗体を生成するために特に有用であるヒトを除くトランスジェニック哺乳類を生成するために用いることができる。
【００４７】
本発明の状況において、用語「異種の」とは、本明細書に記載される核酸配列または遺伝子座が、それが位置する哺乳類に対して内在性でないことを意味する。
【００４８】
「ＶＨ重鎖遺伝子座」は、本発明の状況において、重鎖エフェクター領域をコードする１つ以上の遺伝子セグメント（それぞれＣＨ１ドメインを欠く）と操作によって連結されている、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、および１つ以上のＪ遺伝子セグメントを含む、ＶＨドメインをコードする最小のマイクロ遺伝子座に関する。好ましくは、抗体レパートリーの可変性の主な原因は、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの選択により、さらにＶ−ＤおよびＤ−Ｊ接合により形成されるＣＤＲ３領域である。
【００４９】
本発明の利点は、再構成されたＶＨ遺伝子配列において得られた抗体レパートリーおよび多様性が、同じヒトを除くトランスジェニック哺乳類における複数のＶＨ重鎖遺伝子座の使用によって最大化することができることである。Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、２００６［１５］は、上に記載されるトランスジェニック遺伝子座が、再構成および対立遺伝子排除に関して正常な免疫グロブリン遺伝子座のような挙動をすることを示した。このことは、同じ動物において（異なる染色体上に）複数の遺伝子座を有して、対立遺伝子排除を利用することにより起こり得るＶＨ組換えの数を最大化する可能性を開いた。各トランスジェニック遺伝子座は、１から４０を超えるＶＨ領域を含有する。遺伝子座の１つを無作為に選択して組換えを開始し、最初の組換えが非生産的などであった場合に生産的な組換えが遺伝子座の１つから産出されるまで次の遺伝子座がその後に続く、対立遺伝子排除のプロセスは、組み合わせた遺伝子座中に存在する全てのＶＨ領域が実際に全体的な組換えプロセスの一部となることを確保するものである。
【００５０】
Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、［１５］はまた、驚くべきことに、同じヒトを除くトランスジェニック哺乳類において複数の重鎖遺伝子座が同じ染色体上で直列になっている場合、その結果、生産的な再構成および抗体の発現が複数の重鎖遺伝子座から起こり得ることを見出した。そのような場合、その後のハイブリドーマクローンはポリクローナルである。当業者であれば、これが抗体の多様性を増加させるためのもう一つの機構であることを理解する。
【００５１】
従って、本発明の別の態様では、本明細書に記載されるように、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類において少なくとも２つ以上のＶＨ重鎖遺伝子座が同じ染色体上で直列になって存在し、その結果、生産的な再構成および抗体の発現が２つ以上の遺伝子座から同時に起こり得る方法が提供される。
【００５２】
好ましくは、多数の重鎖遺伝子座は最初に別々にヒトを除くトランスジェニック哺乳類に導入され、単一の重鎖遺伝子座を有するヒトを除くトランスジェニック哺乳類を作り出す。次に、ＶＨ領域の数を最大化するためにこれらの動物を交配させて複数の重鎖遺伝子座を有する後代を生成し、最大の多様性をもたらす。遺伝子座はまた、新しい１ラウンドの遺伝子組換えによって加えてもよい。新しい遺伝子座は、既に１以上の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を含むヒトを除く哺乳類由来の卵に注入される。異種のＶＨ重鎖遺伝子座の安定な融合により、利用可能なＶＨ領域の増加および、従って多様性がもたらされる。異種のＶＨ重鎖遺伝子座を、さらなる異種のＶＨ重鎖遺伝子座とともに含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類に由来するＥＳ細胞の安定なトランスフェクションは、ＥＳ細胞技術を胚融合および胚盤胞注入による遺伝子組換えに使用することのできるヒトを除く哺乳類（例えばマウス）において多様性を増加させる代替経路を提供する。
【００５３】
好ましくは、それぞれの異なる重鎖遺伝子座は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類のゲノム中に単一コピーとして存在する。
【００５４】
さらに、複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを使用することにより、得られる抗体レパートリーおよび多様性のさらなる増加がもたらされる。その後の体細胞突然変異は、ＶＬおよびＬｃ（軽鎖）抗体遺伝子座の必要なく最小の遺伝子座（マイクロ遺伝子座）を使用しながら達成される。
【００５５】
本発明の状況において、用語「Ｄ遺伝子セグメント」および「Ｊ遺伝子セグメント」には、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの天然の配列が含まれる。好ましくは、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントと同じ脊椎動物に由来する。例えば、Ｖ遺伝子セグメントがヒトに由来する場合、必要に応じて可溶化されたまたは操作されたＤおよびＪ遺伝子セグメントも、ヒトに由来することが好ましい。あるいは、Ｖ遺伝子セグメントは、例えばラクダ科動物に由来し、ＤおよびＪ遺伝子セグメントはヒトに由来してもよく、逆も同様である。
【００５６】
Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントという用語はまた、得られるセグメントが本明細書に記載される重鎖抗体遺伝子座の残りの成分と組み換えられて本明細書に記載の重鎖のみ抗体を生成することができる限り、誘導体、相同体およびその断片をその範囲内に含む。ＤおよびＪ遺伝子セグメントは天然の供給源から誘導されてもよいし、それらは当業者が熟知ある、本明細書に記載される方法を用いて合成されてもよい。Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは組換えが可能であり、好ましくは、体細胞突然変異を受ける。
【００５７】
ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、単一の脊椎動物種に由来することが好ましい。これはいずれの脊椎動物種であってもよいが、好ましくはヒトである。
【００５８】
好ましくは、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、１〜４０（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０または４０）以上のＤ遺伝子セグメントを含む。Ｄ遺伝子セグメントはいずれの脊椎動物種に由来してもよいが、最も好ましくは、Ｄ遺伝子セグメントはヒトＤ遺伝子セグメント（通常２５個の機能性Ｄ遺伝子セグメント）である。
【００５９】
好ましくは、それぞれのＶＨ重鎖遺伝子座は、１〜２０（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０）以上のＪ遺伝子セグメントを含む。Ｊ遺伝子セグメントはいずれの脊椎動物種に由来してもよいが、最も好ましくは、Ｊ遺伝子セグメントはヒトＪ遺伝子セグメント（通常６つのＪ遺伝子セグメント）である。
【００６０】
各ＶＨ重鎖遺伝子座は、同一のＤおよびＪ遺伝子セグメントを含有してよい。あるいは、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの異なる組合せを含有してよい。例えば、各ＶＨ重鎖遺伝子座がただ１つのＶ遺伝子セグメントを含有し、このセグメントが各遺伝子座において同一である場合、生産的な再構成を得るための機会をさらに最適化するために、各遺伝子座においてＤおよびＪ遺伝子セグメントの異なる組合せを使用することが有利である。しかし、各ＶＨ重鎖遺伝子座が１つ以上の異なるＶ遺伝子セグメントを含有する場合、各遺伝子座においてＤおよびＪ遺伝子セグメントの同一の組合せを使用することが有利であろう。
【００６１】
好ましくは、ＶＨ重鎖遺伝子座は、１以上のＶ遺伝子セグメント、２５の機能性ヒトＤ遺伝子セグメントおよび６つのヒトＪ遺伝子セグメントを含む。
【００６２】
重鎖定常領域をコードする各遺伝子セグメントは、重鎖定常領域遺伝子セグメントがＣＨ１ドメインを発現しないという条件で、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、ＣεまたはＣα１−２クラスの１個以上の重鎖定常領域エキソンを含み得る。重鎖定常領域遺伝子セグメントは、好ましいクラスまたは必要な抗体クラスの混合物に応じて選択される。場合により、異種重鎖遺伝子座はＣμおよびＣδを欠損している。
【００６３】
従って、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、インビボでエフェクター機能をもたらす少なくとも１つの重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含んでよく（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはそのアイソタイプ）、各定常領域はＣＨ１ドメインを含まない。各遺伝子座は、１つの特定の定常領域をコードする遺伝子セグメントをただ１つ含有してよい。これは、エフェクター機能が必要とされる場合に有利である。あるいは、各遺伝子座は、それぞれが異なる定常領域をコードする１個よりも多くの遺伝子セグメントを含んでよい。これは、様々なクラスの重鎖のみ抗体が産生されることを可能とするような、特定のエフェクター機能についての要件がない場合に有利である。
【００６４】
各遺伝子座は同じ定常領域コード遺伝子セグメントを含有してもよく、または各遺伝子座は異なる定常領域コード遺伝子セグメントまたはその異なる組合せを有してもよい。
【００６５】
操作上、重鎖定常領域は、Ｂ細胞においてＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントと組換え可能な天然のまたは操作された遺伝子セグメントによってコードされる。
【００６６】
各重鎖のみ抗体において、定常領域は、重鎖のみ抗体の生成が起こり得るように、ＣＨ１ドメインを含まずに発現される。ＣＨ１エキソンは、上記のＶＨ重鎖のみ抗体の定常領域が機能性ＣＨ１ドメインを含有しないように除去され得る。
【００６７】
多価の結合複合体を操作する際にクラス特異的な重鎖定常領域を含むことにより、インビボでエフェクター機能の治療上の利益が必要される機能性に応じてもたらされる。個々のエフェクター領域を操作することも、機能性の付加または欠失をもたらし得る［２３］。従って、ＩｇＡ定常領域の機能性を含むことにより、病原体に対して改良された粘膜機能をもたらされるが［２４］、一方で、ＩｇＧ１定常領域の機能性が存在することにより、インビボで強化された血清安定性がもたらされる。重鎖ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインが存在することにより、自然抗体に見られるような安定的な二量体形成の基盤がもたらされ、翻訳後グリコシル化の認識部位がもたらされる。ＣＨ２およびＣＨ３の存在はまた、二重特異性および多価の複合体を試薬および診断薬として用いる際に、二次抗体の認識も可能にする。
【００６８】
例えば、ＩｇＭ抗体は、マクロファージの活性化および補体経路の活性化に重要な役割を果たすことが公知である。その結合部位が近接していることに起因して、ＩｇＭは、ウイルスを含む病原体に高い親和力を有する。しかし、ＩｇＭは、迅速なイムノアッセイ技法での使用が困難であることも公知であり、その一方でＩｇＧ抗体はこれらの技法で容易に使用することができる。用途に応じて、好ましい抗体クラス、すなわちＩｇＧまたはＩｇＭを選択することが有用である。
【００６９】
ＣＨ１を欠く異種の重鎖Ｃγ遺伝子座の全部または一部の発現は、異種のＩｇＧ遺伝子座に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプに応じて、場合により一部または全てのＩｇＧアイソタイプを生成する。あるいは、重鎖はＣε遺伝子を含んでよい。得られるＩｇＥ分子も治療に使用してよい。
【００７０】
あるいは、選択された抗体の混合物を得ることもできる。例えば、ＩｇＡおよびＩｇＭは、重鎖定常領域がＣαおよびＣμ遺伝子を含む場合に得ることができる。
【００７１】
好ましくは、重鎖定常領域は、特に重鎖のみ抗体がヒトにおける治療用途に使用される場合に、ヒト起源である。重鎖のみ抗体が獣医学目的に使用される場合は、重鎖定常領域は、獣医学治療が行われる標的生物、脊椎動物または哺乳類に由来することが好ましい。
【００７２】
発現した場合、各重鎖定常領域はＣＨ１ドメインを欠く。好ましくは、ＣＨ１エキソンが欠失している。場合により、ＣμおよびＣδ定常領域は変異しているか、欠失しているか、または置換されていてよい。例えば、機能性ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭの存在は、Ｂ細胞の成熟を阻害し、その結果として同じ遺伝子座の中で重鎖のみのＩｇＧ（ＣＨ１を欠く）の生産的発現を制限する。
【００７３】
本明細書に定義される「重鎖定常領域エキソン」（「ＣＨエキソン」）には、天然の脊椎動物の配列が含まれるが、特に哺乳類のＣＨエキソンである。これはクラス特異的な方法で変動する。例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡは天然にＣＨ４ドメインを欠く。用語「ＣＨエキソン」は、ＣＨエキソンが、それが重鎖定常領域の成分である場合に、本明細書に定義される機能性重鎖のみ抗体を形成することができる限り、その範囲内に誘導体、相同体およびその断片も含む。
【００７４】
ＣＨ４またはその他の機能性ドメインは、存在する場合、細胞内分泌プロセス、Ｂ細胞の成熟または得られる抗体の結合活性を阻害しないならば、任意選択的に導入遺伝子内で操作されるかまたは除去されてよい。
【００７５】
細胞表面の集合を妨げる分泌機構とその結果起こるＢ細胞成熟に操作が影響を及ぼさないならば、重鎖エフェクター分子は操作されて、機能性ドメイン、例えばカルボキシ末端ＣＨ４ドメインが取り除かれてよい。例えばグリコシル化を改良するかまたは機能を付加するために、さらなる特徴を遺伝子座に組み換えてもよい。
【００７６】
従って、異種の重鎖遺伝子座は、基本的に正常にＢ細胞成熟した状態で、必要とされる抗体クラスに応じて、重鎖のみ抗体の好ましいクラスまたは混合物を生成するように設計される。ラクダ科動物Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントおよびラクダ科動物エフェクター領域を利用すると、ラクダ科動物抗体に特有の特長、例えば伸張したＣＤＲ３ループなどを有するラクダ科動物抗体が産生される。ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを使用すると、伸張したＣＤＲ３ループを欠くヒト重鎖のみ抗体が産生される。
【００７７】
本発明の状況において「ＶＨドメイン」は、上記に定義されるように、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントと組み換えられる場合、Ｖ遺伝子セグメントの発現産物を指す。好ましくは、ＶＨドメインは、ＶＤＪ組換えおよび体細胞突然変異の結果として抗原と結合する改良された能力を有する。ラクダ科動物種に特有の伸張したＣＤＲ３ループの存在または不在に対する依存性はない。ＶＨドメインはモノマーとして抗原と結合することが可能である。可溶性重鎖のみ抗体複合体の一部として発現された場合に、ＶＬドメインとの組換えの可能性は、ＣＨ１エキソンの除去により排除されている（［２５］参照）。
【００７８】
ＶＨドメインは、単独で、多様なタンパク質ドメインと遺伝子操作されて、例えば毒素、酵素および造影剤を含む、標的とされる治療および診断目的のための融合タンパク質を生成することもできる。
【００７９】
ＶＨドメインコード配列は、天然の供給源から誘導されてもよいし、それらは当業者の熟知の方法を用いて合成されてもよい。
【００８０】
ＶＨドメインの性質は、必要とされる特徴を有する配列をコードするＶ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントを選択するかまたは操作することにより変更または改良することができる。上記に示されるように、３９個の機能性ヒトＶＨ領域の一部は重鎖のみ抗体の産生に適していない可能性がある。様々な抗体特性を改良しようと試みて多数の研究が先行技術において行われた［２６，２９］。特定のＶＨ領域特性に関して、Ｄｏｌｋ ｅｔ ａｌ．［３０］は、ファージディスプレイ技術を用いて、フケ予防シャンプーに伴う厳しい条件下において改良された安定性を示す、重鎖のみ抗体を生成した。
【００８１】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、好ましくは、げっ歯類、例えば、ウサギ、モルモット、ラットまたはマウスである。マウスが特に好ましい。代わりとなる哺乳類、例えばヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌまたはその他の動物を用いてもよい。好ましくは、哺乳類はマウスである。
【００８２】
好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、確立された卵母細胞注射技術のみを用いて作製される。確立されていれば、ＥＳ細胞技術またはクローニングを用いてもよい。
【００８３】
有利には、哺乳類に内在する抗体の重鎖遺伝子座および場合により軽鎖遺伝子座は、重鎖のみ抗体が本発明の方法に従って発現される場合に、削除されるか抑制される（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）。
【００８４】
抗体の供給源とは異なる起源の脊椎動物の種への抗体の投与は、しばしば投与された抗体に対する免疫応答の発現をもたらすので、本発明の上記の態様に記載される重鎖のみ抗体を生成する方法は、ヒトの治療用途のための抗体の生成において特に有用であり得る。本発明に従って生成される抗体は、それらが実質的に単一または既知のクラスの抗体であり、好ましくは、ヒト起源であるという点で、先行技術のそれに優る利点を有する。抗体は、インビボでのＶＤＪ組換えと親和性成熟の組合せにより高親和性である。
【００８５】
従って、本発明のさらなる態様は、上記により定義された複数の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を含むヒトを除くトランスジェニック哺乳類を提供する。好ましくは、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む抗体を産生する能力が低下するように遺伝子操作されてよい。
【００８６】
抗体産生細胞は、本明細書に定義されるヒトを除くトランスジェニック哺乳類から誘導され、例えば、本明細書に定義される重鎖のみ抗体の産生のためのハイブリドーマの調製に使用されてよい。それに加えて、またあるいは、核酸配列をこれらのヒトを除くトランスジェニック哺乳類から単離し、当業者の熟知な組換えＤＮＡ技法を用いてＶＨドメイン重鎖のみ抗体またはその二重特異性／二機能性複合体を生成するために用いてよい。
【００８７】
あるいは、またはそれに加えて、抗原特異的な重鎖のみ抗体は、本明細書に定義されるヒトを除くトランスジェニック哺乳類の免疫化によって生成されてよい。
【００８８】
従って、本発明はまた、上に定義されるヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫することによる、重鎖のみ抗体の産生のための方法を提供する。抗体およびその断片は、当業者に公知の確立された方法を用いて単離され、特性決定され、製造されてよい。これらの抗体は、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２９２号に記載される方法に特に役立つ。
【００８９】
本発明を、これから一例として、以下の図を参照する以下の詳細な説明において説明する。
〔実施例〕
【００９０】
実施例１−重鎖のみ抗体遺伝子座はマウスにおいて完全に機能性であり、対立遺伝子排除に対して感受性である。
【００９１】
上記に考察されるように、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．［１５］は、トランスジェニックマウスにおける重鎖のみ抗体の誘導のための方法を開発した。本方法および本明細書に記載される実験のさらなる詳細に関して、当業者は、参照により本明細書に組み込まれるＪａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．［１５］を参照されたい。１
＜方法＞
・構築物
ゲノムコスミドライブラリーを、標準法を用いてラマ（Ｌａｍａ Ｇｌａｍａ）の末梢血細胞から作成した。２つの異なる生殖細胞系列ＶＨＨを、それらの配列、停止コドンを含まないオープンリーディングフレームおよびルフランの番号付け［３２］に従う４２、５０および５２位の親水性のアミノ酸コドンの存在、ならびに４９位に親水性のアミノ酸を含むものと含まないものに基づいて選択した。一方はＩＧＨＶ１Ｓ１（受託番号ＡＦ３０５９４４）と同一であり、もう一方はＩＧＨＶ１Ｓ３（受託番号ＡＦ３０５９４６）と９４％の同一性を有する。２つのクローン（ヒト重鎖ＤおよびＪ領域、ＣμおよびＣδを含有するクローン１０６５Ｎ８ならびにＣγ３遺伝子を含有するクローン１１１５ Ｎ１５）をヒトゲノムＰａｃライブラリーＲＰＣＩ−１１（ＢＡＣＰＡＣ Ｒｅｃｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＳＡ）から選択した。異なるヒトゲノムライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＢａｃクローン１１７７１をＣγ２遺伝子およびＩｇ重鎖ＬＣＲの供給源として用いた［３３］。標準技法を用いて、Ｃγ３およびＣγ２遺伝子を別々にｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。単一の点突然変異（Ｇ〜Ａ）［３４］またはＣＨ１エキソンの完全な欠失を相同組換えにより達成した［３５］。同様にｆｒｔおよびｌｏｘＰ部位をＣμスイッチ領域の前に導入し、２番目のｌｏｘＰ部位をＣγ２スイッチ領域の前に設置し、ＭＧＳまたはＭＧΔを得た。
【００９２】
ＧＳまたはＧΔ構築物を得るために、ＭＧＳまたはＭＧΔベクター（図１）、２つのラマＶＨＨ遺伝子、その後にヒトＤおよびＪ重鎖領域、Ｃμ、Ｃδならびに修飾されたヒトＣγ２およびＣγ３遺伝子および３’ＬＣＲを含有し、１６個の２９４Ｃｒｅ大腸菌株４４に形質転換し、ｃｒｅに媒介される組換えによってＧＳまたはＧΔ遺伝子座を得た（図１）。相同組換えによるＣμＣＨ１領域の欠失によりＭＧΔからＭΔＧΔを得た。
・トランスジェニックマウスの生成、育種および遺伝子型同定
２２０ＫｂのＭＧＳまたはＭＧΔまたはＭΔＧΔ断片、１５０ＫｂのＧＳまたはＧΔ断片（図１）をベクター配列から精製し、受精したＦＶＢ Ｘ Ｂ１６／μＭＴ−／−卵の前核に２ｎｇ／μｌの濃度で注入した。５’および３’末端プローブを用いる尾由来ＤＮＡのサザンブロット分析により、トランスジェニック遺伝子座を、完全性およびコピーの数についてチェックした。トランスジェニックμＭＴ＋／−樹立系統をμＭＴ−／−バックグラウンドの系統として育種した。以下のプライマー：Ａｓｐ５ＩｇＭｆｗ：５’−ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＣＴＣ−３’（配列番号１）と、ＨＬＬ−ＭＤには、Ａｓｐ３’ＩｇＧ２ｒｖ：５’−ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２）の組合せ、または、ＭＧＳには、Ａｓｐ３’ＩｇＭｒｖ：５’−ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣ−３’（配列番号３）の組合せ、およびμＭＴ遺伝子型には、ＭＩＧＭＥＭＢＩＮＴＲＯＮ１：ｆｗ：５’−ＣＣＡＧＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＣＧＣＴＡＡＧＡＴＴＣ−３’（配列番号４）とＭＩＧＭＥＭＢＥＸＯＮ１ｒｖ：５’−ＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号５）の組合せを用いるＰＣＲ（９４℃にて４５秒間の変性、６０℃にて３０秒間のアニーリングおよび７２℃にて１分４０秒間の伸張で３０サイクル）により遺伝子型同定を行った。
・ＲＴ−ＰＣＲ
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ＲＮＡ単離系統（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。以下のプライマー：ＬＶＨＨｆｗ：５’−ＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号６）と、ＨＩＮＧＥＩｇＧ２ｒｖ：５’ＣＡＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣ−３’（配列番号７）またはｈＩｇＭＣＨ２ｒｖ：ＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣ−３’（配列番号８）の組み合わせを用いてＰＣＲを行った。増幅は、９４℃にて３０秒間の変性、６０℃にて３０秒間のアニーリングおよび７２℃にて１分間の伸張で３０サイクル間であった。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、Ｔ７またはＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
・フローサイトメトリー分析：
単細胞懸濁液を、既に記載したようにＰＢＳ中のリンパ器官から調製した４５。約１×１０６個の細胞を、９６ウェルプレート中のＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中の抗体を用いて４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡで２回洗浄した。それぞれのサンプルについて、ＦＡＣＳｃａｎアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて３×１０４イベントが記録された。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔバージョン１．０コンピュータソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで四色分析を行った。使用した大部分の抗体は記載されている［３６］；ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧおよび抗ヒトＩｇＭはＳｉｇｍａ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ）より購入した。
・Ｉｇ遺伝子再構成分析
ｗｔマウスＭΔＧΔおよびＧΔトランスジェニックマウスの脾臓および肝臓から単細胞懸濁液を作成した。ＭＡＣＳ ＣＤ４５（Ｂ２２０）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＡｕｔｏｍａｃｓセパレーターで製造業者の説明書に従って用いて 約９０％の純度までＢ細胞を確実に選択した［３７］。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩ消化させ、Ｈｙｂｏｎｄナイロンフィルター上でブロットした。３２Ｐ放射標識されたＪκプローブ（Ｊκ１およびＪκ５領域のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅より入手）および３２Ｐ放射標識された炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）プローブを用いてフィルターをハイブリダイズした。肝臓ＤＮＡを流してκ生殖細胞系列の構成シグナルを示した（２．８Ｋｂバンド）。４ｋｂバンドとハイブリダイズするＣＡＩＩプローブを負荷対照として用いた。Ｔｙｆｏｏｎ９２００（Ａｍｅｒｓｃｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフィルターを走査した。生殖細胞系Ｊκバンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ５．２ソフトウェアを用いて定量し、負荷対照のそれに正規化し、対照肝臓ＤＮＡ（１００％とする）の割合で表した。異なる再構成イベントの増幅のためのハイブリドーマ由来のゲノムＤＮＡで使用されるＰＣＲプライマーは次の通りであった、
ＩＧＨＪｌＲ：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号９）、
ＩＧＨＪ２Ｒ：５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１０）、
ＩＧＨＪ３Ｒ：５’−ＧＧＣＣＣＣＡＧＡＹＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＴ−３’（配列番号１１）、
ＩＧＨＪ４Ｒ：５’−ＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴ−３’（配列番号１２）、
ＩＧＨＪ５Ｒ：５’−ＣＣＣＡＧＧＲＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１３）、
ＩＧＨＪ６Ｒ：５’−ＣＣＡＧＡＡＣＧＴＣＣＡＴＲＹＭＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号１４）。
・ＤＮＡ ＦＩＳＨ分析
標的ＤＮＡの調製：モノクローナルハイブリドーマ細胞をＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中で培養し、Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ［３８］に記載されるようにアガロースに包埋した。ＧΔトランスジェニック系統１のマウス由来の肺を収集し、単細胞懸濁液を作った。包埋した細胞をプロテイナーゼＫおよびリボヌクレアーゼＨで処理した。機械的に伸張されたＤＮＡを、ポリ−Ｌ−リシンスライド（Ｓｉｇｍａ）上で電子レンジと別のスライドの端を用いて調製した。
【００９３】
プローブ：ＧΔ導入遺伝子の再構成されたコピーおよび再構成されなかったコピーを検出するため、ＤＮＡ断片を精製した。ＶＨＨとＤの間の領域のハイブリダイズ用に２．３ｋＢ ＳｐｅＩおよび３．６ｋＢ ＳｐｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片、およびＬＣＲ検出用に５．９ｋＢ ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片またはＩｇＨ３’ＬＣＲ（１６ｋＢ）を含有する低コピー数のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド。ニックトランスレーションによりビオチン−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）またはジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）でプローブを標識した。プローブをピペットでスライドの上に移す前に、９０℃にて５分間、氷上で５分間、および３７℃にて４５分間でそれらを変性させた。インサイチューハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーション混合物は５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、サケ精子ＤＮＡ（２００ｎｇ／μｌ）、５×デンハート液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有した。プローブのハイブリダイゼーションは、ピペットで２５μｌの混合物をスライド上に移し、２４×３２ｍｍのカバーガラスで覆うことにより行われる。プローブおよび標的配列を変性させるため、スライドを８０℃の加温板の上に２分間置いた。プローブは加湿チャンバー（加湿剤は５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣである）中で３７℃にて一晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、記載される通り行った［３９］。
【００９４】
ハプテン標識されたプローブの免疫学的検出：ジゴキシゲニンプローブを、ヒツジ抗ジゴキシゲニン（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、フルオレセイン結合ウサギ抗ヒツジ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、およびフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。ビオチンプローブは、テキサスレッド結合アビジン（１：５００、Ｓｉｇｍａ）およびビオチン結合ヤギ抗アビジン（１：５００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて検出した。この段階を２回繰り返した。全てのインキュベーションおよび洗浄は記載される通り行った４８。染色の後、スライドを段階的な一連のエタノール（７０、９０、および１００％）中で段階ごとに５分間室温にて脱水した。細胞またはＤＮＡを２５μｌの抗退色性包埋剤Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に包埋した。１００倍対物レンズを用いるＬｅｉｃａ ＤＭＲＢＥ 蛍光顕微鏡で視覚化を行った。
・免疫化およびハイブリドーマ作成
８週齢のマウスを、Ｓｐｅｃｏｌアジュバント（ＩＤＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄｔ，ＮＬ）または事前処方ＤＫＴＰワクチンを含む５〜２０μｇの抗原で０、１４、２８、４２日に皮下注射し、５０日に腹腔内注射して免疫した。０、１４および４５日に採血した。５６日にＣｌｏｎａｌＣｅｌｌＴＭＨＹキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｎａｄａ）を製造業者の説明書に従って用いて、脾臓細胞をＳｐ２−Ｏ−Ａｇｌ４骨髄腫細胞株（Ｒ．Ｈａｐｅｒｅｎより寄贈）と融合させた。ＤＫＴＰワクチンはＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，ＮＬ）より得られた。
・ｓｄＡＢライブラリーの構築およびスクリーニング
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ＲＮＡ単離系統（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＫＴＰ免疫単一コピーＧΔおよびＴＮＦα免疫ＭΔＧΔマウスの脾臓から全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて作成した。ＶＨＨＤＪ断片をコードするＤＮＡ断片を、特異的プライマー：ｖｈ１ ｂａｃｋ Ｓｆｉ Ｉプライマー［４０〜４２］を、ｈＩｇＧ２ｈｉｎｇｒｅｖプライマー（５’−ＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣ−３’（配列番号１５））またはＣＨ２ｈｕＩｇＭｒｅｖプライマー（５’−ＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡＡＴ−３’（配列番号１６））と組み合せたものを用いてＰＣＲにより増幅させた。増幅したＶＨＨＤＪ（約４００ｂｐ）をＳｆｉ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化させ、ゲル精製し、Ｓｆｉ Ｉ／ＮｏｔＩ消化ファージミドｐＨＥＮ由来ベクターにクローニングした。ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）への形質転換により、ヒト単一のドメイン抗体ライブラリーが得られた。プラスチック（希釈されていないワクチンをコートしたイムノチューブ）に吸着させたＤＫＴＰワクチン抗原または精製されたヒトＴＮＦα（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＳＡ）へのパニングを用いて、２ラウンドの選択を行った。
・免疫細胞化学およびウエスタンブロット
ｒｔＴＡの存在に応答するマーカープラスミドでトランスフェクトされたｔｅｔ−ｏｎ細胞系統の細胞をスライド上で増殖させた。ドキシサイクリン誘導の２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳに固定し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００／ＰＢＳで透過処理した。ｒｔＴＡに対するＨＣＡｂを１：５０希釈して使用し、その後ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＩＴＣ染色（Ｓｉｇｍａ，１：５００希釈）に使用した。マーカータンパク質を前記に記載したように検出した５１。ウエスタンブロットは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ，１／２５００希釈）、ヒトＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ，１／２５００希釈）を用いる標準法であった。
・Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲル濾過
２００ｍＭ ＫＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．９／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／０．５ｍＭ ＥＧＴＡ／２０％グリセロールで平衡したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／３０カラムを備えるＡＫＴＡ ＦＰＬＣ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いて、ＭΔＧΔマウス血清およびヒト対照血清のサイズ分画を行った。１００μｌ／分の流量を用いて、５００μｌの画分を回収し、１００％トリクロロ酢酸でで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）に続いてウエスタンブロット免疫ブロット法により解析した。
・ＢＩＡｃｏｒｅ測定
実験は、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にて行った。製造業者の提供する標準的なＮＨＳ−ＥＤＣキットを用いて３０００共鳴単位（ＲＵ、任意の結合応答単位）のレベルまでＣＭ５センサーチップ上に精製タンパク質を固定化した。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０中、４０マイクログラム／ｍｌの一定の流速で抗体を固定化抗原に通過させた。製造業者のＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて平衡時の応答を記録し、カーブフィッティングを使用して平衡解離定数を得た。
＜結果＞
・ラクダ科動物様ＣＨ１スプライス変異は、ヒト重鎖遺伝子座におけるエキソンスキッピングには不十分である。
【００９５】
ラクダ科動物におけるＨＣＡｂ（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３）の生成にＩｇＭ＋中間段階が必要かどうかは不明である。そのため、本発明者らは、まず、μＭＴバックグラウンドにおいて２つのハイブリッドヒト遺伝子座、１つはヒトＣμ、Ｃδ、Ｃγ２およびＣγ３定常領域を有する遺伝子座（ＭＧＳ）、およびもう１つはヒトＣγ２およびＣγ３しか有さない１つの遺伝子座（図１）を生成した［４３］。そのＣγ領域に、まず、ラクダ科動物ＣＨ１スプライス変異を含有するように突然変異を起こさせた。μ鎖遺伝子の膜貫通ドメイン欠失によりＢ細胞がほぼ完全に欠けているμＭＴ動物［４３］がやはりＢ細胞小集団を有し、膜ＩｇＭの不在下で機能性ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを産生することが証明され［４４〜４６］、（一部の）Ｂ細胞はＩｇＭの表面発現なしに成長することが示唆されていることから、ＭＧＳを作製した。ＶＨ溶解度を向上させるためにヒトＶＨドメインを突然変異させる［４７、４８］代わりに、ラマ起源の２つのＶＨＨを導入した。ラクダ科動物ＶＨＨ領域は、４２位、４９位、５０位および５２位に特徴的なアミノ酸を含有する［４９］。第１の、ＶＨＨ１は、これらのＶＨＨに特徴的なアミノ酸の全てを含有したが、基礎実験のこの証明における溶解度の重要性を検証するために、もう１つの、ＶＨＨ２では、４９位のＧｌｕ（Ｅ）の代わりに、これらの重大な「溶解」アミノ酸の１つであるＧｌｎ（Ｑ）を欠失させた。本発明者らは、さらに軽鎖可変部（ＶＬ）対合２１に重要であると考えられることから、５０位（Ａｒｇ、Ｒ）ではなく４９位を選択した。前記遺伝子座は、５つのヒト重鎖ＤおよびＪ領域の全ておよびその遺伝子座の３’末端に遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）も含有した（図８）。驚くべきことに、スプライス変異によりトランスジェニックマウスに正しいＣＨ１エキソンスキッピングは起こらず、ヒトＩｇ発現の欠如につながらなかった（図８）。
・ＣＨ１領域を欠くヒト遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスの解析
ＣＨ１のスプライシング問題を克服するために、本発明者らは３種類の新規構築物を生成した（図１）。全てがＣＨ１を欠失させたＣγ２およびＣγ３を含有し、１つはＣμおよびＣδを含むもの（ＭＧΔ）であり、１つはＣμおよびＣδを含まないもの（ＧΔ）であり、１つはＣＨ１を欠失させたＣμセグメントを有するもの（ＭΔＧΔ）であった。μＭＴバックグラウンドにおいて、異なるコピー数（１〜５コピー）の３つのＭＧΔ、６つのＧΔおよび４つのＭΔＧΔトランスジェニックマウス系統を得た。骨髄（ＢＭ）および脾臓においてＢ細胞の成長を解析した。異なるコピー数のマウスで同じ結果を得た。
・ＧΔおよびＭΔＧΔの発現はμＭＴマウスにおけるＢ細胞の成長を救済する
ＭＧΔマウスはμＭＴバックグラウンドにおいてＢ細胞の成長を救済することができなかったが、一方、ＧΔおよびＭΔＧΔ構築物はＢ細胞の成長を効果的に救済した。Ｂ２２０／ＣＤ１９陽性細胞の救済は、異なるリンパ系コンパートメントにおいて、コピー数に関係なく、３０〜１００％間であった（図２Ａ）。これは、Ｂ２２０対ヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＧ染色を用いたＢＭのフローサイトメトリーによって確認される（図２Ｂ）。ＭΔＧΔマウスは、野生型またはμＭＴマウスに存在しないヒトＩｇＭ産生細胞をＢＭにおいて含有する。従って、これらの細胞は、これらの細胞がヒトＩｇＧを含有しないように、クラススイッチを受けなかった。ＧΔマウスはヒトＩｇＧ発現Ｂ細胞だけを含む。ＭＧΔマウスは、細胞表面でヒトＩｇを発現するＢ細胞を含有するとしても非常に少なく、興味深いことに、Ｂ２２０細胞の一部は細胞内ＩｇＭを発現するが、ＩｇＧは発現しない（図２Ｂ）。ＭΔＧΔおよびＧΔマウス（下記参照）とは対照的に、ＭＧΔマウスはマウスＩｇ軽鎖を発現する（図６Ｇ）。これらの結果は、異なる構築物中でＣμおよびＣγ遺伝子が発現されることを示し、ＣＨ１が存在しないことがＶＨＨに基づく抗体の細胞表面発現にとって重大であることが強く示唆される。
・ヒトＨＣＡｂ ＩｇＧおよびＩｇＭはＢＭでのＢ細胞の成長中にマウス（プレ）ＢＣＲに機能的に置き換わる
小型静止プレＢ細胞への大循環の発展進行中、特異的細胞表面マーカーの発現はプレＢＣＲ依存的にダウンレギュレートされる［３６］。プレＢＣＲに機能的に置き換わるヒトＨＣＡｂの能力を調査するために、様々なマーカーの発現をＦＡＣＳにより解析した。プロＢ細胞は、高レベルの細胞質ＳＬＣ、ＩＬ−７ＲおよびＣＤ４３を発現するが、これらはプレＢＣＲ発現時にダウンレギュレートされ、成熟Ｂ細胞では存在しない（図２Ｃ、μＭＴマウスからのプロＢ細胞、ｗｔマウスの表面ＩｇＭ−プロＢ／プレＢ細胞画分および表面ＩｇＭ＋Ｂ細胞画分と比較）。
【００９６】
ＭΔＧΔ／μＭＴまたはＧΔ／μＭＴマウスのヒトＩｇ＋Ｂ細胞はＳＬＣおよびＩＬ−７Ｒレベルが低く、これにより、ヒト単鎖ＩｇＧおよびＩｇＭ受容体は、ＳＬＣおよびＩＬ−７ＲのダウンレギュレーションにおいてマウスプレＢＣＲに機能的に置き換わることが示される。ＣＤ４３では、これはＧΔマウスにおける場合のみのようであるが、ＭΔＧΔマウスにおけるＣＤ４３発現の持続はこれらのマウスにおけるＢ−１ Ｂ細胞分化の増加という知見に関連があるかもしれない。同様に、正常なプレＢＣＲシグナル伝達のように、ＣＤ２およびＭＨＣクラスＩＩ発現が誘導される。プレＢ細胞段階で一過性に誘導されたＩＬ−２Ｒ／ＣＤ２５のレベルは、成熟ＭΔＧΔまたはＧΔ／μＭＴ Ｂ細胞では非常に低く、成熟ｗｔ Ｂ細胞のレベルと同程度である（図２Ｃ）。さらに、ｉｃ Ｉｇκ発現は成熟ＭΔＧΔまたはＧΔ／μＭＴ Ｂ細胞では検出できず（図２Ｃ）、ＩＬ−７＋培養物から５日後のＩＬ−７除去時にはインビトロＢＭ培養物においても誘導されていなかった（図なし）。最後に、ＭΔＧΔまたはＧΔトランスジェニックマウスにおけるヒトＨＣＡｂ発現Ｂ細胞集団は、ＢＭで生成された細胞（ＨＳＡｈｉｇｈおよびＡＡ４．１／ＣＤ９３ｈｉｇｈ）から部分的になり、末梢で成熟し、再循環している細胞（ＨＳＡｌｏｗおよびＣＤ９３ｌｏｗ）から部分的になり、正常マウスでの結果と同様であった。
【００９７】
まとめると、これらの結果は、ヒトＨＣＡｂのＩｇＧおよびＩｇＭが、発達上調節されるマーカーの発現に関して、Ｂ細胞の成長中にマウス（プレ）ＢＣＲに機能的に置き換わることを示す。ＩｇのＬ鎖は誘導されない（下記参照）。ＢＭ ＲＮＡのｃＤＮＡ解析は、ＶＤＪ組換えのための両方のＶＨＨセグメントの使用、ＣＨ１の不在、そして重要なことにＣＤＲ３領域の大きな多様性を示している（図２Ｄ）。
・複数の再配列および対立遺伝子排除
免疫後、ＭΔＧΔおよびＧΔ系統から、特に５コピーＧΔ系統１で多数のハイブリドーマを作製した（下記参照）。配列解析により、多コピーＧΔ遺伝子座において１つ以上の再配列が起こり得ることが示された。解析した５つの異なる５コピーハイブリドーマのうち、１つのハイブリドーマ（Ｇ２０）はフレーム内にある１つのコピーを再配列し；２つのハイブリドーマ（Ｔ７およびＴ１２）は各々２つの再配列を有し、そのうちの１つの再配列は両方のハイブリドーマにおいてフレーム外であり；１つのハイブリドーマ（Ｔ３）は２つのフレーム内再配列（Ｊ２およびＪ４）を有し；一方、１つのハイブリドーマ（Ｔ１）はフレーム内の２つの再配列（Ｊ２およびＪ４）を含む４つの再配列を有した。
【００９８】
Ｔ１およびＴ３は２つの生産的ｍＲＮＡを発現し、それらは分泌された抗体の質量分析によりｃＤＮＡと正確にマッチさせて確認された（図なし）。本発明者らは、２つの異なるハイブリドーマ：Ｇ２０（１つの再配列）およびＴ１（４つの再配列）において、それぞれのコピーを検出するＬＣＲプローブと、再配列されていないコピーだけを検出する、ＶＨＨおよびＤセグメントの間に位置するプローブとを用いて、ＤＮＡ伸張線維ＦＩＳＨおよび標準的なＤＮＡ−ＦＩＳＨも行った（図３Ａ〜Ｅ）。対照肺細胞は、サザンブロットマッピング（図なし）に一致して、一方の末端に５つの完全なコピーと半分の導入遺伝子を示したが（図３Ａ）、一方、ハイブリドーマではＧ２０およびＴ１それぞれにおいて１つおよび４つの再配列されたコピーを確かに示している（図３Ｂ、Ｃ〜Ｅ）。従って、複数のコピーは同じ対立遺伝子上でうまく再配列することができる。次に、本発明者らは、ＨＣＡｂ遺伝子座に、正常なマウス遺伝子座に対する（不）利点があるかどうか、そして遺伝子座の対立遺伝子排除が起こっているかどうかを求めた。ｗｔバックグラウンドにおけるＧΔ系統１トランスジェニックマウスのＢ２２０／ＣＤ１９陽性ＢＭ細胞をヒトＩｇＧおよびマウスＩｇＭの発現について解析した。明らかに、ＧΔＢ細胞はマウスＩｇまたはヒトＩｇのいずれかを発現し（図３Ｆ）、対立遺伝子排除を示している。
・ＧΔ、ＭΔＧΔおよびＭＧΔトランスジェニックマウスにおける脾臓Ｂ細胞
導入遺伝子がμＭＴマウスにおけるＢ細胞分化に与える影響を評価するために、本発明者らはＣＤ２１／ＣＤ２３プロフィールを用いてフローサイトメトリーにより脾臓Ｂ細胞亜集団サイズを調べた（図４Ａ）。ＧΔマウスでは、ＣＤ２１ｌｏｗＣＤ２３ｌｏｗ未成熟Ｂ細胞の割合は正常な範囲にあり、ヒト単鎖ＩｇＧ発現細胞は濾胞（ＦＯ；ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）Ｂ細胞へも辺縁帯（ＭＺ；ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ）Ｂ細胞へも分化し得た。ＭΔＧΔマウスでは、未成熟Ｂ細胞画分が増加し、ＨＣＡｂ−ＩｇＭ発現細胞のＦＯおよびＭＺ−８ Ｂ細胞への分化がいくらか損なうことを示している。これらの脾臓では、ＣＤ２３発現の減少は、Ｂ−１ Ｂ細胞系統への分化を示す、ＣＤ４３およびＣＤ５の表面発現レベルの増加を伴っていた。ＭＧΔトランスジェニックマウスに存在する少数のヒトＩｇＭ発現Ｂ細胞（マウス軽鎖も発現する、図６参照）は、ＭΔＧΔトランスジェニックマウスにおけるものと同様のＦＯ／ＭＺ分布を現した。ＭＧΔマウスは違うが、ＭΔＧΔおよびＧΔマウスは、正常な脾臓構造を有し、白脾髄の外側境界に存在する濾胞および辺縁帯を含有するＢ細胞リッチな領域で囲まれた動脈周囲リンパ球鞘（ＰＡＬＳ）に集中しているＴ細胞の分離を示す（図４Ｂ）。
【００９９】
それらはまた、Ｔ細胞依存性抗体応答中のｗｔに匹敵する、二次リンパ組織のＢ細胞濾胞胚中心を形成する（図なし）。これらは、記憶形成と、体細胞超変異に起因する親和性に基づく選択の部位である。ＧΔマウスでは、これらの胚中心においてヒトＩｇＧ陽性細胞が検出される。本発明者らは、ヒトＩｇＧ遺伝子の超突然変異を、パイエル板（Ｐａｙｅｒ′ｓ ｐａｔｃｈｅｓ）に存在するＢ細胞のｃＤＮＡ解析により確認した（図４Ｃ）。ＶＨＨ１およびＶＨＨ２の両方を使用する。総合すれば、これらの発見により、ＧΔおよびＭΔＧΔトランスジェニックマウスにおいて、ＢＭから移動する未成熟Ｂ細胞は、脾臓においてＦＯ−Ｂ細胞およびＭＺ−Ｂ細胞の両方へと分化し、抗原曝露後に体細胞超変異を受ける能力を有することが実証される。
・単一コピー遺伝子座は効果的に救済し、ＣＨ１の不在が必須である
ＧΔ系統１マウス（図２Ａ）は５コピーのＧΔ遺伝子座を含有するため、従って効果的な救済が遺伝子座のコピー数と関係がある可能性があった。しかし、５コピーＧΔ系統１からＦｌｐｅＲ系統２３との交配によるＦｌｐ組換えにより得られた単一コピートランスジェニック系統は、Ｂ細胞の成長を同程度まで救済した（図４Ｄ、図２Ａ）。単一コピーの遺伝子座は救済に十分であり、そしてＣＨ１領域を含むＣμ定常領域の存在が阻害性であることを、非救済単一コピー系統ＭＧΔ（系統３）から、単一コピーＧΔ系統をもたらすＣｒｅ組換え（ｃｒｅ発現系統への品種改良）によりＣμおよびＣδ領域を欠失させることによって確認した（図４Ｄ）。それまで非救済であった遺伝子座はその時点で他のＧΔ系統と同じＢ細胞の成長９を与える。従って、コピー数は救済に影響を及ぼさず、Ｃμ領域にＣＨ１が存在することによりＢ細胞救済が阻害される（下記も参照）。
・ＭΔＧΔおよびＧΔトランスジェニックマウスにおいてマウスＩｇ軽鎖遺伝子座は再配列しない
マウスＩｇ軽鎖タンパク質はＭΔＧΔおよびＧΔマウスでは血清のウエスタンブロット（図なし、図２Ｃおよび６Ａ参照）によってまたはＦＡＣＳによって検出されず、マウス軽鎖遺伝子が再配列しないことが示唆された。これは、サザンブロット解析により選別された脾臓Ｂ２２０＋細胞画分および肝臓細胞のＤＮＡにおけるＩｇκ遺伝子座生殖細胞系列シグナルの密度を比較することによって確認され（図５ＡおよびＢ）、これによりマウス軽鎖は再配列せず、生殖細胞系列構成を保つことが示される。対照的に、ＭＧΔ／μＭＴマウスの少数のヒトＩｇ発現細胞において軽鎖が検出される（図６Ｇ参照）。
【０１００】
従って、ＢＭでの初期Ｂ細胞の成長におけるヒトＨＣＡｂの発現は軽鎖再配列を導くシグナルを与えることができない。これに関連して、ＨＣＡｂはプレＢＣＲよりもむしろＢＣＲによく似ており、このことはＨＣＡｂがＣＨ１の不在下で擬似軽鎖と結合できなかったことと関係があると考えられる［６１］。
・ＧΔ／μＭＴおよびＭΔＧΔ／μＭＴマウスの血清分析
ヒトＩｇＭはＭΔＧΔ血清に存在し、ヒトＩｇＧはＭΔＧΔマウス血清およびＧΔマウス血清の両方に存在した。免疫されていない成体動物では、ヒトＩｇＭ（＜５０μｇ／ｍｌ）およびＩｇＧ（２００〜１０００μｇ／ｍｌ）は、正常ヒトＩｇＨ遺伝子座を有する正常マウスまたはトランスジェニックマウスに見られるものと同様のレベルで存在する［６５］。６種全てのＧΔマウスの血清のゲル電気泳動では、非還元性条件下で約７０ｋＤ、還元性条件下で約３５ｋＤのＭＷを有するＨＣＡｂのＩｇＧが現われ、軽鎖を欠く重鎖二量体とＣＨ１エキソンを欠く各重鎖と一致した（図６Ａ、Ｂ）。
【０１０１】
ＭΔＧΔマウスの血清は、多量体重鎖のみのヒトＩｇＭを含有した。還元性条件下（図６Ｃ）では、４種全ての系統が、ＣＨ１のＭＷを減じた後にヒト対照ＩｇＭとしてのＭＷを有するＩｇＭ鎖を含有した。また、血清を非還元性条件下でも分画した（図６Ｄ、横方向の画分）後、それぞれの画分１０を還元性条件下でゲル電気泳動により解析した（図６Ｄ、縦方向のレーン）。９００ｋＤのヒト血清五量体ＩｇＭ対照と比較すると、トランスジェニックＩｇＭは６００ｋＤで分別され、それが多量体であること、ならびに軽鎖およびＣＨ１を欠くことに一致する。従って、ＭΔＧΔマウスはＨＣＡｂ多量体ＩｇＭおよび二量体ＩｇＧを産生するが、一方、ＧΔは血清中で二量体ＩｇＧを産生する。
・ＭＧΔマウスの血清分析
ＭＧΔ／μＭＴ系統の末梢および脾臓では、Ｂ２２０陽性細胞はほとんど見られず（野生型の１％未満）、極まれに小さなＢ細胞集団が脾臓において見られる（図４Ｂ）。精製後にのみ血清中に少量のヒトＩｇＭおよびＩｇＧが検出された（図６Ｅ、Ｆ）。これらのマウスにおけるヒトＩｇＭは、還元性条件下では通常のサイズであったが、一方、循環しているヒトＩｇＧはより短く（ＣＨ１の欠失に一致する、見かけのＭＷは３５ｋＤ）。興味深いことに、ヒトＩｇＭと結合していると思われるマウスκ軽鎖も検出された（図６Ｇ）。
【０１０２】
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧは定量ＥＬＩＳＡアッセイでの検出レベルを下回っていたが、本発明者らは、それにもかかわらず、ＭＧΔ／μＭＴマウスが免疫化に応答し得るかどうかを検証した。マウスをヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）で免疫し、ｗｔマウスは強いＴＮＦ−α特異的抗体応答を発現したが、一方、用いた２種のＭＧΔ系統の３匹のマウスにおいては、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット解析によって抗原特異的ヒトＩｇＧを検出することができなかった（図なし）。
・ＭΔＧΔおよびＧΔマウスの免疫化は抗原特異的Ａｂ産生をもたらす
ＧΔ／μＭＴマウスを大腸菌ｈｓｐ７０、ＤＫＴＰ（ジフテリア毒素、百日咳菌の全細胞溶解物、破傷風毒素ならびに不活化ポリオウイルス１型、２型および３型）およびｒｔＴＡで免疫し［５０］、一方、ＭΔＧΔマウスをヒトＴＮＦαで免疫した。ＥＬＩＳＡで陽性であった血清を有するマウスから、ファージディスプレイライブラリーによりハイブリドーマまたは単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）を用いて個々の完全抗体を単離した。
【０１０３】
抗体ＲＮＡのＲＴＰＣＲ後にαｈｓｐ７０特異的、破傷風毒素特異的およびｒｔＴＡ特異的モノクローナルを配列決定した（図７Ａ）。これにより、ＩｇＧ２（８つのうちの７つ）およびＩｇＧ３（８つのうちの１つ）抗体の両方が産生されることが示された（ｓｄＡｂはＩｇＧ２ライブラリーから単離した）。異なるＤおよびＪ領域を使用した。高頻度ではないが、１１のＨＣＡｂのＶＨＨは超突然変異を受けていた。３つのｈＴＮＦα特異的抗体（１つは陽性ＩｇＭハイブリドーマ、図６α−ｈＴＮＦα＃１および２つはｓｄＡｂα−ｈＴＮＦα＃２＆３）は全て、ＣＤＲ２領域に異なる超突然変異を有した。１４全ての抗体の配列を比較すると、全てのＪ領域が用いられているものの、ヒトと同じようにＪＨ４が最もよく用いられていることが明らかであった。驚くべきことに、全ての抗体はラマＶＨＨ２（４９位に典型なグルタミン酸ではなくグルタミン（Ｑ）を有する［５１］）を含有した。最後に、ＣＤＲ３領域が多様性の大部分をもたらしていることは明らかである２７。それは、ラマおよびヒトにおいて通常見られるものと非常に類似している、１０〜２０アミノ酸長の間で変化する（平均は１３．６ａａ）［５２、５３］。本発明者らは、次に、これらのＨＣＡｂが常用アッセイにおいてハイブリドーマ上清および細菌原形質周辺画分のｓｄＡｂとして機能するかどうかを検証した（図７）。ＥＬＩＳＡアッセイでは抗体の全てが陽性であり、ウエスタンブロットでの抗原検出でも全てが陽性であった（例えばα−ＤＫＴＰおよびα−ｒｔＴＡ血清とハイブリドーマ培地とα百日咳菌ｓｄＡｂ、図７Ｂ）。また、本発明者らは、ｒｔＴＡ発現プラスミドでトランスフェクトした細胞系統を用いて免疫細胞化学によりα−ｒｔＴＡ ＩｇＧも検証した（図７Ｃ、Ｄ）。ｒｔＴＡ ＨＣ−ＩｇＧは極めてはっきりとした特異的な核染色を示した。多数の抗体の親和性は高かったが、一部のもの（特にｓｄＡｂ）ではかなり低かった。例えば、免疫細胞化学に用いたα−ｒｔＴＡ抗体（図７Ｃ、Ｄ）は、ＢｉａＣｏｒｅで決定されるように約３ｎＭであった（図７Ｅ）。
＜結論＞
本明細書において、本発明者らは、μＭＴマウスにおけるＢ細胞の成長を救済し、結果的に機能性ＨＣＡｂ産生をもたらす修飾ＨＣＡｂ遺伝子座の発現を報告した。これらのマウスを免疫して、抗原特異的ＨＣＡｂを産生させることができる。ラクダ科動物の場合、ＨＣＡｂの分泌にはＣＨ１の除去が不可欠であるが、ＣＨ１の排除には３’ＣＨ１／イントロン境界における単一ラクダ科動物（総説３０）スプライス変異では不十分であり、従って少なくともヒト遺伝子座において、単にこの単一点突然変異以上のものが必要である。ＣＨ１をＶＨＨとともに有するＩｇＭはＢ細胞の成長を妨げるが、これは恐らく、プレＢＣＲとの関連でＩｇＭ表面分子の効果のない会合に起因する。対照的に、ＨＣＤ様ヒトμタンパク質を発現するマウスは、λ５とは無関係にＳＣＩＤバックグラウンドにおいて正常ＣＤ４３プレＢ細胞を生じる［５４］。末端切断型Ｃμタンパク質は、関連Ｌ鎖なしにＢ細胞表面で発現され、自己会合を介してシグナル伝達するプレＢＣＲによく似ていると考えられる［５５］。
【０１０４】
通常、ＢｉＰシャペロンは、後に鎖間接触に関与するＩｇ鎖の疎水性表面と結合することによって抗体分子の折り畳みおよび会合を監視している３１。ＶＨＨのＦＲ２に親水性アミノ酸が存在することによって、ＶＨＨとのＢｉＰの結合がほぼ確実に阻止され、この場合には可溶性にする（代理）軽鎖は必要でない。同時に、ＣＨ１は、会合（軽鎖によるＢｉＰの置換）が完了するまでＥＲに重鎖を保持するとされているＢｉＰとの相互作用をもたらす。本発明者らの結果は、プレＢ細胞受容体レベルでは、λ５タンパク質との非共有結合における代理軽鎖（ＳＬＣ）の一部としてのＶｐｒｅタンパク質とのトランスジェニックμ重鎖対合は、ＣＨ１ドメインを含有するμ重鎖がＶＨＨと結合されている場合には起こるのができないことを示唆している。そのため、ＭＧＳおよびＭＧΔトランスジェニックマウスにおけるヒトＩｇＭは、この点で、増殖展開および発展進行をシグナル伝達するために不十分であることが公知である不完全プレＢＣＲ様複合体に似ている［５６、５７］。これにより、ＢＭではＢ２２０陽性細胞の３０％しか細胞内ＩｇＭを有さない理由を説明することができる（図２Ｂ）。これらのマウスの脾臓に少数の成熟Ｂ細胞が存在することは、μ重鎖を含有するが任意のＳＬＣまたは通常の軽鎖が欠失している最近記載された新規な受容体複合体によって説明する［５８］。
【０１０５】
ＣＨ１がＣγ２および３に存在せず、ＩｇＭがその遺伝子座から除去されている場合には、Ｂ細胞の成長の救済が起こり、ＩｇＧがＩｇＭに機能的に置き換わることが示される。Ｒａｇ２−／−マウスにおける成熟ＣＤ２１＋Ｂ細胞の成長の支援において、プロＢ細胞段階以降に発現されるＩｇＧ１受容体をＩｇＭの代わりにすることができる［５９］。最近、事前に再配列したラクダ科動物ＩｇＧ２ａがμＭＴ（およびＣΔ−／−）バックグラウンドの２匹のトランスジェニックマウスのうちの１匹においてＢ細胞の成長を部分的に救済することができるということも示された１３。本発明者らの場合では、ＣＨ１を欠くＩｇＭまたはＩｇＧは１０種の独立したトランスジェニックマウス系統のうちの１０種においてＢ細胞の成長を救済する。さらに、本発明者らは軽鎖再配列を観察しておらず、さらなるＢ細胞分化に軽鎖発現は必要でないと結論づけられる。本明細書で得られた結果とＺｏｕ ｅｔ ａｌ．の結果［６０］における相違は、ＬＣＲが本発明者らの構築物に含まれていることによる重鎖遺伝子座の発現レベル（すなわちシグナル伝達）によって説明することができる。本発明者らの結果は、ＣＨ１［６１］またはＶＨおよびＣＨ１［６２］を欠く末端切断型μ重鎖タンパク質が、ＳＬＣと結合することができず、κ遺伝子再配列を活性化することができないことを裏付ける。
【０１０６】
５コピーＧΔ系統１（および他の多コピー系統）は、ゲノムの同じ位置に組み込まれた単一コピー系統と同じ程度までＢ細胞の成長を救済する。興味深いことに、多コピートランスジェニック遺伝子座では１以上の再配列が起こる（図３）。２種の単一脾細胞由来のハイブリドーマの２つは、２種の生産的ＨＣＡｂ転写物およびタンパク質をもたらした。この結果は、同じＢ細胞における２種の抗体の発現は無害であることを裏付けている［６３］。しかし、二重抗体産生Ｂ細胞は抗原曝露下で単一抗体産生細胞との競争に敗れるという予測３７は、抗原曝露後に得られた５つのハイブリドーマから２種の二重抗体発現細胞を見出した本発明者らの結果からは実証されない。
【０１０７】
ＢＭ細胞は細胞表面でマウスまたはヒトＩｇを発現するため、野生型マウスにおいて（多コピーの）遺伝子座は対立遺伝子排除を受けやすい。細胞表面で両方を発現する細胞の有意な集団はない（図３Ｆ、上のパネル）。恐らく最も興味深いのは、マウスＩｇおよびヒトＩｇを発現している細胞の数の対比である。ｗｔ／５コピーＧΔマウスでは、再配列に利用できる３つの可能性ある対立遺伝子、１つのＩｇ遺伝子座を有する２つのマウス対立遺伝子および５つのヒトＨＣＡｂ遺伝子座を有する１つの対立遺伝子が存在する。確率的に選択されるならば、ヒト対立遺伝子は３回のうち１回しか選択されない。
【０１０８】
遺伝子座の数を計数すれば、ヒト遺伝子座はまず７細胞のうち５細胞で再配列する。しかし、内因性マウスおよびトランスジェニックヒトＨＣＡｂはほぼ同等に発現される（４４／３８、図３Ｆ 下のパネル）。これらの数はＶ領域のランダム使用によって起こり得るずれやトランスジェニック遺伝子座における位置効果の可能性を無視しているが、最初の選択が対立遺伝子の確率的選択であり、続いて１対立遺伝子につき複数の遺伝子の再配列が行われ得ることを強く示唆している。
【０１０９】
これは、本発明者らがＧΔ遺伝子座の複数の再配列を頻繁に観察しているという事実と一致する。通常、生産的再配列は組換えをダウンレギュレートして、他の対立遺伝子の再配列を妨げる。しかし、トランスジェニック対立遺伝子における複数のコピーは同じオープンな遺伝子座に存在し、ＲＡＧダウンレギュレーション前に組み換えられる。これは、複数の再配列が同時に起こるためであるか、または空間要素（「コンパートメント」）を含むならば、ＲＡＧがダウンレギュレートされる前に接近していれば遺伝子座の別の遺伝子を再配列する十分な時間があり得る。
【０１１０】
ｗｔマウスにおいて再配列が生産的ではない（シグナル伝達はなく、ＲＡＧはとどまる）場合に限り、第２の遺伝子座が活性化され、第１の遺伝子座に置き換わり、再配列されるための十分な時間がある。この論証を支持して、同じ染色体上に複数の遺伝子座を有する他の種には、２つのＡｂを発現する、より多くの細胞が存在するという見解が生じる［６４］。
【０１１１】
重要なことには、これらの試験によってＨＣＡｂ遺伝子座はマウスにおける発現に成功し得ることが分かる。抗原曝露は、遺伝子座の構成によって異なるクラスの高親和性抗原特異的ヒトＨＣＡｂの産生をもたらす。これらの抗体は、正常マウスまたは他の「正常」なヒトＩｇＨトランスジェニックマウスでのレベルと同様のレベルで発現される［６５］。本発明者らの実験では２つの可変領域だけを使用したが、本発明者らが検証した無関係なタンパク質のほぼ全てに対して様々な特異性を有する高親和性抗体の単離に成功し、ＣＤＲ３によってもたらされる多様性の効率および有効性を立証した［６６］。従って、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えおよびインビボ選択を行うことは、ファージディスプレイを用いたファージミドライブラリーからのヒト単鎖抗体断片の作製に対して非常に重要な利点をもたらす３９。ハイブリドーマは容易に生成することができ、このことによって、重要なことに、ファージディスプレイやさらなるスクリーニングの必要なく、完全ヒトＨＣＡｂまたはｓｄＡｂ断片の直接クローニングおよび発現を可能にする。
【０１１２】
従って、これらのマウスは、特にＨＣＡｂが通常の抗体、例えば酵素の活性部位に対してほとんど抗原性がないエピトープを認識し得るという証拠４に照らして、臨床目的またはその他の目的でのヒトＨＣＡｂの産生に関して全く新しい可能性を広げる。抗原の全てが認識されるわけではないことの理由は、限られた数の可変領域によって説明することができる（ポリオおよびジフテリアタンパク質はＧΔマウスでは応答をもたらさなかったが、一方、ｗｔ対照マウスでは応答がもたらされた）。驚くべきことに、抗体の全てがラマＶＨＨ２領域を有した。これには、４９位に保存アミノ酸［６７］が含まれず、それを有し、溶解性がより高いはずであるＶＨＨ１とは対照的である。
【０１１３】
それでもなお、本発明者らは、遺伝子座により多くの可変領域を追加することによっていっそう広範囲にわたるレパートリーをもたらすものと予測する。単一対立遺伝子上では複数のコピーの遺伝子座を避けることが好ましいが、多様性を高めるために異なるＶＨ領域の単一コピーをそれぞれが含む複対立遺伝子を含むマウスを生成することが有利。そのような新しい遺伝子座では、通常発生する（ヒト）ＶＨ領域または溶解度１８および軽鎖対合を高めるために操作されたＶＨ領域のいずれかを使用することができる。
【０１１４】
結論として、本発明者らは、潜在的に任意のクラスの抗原特異的高親和性ＨＣＡｂがマウスで産生され得ることを立証した。この技術は、人における治療薬または診断薬として使用するための、抗原曝露に応答する任意のクラスの完全ヒトＨＣＡｂまたはそれらの断片の生成を可能にする。また、異なる脊椎動物遺伝子座を用いることによって、本発明者らの技術は、試薬、診断法として使用するための、または動物の治療のための任意の脊椎動物由来の高親和性成熟抗体の産生を可能にする。
【実施例１】
【０１１５】
Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、トランスジェニックＶＨ遺伝子座が遺伝子導入によってコードされた重鎖のみ抗体を産生するように正確に再結合していること、そしてそのような遺伝子座は内因性（マウス）重鎖免疫グロブリン遺伝子座の存在下で対立遺伝子排除に対して感受性があることを示した。対立遺伝子排除プロセスを用いることによって、重鎖のみ抗体産生に使用されるＶＨトランスジェニック遺伝子座の数を増加させることができるということを示すために、異なる重鎖のみの遺伝子座を含む２匹のトランスジェニックマウスを交配させ、結果として両方の遺伝子座を含む子孫を得た。一方のマウスはＭＧΔ遺伝子座を含有した（ＩｇＭおよびＩｇＧ遺伝子座、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６）が、もう一方のマウスはＧΔ遺伝子座（ＩｇＧ遺伝子座単独、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を含有し、両方のマウスはμＭＴバックグラウンドを有するものであった。ダブルトランスジェニック子孫のＢ細胞からハイブリドーマを誘導し、標準的な方法によって培養下で増殖させた。多数の得られた個々のモノクローナル細胞系統をＰＣＲおよびサザンブロットによって解析し、それによって生産的に再配列されたＭＧΔ遺伝子座を含有する系統が、再配列されていないＧΔまたは生産的に再配列されていないＧΔ遺伝子座を含むことが示された。逆に、生産的に再配列されたＧΔ遺伝子座を含有する細胞系統は、再配列されていないまたは生産的に再配列されていないＭＧΔ遺伝子座を含有した。このように、利用できるＶＨ領域の合計が組換えプロセスに使用される。
＜実施例３および４＞
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、前の実施例に記載される、当技術分野で公知の方法（Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ ２００６）を用いて、機能性ヒトＶＨ領域全数を、ヒトＶＨ領域（またはそれらの変異体）を、全ＤＨ領域、全ＪＨ領域ならびにＣμ、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣα領域と３’ＬＣＲの組合せを含む複数の修飾ヒト遺伝子座にクローニングすることによって増加させる。この手順は、独立した遺伝子座の複数の同一ＶＨ領域または独立した遺伝子座の異なるＶＨ領域を用いて行うことができる。異なる遺伝子座は同一重鎖領域または異なる重鎖領域を含有し得る。実施例３は、重鎖領域の異なる組合せを有する遺伝子座の同一ＶＨ領域を有する遺伝子座に関し、実施例４は同一重鎖定常領域と異なるＶＨ領域を有する２つの遺伝子座に関する。両実施例において、さらに遺伝子座を追加してよいことは明らかである。
【実施例２】
【０１１６】
ヒトＶＨ領域は、可能性ある３９個の機能性ヒトＶＨ領域（あるいはヒトＶＬ領域またはＴＣＲのＶ領域または突然変異誘発によって得られるこれらの全ての変異体を使用または追加してよい）の中から選択されたそれぞれのＶＨに特異的なプライマーを用いたヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離する。ヒトＶＨ領域は、前記実施例に記載した、すなわちヒトＤＨおよびＪＨ（または他のＤおよびＪ領域）とそれぞれＣＨ１および３’ＬＣＲが欠失しているＣμ、Ｃγ２、Ｃγ３を含む遺伝子座にセットでクローニングされる（図９）。ＣＨ１およびスイッチ領域が欠失しているＣα領域はＧΔ遺伝子座に別個にクローニングされる（図１０）。このＧΔ遺伝子座は、ｌｏｘ部位を含有せず、ラマＶＨＨ領域が標準的な相同組換えによって除去されて、特異ＰＩ−ＰｓｐＩ部位を残している（図１０）という点から原型遺伝子座の変異体である。
【０１１７】
機能性ＶＨ領域は、各遺伝子座の任意の複数に関して同時にクローニングすることができる。最初に、１７個の機能性ヒトＶＨ領域を、クローニングされた２個の遺伝子を１セットで同時にクローニングする。これらの最初の構築物のそれぞれに、第２のセットを従来の方法（例えばＸｈｏＩ−ＳａｌＩ制限消化／連結を用いて、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ適合部位の連結により両方を破壊する）により追加する。４、４、４、３および２個の遺伝子を含有するセットがＢＡＣベクター中の１７個の遺伝子の１セットに連結される。この手法は、他の数の遺伝子を含有するセットを組み合わせることによって行ってよいことは明らかである。前記方法は、所望の数のＶＨ領域を得る任意の時点で終了してよく、またはより多数のＶＨ領域を得るために延長してよい。
【０１１８】
１セット全て（例えば１７個の遺伝子）を特異ＰＩ−ＰｓｐＩ部位の修飾ＧΔ遺伝子座にクローニングする。Ｃα領域はこの遺伝子座のＩ−ＣｅｕＩ部位にクローニングされ、結果としてＩｇαおよびＩｇＧを産生可能なＡΔＧΔ遺伝子座が生じる（図１０）。また、他の重鎖領域もクローニングすることができた。
【０１１９】
これらの最終的な遺伝子座は、その後、前記実施例に記載されている独立したトランスジェニックマウス（好ましくは、μＭＴなどのＩｇＨ遺伝子座欠損マウス）に導入される。これらの独立した遺伝子座は、独立したマウス系統、ＩｇＧだけを作製する系統ならびにＩｇＡおよび／またはＩｇＧを作製する系統を生成するために用いられる。これらのマウスは、続いて、２つの異なる遺伝子座から３４個のＶＨ領域を提供できるようにＶＨ領域全体を有するように交配される。これらのマウスを両方の遺伝子座に関してホモ接合性になるように交配することによって、組換えに利用できる６８個のＶＨ領域が作製されることになる。組み込まれた遺伝子座の複数のコピーを有することによって、この数はいっそうさらに増加する。これらのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマの解析は、生産的に再配列された遺伝子座が存在する場合に、作り出された他の遺伝子座が、標準的な手法による対立遺伝子排除の結果、再配列されていないかまたは生産的に再配列されていないことを示すために利用される。
【実施例３】
【０１２０】
前記領域（または突然変異誘発によって得られたそれらの変異体）に対して同様に単離された１以上のＶＨ領域の異なるセットを、前記と同じ方法により２つの独立した遺伝子座にクローニングする。これは結果として２つの異なるＧΔ遺伝子座（またはそれらの変異体、例えばＣαが追加されたもの）をもたらすことになる。これらの遺伝子座は、独立したマウスに導入されて、独立したトランスジェニック系統（例えばそれぞれ１０個のＶＨドメインを有する２つの遺伝子座、図１１）をもたらす。これらのマウスは、その後、組換えプロセスに利用できる全ての使用ＶＨ領域を有するダブルトランスジェニックマウスを得るために交配されることになる。これらのマウスを両方の遺伝子座に関してホモ接合性なるように交配することによって、組換えに利用できるＶＨ領域の数が倍増することになる（図１２、染色体１に組み込まれた１つの遺伝子座と染色体８上の１つの遺伝子座に関するカリオグラム）。組み込まれた遺伝子座の複数のコピーを有することによって、この数はいっそうさらに増加する。これらのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマの解析は、生産的に再配列された遺伝子座が存在する場合に、作り出された他の遺伝子座が、対立遺伝子排除の結果、再配列されていないかまたは生産的に再配列されていないということを示すために利用される。
【０１２１】
前記プロセスは、所望の数のＶＨ領域を得る任意の時点で終了してよい。これらのＶＨ領域にＤ、ＪＨおよび定常領域が追加される。これらの最終遺伝子座は、その後、前記実施例に記載されている独立したトランスジェニックマウス（好ましくは、ＩｇＨ遺伝子座欠損マウスを含む）に導入され得る。あるいは、ｌｏｘ部位の位置により、Ｃμ（ＩｇＭ）単独、またはＣγ２およびＣγ３（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３）単独、またはＣα単独（ＩｇＡ）またはそれらの組合せを含有する独立した遺伝子座を生成するための個々の定常領域の排除が可能となる。これらの独立した遺伝子座は、ヒトＩｇＭ単独、またはＩｇＧ単独またはＩｇＡ単独またはそれらの組合せのいずれかを作製する独立したマウス系統を生成するために用いられる。
［参考文献］
【０１２２】
【表２Ａ】
【０１２３】
【表２Ｂ】
【０１２４】
【表２Ｃ】
【０１２５】
【表２Ｄ】
【０１２６】
【表２Ｅ】
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】トランスジェニックマウスを生成するために使用されたＤＮＡ断片の模式図である。２つのラマＶＨＨエキソンは、ヒト重鎖多様性（Ｄ）および結合（Ｊ）遺伝子セグメントと連結され、その後にＣμ、Ｃδ、Ｃγ２およびＣγ３ヒト定常領域遺伝子およびヒト重鎖Ｉｇ３’ＬＣＲが続く。ヒトＣγ２およびＣγ３遺伝子は、構築物ＭＧΔおよびＧΔ中のＣγ２およびＣγ３遺伝子からの、または同様に構築物ＭΔＧΔ中のＣμからのＣＨ１エキソンの完全な欠失により修飾されていた。２つのＬｏｘＰ位（赤色）が同じ方向に存在することにより、Ｃｒｅに媒介される組換えの際、ＣμおよびＣδ遺伝子の除去が可能になる。Ｆｒｔ位（緑色）が存在することにより、Ｆｌｐに媒介される組換えによる、複数コピー導入遺伝子アレイからの単一コピートランスジェニックマウスの生成が可能になる。
【図２】パネルＡ：異なる器官における総細胞のうちのＢ２２０／ＣＤ１９陽性細胞の百分率として表されたＢリンパ球のフローサイトメトリー分析の表である。パネルＢ：ＢＭ中のｗｔ、μＭＴ、ＭＧΔ／μＭＴ、ＭΔＧΔ／μＭＴおよびＧΔ／μＭＴマウスのＢ細胞集団のフローサイトメトリー分析。Ｂ２２０の前方および側方散乱ならびに表面発現に基づいてリンパ球系統細胞をゲートし、ヒトＩｇＭまたはＩｇＧをプロットした。データはドットプロットとして表示される。ＭＧΔμＭＴマウスについて、Ｂ２２０＋画分をゲートして細胞内（ｉｃ）ヒトＩｇμおよびγＨ鎖の発現について分析し、ヒストグラムオーバーレイ（赤色線）として、一緒にμＭＴマウス由来のＢ２２０＋細胞のバックグラウンド染色（黒色線）を対照として表示した。陽性細胞の百分率が示されている。パネルＣ：ＭΔＧΔまたはＧΔ導入遺伝子の発現は、プレＢＣＲおよびＢＣＲの機能を救済する。μＭＴマウス由来の総ＣＤ１９＋画分（プロＢ細胞）、野生型マウス由来のＣＤ１９＋表面ＩｇＭ＋画分（プロＢ／プレＢ細胞）およびＣＤ１９＋表面ＩｇＭ＋画分（Ｂ細胞）、ＭΔ−ＧΔμＭＴマウス由来のＣＤ１９＋表面ヒトＩｇＭ＋画分（Ｂ細胞）およびＧΔμＭＴマウス由来のＣＤ１９＋表面ヒトＩｇＧ＋画分（Ｂ細胞）において示されたマーカーの発現プロフィール。ｉｃ−Ｉｇκ＝細胞内ＩｇκＬ鎖。フローサイトメトリーデータはヒストグラムとして表示される。示されるデータは、各群内で試験された３〜８匹の動物の代表である。パネルＤ：ＶＨＨ１およびＶＨＨ２特異的プライマーをヒトＣγ２プライマーと組合せて用いてＢＭ ｃＤＮＡから得た、ＰＣＲ産物の配列アラインメント、ＶＤＪ組換えを示す。配列はＧΔに由来する。緑色は配列同一性を示す。
【図３】パネルＡ〜Ｅ：５つのコピーのヒトＧΔ遺伝子座のＤＮＡ−ＦＩＳＨ。パネルＡ：その半分をＬＣＲ（赤色）を含む遺伝子座に、その半分をＶＨＨからＪ領域（緑色）を有する遺伝子座に隣接されている５つのインタクトなＧΔ遺伝子座のコピー（１〜５）を有するＧΔ系統１トランスジェニックマウスの肺細胞由来の伸張されたクロマチン線維。パネルＢ：１つのコピーが再構成されている（白色矢印）ＧΔ系統１のＢ細胞に由来するハイブリドーマ（Ｇ２０）の伸張されたクロマチン線維ＦＩＳＨ。パネルＣ：ＬＣＲプローブを用いるハイブリドーマＴ１の伸張されていないＤＮＡ−ＦＩＳＨ（赤色）。パネルＤ：ＶＨＨ〜Ｄ間のプローブを用い、Ｃと同内容（緑色）。パネルＥ：パネルＣとＥのオーバーレイ。赤色シグナルの喪失がないのに対し、４つの緑色シグナルの喪失が見られることから、Ｔ１が４つの再構成を有することに留意されたい。パネルＦ：ＧΔトランスジェニックマウスにおいて対立遺伝子が排除されている。マウス表面または細胞内（ｉｃ）μＨ鎖および示されるマウス由来の総ＢＭ ＣＤ１９＋細胞画分上のトランスジェニックヒトＩｇＧのフローサイトメトリー分析。データはドットプロットとして表示され、示される象限内の細胞の百分率が示される。示されるデータは、各群内で試験された４匹のマウスの代表的なデータである。
【図４】ｗｔ、μＭＴ、ＧΔ、ＭΔＧΔおよびＭＧΔマウスの脾臓のＢ細胞集団の分析を示す図である。示されるデータは、各群内で試験された４〜８匹のマウスの代表的なデータである。パネルＡ：上側、Ｂ２２０に対してマウスＩｇＭ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭについて染色された脾臓細胞のＦＡＣＳデータ。下側、脾臓のＢ細胞集団のフローサイトメトリー分析。Ｂ２２０の前方および側方散乱ならびに表面発現に基づいてリンパ球系統細胞をゲートし、示されたＩｇ（上部）またはＣＤ２１／ＣＤ２３プロフィールはドットプロットとして示され、示されたゲート内の細胞の百分率が示される。ＣＤ２１ｌｏｗＣＤ２３ｌｏｗ：未熟Ｂ細胞；ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋：濾胞性Ｂ細胞；ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ：辺縁帯Ｂ細胞。パネルＢ：ｗｔ、μＭＴ、ＧΔ／μＭＴ、ＭΔＧΔ／μＭＴおよびＭＧΔ／μＭＴマウスの脾臓の組織像。免疫組織化学分析；５μｍの凍結切片を、Ｂ細胞には抗Ｂ２２０（青色）で、樹状細胞には抗ＣＤ１１ｃ／Ｎ４１８（茶色）で染色した。矢印は、ＭＧΔ脾臓におけるＢ細胞の小さなクラスターの位置を示す。パネルＣ：ＶＨＨ１およびＶＨＨ２特異的プライマーをヒトＣγ２プライマーと組合せて用いてパイエル板ｃＤＮＡから得たＰＣＲ産物の配列アラインメント、トランスジェニック遺伝子座がＣＤＲ１および２領域で超突然変異を受けることを示す。配列は、ＣＨ１の欠失しているトランスジェニック遺伝子座ＧΔに由来する。パネルＤ：上側；脾臓細胞のＦＡＣＳデータ、抗ＣＤ１９および抗Ｂ２２０で染色。下側左：ＦｌｐｅＲトランスジェニック系統に交配することによるインビボＦｌｐ組換えの模式図、および５つのコピーＧΔ系統１に由来する単一コピー組換え型の脾臓細胞に関するＦＡＣＳデータ。下側右：ＭＧΔ系統をＣＡＧＣｒｅトランスジェニック系統に交配することによるインビボＣｒｅ組換えの模式図、組換え型の脾臓細胞に関するＦＡＣＳスキャンデータを支持し、直接生成した元のＧΔ系統に見られるようなＢ細胞の救済を示す。
【図５】ＧΔ／μＭＴ（パネルＡ）およびＭΔＧΔ／μＭＴ（パネルＢ）トランスジェニック系統においてκ軽鎖再構成が行われないことを示すサザンブロットを示す図である。１匹のｗｔマウスおよび２匹のＧΔまたは４匹のＭΔＧΔトランスジェニックマウス由来の肝臓ＤＮＡ（Ｌ）およびＢ細胞ＤＮＡ（Ｂ）をＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、３２Ｐ放射標識されたＪκプローブおよび炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）プローブを用いて分析した。４ｋｂバンドにハイブリダイズするＣＡＩＩプローブを泳動対照として用いた。肝臓ＤＮＡを流してκ生殖細胞系列の配置を示した（２．８Ｋｂバンド）。ｗｔＢ細胞だけが、２．８ｋｂ断片の強度の低下で測定されるκ遺伝子座の再構成を示す（肝臓と比較するとシグナルの３０％が残る）。
【図６】μＭＴバックグラウンドにおいて非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ〜Ｇ）、６種類の異なるＧΔ系統（Ａ、Ｂ）、４種類の異なるＭΔＧΔ系統（Ｃ）および２種類の異なるＭＧΔ系統（Ｅ〜Ｇ）の、Ｐｒｏｔ Ｇまたはコンカバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）精製された血清サンプルを泳動した。トランスジェニックヒトＩｇＧ（パネルＢ、Ｆ）およびＩｇＭ（パネルＣ、Ｄ）のサイズはＣＨ１欠失と一致し、軽鎖が存在しない。マウスκ軽鎖は正常なサイズであった（Ｇ）。ヒト血清を陽性対照として用いた。パネルＤ：非還元条件下でヒトＩｇＭ対照に混合後のＭΔＧΔ血清のＳｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ分画。それぞれの画分を還元条件下でゲル電気泳動により分析した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムから回収された画分は左（高ＭＷ）から右（低ＭＷ）である。対照は、ヒト血清単独（第１レーン左）およびヒトＩｇＭ対照血清（レーンＭΔＧΔ血清）に混合する前のマウス血清である。サイズマーカーが示される。
【図７】パネルＡ：破傷風毒素；ＨＳＰ７０、ｒｔＴＡおよびヒトＴＮＦαに特異的なモノクローナル抗体ｃＤＮＡの配列。上の配列は生殖細胞系列ＶＨＨ２配列である。ＣＤＲ１、２および３ならびにヒンジ領域が配列の上に示されている。異なるアイソタイプおよびクラスは右側に異なる色で示されている。用いられるＪ領域は右側に示されている。パネルＢ：異なる重鎖のみ抗体（ハイブリドーマ、血清およびｓｄＡｂ）を用いるウエスタンブロットの例。左側のパネル、それぞれ１／１００および１／２５０希釈された、抗ｒｔＴＡ血清およびハイブリドーマ培地。中央のパネル、それぞれ１／２００および１／１００希釈された、ｗｔおよびＧΔマウス由来の抗ＤＫＴＰ血清。右側のパネル、百日咳菌抗原（ＤＫＴＰ）を含むかまたはそれを欠く（ＤＴＰ、本発明者らは精製された百日咳菌抗原を購入することができなかったため）ワクチンに対する抗百日咳菌ｓｄＡｂ。パネルＣおよびＤ：細胞質においてマーカータンパク質を発現することによりｒｔＴＡの存在に応答するマーカープラスミドを追加的にトランスフェクトされたＴｅｔ−ｏｎ細胞系統の１つの免疫染色５１。パネルＣは、ｒｔＴＡを発現している核を示す（緑色）。パネルＤは、ｒｔＴＡに応答した細胞質中のマーカータンパク質のドキシサイクリン誘導発現（赤色）、および細胞のＤＡＰＩでの核染色（青色）を示す。パネルＥ：抗ｒｔＴＡ抗体のＢｉａＣｏｒｅ分析の例。親和性が示されている。
【図８】パネルＡ：ラクダ科動物様スプライス変異を含むＩｇ遺伝子座の概略図である。２つのヒトＩｇＧ定常領域（Ｃγ２およびＣγ３）を、まず、Ｇγ２−ＳおよびＧγ３−Ｓで表されるラクダ科動物ＩｇＧ ＨＣＡｂｓ５においてＣＨ１エキソンのスキッピングをもたらすと考えられるＧ＋１〜Ａ＋１のスプライスを変更することにより変異させた。遺伝子座は、２つのラマＶＨＨ領域、全てのヒトＤおよびＪＨ領域ならびにヒトＣμ、ＣδおよびＣγ２およびＣγ３およびＬＣＲを含有した（明細書本文も参照のこと）。これらの遺伝子座をμＭＴトランスジェニックマウスに導入し、ヒト遺伝子座の発現について分析した。パネルＢ：ＧＳマウス由来の骨髄（ＢＭ）ヒトＩｇＧｃＤＮＡの配列決定から、両方のＶＨＨが異なるヒトＤおよびＪセグメントと組み換えられ、Ｃγ２定常領域で転写されることが示された。しかし、ＣＨ１エキソンは、まだ最後の１６ｂｐを残して存在し、それを切り出した。進行中であるが、イントロン１の４位におけるＡ〜Ｇの移行に起因する、ＣＨ１エキソンの同じ潜在スプライス部位が白血病患者において報告された［３１］。ＭＧＳまたはＧＳ系統のいずれもμＭＴマウスにおいてＢ細胞の成長を救済しなかった（図なし）。マウスのＢ細胞転写／翻訳機構は再構成されたヒトコブラクダＶＨＨ−γ２ａをプロセシングすることができるが［３４、６０］、本発明者らのデータは、Ｇ〜Ａ突然変異に加えて、その他の特徴がＣＨ１エキソンスキッピングに重要であることを示す。
【図９】実施例３および４に説明される様々な遺伝子座でのヒトＶＨ領域のクローニングの模式図である。
【図１０】複数のＶＨ遺伝子セグメント、全Ｄ領域、全ＪＨ領域、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣｘ領域および３’ＬＣＲを含む重鎖遺伝子座の例を示す図である。
【図１１】複数のＶＨ遺伝子セグメント、全Ｄ領域、全ＪＨ領域、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣｘ領域および３’ＬＣＲを含む重鎖遺伝子座の例を示す図である。
【図１２】染色体１に組み込まれた１つの遺伝子座と染色体８に組み込まれた１つの遺伝子座を含むカリオグラムを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における、抗原曝露に応答する親和性成熟した機能性重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの改良された製造方法およびその使用に関する。本発明はまた、複数の遺伝子座からのクラス特異的重鎖のみ抗体の多様なレパートリーの製造に関する。
【０００２】
特に、本発明は、任意のクラスまたは複数のクラスの混合物のヒト抗原特異的な高親和性の重鎖のみ抗体の生成、ならびに十分に機能性のＶＨ抗原結合ドメインの単離および発現のための方法に関する。
【０００３】
本発明の方法を用いて生成された重鎖のみ抗体も記載される。
【０００４】
以下の説明において、全てのアミノ酸残基位置番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．により考案された番号付け方式に従って示される［１］。
【背景技術】
【０００５】
＜抗体＞
抗体の構造は当技術分野で周知である。大部分の天然抗体は四量体であり、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む。重鎖はそれぞれの重鎖に沿ってほぼ中間に位置するヒンジドメイン間のジスルフィド結合を介して相互に連結されている。軽鎖はそれぞれの重鎖とヒンジドメインのＮ末端側で会合している。それぞれの軽鎖は、通常、各重鎖とヒンジドメインに近いジスルフィド結合により結合している。
【０００６】
抗体分子が正常に折り畳まれると、それぞれの鎖は、より線状のポリペプチド配列により連結された多数の別個の球状のドメインに折り畳まれる。例えば、軽鎖は、可変（ＶＬ）および定常（ＣＬ）ドメインに折り畳まれる。重鎖は、単一の可変ドメインＶＨ、第１の定常ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジドメインおよび２または３個のさらなる定常ドメインを有する。重鎖定常ドメインおよびヒンジドメインは一体となって抗体重鎖の定常領域として一般に公知な構造を形成する。重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖可変ドメインの相互作用は、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成をもたらす。重鎖および軽鎖の相互作用は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣκまたはＣλドメインにより促進される。一般に、ＶＨおよびＶＬの両方は抗原結合に必要とされるが、重鎖二量体およびアミノ末端断片は軽鎖の不在下で活性を保持することが示されている［２］。
【０００７】
重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖の両方の可変ドメインの中で、一部の短いポリペプチドセグメントは例外的な可変性を示す。これらのセグメントは超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。間にあるセグメントはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬドメインのそれぞれの中に、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）がある。
【０００８】
哺乳類において、５つのクラスの抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が存在し、ヒトには４つのＩｇＧサブタイプと２つのＩｇＡサブタイプが存在する。
【０００９】
【表１】
抗体クラスはその生理学的機能において異なる。例えば、ＩｇＧは、成熟した免疫応答において主要な役割を果たす。ＩｇＭは、補体結合および凝集に関与する。ＩｇＡは、分泌物（涙、唾液、初乳、粘液）中の抗体の主要なクラスであり、従って局所免疫に役割を果たす。天然抗体のエフェクター機能は、重鎖定常領域によってもたらされる。
【００１０】
ＩｇＡは、粘液を含有する部位（例えば、腸内、気道内または泌尿生殖器路内）に見出すことができ、病原体による粘膜部位のコロニー形成を防ぐ。ＩｇＤは主にＢ細胞上の抗原受容体として機能する。ＩｇＥはアレルゲンと結合して肥満細胞からのヒスタミン放出（アレルギーの基礎をなす機構）を誘発し、また、蠕虫（虫）に対する保護をもたらす。ＩｇＧは（その４つのアイソタイプにおいて）、侵入してくる病原体に対して抗体に基づく免疫性の大部分をもたらす。ＩｇＭは、Ｂ細胞の表面に発現され、Ｂ細胞の媒介する免疫性初期段階において（すなわち、病原体を排除するために十分なＩｇＧが存在する前に）病原体を排除するための非常に高い親和性を有する分泌型としても存在する。
【００１１】
正常なヒトＢ細胞は、単一の重鎖遺伝子座を１４番染色体上に含有し、その遺伝子座から重鎖をコードする遺伝子が再構成により形成される。マウスにおいて、重鎖遺伝子座は１２番染色体に位置する。正常な重鎖遺伝子座は、複数のＶ遺伝子セグメント、多数のＤ遺伝子セグメントおよび多数のＪ遺伝子セグメントを含む。ＶＨドメインの大部分はＶ遺伝子セグメントによってコードされるが、それぞれのＶＨドメインのＣ末端はＤ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントによってコードされる。Ｂ細胞におけるＶＤＪの再構成と、その後の親和性成熟は、それぞれのＶＨドメインにその抗原結合特異性をもたらす。正常なＨ２Ｌ２四量体の配列解析は、多様性が主にＶＤＪ再構成と体細胞超変異の組合せに起因することを実証する［３］。ヒトゲノムには５０個を超えるヒトＶ遺伝子セグメントが存在し、そのうちの３９個のみが機能性である。
【００１２】
完全なヒト抗体（Ｈ２Ｌ２）は、現在、トランスジェニックマウスから抗原曝露に応答して導くことができる。そのようなトランスジェニックマウスは単一のヒト重鎖遺伝子座および別個の軽鎖遺伝子座を含む。対応するマウス重鎖および軽鎖遺伝子座は、マウス抗体の不在下でヒト抗体のみが産生されるように欠失または抑制される（［４〜１０］）。
【００１３】
新しい分子生物学技法の出現で、重鎖のみ抗体（軽鎖を欠く）の存在が、人におけるＢ細胞増殖性障害において同定され（重鎖疾患）、さらにマウスモデル系においても同定された。分子レベルでの重鎖疾患の分析により、ゲノムレベルでの突然変異および欠失が重鎖ＣＨ１ドメインの不適切な発現をもたらし、軽鎖と結合する能力を欠く重鎖のみ抗体の発現を引き起こしたことが示された［１１、１２］。
【００１４】
ラクダ科動物が、遺伝子の自然突然変異の結果として、軽鎖との結合を媒介するＣＨ１ドメインが存在しないために軽鎖と結合することのできない機能性ＩｇＧ２およびＩｇＧ３重鎖のみ二量体を生成することが示された［１３］。ラクダ科動物重鎖のみ抗体の特性を特徴付けるのは、ヒトおよび正常なラクダ科動物ＶＨドメインに対して改良された溶解度をもたらすラクダ科動物ＶＨドメインの特定のサブセットである。この特定のサブセット中のラクダ科動物ＶＨドメインは通常ＶＨＨドメインと称される。
【００１５】
サメなどの種が、おそらく哺乳類Ｔ細胞受容体または抗体軽鎖に類縁であり、重鎖のみ様結合タンパク質ファミリーを生成することも示されている［１４］。
【００１６】
ラクダ科動物重鎖のみ抗体の産生のために、ラクダ科動物生殖細胞系列の重鎖遺伝子座は、可能性のある重鎖定常領域の一部または全部をコードする遺伝子セグメントを含む。成熟の間、再構成されたＶＨＨＤＪ結合ドメインは、ヒンジドメインをコードする遺伝子セグメントの５’末端上にスプライスされて、ＣＨ１ドメインを欠き、従って軽鎖と会合することのできない重鎖をコードする、再構成された遺伝子がもたらされる。
【００１７】
ラクダ科動物ＶＨＨドメインは、特徴的な多数のアミノ酸を３７、４４、４５および４７の位置に含有する［４９］。これらの保存されたアミノ酸は、重鎖のみ抗体に溶解性を付与するために重要であると考えられる。特定のラクダ科動物ＶＨドメインだけが、改良された溶解度特性を有するＶＨＨドメインである。それらはＶＨサブファミリーに限定され、そのため限定された範囲の抗原だけに増殖的に応答する。
【００１８】
重鎖のみモノクローナル抗体は、標準的なクローニング技術によりラクダ科動物脾臓のＢ細胞から、またはファージもしくはその他のディスプレイ技術によりＢ細胞ｍＲＮＡから回復することができる［１８］。ラクダ科動物に由来する重鎖のみ抗体は高親和性である。重鎖のみ抗体をコードするｍＲＮＡの配列解析は、正常な四量体抗体の産生においても観察されるように、多様性が主にＶＨＨＤＪ再構成と体細胞超変異の組合せに起因することを実証する［４９］。
【００１９】
天然のラクダ科動物およびヒトＶＨドメインの重要かつ共通する特徴は、それぞれのドメインが、最適な溶解度および結合親和性のためにＶＬドメインでの二量化に依存することなく、モノマーとして結合することである。
【００２０】
近年、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における重鎖のみ抗体の産生のための方法が開発された（ＷＯ０２／０８５９４５号およびＷＯ０２／０８５９４４号参照）。潜在的に任意のクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥ）の、任意の哺乳類に由来する機能性重鎖のみ抗体は、抗原曝露の結果としてヒトを除くトランスジェニック哺乳類（好ましくはマウス）から生成することができる。これらの初期研究は２つのラマＶ遺伝子セグメントの使用に頼り、抗体応答の限定されたレパートリーに悩まされた。
【００２１】
Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．［１５］は、トランスジェニックマウスにおける重鎖のみ抗体の誘導のための方法を開発した。Ｂ細胞での抗体成熟の結果として高い結合親和性を有するこれらの重鎖のみ抗体は、抗原曝露の結果として誘導され、確立されたハイブリドーマ技術を用いて選択され、軽鎖（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）の不在下で任意のクラスの抗体として、またはＶＨ結合ドメイン単独として生成され得る。これらの重鎖のみ抗体は、全てのヒトＤおよびＪ遺伝子セグメントと結合した２つのラマＶＨＨ（クラス３）遺伝子セグメントならびに全てのヒト定常領域をコードする遺伝子セグメントを含有する生殖細胞系列（すなわち非再構成）配置中の抗体重鎖遺伝子座から誘導された。それぞれの定常領域をコードする遺伝子セグメントは、ＣＨ１ドメインの欠失を有し、軽鎖の結合を妨げた。さらに、この遺伝子座は、３’末端に抗体ＬＣＲを含有し、Ｂ系列の細胞における高いレベルの発現を確保する。この遺伝子座を受精卵のマイクロインジェクションによりマウスに導入した。
＜抗体を原料とした産物の製造＞
抗体を原料とした産物の遺伝子工学による製造、特にヒトまたはヒト化抗体を原料とした産物の製造は、新規なクラスの医薬、診断法および試薬の生成をもたらすと同時に、新規な産業、雇用および富の創造の機会の創出をもたらした（ｗｗｗ．ｄｒｕｇｒｅｓｅａｒｃｈｅｒ．ｃｏｍ、ｗｗｗ．ｌｅａｄｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏ．ｕｋ参照）。抗体を原料とした産物は通常、天然の四量体抗体から導かれる。抗体を原料とした産物の製造に関する特許および特許出願は多くある。これらの特許および特許出願は、（例えばトランスジェニックマウスからの）誘導の経路、製造の経路および産物に特異的な物質の事柄に関する。そのような抗体を原料とした産物は、抗体断片を介して完全な四量体抗体から一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子までさまざまである。
【００２２】
抗体を原料とした産物は、２１世紀に着手される新規な医薬品の高い割合を占める。モノクローナル抗体療法は、関節リウマチおよびクローン病の治療のための好ましい経路として既に容認され、癌の治療において見事な進展がある。また、抗体を原料とした産物は、心血管疾患および感染症の治療のために開発中である。大部分の販売されている抗体を原料とした産物は、標的リガンド（例えばＴＮＦα）上の単一の明確なエピトープを認識し、結合する。
【００２３】
近年、高親和性ＶＨドメインは、ディスプレイライブラリー中の無作為化されたヒトＶＨドメインから選択されるか、またはラクダ科動物の抗原曝露によって自然に産生された重鎖のみ抗体から誘導されるか、またはラクダ科動物で作られたＶＨドメインライブラリーから誘導されている。これらの高親和性ＶＨドメインは抗体を原料とした産物に組み込まれている。これらのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインとも呼ばれ、多数の古典的なＶＨドメインとは違い、特に、軽鎖の不在下で重鎖の改良された溶解度および安定性を確保する多数の突然変異を提示する。これらの変化の中で最も顕著なものは、荷電アミノ酸が４５位に存在することである［１６］。
【００２４】
多数のグループが、天然の四量体抗体から誘導される重鎖のみ抗体の作製に取り組んできた。Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．は（同文中に２およびその他の参照文献が引用される）、親和性精製された、特性が十分明らかであるウサギ抗体の縮小された重鎖成分の分離、それに続いてその後の個々の重鎖の再生を記載している。再生された重鎖の免疫学的特性解析により、軽鎖を含まない重鎖ホモ二量体が、単独で、能力のある結合抗原であることが実証された。
【００２５】
その後、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．［１８］は、クローン化されたマウスＶＨ領域が、大腸菌発現系で可溶性タンパク質モノマーとして発現されると、高い親和性で抗原と結合する能力を保持することを明白に実証した。Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．［１８］は、ＶＨドメインの単離および特性解析を記載し、古典的なモノクローナル抗体産生（最後の段落参照）と比較した場合のこのアプローチの潜在的な商業上の利益を示した。彼らはまた、通常は軽鎖と会合する重鎖から単離されたＶＨドメインが天然の四量体抗体の溶解性に欠けていることを認めている。従って、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．［１８］は、これらの分子を表現するために「粘着性のある」という用語を用い、この「粘着性」は改良された溶解度特性を有するＶＨドメインの設計によって対処することができると提案した。
【００２６】
ＶＨ溶解度の改良は、その後、ファージディスプレイを用いる無作為化された部位特異的なアプローチの組合せを用いて対処されてきた。例えば、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ［１７］は（ＷＯ９２／０１０４７号参照）、溶解度を改良すると同時に結合特異性を維持するためにラクダ科動物重鎖のみ抗体のＶＨドメインの特徴の一部をファージディスプレイと組み合わせて組み込んだ。
【００２７】
ファージライブラリーに由来する単離されたヒトＶＨドメインに関する複数の独立した研究により、ＶＨドメインの抗原特異的な結合が実証されたが、これらのＶＨドメインは溶解度が低いことが分かった。さらに、ファージアレイに提示される特異的結合特性を有するヒトＶＨドメインの選択が操作された抗体のためのビルディングブロックを形成することが示唆された［１８］。
【００２８】
ヒトＶＨドメインは改良された溶解度特性のために操作されてよく［１９、２０］、または溶解度はインビボで自然選択により獲得されてもよい［２１］。しかし、ＶＨ結合ドメインがファージライブラリーから誘導されている場合、例えば親和性ホットスポットのランダム化を含む親和性改善策の適用にもかかわらず、抗原に対する固有の親和性は低マイクロモルから高ナノモルの範囲のままである［２２］。
【００２９】
ファージまたは代替ディスプレイ技術により生成されたヒトＶＨまたはラクダ科動物ＶＨドメインは、体細胞突然変異の結果としての改良された特性の利点および正常な抗体結合部位のＣＤＲ３領域におけるＤおよびＪ遺伝子セグメントの組換えにより提供されるさらなる多様性を欠く。一部のラクダ科動物ＶＨ（ＶＨＨ）ドメインは、ヒトＶＨに対して溶解度の点で利点を示すものの、ヒトにおいて抗原性であることが判明し、さらに、ラクダ科動物ＶＨがラクダ科動物の免疫化またはファージディスプレイ技術により生成されねばならないという不利点を被る可能性がある。
【００３０】
ファージ由来ヒトＶＨ領域は、高い親和性結合特性を達成するためにそれらが多くの回のパニングおよびその後の変異誘発を必要とするので、使用することが困難である。ラクダ科動物ＶＨＨドメインは、ファージもしくは類似のディスプレイライブラリーから単離された場合に同じ困難な手順を必要とするか、または、古典的なハイブリドーマ技術に従わない大型動物（同様に古典的な抗体を作成するラマまたはラクダ）の免疫化を必要とする。さらに、ラクダ科動物の結合ドメインは抗原性であることが分かり、ヒト化を必要とし得る。
【００３１】
抗原曝露の結果としてのヒトを除くトランスジェニック哺乳類における重鎖のみ抗体の産生（ＷＯ０２／０８５９４５号およびＷＯ０２／０８５９４４号参照）は、これらの多くの問題を克服する。
【００３２】
しかし、当技術分野において、重鎖のみ抗体の多様性およびインビボでＢ細胞の応答を最大化する、特に、クラス特異的ヒト重鎖のみ抗体の機能性レパートリーおよび多様な臨床、工業および研究用途で使用するための最大の抗原結合可能性を保持する機能性ＶＨ重鎖のみ結合ドメインを生成する必要性が残っている。
【発明の開示】
【００３３】
本発明者らは、驚くべきことに、先行技術の制限を克服し、クラス特異的な重鎖のみ抗体を生成するために用いられるヒトを除くトランスジェニック哺乳類に存在する重鎖のみの遺伝子座の数を増加させることにより、抗体応答のレパートリーを大いに増大させることができることを示した。
【００３４】
本発明は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類が複数の重鎖のみの遺伝子座を有する場合、それらの遺伝子座は対立遺伝子排除の対象となるという発見に依存する。その結果、ただ１つの遺伝子座が確率的に選択され、首尾よく組換えられ、結果として重鎖のみ抗体の産生がもたらされる。従って、複数のＶＨ重鎖遺伝子座を同じヒトを除くトランスジェニック哺乳類に用いて、哺乳類から入手可能な抗体レパートリーおよび多様性を最大化することができる。抗原に曝露された場合、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、残りの遺伝子座を除いて特異的抗原曝露に応答するために最も適しているＶ遺伝子セグメントを含む遺伝子座を「選択する」。
【００３５】
本発明の方法により生成され得る重鎖のみ抗体は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類が一連の遺伝子座から「選択する」ことが可能であることの結果として高い結合親和性を示し、それから一般に伸張されたＣＤＲ３ループの不在下でＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの再構成ならびに体細胞突然変異が起こり得る。本質的に正常なＢ細胞の成熟は、高いレベルの重鎖のみ抗体が（ＣＨ１ドメインが組換え遺伝子座に存在する全ての抗体クラスから排除されているという条件で）単離された血漿中に存在する状態で観察される。Ｂ細胞の成熟および構築された二量体（例えばＩｇＧ）または多量体（例えばＩｇＭ）の分泌は、軽鎖遺伝子の存在または発現に依存しない。
【００３６】
従って、本発明の第１の態様では、その哺乳類に複数の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を供与する段階を含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類におけるＶＨ重鎖のみ抗体の産生のための方法が提供され、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、１個以上のＶ遺伝子セグメント、１個以上のＤ遺伝子セグメント、１個以上のＪ遺伝子セグメント、および発現した場合、ＣＨ１ドメインを含まず、前記遺伝子座の少なくとも１つからＶＨ重鎖のみ抗体を発現する重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含む。
【００３７】
好ましくは、それぞれのＶＨ重鎖遺伝子座は、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０または６０個のＶ遺伝子セグメントを含み、それは任意の脊椎動物種に由来してもよい。
【００３８】
一実施形態では、各遺伝子座は、ただ１つのＶ遺伝子セグメントを含んでよい。本実施形態の一つの代替形態では、各Ｖ遺伝子セグメントは他の全てのＶ遺伝子セグメントとは異なっている。第２の代替形態では、各Ｖ遺伝子セグメントは、他の全てのＶ遺伝子セグメントと同一である。この第２の代替形態では、各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントは、他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００３９】
従って、非ヒト哺乳類は単一のＶＨ重鎖遺伝子座の複数のコピーを含有し得ることが想定される。これは、Ｂ細胞において生産的な再構成が起こり、従って有用な重鎖のみ抗体の産生を可能にする機会を最適化するという利点を有する。
【００４０】
非ヒト哺乳類が、多数の異なるＶＨ重鎖遺伝子座を含有するならば、これは、所望の特異性を有する重鎖のみ抗体を得る機会をさらに最適化する。
【００４１】
もう１つの実施形態では、それぞれの遺伝子座は複数のＶ遺伝子セグメントを含む。本実施形態では、任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントは、全て同じ種の生物に由来してよい、例えば、全てのＶ遺伝子セグメントがヒト起源であってよい。あるいは、任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントは異なる種の生物に由来してよい。例えば、一部のＶ遺伝子セグメントがヒトに由来し、他のものはラクダ科動物またはサメに由来してよい。
【００４２】
好ましくは、Ｖ遺伝子セグメントはヒト起源である。
【００４３】
用語「Ｖ遺伝子セグメント」は、ラクダ科動物およびヒトを含む脊椎動物に由来する任意の天然のＶ遺伝子セグメントを包含する。Ｖ遺伝子セグメントは、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、および重鎖定常（エフェクター）領域（ＣＨ１エキソン以外の数個のエキソンを含み得る）をコードする遺伝子セグメントと組み換えて、核酸が発現されるとＶＨ重鎖のみ抗体を生成できなければならない。
【００４４】
Ｖ遺伝子セグメントはまた、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、および重鎖定常領域（１個以上のエキソンを含むがＣＨ１エキソンは含まない）をコードする遺伝子セグメントと組み換えて、本明細書に定義される重鎖のみ抗体を生成できる相同体、誘導体またはタンパク質断片をコードする任意の遺伝子配列をその範囲内に含む。Ｖ遺伝子セグメントは、例えばＴ細胞受容体遺伝子座または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に由来してよい。
【００４５】
好ましくは、本発明の複数の重鎖遺伝子座は、複数の遺伝子座に分散された、改良された溶解度特性を有する３９個の機能性ヒトＶ遺伝子セグメントおよび操作された前記ヒトＶ遺伝子セグメントの変異体のうちの、任意の数または任意の組合せを含む。これらは、任意の数の遺伝子座、例えば８つのＶ遺伝子セグメントを含む４つの遺伝子座に加えて７つのＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；４つのＶ遺伝子セグメントを含む７つの遺伝子座に加えて３つのＶ遺伝子セグメントを含む１つの遺伝子座；またはそれぞれ１つのＶ遺伝子セグメントを含む３９の遺伝子座上であってよい。
【００４６】
ヒトＶ遺伝子は７つのファミリー、ＶＨ１〜ＶＨ７に分類され、各ファミリー内の個々の遺伝子に番号が付けられている。それぞれの遺伝子が使用される頻度は、特定の免疫応答の変動する要件に依存する。例えば、ファミリーＶＨ３の遺伝子は、細菌性抗原に応答する際にファミリーＶＨ５の遺伝子と比較して選択的に使用され得る。従って、本発明のさらに好ましい実施形態では、特定の抗原に対する抗体応答を生成するために有用であることが示されたＶ遺伝子セグメントのグループを別々のヒトを除くトランスジェニック哺乳類の系へ分類する。Ｖ遺伝子セグメントはファミリーに従って分類されるか、またはそれらは個々の機能に従って分類される。例えば、ファミリーＶＨ３のＶ遺伝子が細菌性抗原に対する抗体応答を生成するために有用であることが示されるならば、細菌性抗原に対する重鎖のみ抗体を生成するために特に有用であるヒトを除くトランスジェニック哺乳類を生成するためにファミリーＶＨ３のＶ遺伝子を用いることができる。あるいは、ファミリーＶＨ３およびＶＨ５の数個の個別の遺伝子が細菌性抗原に対する免疫応答を生成するために有用であることが示されるならば、それらは一緒に分類されて、細菌性抗原に対する重鎖のみ抗体を生成するために特に有用であるヒトを除くトランスジェニック哺乳類を生成するために用いることができる。
【００４７】
本発明の状況において、用語「異種の」とは、本明細書に記載される核酸配列または遺伝子座が、それが位置する哺乳類に対して内在性でないことを意味する。
【００４８】
「ＶＨ重鎖遺伝子座」は、本発明の状況において、重鎖エフェクター領域をコードする１つ以上の遺伝子セグメント（それぞれＣＨ１ドメインを欠く）と操作によって連結されている、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、および１つ以上のＪ遺伝子セグメントを含む、ＶＨドメインをコードする最小のマイクロ遺伝子座に関する。好ましくは、抗体レパートリーの可変性の主な原因は、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの選択により、さらにＶ−ＤおよびＤ−Ｊ接合により形成されるＣＤＲ３領域である。
【００４９】
本発明の利点は、再構成されたＶＨ遺伝子配列において得られた抗体レパートリーおよび多様性が、同じヒトを除くトランスジェニック哺乳類における複数のＶＨ重鎖遺伝子座の使用によって最大化することができることである。Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、２００６［１５］は、上に記載されるトランスジェニック遺伝子座が、再構成および対立遺伝子排除に関して正常な免疫グロブリン遺伝子座のような挙動をすることを示した。このことは、同じ動物において（異なる染色体上に）複数の遺伝子座を有して、対立遺伝子排除を利用することにより起こり得るＶＨ組換えの数を最大化する可能性を開いた。各トランスジェニック遺伝子座は、１から４０を超えるＶＨ領域を含有する。遺伝子座の１つを無作為に選択して組換えを開始し、最初の組換えが非生産的などであった場合に生産的な組換えが遺伝子座の１つから産出されるまで次の遺伝子座がその後に続く、対立遺伝子排除のプロセスは、組み合わせた遺伝子座中に存在する全てのＶＨ領域が実際に全体的な組換えプロセスの一部となることを確保するものである。
【００５０】
Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、［１５］はまた、驚くべきことに、同じヒトを除くトランスジェニック哺乳類において複数の重鎖遺伝子座が同じ染色体上で直列になっている場合、その結果、生産的な再構成および抗体の発現が複数の重鎖遺伝子座から起こり得ることを見出した。そのような場合、その後のハイブリドーマクローンはポリクローナルである。当業者であれば、これが抗体の多様性を増加させるためのもう一つの機構であることを理解する。
【００５１】
従って、本発明の別の態様では、本明細書に記載されるように、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類において少なくとも２つ以上のＶＨ重鎖遺伝子座が同じ染色体上で直列になって存在し、その結果、生産的な再構成および抗体の発現が２つ以上の遺伝子座から同時に起こり得る方法が提供される。
【００５２】
好ましくは、多数の重鎖遺伝子座は最初に別々にヒトを除くトランスジェニック哺乳類に導入され、単一の重鎖遺伝子座を有するヒトを除くトランスジェニック哺乳類を作り出す。次に、ＶＨ領域の数を最大化するためにこれらの動物を交配させて複数の重鎖遺伝子座を有する後代を生成し、最大の多様性をもたらす。遺伝子座はまた、新しい１ラウンドの遺伝子組換えによって加えてもよい。新しい遺伝子座は、既に１以上の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を含むヒトを除く哺乳類由来の卵に注入される。異種のＶＨ重鎖遺伝子座の安定な融合により、利用可能なＶＨ領域の増加および、従って多様性がもたらされる。異種のＶＨ重鎖遺伝子座を、さらなる異種のＶＨ重鎖遺伝子座とともに含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類に由来するＥＳ細胞の安定なトランスフェクションは、ＥＳ細胞技術を胚融合および胚盤胞注入による遺伝子組換えに使用することのできるヒトを除く哺乳類（例えばマウス）において多様性を増加させる代替経路を提供する。
【００５３】
好ましくは、それぞれの異なる重鎖遺伝子座は、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類のゲノム中に単一コピーとして存在する。
【００５４】
さらに、複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを使用することにより、得られる抗体レパートリーおよび多様性のさらなる増加がもたらされる。その後の体細胞突然変異は、ＶＬおよびＬｃ（軽鎖）抗体遺伝子座の必要なく最小の遺伝子座（マイクロ遺伝子座）を使用しながら達成される。
【００５５】
本発明の状況において、用語「Ｄ遺伝子セグメント」および「Ｊ遺伝子セグメント」には、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの天然の配列が含まれる。好ましくは、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントと同じ脊椎動物に由来する。例えば、Ｖ遺伝子セグメントがヒトに由来する場合、必要に応じて可溶化されたまたは操作されたＤおよびＪ遺伝子セグメントも、ヒトに由来することが好ましい。あるいは、Ｖ遺伝子セグメントは、例えばラクダ科動物に由来し、ＤおよびＪ遺伝子セグメントはヒトに由来してもよく、逆も同様である。
【００５６】
Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントという用語はまた、得られるセグメントが本明細書に記載される重鎖抗体遺伝子座の残りの成分と組み換えられて本明細書に記載の重鎖のみ抗体を生成することができる限り、誘導体、相同体およびその断片をその範囲内に含む。ＤおよびＪ遺伝子セグメントは天然の供給源から誘導されてもよいし、それらは当業者が熟知ある、本明細書に記載される方法を用いて合成されてもよい。Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは組換えが可能であり、好ましくは、体細胞突然変異を受ける。
【００５７】
ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、単一の脊椎動物種に由来することが好ましい。これはいずれの脊椎動物種であってもよいが、好ましくはヒトである。
【００５８】
好ましくは、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、１〜４０（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０または４０）以上のＤ遺伝子セグメントを含む。Ｄ遺伝子セグメントはいずれの脊椎動物種に由来してもよいが、最も好ましくは、Ｄ遺伝子セグメントはヒトＤ遺伝子セグメント（通常２５個の機能性Ｄ遺伝子セグメント）である。
【００５９】
好ましくは、それぞれのＶＨ重鎖遺伝子座は、１〜２０（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０）以上のＪ遺伝子セグメントを含む。Ｊ遺伝子セグメントはいずれの脊椎動物種に由来してもよいが、最も好ましくは、Ｊ遺伝子セグメントはヒトＪ遺伝子セグメント（通常６つのＪ遺伝子セグメント）である。
【００６０】
各ＶＨ重鎖遺伝子座は、同一のＤおよびＪ遺伝子セグメントを含有してよい。あるいは、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの異なる組合せを含有してよい。例えば、各ＶＨ重鎖遺伝子座がただ１つのＶ遺伝子セグメントを含有し、このセグメントが各遺伝子座において同一である場合、生産的な再構成を得るための機会をさらに最適化するために、各遺伝子座においてＤおよびＪ遺伝子セグメントの異なる組合せを使用することが有利である。しかし、各ＶＨ重鎖遺伝子座が１つ以上の異なるＶ遺伝子セグメントを含有する場合、各遺伝子座においてＤおよびＪ遺伝子セグメントの同一の組合せを使用することが有利であろう。
【００６１】
好ましくは、ＶＨ重鎖遺伝子座は、１以上のＶ遺伝子セグメント、２５の機能性ヒトＤ遺伝子セグメントおよび６つのヒトＪ遺伝子セグメントを含む。
【００６２】
重鎖定常領域をコードする各遺伝子セグメントは、重鎖定常領域遺伝子セグメントがＣＨ１ドメインを発現しないという条件で、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、ＣεまたはＣα１−２クラスの１個以上の重鎖定常領域エキソンを含み得る。重鎖定常領域遺伝子セグメントは、好ましいクラスまたは必要な抗体クラスの混合物に応じて選択される。場合により、異種重鎖遺伝子座はＣμおよびＣδを欠損している。
【００６３】
従って、各ＶＨ重鎖遺伝子座は、インビボでエフェクター機能をもたらす少なくとも１つの重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含んでよく（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＤまたはそのアイソタイプ）、各定常領域はＣＨ１ドメインを含まない。各遺伝子座は、１つの特定の定常領域をコードする遺伝子セグメントをただ１つ含有してよい。これは、エフェクター機能が必要とされる場合に有利である。あるいは、各遺伝子座は、それぞれが異なる定常領域をコードする１個よりも多くの遺伝子セグメントを含んでよい。これは、様々なクラスの重鎖のみ抗体が産生されることを可能とするような、特定のエフェクター機能についての要件がない場合に有利である。
【００６４】
各遺伝子座は同じ定常領域コード遺伝子セグメントを含有してもよく、または各遺伝子座は異なる定常領域コード遺伝子セグメントまたはその異なる組合せを有してもよい。
【００６５】
操作上、重鎖定常領域は、Ｂ細胞においてＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントと組換え可能な天然のまたは操作された遺伝子セグメントによってコードされる。
【００６６】
各重鎖のみ抗体において、定常領域は、重鎖のみ抗体の生成が起こり得るように、ＣＨ１ドメインを含まずに発現される。ＣＨ１エキソンは、上記のＶＨ重鎖のみ抗体の定常領域が機能性ＣＨ１ドメインを含有しないように除去され得る。
【００６７】
多価の結合複合体を操作する際にクラス特異的な重鎖定常領域を含むことにより、インビボでエフェクター機能の治療上の利益が必要される機能性に応じてもたらされる。個々のエフェクター領域を操作することも、機能性の付加または欠失をもたらし得る［２３］。従って、ＩｇＡ定常領域の機能性を含むことにより、病原体に対して改良された粘膜機能をもたらされるが［２４］、一方で、ＩｇＧ１定常領域の機能性が存在することにより、インビボで強化された血清安定性がもたらされる。重鎖ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインが存在することにより、自然抗体に見られるような安定的な二量体形成の基盤がもたらされ、翻訳後グリコシル化の認識部位がもたらされる。ＣＨ２およびＣＨ３の存在はまた、二重特異性および多価の複合体を試薬および診断薬として用いる際に、二次抗体の認識も可能にする。
【００６８】
例えば、ＩｇＭ抗体は、マクロファージの活性化および補体経路の活性化に重要な役割を果たすことが公知である。その結合部位が近接していることに起因して、ＩｇＭは、ウイルスを含む病原体に高い親和力を有する。しかし、ＩｇＭは、迅速なイムノアッセイ技法での使用が困難であることも公知であり、その一方でＩｇＧ抗体はこれらの技法で容易に使用することができる。用途に応じて、好ましい抗体クラス、すなわちＩｇＧまたはＩｇＭを選択することが有用である。
【００６９】
ＣＨ１を欠く異種の重鎖Ｃγ遺伝子座の全部または一部の発現は、異種のＩｇＧ遺伝子座に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプに応じて、場合により一部または全てのＩｇＧアイソタイプを生成する。あるいは、重鎖はＣε遺伝子を含んでよい。得られるＩｇＥ分子も治療に使用してよい。
【００７０】
あるいは、選択された抗体の混合物を得ることもできる。例えば、ＩｇＡおよびＩｇＭは、重鎖定常領域がＣαおよびＣμ遺伝子を含む場合に得ることができる。
【００７１】
好ましくは、重鎖定常領域は、特に重鎖のみ抗体がヒトにおける治療用途に使用される場合に、ヒト起源である。重鎖のみ抗体が獣医学目的に使用される場合は、重鎖定常領域は、獣医学治療が行われる標的生物、脊椎動物または哺乳類に由来することが好ましい。
【００７２】
発現した場合、各重鎖定常領域はＣＨ１ドメインを欠く。好ましくは、ＣＨ１エキソンが欠失している。場合により、ＣμおよびＣδ定常領域は変異しているか、欠失しているか、または置換されていてよい。例えば、機能性ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭの存在は、Ｂ細胞の成熟を阻害し、その結果として同じ遺伝子座の中で重鎖のみのＩｇＧ（ＣＨ１を欠く）の生産的発現を制限する。
【００７３】
本明細書に定義される「重鎖定常領域エキソン」（「ＣＨエキソン」）には、天然の脊椎動物の配列が含まれるが、特に哺乳類のＣＨエキソンである。これはクラス特異的な方法で変動する。例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡは天然にＣＨ４ドメインを欠く。用語「ＣＨエキソン」は、ＣＨエキソンが、それが重鎖定常領域の成分である場合に、本明細書に定義される機能性重鎖のみ抗体を形成することができる限り、その範囲内に誘導体、相同体およびその断片も含む。
【００７４】
ＣＨ４またはその他の機能性ドメインは、存在する場合、細胞内分泌プロセス、Ｂ細胞の成熟または得られる抗体の結合活性を阻害しないならば、任意選択的に導入遺伝子内で操作されるかまたは除去されてよい。
【００７５】
細胞表面の集合を妨げる分泌機構とその結果起こるＢ細胞成熟に操作が影響を及ぼさないならば、重鎖エフェクター分子は操作されて、機能性ドメイン、例えばカルボキシ末端ＣＨ４ドメインが取り除かれてよい。例えばグリコシル化を改良するかまたは機能を付加するために、さらなる特徴を遺伝子座に組み換えてもよい。
【００７６】
従って、異種の重鎖遺伝子座は、基本的に正常にＢ細胞成熟した状態で、必要とされる抗体クラスに応じて、重鎖のみ抗体の好ましいクラスまたは混合物を生成するように設計される。ラクダ科動物Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントおよびラクダ科動物エフェクター領域を利用すると、ラクダ科動物抗体に特有の特長、例えば伸張したＣＤＲ３ループなどを有するラクダ科動物抗体が産生される。ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを使用すると、伸張したＣＤＲ３ループを欠くヒト重鎖のみ抗体が産生される。
【００７７】
本発明の状況において「ＶＨドメイン」は、上記に定義されるように、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントと組み換えられる場合、Ｖ遺伝子セグメントの発現産物を指す。好ましくは、ＶＨドメインは、ＶＤＪ組換えおよび体細胞突然変異の結果として抗原と結合する改良された能力を有する。ラクダ科動物種に特有の伸張したＣＤＲ３ループの存在または不在に対する依存性はない。ＶＨドメインはモノマーとして抗原と結合することが可能である。可溶性重鎖のみ抗体複合体の一部として発現された場合に、ＶＬドメインとの組換えの可能性は、ＣＨ１エキソンの除去により排除されている（［２５］参照）。
【００７８】
ＶＨドメインは、単独で、多様なタンパク質ドメインと遺伝子操作されて、例えば毒素、酵素および造影剤を含む、標的とされる治療および診断目的のための融合タンパク質を生成することもできる。
【００７９】
ＶＨドメインコード配列は、天然の供給源から誘導されてもよいし、それらは当業者の熟知の方法を用いて合成されてもよい。
【００８０】
ＶＨドメインの性質は、必要とされる特徴を有する配列をコードするＶ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントを選択するかまたは操作することにより変更または改良することができる。上記に示されるように、３９個の機能性ヒトＶＨ領域の一部は重鎖のみ抗体の産生に適していない可能性がある。様々な抗体特性を改良しようと試みて多数の研究が先行技術において行われた［２６，２９］。特定のＶＨ領域特性に関して、Ｄｏｌｋ ｅｔ ａｌ．［３０］は、ファージディスプレイ技術を用いて、フケ予防シャンプーに伴う厳しい条件下において改良された安定性を示す、重鎖のみ抗体を生成した。
【００８１】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、好ましくは、げっ歯類、例えば、ウサギ、モルモット、ラットまたはマウスである。マウスが特に好ましい。代わりとなる哺乳類、例えばヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌまたはその他の動物を用いてもよい。好ましくは、哺乳類はマウスである。
【００８２】
好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、確立された卵母細胞注射技術のみを用いて作製される。確立されていれば、ＥＳ細胞技術またはクローニングを用いてもよい。
【００８３】
有利には、哺乳類に内在する抗体の重鎖遺伝子座および場合により軽鎖遺伝子座は、重鎖のみ抗体が本発明の方法に従って発現される場合に、削除されるか抑制される（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）。
【００８４】
抗体の供給源とは異なる起源の脊椎動物の種への抗体の投与は、しばしば投与された抗体に対する免疫応答の発現をもたらすので、本発明の上記の態様に記載される重鎖のみ抗体を生成する方法は、ヒトの治療用途のための抗体の生成において特に有用であり得る。本発明に従って生成される抗体は、それらが実質的に単一または既知のクラスの抗体であり、好ましくは、ヒト起源であるという点で、先行技術のそれに優る利点を有する。抗体は、インビボでのＶＤＪ組換えと親和性成熟の組合せにより高親和性である。
【００８５】
従って、本発明のさらなる態様は、上記により定義された複数の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を含むヒトを除くトランスジェニック哺乳類を提供する。好ましくは、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類は、軽鎖を含む抗体を産生する能力が低下するように遺伝子操作されてよい。
【００８６】
抗体産生細胞は、本明細書に定義されるヒトを除くトランスジェニック哺乳類から誘導され、例えば、本明細書に定義される重鎖のみ抗体の産生のためのハイブリドーマの調製に使用されてよい。それに加えて、またあるいは、核酸配列をこれらのヒトを除くトランスジェニック哺乳類から単離し、当業者の熟知な組換えＤＮＡ技法を用いてＶＨドメイン重鎖のみ抗体またはその二重特異性／二機能性複合体を生成するために用いてよい。
【００８７】
あるいは、またはそれに加えて、抗原特異的な重鎖のみ抗体は、本明細書に定義されるヒトを除くトランスジェニック哺乳類の免疫化によって生成されてよい。
【００８８】
従って、本発明はまた、上に定義されるヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫することによる、重鎖のみ抗体の産生のための方法を提供する。抗体およびその断片は、当業者に公知の確立された方法を用いて単離され、特性決定され、製造されてよい。これらの抗体は、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２９２号に記載される方法に特に役立つ。
【００８９】
本発明を、これから一例として、以下の図を参照する以下の詳細な説明において説明する。
〔実施例〕
【００９０】
実施例１−重鎖のみ抗体遺伝子座はマウスにおいて完全に機能性であり、対立遺伝子排除に対して感受性である。
【００９１】
上記に考察されるように、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．［１５］は、トランスジェニックマウスにおける重鎖のみ抗体の誘導のための方法を開発した。本方法および本明細書に記載される実験のさらなる詳細に関して、当業者は、参照により本明細書に組み込まれるＪａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．［１５］を参照されたい。１
＜方法＞
・構築物
ゲノムコスミドライブラリーを、標準法を用いてラマ（Ｌａｍａ Ｇｌａｍａ）の末梢血細胞から作成した。２つの異なる生殖細胞系列ＶＨＨを、それらの配列、停止コドンを含まないオープンリーディングフレームおよびルフランの番号付け［３２］に従う４２、５０および５２位の親水性のアミノ酸コドンの存在、ならびに４９位に親水性のアミノ酸を含むものと含まないものに基づいて選択した。一方はＩＧＨＶ１Ｓ１（受託番号ＡＦ３０５９４４）と同一であり、もう一方はＩＧＨＶ１Ｓ３（受託番号ＡＦ３０５９４６）と９４％の同一性を有する。２つのクローン（ヒト重鎖ＤおよびＪ領域、ＣμおよびＣδを含有するクローン１０６５Ｎ８ならびにＣγ３遺伝子を含有するクローン１１１５ Ｎ１５）をヒトゲノムＰａｃライブラリーＲＰＣＩ−１１（ＢＡＣＰＡＣ Ｒｅｃｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＳＡ）から選択した。異なるヒトゲノムライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＢａｃクローン１１７７１をＣγ２遺伝子およびＩｇ重鎖ＬＣＲの供給源として用いた［３３］。標準技法を用いて、Ｃγ３およびＣγ２遺伝子を別々にｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。単一の点突然変異（Ｇ〜Ａ）［３４］またはＣＨ１エキソンの完全な欠失を相同組換えにより達成した［３５］。同様にｆｒｔおよびｌｏｘＰ部位をＣμスイッチ領域の前に導入し、２番目のｌｏｘＰ部位をＣγ２スイッチ領域の前に設置し、ＭＧＳまたはＭＧΔを得た。
【００９２】
ＧＳまたはＧΔ構築物を得るために、ＭＧＳまたはＭＧΔベクター（図１）、２つのラマＶＨＨ遺伝子、その後にヒトＤおよびＪ重鎖領域、Ｃμ、Ｃδならびに修飾されたヒトＣγ２およびＣγ３遺伝子および３’ＬＣＲを含有し、１６個の２９４Ｃｒｅ大腸菌株４４に形質転換し、ｃｒｅに媒介される組換えによってＧＳまたはＧΔ遺伝子座を得た（図１）。相同組換えによるＣμＣＨ１領域の欠失によりＭＧΔからＭΔＧΔを得た。
・トランスジェニックマウスの生成、育種および遺伝子型同定
２２０ＫｂのＭＧＳまたはＭＧΔまたはＭΔＧΔ断片、１５０ＫｂのＧＳまたはＧΔ断片（図１）をベクター配列から精製し、受精したＦＶＢ Ｘ Ｂ１６／μＭＴ−／−卵の前核に２ｎｇ／μｌの濃度で注入した。５’および３’末端プローブを用いる尾由来ＤＮＡのサザンブロット分析により、トランスジェニック遺伝子座を、完全性およびコピーの数についてチェックした。トランスジェニックμＭＴ＋／−樹立系統をμＭＴ−／−バックグラウンドの系統として育種した。以下のプライマー：Ａｓｐ５ＩｇＭｆｗ：５’−ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＣＴＣ−３’（配列番号１）と、ＨＬＬ−ＭＤには、Ａｓｐ３’ＩｇＧ２ｒｖ：５’−ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２）の組合せ、または、ＭＧＳには、Ａｓｐ３’ＩｇＭｒｖ：５’−ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣ−３’（配列番号３）の組合せ、およびμＭＴ遺伝子型には、ＭＩＧＭＥＭＢＩＮＴＲＯＮ１：ｆｗ：５’−ＣＣＡＧＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＣＧＣＴＡＡＧＡＴＴＣ−３’（配列番号４）とＭＩＧＭＥＭＢＥＸＯＮ１ｒｖ：５’−ＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号５）の組合せを用いるＰＣＲ（９４℃にて４５秒間の変性、６０℃にて３０秒間のアニーリングおよび７２℃にて１分４０秒間の伸張で３０サイクル）により遺伝子型同定を行った。
・ＲＴ−ＰＣＲ
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ＲＮＡ単離系統（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。以下のプライマー：ＬＶＨＨｆｗ：５’−ＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号６）と、ＨＩＮＧＥＩｇＧ２ｒｖ：５’ＣＡＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣ−３’（配列番号７）またはｈＩｇＭＣＨ２ｒｖ：ＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣ−３’（配列番号８）の組み合わせを用いてＰＣＲを行った。増幅は、９４℃にて３０秒間の変性、６０℃にて３０秒間のアニーリングおよび７２℃にて１分間の伸張で３０サイクル間であった。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、Ｔ７またはＳＰ６プライマーを用いて配列決定した。
・フローサイトメトリー分析：
単細胞懸濁液を、既に記載したようにＰＢＳ中のリンパ器官から調製した４５。約１×１０６個の細胞を、９６ウェルプレート中のＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中の抗体を用いて４℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡで２回洗浄した。それぞれのサンプルについて、ＦＡＣＳｃａｎアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて３×１０４イベントが記録された。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔバージョン１．０コンピュータソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで四色分析を行った。使用した大部分の抗体は記載されている［３６］；ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧおよび抗ヒトＩｇＭはＳｉｇｍａ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ＮＬ）より購入した。
・Ｉｇ遺伝子再構成分析
ｗｔマウスＭΔＧΔおよびＧΔトランスジェニックマウスの脾臓および肝臓から単細胞懸濁液を作成した。ＭＡＣＳ ＣＤ４５（Ｂ２２０）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＡｕｔｏｍａｃｓセパレーターで製造業者の説明書に従って用いて 約９０％の純度までＢ細胞を確実に選択した［３７］。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩ消化させ、Ｈｙｂｏｎｄナイロンフィルター上でブロットした。３２Ｐ放射標識されたＪκプローブ（Ｊκ１およびＪκ５領域のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅より入手）および３２Ｐ放射標識された炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）プローブを用いてフィルターをハイブリダイズした。肝臓ＤＮＡを流してκ生殖細胞系列の構成シグナルを示した（２．８Ｋｂバンド）。４ｋｂバンドとハイブリダイズするＣＡＩＩプローブを負荷対照として用いた。Ｔｙｆｏｏｎ９２００（Ａｍｅｒｓｃｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフィルターを走査した。生殖細胞系Ｊκバンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ５．２ソフトウェアを用いて定量し、負荷対照のそれに正規化し、対照肝臓ＤＮＡ（１００％とする）の割合で表した。異なる再構成イベントの増幅のためのハイブリドーマ由来のゲノムＤＮＡで使用されるＰＣＲプライマーは次の通りであった、
ＩＧＨＪｌＲ：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号９）、
ＩＧＨＪ２Ｒ：５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１０）、
ＩＧＨＪ３Ｒ：５’−ＧＧＣＣＣＣＡＧＡＹＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＴ−３’（配列番号１１）、
ＩＧＨＪ４Ｒ：５’−ＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴ−３’（配列番号１２）、
ＩＧＨＪ５Ｒ：５’−ＣＣＣＡＧＧＲＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１３）、
ＩＧＨＪ６Ｒ：５’−ＣＣＡＧＡＡＣＧＴＣＣＡＴＲＹＭＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号１４）。
・ＤＮＡ ＦＩＳＨ分析
標的ＤＮＡの調製：モノクローナルハイブリドーマ細胞をＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中で培養し、Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ［３８］に記載されるようにアガロースに包埋した。ＧΔトランスジェニック系統１のマウス由来の肺を収集し、単細胞懸濁液を作った。包埋した細胞をプロテイナーゼＫおよびリボヌクレアーゼＨで処理した。機械的に伸張されたＤＮＡを、ポリ−Ｌ−リシンスライド（Ｓｉｇｍａ）上で電子レンジと別のスライドの端を用いて調製した。
【００９３】
プローブ：ＧΔ導入遺伝子の再構成されたコピーおよび再構成されなかったコピーを検出するため、ＤＮＡ断片を精製した。ＶＨＨとＤの間の領域のハイブリダイズ用に２．３ｋＢ ＳｐｅＩおよび３．６ｋＢ ＳｐｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片、およびＬＣＲ検出用に５．９ｋＢ ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片またはＩｇＨ３’ＬＣＲ（１６ｋＢ）を含有する低コピー数のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド。ニックトランスレーションによりビオチン−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）またはジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）でプローブを標識した。プローブをピペットでスライドの上に移す前に、９０℃にて５分間、氷上で５分間、および３７℃にて４５分間でそれらを変性させた。インサイチューハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーション混合物は５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、サケ精子ＤＮＡ（２００ｎｇ／μｌ）、５×デンハート液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有した。プローブのハイブリダイゼーションは、ピペットで２５μｌの混合物をスライド上に移し、２４×３２ｍｍのカバーガラスで覆うことにより行われる。プローブおよび標的配列を変性させるため、スライドを８０℃の加温板の上に２分間置いた。プローブは加湿チャンバー（加湿剤は５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣである）中で３７℃にて一晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、記載される通り行った［３９］。
【００９４】
ハプテン標識されたプローブの免疫学的検出：ジゴキシゲニンプローブを、ヒツジ抗ジゴキシゲニン（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、フルオレセイン結合ウサギ抗ヒツジ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、およびフルオレセイン結合ヤギ抗ウサギ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。ビオチンプローブは、テキサスレッド結合アビジン（１：５００、Ｓｉｇｍａ）およびビオチン結合ヤギ抗アビジン（１：５００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて検出した。この段階を２回繰り返した。全てのインキュベーションおよび洗浄は記載される通り行った４８。染色の後、スライドを段階的な一連のエタノール（７０、９０、および１００％）中で段階ごとに５分間室温にて脱水した。細胞またはＤＮＡを２５μｌの抗退色性包埋剤Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に包埋した。１００倍対物レンズを用いるＬｅｉｃａ ＤＭＲＢＥ 蛍光顕微鏡で視覚化を行った。
・免疫化およびハイブリドーマ作成
８週齢のマウスを、Ｓｐｅｃｏｌアジュバント（ＩＤＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄｔ，ＮＬ）または事前処方ＤＫＴＰワクチンを含む５〜２０μｇの抗原で０、１４、２８、４２日に皮下注射し、５０日に腹腔内注射して免疫した。０、１４および４５日に採血した。５６日にＣｌｏｎａｌＣｅｌｌＴＭＨＹキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｎａｄａ）を製造業者の説明書に従って用いて、脾臓細胞をＳｐ２−Ｏ−Ａｇｌ４骨髄腫細胞株（Ｒ．Ｈａｐｅｒｅｎより寄贈）と融合させた。ＤＫＴＰワクチンはＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，ＮＬ）より得られた。
・ｓｄＡＢライブラリーの構築およびスクリーニング
Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ＲＮＡ単離系統（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＫＴＰ免疫単一コピーＧΔおよびＴＮＦα免疫ＭΔＧΔマウスの脾臓から全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて作成した。ＶＨＨＤＪ断片をコードするＤＮＡ断片を、特異的プライマー：ｖｈ１ ｂａｃｋ Ｓｆｉ Ｉプライマー［４０〜４２］を、ｈＩｇＧ２ｈｉｎｇｒｅｖプライマー（５’−ＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣ−３’（配列番号１５））またはＣＨ２ｈｕＩｇＭｒｅｖプライマー（５’−ＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡＡＴ−３’（配列番号１６））と組み合せたものを用いてＰＣＲにより増幅させた。増幅したＶＨＨＤＪ（約４００ｂｐ）をＳｆｉ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化させ、ゲル精製し、Ｓｆｉ Ｉ／ＮｏｔＩ消化ファージミドｐＨＥＮ由来ベクターにクローニングした。ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）への形質転換により、ヒト単一のドメイン抗体ライブラリーが得られた。プラスチック（希釈されていないワクチンをコートしたイムノチューブ）に吸着させたＤＫＴＰワクチン抗原または精製されたヒトＴＮＦα（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＳＡ）へのパニングを用いて、２ラウンドの選択を行った。
・免疫細胞化学およびウエスタンブロット
ｒｔＴＡの存在に応答するマーカープラスミドでトランスフェクトされたｔｅｔ−ｏｎ細胞系統の細胞をスライド上で増殖させた。ドキシサイクリン誘導の２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳに固定し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００／ＰＢＳで透過処理した。ｒｔＴＡに対するＨＣＡｂを１：５０希釈して使用し、その後ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＩＴＣ染色（Ｓｉｇｍａ，１：５００希釈）に使用した。マーカータンパク質を前記に記載したように検出した５１。ウエスタンブロットは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ，１／２５００希釈）、ヒトＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ，１／２５００希釈）を用いる標準法であった。
・Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲル濾過
２００ｍＭ ＫＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．９／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／０．５ｍＭ ＥＧＴＡ／２０％グリセロールで平衡したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／３０カラムを備えるＡＫＴＡ ＦＰＬＣ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いて、ＭΔＧΔマウス血清およびヒト対照血清のサイズ分画を行った。１００μｌ／分の流量を用いて、５００μｌの画分を回収し、１００％トリクロロ酢酸でで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）に続いてウエスタンブロット免疫ブロット法により解析した。
・ＢＩＡｃｏｒｅ測定
実験は、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にて行った。製造業者の提供する標準的なＮＨＳ−ＥＤＣキットを用いて３０００共鳴単位（ＲＵ、任意の結合応答単位）のレベルまでＣＭ５センサーチップ上に精製タンパク質を固定化した。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０中、４０マイクログラム／ｍｌの一定の流速で抗体を固定化抗原に通過させた。製造業者のＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて平衡時の応答を記録し、カーブフィッティングを使用して平衡解離定数を得た。
＜結果＞
・ラクダ科動物様ＣＨ１スプライス変異は、ヒト重鎖遺伝子座におけるエキソンスキッピングには不十分である。
【００９５】
ラクダ科動物におけるＨＣＡｂ（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３）の生成にＩｇＭ＋中間段階が必要かどうかは不明である。そのため、本発明者らは、まず、μＭＴバックグラウンドにおいて２つのハイブリッドヒト遺伝子座、１つはヒトＣμ、Ｃδ、Ｃγ２およびＣγ３定常領域を有する遺伝子座（ＭＧＳ）、およびもう１つはヒトＣγ２およびＣγ３しか有さない１つの遺伝子座（図１）を生成した［４３］。そのＣγ領域に、まず、ラクダ科動物ＣＨ１スプライス変異を含有するように突然変異を起こさせた。μ鎖遺伝子の膜貫通ドメイン欠失によりＢ細胞がほぼ完全に欠けているμＭＴ動物［４３］がやはりＢ細胞小集団を有し、膜ＩｇＭの不在下で機能性ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを産生することが証明され［４４〜４６］、（一部の）Ｂ細胞はＩｇＭの表面発現なしに成長することが示唆されていることから、ＭＧＳを作製した。ＶＨ溶解度を向上させるためにヒトＶＨドメインを突然変異させる［４７、４８］代わりに、ラマ起源の２つのＶＨＨを導入した。ラクダ科動物ＶＨＨ領域は、４２位、４９位、５０位および５２位に特徴的なアミノ酸を含有する［４９］。第１の、ＶＨＨ１は、これらのＶＨＨに特徴的なアミノ酸の全てを含有したが、基礎実験のこの証明における溶解度の重要性を検証するために、もう１つの、ＶＨＨ２では、４９位のＧｌｕ（Ｅ）の代わりに、これらの重大な「溶解」アミノ酸の１つであるＧｌｎ（Ｑ）を欠失させた。本発明者らは、さらに軽鎖可変部（ＶＬ）対合２１に重要であると考えられることから、５０位（Ａｒｇ、Ｒ）ではなく４９位を選択した。前記遺伝子座は、５つのヒト重鎖ＤおよびＪ領域の全ておよびその遺伝子座の３’末端に遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）も含有した（図８）。驚くべきことに、スプライス変異によりトランスジェニックマウスに正しいＣＨ１エキソンスキッピングは起こらず、ヒトＩｇ発現の欠如につながらなかった（図８）。
・ＣＨ１領域を欠くヒト遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスの解析
ＣＨ１のスプライシング問題を克服するために、本発明者らは３種類の新規構築物を生成した（図１）。全てがＣＨ１を欠失させたＣγ２およびＣγ３を含有し、１つはＣμおよびＣδを含むもの（ＭＧΔ）であり、１つはＣμおよびＣδを含まないもの（ＧΔ）であり、１つはＣＨ１を欠失させたＣμセグメントを有するもの（ＭΔＧΔ）であった。μＭＴバックグラウンドにおいて、異なるコピー数（１〜５コピー）の３つのＭＧΔ、６つのＧΔおよび４つのＭΔＧΔトランスジェニックマウス系統を得た。骨髄（ＢＭ）および脾臓においてＢ細胞の成長を解析した。異なるコピー数のマウスで同じ結果を得た。
・ＧΔおよびＭΔＧΔの発現はμＭＴマウスにおけるＢ細胞の成長を救済する
ＭＧΔマウスはμＭＴバックグラウンドにおいてＢ細胞の成長を救済することができなかったが、一方、ＧΔおよびＭΔＧΔ構築物はＢ細胞の成長を効果的に救済した。Ｂ２２０／ＣＤ１９陽性細胞の救済は、異なるリンパ系コンパートメントにおいて、コピー数に関係なく、３０〜１００％間であった（図２Ａ）。これは、Ｂ２２０対ヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＧ染色を用いたＢＭのフローサイトメトリーによって確認される（図２Ｂ）。ＭΔＧΔマウスは、野生型またはμＭＴマウスに存在しないヒトＩｇＭ産生細胞をＢＭにおいて含有する。従って、これらの細胞は、これらの細胞がヒトＩｇＧを含有しないように、クラススイッチを受けなかった。ＧΔマウスはヒトＩｇＧ発現Ｂ細胞だけを含む。ＭＧΔマウスは、細胞表面でヒトＩｇを発現するＢ細胞を含有するとしても非常に少なく、興味深いことに、Ｂ２２０細胞の一部は細胞内ＩｇＭを発現するが、ＩｇＧは発現しない（図２Ｂ）。ＭΔＧΔおよびＧΔマウス（下記参照）とは対照的に、ＭＧΔマウスはマウスＩｇ軽鎖を発現する（図６Ｇ）。これらの結果は、異なる構築物中でＣμおよびＣγ遺伝子が発現されることを示し、ＣＨ１が存在しないことがＶＨＨに基づく抗体の細胞表面発現にとって重大であることが強く示唆される。
・ヒトＨＣＡｂ ＩｇＧおよびＩｇＭはＢＭでのＢ細胞の成長中にマウス（プレ）ＢＣＲに機能的に置き換わる
小型静止プレＢ細胞への大循環の発展進行中、特異的細胞表面マーカーの発現はプレＢＣＲ依存的にダウンレギュレートされる［３６］。プレＢＣＲに機能的に置き換わるヒトＨＣＡｂの能力を調査するために、様々なマーカーの発現をＦＡＣＳにより解析した。プロＢ細胞は、高レベルの細胞質ＳＬＣ、ＩＬ−７ＲおよびＣＤ４３を発現するが、これらはプレＢＣＲ発現時にダウンレギュレートされ、成熟Ｂ細胞では存在しない（図２Ｃ、μＭＴマウスからのプロＢ細胞、ｗｔマウスの表面ＩｇＭ−プロＢ／プレＢ細胞画分および表面ＩｇＭ＋Ｂ細胞画分と比較）。
【００９６】
ＭΔＧΔ／μＭＴまたはＧΔ／μＭＴマウスのヒトＩｇ＋Ｂ細胞はＳＬＣおよびＩＬ−７Ｒレベルが低く、これにより、ヒト単鎖ＩｇＧおよびＩｇＭ受容体は、ＳＬＣおよびＩＬ−７ＲのダウンレギュレーションにおいてマウスプレＢＣＲに機能的に置き換わることが示される。ＣＤ４３では、これはＧΔマウスにおける場合のみのようであるが、ＭΔＧΔマウスにおけるＣＤ４３発現の持続はこれらのマウスにおけるＢ−１ Ｂ細胞分化の増加という知見に関連があるかもしれない。同様に、正常なプレＢＣＲシグナル伝達のように、ＣＤ２およびＭＨＣクラスＩＩ発現が誘導される。プレＢ細胞段階で一過性に誘導されたＩＬ−２Ｒ／ＣＤ２５のレベルは、成熟ＭΔＧΔまたはＧΔ／μＭＴ Ｂ細胞では非常に低く、成熟ｗｔ Ｂ細胞のレベルと同程度である（図２Ｃ）。さらに、ｉｃ Ｉｇκ発現は成熟ＭΔＧΔまたはＧΔ／μＭＴ Ｂ細胞では検出できず（図２Ｃ）、ＩＬ−７＋培養物から５日後のＩＬ−７除去時にはインビトロＢＭ培養物においても誘導されていなかった（図なし）。最後に、ＭΔＧΔまたはＧΔトランスジェニックマウスにおけるヒトＨＣＡｂ発現Ｂ細胞集団は、ＢＭで生成された細胞（ＨＳＡｈｉｇｈおよびＡＡ４．１／ＣＤ９３ｈｉｇｈ）から部分的になり、末梢で成熟し、再循環している細胞（ＨＳＡｌｏｗおよびＣＤ９３ｌｏｗ）から部分的になり、正常マウスでの結果と同様であった。
【００９７】
まとめると、これらの結果は、ヒトＨＣＡｂのＩｇＧおよびＩｇＭが、発達上調節されるマーカーの発現に関して、Ｂ細胞の成長中にマウス（プレ）ＢＣＲに機能的に置き換わることを示す。ＩｇのＬ鎖は誘導されない（下記参照）。ＢＭ ＲＮＡのｃＤＮＡ解析は、ＶＤＪ組換えのための両方のＶＨＨセグメントの使用、ＣＨ１の不在、そして重要なことにＣＤＲ３領域の大きな多様性を示している（図２Ｄ）。
・複数の再配列および対立遺伝子排除
免疫後、ＭΔＧΔおよびＧΔ系統から、特に５コピーＧΔ系統１で多数のハイブリドーマを作製した（下記参照）。配列解析により、多コピーＧΔ遺伝子座において１つ以上の再配列が起こり得ることが示された。解析した５つの異なる５コピーハイブリドーマのうち、１つのハイブリドーマ（Ｇ２０）はフレーム内にある１つのコピーを再配列し；２つのハイブリドーマ（Ｔ７およびＴ１２）は各々２つの再配列を有し、そのうちの１つの再配列は両方のハイブリドーマにおいてフレーム外であり；１つのハイブリドーマ（Ｔ３）は２つのフレーム内再配列（Ｊ２およびＪ４）を有し；一方、１つのハイブリドーマ（Ｔ１）はフレーム内の２つの再配列（Ｊ２およびＪ４）を含む４つの再配列を有した。
【００９８】
Ｔ１およびＴ３は２つの生産的ｍＲＮＡを発現し、それらは分泌された抗体の質量分析によりｃＤＮＡと正確にマッチさせて確認された（図なし）。本発明者らは、２つの異なるハイブリドーマ：Ｇ２０（１つの再配列）およびＴ１（４つの再配列）において、それぞれのコピーを検出するＬＣＲプローブと、再配列されていないコピーだけを検出する、ＶＨＨおよびＤセグメントの間に位置するプローブとを用いて、ＤＮＡ伸張線維ＦＩＳＨおよび標準的なＤＮＡ−ＦＩＳＨも行った（図３Ａ〜Ｅ）。対照肺細胞は、サザンブロットマッピング（図なし）に一致して、一方の末端に５つの完全なコピーと半分の導入遺伝子を示したが（図３Ａ）、一方、ハイブリドーマではＧ２０およびＴ１それぞれにおいて１つおよび４つの再配列されたコピーを確かに示している（図３Ｂ、Ｃ〜Ｅ）。従って、複数のコピーは同じ対立遺伝子上でうまく再配列することができる。次に、本発明者らは、ＨＣＡｂ遺伝子座に、正常なマウス遺伝子座に対する（不）利点があるかどうか、そして遺伝子座の対立遺伝子排除が起こっているかどうかを求めた。ｗｔバックグラウンドにおけるＧΔ系統１トランスジェニックマウスのＢ２２０／ＣＤ１９陽性ＢＭ細胞をヒトＩｇＧおよびマウスＩｇＭの発現について解析した。明らかに、ＧΔＢ細胞はマウスＩｇまたはヒトＩｇのいずれかを発現し（図３Ｆ）、対立遺伝子排除を示している。
・ＧΔ、ＭΔＧΔおよびＭＧΔトランスジェニックマウスにおける脾臓Ｂ細胞
導入遺伝子がμＭＴマウスにおけるＢ細胞分化に与える影響を評価するために、本発明者らはＣＤ２１／ＣＤ２３プロフィールを用いてフローサイトメトリーにより脾臓Ｂ細胞亜集団サイズを調べた（図４Ａ）。ＧΔマウスでは、ＣＤ２１ｌｏｗＣＤ２３ｌｏｗ未成熟Ｂ細胞の割合は正常な範囲にあり、ヒト単鎖ＩｇＧ発現細胞は濾胞（ＦＯ；ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）Ｂ細胞へも辺縁帯（ＭＺ；ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ）Ｂ細胞へも分化し得た。ＭΔＧΔマウスでは、未成熟Ｂ細胞画分が増加し、ＨＣＡｂ−ＩｇＭ発現細胞のＦＯおよびＭＺ−８ Ｂ細胞への分化がいくらか損なうことを示している。これらの脾臓では、ＣＤ２３発現の減少は、Ｂ−１ Ｂ細胞系統への分化を示す、ＣＤ４３およびＣＤ５の表面発現レベルの増加を伴っていた。ＭＧΔトランスジェニックマウスに存在する少数のヒトＩｇＭ発現Ｂ細胞（マウス軽鎖も発現する、図６参照）は、ＭΔＧΔトランスジェニックマウスにおけるものと同様のＦＯ／ＭＺ分布を現した。ＭＧΔマウスは違うが、ＭΔＧΔおよびＧΔマウスは、正常な脾臓構造を有し、白脾髄の外側境界に存在する濾胞および辺縁帯を含有するＢ細胞リッチな領域で囲まれた動脈周囲リンパ球鞘（ＰＡＬＳ）に集中しているＴ細胞の分離を示す（図４Ｂ）。
【００９９】
それらはまた、Ｔ細胞依存性抗体応答中のｗｔに匹敵する、二次リンパ組織のＢ細胞濾胞胚中心を形成する（図なし）。これらは、記憶形成と、体細胞超変異に起因する親和性に基づく選択の部位である。ＧΔマウスでは、これらの胚中心においてヒトＩｇＧ陽性細胞が検出される。本発明者らは、ヒトＩｇＧ遺伝子の超突然変異を、パイエル板（Ｐａｙｅｒ′ｓ ｐａｔｃｈｅｓ）に存在するＢ細胞のｃＤＮＡ解析により確認した（図４Ｃ）。ＶＨＨ１およびＶＨＨ２の両方を使用する。総合すれば、これらの発見により、ＧΔおよびＭΔＧΔトランスジェニックマウスにおいて、ＢＭから移動する未成熟Ｂ細胞は、脾臓においてＦＯ−Ｂ細胞およびＭＺ−Ｂ細胞の両方へと分化し、抗原曝露後に体細胞超変異を受ける能力を有することが実証される。
・単一コピー遺伝子座は効果的に救済し、ＣＨ１の不在が必須である
ＧΔ系統１マウス（図２Ａ）は５コピーのＧΔ遺伝子座を含有するため、従って効果的な救済が遺伝子座のコピー数と関係がある可能性があった。しかし、５コピーＧΔ系統１からＦｌｐｅＲ系統２３との交配によるＦｌｐ組換えにより得られた単一コピートランスジェニック系統は、Ｂ細胞の成長を同程度まで救済した（図４Ｄ、図２Ａ）。単一コピーの遺伝子座は救済に十分であり、そしてＣＨ１領域を含むＣμ定常領域の存在が阻害性であることを、非救済単一コピー系統ＭＧΔ（系統３）から、単一コピーＧΔ系統をもたらすＣｒｅ組換え（ｃｒｅ発現系統への品種改良）によりＣμおよびＣδ領域を欠失させることによって確認した（図４Ｄ）。それまで非救済であった遺伝子座はその時点で他のＧΔ系統と同じＢ細胞の成長９を与える。従って、コピー数は救済に影響を及ぼさず、Ｃμ領域にＣＨ１が存在することによりＢ細胞救済が阻害される（下記も参照）。
・ＭΔＧΔおよびＧΔトランスジェニックマウスにおいてマウスＩｇ軽鎖遺伝子座は再配列しない
マウスＩｇ軽鎖タンパク質はＭΔＧΔおよびＧΔマウスでは血清のウエスタンブロット（図なし、図２Ｃおよび６Ａ参照）によってまたはＦＡＣＳによって検出されず、マウス軽鎖遺伝子が再配列しないことが示唆された。これは、サザンブロット解析により選別された脾臓Ｂ２２０＋細胞画分および肝臓細胞のＤＮＡにおけるＩｇκ遺伝子座生殖細胞系列シグナルの密度を比較することによって確認され（図５ＡおよびＢ）、これによりマウス軽鎖は再配列せず、生殖細胞系列構成を保つことが示される。対照的に、ＭＧΔ／μＭＴマウスの少数のヒトＩｇ発現細胞において軽鎖が検出される（図６Ｇ参照）。
【０１００】
従って、ＢＭでの初期Ｂ細胞の成長におけるヒトＨＣＡｂの発現は軽鎖再配列を導くシグナルを与えることができない。これに関連して、ＨＣＡｂはプレＢＣＲよりもむしろＢＣＲによく似ており、このことはＨＣＡｂがＣＨ１の不在下で擬似軽鎖と結合できなかったことと関係があると考えられる［６１］。
・ＧΔ／μＭＴおよびＭΔＧΔ／μＭＴマウスの血清分析
ヒトＩｇＭはＭΔＧΔ血清に存在し、ヒトＩｇＧはＭΔＧΔマウス血清およびＧΔマウス血清の両方に存在した。免疫されていない成体動物では、ヒトＩｇＭ（＜５０μｇ／ｍｌ）およびＩｇＧ（２００〜１０００μｇ／ｍｌ）は、正常ヒトＩｇＨ遺伝子座を有する正常マウスまたはトランスジェニックマウスに見られるものと同様のレベルで存在する［６５］。６種全てのＧΔマウスの血清のゲル電気泳動では、非還元性条件下で約７０ｋＤ、還元性条件下で約３５ｋＤのＭＷを有するＨＣＡｂのＩｇＧが現われ、軽鎖を欠く重鎖二量体とＣＨ１エキソンを欠く各重鎖と一致した（図６Ａ、Ｂ）。
【０１０１】
ＭΔＧΔマウスの血清は、多量体重鎖のみのヒトＩｇＭを含有した。還元性条件下（図６Ｃ）では、４種全ての系統が、ＣＨ１のＭＷを減じた後にヒト対照ＩｇＭとしてのＭＷを有するＩｇＭ鎖を含有した。また、血清を非還元性条件下でも分画した（図６Ｄ、横方向の画分）後、それぞれの画分１０を還元性条件下でゲル電気泳動により解析した（図６Ｄ、縦方向のレーン）。９００ｋＤのヒト血清五量体ＩｇＭ対照と比較すると、トランスジェニックＩｇＭは６００ｋＤで分別され、それが多量体であること、ならびに軽鎖およびＣＨ１を欠くことに一致する。従って、ＭΔＧΔマウスはＨＣＡｂ多量体ＩｇＭおよび二量体ＩｇＧを産生するが、一方、ＧΔは血清中で二量体ＩｇＧを産生する。
・ＭＧΔマウスの血清分析
ＭＧΔ／μＭＴ系統の末梢および脾臓では、Ｂ２２０陽性細胞はほとんど見られず（野生型の１％未満）、極まれに小さなＢ細胞集団が脾臓において見られる（図４Ｂ）。精製後にのみ血清中に少量のヒトＩｇＭおよびＩｇＧが検出された（図６Ｅ、Ｆ）。これらのマウスにおけるヒトＩｇＭは、還元性条件下では通常のサイズであったが、一方、循環しているヒトＩｇＧはより短く（ＣＨ１の欠失に一致する、見かけのＭＷは３５ｋＤ）。興味深いことに、ヒトＩｇＭと結合していると思われるマウスκ軽鎖も検出された（図６Ｇ）。
【０１０２】
ヒトＩｇＭおよびＩｇＧは定量ＥＬＩＳＡアッセイでの検出レベルを下回っていたが、本発明者らは、それにもかかわらず、ＭＧΔ／μＭＴマウスが免疫化に応答し得るかどうかを検証した。マウスをヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）で免疫し、ｗｔマウスは強いＴＮＦ−α特異的抗体応答を発現したが、一方、用いた２種のＭＧΔ系統の３匹のマウスにおいては、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット解析によって抗原特異的ヒトＩｇＧを検出することができなかった（図なし）。
・ＭΔＧΔおよびＧΔマウスの免疫化は抗原特異的Ａｂ産生をもたらす
ＧΔ／μＭＴマウスを大腸菌ｈｓｐ７０、ＤＫＴＰ（ジフテリア毒素、百日咳菌の全細胞溶解物、破傷風毒素ならびに不活化ポリオウイルス１型、２型および３型）およびｒｔＴＡで免疫し［５０］、一方、ＭΔＧΔマウスをヒトＴＮＦαで免疫した。ＥＬＩＳＡで陽性であった血清を有するマウスから、ファージディスプレイライブラリーによりハイブリドーマまたは単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）を用いて個々の完全抗体を単離した。
【０１０３】
抗体ＲＮＡのＲＴＰＣＲ後にαｈｓｐ７０特異的、破傷風毒素特異的およびｒｔＴＡ特異的モノクローナルを配列決定した（図７Ａ）。これにより、ＩｇＧ２（８つのうちの７つ）およびＩｇＧ３（８つのうちの１つ）抗体の両方が産生されることが示された（ｓｄＡｂはＩｇＧ２ライブラリーから単離した）。異なるＤおよびＪ領域を使用した。高頻度ではないが、１１のＨＣＡｂのＶＨＨは超突然変異を受けていた。３つのｈＴＮＦα特異的抗体（１つは陽性ＩｇＭハイブリドーマ、図６α−ｈＴＮＦα＃１および２つはｓｄＡｂα−ｈＴＮＦα＃２＆３）は全て、ＣＤＲ２領域に異なる超突然変異を有した。１４全ての抗体の配列を比較すると、全てのＪ領域が用いられているものの、ヒトと同じようにＪＨ４が最もよく用いられていることが明らかであった。驚くべきことに、全ての抗体はラマＶＨＨ２（４９位に典型なグルタミン酸ではなくグルタミン（Ｑ）を有する［５１］）を含有した。最後に、ＣＤＲ３領域が多様性の大部分をもたらしていることは明らかである２７。それは、ラマおよびヒトにおいて通常見られるものと非常に類似している、１０〜２０アミノ酸長の間で変化する（平均は１３．６ａａ）［５２、５３］。本発明者らは、次に、これらのＨＣＡｂが常用アッセイにおいてハイブリドーマ上清および細菌原形質周辺画分のｓｄＡｂとして機能するかどうかを検証した（図７）。ＥＬＩＳＡアッセイでは抗体の全てが陽性であり、ウエスタンブロットでの抗原検出でも全てが陽性であった（例えばα−ＤＫＴＰおよびα−ｒｔＴＡ血清とハイブリドーマ培地とα百日咳菌ｓｄＡｂ、図７Ｂ）。また、本発明者らは、ｒｔＴＡ発現プラスミドでトランスフェクトした細胞系統を用いて免疫細胞化学によりα−ｒｔＴＡ ＩｇＧも検証した（図７Ｃ、Ｄ）。ｒｔＴＡ ＨＣ−ＩｇＧは極めてはっきりとした特異的な核染色を示した。多数の抗体の親和性は高かったが、一部のもの（特にｓｄＡｂ）ではかなり低かった。例えば、免疫細胞化学に用いたα−ｒｔＴＡ抗体（図７Ｃ、Ｄ）は、ＢｉａＣｏｒｅで決定されるように約３ｎＭであった（図７Ｅ）。
＜結論＞
本明細書において、本発明者らは、μＭＴマウスにおけるＢ細胞の成長を救済し、結果的に機能性ＨＣＡｂ産生をもたらす修飾ＨＣＡｂ遺伝子座の発現を報告した。これらのマウスを免疫して、抗原特異的ＨＣＡｂを産生させることができる。ラクダ科動物の場合、ＨＣＡｂの分泌にはＣＨ１の除去が不可欠であるが、ＣＨ１の排除には３’ＣＨ１／イントロン境界における単一ラクダ科動物（総説３０）スプライス変異では不十分であり、従って少なくともヒト遺伝子座において、単にこの単一点突然変異以上のものが必要である。ＣＨ１をＶＨＨとともに有するＩｇＭはＢ細胞の成長を妨げるが、これは恐らく、プレＢＣＲとの関連でＩｇＭ表面分子の効果のない会合に起因する。対照的に、ＨＣＤ様ヒトμタンパク質を発現するマウスは、λ５とは無関係にＳＣＩＤバックグラウンドにおいて正常ＣＤ４３プレＢ細胞を生じる［５４］。末端切断型Ｃμタンパク質は、関連Ｌ鎖なしにＢ細胞表面で発現され、自己会合を介してシグナル伝達するプレＢＣＲによく似ていると考えられる［５５］。
【０１０４】
通常、ＢｉＰシャペロンは、後に鎖間接触に関与するＩｇ鎖の疎水性表面と結合することによって抗体分子の折り畳みおよび会合を監視している３１。ＶＨＨのＦＲ２に親水性アミノ酸が存在することによって、ＶＨＨとのＢｉＰの結合がほぼ確実に阻止され、この場合には可溶性にする（代理）軽鎖は必要でない。同時に、ＣＨ１は、会合（軽鎖によるＢｉＰの置換）が完了するまでＥＲに重鎖を保持するとされているＢｉＰとの相互作用をもたらす。本発明者らの結果は、プレＢ細胞受容体レベルでは、λ５タンパク質との非共有結合における代理軽鎖（ＳＬＣ）の一部としてのＶｐｒｅタンパク質とのトランスジェニックμ重鎖対合は、ＣＨ１ドメインを含有するμ重鎖がＶＨＨと結合されている場合には起こるのができないことを示唆している。そのため、ＭＧＳおよびＭＧΔトランスジェニックマウスにおけるヒトＩｇＭは、この点で、増殖展開および発展進行をシグナル伝達するために不十分であることが公知である不完全プレＢＣＲ様複合体に似ている［５６、５７］。これにより、ＢＭではＢ２２０陽性細胞の３０％しか細胞内ＩｇＭを有さない理由を説明することができる（図２Ｂ）。これらのマウスの脾臓に少数の成熟Ｂ細胞が存在することは、μ重鎖を含有するが任意のＳＬＣまたは通常の軽鎖が欠失している最近記載された新規な受容体複合体によって説明する［５８］。
【０１０５】
ＣＨ１がＣγ２および３に存在せず、ＩｇＭがその遺伝子座から除去されている場合には、Ｂ細胞の成長の救済が起こり、ＩｇＧがＩｇＭに機能的に置き換わることが示される。Ｒａｇ２−／−マウスにおける成熟ＣＤ２１＋Ｂ細胞の成長の支援において、プロＢ細胞段階以降に発現されるＩｇＧ１受容体をＩｇＭの代わりにすることができる［５９］。最近、事前に再配列したラクダ科動物ＩｇＧ２ａがμＭＴ（およびＣΔ−／−）バックグラウンドの２匹のトランスジェニックマウスのうちの１匹においてＢ細胞の成長を部分的に救済することができるということも示された１３。本発明者らの場合では、ＣＨ１を欠くＩｇＭまたはＩｇＧは１０種の独立したトランスジェニックマウス系統のうちの１０種においてＢ細胞の成長を救済する。さらに、本発明者らは軽鎖再配列を観察しておらず、さらなるＢ細胞分化に軽鎖発現は必要でないと結論づけられる。本明細書で得られた結果とＺｏｕ ｅｔ ａｌ．の結果［６０］における相違は、ＬＣＲが本発明者らの構築物に含まれていることによる重鎖遺伝子座の発現レベル（すなわちシグナル伝達）によって説明することができる。本発明者らの結果は、ＣＨ１［６１］またはＶＨおよびＣＨ１［６２］を欠く末端切断型μ重鎖タンパク質が、ＳＬＣと結合することができず、κ遺伝子再配列を活性化することができないことを裏付ける。
【０１０６】
５コピーＧΔ系統１（および他の多コピー系統）は、ゲノムの同じ位置に組み込まれた単一コピー系統と同じ程度までＢ細胞の成長を救済する。興味深いことに、多コピートランスジェニック遺伝子座では１以上の再配列が起こる（図３）。２種の単一脾細胞由来のハイブリドーマの２つは、２種の生産的ＨＣＡｂ転写物およびタンパク質をもたらした。この結果は、同じＢ細胞における２種の抗体の発現は無害であることを裏付けている［６３］。しかし、二重抗体産生Ｂ細胞は抗原曝露下で単一抗体産生細胞との競争に敗れるという予測３７は、抗原曝露後に得られた５つのハイブリドーマから２種の二重抗体発現細胞を見出した本発明者らの結果からは実証されない。
【０１０７】
ＢＭ細胞は細胞表面でマウスまたはヒトＩｇを発現するため、野生型マウスにおいて（多コピーの）遺伝子座は対立遺伝子排除を受けやすい。細胞表面で両方を発現する細胞の有意な集団はない（図３Ｆ、上のパネル）。恐らく最も興味深いのは、マウスＩｇおよびヒトＩｇを発現している細胞の数の対比である。ｗｔ／５コピーＧΔマウスでは、再配列に利用できる３つの可能性ある対立遺伝子、１つのＩｇ遺伝子座を有する２つのマウス対立遺伝子および５つのヒトＨＣＡｂ遺伝子座を有する１つの対立遺伝子が存在する。確率的に選択されるならば、ヒト対立遺伝子は３回のうち１回しか選択されない。
【０１０８】
遺伝子座の数を計数すれば、ヒト遺伝子座はまず７細胞のうち５細胞で再配列する。しかし、内因性マウスおよびトランスジェニックヒトＨＣＡｂはほぼ同等に発現される（４４／３８、図３Ｆ 下のパネル）。これらの数はＶ領域のランダム使用によって起こり得るずれやトランスジェニック遺伝子座における位置効果の可能性を無視しているが、最初の選択が対立遺伝子の確率的選択であり、続いて１対立遺伝子につき複数の遺伝子の再配列が行われ得ることを強く示唆している。
【０１０９】
これは、本発明者らがＧΔ遺伝子座の複数の再配列を頻繁に観察しているという事実と一致する。通常、生産的再配列は組換えをダウンレギュレートして、他の対立遺伝子の再配列を妨げる。しかし、トランスジェニック対立遺伝子における複数のコピーは同じオープンな遺伝子座に存在し、ＲＡＧダウンレギュレーション前に組み換えられる。これは、複数の再配列が同時に起こるためであるか、または空間要素（「コンパートメント」）を含むならば、ＲＡＧがダウンレギュレートされる前に接近していれば遺伝子座の別の遺伝子を再配列する十分な時間があり得る。
【０１１０】
ｗｔマウスにおいて再配列が生産的ではない（シグナル伝達はなく、ＲＡＧはとどまる）場合に限り、第２の遺伝子座が活性化され、第１の遺伝子座に置き換わり、再配列されるための十分な時間がある。この論証を支持して、同じ染色体上に複数の遺伝子座を有する他の種には、２つのＡｂを発現する、より多くの細胞が存在するという見解が生じる［６４］。
【０１１１】
重要なことには、これらの試験によってＨＣＡｂ遺伝子座はマウスにおける発現に成功し得ることが分かる。抗原曝露は、遺伝子座の構成によって異なるクラスの高親和性抗原特異的ヒトＨＣＡｂの産生をもたらす。これらの抗体は、正常マウスまたは他の「正常」なヒトＩｇＨトランスジェニックマウスでのレベルと同様のレベルで発現される［６５］。本発明者らの実験では２つの可変領域だけを使用したが、本発明者らが検証した無関係なタンパク質のほぼ全てに対して様々な特異性を有する高親和性抗体の単離に成功し、ＣＤＲ３によってもたらされる多様性の効率および有効性を立証した［６６］。従って、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えおよびインビボ選択を行うことは、ファージディスプレイを用いたファージミドライブラリーからのヒト単鎖抗体断片の作製に対して非常に重要な利点をもたらす３９。ハイブリドーマは容易に生成することができ、このことによって、重要なことに、ファージディスプレイやさらなるスクリーニングの必要なく、完全ヒトＨＣＡｂまたはｓｄＡｂ断片の直接クローニングおよび発現を可能にする。
【０１１２】
従って、これらのマウスは、特にＨＣＡｂが通常の抗体、例えば酵素の活性部位に対してほとんど抗原性がないエピトープを認識し得るという証拠４に照らして、臨床目的またはその他の目的でのヒトＨＣＡｂの産生に関して全く新しい可能性を広げる。抗原の全てが認識されるわけではないことの理由は、限られた数の可変領域によって説明することができる（ポリオおよびジフテリアタンパク質はＧΔマウスでは応答をもたらさなかったが、一方、ｗｔ対照マウスでは応答がもたらされた）。驚くべきことに、抗体の全てがラマＶＨＨ２領域を有した。これには、４９位に保存アミノ酸［６７］が含まれず、それを有し、溶解性がより高いはずであるＶＨＨ１とは対照的である。
【０１１３】
それでもなお、本発明者らは、遺伝子座により多くの可変領域を追加することによっていっそう広範囲にわたるレパートリーをもたらすものと予測する。単一対立遺伝子上では複数のコピーの遺伝子座を避けることが好ましいが、多様性を高めるために異なるＶＨ領域の単一コピーをそれぞれが含む複対立遺伝子を含むマウスを生成することが有利。そのような新しい遺伝子座では、通常発生する（ヒト）ＶＨ領域または溶解度１８および軽鎖対合を高めるために操作されたＶＨ領域のいずれかを使用することができる。
【０１１４】
結論として、本発明者らは、潜在的に任意のクラスの抗原特異的高親和性ＨＣＡｂがマウスで産生され得ることを立証した。この技術は、人における治療薬または診断薬として使用するための、抗原曝露に応答する任意のクラスの完全ヒトＨＣＡｂまたはそれらの断片の生成を可能にする。また、異なる脊椎動物遺伝子座を用いることによって、本発明者らの技術は、試薬、診断法として使用するための、または動物の治療のための任意の脊椎動物由来の高親和性成熟抗体の産生を可能にする。
【実施例１】
【０１１５】
Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、トランスジェニックＶＨ遺伝子座が遺伝子導入によってコードされた重鎖のみ抗体を産生するように正確に再結合していること、そしてそのような遺伝子座は内因性（マウス）重鎖免疫グロブリン遺伝子座の存在下で対立遺伝子排除に対して感受性があることを示した。対立遺伝子排除プロセスを用いることによって、重鎖のみ抗体産生に使用されるＶＨトランスジェニック遺伝子座の数を増加させることができるということを示すために、異なる重鎖のみの遺伝子座を含む２匹のトランスジェニックマウスを交配させ、結果として両方の遺伝子座を含む子孫を得た。一方のマウスはＭＧΔ遺伝子座を含有した（ＩｇＭおよびＩｇＧ遺伝子座、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６）が、もう一方のマウスはＧΔ遺伝子座（ＩｇＧ遺伝子座単独、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を含有し、両方のマウスはμＭＴバックグラウンドを有するものであった。ダブルトランスジェニック子孫のＢ細胞からハイブリドーマを誘導し、標準的な方法によって培養下で増殖させた。多数の得られた個々のモノクローナル細胞系統をＰＣＲおよびサザンブロットによって解析し、それによって生産的に再配列されたＭＧΔ遺伝子座を含有する系統が、再配列されていないＧΔまたは生産的に再配列されていないＧΔ遺伝子座を含むことが示された。逆に、生産的に再配列されたＧΔ遺伝子座を含有する細胞系統は、再配列されていないまたは生産的に再配列されていないＭＧΔ遺伝子座を含有した。このように、利用できるＶＨ領域の合計が組換えプロセスに使用される。
＜実施例３および４＞
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、前の実施例に記載される、当技術分野で公知の方法（Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ ２００６）を用いて、機能性ヒトＶＨ領域全数を、ヒトＶＨ領域（またはそれらの変異体）を、全ＤＨ領域、全ＪＨ領域ならびにＣμ、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣα領域と３’ＬＣＲの組合せを含む複数の修飾ヒト遺伝子座にクローニングすることによって増加させる。この手順は、独立した遺伝子座の複数の同一ＶＨ領域または独立した遺伝子座の異なるＶＨ領域を用いて行うことができる。異なる遺伝子座は同一重鎖領域または異なる重鎖領域を含有し得る。実施例３は、重鎖領域の異なる組合せを有する遺伝子座の同一ＶＨ領域を有する遺伝子座に関し、実施例４は同一重鎖定常領域と異なるＶＨ領域を有する２つの遺伝子座に関する。両実施例において、さらに遺伝子座を追加してよいことは明らかである。
【実施例２】
【０１１６】
ヒトＶＨ領域は、可能性ある３９個の機能性ヒトＶＨ領域（あるいはヒトＶＬ領域またはＴＣＲのＶ領域または突然変異誘発によって得られるこれらの全ての変異体を使用または追加してよい）の中から選択されたそれぞれのＶＨに特異的なプライマーを用いたヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離する。ヒトＶＨ領域は、前記実施例に記載した、すなわちヒトＤＨおよびＪＨ（または他のＤおよびＪ領域）とそれぞれＣＨ１および３’ＬＣＲが欠失しているＣμ、Ｃγ２、Ｃγ３を含む遺伝子座にセットでクローニングされる（図９）。ＣＨ１およびスイッチ領域が欠失しているＣα領域はＧΔ遺伝子座に別個にクローニングされる（図１０）。このＧΔ遺伝子座は、ｌｏｘ部位を含有せず、ラマＶＨＨ領域が標準的な相同組換えによって除去されて、特異ＰＩ−ＰｓｐＩ部位を残している（図１０）という点から原型遺伝子座の変異体である。
【０１１７】
機能性ＶＨ領域は、各遺伝子座の任意の複数に関して同時にクローニングすることができる。最初に、１７個の機能性ヒトＶＨ領域を、クローニングされた２個の遺伝子を１セットで同時にクローニングする。これらの最初の構築物のそれぞれに、第２のセットを従来の方法（例えばＸｈｏＩ−ＳａｌＩ制限消化／連結を用いて、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ適合部位の連結により両方を破壊する）により追加する。４、４、４、３および２個の遺伝子を含有するセットがＢＡＣベクター中の１７個の遺伝子の１セットに連結される。この手法は、他の数の遺伝子を含有するセットを組み合わせることによって行ってよいことは明らかである。前記方法は、所望の数のＶＨ領域を得る任意の時点で終了してよく、またはより多数のＶＨ領域を得るために延長してよい。
【０１１８】
１セット全て（例えば１７個の遺伝子）を特異ＰＩ−ＰｓｐＩ部位の修飾ＧΔ遺伝子座にクローニングする。Ｃα領域はこの遺伝子座のＩ−ＣｅｕＩ部位にクローニングされ、結果としてＩｇαおよびＩｇＧを産生可能なＡΔＧΔ遺伝子座が生じる（図１０）。また、他の重鎖領域もクローニングすることができた。
【０１１９】
これらの最終的な遺伝子座は、その後、前記実施例に記載されている独立したトランスジェニックマウス（好ましくは、μＭＴなどのＩｇＨ遺伝子座欠損マウス）に導入される。これらの独立した遺伝子座は、独立したマウス系統、ＩｇＧだけを作製する系統ならびにＩｇＡおよび／またはＩｇＧを作製する系統を生成するために用いられる。これらのマウスは、続いて、２つの異なる遺伝子座から３４個のＶＨ領域を提供できるようにＶＨ領域全体を有するように交配される。これらのマウスを両方の遺伝子座に関してホモ接合性になるように交配することによって、組換えに利用できる６８個のＶＨ領域が作製されることになる。組み込まれた遺伝子座の複数のコピーを有することによって、この数はいっそうさらに増加する。これらのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマの解析は、生産的に再配列された遺伝子座が存在する場合に、作り出された他の遺伝子座が、標準的な手法による対立遺伝子排除の結果、再配列されていないかまたは生産的に再配列されていないことを示すために利用される。
【実施例３】
【０１２０】
前記領域（または突然変異誘発によって得られたそれらの変異体）に対して同様に単離された１以上のＶＨ領域の異なるセットを、前記と同じ方法により２つの独立した遺伝子座にクローニングする。これは結果として２つの異なるＧΔ遺伝子座（またはそれらの変異体、例えばＣαが追加されたもの）をもたらすことになる。これらの遺伝子座は、独立したマウスに導入されて、独立したトランスジェニック系統（例えばそれぞれ１０個のＶＨドメインを有する２つの遺伝子座、図１１）をもたらす。これらのマウスは、その後、組換えプロセスに利用できる全ての使用ＶＨ領域を有するダブルトランスジェニックマウスを得るために交配されることになる。これらのマウスを両方の遺伝子座に関してホモ接合性なるように交配することによって、組換えに利用できるＶＨ領域の数が倍増することになる（図１２、染色体１に組み込まれた１つの遺伝子座と染色体８上の１つの遺伝子座に関するカリオグラム）。組み込まれた遺伝子座の複数のコピーを有することによって、この数はいっそうさらに増加する。これらのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマの解析は、生産的に再配列された遺伝子座が存在する場合に、作り出された他の遺伝子座が、対立遺伝子排除の結果、再配列されていないかまたは生産的に再配列されていないということを示すために利用される。
【０１２１】
前記プロセスは、所望の数のＶＨ領域を得る任意の時点で終了してよい。これらのＶＨ領域にＤ、ＪＨおよび定常領域が追加される。これらの最終遺伝子座は、その後、前記実施例に記載されている独立したトランスジェニックマウス（好ましくは、ＩｇＨ遺伝子座欠損マウスを含む）に導入され得る。あるいは、ｌｏｘ部位の位置により、Ｃμ（ＩｇＭ）単独、またはＣγ２およびＣγ３（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３）単独、またはＣα単独（ＩｇＡ）またはそれらの組合せを含有する独立した遺伝子座を生成するための個々の定常領域の排除が可能となる。これらの独立した遺伝子座は、ヒトＩｇＭ単独、またはＩｇＧ単独またはＩｇＡ単独またはそれらの組合せのいずれかを作製する独立したマウス系統を生成するために用いられる。
［参考文献］
【０１２２】
【表２Ａ】
【０１２３】
【表２Ｂ】
【０１２４】
【表２Ｃ】
【０１２５】
【表２Ｄ】
【０１２６】
【表２Ｅ】
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】トランスジェニックマウスを生成するために使用されたＤＮＡ断片の模式図である。２つのラマＶＨＨエキソンは、ヒト重鎖多様性（Ｄ）および結合（Ｊ）遺伝子セグメントと連結され、その後にＣμ、Ｃδ、Ｃγ２およびＣγ３ヒト定常領域遺伝子およびヒト重鎖Ｉｇ３’ＬＣＲが続く。ヒトＣγ２およびＣγ３遺伝子は、構築物ＭＧΔおよびＧΔ中のＣγ２およびＣγ３遺伝子からの、または同様に構築物ＭΔＧΔ中のＣμからのＣＨ１エキソンの完全な欠失により修飾されていた。２つのＬｏｘＰ位（赤色）が同じ方向に存在することにより、Ｃｒｅに媒介される組換えの際、ＣμおよびＣδ遺伝子の除去が可能になる。Ｆｒｔ位（緑色）が存在することにより、Ｆｌｐに媒介される組換えによる、複数コピー導入遺伝子アレイからの単一コピートランスジェニックマウスの生成が可能になる。
【図２】パネルＡ：異なる器官における総細胞のうちのＢ２２０／ＣＤ１９陽性細胞の百分率として表されたＢリンパ球のフローサイトメトリー分析の表である。パネルＢ：ＢＭ中のｗｔ、μＭＴ、ＭＧΔ／μＭＴ、ＭΔＧΔ／μＭＴおよびＧΔ／μＭＴマウスのＢ細胞集団のフローサイトメトリー分析。Ｂ２２０の前方および側方散乱ならびに表面発現に基づいてリンパ球系統細胞をゲートし、ヒトＩｇＭまたはＩｇＧをプロットした。データはドットプロットとして表示される。ＭＧΔμＭＴマウスについて、Ｂ２２０＋画分をゲートして細胞内（ｉｃ）ヒトＩｇμおよびγＨ鎖の発現について分析し、ヒストグラムオーバーレイ（赤色線）として、一緒にμＭＴマウス由来のＢ２２０＋細胞のバックグラウンド染色（黒色線）を対照として表示した。陽性細胞の百分率が示されている。パネルＣ：ＭΔＧΔまたはＧΔ導入遺伝子の発現は、プレＢＣＲおよびＢＣＲの機能を救済する。μＭＴマウス由来の総ＣＤ１９＋画分（プロＢ細胞）、野生型マウス由来のＣＤ１９＋表面ＩｇＭ＋画分（プロＢ／プレＢ細胞）およびＣＤ１９＋表面ＩｇＭ＋画分（Ｂ細胞）、ＭΔ−ＧΔμＭＴマウス由来のＣＤ１９＋表面ヒトＩｇＭ＋画分（Ｂ細胞）およびＧΔμＭＴマウス由来のＣＤ１９＋表面ヒトＩｇＧ＋画分（Ｂ細胞）において示されたマーカーの発現プロフィール。ｉｃ−Ｉｇκ＝細胞内ＩｇκＬ鎖。フローサイトメトリーデータはヒストグラムとして表示される。示されるデータは、各群内で試験された３〜８匹の動物の代表である。パネルＤ：ＶＨＨ１およびＶＨＨ２特異的プライマーをヒトＣγ２プライマーと組合せて用いてＢＭ ｃＤＮＡから得た、ＰＣＲ産物の配列アラインメント、ＶＤＪ組換えを示す。配列はＧΔに由来する。緑色は配列同一性を示す。
【図３】パネルＡ〜Ｅ：５つのコピーのヒトＧΔ遺伝子座のＤＮＡ−ＦＩＳＨ。パネルＡ：その半分をＬＣＲ（赤色）を含む遺伝子座に、その半分をＶＨＨからＪ領域（緑色）を有する遺伝子座に隣接されている５つのインタクトなＧΔ遺伝子座のコピー（１〜５）を有するＧΔ系統１トランスジェニックマウスの肺細胞由来の伸張されたクロマチン線維。パネルＢ：１つのコピーが再構成されている（白色矢印）ＧΔ系統１のＢ細胞に由来するハイブリドーマ（Ｇ２０）の伸張されたクロマチン線維ＦＩＳＨ。パネルＣ：ＬＣＲプローブを用いるハイブリドーマＴ１の伸張されていないＤＮＡ−ＦＩＳＨ（赤色）。パネルＤ：ＶＨＨ〜Ｄ間のプローブを用い、Ｃと同内容（緑色）。パネルＥ：パネルＣとＥのオーバーレイ。赤色シグナルの喪失がないのに対し、４つの緑色シグナルの喪失が見られることから、Ｔ１が４つの再構成を有することに留意されたい。パネルＦ：ＧΔトランスジェニックマウスにおいて対立遺伝子が排除されている。マウス表面または細胞内（ｉｃ）μＨ鎖および示されるマウス由来の総ＢＭ ＣＤ１９＋細胞画分上のトランスジェニックヒトＩｇＧのフローサイトメトリー分析。データはドットプロットとして表示され、示される象限内の細胞の百分率が示される。示されるデータは、各群内で試験された４匹のマウスの代表的なデータである。
【図４】ｗｔ、μＭＴ、ＧΔ、ＭΔＧΔおよびＭＧΔマウスの脾臓のＢ細胞集団の分析を示す図である。示されるデータは、各群内で試験された４〜８匹のマウスの代表的なデータである。パネルＡ：上側、Ｂ２２０に対してマウスＩｇＭ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭについて染色された脾臓細胞のＦＡＣＳデータ。下側、脾臓のＢ細胞集団のフローサイトメトリー分析。Ｂ２２０の前方および側方散乱ならびに表面発現に基づいてリンパ球系統細胞をゲートし、示されたＩｇ（上部）またはＣＤ２１／ＣＤ２３プロフィールはドットプロットとして示され、示されたゲート内の細胞の百分率が示される。ＣＤ２１ｌｏｗＣＤ２３ｌｏｗ：未熟Ｂ細胞；ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋：濾胞性Ｂ細胞；ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗ：辺縁帯Ｂ細胞。パネルＢ：ｗｔ、μＭＴ、ＧΔ／μＭＴ、ＭΔＧΔ／μＭＴおよびＭＧΔ／μＭＴマウスの脾臓の組織像。免疫組織化学分析；５μｍの凍結切片を、Ｂ細胞には抗Ｂ２２０（青色）で、樹状細胞には抗ＣＤ１１ｃ／Ｎ４１８（茶色）で染色した。矢印は、ＭＧΔ脾臓におけるＢ細胞の小さなクラスターの位置を示す。パネルＣ：ＶＨＨ１およびＶＨＨ２特異的プライマーをヒトＣγ２プライマーと組合せて用いてパイエル板ｃＤＮＡから得たＰＣＲ産物の配列アラインメント、トランスジェニック遺伝子座がＣＤＲ１および２領域で超突然変異を受けることを示す。配列は、ＣＨ１の欠失しているトランスジェニック遺伝子座ＧΔに由来する。パネルＤ：上側；脾臓細胞のＦＡＣＳデータ、抗ＣＤ１９および抗Ｂ２２０で染色。下側左：ＦｌｐｅＲトランスジェニック系統に交配することによるインビボＦｌｐ組換えの模式図、および５つのコピーＧΔ系統１に由来する単一コピー組換え型の脾臓細胞に関するＦＡＣＳデータ。下側右：ＭＧΔ系統をＣＡＧＣｒｅトランスジェニック系統に交配することによるインビボＣｒｅ組換えの模式図、組換え型の脾臓細胞に関するＦＡＣＳスキャンデータを支持し、直接生成した元のＧΔ系統に見られるようなＢ細胞の救済を示す。
【図５】ＧΔ／μＭＴ（パネルＡ）およびＭΔＧΔ／μＭＴ（パネルＢ）トランスジェニック系統においてκ軽鎖再構成が行われないことを示すサザンブロットを示す図である。１匹のｗｔマウスおよび２匹のＧΔまたは４匹のＭΔＧΔトランスジェニックマウス由来の肝臓ＤＮＡ（Ｌ）およびＢ細胞ＤＮＡ（Ｂ）をＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、３２Ｐ放射標識されたＪκプローブおよび炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）プローブを用いて分析した。４ｋｂバンドにハイブリダイズするＣＡＩＩプローブを泳動対照として用いた。肝臓ＤＮＡを流してκ生殖細胞系列の配置を示した（２．８Ｋｂバンド）。ｗｔＢ細胞だけが、２．８ｋｂ断片の強度の低下で測定されるκ遺伝子座の再構成を示す（肝臓と比較するとシグナルの３０％が残る）。
【図６】μＭＴバックグラウンドにおいて非還元条件下（Ａ）および還元条件下（Ｂ〜Ｇ）、６種類の異なるＧΔ系統（Ａ、Ｂ）、４種類の異なるＭΔＧΔ系統（Ｃ）および２種類の異なるＭＧΔ系統（Ｅ〜Ｇ）の、Ｐｒｏｔ Ｇまたはコンカバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）精製された血清サンプルを泳動した。トランスジェニックヒトＩｇＧ（パネルＢ、Ｆ）およびＩｇＭ（パネルＣ、Ｄ）のサイズはＣＨ１欠失と一致し、軽鎖が存在しない。マウスκ軽鎖は正常なサイズであった（Ｇ）。ヒト血清を陽性対照として用いた。パネルＤ：非還元条件下でヒトＩｇＭ対照に混合後のＭΔＧΔ血清のＳｕｐｅｒｏｓｅ６サイズ分画。それぞれの画分を還元条件下でゲル電気泳動により分析した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムから回収された画分は左（高ＭＷ）から右（低ＭＷ）である。対照は、ヒト血清単独（第１レーン左）およびヒトＩｇＭ対照血清（レーンＭΔＧΔ血清）に混合する前のマウス血清である。サイズマーカーが示される。
【図７】パネルＡ：破傷風毒素；ＨＳＰ７０、ｒｔＴＡおよびヒトＴＮＦαに特異的なモノクローナル抗体ｃＤＮＡの配列。上の配列は生殖細胞系列ＶＨＨ２配列である。ＣＤＲ１、２および３ならびにヒンジ領域が配列の上に示されている。異なるアイソタイプおよびクラスは右側に異なる色で示されている。用いられるＪ領域は右側に示されている。パネルＢ：異なる重鎖のみ抗体（ハイブリドーマ、血清およびｓｄＡｂ）を用いるウエスタンブロットの例。左側のパネル、それぞれ１／１００および１／２５０希釈された、抗ｒｔＴＡ血清およびハイブリドーマ培地。中央のパネル、それぞれ１／２００および１／１００希釈された、ｗｔおよびＧΔマウス由来の抗ＤＫＴＰ血清。右側のパネル、百日咳菌抗原（ＤＫＴＰ）を含むかまたはそれを欠く（ＤＴＰ、本発明者らは精製された百日咳菌抗原を購入することができなかったため）ワクチンに対する抗百日咳菌ｓｄＡｂ。パネルＣおよびＤ：細胞質においてマーカータンパク質を発現することによりｒｔＴＡの存在に応答するマーカープラスミドを追加的にトランスフェクトされたＴｅｔ−ｏｎ細胞系統の１つの免疫染色５１。パネルＣは、ｒｔＴＡを発現している核を示す（緑色）。パネルＤは、ｒｔＴＡに応答した細胞質中のマーカータンパク質のドキシサイクリン誘導発現（赤色）、および細胞のＤＡＰＩでの核染色（青色）を示す。パネルＥ：抗ｒｔＴＡ抗体のＢｉａＣｏｒｅ分析の例。親和性が示されている。
【図８】パネルＡ：ラクダ科動物様スプライス変異を含むＩｇ遺伝子座の概略図である。２つのヒトＩｇＧ定常領域（Ｃγ２およびＣγ３）を、まず、Ｇγ２−ＳおよびＧγ３−Ｓで表されるラクダ科動物ＩｇＧ ＨＣＡｂｓ５においてＣＨ１エキソンのスキッピングをもたらすと考えられるＧ＋１〜Ａ＋１のスプライスを変更することにより変異させた。遺伝子座は、２つのラマＶＨＨ領域、全てのヒトＤおよびＪＨ領域ならびにヒトＣμ、ＣδおよびＣγ２およびＣγ３およびＬＣＲを含有した（明細書本文も参照のこと）。これらの遺伝子座をμＭＴトランスジェニックマウスに導入し、ヒト遺伝子座の発現について分析した。パネルＢ：ＧＳマウス由来の骨髄（ＢＭ）ヒトＩｇＧｃＤＮＡの配列決定から、両方のＶＨＨが異なるヒトＤおよびＪセグメントと組み換えられ、Ｃγ２定常領域で転写されることが示された。しかし、ＣＨ１エキソンは、まだ最後の１６ｂｐを残して存在し、それを切り出した。進行中であるが、イントロン１の４位におけるＡ〜Ｇの移行に起因する、ＣＨ１エキソンの同じ潜在スプライス部位が白血病患者において報告された［３１］。ＭＧＳまたはＧＳ系統のいずれもμＭＴマウスにおいてＢ細胞の成長を救済しなかった（図なし）。マウスのＢ細胞転写／翻訳機構は再構成されたヒトコブラクダＶＨＨ−γ２ａをプロセシングすることができるが［３４、６０］、本発明者らのデータは、Ｇ〜Ａ突然変異に加えて、その他の特徴がＣＨ１エキソンスキッピングに重要であることを示す。
【図９】実施例３および４に説明される様々な遺伝子座でのヒトＶＨ領域のクローニングの模式図である。
【図１０】複数のＶＨ遺伝子セグメント、全Ｄ領域、全ＪＨ領域、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣｘ領域および３’ＬＣＲを含む重鎖遺伝子座の例を示す図である。
【図１１】複数のＶＨ遺伝子セグメント、全Ｄ領域、全ＪＨ領域、Ｃγ２、Ｃγ３およびＣｘ領域および３’ＬＣＲを含む重鎖遺伝子座の例を示す図である。
【図１２】染色体１に組み込まれた１つの遺伝子座と染色体８に組み込まれた１つの遺伝子座を含むカリオグラムを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異種ＶＨ重鎖遺伝子座を哺乳類に供与するステップを含み、各ＶＨ重鎖遺伝子座が、１つ以上のＶ遺伝子セグメントと、１つ以上のＤ遺伝子セグメントと、１つ以上のＪ遺伝子セグメントと、発現されたときにＣＨ１ドメインを含まずに前記遺伝子座の少なくとも１つからＶＨ重鎖のみ抗体を発現する重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントとを含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類におけるＶＨ重鎖のみ抗体の産生方法。
【請求項２】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が１つ以上のＶ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各遺伝子座がＶ遺伝子セグメントのみを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各Ｖ遺伝子セグメントが、他の全てのＶ遺伝子セグメントと異なっている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
各Ｖ遺伝子セグメントが他の全てのＶ遺伝子セグメントと同一である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントが他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと同じである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントが他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと異なる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
各遺伝子座が複数のＶ遺伝子セグメントを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントが全て同じ種の生物に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントが異なる種の生物に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｖ遺伝子セグメントがヒト起源のものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
複数の重鎖遺伝子座が、複数の遺伝子座に分散された、改良された溶解度特性を有する３９個の機能性ヒトＶ遺伝子セグメントおよび操作された前記ヒトＶ遺伝子セグメントの変異体のうちの、任意の数または任意の組合せを含む、請求項１〜４および８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
各異なる重鎖遺伝子座がヒトを除くトランスジェニック哺乳類のゲノム中の単一コピーとして存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が１〜４０個のＤ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｄ遺伝子セグメントがヒトＤ遺伝子セグメントである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
それぞれのＶＨ重鎖遺伝子座が１〜２０個のＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｊ遺伝子セグメントがヒトＪ遺伝子セグメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が同一のＤおよびＪ遺伝子セグメントを含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの異なる組合せを含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が１個以上のＶ遺伝子セグメント、２５個の機能性ヒトＤ遺伝子セグメントおよび６個のヒトＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が、インビボでエフェクター機能をもたらす少なくとも１つの重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含み、定常領域は、発現されたときに、抗体中にＣＨ１ドメインを含まない、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
各遺伝子座が、１つの特定の定常領域をコードする遺伝子セグメントを１つのみ含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
各遺伝子座が、それぞれ異なる定常領域をコードする、１個よりも多くの遺伝子セグメントを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
各遺伝子座が、同一の定常領域をコードする遺伝子セグメントを含有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
各遺伝子座が、異なる定常領域コード遺伝子セグメントまたは定常領域コード遺伝子セグメントの異なる組合せを有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
重鎖定常領域をコードする各遺伝子セグメントが、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、ＣεまたはＣα１−２クラスの１個以上の重鎖定常領域エキソンを含むが、但し重鎖定常領域遺伝子セグメントがＣＨ１ドメインを発現しない、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
重鎖定常領域がヒト起源のものである、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における２以上の異種のＶＨ重鎖遺伝子座が同一の染色体上に直列に存在する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における１つ以上の異種のＶＨ重鎖遺伝子座が異なる染色体上に存在する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類がげっ歯類である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
げっ歯類がマウスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の複数の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類。
【請求項３３】
請求項３２に記載のヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫することによる、重鎖のみ抗体の産生方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載のヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫するステップと、
Ｂ細胞ハイブリドーマを生成するステップと、
抗原特異的な重鎖のみ抗体を発現している細胞を選択するステップと、
抗原特異的な組換え親和性成熟ＶＨ重鎖のみ抗体を単離するステップと
を含む、高親和性の抗原特異的ＶＨ重鎖のみ抗体の産生方法。
【請求項１】
複数の異種ＶＨ重鎖遺伝子座を哺乳類に供与するステップを含み、各ＶＨ重鎖遺伝子座が、１つ以上のＶ遺伝子セグメントと、１つ以上のＤ遺伝子セグメントと、１つ以上のＪ遺伝子セグメントと、発現されたときにＣＨ１ドメインを含まずに前記遺伝子座の少なくとも１つからＶＨ重鎖のみ抗体を発現する重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントとを含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類におけるＶＨ重鎖のみ抗体の産生方法。
【請求項２】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が１つ以上のＶ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各遺伝子座がＶ遺伝子セグメントのみを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各Ｖ遺伝子セグメントが、他の全てのＶ遺伝子セグメントと異なっている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
各Ｖ遺伝子セグメントが他の全てのＶ遺伝子セグメントと同一である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントが他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと同じである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
各遺伝子座中の残りの遺伝子セグメントが他の全ての遺伝子座中の遺伝子セグメントと異なる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
各遺伝子座が複数のＶ遺伝子セグメントを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントが全て同じ種の生物に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
任意の１つの遺伝子座中のＶ遺伝子セグメントが異なる種の生物に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｖ遺伝子セグメントがヒト起源のものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
複数の重鎖遺伝子座が、複数の遺伝子座に分散された、改良された溶解度特性を有する３９個の機能性ヒトＶ遺伝子セグメントおよび操作された前記ヒトＶ遺伝子セグメントの変異体のうちの、任意の数または任意の組合せを含む、請求項１〜４および８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
各異なる重鎖遺伝子座がヒトを除くトランスジェニック哺乳類のゲノム中の単一コピーとして存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が１〜４０個のＤ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｄ遺伝子セグメントがヒトＤ遺伝子セグメントである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
それぞれのＶＨ重鎖遺伝子座が１〜２０個のＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｊ遺伝子セグメントがヒトＪ遺伝子セグメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が同一のＤおよびＪ遺伝子セグメントを含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの異なる組合せを含有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が１個以上のＶ遺伝子セグメント、２５個の機能性ヒトＤ遺伝子セグメントおよび６個のヒトＪ遺伝子セグメントを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
各ＶＨ重鎖遺伝子座が、インビボでエフェクター機能をもたらす少なくとも１つの重鎖定常領域をコードする遺伝子セグメントを含み、定常領域は、発現されたときに、抗体中にＣＨ１ドメインを含まない、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
各遺伝子座が、１つの特定の定常領域をコードする遺伝子セグメントを１つのみ含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
各遺伝子座が、それぞれ異なる定常領域をコードする、１個よりも多くの遺伝子セグメントを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
各遺伝子座が、同一の定常領域をコードする遺伝子セグメントを含有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
各遺伝子座が、異なる定常領域コード遺伝子セグメントまたは定常領域コード遺伝子セグメントの異なる組合せを有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
重鎖定常領域をコードする各遺伝子セグメントが、Ｃδ、Ｃγ１−４、Ｃμ、ＣεまたはＣα１−２クラスの１個以上の重鎖定常領域エキソンを含むが、但し重鎖定常領域遺伝子セグメントがＣＨ１ドメインを発現しない、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
重鎖定常領域がヒト起源のものである、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における２以上の異種のＶＨ重鎖遺伝子座が同一の染色体上に直列に存在する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類における１つ以上の異種のＶＨ重鎖遺伝子座が異なる染色体上に存在する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ヒトを除くトランスジェニック哺乳類がげっ歯類である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
げっ歯類がマウスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の複数の異種のＶＨ重鎖遺伝子座を含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類。
【請求項３３】
請求項３２に記載のヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫することによる、重鎖のみ抗体の産生方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載のヒトを除くトランスジェニック哺乳類を抗原で免疫するステップと、
Ｂ細胞ハイブリドーマを生成するステップと、
抗原特異的な重鎖のみ抗体を発現している細胞を選択するステップと、
抗原特異的な組換え親和性成熟ＶＨ重鎖のみ抗体を単離するステップと
を含む、高親和性の抗原特異的ＶＨ重鎖のみ抗体の産生方法。
【図１】
【図２Ａ．２Ｂ】
【図２Ｃ．２Ｄ】
【図３Ａ−３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ．４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ−７Ｅ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ．２Ｂ】
【図２Ｃ．２Ｄ】
【図３Ａ−３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ．４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ−７Ｅ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５２４６４１（Ｐ２００９−５２４６４１Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５１９０８（Ｐ２００８−５５１９０８）
【出願日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９６７７９
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０８２２６３００）エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９６７７９
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０８２２６３００）エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム (2)
【Ｆターム（参考）】
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