小型ＲＮＡを単離するための方法
小型ＲＮＡをサンプルから単離するための方法が提供され、上記方法は、上記サンプルをａ）少なくとも１つのアルコール、ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩、およびｃ）シリカ粒子と接触させることによって、ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる工程ならびに結合したＲＮＡを残りのサンプルから分離する工程を含む。本発明はまた、小型ＲＮＡ分子をサンプル、特に生物学的サンプル（例えば、血液、血液産物、組織および体液）から有効に単離するための組成物、およびキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明をもたらした研究は、助成金契約番号２２２９１６の下、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ’ｓ Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（ＦＰ７／２００７−２０１３）からの資金提供を受けている。
【０００２】
本発明は、小型ＲＮＡ分子をサンプル、特に生物学的サンプル（例えば、組織および体液）から単離するための方法、組成物、およびキットに関連する。
【背景技術】
【０００３】
小型ＲＮＡ（すなわち、種々の組織および多くの生物由来、ならびに細胞の培養物由来のおよそ２５０ヌクレオチドまたはそれより少ないＲＮＡ分子）の研究は、大変興味深い領域であり、将来に１つ残る見込みがある。小型ＲＮＡとしては、とりわけマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子干渉ＲＮＡ分子が挙げられ、その両方は、遺伝子の発現に及ぼす強力な作用を有し得る。さらに、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡプロセシングに関与する他の核内低分子ＲＮＡおよび核小体低分子ＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ）も重要である。
【０００４】
それぞれの小型ＲＮＡ分子に対する興味の増加を伴って、標準的な単離手順は、小型ＲＮＡの単離を容易にするために改変されている。このことは、小型ＲＮＡ分子が、単離プロセスの間に有効に捕捉および溶出されないことが多いので、ＤＮＡまたは総ＲＮＡを単離するための標準として使用される公知のプロトコルが、通常、小型ＲＮＡ分子を単離するのに理想的ではないからである。従って、標準手順を用いてサンプルから単離される総ＲＮＡは、通常、十分な量の小型ＲＮＡ分子を含まない。従って、小型ＲＮＡ分子の、単独または総ＲＮＡの一部としての、効率的な単離のための改善された技術の必要性が存在する。
【０００５】
小型ＲＮＡ分子の単離のために最適化されている方法は、しばしば、フェノールおよびクロロホルム抽出ならびに段階的なアルコール分画に依存する。フェノールおよびクロロホルムの使用を含む方法の主要な欠点は、とりわけ、これらの化学物質が潜在的な健康リスクを引き起こすことである。さらに、それらはまた特定の生物学的物質と効果がない。さらに、相の分離およびアルコール分画は、困難で時間がかかり、高スループットおよび自動化の要求に適合しないようにする。
【０００６】
さらに、総ＲＮＡの単離のためのカオトロピック剤、高濃度のアルコールおよびシリカ膜の使用を含む、小型ＲＮＡを単離するための改善された方法が開発されている。これらのプロトコルを用いて単離される総ＲＮＡはまた、一部分として小型ＲＮＡを含む。これらの方法は、従って、小型ＲＮＡ分子を効率的に単離するのに有用である。これらの方法に基づく市販の製品は、例えば、ＱＩＡＧＥＮによって販売されるＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡキットである。このキットは、サンプルからの小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする。しかし、たとえこの方法が、小型ＲＮＡを単離することにおいて非常に効率的であっても、単離がシリカ膜によって行われるという欠点を有する。シリカ膜を用いる単離手順は、しばしば時間がかかり、また、高スループット様式（例えば、ロボットシステムを用いる）での柔軟性がありかつ専用の自動化プロセスによって小型ＲＮＡを単離するのを難しくする。さらに、より大きいサンプル体積も処理できることが望ましい。特に、複雑な生物学的サンプル（例えば、全血、および血液産物）から小型ＲＮＡを効率的に単離することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、好ましくは、自動化システムによる処理をも可能にする、サンプル、特に生物学的サンプルからの小型ＲＮＡ分子の効率的な単離のための改善された技術の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、シリカ粒子を用いることによって、小型ＲＮＡ分子をサンプルから迅速かつ効率的に単離するための方法を提供する。シリカ粒子、特に磁性シリカ粒子の使用は、サンプルからの小型ＲＮＡ分子の、迅速で、柔軟性があり、かつまた自動化された高スループットでの単離を可能にする。本発明者らは、シリカ粒子を用いるときに複雑なサンプルであっても小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする特別な結合条件を同定した。
【０００９】
従って、本発明の１つの局面に従って、小型ＲＮＡをサンプルから単離するための方法を提供し、ここで、上記方法は、
上記サンプルを
ａ）少なくとも１つのアルコール、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩、および
ｃ）シリカ粒子
と接触させることによって、上記ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる工程、ならびに
結合した上記ＲＮＡを上記サンプルの残りから分離する工程
を含む。
【００１０】
この方法は、良好な収量で、サンプルからの小型ＲＮＡの効率的かつ迅速な単離を可能にすることが見出されている。上記小型ＲＮＡは、好ましくは、総ＲＮＡの一部として得られる。
【００１１】
本発明のさらなる局面に従って、小型ＲＮＡをサンプルから単離するためのキットを提供し、このキットは、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子
とを含む。
【００１２】
本発明のさらなる局面は、小型ＲＮＡをシリカ粒子に結合させるための組成物を包含し、この組成物は、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子
とを含む。
【００１３】
本願の他の目的、特徴、利点および局面は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかとなる。しかし、以下の記載、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例が、本願の好ましい実施形態を示す一方で、例示のみとして与えられることが理解されるべきである。開示される発明の趣旨および範囲内の種々の変化および改変は、以下を読むことによって当業者に容易に明らかとなる。
【００１４】
発明の詳細な説明
シリカ粒子（例えば、磁性シリカ粒子）が、それらの結合の特徴においてシリカ膜とかなり異なることが見出されている。従って、シリカ膜について確立された結合条件は、特に複雑なサンプル（例えば、全血のサンプル）について、特にシリカ粒子と同等の量で、効率的に小型ＲＮＡを結合させるのに適していない。このことは、シリカ粒子を用いるときに、受容可能な収量での小型ＲＮＡの単離および精製を難しくする。
【００１５】
従って、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子（例えば、特に磁性シリカ粒子）を用いるときに小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする適切な結合条件を見出すことが必要であった。シリカ粒子および特に磁性シリカ粒子の使用は、例えば、自動化プロセスにおける粒子の処理に関して利点を有する。
【００１６】
特定のカオトロピックアニオンを用いることによって、小型ＲＮＡをシリカ粒子に有効に結合させることが可能であることが、今や、驚くことに見出された。特定のカオトロピックアニオンを用いるとき、上記小型ＲＮＡの結合は、一般的に使用されるカオトロピック剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアネートまたはグアニジニウムヒドロクロリド）を含む通常の結合条件と比較してかなり改善された。
【００１７】
従って、本発明の第一の局面に従って、小型ＲＮＡをサンプルから単離するための方法を提供し、上記方法は、サンプルを
ａ）少なくとも１つのアルコール、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩、および
ｃ）シリカ粒子
と接触させることによって、上記ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる工程、ならびに
結合したＲＮＡをサンプルの残りから分離する工程を含む。
【００１８】
それぞれの結合条件が、磁石を介したシリカ粒子の処理を簡便にするために好ましくは磁性シリカ粒子であるシリカ粒子への小型ＲＮＡの効率的な結合を可能にし、それにより、手動の処理の他に、ロボットシステムを使用することによる容易な処理をも可能にすることが驚くことに見出された。
【００１９】
１つの実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンは、飽和限度までの少なくとも０．０５Ｍの濃度で、結合組成物中に存在する。１つの実施形態に従って、濃度は０．０５Ｍ〜４Ｍの範囲にある。１つの実施形態に従って、濃度は０．０５Ｍ〜３Ｍの範囲、および好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍの範囲にある。非常に好ましい実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンの濃度は、０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にある。最も好ましくは、上記カオトロピックアニオンの濃度は、１Ｍ未満であり、０．１Ｍ〜０．９Ｍの範囲、または０．１Ｍ〜０．８Ｍの範囲にある。従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩は、好ましくは、特に上記塩が一価カチオンを含むときに本発明に従ってカオトロピックアニオンについて上に記載された濃度で、結合組成物中に存在する。カチオンとして、アルカリ金属イオン（例えば、好ましくは、ナトリウム）が使用され得る。従って、１つの実施形態に従って、カオトロピック塩は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択される。実施例に示されるように、それぞれのカオトロピック塩は、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときに、小型ＲＮＡの単離に特によく適している。好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムは、０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度、好ましくは０．１Ｍ〜０．７Ｍの濃度で、結合組成物中に存在する。所望される場合、他のカオトロピック塩（例えば、一般的に使用されるグアニジニウム塩）も、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩に加えて使用され得る。
【００２０】
シリカ粒子を用いることによって小型ＲＮＡを単離することについて、結合の間、および従って結合組成物中で、４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下のアルコール濃度を使用することは、有益である。最も好ましいものは、結合の間、５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下のアルコール濃度である。また、アルコールの混合物が使用され得る。
【００２１】
アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールが使用され得る。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。上記アルコールは、好ましくは、イソプロパノール、およびエタノールから選択され、特によく適しているのは、イソプロパノールである。
【００２２】
必要に応じて、１つまたはそれより多くの洗剤が、結合組成物中に含まれ得る。好ましくは、イオン性および／または非イオン性洗剤が、洗剤として使用される。好ましくは、非イオン性洗剤が、少なくとも５％の濃度で使用される。上記洗剤は、例えば、結合バッファーとともに添加され得る。
【００２３】
さらに、生物学的バッファーは、結合のために使用され得る。生物学的バッファーの限定されない例としては、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンおよび他が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーが使用される。従って、１つの実施形態に従って、上記サンプルは、少なくとも１つのアルコールと、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、ならびに好ましくはＴｒｉｓである生物学的バッファーとを含む結合バッファーと接触させられる。必要に応じて、上記結合バッファーはまた、上に記載されるような洗剤を含み得る。しかし、構成要素はまた、上記サンプルに別個に添加されて、適切な結合組成物を形成し得る。好ましくは、上記結合バッファーは、ｐＨ８を含む範囲において緩衝化する。１つの実施形態に従って、上記結合バッファーは、ｐＨ７．０〜９、好ましくは７．５〜８．５の範囲にあるｐＨを有し；最も好ましい上記結合バッファーは、ｐＨ８を有する。
【００２４】
上記シリカ粒子は、ビーズの形態で使用され得、好ましくは約０．０２μｍ〜約３０μｍの粒径、好ましくは０．０５μｍ〜１５μｍの粒径、および最も好ましくは０．１μｍ〜１０μｍの粒径を有する。核酸結合キャリアの処理を容易にするために、好ましくは磁性シリカ粒子が使用される。上記磁性シリカ粒子は、例えば、フェリ磁性、強磁性、常磁性、または超常磁性であり得る。適切な磁性シリカ粒子は、例えば、ＷＯ０１／７１７３２、ＷＯ２００４／００３２３１、およびＷＯ２００３／００４１５０に記載される。他の磁性シリカ粒子はまた、先行技術から公知であり、例えば、ＷＯ９８／３１８４０、ＷＯ９８／３１４６１、ＥＰ１ ２６０ ５９５、ＷＯ９６／４１８１１、およびＥＰ０ ３４３ ９３４に記載され、また例えば、磁性シリカガラス粒子を含む。
【００２５】
上に概説されるように、本発明の方法は、サンプルから小型ＲＮＡを回収するのに特に適している。代表的に、小型ＲＮＡ分子は、長さが、約２５０ヌクレオチド未満、好ましくは２００ヌクレオチド未満である。原核細胞および真核細胞の両方は、複数の異なる大きさのＲＮＡ分子を含む。約２００または２５０ヌクレオチドの長さより大きなＲＮＡ分子としては、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）（ｌｎｃＲＮＡ）／長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）（ｌｉｎｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、１６Ｓ／１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、および２３Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡが挙げられる。約２００〜２５０ヌクレオチド未満の長さを有する小型ＲＮＡ分子としては、５．８Ｓ ｒＲＮＡ、５Ｓ ｒＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、反復配列関連ｓｉＲＮＡ（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ）（ｒａｓｉＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）、極小ノンコーディングＲＮＡ（ｔｉｎｙ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）（ｔｎｃＲＮＡ）、小型走査ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｓｃａｎ ＲＮＡ）（ｓｃＲＮＡ）、および小型調節性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ＲＮＡ）（ｓｍＲＮＡ）が挙げられる。上記小型ＲＮＡは、総ＲＮＡの一部分として得られ得、従って、サンプルから単離される総ＲＮＡ中に実質的な量で含まれる。
【００２６】
上記サンプルは、任意の種類であり得、従って、また、小型ＲＮＡ分子を含むインビトロでのサンプルであり得る。好ましくは、上記サンプルは、ヒト、動物、植物、細菌、または真菌類由来の生物学的サンプルである。好ましくは、上記サンプルは、細胞、組織、細菌、ウイルス、および体液（例えば、血液、血液産物（例えば、軟膜、血漿、および血清）、尿、液体（ｌｉｑｕｏｒ）、痰、便、ＣＳＦ、および精子）、上皮スワブ、生検材料、骨髄サンプル、および組織サンプル、好ましくは、器官組織サンプル（例えば、肺および肝臓）からなる群より選択される。好ましくは、上記サンプルは、全血および血液産物（例えば、軟膜、血清、または血漿）から選択される。
【００２７】
ＲＮＡが生物学的サンプル（例えば、全血または血液産物）から単離されるときに特に好ましい１つの実施形態に従って、核酸は、サンプルの現状および特に転写パターンを保存するために好ましくは、生物学的サンプルが、その天然の環境から取得されたすぐ後に安定化される。これは、医学および診断の分野において特に有益である。
【００２８】
従って、１つの実施形態に従って、上記生物学的サンプルは、上記サンプルから核酸を単離する前に上記生物学的サンプルにおいて核酸を安定化するために核酸保存安定化組成物と混合される。１つの実施形態に従って、上記安定化組成物は、
ａ）一般式：
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−
のカチオン性化合物であって、
ここでＹは、窒素またはリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）を表し、好ましくは窒素を表し、
Ｒ１Ｒ２Ｒ３およびＲ４は、独立して、分岐または非分岐のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基および／またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を表し；
Ｘ−は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸のアニオンを表す、カチオン性化合物；ならびに
ｂ）少なくとも１つのプロトン供与体であって、ここで上記プロトン供与体は、好ましくは、飽和までの５０ｍＭより上の濃度で上記組成物に存在し、ここで上記プロトン供与体は、好ましくは、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニルカルボン酸、飽和および／もしくは不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシルジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシルトリカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、または無機酸、またはそれらの塩からなる群から、それら単独で、または組み合わせて選択される、少なくとも１つのプロトン供与体
を含む。
【００２９】
好ましくは、Ｒ１は、１２、１４、または１６炭素原子を有する、高級アルキル基を示し、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれメチル基を表す。
【００３０】
好ましくは、上記アニオンＸ−は、ハロゲン化水素酸（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｃ ａｃｉｄ）のアニオン、または一塩基性または二塩基性有機酸のアニオンを表し、最も好ましい上記アニオンＸ−は、臭化物イオン、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、シュウ酸イオン、マロン酸イオン、コハク酸イオン、またはクエン酸イオンからなる群より選択される。
【００３１】
好ましくは、上記プロトン供与体は、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニルカルボン酸、飽和および／もしくは不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、または無機酸、またはそれらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、上記脂肪族モノカルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチルメチル酢酸（２−メチル酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、またはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）、またはそれらの混合物からなる群より選択されるＣ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸を含む。好ましくは、脂肪族アルケニルカルボン酸は、アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸、もしくはビニル酢酸、またはそれらの混合物からなる群より選択される。好ましくは、上記飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、もしくはアジピン酸、またはそれらの混合物からなる群より選択される。最も好ましくは、上記脂肪族ジカルボン酸は、シュウ酸、もしくはコハク酸、またはそれらの混合物である。好ましくは、上記脂肪族ヒドロキシルジカルボン酸、および脂肪族ヒドロキシルトリカルボン酸は、タルトロン酸、Ｄ−（＋）−リンゴ酸、Ｌ−（−）−リンゴ酸もしくはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ酒石酸、およびクエン酸、またはそれらの混合物からなる群より選択される。最も好ましくは、上記不飽和ジカルボン酸は、マレイン酸および／もしくはフマル酸、またはそれらの混合物である。好ましくは、不飽和トリカルボン酸は、アコニット酸である。好ましくは、脂肪族ケトジカルボン酸は、メソシュウ酸もしくはオキサロ酢酸、またはそれらの混合物である。好ましくは、上記アミノ酸は、アミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノイソ吉草酸（バリン）、α−アミノイソカプロン酸（ロイシン）、およびα−アミノ−β−メチル吉草酸（イソロイシン）、またはそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３２】
好ましくは、安定化させる組成物は、水性溶液中に存在する。好ましくは、上記カチオン性化合物は、０．０１重量％〜１５重量％の範囲の濃度で含まれる。
【００３３】
適切な安定化させる溶液はまた、例えば、ＵＳ７，２７０，９５３において詳細に記載され、本明細書中で参考として援用される。
【００３４】
安定化させる溶液中の添加物に起因して、上に記載されるように安定化された複雑なサンプルは、核酸を単離することが特に難しい。本発明の方法は、これらの困難な点を克服し、それぞれ安定化されたサンプル、および特に複雑な生物学的サンプル（例えば、血液、血液産物（例えば、軟膜、血清および／または血漿）、または組織サンプル、特に、例えば、肺および肝臓から得られる器官組織サンプル）由来の特に総ＲＮＡの一部として、良好な収量での小型ＲＮＡの単離を可能にする。従って、本発明の方法は、医学および特に診断の分野において特に有用である。
【００３５】
さらに、本発明の方法は、大きいサンプル体積からも、複雑なサンプル（例えば、全血、血液産物、または組織サンプル）に直面するときにも、ＲＮＡ（上記小型ＲＮＡが挙げられる）の単離を可能にすることが、驚くことに見出された。従って、少なくとも１ｍｌ、少なくとも２ｍｌ、および好ましくは少なくとも２．５ｍｌの体積を有する複雑なサンプルは、本発明の方法で効率的に処理され得る。
【００３６】
使用されるサンプルに依存して、ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる前に上記サンプルを予め処理することが有用であり得る。従って、１つの実施形態に従って、上記サンプルの少なくとも一部分は、少なくとも１つ溶解剤の添加によって、結合前に予め処理される。好ましくは、溶解のために、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）、およびカオトロピック剤（例えば、グアニジニウムヒドロクロリド、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、および／または過塩素酸ナトリウム）が使用される。溶解のための他の適切な方法としては、例えば、洗剤（例えば、ＳＤＳ、ＬｉＤＳ、またはサルコシル）の使用が挙げられる。しかし、また、先行技術において公知である他の適切な溶解方法が使用され得る。それぞれの方法が、先行技術において公知であるので、ここでさらに記載する必要はない。好ましくは、溶解は、プロテイナーゼＫ、およびカオトロピック剤を用いて、中性ｐＨにてバッファーにおいて行われる。
【００３７】
１つの実施形態に従って、非標的核酸は、適切な核酸結合キャリアの添加によって、主に上記非標的核酸が上記核酸結合キャリアに結合される条件下で、溶解後、少なくとも部分的に除去される。この目的のために、再度シリカ粒子が使用され得る。通常、ＲＮＡが上記生物学的サンプルから単離されるとき、上記非標的核酸はＤＮＡである。それぞれの非標的核酸を除去するための適切な方法は、例えば、ＥＰ０ ８８０ ５３７およびＷＯ９５／２１８４９に記載される。
【００３８】
ＲＮＡの単離についての１つの実施形態に従って、上記非標的核酸の除去後に得られる上清は、上に記載されるように、シリカ粒子、少なくとも１つのアルコール、ならびにトリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と接触させて、上記ＲＮＡ（上記小型ＲＮＡが挙げられる）を上記シリカ粒子に結合させる。適切な結合条件は上に記載される。それは、上の開示に参照される。
【００３９】
好ましい実施形態に従って、上記シリカ粒子に結合後、上記ＲＮＡは、１つまたはそれより多くの洗浄バッファーを用いて少なくとも１回洗浄される。適切な洗浄バッファーの例は、少なくとも１つのカオトロピック剤、および／または少なくとも１つのアルコールを含む。洗浄バッファーにおいて使用され得るカオトロピック塩としては、グアニジニウムヒドロクロリド、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムイソチオシアネート、およびヨウ化ナトリウムが挙げられる。さらに、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩が使用され得る。それぞれのカオトロピック塩の例は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムのようなアルカリ塩である。アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールが使用され得る。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。好ましくは、イソプロパノール、および／またはエタノールが使用される。好ましくは、上記洗浄バッファーは、少なくとも５０％のアルコール、および少なくとも１Ｍのカオトロピック塩、好ましくは少なくとも２Ｍのカオトロピック塩を含む。さらに、上記洗浄バッファーは、洗剤を含み得る。好ましくは、イオン性および／または非イオン性洗剤が、洗剤として使用される。好ましくは、非イオン性洗剤は、少なくとも５％の濃度で使用される。
【００４０】
上に記載される洗浄バッファーの代わり、またはこのバッファーの他に使用され得る、さらなる適切な洗浄バッファーは、アルコールおよび生物学的バッファーを含む。適切なアルコールおよび生物学的バッファーは、上に記載される。好ましくは、イソプロパノールまたはエタノール、最も好ましくはエタノールが、この第二の洗浄ステップのために使用される。好ましくは、エタノールは、少なくとも７０ｖ／ｖ％の濃度、好ましくは少なくとも８０ｖ／ｖ％の濃度で使用される。上記生物学的バッファーは、好ましくは約７〜８のｐＨのＴｒｉｓである。
【００４１】
１つの実施形態に従って、ＤＮアーゼ消化は、第一の洗浄ステップ（複数可）の後に行われる。ＤＮアーゼ消化を行うための条件が、先行技術において周知であるので、ここでさらに記載する必要はない。
【００４２】
１つの実施形態に従って、第一の洗浄ステップ（複数可）および必要に応じてＤＮアーゼ消化の後に、上記シリカ粒子および上記ＲＮＡは、再度、少なくとも１つのアルコール、ならびにトリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と接触させられる。この目的のために、好ましくは、それぞれの剤および必要に応じて上に記載されるような洗剤を含む、結合バッファーが使用される。この第二のＲＮＡ結合ステップは、上記シリカ粒子に対する上記ＲＮＡ、および特に上記小型ＲＮＡのしっかりした結合を確実にし、従って、良好な収量を確実にする。上記第二の結合ステップは、上に記載されるような条件下で行われ得、ここで、適切な濃度および例は、特に、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオン、対応するカオトロピック塩、アルコール、および生物学的バッファーについて記載される。それは、上の開示に参照される。
【００４３】
必要に応じて、さらなる洗浄ステップが、上記第二のＲＮＡ結合ステップの後に行われ得る。洗浄バッファーとして、上に記載されるのと同じ洗浄バッファーが使用され得る。それは、上の開示に参照される。
【００４４】
所望される場合、上記ＲＮＡは、上記シリカ粒子から溶出され得る。あるいは、上記ＲＮＡはまた、意図されるその後の適用（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に依存して、依然として上記シリカ粒子に結合されている間に処理され得る。溶出は、例えば、古典的な溶出バッファー（例えば、水、バッファー、特に生物学的バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ））を用いて行われ得、好ましくは、意図されるその後の適用を妨げない溶出溶液が使用される。
【００４５】
上に記載される、小型ＲＮＡの単離を行った後、必要に応じて総ＲＮＡの一部として上記小型ＲＮＡは使用され得、それぞれさらに処理（例えば、増幅、改変、逆転写または分析手順）され得る。
【００４６】
また、提供されるのは、サンプルから小型ＲＮＡを単離するためのキットであって、上記キットは、
ａ）必要に応じて、少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子と、
ｄ）必要に応じて、使用のための指示書
とを含む、キットである。
【００４７】
１つの実施形態に従って、上記キットは、アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールを含む。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。好ましくは、イソプロパノール、および／またはエタノールが、アルコールとしてキットに含まれる。上に記載されるように、イソプロパノールが最も好ましい。
【００４８】
上記キットは、少なくとも１つのアルコールと、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩とを含む、結合バッファーを含み得る。１つの結合バッファー中に上記アルコールおよび上記カオトロピック塩を提供することは、顧客が、それぞれの構成要素を別個に混合して上記結合組成物を形成する必要がないという利点を有する。上記結合バッファーは、好ましくは、約４０ｖ／ｖ％以上の、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下の、上記結合組成物におけるアルコールの濃度をもたらすのに適した濃度で上記アルコールを含む。最も好ましい上記アルコールは、上記結合組成物において、５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下のアルコール濃度をもたらすのに適した上記結合バッファーにおいて提供される。この目的のために、１つの実施形態に従って、上記結合バッファーは、少なくとも６０ｖ／ｖ％、好ましくは少なくとも７０ｖ／ｖ％の濃度でアルコールを含む。
【００４９】
さらに、１つの実施形態に従って、上記結合バッファーは、上記カオトロピック塩を含み、このカオトロピック塩は、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む。１つの実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、飽和限度までの少なくとも０．０５Ｍの上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で、上記結合バッファー中に存在する。１つの実施形態に従って、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、０．０５Ｍ〜４Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。１つの実施形態に従って、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、０．０５Ｍ〜３Ｍの範囲、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。非常に好ましい実施形態に従って、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。最も好ましくは、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、１Ｍ未満であり、０．１Ｍ〜０．９Ｍの範囲、または０．１Ｍ〜０．８Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩は、上記カオトロピックアニオンについて上に記載される濃度で、上記結合バッファー中に存在し得る。カオトロピック塩のカチオンとして、アルカリ金属イオン（例えば、好ましくは、ナトリウム）が使用され得る。従って、１つの実施形態に従って、カオトロピック塩は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択される上記結合バッファー中に含まれる。実施例に示されるように、それぞれのカオトロピック塩は、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときに、総ＲＮＡ一部としての小型ＲＮＡの単離に特によく適している。好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムは、０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度で上記結合バッファー中に存在する。好ましい実施形態に従って、上記結合バッファーは、少なくとも０．５Ｍの上記カオトロピック塩を含み、それは、好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムである。トリクロロ酢酸ナトリウムは、好ましくは、０．６Ｍの濃度で上記結合バッファー中に存在する。上に記載されるように、他のカオトロピック塩（例えば、一般的に使用されるグアニジニウム塩）は、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩に加えて上記結合バッファー中に含まれ得る。
【００５０】
さらに、上記結合バッファーは、生物学的バッファーを含み得る。上記生物学的バッファーおよび適切なｐＨ値に関する詳細は、本発明に従う方法とともに上に記載される。それは、上の開示に参照される。好ましくは、７と９との間のｐＨ、８．５のｐＨ、好ましくはｐＨ８〜８．５を有するＴｒｉｓバッファーが使用される。
【００５１】
好ましくは、磁性シリカ粒子は、上記キットに含まれる。このことは、上記磁性シリカ粒子が、単離の間の、取り扱いおよび従って上記シリカ粒子の処理を簡単にするからである。磁性シリカ粒子の使用はまた、例えば、ロボットシステムを介した単離プロトコルの自動化処理を可能にする。適切な磁性シリカ粒子は、上に記載され、また先行技術において公知である。
【００５２】
さらなる実施形態に従って、上記キットは、追加的または代替的に溶解バッファーを含み、これは、好ましくは、少なくとも１つのカオトロピック塩を含む。さらに、上記キットは、追加的または代替的に、溶解酵素（例えば、プロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫ）を含む溶液を含む。
【００５３】
さらに、上記キットは、１つまたはそれより多くの洗浄バッファーを含み得る。適切な洗浄バッファーは、上に記載される；それは、上の開示に参照される。
【００５４】
さらに、上記キットは、追加的または代替的に溶出バッファーを含み得る。適切な溶出バッファーは、上に記載される；それは、上の開示に参照される。
【００５５】
さらなる実施形態に従って、小型ＲＮＡをシリカ粒子に結合させるための組成物が提供され、この組成物は、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子と
ｄ）核酸を含む、少なくとも１つのサンプル、またはサンプルの一部分もしくは一部
とを含む。
【００５６】
シリカ粒子を用いることによって小型ＲＮＡを単離するために、それぞれの結合組成物を使用する利点は、上に詳細に記載される。それは、上の開示に参照される。
【００５７】
好ましくは総ＲＮＡの一部分として、上記サンプルから小型ＲＮＡを単離するのに適している上記組成物は、好ましくは、１つまたはそれより多くの以下の特徴を有する：
１つの実施形態に従って、それは、アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールを含む。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。好ましくは、アルコールとして、イソプロパノールおよび／またはエタノール、最も好ましくはイソプロパノールが含まれる。上記アルコールは、１つの実施形態に従って、約４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下の濃度で含まれる。最も好ましくは、上記アルコールは、５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下の濃度で含まれる。
【００５８】
１つの実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンは、飽和限度までの少なくとも０．０５Ｍの濃度で上記結合組成物中に存在する。１つ実施形態に従って、上記の濃度は、０．０５Ｍ〜４Ｍの範囲にある。１つの実施形態に従って、上記の濃度は、０．０５Ｍ〜３Ｍの範囲、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍの範囲にある。非常に好ましい実施形態に従って、上記結合組成物における、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンの濃度は、０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にある。最も好ましくは、上記カオトロピックアニオンの濃度は、１Ｍ未満であり、０．１Ｍ〜０，９Ｍの範囲、または０．１Ｍ〜０．８Ｍの範囲にある。従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩は、上記カオトロピックアニオンについて上に記載される濃度で、上記結合組成物中に存在し得る。対応するカチオンは、好ましくは、アルカリ金属イオン（例えば、ナトリウム）である。従って、１つの実施形態に従って、上記結合組成物は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択されるカオトロピック塩を含む。実施例に示されるように、それぞれのカオトロピック塩は、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときに、小型ＲＮＡの単離に特によく適している。好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムは、０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度、好ましくは０．１Ｍ〜０．７Ｍの濃度で上記結合組成物中に存在する。もちろん、他のカオトロピック塩（例えば、一般的に使用されるグアニジニウム塩）は、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩に加えて含まれ得る。
【００５９】
さらに、上記組成物は、好ましくはＴｒｉｓである生物学的バッファーを含み得る。適切な生物学的バッファーおよび適切なｐＨ値の例は、本発明に従う方法とともに上に記載される。それは、上の開示に参照される。
【００６０】
上に概説されるように、上記結合組成物はまた、洗剤を含み得る；詳細について、それは上の開示に参照される。
【００６１】
それぞれの組成物の利点およびさらなる特徴はまた、シリカ粒子を用いて小型ＲＮＡを単離するための方法とともに上に概説された。それは、上の開示に参照される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）プライマーアッセイ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；− ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（自動化キットであって、ここで磁性シリカ粒子は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステムによって処理される核酸結合キャリアとして使用される、自動化キット；ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、− ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（ＲＮＡを単離するために、核酸結合キャリアとしてシリカ膜を用いたｍｉＲＮＡの単離のための専用キット；ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、− ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（核酸結合キャリアとしてシリカ膜を用いた一般のＲＮＡ単離キット；ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、および− 本発明の方法に従って、それぞれ、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、またはトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む、結合バッファーを用いたＲＮＡ単離方法であって、ここで磁性シリカ粒子が、単離のための核酸結合キャリアとして使用され、ここではそれは、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステム（ＱＩＡＧＥＮ）によって処理されるＭａｇＡｔｔｒａｃｔ粒子（ＱＩＡＧＥＮ）である、ＲＮＡ単離方法。行われた単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと。上記小型ＲＮＡが、種々の比較された方法によって、上記総ＲＮＡの一部として有効に単離されたかどうかを分析するために、ｍｉＲＮＡ ｈａｓ−ｍｉＲ １６が、ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙにおいて検出された。結果は、図１に示される。
【図２−１】図２ａ）〜図２ｃ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、３つのｍｉＳｃｒｉｐｔ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、および核酸結合キャリアとしてＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用した、トリクロロ酢酸ナトリウムを含む本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ １０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ １６、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【図２−２】図２ａ）〜図２ｃ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、３つのｍｉＳｃｒｉｐｔ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、および核酸結合キャリアとしてＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用した、トリクロロ酢酸ナトリウムを含む本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ １０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ １６、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【図３】図３ａ）および図３ｂ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、２つのＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、および核酸結合キャリアとしてＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用した、トリクロロ酢酸ナトリウムを含む本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈａｓ−ｍｉＲ １６、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【図４】図４ａ）および図４ｂ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、２つのｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、およびイソプロパノールまたはエタノールのいずれかとともにトリクロロ酢酸ナトリウムを含み、核酸結合キャリアとして、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用される、本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ １０ａ、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
実施例
１．ＲＮＡ単離プロトコル
総ＲＮＡを、安定化溶液を含むＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブにおいて、異なる５ドナーからの全血（２．５ｍｌ）から単離した。適切な安定化溶液をまた、上に記載する。安定化されたサンプルを含むＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を、市販のキットＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）のための指示マニュアル、または本発明に従う方法に従って、さらに処理した。
【００６４】
上記安定化されたサンプルを以下のように処理した：
ａ）ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）
詳細なプロトコルは、対応するハンドブックに記載されている。従って、本明細書中において、それぞれのプロトコルを簡潔にのみ記載する：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブを、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。
【００６５】
２． 遠心分離後、上清をデカントすることによって除いた。上記上清を捨て、ペレットをステップ３における再懸濁のために取っておいた。
【００６６】
３． １つのチューブ当たり３００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＢＲ１を添加した。上記チューブを閉め、ボルテックスによってペレットを完全に再懸濁した。マルチチューブボルテクサー（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）を、それぞれ、上記ペレットが完全に再懸濁するまで、全速力で３０秒間、再懸濁のために使用した。
【００６７】
４． クロージャ（ｃｌｏｓｕｒｅ）を除き、捨てた。
【００６８】
５． ロボットシステムＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＳＰを、さらなる処理のために使用した。ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ単離のために必要とされる試薬カートリッジおよび消耗品を、「試薬および消耗品」引出しに入れた。さらに、必要とされる溶出ラックを「溶出液」引出しに入れた。
【００６９】
６． ステップ４からのサンプルを、適切なサンプルキャリアに配置し、「サンプル」引出しに入れた。その後、上記サンプルを、対応するプログラムを用いて、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙによって処理した。簡単に言うと、上記ロボットシステムＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙは、溶解バッファーＢＲ２、プロテイナーゼＫ、およびＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズを添加することによってプローブを処理する。まず、ＤＮＡを上記ビーズに結合させ、除く。その後、結合バッファーＱＳＢ１の他にさらなる磁性ビーズを添加する。その後、複合体を、バッファーＱＳＢ１およびバッファーＢＲ４を用いて予め洗浄する。
【００７０】
７． 上記サンプルをバッファーＢＲ５で予め溶出し、残っているＤＮＡを消化する。バッファーＱＳＢ２を添加することによって、ＲＮＡを再結合させる。その後、さらなる洗浄ステップを行い、複合体を乾燥させ、ＲＮＡを溶出する。
【００７１】
ｂ）ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）
詳細なプロトコルは、対応するハンドブックに記載されている。従って、本明細書中において、それぞれのプロトコルを簡潔にのみ記載する：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブを、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。
【００７２】
２． 上清をデカントまたはピペッティングによって除いた。４ｍｌのＲＮアーゼを含まない水を、ペレットに添加し、チューブを閉めた。
【００７３】
３． 上記ペレットを、目に見えて溶解するまでボルテックスし、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。その上清全体をデカントまたはピペッティングによって除き、捨てた。
【００７４】
４． ３５０μｌのバッファーＢＭ１を添加し、ペレットが目に見えて溶解するまでボルテックスした。
【００７５】
５． サンプルを１．５ｍｌの微量遠心分離チューブにピペットで入れた。３００μｌのバッファーＢＭ２、および４０μｌのプロテイナーゼＫを添加した。これらの構成要素を、５秒間ボルテックスすることによって混合し、４００〜１４００ｒｐｍでのシェーカーインキュベーターにおいて５５℃にて１０分間、インキュベートした。インキュベーション後、ステップ２０において使用するために、シェーカーインキュベーターの温度を６５℃に設定した。
【００７６】
６． サンプルを、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにピペットで入れ、２ｍｌの処理チューブに配置し、全速力で３分間、遠心分離した。
【００７７】
７． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムからのフロースルーの上清全体を、上記処理チューブ内のペレットをかき乱すことなく、新しい１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに慎重に移した。
【００７８】
８． ７００μｌのイソプロパノール（１００％、純度グレード ｐ．ａ．）を添加し、ボルテックスすることによって混合した。
【００７９】
９． ７００μｌのサンプルをＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、２ｍｌの処理チューブに配置した。８０００〜２００００×ｇでの１分間の遠心分離後、そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８０】
１０． 残っているサンプルをＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、古い処理チューブを捨てた。
【００８１】
１１． ３５０μｌのバッファーＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加した。ふたを閉め、８０００〜２００００×ｇで１５秒間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８２】
１２． １０μｌのＤＮアーゼＩストック溶液を、１．５ｍｌの微量遠心分離チューブ中の７０μｌのバッファーＲＤＤに添加した。
【００８３】
１３． ＤＮアーゼＩインキュベーション混合物（８０μｌ）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せ、ベンチトップ上で１５分間インキュベートした。
【００８４】
１４． ３５０μｌのバッファーＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加した。ふたを閉め、８０００〜２００００×ｇで１５秒間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８５】
１５． ５００μｌのバッファーＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加し、８０００〜２００００×ｇで１５秒間、遠心分離した。フロースルーを捨てた。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８６】
１６． 別の５００μｌのバッファーＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加し、８０００〜２００００×ｇで２分間、遠心分離した。
【００８７】
１７． フロースルーを含む処理チューブを捨て、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。
【００８８】
１８． フロースルーを含む処理チューブを捨てた。ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを新しい１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに配置し、４０μｌのバッファーＢＲ５を、そのスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せた。ふたを閉め、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。
【００８９】
１９． ４０μｌのバッファーＢＲ５および同じ微量遠心分離チューブを用いて、溶出ステップ１８を記載されたように繰り返した。
【００９０】
２０． 溶出液を、シェーカーインキュベーターにおいて振とうさせることなく、６５℃にて５分間、インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを氷上ですぐに冷やした。
【００９１】
２１． その後、サンプルは、すぐに使用でき、それぞれ保存した。
【００９２】
ｃ）ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）
詳細なプロトコルは、対応するハンドブックに記載される。従って、本明細書中において、それぞれのプロトコルを簡潔にのみ記載する：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡチューブを、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。
【００９３】
２． 上清をデカントまたはピペッティングによって除いた。４ｍｌのＲＮアーゼを含まない水を、ペレットに添加し、チューブを閉めた。
【００９４】
３． 上記ペレットを、目に見えて溶解するまでボルテックスし、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。その上清全体を除き、捨てた。
【００９５】
４． ３５０μｌの再懸濁バッファー（ＢＲ１）を添加し、ペレットが目に見えて溶解するまでボルテックスした。
【００９６】
５． サンプルを１．５ｍｌの微量遠心分離チューブにピペットで入れた。３００μｌの結合バッファー（ＢＲ２）、および４０μｌのプロテイナーゼＫを添加し、５秒間ボルテックスすることによって混合し、４００〜１４００ｒｐｍでのシェーカーインキュベーターを用いて、５５℃にて１０分間、インキュベートした。インキュベーション後、ステップ２０のために、シェーカーインキュベーターの温度を６５℃に設定した。
【００９７】
６． 溶解産物を、２ｍｌの処理チューブに配置されたＰＡＸｇｅｎｅ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにピペットで直接的に入れ、最高スピードで３分間、遠心分離した。
【００９８】
７． フロースルー画分の上清全体を、処理チューブ内のペレットをかき乱すことなく、新たな１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに慎重に移した。
【００９９】
８． ３５０μｌのエタノール（９６〜１００％、純度グレード ｐ．ａ．）を添加し、ボルテックスすることによって混合し、軽く遠心分離して（５００〜１０００×ｇで１〜２秒）、チューブのふたの内側から滴を除いた。
【０１００】
９． ７００μｌのサンプルを、２ｍｌの処理チューブに配置されたＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０１】
１０． 残っているサンプルをＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０２】
１１． ３５０μｌの洗浄バッファー１をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０３】
１２． １０μｌのＤＮアーゼＩストック溶液を、１．５ｍｌの微量遠心分離チューブ中の７０μｌのＤＮＡ消化バッファー（ＲＤＤ）に添加し、混合し、軽く遠心分離した。
【０１０４】
１３． ＤＮアーゼＩインキュベーション混合物（８０μｌ）をＰＡＸｇｅｎｅスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せ、ベンチトップ上に１５分間置いた。
【０１０５】
１４． ３５０μｌの洗浄バッファー１（ＢＲ３）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０６】
１５． ５００μｌの洗浄バッファー２（ＢＲ４）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０７】
１６． 別の５００μｌの洗浄バッファー２（ＢＲ４）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加し、８０００〜２００００×ｇで３分間、遠心分離した。
【０１０８】
１７． フロースルーを含む処理チューブを捨て、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。
【０１０９】
１８． フロースルーを含む処理チューブを捨て、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを１．５ｍｌの遠心分離チューブに配置し、４０μｌの溶出バッファー（ＢＲ５）を、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。
【０１１０】
１９． ４０μｌの溶出バッファー（ＢＲ５）および同じ微量遠心分離チューブを用いて、溶出ステップ１８を記載されたように繰り返した。
【０１１１】
２０． 溶出液を、シェーカーインキュベーターにおいて振とうさせることなく、６５℃にて５分間、インキュベートした。インキュベーション後、そのサンプルを氷上ですぐに冷やした。
【０１１２】
２１． サンプルは、ここですぐに使用でき、それぞれ保存した。
【０１１３】
ｄ）本発明に従う方法
本発明に従う方法を、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステムにおいて行った。簡単に言うと、以下のステップを行った：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブを、３．０００〜６．０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。ペレットを、酢酸アンモニウムを含むバッファー（３００μｌ）の添加およびボルテックスすることによって再懸濁した。
【０１１４】
２． さらに溶解剤、好ましくはプロテイナーゼＫ（４０μｌ）、および３Ｍ超のカオトロピック塩、好ましくはＧＩＴＣを含む溶解バッファー（２３０μｌ）を添加した。その後、サンプルを５６℃で１０分間、インキュベートした。
【０１１５】
３． ＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズを添加して、ＤＮＡをシリカ粒子と一緒に結合させて除いた。
【０１１６】
４． ＲＮＡの結合のために、新しいＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズ、ならびに本発明に従って、８０％のイソプロパノール（またはエタノール）、それぞれ０．６Ｍの過塩素酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、またはトリクロロ酢酸ナトリウム、およびＴｒｉｓを含む１５００μｌの結合バッファーを添加した。
【０１１７】
５． ２つの洗浄ステップを行った。第一の洗浄ステップを、イソプロパノール、ＧＴＣおよび洗剤を含むバッファーで行い；第二の洗浄ステップを、エタノールおよびＴｒｉｓを含む洗浄バッファーで行った。
【０１１８】
６． その後、ＤＮアーゼ消化を行った。
【０１１９】
７． ＲＮＡを上記ビーズに再結合させるために、本発明に従って、１４００μｌの同じ結合バッファー（上記を参照のこと）を添加した。この第二の結合ステップは小型ＲＮＡの良好な収量を確実にする。
【０１２０】
８． その後、４つの追加の洗浄ステップを行った。
【０１２１】
９． 総ＲＮＡを、適切な溶出バッファー（ＢＲ５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、溶出した。また、他の一般的な溶出バッファー（例えば、水またはＴｒｉｓバッファー）が、使用され得る。
【０１２２】
２．結果
小型ＲＮＡが総ＲＮＡの一部として有効に単離されたかどうかを、種々の比較された方法によって分析するために、数種類のｍｉＲＮＡを種々の確立されたアッセイ（詳細は、図を参照のこと）を用いて検出した。各方法の溶出液を用いて得られたＣＴ値を示す。ＣＴ値が高くなればなるほど、分析された溶出液におけるそれぞれのｍｉＲＮＡの濃度はより低く、従って、試験された方法による小型ＲＮＡの単離はより効率が低かった。
【０１２３】
結果は、磁性シリカ粒子を用いる市販のキットが、小型ＲＮＡを単離することにおいて、単離のために特定のカオトロピック塩を用いる本発明の方法よりも効率が低いことを示す（図を参照のこと）。最良の結果は、マニュアルＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡキットを用いて達成されるが、このキットは、シリカ膜ベースであり、従って、柔軟性がありかつ高スループットの自動化プロセスに適さないという欠点を有する。本発明に従う方法で得られた結果は、たとえ磁性シリカ粒子が単離に使用されても、本発明に従う方法が良好な収量で小型ＲＮＡを単離するのに適していることを示す。従って、本発明によって提供される新規の結合条件は、特定の結合条件を用いることによって、シリカ粒子の使用に基づく標準ＲＮＡ単離方法を改善することを可能にし、それにより、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときでさえ、小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする。
【技術分野】
【０００１】
本発明をもたらした研究は、助成金契約番号２２２９１６の下、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ’ｓ Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（ＦＰ７／２００７−２０１３）からの資金提供を受けている。
【０００２】
本発明は、小型ＲＮＡ分子をサンプル、特に生物学的サンプル（例えば、組織および体液）から単離するための方法、組成物、およびキットに関連する。
【背景技術】
【０００３】
小型ＲＮＡ（すなわち、種々の組織および多くの生物由来、ならびに細胞の培養物由来のおよそ２５０ヌクレオチドまたはそれより少ないＲＮＡ分子）の研究は、大変興味深い領域であり、将来に１つ残る見込みがある。小型ＲＮＡとしては、とりわけマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子干渉ＲＮＡ分子が挙げられ、その両方は、遺伝子の発現に及ぼす強力な作用を有し得る。さらに、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡプロセシングに関与する他の核内低分子ＲＮＡおよび核小体低分子ＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ）も重要である。
【０００４】
それぞれの小型ＲＮＡ分子に対する興味の増加を伴って、標準的な単離手順は、小型ＲＮＡの単離を容易にするために改変されている。このことは、小型ＲＮＡ分子が、単離プロセスの間に有効に捕捉および溶出されないことが多いので、ＤＮＡまたは総ＲＮＡを単離するための標準として使用される公知のプロトコルが、通常、小型ＲＮＡ分子を単離するのに理想的ではないからである。従って、標準手順を用いてサンプルから単離される総ＲＮＡは、通常、十分な量の小型ＲＮＡ分子を含まない。従って、小型ＲＮＡ分子の、単独または総ＲＮＡの一部としての、効率的な単離のための改善された技術の必要性が存在する。
【０００５】
小型ＲＮＡ分子の単離のために最適化されている方法は、しばしば、フェノールおよびクロロホルム抽出ならびに段階的なアルコール分画に依存する。フェノールおよびクロロホルムの使用を含む方法の主要な欠点は、とりわけ、これらの化学物質が潜在的な健康リスクを引き起こすことである。さらに、それらはまた特定の生物学的物質と効果がない。さらに、相の分離およびアルコール分画は、困難で時間がかかり、高スループットおよび自動化の要求に適合しないようにする。
【０００６】
さらに、総ＲＮＡの単離のためのカオトロピック剤、高濃度のアルコールおよびシリカ膜の使用を含む、小型ＲＮＡを単離するための改善された方法が開発されている。これらのプロトコルを用いて単離される総ＲＮＡはまた、一部分として小型ＲＮＡを含む。これらの方法は、従って、小型ＲＮＡ分子を効率的に単離するのに有用である。これらの方法に基づく市販の製品は、例えば、ＱＩＡＧＥＮによって販売されるＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡキットである。このキットは、サンプルからの小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする。しかし、たとえこの方法が、小型ＲＮＡを単離することにおいて非常に効率的であっても、単離がシリカ膜によって行われるという欠点を有する。シリカ膜を用いる単離手順は、しばしば時間がかかり、また、高スループット様式（例えば、ロボットシステムを用いる）での柔軟性がありかつ専用の自動化プロセスによって小型ＲＮＡを単離するのを難しくする。さらに、より大きいサンプル体積も処理できることが望ましい。特に、複雑な生物学的サンプル（例えば、全血、および血液産物）から小型ＲＮＡを効率的に単離することが望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、好ましくは、自動化システムによる処理をも可能にする、サンプル、特に生物学的サンプルからの小型ＲＮＡ分子の効率的な単離のための改善された技術の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、シリカ粒子を用いることによって、小型ＲＮＡ分子をサンプルから迅速かつ効率的に単離するための方法を提供する。シリカ粒子、特に磁性シリカ粒子の使用は、サンプルからの小型ＲＮＡ分子の、迅速で、柔軟性があり、かつまた自動化された高スループットでの単離を可能にする。本発明者らは、シリカ粒子を用いるときに複雑なサンプルであっても小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする特別な結合条件を同定した。
【０００９】
従って、本発明の１つの局面に従って、小型ＲＮＡをサンプルから単離するための方法を提供し、ここで、上記方法は、
上記サンプルを
ａ）少なくとも１つのアルコール、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩、および
ｃ）シリカ粒子
と接触させることによって、上記ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる工程、ならびに
結合した上記ＲＮＡを上記サンプルの残りから分離する工程
を含む。
【００１０】
この方法は、良好な収量で、サンプルからの小型ＲＮＡの効率的かつ迅速な単離を可能にすることが見出されている。上記小型ＲＮＡは、好ましくは、総ＲＮＡの一部として得られる。
【００１１】
本発明のさらなる局面に従って、小型ＲＮＡをサンプルから単離するためのキットを提供し、このキットは、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子
とを含む。
【００１２】
本発明のさらなる局面は、小型ＲＮＡをシリカ粒子に結合させるための組成物を包含し、この組成物は、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子
とを含む。
【００１３】
本願の他の目的、特徴、利点および局面は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかとなる。しかし、以下の記載、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例が、本願の好ましい実施形態を示す一方で、例示のみとして与えられることが理解されるべきである。開示される発明の趣旨および範囲内の種々の変化および改変は、以下を読むことによって当業者に容易に明らかとなる。
【００１４】
発明の詳細な説明
シリカ粒子（例えば、磁性シリカ粒子）が、それらの結合の特徴においてシリカ膜とかなり異なることが見出されている。従って、シリカ膜について確立された結合条件は、特に複雑なサンプル（例えば、全血のサンプル）について、特にシリカ粒子と同等の量で、効率的に小型ＲＮＡを結合させるのに適していない。このことは、シリカ粒子を用いるときに、受容可能な収量での小型ＲＮＡの単離および精製を難しくする。
【００１５】
従って、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子（例えば、特に磁性シリカ粒子）を用いるときに小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする適切な結合条件を見出すことが必要であった。シリカ粒子および特に磁性シリカ粒子の使用は、例えば、自動化プロセスにおける粒子の処理に関して利点を有する。
【００１６】
特定のカオトロピックアニオンを用いることによって、小型ＲＮＡをシリカ粒子に有効に結合させることが可能であることが、今や、驚くことに見出された。特定のカオトロピックアニオンを用いるとき、上記小型ＲＮＡの結合は、一般的に使用されるカオトロピック剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアネートまたはグアニジニウムヒドロクロリド）を含む通常の結合条件と比較してかなり改善された。
【００１７】
従って、本発明の第一の局面に従って、小型ＲＮＡをサンプルから単離するための方法を提供し、上記方法は、サンプルを
ａ）少なくとも１つのアルコール、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩、および
ｃ）シリカ粒子
と接触させることによって、上記ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる工程、ならびに
結合したＲＮＡをサンプルの残りから分離する工程を含む。
【００１８】
それぞれの結合条件が、磁石を介したシリカ粒子の処理を簡便にするために好ましくは磁性シリカ粒子であるシリカ粒子への小型ＲＮＡの効率的な結合を可能にし、それにより、手動の処理の他に、ロボットシステムを使用することによる容易な処理をも可能にすることが驚くことに見出された。
【００１９】
１つの実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンは、飽和限度までの少なくとも０．０５Ｍの濃度で、結合組成物中に存在する。１つの実施形態に従って、濃度は０．０５Ｍ〜４Ｍの範囲にある。１つの実施形態に従って、濃度は０．０５Ｍ〜３Ｍの範囲、および好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍの範囲にある。非常に好ましい実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンの濃度は、０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にある。最も好ましくは、上記カオトロピックアニオンの濃度は、１Ｍ未満であり、０．１Ｍ〜０．９Ｍの範囲、または０．１Ｍ〜０．８Ｍの範囲にある。従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩は、好ましくは、特に上記塩が一価カチオンを含むときに本発明に従ってカオトロピックアニオンについて上に記載された濃度で、結合組成物中に存在する。カチオンとして、アルカリ金属イオン（例えば、好ましくは、ナトリウム）が使用され得る。従って、１つの実施形態に従って、カオトロピック塩は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択される。実施例に示されるように、それぞれのカオトロピック塩は、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときに、小型ＲＮＡの単離に特によく適している。好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムは、０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度、好ましくは０．１Ｍ〜０．７Ｍの濃度で、結合組成物中に存在する。所望される場合、他のカオトロピック塩（例えば、一般的に使用されるグアニジニウム塩）も、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩に加えて使用され得る。
【００２０】
シリカ粒子を用いることによって小型ＲＮＡを単離することについて、結合の間、および従って結合組成物中で、４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下のアルコール濃度を使用することは、有益である。最も好ましいものは、結合の間、５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下のアルコール濃度である。また、アルコールの混合物が使用され得る。
【００２１】
アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールが使用され得る。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。上記アルコールは、好ましくは、イソプロパノール、およびエタノールから選択され、特によく適しているのは、イソプロパノールである。
【００２２】
必要に応じて、１つまたはそれより多くの洗剤が、結合組成物中に含まれ得る。好ましくは、イオン性および／または非イオン性洗剤が、洗剤として使用される。好ましくは、非イオン性洗剤が、少なくとも５％の濃度で使用される。上記洗剤は、例えば、結合バッファーとともに添加され得る。
【００２３】
さらに、生物学的バッファーは、結合のために使用され得る。生物学的バッファーの限定されない例としては、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンおよび他が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーが使用される。従って、１つの実施形態に従って、上記サンプルは、少なくとも１つのアルコールと、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、ならびに好ましくはＴｒｉｓである生物学的バッファーとを含む結合バッファーと接触させられる。必要に応じて、上記結合バッファーはまた、上に記載されるような洗剤を含み得る。しかし、構成要素はまた、上記サンプルに別個に添加されて、適切な結合組成物を形成し得る。好ましくは、上記結合バッファーは、ｐＨ８を含む範囲において緩衝化する。１つの実施形態に従って、上記結合バッファーは、ｐＨ７．０〜９、好ましくは７．５〜８．５の範囲にあるｐＨを有し；最も好ましい上記結合バッファーは、ｐＨ８を有する。
【００２４】
上記シリカ粒子は、ビーズの形態で使用され得、好ましくは約０．０２μｍ〜約３０μｍの粒径、好ましくは０．０５μｍ〜１５μｍの粒径、および最も好ましくは０．１μｍ〜１０μｍの粒径を有する。核酸結合キャリアの処理を容易にするために、好ましくは磁性シリカ粒子が使用される。上記磁性シリカ粒子は、例えば、フェリ磁性、強磁性、常磁性、または超常磁性であり得る。適切な磁性シリカ粒子は、例えば、ＷＯ０１／７１７３２、ＷＯ２００４／００３２３１、およびＷＯ２００３／００４１５０に記載される。他の磁性シリカ粒子はまた、先行技術から公知であり、例えば、ＷＯ９８／３１８４０、ＷＯ９８／３１４６１、ＥＰ１ ２６０ ５９５、ＷＯ９６／４１８１１、およびＥＰ０ ３４３ ９３４に記載され、また例えば、磁性シリカガラス粒子を含む。
【００２５】
上に概説されるように、本発明の方法は、サンプルから小型ＲＮＡを回収するのに特に適している。代表的に、小型ＲＮＡ分子は、長さが、約２５０ヌクレオチド未満、好ましくは２００ヌクレオチド未満である。原核細胞および真核細胞の両方は、複数の異なる大きさのＲＮＡ分子を含む。約２００または２５０ヌクレオチドの長さより大きなＲＮＡ分子としては、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）（ｌｎｃＲＮＡ）／長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）（ｌｉｎｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、１６Ｓ／１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、および２３Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡが挙げられる。約２００〜２５０ヌクレオチド未満の長さを有する小型ＲＮＡ分子としては、５．８Ｓ ｒＲＮＡ、５Ｓ ｒＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、反復配列関連ｓｉＲＮＡ（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ）（ｒａｓｉＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）、極小ノンコーディングＲＮＡ（ｔｉｎｙ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）（ｔｎｃＲＮＡ）、小型走査ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｓｃａｎ ＲＮＡ）（ｓｃＲＮＡ）、および小型調節性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ＲＮＡ）（ｓｍＲＮＡ）が挙げられる。上記小型ＲＮＡは、総ＲＮＡの一部分として得られ得、従って、サンプルから単離される総ＲＮＡ中に実質的な量で含まれる。
【００２６】
上記サンプルは、任意の種類であり得、従って、また、小型ＲＮＡ分子を含むインビトロでのサンプルであり得る。好ましくは、上記サンプルは、ヒト、動物、植物、細菌、または真菌類由来の生物学的サンプルである。好ましくは、上記サンプルは、細胞、組織、細菌、ウイルス、および体液（例えば、血液、血液産物（例えば、軟膜、血漿、および血清）、尿、液体（ｌｉｑｕｏｒ）、痰、便、ＣＳＦ、および精子）、上皮スワブ、生検材料、骨髄サンプル、および組織サンプル、好ましくは、器官組織サンプル（例えば、肺および肝臓）からなる群より選択される。好ましくは、上記サンプルは、全血および血液産物（例えば、軟膜、血清、または血漿）から選択される。
【００２７】
ＲＮＡが生物学的サンプル（例えば、全血または血液産物）から単離されるときに特に好ましい１つの実施形態に従って、核酸は、サンプルの現状および特に転写パターンを保存するために好ましくは、生物学的サンプルが、その天然の環境から取得されたすぐ後に安定化される。これは、医学および診断の分野において特に有益である。
【００２８】
従って、１つの実施形態に従って、上記生物学的サンプルは、上記サンプルから核酸を単離する前に上記生物学的サンプルにおいて核酸を安定化するために核酸保存安定化組成物と混合される。１つの実施形態に従って、上記安定化組成物は、
ａ）一般式：
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−
のカチオン性化合物であって、
ここでＹは、窒素またはリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）を表し、好ましくは窒素を表し、
Ｒ１Ｒ２Ｒ３およびＲ４は、独立して、分岐または非分岐のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基および／またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を表し；
Ｘ−は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸のアニオンを表す、カチオン性化合物；ならびに
ｂ）少なくとも１つのプロトン供与体であって、ここで上記プロトン供与体は、好ましくは、飽和までの５０ｍＭより上の濃度で上記組成物に存在し、ここで上記プロトン供与体は、好ましくは、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニルカルボン酸、飽和および／もしくは不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシルジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシルトリカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、または無機酸、またはそれらの塩からなる群から、それら単独で、または組み合わせて選択される、少なくとも１つのプロトン供与体
を含む。
【００２９】
好ましくは、Ｒ１は、１２、１４、または１６炭素原子を有する、高級アルキル基を示し、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれメチル基を表す。
【００３０】
好ましくは、上記アニオンＸ−は、ハロゲン化水素酸（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｃ ａｃｉｄ）のアニオン、または一塩基性または二塩基性有機酸のアニオンを表し、最も好ましい上記アニオンＸ−は、臭化物イオン、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、シュウ酸イオン、マロン酸イオン、コハク酸イオン、またはクエン酸イオンからなる群より選択される。
【００３１】
好ましくは、上記プロトン供与体は、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニルカルボン酸、飽和および／もしくは不飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、または無機酸、またはそれらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、上記脂肪族モノカルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸、イソ吉草酸、エチルメチル酢酸（２−メチル酪酸）、２，２−ジメチルプロピオン酸（ピバル酸）、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、またはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）、またはそれらの混合物からなる群より選択されるＣ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸を含む。好ましくは、脂肪族アルケニルカルボン酸は、アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸、もしくはビニル酢酸、またはそれらの混合物からなる群より選択される。好ましくは、上記飽和脂肪族Ｃ２〜Ｃ６ジカルボン酸は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、もしくはアジピン酸、またはそれらの混合物からなる群より選択される。最も好ましくは、上記脂肪族ジカルボン酸は、シュウ酸、もしくはコハク酸、またはそれらの混合物である。好ましくは、上記脂肪族ヒドロキシルジカルボン酸、および脂肪族ヒドロキシルトリカルボン酸は、タルトロン酸、Ｄ−（＋）−リンゴ酸、Ｌ−（−）−リンゴ酸もしくはＤＬ−リンゴ酸、（２Ｒ，３Ｒ）−（＋）−酒石酸、（２Ｓ，３Ｓ）−（−）−酒石酸、メソ酒石酸、およびクエン酸、またはそれらの混合物からなる群より選択される。最も好ましくは、上記不飽和ジカルボン酸は、マレイン酸および／もしくはフマル酸、またはそれらの混合物である。好ましくは、不飽和トリカルボン酸は、アコニット酸である。好ましくは、脂肪族ケトジカルボン酸は、メソシュウ酸もしくはオキサロ酢酸、またはそれらの混合物である。好ましくは、上記アミノ酸は、アミノ酢酸（グリシン）、α−アミノプロピオン酸（アラニン）、α−アミノイソ吉草酸（バリン）、α−アミノイソカプロン酸（ロイシン）、およびα−アミノ−β−メチル吉草酸（イソロイシン）、またはそれらの混合物からなる群より選択される。
【００３２】
好ましくは、安定化させる組成物は、水性溶液中に存在する。好ましくは、上記カチオン性化合物は、０．０１重量％〜１５重量％の範囲の濃度で含まれる。
【００３３】
適切な安定化させる溶液はまた、例えば、ＵＳ７，２７０，９５３において詳細に記載され、本明細書中で参考として援用される。
【００３４】
安定化させる溶液中の添加物に起因して、上に記載されるように安定化された複雑なサンプルは、核酸を単離することが特に難しい。本発明の方法は、これらの困難な点を克服し、それぞれ安定化されたサンプル、および特に複雑な生物学的サンプル（例えば、血液、血液産物（例えば、軟膜、血清および／または血漿）、または組織サンプル、特に、例えば、肺および肝臓から得られる器官組織サンプル）由来の特に総ＲＮＡの一部として、良好な収量での小型ＲＮＡの単離を可能にする。従って、本発明の方法は、医学および特に診断の分野において特に有用である。
【００３５】
さらに、本発明の方法は、大きいサンプル体積からも、複雑なサンプル（例えば、全血、血液産物、または組織サンプル）に直面するときにも、ＲＮＡ（上記小型ＲＮＡが挙げられる）の単離を可能にすることが、驚くことに見出された。従って、少なくとも１ｍｌ、少なくとも２ｍｌ、および好ましくは少なくとも２．５ｍｌの体積を有する複雑なサンプルは、本発明の方法で効率的に処理され得る。
【００３６】
使用されるサンプルに依存して、ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる前に上記サンプルを予め処理することが有用であり得る。従って、１つの実施形態に従って、上記サンプルの少なくとも一部分は、少なくとも１つ溶解剤の添加によって、結合前に予め処理される。好ましくは、溶解のために、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）、およびカオトロピック剤（例えば、グアニジニウムヒドロクロリド、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、および／または過塩素酸ナトリウム）が使用される。溶解のための他の適切な方法としては、例えば、洗剤（例えば、ＳＤＳ、ＬｉＤＳ、またはサルコシル）の使用が挙げられる。しかし、また、先行技術において公知である他の適切な溶解方法が使用され得る。それぞれの方法が、先行技術において公知であるので、ここでさらに記載する必要はない。好ましくは、溶解は、プロテイナーゼＫ、およびカオトロピック剤を用いて、中性ｐＨにてバッファーにおいて行われる。
【００３７】
１つの実施形態に従って、非標的核酸は、適切な核酸結合キャリアの添加によって、主に上記非標的核酸が上記核酸結合キャリアに結合される条件下で、溶解後、少なくとも部分的に除去される。この目的のために、再度シリカ粒子が使用され得る。通常、ＲＮＡが上記生物学的サンプルから単離されるとき、上記非標的核酸はＤＮＡである。それぞれの非標的核酸を除去するための適切な方法は、例えば、ＥＰ０ ８８０ ５３７およびＷＯ９５／２１８４９に記載される。
【００３８】
ＲＮＡの単離についての１つの実施形態に従って、上記非標的核酸の除去後に得られる上清は、上に記載されるように、シリカ粒子、少なくとも１つのアルコール、ならびにトリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と接触させて、上記ＲＮＡ（上記小型ＲＮＡが挙げられる）を上記シリカ粒子に結合させる。適切な結合条件は上に記載される。それは、上の開示に参照される。
【００３９】
好ましい実施形態に従って、上記シリカ粒子に結合後、上記ＲＮＡは、１つまたはそれより多くの洗浄バッファーを用いて少なくとも１回洗浄される。適切な洗浄バッファーの例は、少なくとも１つのカオトロピック剤、および／または少なくとも１つのアルコールを含む。洗浄バッファーにおいて使用され得るカオトロピック塩としては、グアニジニウムヒドロクロリド、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムイソチオシアネート、およびヨウ化ナトリウムが挙げられる。さらに、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩が使用され得る。それぞれのカオトロピック塩の例は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムのようなアルカリ塩である。アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールが使用され得る。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。好ましくは、イソプロパノール、および／またはエタノールが使用される。好ましくは、上記洗浄バッファーは、少なくとも５０％のアルコール、および少なくとも１Ｍのカオトロピック塩、好ましくは少なくとも２Ｍのカオトロピック塩を含む。さらに、上記洗浄バッファーは、洗剤を含み得る。好ましくは、イオン性および／または非イオン性洗剤が、洗剤として使用される。好ましくは、非イオン性洗剤は、少なくとも５％の濃度で使用される。
【００４０】
上に記載される洗浄バッファーの代わり、またはこのバッファーの他に使用され得る、さらなる適切な洗浄バッファーは、アルコールおよび生物学的バッファーを含む。適切なアルコールおよび生物学的バッファーは、上に記載される。好ましくは、イソプロパノールまたはエタノール、最も好ましくはエタノールが、この第二の洗浄ステップのために使用される。好ましくは、エタノールは、少なくとも７０ｖ／ｖ％の濃度、好ましくは少なくとも８０ｖ／ｖ％の濃度で使用される。上記生物学的バッファーは、好ましくは約７〜８のｐＨのＴｒｉｓである。
【００４１】
１つの実施形態に従って、ＤＮアーゼ消化は、第一の洗浄ステップ（複数可）の後に行われる。ＤＮアーゼ消化を行うための条件が、先行技術において周知であるので、ここでさらに記載する必要はない。
【００４２】
１つの実施形態に従って、第一の洗浄ステップ（複数可）および必要に応じてＤＮアーゼ消化の後に、上記シリカ粒子および上記ＲＮＡは、再度、少なくとも１つのアルコール、ならびにトリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と接触させられる。この目的のために、好ましくは、それぞれの剤および必要に応じて上に記載されるような洗剤を含む、結合バッファーが使用される。この第二のＲＮＡ結合ステップは、上記シリカ粒子に対する上記ＲＮＡ、および特に上記小型ＲＮＡのしっかりした結合を確実にし、従って、良好な収量を確実にする。上記第二の結合ステップは、上に記載されるような条件下で行われ得、ここで、適切な濃度および例は、特に、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオン、対応するカオトロピック塩、アルコール、および生物学的バッファーについて記載される。それは、上の開示に参照される。
【００４３】
必要に応じて、さらなる洗浄ステップが、上記第二のＲＮＡ結合ステップの後に行われ得る。洗浄バッファーとして、上に記載されるのと同じ洗浄バッファーが使用され得る。それは、上の開示に参照される。
【００４４】
所望される場合、上記ＲＮＡは、上記シリカ粒子から溶出され得る。あるいは、上記ＲＮＡはまた、意図されるその後の適用（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に依存して、依然として上記シリカ粒子に結合されている間に処理され得る。溶出は、例えば、古典的な溶出バッファー（例えば、水、バッファー、特に生物学的バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ））を用いて行われ得、好ましくは、意図されるその後の適用を妨げない溶出溶液が使用される。
【００４５】
上に記載される、小型ＲＮＡの単離を行った後、必要に応じて総ＲＮＡの一部として上記小型ＲＮＡは使用され得、それぞれさらに処理（例えば、増幅、改変、逆転写または分析手順）され得る。
【００４６】
また、提供されるのは、サンプルから小型ＲＮＡを単離するためのキットであって、上記キットは、
ａ）必要に応じて、少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子と、
ｄ）必要に応じて、使用のための指示書
とを含む、キットである。
【００４７】
１つの実施形態に従って、上記キットは、アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールを含む。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。好ましくは、イソプロパノール、および／またはエタノールが、アルコールとしてキットに含まれる。上に記載されるように、イソプロパノールが最も好ましい。
【００４８】
上記キットは、少なくとも１つのアルコールと、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩とを含む、結合バッファーを含み得る。１つの結合バッファー中に上記アルコールおよび上記カオトロピック塩を提供することは、顧客が、それぞれの構成要素を別個に混合して上記結合組成物を形成する必要がないという利点を有する。上記結合バッファーは、好ましくは、約４０ｖ／ｖ％以上の、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下の、上記結合組成物におけるアルコールの濃度をもたらすのに適した濃度で上記アルコールを含む。最も好ましい上記アルコールは、上記結合組成物において、５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下のアルコール濃度をもたらすのに適した上記結合バッファーにおいて提供される。この目的のために、１つの実施形態に従って、上記結合バッファーは、少なくとも６０ｖ／ｖ％、好ましくは少なくとも７０ｖ／ｖ％の濃度でアルコールを含む。
【００４９】
さらに、１つの実施形態に従って、上記結合バッファーは、上記カオトロピック塩を含み、このカオトロピック塩は、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む。１つの実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、飽和限度までの少なくとも０．０５Ｍの上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で、上記結合バッファー中に存在する。１つの実施形態に従って、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、０．０５Ｍ〜４Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。１つの実施形態に従って、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、０．０５Ｍ〜３Ｍの範囲、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。非常に好ましい実施形態に従って、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。最も好ましくは、上記カオトロピックアニオンは、上記結合組成物において、１Ｍ未満であり、０．１Ｍ〜０．９Ｍの範囲、または０．１Ｍ〜０．８Ｍの範囲にある上記カオトロピックアニオンの濃度を得るのに適した濃度で上記結合バッファー中に存在する。従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩は、上記カオトロピックアニオンについて上に記載される濃度で、上記結合バッファー中に存在し得る。カオトロピック塩のカチオンとして、アルカリ金属イオン（例えば、好ましくは、ナトリウム）が使用され得る。従って、１つの実施形態に従って、カオトロピック塩は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択される上記結合バッファー中に含まれる。実施例に示されるように、それぞれのカオトロピック塩は、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときに、総ＲＮＡ一部としての小型ＲＮＡの単離に特によく適している。好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムは、０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度で上記結合バッファー中に存在する。好ましい実施形態に従って、上記結合バッファーは、少なくとも０．５Ｍの上記カオトロピック塩を含み、それは、好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムである。トリクロロ酢酸ナトリウムは、好ましくは、０．６Ｍの濃度で上記結合バッファー中に存在する。上に記載されるように、他のカオトロピック塩（例えば、一般的に使用されるグアニジニウム塩）は、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩に加えて上記結合バッファー中に含まれ得る。
【００５０】
さらに、上記結合バッファーは、生物学的バッファーを含み得る。上記生物学的バッファーおよび適切なｐＨ値に関する詳細は、本発明に従う方法とともに上に記載される。それは、上の開示に参照される。好ましくは、７と９との間のｐＨ、８．５のｐＨ、好ましくはｐＨ８〜８．５を有するＴｒｉｓバッファーが使用される。
【００５１】
好ましくは、磁性シリカ粒子は、上記キットに含まれる。このことは、上記磁性シリカ粒子が、単離の間の、取り扱いおよび従って上記シリカ粒子の処理を簡単にするからである。磁性シリカ粒子の使用はまた、例えば、ロボットシステムを介した単離プロトコルの自動化処理を可能にする。適切な磁性シリカ粒子は、上に記載され、また先行技術において公知である。
【００５２】
さらなる実施形態に従って、上記キットは、追加的または代替的に溶解バッファーを含み、これは、好ましくは、少なくとも１つのカオトロピック塩を含む。さらに、上記キットは、追加的または代替的に、溶解酵素（例えば、プロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫ）を含む溶液を含む。
【００５３】
さらに、上記キットは、１つまたはそれより多くの洗浄バッファーを含み得る。適切な洗浄バッファーは、上に記載される；それは、上の開示に参照される。
【００５４】
さらに、上記キットは、追加的または代替的に溶出バッファーを含み得る。適切な溶出バッファーは、上に記載される；それは、上の開示に参照される。
【００５５】
さらなる実施形態に従って、小型ＲＮＡをシリカ粒子に結合させるための組成物が提供され、この組成物は、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子と
ｄ）核酸を含む、少なくとも１つのサンプル、またはサンプルの一部分もしくは一部
とを含む。
【００５６】
シリカ粒子を用いることによって小型ＲＮＡを単離するために、それぞれの結合組成物を使用する利点は、上に詳細に記載される。それは、上の開示に参照される。
【００５７】
好ましくは総ＲＮＡの一部分として、上記サンプルから小型ＲＮＡを単離するのに適している上記組成物は、好ましくは、１つまたはそれより多くの以下の特徴を有する：
１つの実施形態に従って、それは、アルコールとして、好ましくは１個〜５個の炭素原子を有する短鎖分岐の、または非分岐のアルコールを含む。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。好ましくは、アルコールとして、イソプロパノールおよび／またはエタノール、最も好ましくはイソプロパノールが含まれる。上記アルコールは、１つの実施形態に従って、約４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下の濃度で含まれる。最も好ましくは、上記アルコールは、５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下の濃度で含まれる。
【００５８】
１つの実施形態に従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンは、飽和限度までの少なくとも０．０５Ｍの濃度で上記結合組成物中に存在する。１つ実施形態に従って、上記の濃度は、０．０５Ｍ〜４Ｍの範囲にある。１つの実施形態に従って、上記の濃度は、０．０５Ｍ〜３Ｍの範囲、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍの範囲にある。非常に好ましい実施形態に従って、上記結合組成物における、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択される上記カオトロピックアニオンの濃度は、０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にある。最も好ましくは、上記カオトロピックアニオンの濃度は、１Ｍ未満であり、０．１Ｍ〜０，９Ｍの範囲、または０．１Ｍ〜０．８Ｍの範囲にある。従って、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩は、上記カオトロピックアニオンについて上に記載される濃度で、上記結合組成物中に存在し得る。対応するカチオンは、好ましくは、アルカリ金属イオン（例えば、ナトリウム）である。従って、１つの実施形態に従って、上記結合組成物は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択されるカオトロピック塩を含む。実施例に示されるように、それぞれのカオトロピック塩は、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときに、小型ＲＮＡの単離に特によく適している。好ましくは、トリクロロ酢酸ナトリウムは、０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度、好ましくは０．１Ｍ〜０．７Ｍの濃度で上記結合組成物中に存在する。もちろん、他のカオトロピック塩（例えば、一般的に使用されるグアニジニウム塩）は、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む上記カオトロピック塩に加えて含まれ得る。
【００５９】
さらに、上記組成物は、好ましくはＴｒｉｓである生物学的バッファーを含み得る。適切な生物学的バッファーおよび適切なｐＨ値の例は、本発明に従う方法とともに上に記載される。それは、上の開示に参照される。
【００６０】
上に概説されるように、上記結合組成物はまた、洗剤を含み得る；詳細について、それは上の開示に参照される。
【００６１】
それぞれの組成物の利点およびさらなる特徴はまた、シリカ粒子を用いて小型ＲＮＡを単離するための方法とともに上に概説された。それは、上の開示に参照される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）プライマーアッセイ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；− ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（自動化キットであって、ここで磁性シリカ粒子は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステムによって処理される核酸結合キャリアとして使用される、自動化キット；ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、− ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（ＲＮＡを単離するために、核酸結合キャリアとしてシリカ膜を用いたｍｉＲＮＡの単離のための専用キット；ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、− ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（核酸結合キャリアとしてシリカ膜を用いた一般のＲＮＡ単離キット；ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、および− 本発明の方法に従って、それぞれ、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、またはトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む、結合バッファーを用いたＲＮＡ単離方法であって、ここで磁性シリカ粒子が、単離のための核酸結合キャリアとして使用され、ここではそれは、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステム（ＱＩＡＧＥＮ）によって処理されるＭａｇＡｔｔｒａｃｔ粒子（ＱＩＡＧＥＮ）である、ＲＮＡ単離方法。行われた単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと。上記小型ＲＮＡが、種々の比較された方法によって、上記総ＲＮＡの一部として有効に単離されたかどうかを分析するために、ｍｉＲＮＡ ｈａｓ−ｍｉＲ １６が、ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙにおいて検出された。結果は、図１に示される。
【図２−１】図２ａ）〜図２ｃ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、３つのｍｉＳｃｒｉｐｔ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、および核酸結合キャリアとしてＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用した、トリクロロ酢酸ナトリウムを含む本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ １０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ １６、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【図２−２】図２ａ）〜図２ｃ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、３つのｍｉＳｃｒｉｐｔ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、および核酸結合キャリアとしてＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用した、トリクロロ酢酸ナトリウムを含む本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ １０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ １６、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【図３】図３ａ）および図３ｂ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、２つのＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、および核酸結合キャリアとしてＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用した、トリクロロ酢酸ナトリウムを含む本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈａｓ−ｍｉＲ １６、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【図４】図４ａ）および図４ｂ）は、以下を用いて生成された溶出液を比較している、２つのｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ）の結果を示す；ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ、およびイソプロパノールまたはエタノールのいずれかとともにトリクロロ酢酸ナトリウムを含み、核酸結合キャリアとして、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズとともに使用される、本発明に従う結合バッファー（本発明の単離手順における詳細については、実施例におけるそれぞれの記載を参照のこと）。ここで、ｍｉＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ １０ａ、およびｈｓａ−ｍｉＲ ３０ｂが検出された。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
実施例
１．ＲＮＡ単離プロトコル
総ＲＮＡを、安定化溶液を含むＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブにおいて、異なる５ドナーからの全血（２．５ｍｌ）から単離した。適切な安定化溶液をまた、上に記載する。安定化されたサンプルを含むＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を、市販のキットＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）のための指示マニュアル、または本発明に従う方法に従って、さらに処理した。
【００６４】
上記安定化されたサンプルを以下のように処理した：
ａ）ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）
詳細なプロトコルは、対応するハンドブックに記載されている。従って、本明細書中において、それぞれのプロトコルを簡潔にのみ記載する：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブを、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。
【００６５】
２． 遠心分離後、上清をデカントすることによって除いた。上記上清を捨て、ペレットをステップ３における再懸濁のために取っておいた。
【００６６】
３． １つのチューブ当たり３００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＢＲ１を添加した。上記チューブを閉め、ボルテックスによってペレットを完全に再懸濁した。マルチチューブボルテクサー（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）を、それぞれ、上記ペレットが完全に再懸濁するまで、全速力で３０秒間、再懸濁のために使用した。
【００６７】
４． クロージャ（ｃｌｏｓｕｒｅ）を除き、捨てた。
【００６８】
５． ロボットシステムＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＳＰを、さらなる処理のために使用した。ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ単離のために必要とされる試薬カートリッジおよび消耗品を、「試薬および消耗品」引出しに入れた。さらに、必要とされる溶出ラックを「溶出液」引出しに入れた。
【００６９】
６． ステップ４からのサンプルを、適切なサンプルキャリアに配置し、「サンプル」引出しに入れた。その後、上記サンプルを、対応するプログラムを用いて、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙによって処理した。簡単に言うと、上記ロボットシステムＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙは、溶解バッファーＢＲ２、プロテイナーゼＫ、およびＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズを添加することによってプローブを処理する。まず、ＤＮＡを上記ビーズに結合させ、除く。その後、結合バッファーＱＳＢ１の他にさらなる磁性ビーズを添加する。その後、複合体を、バッファーＱＳＢ１およびバッファーＢＲ４を用いて予め洗浄する。
【００７０】
７． 上記サンプルをバッファーＢＲ５で予め溶出し、残っているＤＮＡを消化する。バッファーＱＳＢ２を添加することによって、ＲＮＡを再結合させる。その後、さらなる洗浄ステップを行い、複合体を乾燥させ、ＲＮＡを溶出する。
【００７１】
ｂ）ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）
詳細なプロトコルは、対応するハンドブックに記載されている。従って、本明細書中において、それぞれのプロトコルを簡潔にのみ記載する：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブを、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。
【００７２】
２． 上清をデカントまたはピペッティングによって除いた。４ｍｌのＲＮアーゼを含まない水を、ペレットに添加し、チューブを閉めた。
【００７３】
３． 上記ペレットを、目に見えて溶解するまでボルテックスし、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。その上清全体をデカントまたはピペッティングによって除き、捨てた。
【００７４】
４． ３５０μｌのバッファーＢＭ１を添加し、ペレットが目に見えて溶解するまでボルテックスした。
【００７５】
５． サンプルを１．５ｍｌの微量遠心分離チューブにピペットで入れた。３００μｌのバッファーＢＭ２、および４０μｌのプロテイナーゼＫを添加した。これらの構成要素を、５秒間ボルテックスすることによって混合し、４００〜１４００ｒｐｍでのシェーカーインキュベーターにおいて５５℃にて１０分間、インキュベートした。インキュベーション後、ステップ２０において使用するために、シェーカーインキュベーターの温度を６５℃に設定した。
【００７６】
６． サンプルを、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにピペットで入れ、２ｍｌの処理チューブに配置し、全速力で３分間、遠心分離した。
【００７７】
７． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムからのフロースルーの上清全体を、上記処理チューブ内のペレットをかき乱すことなく、新しい１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに慎重に移した。
【００７８】
８． ７００μｌのイソプロパノール（１００％、純度グレード ｐ．ａ．）を添加し、ボルテックスすることによって混合した。
【００７９】
９． ７００μｌのサンプルをＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、２ｍｌの処理チューブに配置した。８０００〜２００００×ｇでの１分間の遠心分離後、そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８０】
１０． 残っているサンプルをＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、古い処理チューブを捨てた。
【００８１】
１１． ３５０μｌのバッファーＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加した。ふたを閉め、８０００〜２００００×ｇで１５秒間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８２】
１２． １０μｌのＤＮアーゼＩストック溶液を、１．５ｍｌの微量遠心分離チューブ中の７０μｌのバッファーＲＤＤに添加した。
【００８３】
１３． ＤＮアーゼＩインキュベーション混合物（８０μｌ）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せ、ベンチトップ上で１５分間インキュベートした。
【００８４】
１４． ３５０μｌのバッファーＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加した。ふたを閉め、８０００〜２００００×ｇで１５秒間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８５】
１５． ５００μｌのバッファーＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加し、８０００〜２００００×ｇで１５秒間、遠心分離した。フロースルーを捨てた。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【００８６】
１６． 別の５００μｌのバッファーＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加し、８０００〜２００００×ｇで２分間、遠心分離した。
【００８７】
１７． フロースルーを含む処理チューブを捨て、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。
【００８８】
１８． フロースルーを含む処理チューブを捨てた。ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを新しい１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに配置し、４０μｌのバッファーＢＲ５を、そのスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せた。ふたを閉め、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。
【００８９】
１９． ４０μｌのバッファーＢＲ５および同じ微量遠心分離チューブを用いて、溶出ステップ１８を記載されたように繰り返した。
【００９０】
２０． 溶出液を、シェーカーインキュベーターにおいて振とうさせることなく、６５℃にて５分間、インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを氷上ですぐに冷やした。
【００９１】
２１． その後、サンプルは、すぐに使用でき、それぞれ保存した。
【００９２】
ｃ）ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）
詳細なプロトコルは、対応するハンドブックに記載される。従って、本明細書中において、それぞれのプロトコルを簡潔にのみ記載する：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡチューブを、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。
【００９３】
２． 上清をデカントまたはピペッティングによって除いた。４ｍｌのＲＮアーゼを含まない水を、ペレットに添加し、チューブを閉めた。
【００９４】
３． 上記ペレットを、目に見えて溶解するまでボルテックスし、スイングアウトローターを用いて、３０００〜５０００×ｇで１０分間、遠心分離した。その上清全体を除き、捨てた。
【００９５】
４． ３５０μｌの再懸濁バッファー（ＢＲ１）を添加し、ペレットが目に見えて溶解するまでボルテックスした。
【００９６】
５． サンプルを１．５ｍｌの微量遠心分離チューブにピペットで入れた。３００μｌの結合バッファー（ＢＲ２）、および４０μｌのプロテイナーゼＫを添加し、５秒間ボルテックスすることによって混合し、４００〜１４００ｒｐｍでのシェーカーインキュベーターを用いて、５５℃にて１０分間、インキュベートした。インキュベーション後、ステップ２０のために、シェーカーインキュベーターの温度を６５℃に設定した。
【００９７】
６． 溶解産物を、２ｍｌの処理チューブに配置されたＰＡＸｇｅｎｅ Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにピペットで直接的に入れ、最高スピードで３分間、遠心分離した。
【００９８】
７． フロースルー画分の上清全体を、処理チューブ内のペレットをかき乱すことなく、新たな１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに慎重に移した。
【００９９】
８． ３５０μｌのエタノール（９６〜１００％、純度グレード ｐ．ａ．）を添加し、ボルテックスすることによって混合し、軽く遠心分離して（５００〜１０００×ｇで１〜２秒）、チューブのふたの内側から滴を除いた。
【０１００】
９． ７００μｌのサンプルを、２ｍｌの処理チューブに配置されたＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０１】
１０． 残っているサンプルをＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０２】
１１． ３５０μｌの洗浄バッファー１をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０３】
１２． １０μｌのＤＮアーゼＩストック溶液を、１．５ｍｌの微量遠心分離チューブ中の７０μｌのＤＮＡ消化バッファー（ＲＤＤ）に添加し、混合し、軽く遠心分離した。
【０１０４】
１３． ＤＮアーゼＩインキュベーション混合物（８０μｌ）をＰＡＸｇｅｎｅスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せ、ベンチトップ上に１５分間置いた。
【０１０５】
１４． ３５０μｌの洗浄バッファー１（ＢＲ３）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０６】
１５． ５００μｌの洗浄バッファー２（ＢＲ４）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。そのスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てた。
【０１０７】
１６． 別の５００μｌの洗浄バッファー２（ＢＲ４）をＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムに添加し、８０００〜２００００×ｇで３分間、遠心分離した。
【０１０８】
１７． フロースルーを含む処理チューブを捨て、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに配置し、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離した。
【０１０９】
１８． フロースルーを含む処理チューブを捨て、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラムを１．５ｍｌの遠心分離チューブに配置し、４０μｌの溶出バッファー（ＢＲ５）を、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡスピンカラム膜上にピペットで直接的に乗せ、８０００〜２００００×ｇで１分間、遠心分離して、ＲＮＡを溶出した。
【０１１０】
１９． ４０μｌの溶出バッファー（ＢＲ５）および同じ微量遠心分離チューブを用いて、溶出ステップ１８を記載されたように繰り返した。
【０１１１】
２０． 溶出液を、シェーカーインキュベーターにおいて振とうさせることなく、６５℃にて５分間、インキュベートした。インキュベーション後、そのサンプルを氷上ですぐに冷やした。
【０１１２】
２１． サンプルは、ここですぐに使用でき、それぞれ保存した。
【０１１３】
ｄ）本発明に従う方法
本発明に従う方法を、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットシステムにおいて行った。簡単に言うと、以下のステップを行った：
１． ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブを、３．０００〜６．０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。ペレットを、酢酸アンモニウムを含むバッファー（３００μｌ）の添加およびボルテックスすることによって再懸濁した。
【０１１４】
２． さらに溶解剤、好ましくはプロテイナーゼＫ（４０μｌ）、および３Ｍ超のカオトロピック塩、好ましくはＧＩＴＣを含む溶解バッファー（２３０μｌ）を添加した。その後、サンプルを５６℃で１０分間、インキュベートした。
【０１１５】
３． ＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズを添加して、ＤＮＡをシリカ粒子と一緒に結合させて除いた。
【０１１６】
４． ＲＮＡの結合のために、新しいＭａｇＡｔｔｒａｃｔビーズ、ならびに本発明に従って、８０％のイソプロパノール（またはエタノール）、それぞれ０．６Ｍの過塩素酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、またはトリクロロ酢酸ナトリウム、およびＴｒｉｓを含む１５００μｌの結合バッファーを添加した。
【０１１７】
５． ２つの洗浄ステップを行った。第一の洗浄ステップを、イソプロパノール、ＧＴＣおよび洗剤を含むバッファーで行い；第二の洗浄ステップを、エタノールおよびＴｒｉｓを含む洗浄バッファーで行った。
【０１１８】
６． その後、ＤＮアーゼ消化を行った。
【０１１９】
７． ＲＮＡを上記ビーズに再結合させるために、本発明に従って、１４００μｌの同じ結合バッファー（上記を参照のこと）を添加した。この第二の結合ステップは小型ＲＮＡの良好な収量を確実にする。
【０１２０】
８． その後、４つの追加の洗浄ステップを行った。
【０１２１】
９． 総ＲＮＡを、適切な溶出バッファー（ＢＲ５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、溶出した。また、他の一般的な溶出バッファー（例えば、水またはＴｒｉｓバッファー）が、使用され得る。
【０１２２】
２．結果
小型ＲＮＡが総ＲＮＡの一部として有効に単離されたかどうかを、種々の比較された方法によって分析するために、数種類のｍｉＲＮＡを種々の確立されたアッセイ（詳細は、図を参照のこと）を用いて検出した。各方法の溶出液を用いて得られたＣＴ値を示す。ＣＴ値が高くなればなるほど、分析された溶出液におけるそれぞれのｍｉＲＮＡの濃度はより低く、従って、試験された方法による小型ＲＮＡの単離はより効率が低かった。
【０１２３】
結果は、磁性シリカ粒子を用いる市販のキットが、小型ＲＮＡを単離することにおいて、単離のために特定のカオトロピック塩を用いる本発明の方法よりも効率が低いことを示す（図を参照のこと）。最良の結果は、マニュアルＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡキットを用いて達成されるが、このキットは、シリカ膜ベースであり、従って、柔軟性がありかつ高スループットの自動化プロセスに適さないという欠点を有する。本発明に従う方法で得られた結果は、たとえ磁性シリカ粒子が単離に使用されても、本発明に従う方法が良好な収量で小型ＲＮＡを単離するのに適していることを示す。従って、本発明によって提供される新規の結合条件は、特定の結合条件を用いることによって、シリカ粒子の使用に基づく標準ＲＮＡ単離方法を改善することを可能にし、それにより、核酸結合キャリアとしてシリカ粒子を用いるときでさえ、小型ＲＮＡの効率的な単離を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小型ＲＮＡをサンプルから単離するための方法であって、該方法は、該サンプルを
ａ）少なくとも１つのアルコール、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩、および
ｃ）シリカ粒子
と接触させることによって、ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる工程、ならびに
結合した該ＲＮＡを該サンプルの残りから分離する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記カオトロピックアニオンが、結合の間、０．０５Ｍ〜２Ｍの濃度、好ましくは０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カオトロピック塩が、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択され、好ましくは該カオトロピック塩がトリクロロ酢酸ナトリウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルコールが、結合の間、４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下、より好ましくは５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下の濃度で存在する、
請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記小型ＲＮＡが、総ＲＮＡの一部として得られる、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
以下の特徴：
ｉ）前記サンプルが、体液、血液、血液産物、組織、および骨髄から選択される生物学的サンプルであり；
ｉｉ）該サンプルが、核酸を安定化するために核酸安定化組成物と混合される；そして／または
ｉｉｉ）該サンプルが、核酸安定化組成物と混合され、ここで該安定化組成物は、
ａ）一般式：
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−
のカチオン性化合物であって、
ここでＹは、窒素またはリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、好ましくは窒素を表し、
Ｒ１Ｒ２Ｒ３およびＲ４は、独立して、分岐または非分岐のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基および／またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を表し；
Ｘ−は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸のアニオンを表す、カチオン性化合物と；
ｂ）少なくとも１つのプロトン供与体と、
を含む、
のうちの１つまたはそれより多くによって特徴付けられる、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル、または該サンプルの一部分もしくは一部が、少なくとも１つ溶解剤、好ましくはプロテアーゼ、および／またはカオトロピック剤の添加によって、結合前に予め処理される、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
溶解後、非標的核酸が、適切な核酸結合キャリアの添加によって、そして該非標的核酸の少なくとも一部分を結合するための適切な条件下で除去される、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シリカ粒子に結合した前記ＲＮＡが洗浄される、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが、
ａ）カオトロピック剤、およびアルコール、および好ましくは洗剤を含む洗浄バッファー；ならびに
ｂ）アルコールおよび生物学的バッファーを含む洗浄バッファー
から選択される、１つまたはそれより多くの洗浄バッファーを用いて少なくとも１回洗浄される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
洗浄後、前記シリカ粒子および前記ＲＮＡが、再度、少なくとも１つのアルコール、ならびにトリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩と、好ましくは請求項１〜４のうちのいずれか一項において定義されるような条件下で接触させられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
小型ＲＮＡをサンプルから単離するためのキットであって、該キットは、
ａ）任意選択のアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子
とを含む、キット。
【請求項１３】
以下の試薬：
ａ）イソプロパノールおよび／またはエタノール；
ｂ）少なくとも６０％の濃度でのアルコール、好ましくは少なくとも７０％のアルコールと、少なくとも０．５Ｍの、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩、好ましくはトリクロロ酢酸ナトリウムと、生物学的バッファー、好ましくはＴｒｉｓとを含む結合バッファー；
ｃ）磁性シリカ粒子；
ｄ）好ましくはカオトロピック剤を含む、溶解バッファー；
ｅ）プロテアーゼを含む組成物；
ｆ）１つまたはそれより多くの洗浄バッファー；
ｇ）溶出バッファー
のうちの１つまたはそれより多くを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
小型ＲＮＡをシリカ粒子に結合させるための組成物であって、該組成物は、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子と
ｄ）核酸を含む、少なくとも１つのサンプル、またはサンプルの一部分もしくは一部
とを含む、組成物。
【請求項１５】
以下の特徴：
ａ）前記組成物が、アルコールとして、イソプロパノールおよび／またはエタノール、好ましくはイソプロパノールを含み；
ｂ）該組成物が、少なくとも４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下、より好ましくは５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下の濃度でアルコールを含み；
ｃ）該組成物が、０．０５Ｍ〜２Ｍの濃度、好ましくは０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度で前記カオトロピックアニオンを含み；
ｄ）該組成物が、カオトロピック塩として、トリクロロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択される塩、好ましくはトリクロロ酢酸ナトリウムである塩を含み；
ｅ）該組成物が、生物学的バッファー、好ましくはＴｒｉｓを含み、そして／あるいは
ｆ）該組成物が、核酸を含む、血液、または血液の一部分もしくは一部を含む、
のうちの１つまたはそれより多くを有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１】
小型ＲＮＡをサンプルから単離するための方法であって、該方法は、該サンプルを
ａ）少なくとも１つのアルコール、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩、および
ｃ）シリカ粒子
と接触させることによって、ＲＮＡをシリカ粒子に結合させる工程、ならびに
結合した該ＲＮＡを該サンプルの残りから分離する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記カオトロピックアニオンが、結合の間、０．０５Ｍ〜２Ｍの濃度、好ましくは０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カオトロピック塩が、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択され、好ましくは該カオトロピック塩がトリクロロ酢酸ナトリウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルコールが、結合の間、４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下、より好ましくは５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下の濃度で存在する、
請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記小型ＲＮＡが、総ＲＮＡの一部として得られる、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
以下の特徴：
ｉ）前記サンプルが、体液、血液、血液産物、組織、および骨髄から選択される生物学的サンプルであり；
ｉｉ）該サンプルが、核酸を安定化するために核酸安定化組成物と混合される；そして／または
ｉｉｉ）該サンプルが、核酸安定化組成物と混合され、ここで該安定化組成物は、
ａ）一般式：
Ｙ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ−
のカチオン性化合物であって、
ここでＹは、窒素またはリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、好ましくは窒素を表し、
Ｒ１Ｒ２Ｒ３およびＲ４は、独立して、分岐または非分岐のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基および／またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル基を表し；
Ｘ−は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸のアニオンを表す、カチオン性化合物と；
ｂ）少なくとも１つのプロトン供与体と、
を含む、
のうちの１つまたはそれより多くによって特徴付けられる、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル、または該サンプルの一部分もしくは一部が、少なくとも１つ溶解剤、好ましくはプロテアーゼ、および／またはカオトロピック剤の添加によって、結合前に予め処理される、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
溶解後、非標的核酸が、適切な核酸結合キャリアの添加によって、そして該非標的核酸の少なくとも一部分を結合するための適切な条件下で除去される、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シリカ粒子に結合した前記ＲＮＡが洗浄される、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが、
ａ）カオトロピック剤、およびアルコール、および好ましくは洗剤を含む洗浄バッファー；ならびに
ｂ）アルコールおよび生物学的バッファーを含む洗浄バッファー
から選択される、１つまたはそれより多くの洗浄バッファーを用いて少なくとも１回洗浄される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
洗浄後、前記シリカ粒子および前記ＲＮＡが、再度、少なくとも１つのアルコール、ならびにトリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩と、好ましくは請求項１〜４のうちのいずれか一項において定義されるような条件下で接触させられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
小型ＲＮＡをサンプルから単離するためのキットであって、該キットは、
ａ）任意選択のアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子
とを含む、キット。
【請求項１３】
以下の試薬：
ａ）イソプロパノールおよび／またはエタノール；
ｂ）少なくとも６０％の濃度でのアルコール、好ましくは少なくとも７０％のアルコールと、少なくとも０．５Ｍの、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩、好ましくはトリクロロ酢酸ナトリウムと、生物学的バッファー、好ましくはＴｒｉｓとを含む結合バッファー；
ｃ）磁性シリカ粒子；
ｄ）好ましくはカオトロピック剤を含む、溶解バッファー；
ｅ）プロテアーゼを含む組成物；
ｆ）１つまたはそれより多くの洗浄バッファー；
ｇ）溶出バッファー
のうちの１つまたはそれより多くを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
小型ＲＮＡをシリカ粒子に結合させるための組成物であって、該組成物は、
ａ）少なくとも１つのアルコールと、
ｂ）トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、およびトリフルオロ酢酸イオンからなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含む少なくとも１つのカオトロピック塩と、
ｃ）シリカ粒子と
ｄ）核酸を含む、少なくとも１つのサンプル、またはサンプルの一部分もしくは一部
とを含む、組成物。
【請求項１５】
以下の特徴：
ａ）前記組成物が、アルコールとして、イソプロパノールおよび／またはエタノール、好ましくはイソプロパノールを含み；
ｂ）該組成物が、少なくとも４０ｖ／ｖ％以上、好ましくは４０ｖ／ｖ％以上〜８０ｖ／ｖ％以下、より好ましくは５０ｖ／ｖ％以上〜６５ｖ／ｖ％以下の濃度でアルコールを含み；
ｃ）該組成物が、０．０５Ｍ〜２Ｍの濃度、好ましくは０．１Ｍ〜１Ｍ未満の濃度で前記カオトロピックアニオンを含み；
ｄ）該組成物が、カオトロピック塩として、トリクロロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムからなる群より選択される塩、好ましくはトリクロロ酢酸ナトリウムである塩を含み；
ｅ）該組成物が、生物学的バッファー、好ましくはＴｒｉｓを含み、そして／あるいは
ｆ）該組成物が、核酸を含む、血液、または血液の一部分もしくは一部を含む、
のうちの１つまたはそれより多くを有する、請求項１４に記載の組成物。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５１６９６９（Ｐ２０１３−５１６９６９Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８４５９（Ｐ２０１２−５４８４５９）
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０５９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８６１９５
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５０７２１４０３８）キアゲン ゲーエムベーハー (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０５９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８６１９５
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５０７２１４０３８）キアゲン ゲーエムベーハー (16)
【Ｆターム（参考）】
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