小さな核酸分子を特徴付ける方法
本発明は、一般に、小さな核酸分子（例えば、プラスミドまたはウイルスから得られる核酸分子）を特徴付ける方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、小さな環状核酸分子を特徴付ける方法を提供し、この方法は、小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程、およびコンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、小さな環状核酸分子を特徴付ける工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００９年１０月８日に出願された米国非仮特許出願第１２／５７５，７０３号の利益、およびこの出願に対する優先権を主張し、その内容は、その全体において本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、小さな核酸分子（例えば、プラスミドまたはウイルスから得られる核酸分子）を特徴付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
例えば、制限酵素地図を開発するために制限酵素エンドヌクレアーゼを用いるゲノムの物理的マッピングは、種々の生物の核酸配列についての正確な情報を提供し得る。例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の制限酵素地図は、オプティカルマッピング（ｏｐｔｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ）によって作製され得る。オプティカルマッピングは、個々の標識されたＤＮＡ分子における制限酵素エンドヌクレアーゼの切断事象を可視化するための蛍光顕微鏡検査を用いることによって、整列された制限酵素地図（ｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍａｐ）を生成し得る。
【０００４】
一般に、オプティカルマップ（ｏｐｔｉｃａｌ ｍａｐ）は、大きなゲノムＤＮＡ分子（例えば、約２５０，０００塩基対〜２，５００，０００塩基対）の消化から生成される。代表的にオプティカルマッピングのために使用される制限酵素エンドヌクレアーゼを用いた大きなゲノムＤＮＡ分子の消化は、数塩基対〜数十万塩基対の範囲に及ぶ制限酵素断片を生成し、平均の断片のサイズは代表的に約１０，０００塩基対である。このような大きな染色体ＤＮＡ断片は、代表的に、消化後に２５個超の内部制限酵素断片（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をもたらす。
【０００５】
オプティカルマッピングによるＤＮＡ分子の同定には、一般に、ＤＮＡ分子が通常、１０００塩基対よりも大きい、少なくとも５個の内部制限酵素断片を含むことを必要とする。従って、サイズが１０，０００塩基対未満である小さなＤＮＡ分子（例えば、直鎖状プラスミドおよびウイルス、ならびに環状プラスミドおよびウイルス）は、通常、それらの内部制限酵素断片のパターンに基づいて同定することを可能にするような十分な数の内部断片をもたらさない。
【０００６】
小さな核酸分子を特徴付ける方法についての、まだ満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本発明は、ローリングサークル増幅法を利用して小さな核酸分子のサイズを増加させ、その結果これらの分子が、大きなＤＮＡ分子と類似して挙動し、従って小さな核酸分子のオプティカルマップを得ることができる。一般に、ローリングサークル増幅法は、小さな一本鎖または二本鎖の核酸分子（プラスミドおよびウイルス）から長い直鎖状コンカテマーを作製するために使用される。コンカテマーは、十万塩基対（例えば、４０００塩基対のモノマーの２０超の繰り返し単位）よりも大きいサイズに到達し得る。このことにより、コンカテマー形態での小さな核酸の堆積が可能となり、このコンカテマー形態での小さな核酸は、消化前に大きなゲノムＤＮＡ断片と類似して挙動し、従って、小さな核酸分子のオプティカルマッピングが可能となる。
【０００８】
本発明の局面は、小さな環状核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を特徴付ける方法であって、小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程、およびコンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、小さな環状核酸分子を特徴付ける工程を含む、方法を提供する。上記増幅を行う工程の前に、本方法は、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含み得る。直鎖状核酸分子を環状化させる工程は、当該分野において公知の任意の技術（例えば、直鎖状核酸分子から環状化核酸分子を作製するためのリガーゼを用いること）によって達成され得る。
【０００９】
一般に、コンカテマーは、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む。しかし、本発明の方法は、より少ない内部制限酵素部位を用いて実施され得る。小さな環状核酸分子は、プラスミドであり得る。小さな核酸分子は、ウイルスから得られ得る。小さな核酸分子は、一本鎖の核酸分子または二本鎖の核酸分子であり得る。
【００１０】
本発明の別の局面は、小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける方法であって、小さな直鎖状核酸分子を環状化して環状核酸分子を生成する工程、環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程、およびコンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける工程を含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の局面は、小さな環状核酸分子を特徴付ける方法であって、小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程、コンカテマーが伸長し、表面上に固定されるように、コンカテマーを表面上へと堆積させる工程であって、その結果、コンカテマーが依然として酵素反応を受け易い状態のままである工程、酵素によってコンカテマーを消化して、１つまたはそれより多くの制限酵素分解物を生成する工程、制限酵素分解物を画像化する工程、および制限酵素分解物からオプティカルマップを構築する工程を含む、方法を提供する。上記増幅を行う工程の前に、本方法は、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含み得る。特定の実施形態において、上記表面は、誘導体化ガラス（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｇｌａｓｓ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明は、一般に、小さな核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）（例えば、プラスミドまたはウイルスから得られる核酸分子）を特徴付ける方法に関する。小さな核酸分子の例は、１０，０００塩基対またはそれより少ない塩基対の核酸分子である。このサイズの核酸分子は、代表的に、プラスミドまたはウイルス由来の核酸分子である。例えば、核酸は、当該分野において公知であるような、あらゆる供給源、組換え分子、ｃＤＮＡ、または合成類似体から単離される天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。核酸の鋳型は、ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ断片（例えば、エキソン、イントロン、調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、開始領域および終止領域、発現調節因子、発現制御物、および他の制御領域などの）、１つまたはそれより多くの一塩基多型（ＳＮＰ）を含むＤＮＡ、対立遺伝子バリアント、および変異核酸を含み得る。
【００１３】
核酸の鋳型はまた、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、スプライスバリアント、アンチセンスＲＮＡ、およびＲＮＡｉ）であり得る。また、本発明に従い、有用であるとして企図されるのは、ポリメラーゼを結合するための認識部位を有するＲＮＡ、単一細胞、小器官または微生物の転写物、および１つまたはそれより多くの細胞（例えば、発生、分化、もしくは疾患の、異なるステージ由来の細胞、および異なる種由来の細胞）のＲＮＡ相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の全てもしくは一部である。核酸は、あらゆる核酸供給源（例えば、ヒト、動物、もしくは植物の細胞、または細胞生物もしくは微生物（例えば、細菌）、または他の感染性病原体（例えば、ウイルス））から得られ得る。別個の核酸は、例えば、患者サンプル（がん性細胞および前がん細胞が挙げられる）における単一の細胞から分析のために単離され得る。
【００１４】
核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、直鎖状であるか、またはすでに環状化されていてよい。小さな核酸分子が直鎖状分子である実施形態において、直鎖状核酸分子は、環状化され得る。直鎖状核酸分子を環状化させることは、当該分野において公知である任意の技術（例えば、直鎖状核酸分子から環状化核酸分子を作製するためのリガーゼを用いること）によって達成され得る。直鎖状鋳型の末端はまた、５’ホスフェートおよび３’−ヒドロキシル、または５’−ヒドロキシルおよび３’−ホスフェートを縮合することによって繋がれ得る。ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼは、直鎖状鋳型の２つの末端を、アダプター分子またはリンカーで、またはアダプター分子もリンカーもなしで酵素によって繋いで、環を形成するために使用され得る。例えば、Ｄ．Ｃ．Ｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８：１７１−７８に記載のように、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを連結させる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ．ＴＭ．（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）はまた、一本鎖の核酸のライゲーションを触媒するために使用され得る。あるいは、二本鎖のＥ．ｃｏｌｉまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼは、二本鎖の核酸の５’末端および３’末端を繋ぐために使用され得、二本鎖の鋳型は、プライマーへのアニール前に変性され得る。
【００１５】
別の実施形態において、核酸リンカーは、まず二本鎖の核酸鋳型の５’末端および３’末端にライゲーションし、このリンカーがライゲーションされ、それにより、直鎖状の二本鎖の核酸鋳型を環状化させる。二本鎖の環状鋳型は、次に変性され、その結果、ローリングサークル増幅プライマーは、一本鎖の鋳型のうちの１つにアニールされ得る。プライマーのハイブリッド形成部位は、好ましくはライゲーション部位に広がっており、その結果、プライマーは、直鎖状核酸鋳型に対してハイブリッド形成しないか、またはあまり有効にはハイブリッド形成しない。
【００１６】
環状化された小さな核酸分子は、次にローリングサークル増幅に供される。ローリングサークル増幅法は、環状核酸鋳型の、末端同士を繋ぐ複数の直鎖状のコピー（コンカテマー）を作製する方法である。インビボで、宿主ＤＮＡ複製タンパク質をリクルートし、他の必要なタンパク質を自律的に合成し、そして２本の鎖のうちの１つに切れ目を入れる（ｎｉｃｋ）ことによって複製を開始することによるローリングサークル増幅によって、細菌性プラスミドおよびいくつかのウイルスは複製する。複製機構により、残留環状鋳型に対する相補鎖が合成され、自己タンパク質は、相補鎖複製産物を切断し、新たなプラスミドへと環状化させる。例えば、Ｋｈａｎ（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６１（４）：４４２−５５；およびＤｅｍｉｄｏｖ （Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１１７５−１１７９，２００５）を参照のこと。
【００１７】
ローリングサークル増幅法は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、および鋳型を含む有効な量の試薬を包含する。ローリングサークル増幅を行うことが可能なあらゆるポリメラーゼは、その反応において使用され得る（例えば、ｐｈｉ ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７変異ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ、シーケナーゼ、他の公知のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、熱分解性（ｔｈｅｒｍｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）ポリメラーゼ、および逆転写酵素）。例えば、Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１９８，５４３号および同第５，００１，０５０号；Ｄｏｕｂｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２５１−５８；Ｏｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１３：７６２−６６；Ｂｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：３５２−５５；Ｋｏｒｏｌｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：９２６４−６８；Ｋｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：９５−１０８；およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３７６：６１２−１６を参照のこと。これらの特許および論文の内容は、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【００１８】
ローリングサークル増幅のためのプライマーは、従来の核酸合成技術を用いて、合成により作製し得る。例えば、プライマーは、標準の化学反応（例えば、ホスホルアミダイト化学反応など）を用いて、自動ＤＮＡ合成器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）モデル３９２または３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器）において合成され得る。例えば、結果として非天然の骨格基（例えば、ホスホロチオエートなど）をもたらす代替の化学反応も、例えば、得られたオリゴヌクレオチドが、重合剤と適合性があるという条件で用いられ得る。プライマーはまた、注文の核酸を専門にする多様な会社（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．））から商業的に注文され得る。
【００１９】
ローリングサークル増幅法は、小さな環状核酸分子から長い直鎖状コンカテマーを作製するために使用される。このようなコンカテマーは、十万塩基対（例えば、４０００塩基対の環状モノマーの２０超の繰り返し単位）よりも大きいサイズに到達し得る。一般に、コンカテマーは、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む。しかし、本発明の方法は、より少ない内部制限酵素部位で実施され得る。モノマーが特定の制限酵素エンドヌクレアーゼに対して単一の切断部位を含む場合、その制限酵素エンドヌクレアーゼによるコンカテマーの消化は、上記モノマーの特徴である繰り返しパターンにおける一連の同一の内部制限酵素断片をもたらす。特定の制限酵素エンドヌクレアーゼに対して２つまたはそれより多くの制限酵素部位を有するモノマーは、より複雑な繰り返しパターンを生じる。
【００２０】
ローリングサークル増幅法は、コンカテマー形態で、消化前に大きなゲノムＤＮＡ断片と同様に挙動する、小さな核酸分子を表面へと堆積することを可能にし、従って、当業者が小さな核酸分子のオプティカルマップを得ることを可能にする。オプティカルマッピングは、単一のＤＮＡ分子からの整列された制限酵素地図の作製ための単一分子技術である（Ｓａｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．５：１−４，１９９５）。
【００２１】
種々の方法は、オプティカルマッピングおよび／またはシークエンシングにおける単一核酸分子の制御可能な伸長に対して使用され得る。本方法は、ゲルベース、固体表面ベース、およびフローベースであり得る（例えば、米国特許第６，５０９，１５８号を参照のこと）。いくつかの適用の間に、個々の、蛍光により標識されたＤＮＡ分子は、（第一世代の方法における）カバーガラスと顕微鏡スライドとの間のアガロースの流れの中で伸長するか、または（第二世代の方法における）ポリリジン処理ガラス表面に固定される。上記Ｓａｍａｄ ｅｔ ａｌ．。加えられたエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを特定の点で切断し、この断片は、画像化される。同上文献。制限酵素地図は、消化からもたらされる断片の数に基づいて構築され得る。同上文献。一般に、最終地図は、同様の分子に由来する断片のサイズの平均である。同上文献。
【００２２】
オプティカルマッピングおよび関連方法は、米国特許第５，４０５，５１９号、米国特許第５，５９９，６６４号、米国特許第６，１５０，０８９号、米国特許第６，１４７，１９８号、米国特許第５，７２０，９２８号、米国特許第６，１７４，６７１号、米国特許第６，２９４，１３６号、米国特許第６，３４０，５６７号、米国特許第６，４４８，０１２号、米国特許第６，５０９，１５８号、米国特許第６，６１０，２５６号、および米国特許第６，７１３，２６３号に記載される。全ての引用された特許は、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【００２３】
オプティカルマップは、Ｒｅｓｌｅｗｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２に記載されるように構築され、これは本明細書中で参考として援用される。手短に言えば、試験生物由来の個々の染色体断片は、負に荷電したＤＮＡと正に荷電した表面との間の静電相互作用によって誘導体化ガラス上に固定され、１つまたはそれより多くの制限酵素エンドヌクレアーゼで消化され、挿入色素（例えば、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色され、そして画像分析のために自動蛍光顕微鏡上に置かれる。染色体断片は固定されているので、制限酵素エンドヌクレアーゼでの消化によって生成される制限酵素断片は、ガラスに付着したままであり、挿入色素での染色後に蛍光顕微鏡検査によって可視化され得る。染色体ＤＮＡ分子における各制限酵素断片のサイズは、画像分析ソフトウェアを用いて測定され、異なる分子における同一の制限酵素断片パターンは、染色体全体にわたる整列された制限酵素地図を構築するために使用される。
【００２４】
制限酵素マッピング、例えば、オプティカルマッピングは、多様な適用において使用され得る。例えば、本明細書中で特色をなす方法は、特性（例えば、物理的特性および／または化学的特性（例えば、ゲノムの一部（例えば、染色体）もしくはゲノム全体の、標識されたおよび／もしくは標識されていない分子（例えば、アンプリコン（例えば、ＰＣＲ産物））の、サイズ、長さ、制限酵素地図、重量、質量、配列、高次構造変化もしくは構造変化、ｐＫａ変化、分布、粘度、緩和の速度）を決定するために使用され得る。
【００２５】
本方法はまた、遺伝子情報がＤＮＡまたはＲＮＡとして保存されている、種々の生物（例えば、ウイルスおよびプリオン）、および種々の微生物（例えば、細菌、原生生物、および真菌類）を、生物の核酸の制限酵素地図を制限酵素地図データベースに対応させることによって同定するために使用され得る。このような同定方法はまた、疾患または障害を診断することにおいて使用され得る。制限酵素マッピングによって生物を同定する方法は、例えば、２００８年５月１４日に出願された米国特許出願第１２／１２０，５８６号に記載され、これは本明細書中で参考として援用される。
【００２６】
本明細書中で特色をなす方法はまた、他の診断における適用において、特定の疾患または障害を同定するのを助けるため使用され得る（例えば、個体または集団についての特定の遺伝子座または遺伝領域の画像化）。本方法の他の使用は、当業者にとって明らかである。
【００２７】
参考としての援用
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公開、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツ）に対する参考文献および引用文献は、本開示にわたってなされている。全てのこのような文書は、このようにして、全ての目的のために、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【００２８】
等価物
本発明は、その範囲または不可欠な特徴から外れることなく他の特定の形態で具体化され得る。前述の実施形態は、従って、全ての点において、本明細書中に記載される本発明に制限を設けるよりもむしろ例示的であることが考慮されるべきである。本発明の範囲は、従って、前述の記載によってよりもむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内に生じる全ての変更は、従って、その中に含まれるべきであることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００９年１０月８日に出願された米国非仮特許出願第１２／５７５，７０３号の利益、およびこの出願に対する優先権を主張し、その内容は、その全体において本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、小さな核酸分子（例えば、プラスミドまたはウイルスから得られる核酸分子）を特徴付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
例えば、制限酵素地図を開発するために制限酵素エンドヌクレアーゼを用いるゲノムの物理的マッピングは、種々の生物の核酸配列についての正確な情報を提供し得る。例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の制限酵素地図は、オプティカルマッピング（ｏｐｔｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ）によって作製され得る。オプティカルマッピングは、個々の標識されたＤＮＡ分子における制限酵素エンドヌクレアーゼの切断事象を可視化するための蛍光顕微鏡検査を用いることによって、整列された制限酵素地図（ｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍａｐ）を生成し得る。
【０００４】
一般に、オプティカルマップ（ｏｐｔｉｃａｌ ｍａｐ）は、大きなゲノムＤＮＡ分子（例えば、約２５０，０００塩基対〜２，５００，０００塩基対）の消化から生成される。代表的にオプティカルマッピングのために使用される制限酵素エンドヌクレアーゼを用いた大きなゲノムＤＮＡ分子の消化は、数塩基対〜数十万塩基対の範囲に及ぶ制限酵素断片を生成し、平均の断片のサイズは代表的に約１０，０００塩基対である。このような大きな染色体ＤＮＡ断片は、代表的に、消化後に２５個超の内部制限酵素断片（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をもたらす。
【０００５】
オプティカルマッピングによるＤＮＡ分子の同定には、一般に、ＤＮＡ分子が通常、１０００塩基対よりも大きい、少なくとも５個の内部制限酵素断片を含むことを必要とする。従って、サイズが１０，０００塩基対未満である小さなＤＮＡ分子（例えば、直鎖状プラスミドおよびウイルス、ならびに環状プラスミドおよびウイルス）は、通常、それらの内部制限酵素断片のパターンに基づいて同定することを可能にするような十分な数の内部断片をもたらさない。
【０００６】
小さな核酸分子を特徴付ける方法についての、まだ満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本発明は、ローリングサークル増幅法を利用して小さな核酸分子のサイズを増加させ、その結果これらの分子が、大きなＤＮＡ分子と類似して挙動し、従って小さな核酸分子のオプティカルマップを得ることができる。一般に、ローリングサークル増幅法は、小さな一本鎖または二本鎖の核酸分子（プラスミドおよびウイルス）から長い直鎖状コンカテマーを作製するために使用される。コンカテマーは、十万塩基対（例えば、４０００塩基対のモノマーの２０超の繰り返し単位）よりも大きいサイズに到達し得る。このことにより、コンカテマー形態での小さな核酸の堆積が可能となり、このコンカテマー形態での小さな核酸は、消化前に大きなゲノムＤＮＡ断片と類似して挙動し、従って、小さな核酸分子のオプティカルマッピングが可能となる。
【０００８】
本発明の局面は、小さな環状核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を特徴付ける方法であって、小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程、およびコンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、小さな環状核酸分子を特徴付ける工程を含む、方法を提供する。上記増幅を行う工程の前に、本方法は、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含み得る。直鎖状核酸分子を環状化させる工程は、当該分野において公知の任意の技術（例えば、直鎖状核酸分子から環状化核酸分子を作製するためのリガーゼを用いること）によって達成され得る。
【０００９】
一般に、コンカテマーは、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む。しかし、本発明の方法は、より少ない内部制限酵素部位を用いて実施され得る。小さな環状核酸分子は、プラスミドであり得る。小さな核酸分子は、ウイルスから得られ得る。小さな核酸分子は、一本鎖の核酸分子または二本鎖の核酸分子であり得る。
【００１０】
本発明の別の局面は、小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける方法であって、小さな直鎖状核酸分子を環状化して環状核酸分子を生成する工程、環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程、およびコンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける工程を含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の局面は、小さな環状核酸分子を特徴付ける方法であって、小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程、コンカテマーが伸長し、表面上に固定されるように、コンカテマーを表面上へと堆積させる工程であって、その結果、コンカテマーが依然として酵素反応を受け易い状態のままである工程、酵素によってコンカテマーを消化して、１つまたはそれより多くの制限酵素分解物を生成する工程、制限酵素分解物を画像化する工程、および制限酵素分解物からオプティカルマップを構築する工程を含む、方法を提供する。上記増幅を行う工程の前に、本方法は、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含み得る。特定の実施形態において、上記表面は、誘導体化ガラス（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｇｌａｓｓ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明は、一般に、小さな核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）（例えば、プラスミドまたはウイルスから得られる核酸分子）を特徴付ける方法に関する。小さな核酸分子の例は、１０，０００塩基対またはそれより少ない塩基対の核酸分子である。このサイズの核酸分子は、代表的に、プラスミドまたはウイルス由来の核酸分子である。例えば、核酸は、当該分野において公知であるような、あらゆる供給源、組換え分子、ｃＤＮＡ、または合成類似体から単離される天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。核酸の鋳型は、ゲノムＤＮＡ、ＤＮＡ断片（例えば、エキソン、イントロン、調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、開始領域および終止領域、発現調節因子、発現制御物、および他の制御領域などの）、１つまたはそれより多くの一塩基多型（ＳＮＰ）を含むＤＮＡ、対立遺伝子バリアント、および変異核酸を含み得る。
【００１３】
核酸の鋳型はまた、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、スプライスバリアント、アンチセンスＲＮＡ、およびＲＮＡｉ）であり得る。また、本発明に従い、有用であるとして企図されるのは、ポリメラーゼを結合するための認識部位を有するＲＮＡ、単一細胞、小器官または微生物の転写物、および１つまたはそれより多くの細胞（例えば、発生、分化、もしくは疾患の、異なるステージ由来の細胞、および異なる種由来の細胞）のＲＮＡ相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の全てもしくは一部である。核酸は、あらゆる核酸供給源（例えば、ヒト、動物、もしくは植物の細胞、または細胞生物もしくは微生物（例えば、細菌）、または他の感染性病原体（例えば、ウイルス））から得られ得る。別個の核酸は、例えば、患者サンプル（がん性細胞および前がん細胞が挙げられる）における単一の細胞から分析のために単離され得る。
【００１４】
核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、直鎖状であるか、またはすでに環状化されていてよい。小さな核酸分子が直鎖状分子である実施形態において、直鎖状核酸分子は、環状化され得る。直鎖状核酸分子を環状化させることは、当該分野において公知である任意の技術（例えば、直鎖状核酸分子から環状化核酸分子を作製するためのリガーゼを用いること）によって達成され得る。直鎖状鋳型の末端はまた、５’ホスフェートおよび３’−ヒドロキシル、または５’−ヒドロキシルおよび３’−ホスフェートを縮合することによって繋がれ得る。ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼは、直鎖状鋳型の２つの末端を、アダプター分子またはリンカーで、またはアダプター分子もリンカーもなしで酵素によって繋いで、環を形成するために使用され得る。例えば、Ｄ．Ｃ．Ｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８：１７１−７８に記載のように、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを連結させる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ．ＴＭ．（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）はまた、一本鎖の核酸のライゲーションを触媒するために使用され得る。あるいは、二本鎖のＥ．ｃｏｌｉまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼは、二本鎖の核酸の５’末端および３’末端を繋ぐために使用され得、二本鎖の鋳型は、プライマーへのアニール前に変性され得る。
【００１５】
別の実施形態において、核酸リンカーは、まず二本鎖の核酸鋳型の５’末端および３’末端にライゲーションし、このリンカーがライゲーションされ、それにより、直鎖状の二本鎖の核酸鋳型を環状化させる。二本鎖の環状鋳型は、次に変性され、その結果、ローリングサークル増幅プライマーは、一本鎖の鋳型のうちの１つにアニールされ得る。プライマーのハイブリッド形成部位は、好ましくはライゲーション部位に広がっており、その結果、プライマーは、直鎖状核酸鋳型に対してハイブリッド形成しないか、またはあまり有効にはハイブリッド形成しない。
【００１６】
環状化された小さな核酸分子は、次にローリングサークル増幅に供される。ローリングサークル増幅法は、環状核酸鋳型の、末端同士を繋ぐ複数の直鎖状のコピー（コンカテマー）を作製する方法である。インビボで、宿主ＤＮＡ複製タンパク質をリクルートし、他の必要なタンパク質を自律的に合成し、そして２本の鎖のうちの１つに切れ目を入れる（ｎｉｃｋ）ことによって複製を開始することによるローリングサークル増幅によって、細菌性プラスミドおよびいくつかのウイルスは複製する。複製機構により、残留環状鋳型に対する相補鎖が合成され、自己タンパク質は、相補鎖複製産物を切断し、新たなプラスミドへと環状化させる。例えば、Ｋｈａｎ（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６１（４）：４４２−５５；およびＤｅｍｉｄｏｖ （Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１１７５−１１７９，２００５）を参照のこと。
【００１７】
ローリングサークル増幅法は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、および鋳型を含む有効な量の試薬を包含する。ローリングサークル増幅を行うことが可能なあらゆるポリメラーゼは、その反応において使用され得る（例えば、ｐｈｉ ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７変異ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ、シーケナーゼ、他の公知のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、熱分解性（ｔｈｅｒｍｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）ポリメラーゼ、および逆転写酵素）。例えば、Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１９８，５４３号および同第５，００１，０５０号；Ｄｏｕｂｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２５１−５８；Ｏｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１３：７６２−６６；Ｂｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：３５２−５５；Ｋｏｒｏｌｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：９２６４−６８；Ｋｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：９５−１０８；およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３７６：６１２−１６を参照のこと。これらの特許および論文の内容は、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【００１８】
ローリングサークル増幅のためのプライマーは、従来の核酸合成技術を用いて、合成により作製し得る。例えば、プライマーは、標準の化学反応（例えば、ホスホルアミダイト化学反応など）を用いて、自動ＤＮＡ合成器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）モデル３９２または３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器）において合成され得る。例えば、結果として非天然の骨格基（例えば、ホスホロチオエートなど）をもたらす代替の化学反応も、例えば、得られたオリゴヌクレオチドが、重合剤と適合性があるという条件で用いられ得る。プライマーはまた、注文の核酸を専門にする多様な会社（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．））から商業的に注文され得る。
【００１９】
ローリングサークル増幅法は、小さな環状核酸分子から長い直鎖状コンカテマーを作製するために使用される。このようなコンカテマーは、十万塩基対（例えば、４０００塩基対の環状モノマーの２０超の繰り返し単位）よりも大きいサイズに到達し得る。一般に、コンカテマーは、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む。しかし、本発明の方法は、より少ない内部制限酵素部位で実施され得る。モノマーが特定の制限酵素エンドヌクレアーゼに対して単一の切断部位を含む場合、その制限酵素エンドヌクレアーゼによるコンカテマーの消化は、上記モノマーの特徴である繰り返しパターンにおける一連の同一の内部制限酵素断片をもたらす。特定の制限酵素エンドヌクレアーゼに対して２つまたはそれより多くの制限酵素部位を有するモノマーは、より複雑な繰り返しパターンを生じる。
【００２０】
ローリングサークル増幅法は、コンカテマー形態で、消化前に大きなゲノムＤＮＡ断片と同様に挙動する、小さな核酸分子を表面へと堆積することを可能にし、従って、当業者が小さな核酸分子のオプティカルマップを得ることを可能にする。オプティカルマッピングは、単一のＤＮＡ分子からの整列された制限酵素地図の作製ための単一分子技術である（Ｓａｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．５：１−４，１９９５）。
【００２１】
種々の方法は、オプティカルマッピングおよび／またはシークエンシングにおける単一核酸分子の制御可能な伸長に対して使用され得る。本方法は、ゲルベース、固体表面ベース、およびフローベースであり得る（例えば、米国特許第６，５０９，１５８号を参照のこと）。いくつかの適用の間に、個々の、蛍光により標識されたＤＮＡ分子は、（第一世代の方法における）カバーガラスと顕微鏡スライドとの間のアガロースの流れの中で伸長するか、または（第二世代の方法における）ポリリジン処理ガラス表面に固定される。上記Ｓａｍａｄ ｅｔ ａｌ．。加えられたエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを特定の点で切断し、この断片は、画像化される。同上文献。制限酵素地図は、消化からもたらされる断片の数に基づいて構築され得る。同上文献。一般に、最終地図は、同様の分子に由来する断片のサイズの平均である。同上文献。
【００２２】
オプティカルマッピングおよび関連方法は、米国特許第５，４０５，５１９号、米国特許第５，５９９，６６４号、米国特許第６，１５０，０８９号、米国特許第６，１４７，１９８号、米国特許第５，７２０，９２８号、米国特許第６，１７４，６７１号、米国特許第６，２９４，１３６号、米国特許第６，３４０，５６７号、米国特許第６，４４８，０１２号、米国特許第６，５０９，１５８号、米国特許第６，６１０，２５６号、および米国特許第６，７１３，２６３号に記載される。全ての引用された特許は、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【００２３】
オプティカルマップは、Ｒｅｓｌｅｗｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２に記載されるように構築され、これは本明細書中で参考として援用される。手短に言えば、試験生物由来の個々の染色体断片は、負に荷電したＤＮＡと正に荷電した表面との間の静電相互作用によって誘導体化ガラス上に固定され、１つまたはそれより多くの制限酵素エンドヌクレアーゼで消化され、挿入色素（例えば、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色され、そして画像分析のために自動蛍光顕微鏡上に置かれる。染色体断片は固定されているので、制限酵素エンドヌクレアーゼでの消化によって生成される制限酵素断片は、ガラスに付着したままであり、挿入色素での染色後に蛍光顕微鏡検査によって可視化され得る。染色体ＤＮＡ分子における各制限酵素断片のサイズは、画像分析ソフトウェアを用いて測定され、異なる分子における同一の制限酵素断片パターンは、染色体全体にわたる整列された制限酵素地図を構築するために使用される。
【００２４】
制限酵素マッピング、例えば、オプティカルマッピングは、多様な適用において使用され得る。例えば、本明細書中で特色をなす方法は、特性（例えば、物理的特性および／または化学的特性（例えば、ゲノムの一部（例えば、染色体）もしくはゲノム全体の、標識されたおよび／もしくは標識されていない分子（例えば、アンプリコン（例えば、ＰＣＲ産物））の、サイズ、長さ、制限酵素地図、重量、質量、配列、高次構造変化もしくは構造変化、ｐＫａ変化、分布、粘度、緩和の速度）を決定するために使用され得る。
【００２５】
本方法はまた、遺伝子情報がＤＮＡまたはＲＮＡとして保存されている、種々の生物（例えば、ウイルスおよびプリオン）、および種々の微生物（例えば、細菌、原生生物、および真菌類）を、生物の核酸の制限酵素地図を制限酵素地図データベースに対応させることによって同定するために使用され得る。このような同定方法はまた、疾患または障害を診断することにおいて使用され得る。制限酵素マッピングによって生物を同定する方法は、例えば、２００８年５月１４日に出願された米国特許出願第１２／１２０，５８６号に記載され、これは本明細書中で参考として援用される。
【００２６】
本明細書中で特色をなす方法はまた、他の診断における適用において、特定の疾患または障害を同定するのを助けるため使用され得る（例えば、個体または集団についての特定の遺伝子座または遺伝領域の画像化）。本方法の他の使用は、当業者にとって明らかである。
【００２７】
参考としての援用
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公開、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツ）に対する参考文献および引用文献は、本開示にわたってなされている。全てのこのような文書は、このようにして、全ての目的のために、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【００２８】
等価物
本発明は、その範囲または不可欠な特徴から外れることなく他の特定の形態で具体化され得る。前述の実施形態は、従って、全ての点において、本明細書中に記載される本発明に制限を設けるよりもむしろ例示的であることが考慮されるべきである。本発明の範囲は、従って、前述の記載によってよりもむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内に生じる全ての変更は、従って、その中に含まれるべきであることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小さな環状核酸分子を特徴付ける方法であって、該方法は、
小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程；および
該コンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、該小さな環状核酸分子を特徴付ける工程を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記増幅を行う工程の前に、前記方法が、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含む、方法。
【請求項３】
前記コンカテマーが、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記小さな環状核酸分子がプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記小さな直鎖状核酸分子が、ウイルスから得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記小さな環状核酸分子が一本鎖の核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記小さな環状核酸分子が二本鎖の核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける方法であって、該方法は、
小さな直鎖状核酸分子を環状化して環状核酸分子を生成する工程；
該環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程；および
該コンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、該小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける工程を含む、
方法。
【請求項１０】
前記コンカテマーが、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記小さな直鎖状核酸分子が、ウイルスから得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記小さな直鎖状核酸分子が一本鎖の核酸分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記小さな直鎖状核酸分子が二本鎖の核酸分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
小さな環状核酸分子を特徴付ける方法であって、該方法は、
小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程；
該コンカテマーが伸長し、表面上に固定されるように、該コンカテマーを表面上へと堆積させる工程であって、その結果、該コンカテマーが依然として酵素反応を受け易い状態のままである工程；
酵素によって該コンカテマーを消化して、１つまたはそれより多くの制限酵素分解物を生成する工程；
該制限酵素分解物を画像化する工程；および
該制限酵素分解物からオプティカルマップを構築する工程を含む、
方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記増幅を行う工程の前に、前記方法が、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含む、方法。
【請求項１７】
前記コンカテマーが、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面が誘導体化ガラスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記小さな環状核酸分子がプラスミドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記小さな環状核酸分子が、ウイルスから得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
小さな環状核酸分子を特徴付ける方法であって、該方法は、
小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程；および
該コンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、該小さな環状核酸分子を特徴付ける工程を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記増幅を行う工程の前に、前記方法が、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含む、方法。
【請求項３】
前記コンカテマーが、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記小さな環状核酸分子がプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記小さな直鎖状核酸分子が、ウイルスから得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記小さな環状核酸分子が一本鎖の核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記小さな環状核酸分子が二本鎖の核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける方法であって、該方法は、
小さな直鎖状核酸分子を環状化して環状核酸分子を生成する工程；
該環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程；および
該コンカテマーのオプティカルマップを作製し、それにより、該小さな直鎖状核酸分子を特徴付ける工程を含む、
方法。
【請求項１０】
前記コンカテマーが、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記小さな直鎖状核酸分子が、ウイルスから得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記小さな直鎖状核酸分子が一本鎖の核酸分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記小さな直鎖状核酸分子が二本鎖の核酸分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
小さな環状核酸分子を特徴付ける方法であって、該方法は、
小さな環状核酸分子においてローリングサークル増幅を行い、それにより、コンカテマーを生成する工程；
該コンカテマーが伸長し、表面上に固定されるように、該コンカテマーを表面上へと堆積させる工程であって、その結果、該コンカテマーが依然として酵素反応を受け易い状態のままである工程；
酵素によって該コンカテマーを消化して、１つまたはそれより多くの制限酵素分解物を生成する工程；
該制限酵素分解物を画像化する工程；および
該制限酵素分解物からオプティカルマップを構築する工程を含む、
方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記増幅を行う工程の前に、前記方法が、小さな直鎖状核酸分子を環状化させる工程をさらに含む、方法。
【請求項１７】
前記コンカテマーが、少なくとも約５個の内部制限酵素部位を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面が誘導体化ガラスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記小さな環状核酸分子がプラスミドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記小さな環状核酸分子が、ウイルスから得られる、請求項１６に記載の方法。
【公表番号】特表２０１３−５０７１２５（Ｐ２０１３−５０７１２５Ａ）
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３３１４７（Ｐ２０１２−５３３１４７）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３８６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４３８５７
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５１０２２３８２９）オプジェン， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３８６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４３８５７
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５１０２２３８２９）オプジェン， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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