小細胞肺癌の判定用キット
【課題】早期診断が可能な小細胞肺癌に対する特異的な新規腫瘍マーカーを提供すること。
【解決手段】早期肺癌の診断のために有用な腫瘍マーカー候補物質の探索を目的として、ヒト肺癌由来培養細胞株の培養上清に放出されるたんぱく質・ペプチドのプロテオーム解析を行った結果、小細胞肺癌培養細胞株であるＳＢＣ３の培養上清にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（proNeurotensin/Neuromedin N）が放出されているが、小細胞肺癌以外の肺癌細胞株（腺癌・大細胞癌・扁平上皮癌）の培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出されないことを見い出した。したがって、ヒトから採取した生体試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに対する抗体や、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブを用いて測定することにより、小細胞肺癌の診断が可能となる。
【解決手段】早期肺癌の診断のために有用な腫瘍マーカー候補物質の探索を目的として、ヒト肺癌由来培養細胞株の培養上清に放出されるたんぱく質・ペプチドのプロテオーム解析を行った結果、小細胞肺癌培養細胞株であるＳＢＣ３の培養上清にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（proNeurotensin/Neuromedin N）が放出されているが、小細胞肺癌以外の肺癌細胞株（腺癌・大細胞癌・扁平上皮癌）の培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出されないことを見い出した。したがって、ヒトから採取した生体試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに対する抗体や、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブを用いて測定することにより、小細胞肺癌の診断が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期肺癌に対応できる腫瘍マーカー、詳しくは小細胞肺癌に特異的な腫瘍マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における診断・判定として血中腫瘍マーカーの計測が挙げられる。腫瘍マーカーは腫瘍または腫瘍と反応した正常細胞が作る物質の中で、血中や尿中などに放出され腫瘍の体外診断を可能としているものである。
【０００３】
上記腫瘍マーカーに関しては、乳癌患者と正常人の胸部組織に差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断 、予後判定、予防および処置するための新
規な組成物、方法および使用（例えば、特許文献１参照）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５およびｍｉＲ１６のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照）や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法；ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照）等が知られている。
【０００４】
また、肺癌は小細胞癌と非小細胞癌の２つの型に大きく分類され、非小細胞癌はさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌の３タイプに分類され、それぞれのタイプによって発生する部位がある程度決まっており、小細胞癌と扁平上皮癌は肺門部に、腺癌と大細胞癌は肺野部にできやすい肺癌といわれている。肺癌に関して、小細胞肺癌 (ＳＣＬＣ）を患う患者を治療し、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細には、α−コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２を使用して小細胞肺癌の存在または位置を決定することにより検出する方法（例えば、特許文献５参照）や、血清中の肺癌マーカーとして優れる血管透過性因子を測定することにより、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観察を行う方法（例えば、特許文献６参照）等が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１５９６４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０２９号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６４６９号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４８１５号公報
【特許文献５】特表平１１−５０６７３７号公報
【特許文献６】特開平９−３３５３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の通り、これまでに様々な腫瘍マーカーが開発されているが、擬陽性が多く初期の癌の検出が困難であるなど改善の余地が多く残されており、特に肺癌・膵臓癌・大腸癌など難治性の癌のマーカーの開発が求められている。更に、現在日本において肺癌は男性の癌死亡率の第１位であり、女性では胃癌に次いで第２位であることから、新たな肺癌に対する腫瘍マーカーの開発による早期診断・治療成績の向上が期待されていた。本発明の課題は、早期診断が可能な小細胞肺癌に対する特異的な新規腫瘍マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、特に早期肺癌の診断のために有用な腫瘍マーカー候補物質の探索を目的として、ヒト肺癌由来培養細胞株の培養上清に放出されるたんぱく質・ペプチドのプロテオーム解析を行った結果、小細胞肺癌培養細胞株であるＳＢＣ３の培養上清にproNeurotensin/Neuromedin N（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）が放出されているが、小細胞肺癌以外の肺癌細胞株（腺癌・大細胞癌・扁平上皮癌）の培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出されないことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキットや、（２）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキットに関する。
【０００９】
また本発明は、（３）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキットや、（４）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキットに関する。
【００１０】
さらに本発明は、（５）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキットや、（６）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、小細胞肺癌の判定、小細胞肺癌再発のリスク評価、抗癌剤の小細胞肺癌に対する有効性の判定、小細胞肺癌の抑制剤・治療剤のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＢＣ３培養細胞株の培養上清のＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図２】ＳＢＣ３培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した際の溶出曲線を示す図である。
【図３】ＳＢＣ３培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いた分離・精製において、１８−１９分前後に溶出した画分のＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図４】トリプシン消化したタンパク質断片のＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図５】トリプシン消化したタンパク質断片のうち、ＭＳスペクトルがｍ／ｚが１０４７のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図６】本発明のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列を示す図である。
【図７】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列において、ＳＢＣ３培養上清をトリプシン処理したペプチド断片についてＮＡＮＯＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計で検出された配列（グレーの色付部分）を示す図である。
【図８】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列において、トリプシン・Ｖ８プロテアーゼ混合液で処理を行ったペプチド断片についてＮＡＮＯＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計で検出された配列（グレーの色付部分）を示す図である。
【図９】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列において、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計及びＮＡＮＯＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計で検出された配列（下線部分）を示す図である。
【図１０】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの分子内構造を示す図である。
【図１１】ＳＢＣ−３を無血清培養した培養上清、ＳＢＣ−３を血清培養した培養上清、ＳＢＣ−３の細胞破砕液を泳動し、ＮＴ、Ｌａｒｇｅ ＮＭＮに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す図である。Ｌａｎｅ１はＳＢＣ−３を無血清培養した培養上清、Ｌａｎｅ２はＳＢＣ−３を血清培養した培養上清、Ｌａｎｅ３はＳＢＣ−３の細胞破砕液を泳動した。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを銀染色したもの、（ｂ）ＮＴ抗体を用いてウエスタンブロットしたもの、（ｃ）Ｌａｒｇｅ ＮＭＮ抗体を用いてウエスタンブロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の肺癌の判定方法としては、ヒトから採取した血清、痰、肺組織等の生体試料中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）の発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の肺癌の判定用キットとしては、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、また、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量の測定方法としては、血清、痰、肺組織溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の肺癌の判定用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現を検出した場合、対象者は小細胞肺癌患者と判定されることになる。
【００１４】
本発明の肺癌再発のリスク評価方法としては、肺癌患者から採取した血清、痰、肺癌組織等の生体試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の肺癌再発のリスク評価用キットとしては、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、また、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量の測定方法としては、血清、痰、肺癌細胞溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の小細胞肺癌再発のリスク評価用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現を検出した場合、対象者は小細胞肺癌が再発していると判定されることになる。
【００１５】
本発明の抗癌剤の有効性の判定方法としては、抗癌剤を服用している小細胞肺癌患者から採取した血清、痰、肺癌組織等の生体試料中の、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性判定用キットとしては、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、抗癌剤の有効性を判定することにより、各患者個人に適した治療、いわゆるテーラーメイド治療が可能となる。また、上記ペプチドｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量の測定方法としては、血清、痰、肺癌細胞溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の抗癌剤の小細胞肺癌における有効性判定用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、抗癌剤の服用の結果、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量が減少した場合、当該抗癌剤は小細胞肺癌の治療に有効であると判定されることになる。
【００１６】
本発明の小細胞肺癌の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法としては、ヒト肺小細胞癌培養細胞株（例えば、ＳＢＣ３、ＳＢＣ５）を、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、上記ペプチドの発現量を測定する方法としては、ヒト肺癌培養細胞株（ＳＢＣ３、ＳＢＣ５）の細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法の他、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を用いるドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法を挙げることができる。そして、被検物質の存在下に培養した細胞溶解物中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量が、被検物質の非存在下における場合と比較して減少している場合、当該被検物質は小細胞肺癌の治療に有効な小細胞肺癌の抑制剤・治療剤である可能性が大きい。
【００１７】
上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができる。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド又はエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１８】
また、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778 号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号）を用いることができ、ヒト化抗体をつくるために、ヒト化抗体の調製法（米国特許第5,585,089号、Nature, 321, 522-525, 1986、Protein Engineering, 4, 773-783, 1991）を用いることができ、キメラ抗体をつくるために、キメラ抗体の調製法（米国特許第4,816,567号、Science, 229, 1202-1207, 1985、BioTechniques, 4, 214, 1986、Nature, 312, 643-646, 1984、Nature, 314, 268.270, 1985）を用いることができる。二機能性抗体は、２つの関連した抗体を産生する２つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、または２つの抗体の断片の化学結合によって産生することができる。
【００１９】
また、上記抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も、上記抗体と同様に用いることができる。例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【００２０】
これら抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記配列番号１に示されるアミノ酸からなるペプチドを免疫学的測定方法により測定することができる。かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２１】
上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセットとしては、これらペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ（配列番号３）のうち、上流及び下流の配列の一部とハイブリダイズしうる相補的なプライマーセットであれば、プライマー配列の長さ及びｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのどの部位と相補的であるかなどは特に制限されず、例えば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プライマーとして用いることができる。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【００２２】
上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとしては、これらペプチドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）とハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる他、検出しやすいように５’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は３２Ｐなどを例示することができる。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（培養細胞株）
実施例では９種類の培養細胞株を用いた。いずれの培養細胞株もヒト肺癌由来のものであり、小細胞癌としてＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、腺癌としてＮＣＩ−Ｈ６５０、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、大細胞癌としてＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ４６０、扁平上皮癌としてＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ１８６９を用いた。ＳＢＣ−３の培養上清を分析し、他の培養上清と比較することで腫瘍マーカーの候補を検索した。これらの細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC社）又は財団法人ヒューマン振興財団から入手することができる。
【００２５】
（培養上清の調整）
培養上清は以下のように回収した。各々の細胞を１×１０６となるよう１０ｃｍシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。培地は１０％のウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Sigma社製）を用いた。次にリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。系内にＦＢＳが存在すると測定誤差が大きくなるため、実施例では無血清培地を使用した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１時間インキュベートした後、培地を捨て、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地を７ｍｌ加えた。４８時間インキュベートした後この培地を回収し、実験に用いた。
【実施例２】
【００２６】
（培養上清のＭＳスペクトル測定）
ＳＢＣ３培養細胞株の培養上清のＭＳスペクトルを測定した。培養上清１ｍｌに対し、ＺｉｐＴｉｐ（Millipore社製）を用いて脱塩・濃縮を行い、ＭＳスペクトルを測定した。ＭＳスペクトルはApplied Biosystems社製４７００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を用いて測定した。対照として細胞と接触していない培地を上述と同様の処理を行い、ＭＳスペクトルを測定した。結果を図１に示す。図のように培養上清では分子量１０００−１００００付近に培地には存在しない分子が多く観測された。これらの分子はＳＢＣ３細胞が生成し、放出したものであると考えられる。また分子量から類推すると直接ＭＳ／ＭＳスペクトルを測定し、タンパク質の配列を決定するためには分子量が大きすぎることが分かった。
【実施例３】
【００２７】
（培養上清中のタンパク質のカラムクロマトグラフィーによる分離とＭＳスペクトル測定）
ＳＢＣ３培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した。カラムクロマトグラフィーシステムとしてＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ２Ｄ（ベックマン社製）を、カラムとしてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ２５０−４．６（５μｍ：関東化学社製）を用いた。溶出曲線を図２に示す。図のように保持時間が１８−１９分前後に培地には無いピークが検出された。これらの全画分を回収し、ＭＳスペクトルを測定した。一例として１８−１９分前後に溶出した画分のＭＳスペクトルを図３に示す。図のように分子量１７３００前後の分子が観測された。
【実施例４】
【００２８】
（タンパク質のトリプシン消化とＭＳ／ＭＳスペクトル測定）
カラムクロマトグラフィーで得られた１８−１９分前後の画分中のタンパク質をトリプシン消化し、ＭＳ／ＭＳ測定を行うことによって、タンパク質の配列を決定した。トリプシン消化は以下のように行った。得られた画分を減圧下で遠心濃縮し、０．２％ ＲａｐｉＧｅｓｔ（Waters社製）を１５μｌ加えタンパク質を溶解した。これにトリプシン溶液（８．３ｎｇ／μｌ、５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）を１５μｌ加え３７℃で１時間インキュベートした。５００ｍＭ 塩酸３μｌを加えて反応を停止した後、ＺｉｐＴｉｐを用いて脱塩を行い、ＭＳスペクトルを測定した。ＭＳスペクトルの結果を図４に示す。分子量１７３００前後のピークは観測されなかったことから、トリプシン消化が行われ、タンパク質が断片化していることが分かる。
【００２９】
さらに上記タンパク質断片のペプチドに対し、ＭＳ／ＭＳスペクトルの測定を行った。一例としてｍ／ｚが１０４７のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトルを図５に示す。図のように１０４７の親ピークが無くなりアミノ酸単位に開裂したスペクトルが得られた。このスペクトルをデータベースと照らし合わせることによって、ペプチド配列を決定した。その結果、このペプチドの配列はＱＬＹＥＮＫＰＲであることが分かった。同定されたｙ系列およびｂ系列の分子量を図５に示す。
【００３０】
さらに、図４で検出されたｍ／ｚが７８９．５、９０２．６、９４５．６、２５１３．１に対して同様にペプチド配列を決定した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
これらのペプチドはアミノ酸１３個からなる直鎖ペプチドであるニューロテンシンの前駆体（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）の一部であることが分かった。図６にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの配列を示す。太字で示したものが検出されたペプチドである。さらにトリプシン消化前のタンパク質の分子量は図３より１７３００前後と推定されていた。ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの分子量は１７２２５であり、高分子のマススペクトルの誤差を許容するとほぼ一致していることが分かる。以上のことよりＳＢＣ３培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが放出されていることが明らかとなった。ニューロテンシン（ＮＴ）は「ＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ」（配列番号２）の構造を持つ。これまでの研究によりＮＴはペプチドホルモンとして機能することが分かっている。しかしながらヒト肺癌由来の腫瘍細胞がＮＴの前駆体であるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを放出しているという報告が無く、本研究によってはじめて明らかとなった。一般的にペプチドホルモンは血中で不安定である場合が多く、腫瘍マーカーとしては不適切である場合が多かったが、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮはペプチドホルモンの前駆体であるため血中安定性が高く腫瘍マーカー候補として適切である可能性が高い。
【実施例５】
【００３３】
（種々の肺癌由来培養細胞の比較）
他の小細胞癌としてＳＢＣ５の培養上清を上述の方法を用いて分析したところ、ＳＢＣ３と同様にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの放出が確認できた。さらに、３種類の大細胞癌、２種類の腺癌、２種類の扁平上皮癌ではｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの放出は検出できなかった。以上のことよりｐｒｏＮＴ／ＮＭＮは小細胞肺癌特異的なマーカーとして期待できると言える。なお、正常者の肺由来の細胞からｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの放出は報告されていない。
【実施例６】
【００３４】
（培養上清中のタンパク質のカラムクロマトグラフィーによる分離とｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析）
また、ＳＢＣ３培養上清を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、得られたタンパク質画分をトリプシンのみ、あるいはトリプシンとＶ８プロテアーゼの２種類の酵素で消化した。消化されたタンパク質断片（ペプチド）に対し、ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計 ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒ（（株）日立ハイテクノロジーズ社製）での測定を行った。トリプシン消化は以下のように行った。
【００３５】
カラムクロマトグラフィーで得られた１８−１９分前後の画分を減圧下で遠心濃縮し、トリプシン溶液３０μｌ（トリプシンが０．５μｇ含まれた５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）を加え、３７℃で１８時間インキュベートし、その反応液５μｌを分析した。
また、トリプシンとＶ８プロテアーゼの２種類の酵素での処理には、トリプシン溶液３０μｌのかえて、トリプシン・Ｖ８プロテアーゼ混合液３０μｌ（トリプシンが１μｇ、Ｖ８プロテアーゼが１μｇ含まれた５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）を用いた。
【００３６】
トリプシンのみで処理を行ったペプチド断片の分析結果を表２及び図７に示す。その結果、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの一部であるペプチド断片が検出された。同様にトリプシン・Ｖ８プロテアーゼ混合液で処理を行ったペプチド断片の分析結果を表３及び図８に示す。図９のスキーム中に下線で示したものが二種類の質量分析計を用いて検出されたペプチドである（配列番号１）。ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのＮ末端およびＣ末端を含むほとんどの配列を検出することができた。
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【実施例７】
【００３９】
（Neurotensin及びLarge Neuromedin Nに対する抗体を用いたウエスタンブロット）
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮは分子内にNeurotensin（ＮＴ）、Neuromedin N（ＮＭＮ）、Large Neuromedin N（Ｌａｒｇｅ ＮＭＮ）の配列を有する（図１０）。そこで、ＳＢＣ３を無血清培養した培養上清、ＳＢＣ−３を血清培養した培養上清、ＳＢＣ３の細胞破砕液を泳動し、ＮＴ、Ｌａｒｇｅ ＮＭＮに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った（図１１）。
【００４０】
その結果、ＳＢＣ−３を血清培養した培養上清及びＳＢＣ−３の細胞破砕液について、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（分子量１７２２５）前後に陽性バンドが検出された（赤矢印）。ＮＴ、Ｌａｒｇｅ ＮＭＮの分子量はこれと大きく異なることから、検出できたバンドはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮであると言える。また細胞内でも検出できたことから細胞がｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを生産し上清に放出したと言える。
抗体を使ってｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出できたため、今後ＥＬＩＳＡなど汎用の臨床検査を用いてもｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出できる可能性を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期肺癌に対応できる腫瘍マーカー、詳しくは小細胞肺癌に特異的な腫瘍マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における診断・判定として血中腫瘍マーカーの計測が挙げられる。腫瘍マーカーは腫瘍または腫瘍と反応した正常細胞が作る物質の中で、血中や尿中などに放出され腫瘍の体外診断を可能としているものである。
【０００３】
上記腫瘍マーカーに関しては、乳癌患者と正常人の胸部組織に差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断 、予後判定、予防および処置するための新
規な組成物、方法および使用（例えば、特許文献１参照）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５およびｍｉＲ１６のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照）や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素ＩＩの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法；ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照）等が知られている。
【０００４】
また、肺癌は小細胞癌と非小細胞癌の２つの型に大きく分類され、非小細胞癌はさらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌の３タイプに分類され、それぞれのタイプによって発生する部位がある程度決まっており、小細胞癌と扁平上皮癌は肺門部に、腺癌と大細胞癌は肺野部にできやすい肺癌といわれている。肺癌に関して、小細胞肺癌 (ＳＣＬＣ）を患う患者を治療し、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細には、α−コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２を使用して小細胞肺癌の存在または位置を決定することにより検出する方法（例えば、特許文献５参照）や、血清中の肺癌マーカーとして優れる血管透過性因子を測定することにより、特に化学発光検出系酵素免疫測定法を用いて高感度で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観察を行う方法（例えば、特許文献６参照）等が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１５９６４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０２９号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６４６９号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４８１５号公報
【特許文献５】特表平１１−５０６７３７号公報
【特許文献６】特開平９−３３５３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の通り、これまでに様々な腫瘍マーカーが開発されているが、擬陽性が多く初期の癌の検出が困難であるなど改善の余地が多く残されており、特に肺癌・膵臓癌・大腸癌など難治性の癌のマーカーの開発が求められている。更に、現在日本において肺癌は男性の癌死亡率の第１位であり、女性では胃癌に次いで第２位であることから、新たな肺癌に対する腫瘍マーカーの開発による早期診断・治療成績の向上が期待されていた。本発明の課題は、早期診断が可能な小細胞肺癌に対する特異的な新規腫瘍マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、特に早期肺癌の診断のために有用な腫瘍マーカー候補物質の探索を目的として、ヒト肺癌由来培養細胞株の培養上清に放出されるたんぱく質・ペプチドのプロテオーム解析を行った結果、小細胞肺癌培養細胞株であるＳＢＣ３の培養上清にproNeurotensin/Neuromedin N（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）が放出されているが、小細胞肺癌以外の肺癌細胞株（腺癌・大細胞癌・扁平上皮癌）の培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出されないことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキットや、（２）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキットに関する。
【０００９】
また本発明は、（３）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキットや、（４）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキットに関する。
【００１０】
さらに本発明は、（５）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキットや、（６）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、小細胞肺癌の判定、小細胞肺癌再発のリスク評価、抗癌剤の小細胞肺癌に対する有効性の判定、小細胞肺癌の抑制剤・治療剤のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＢＣ３培養細胞株の培養上清のＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図２】ＳＢＣ３培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した際の溶出曲線を示す図である。
【図３】ＳＢＣ３培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いた分離・精製において、１８−１９分前後に溶出した画分のＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図４】トリプシン消化したタンパク質断片のＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図５】トリプシン消化したタンパク質断片のうち、ＭＳスペクトルがｍ／ｚが１０４７のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトル測定結果を示す図である。
【図６】本発明のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列を示す図である。
【図７】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列において、ＳＢＣ３培養上清をトリプシン処理したペプチド断片についてＮＡＮＯＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計で検出された配列（グレーの色付部分）を示す図である。
【図８】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列において、トリプシン・Ｖ８プロテアーゼ混合液で処理を行ったペプチド断片についてＮＡＮＯＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計で検出された配列（グレーの色付部分）を示す図である。
【図９】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのアミノ酸配列において、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計及びＮＡＮＯＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計で検出された配列（下線部分）を示す図である。
【図１０】ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの分子内構造を示す図である。
【図１１】ＳＢＣ−３を無血清培養した培養上清、ＳＢＣ−３を血清培養した培養上清、ＳＢＣ−３の細胞破砕液を泳動し、ＮＴ、Ｌａｒｇｅ ＮＭＮに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す図である。Ｌａｎｅ１はＳＢＣ−３を無血清培養した培養上清、Ｌａｎｅ２はＳＢＣ−３を血清培養した培養上清、Ｌａｎｅ３はＳＢＣ−３の細胞破砕液を泳動した。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを銀染色したもの、（ｂ）ＮＴ抗体を用いてウエスタンブロットしたもの、（ｃ）Ｌａｒｇｅ ＮＭＮ抗体を用いてウエスタンブロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の肺癌の判定方法としては、ヒトから採取した血清、痰、肺組織等の生体試料中の、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）の発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の肺癌の判定用キットとしては、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、また、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量の測定方法としては、血清、痰、肺組織溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の肺癌の判定用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現を検出した場合、対象者は小細胞肺癌患者と判定されることになる。
【００１４】
本発明の肺癌再発のリスク評価方法としては、肺癌患者から採取した血清、痰、肺癌組織等の生体試料中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の肺癌再発のリスク評価用キットとしては、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、また、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量の測定方法としては、血清、痰、肺癌細胞溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の小細胞肺癌再発のリスク評価用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現を検出した場合、対象者は小細胞肺癌が再発していると判定されることになる。
【００１５】
本発明の抗癌剤の有効性の判定方法としては、抗癌剤を服用している小細胞肺癌患者から採取した血清、痰、肺癌組織等の生体試料中の、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性判定用キットとしては、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、抗癌剤の有効性を判定することにより、各患者個人に適した治療、いわゆるテーラーメイド治療が可能となる。また、上記ペプチドｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量の測定方法としては、血清、痰、肺癌細胞溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の抗癌剤の小細胞肺癌における有効性判定用キットを用いる、ＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。そして、抗癌剤の服用の結果、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量が減少した場合、当該抗癌剤は小細胞肺癌の治療に有効であると判定されることになる。
【００１６】
本発明の小細胞肺癌の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法としては、ヒト肺小細胞癌培養細胞株（例えば、ＳＢＣ３、ＳＢＣ５）を、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、上記ペプチドの発現量を測定する方法としては、ヒト肺癌培養細胞株（ＳＢＣ３、ＳＢＣ５）の細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法の他、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を用いるドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法を挙げることができる。そして、被検物質の存在下に培養した細胞溶解物中のｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの発現量が、被検物質の非存在下における場合と比較して減少している場合、当該被検物質は小細胞肺癌の治療に有効な小細胞肺癌の抑制剤・治療剤である可能性が大きい。
【００１７】
上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができる。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチド又はエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１８】
また、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778 号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号）を用いることができ、ヒト化抗体をつくるために、ヒト化抗体の調製法（米国特許第5,585,089号、Nature, 321, 522-525, 1986、Protein Engineering, 4, 773-783, 1991）を用いることができ、キメラ抗体をつくるために、キメラ抗体の調製法（米国特許第4,816,567号、Science, 229, 1202-1207, 1985、BioTechniques, 4, 214, 1986、Nature, 312, 643-646, 1984、Nature, 314, 268.270, 1985）を用いることができる。二機能性抗体は、２つの関連した抗体を産生する２つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、または２つの抗体の断片の化学結合によって産生することができる。
【００１９】
また、上記抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も、上記抗体と同様に用いることができる。例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【００２０】
これら抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記配列番号１に示されるアミノ酸からなるペプチドを免疫学的測定方法により測定することができる。かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２１】
上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセットとしては、これらペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ（配列番号３）のうち、上流及び下流の配列の一部とハイブリダイズしうる相補的なプライマーセットであれば、プライマー配列の長さ及びｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのどの部位と相補的であるかなどは特に制限されず、例えば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プライマーとして用いることができる。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【００２２】
上記ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとしては、これらペプチドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）とハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ペプチドのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる他、検出しやすいように５’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は３２Ｐなどを例示することができる。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（培養細胞株）
実施例では９種類の培養細胞株を用いた。いずれの培養細胞株もヒト肺癌由来のものであり、小細胞癌としてＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、腺癌としてＮＣＩ−Ｈ６５０、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、大細胞癌としてＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ４６０、扁平上皮癌としてＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ１８６９を用いた。ＳＢＣ−３の培養上清を分析し、他の培養上清と比較することで腫瘍マーカーの候補を検索した。これらの細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC社）又は財団法人ヒューマン振興財団から入手することができる。
【００２５】
（培養上清の調整）
培養上清は以下のように回収した。各々の細胞を１×１０６となるよう１０ｃｍシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。培地は１０％のウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Sigma社製）を用いた。次にリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。系内にＦＢＳが存在すると測定誤差が大きくなるため、実施例では無血清培地を使用した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１時間インキュベートした後、培地を捨て、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地を７ｍｌ加えた。４８時間インキュベートした後この培地を回収し、実験に用いた。
【実施例２】
【００２６】
（培養上清のＭＳスペクトル測定）
ＳＢＣ３培養細胞株の培養上清のＭＳスペクトルを測定した。培養上清１ｍｌに対し、ＺｉｐＴｉｐ（Millipore社製）を用いて脱塩・濃縮を行い、ＭＳスペクトルを測定した。ＭＳスペクトルはApplied Biosystems社製４７００ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を用いて測定した。対照として細胞と接触していない培地を上述と同様の処理を行い、ＭＳスペクトルを測定した。結果を図１に示す。図のように培養上清では分子量１０００−１００００付近に培地には存在しない分子が多く観測された。これらの分子はＳＢＣ３細胞が生成し、放出したものであると考えられる。また分子量から類推すると直接ＭＳ／ＭＳスペクトルを測定し、タンパク質の配列を決定するためには分子量が大きすぎることが分かった。
【実施例３】
【００２７】
（培養上清中のタンパク質のカラムクロマトグラフィーによる分離とＭＳスペクトル測定）
ＳＢＣ３培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した。カラムクロマトグラフィーシステムとしてＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ２Ｄ（ベックマン社製）を、カラムとしてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰ２５０−４．６（５μｍ：関東化学社製）を用いた。溶出曲線を図２に示す。図のように保持時間が１８−１９分前後に培地には無いピークが検出された。これらの全画分を回収し、ＭＳスペクトルを測定した。一例として１８−１９分前後に溶出した画分のＭＳスペクトルを図３に示す。図のように分子量１７３００前後の分子が観測された。
【実施例４】
【００２８】
（タンパク質のトリプシン消化とＭＳ／ＭＳスペクトル測定）
カラムクロマトグラフィーで得られた１８−１９分前後の画分中のタンパク質をトリプシン消化し、ＭＳ／ＭＳ測定を行うことによって、タンパク質の配列を決定した。トリプシン消化は以下のように行った。得られた画分を減圧下で遠心濃縮し、０．２％ ＲａｐｉＧｅｓｔ（Waters社製）を１５μｌ加えタンパク質を溶解した。これにトリプシン溶液（８．３ｎｇ／μｌ、５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）を１５μｌ加え３７℃で１時間インキュベートした。５００ｍＭ 塩酸３μｌを加えて反応を停止した後、ＺｉｐＴｉｐを用いて脱塩を行い、ＭＳスペクトルを測定した。ＭＳスペクトルの結果を図４に示す。分子量１７３００前後のピークは観測されなかったことから、トリプシン消化が行われ、タンパク質が断片化していることが分かる。
【００２９】
さらに上記タンパク質断片のペプチドに対し、ＭＳ／ＭＳスペクトルの測定を行った。一例としてｍ／ｚが１０４７のフラグメントに対するＭＳ／ＭＳスペクトルを図５に示す。図のように１０４７の親ピークが無くなりアミノ酸単位に開裂したスペクトルが得られた。このスペクトルをデータベースと照らし合わせることによって、ペプチド配列を決定した。その結果、このペプチドの配列はＱＬＹＥＮＫＰＲであることが分かった。同定されたｙ系列およびｂ系列の分子量を図５に示す。
【００３０】
さらに、図４で検出されたｍ／ｚが７８９．５、９０２．６、９４５．６、２５１３．１に対して同様にペプチド配列を決定した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
これらのペプチドはアミノ酸１３個からなる直鎖ペプチドであるニューロテンシンの前駆体（ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ）の一部であることが分かった。図６にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの配列を示す。太字で示したものが検出されたペプチドである。さらにトリプシン消化前のタンパク質の分子量は図３より１７３００前後と推定されていた。ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの分子量は１７２２５であり、高分子のマススペクトルの誤差を許容するとほぼ一致していることが分かる。以上のことよりＳＢＣ３培養上清にはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが放出されていることが明らかとなった。ニューロテンシン（ＮＴ）は「ＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ」（配列番号２）の構造を持つ。これまでの研究によりＮＴはペプチドホルモンとして機能することが分かっている。しかしながらヒト肺癌由来の腫瘍細胞がＮＴの前駆体であるｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを放出しているという報告が無く、本研究によってはじめて明らかとなった。一般的にペプチドホルモンは血中で不安定である場合が多く、腫瘍マーカーとしては不適切である場合が多かったが、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮはペプチドホルモンの前駆体であるため血中安定性が高く腫瘍マーカー候補として適切である可能性が高い。
【実施例５】
【００３３】
（種々の肺癌由来培養細胞の比較）
他の小細胞癌としてＳＢＣ５の培養上清を上述の方法を用いて分析したところ、ＳＢＣ３と同様にｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの放出が確認できた。さらに、３種類の大細胞癌、２種類の腺癌、２種類の扁平上皮癌ではｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの放出は検出できなかった。以上のことよりｐｒｏＮＴ／ＮＭＮは小細胞肺癌特異的なマーカーとして期待できると言える。なお、正常者の肺由来の細胞からｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの放出は報告されていない。
【実施例６】
【００３４】
（培養上清中のタンパク質のカラムクロマトグラフィーによる分離とｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析）
また、ＳＢＣ３培養上清を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、得られたタンパク質画分をトリプシンのみ、あるいはトリプシンとＶ８プロテアーゼの２種類の酵素で消化した。消化されたタンパク質断片（ペプチド）に対し、ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＬＩＴ−ＴＯＦ質量分析計 ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒ（（株）日立ハイテクノロジーズ社製）での測定を行った。トリプシン消化は以下のように行った。
【００３５】
カラムクロマトグラフィーで得られた１８−１９分前後の画分を減圧下で遠心濃縮し、トリプシン溶液３０μｌ（トリプシンが０．５μｇ含まれた５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）を加え、３７℃で１８時間インキュベートし、その反応液５μｌを分析した。
また、トリプシンとＶ８プロテアーゼの２種類の酵素での処理には、トリプシン溶液３０μｌのかえて、トリプシン・Ｖ８プロテアーゼ混合液３０μｌ（トリプシンが１μｇ、Ｖ８プロテアーゼが１μｇ含まれた５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）を用いた。
【００３６】
トリプシンのみで処理を行ったペプチド断片の分析結果を表２及び図７に示す。その結果、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮの一部であるペプチド断片が検出された。同様にトリプシン・Ｖ８プロテアーゼ混合液で処理を行ったペプチド断片の分析結果を表３及び図８に示す。図９のスキーム中に下線で示したものが二種類の質量分析計を用いて検出されたペプチドである（配列番号１）。ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮのＮ末端およびＣ末端を含むほとんどの配列を検出することができた。
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【実施例７】
【００３９】
（Neurotensin及びLarge Neuromedin Nに対する抗体を用いたウエスタンブロット）
ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮは分子内にNeurotensin（ＮＴ）、Neuromedin N（ＮＭＮ）、Large Neuromedin N（Ｌａｒｇｅ ＮＭＮ）の配列を有する（図１０）。そこで、ＳＢＣ３を無血清培養した培養上清、ＳＢＣ−３を血清培養した培養上清、ＳＢＣ３の細胞破砕液を泳動し、ＮＴ、Ｌａｒｇｅ ＮＭＮに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った（図１１）。
【００４０】
その結果、ＳＢＣ−３を血清培養した培養上清及びＳＢＣ−３の細胞破砕液について、ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮ（分子量１７２２５）前後に陽性バンドが検出された（赤矢印）。ＮＴ、Ｌａｒｇｅ ＮＭＮの分子量はこれと大きく異なることから、検出できたバンドはｐｒｏＮＴ／ＮＭＮであると言える。また細胞内でも検出できたことから細胞がｐｒｏＮＴ／ＮＭＮを生産し上清に放出したと言える。
抗体を使ってｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出できたため、今後ＥＬＩＳＡなど汎用の臨床検査を用いてもｐｒｏＮＴ／ＮＭＮが検出できる可能性を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキット。
【請求項２】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキット。
【請求項３】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキット。
【請求項４】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキット。
【請求項５】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキット。
【請求項６】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキット。
【請求項１】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキット。
【請求項２】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキット。
【請求項３】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキット。
【請求項４】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキット。
【請求項５】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキット。
【請求項６】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−２１５５８９（Ｐ２０１２−２１５５８９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７１４３７（Ｐ２０１２−１７１４３７）
【出願日】平成２４年８月１日（２０１２．８．１）
【分割の表示】特願２００７−８６８３１（Ｐ２００７−８６８３１）の分割
【原出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年８月１日（２０１２．８．１）
【分割の表示】特願２００７−８６８３１（Ｐ２００７−８６８３１）の分割
【原出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]