小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤
【課題】
小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる神経細胞死を予防又は抑制することにより、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を効果的に予防又は治療することができ、かつ副作用が少ない医薬を提供する。
【解決手段】
抑肝散を有効成分として含有する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は抑制剤。
小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる神経細胞死を予防又は抑制することにより、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を効果的に予防又は治療することができ、かつ副作用が少ない医薬を提供する。
【解決手段】
抑肝散を有効成分として含有する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレスによる細胞死、特に神経細胞死を予防又は抑制するための医薬に関するものである。本発明はまた、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を予防又は治療するための医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
小胞体は、分泌系タンパク質及び膜タンパク質が正しく折りたたまれ、その立体構造を整える場である。また、小胞体は、細胞内カルシウムの貯蔵庫等として、多岐にわたる生理作用を有している。しかしながら、虚血、低酸素、遺伝子変異などの物理化学的ストレスによって、小胞体内に正常な折りたたみ構造を持たないタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）が増加したり、小胞体のカルシウムホメオスタシス（カルシウム恒常性）が撹乱されたりすることにより、小胞体の機能障害を引き起こすことが知られている。このような小胞体の機能が障害される状態及び小胞体の機能障害の状態は、小胞体ストレスと呼ばれている。
【０００３】
小胞体ストレスが加わると細胞は直ちにストレスから回避するための防御システムを活性化させる。小胞体膜上には、ストレスシグナル伝達に関与する膜タンパク質ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１α及びＡＴＦ６が存在する。これらの膜タンパク質は、小胞体ストレスセンサーとして異常タンパク質の蓄積を感知し、細胞質又は核内にシグナルを伝える。例えば、ＰＥＲＫが活性化されると、翻訳開始因子２のαサブユニット（ｅＩＦ２α）がリン酸化されてタンパク質の合成を抑制する。また、これらのストレスセンサーが活性化されることにより、分子シャペロンの転写が促進される。これがいわゆる小胞体ストレス応答又はunfolded protein response（UPR）といわれる応答機構である。しかしながら、強い小胞体ストレスの状態が継続すると、細胞がストレスに抵抗しきれず、自ら細胞死（アポトーシス）を選択することが明らかになってきている。
【０００４】
小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる細胞死が、種々の疾患に関与していることが指摘されている。例えば、アルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン−１）の変異が発現している神経細胞では、小胞体ストレス化での細胞死が促進される。これは、プレセニリン−１の変異が、小胞体ストレスセンサーの活性化を抑制し、その結果神経細胞死に導くためである。アルツハイマー病の原因遺伝子プレセニリン−２の変異によっても、小胞体ストレス下での細胞死が促進されることが報告されている（非特許文献１）。さらに、パーキンソン病、ポリグルタミン病（ハンチントン病）、狂牛病（プリオン病又は牛海面状脳症（ＢＳＥ）ともいう）、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の難治性神経変性疾患の発症及び病態進行にも、小胞体ストレスによる神経細胞死が関与していることが報告されている。これらの難治性神経変性疾患の患者は増加しており、有効な予防及び治療法の開発が望まれている。
【０００５】
例えば、アルツハイマー病治療薬として、アセチルコリンの分解を防ぎ、大脳皮質ニューロンの活性化をもたらすことにより認知症の進行を遅らせる薬剤（アセチルコリン分解阻害剤）が使用されている。しかしながらこのような薬剤では、アルツハイマー病の原因である神経細胞死を抑制できない。このため、アルツハイマー病の症状は改善するものの、その原因を治療することはできず、根本的治療薬とはいえなかった。また、アミロイド仮説に基づき、アミロイドβタンパク質の切り出し抑制、アミロイドβタンパク質に対する免疫療法等の開発が進められている。しかしながら、副作用の問題があり、さらに、症状改善の点からも望ましい結果が得られていない。さらに、脳虚血後の神経細胞死についても、現在のところ、予防又は治療の手段はない。
【０００６】
神経細胞は、一度成熟すると細胞分裂をすることができない。このため、小胞体ストレスによる神経細胞死及びこれに関連する疾患の発症機構の理解及び治療法の開発が急務となっている。しかしながら、小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる神経細胞死を効果的に予防又は抑制する活性を有する物質又は成分は、未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Journal of Chemical Neuroanatomy 28 (2004) 67-78
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる神経細胞死を予防又は抑制することにより、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を効果的に予防又は治療することができ、かつ副作用が少ない医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ね、漢方方剤（漢方薬）である抑肝散が、サプシガルジンに誘導される小胞体ストレスによる神経細胞死を有意に予防及び抑制することを見出し、この知見に基づきさらに研究を重ねた。その結果本発明者らは、抑肝散が、アルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン１）の変異が発現している神経細胞において、小胞体ストレス下での神経細胞死を有意に予防及び抑制することを見出した。抑肝散は、これまでの臨床使用において副作用が少ないことが証明されている安全性が高い漢方方剤である。また、脳虚血における神経細胞死を予防又は抑制する有効な治療薬はこれまでなかったが、本発明者らは、抑肝散が、低酸素状態（脳虚血モデル）によって誘導される小胞体ストレスによる神経細胞死も有意に予防及び抑制することを見出した。
【００１０】
本発明者らはさらに、抑肝散の構成生薬の中でも、川きゅう（センキュウ）が、このアルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン１）の変異が発現している神経細胞における小胞体ストレスによる神経細胞死を有意に予防及び抑制することを見出した。また、川きゅうは、低酸素状態（脳虚血モデル）によって誘導される小胞体ストレスによる神経細胞死も有意に予防及び抑制することを見出した。また、抑肝散の構成生薬の１つである柴胡（サイコ）が、これらの小胞体ストレスによる神経細胞死を抑制する傾向を示すことを見出した。
【００１１】
神経細胞にカルシウム恒常性の破綻等を誘導する、又は神経細胞を低酸素状態に暴露すると、神経細胞を守るＧＲＰ７８／Ｂｉｐ等の発現が誘導される。また、その一方で、細胞死の引き金となるＣＨＯＰ等の誘導も生じる。両者のバランスが崩れ、ＣＨＯＰの発現が優位となると、神経細胞は死に至る。例えば、アルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン１等）の変異が発現している細胞では、これらのバランスが崩れやすい状態になっており、細胞死が促進されている。本発明者らは、抑肝散及びその構成生薬の川きゅうは、ＧＲＰ７８／Ｂｉｐの発現を高める作用があり、この作用によって小胞体ストレスによる細胞死を抑制することを見出した。また、抑肝散、並びにその構成生薬の川きゅう及び柴胡は、ＣＨＯＰの誘導を抑制する作用があり、この作用によって小胞体ストレスによる細胞死を抑制することを見出した。
これらの知見から本発明者らは、抑肝散、並びにその構成生薬である川きゅう及び柴胡は、神経細胞における小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制に有効であり、さらに副作用も少ないことから、アルツハイマー病、脳虚血等の小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療に有用であることに想到した。
【００１２】
このように小胞体ストレスによる神経細胞死を予防及び抑制できる医薬は、例えば、現在アルツハイマー病の唯一の治療薬とされているアセチルコリン分解阻害剤に比して、アルツハイマー病発症進展機序を抑制するという点において、大きく異なる画期的な医薬である。しかも、生薬である抑肝散、並びに川きゅう及び柴胡には副作用が少ないことから、予防的に投与しても安全性が高く、例えば、家族性アルツハイマー病（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＤ：ＦＡＤ）家系での未発症家族に対する発症の予防等、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防に好適に用いることができるものである。
本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１３】
（１）抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
（２）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である前記（１）に記載の予防又は治療剤。
（３）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である前記（１）又は（２）に記載の予防又は治療剤。
【００１４】
（４）川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
（５）生薬が、川きゅうである前記（４）に記載の予防又は治療剤。
（６）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である前記（４）又は（５）に記載の予防又は治療剤。
（７）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である前記（５）又は（６）に記載の予防又は治療剤。
【００１５】
（８）抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
（９）川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
（１０）抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤。
【００１６】
本発明はまた、
抑肝散を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療方法、
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療方法、
抑肝散を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制方法、
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制方法、
抑肝散を哺乳類に投与する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制方法、及び
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を哺乳類に投与する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制方法、
に関する。
【００１７】
本発明はさらに、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、抑肝散の使用、及び、
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬の使用、
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる神経細胞等の細胞死を効果的に、しかも副作用が少ないため安全に予防又は抑制することができる。このため、本発明によれば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病（ＢＳＥ）、脳虚血及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を効果的に、しかも安全に予防又は治療することができる。本発明の予防又は治療剤は、例えば、現在アルツハイマー病の唯一の治療薬とされているアセチルコリン分解阻害剤に比して、アルツハイマー病発症進展機序を抑制するという点において、大きく異なる画期的な予防又は治療剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、サプシガルジン（ＴＧ）による細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。
【図２】図２は、サプシガルジン（ＴＧ）による細胞死に対する抑肝散の時間依存的効果を示す図である。
【図３】図３は、サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散の効果（濃度依存性）を示す図である。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｄ）は、サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散の効果（濃度依存性）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】図５は、低酸素負荷による細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｃ）は、低酸素負荷による細胞死に対する抑肝散の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】ＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散の作用を調べたウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】ツニカマイシン（培地中終濃度５μｇ／ｍＬ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図９】ツニカマイシン（培地中終濃度２μｇ／ｍＬ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図１０】ツニカマイシン（培地中終濃度５μｇ／ｍＬ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図１１】ツニカマイシン（培地中終濃度２μｇ／ｍＬ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図１２】抑肝散の各構成生薬の、サプシガルジン誘発細胞死に対する効果を示す図である。
【図１３】抑肝散の構成生薬それぞれの単独毒性を示す図である。
【図１４】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び各生薬成分の効果を示す図である。
【図１５】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び茯苓の効果を示す図である。
【図１６】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び柴胡の効果を示す図である。
【図１７】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び川きゅうの効果を示す図である。
【図１８】ＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及び各生薬成分の効果を示す図である。
【図１９】サプシガルジン（ＴＧ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２０】サプシガルジン（ＴＧ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２１】ツニカマイシン（Ｔｍ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２２】ツニカマイシン（Ｔｍ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２３】アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞（Δ９）におけるＥＲストレスによる細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。
【図２４】アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞におけるＥＲストレスによる細胞死に対する川きゅうの効果を示す図である。
【図２５】アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞におけるＥＲストレスによる細胞死に対する柴胡の効果を示す図である。
【図２６】ＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及び川きゅうの効果を示す図である。
【図２７】ＣＨＯＰ遺伝子の発現に対する抑肝散及び川きゅうの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤は、抑肝散を含有するものである。
本発明の予防又は治療剤の別の態様の１つは、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤である。
【００２１】
本発明において、「予防」とは、症状又は疾病及びその付随する症候の発症を遅延し、又は防止すること、対象が、症状若しくは疾病を獲得しないようにすること、又は、対象が症状若しくは疾病を獲得するリスクを低減することを意味する。
「治療」とは、症状又は疾病を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、症状又は疾病の進行をとどめること、又は症状又は疾病の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを意味する。
【００２２】
抑肝散としては、市販の漢方方剤を使用することができる。市販の漢方方剤として、例えば、医療用漢方薬であるツムラ抑肝散エキス顆粒（商品名）（ツムラ社製）、オースギ抑肝散料（商品名）（常盤薬品工業社製）；第二類医薬である一元 抑肝散（商品名、一元製薬社製）等が好ましい。中でも、医療用漢方薬であるツムラ抑肝散エキス顆粒（商品名）（ツムラ社製）が好ましい。
【００２３】
本発明の予防又は治療剤に含有される川きゅう（センキュウ）（Cnidii Rhizoma）は、漢方薬である抑肝散等に使用されている生薬である。川きゅうは、セリ科（Umbelliferae）の植物センキュウ（学名：Cnidium officinale Makino）の根茎である。
柴胡（サイコ）（Bupleuri Radix）は、抑肝散等に使用されている生薬である。柴胡は、セリ科のミシマサイコ（学名：Bupleurum scorzonerifolium, B.falcatum）又はその変種の根である。
【００２４】
本発明の予防又は治療剤は、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を含有する場合には、少なくとも川きゅうを含有することが好ましい。川きゅうを含有することにより、アルツハイマー病、脳虚血等の神経細胞死関連疾患の予防又は治療に特に効果が高いものとなる。
【００２５】
本発明の予防又は治療剤の有効成分として用いられる川きゅう及び柴胡は、何れも公知のものであり、例えば生薬末等として市販されているものである。本発明においては、これらの生薬として、市販の生薬末などを使用することができる。
【００２６】
川きゅう及び柴胡は、通常、抑肝散等の漢方方剤（漢方薬）にエキス末（エキス乾燥物）として含まれている。本発明の予防又は治療剤として、川きゅう及び柴胡に更に生薬を組合せて提供されている漢方方剤（漢方薬）を用いることも好ましい。このような漢方薬としては、抑肝散が好ましい。本発明の予防又は治療剤として抑肝散を用いることは、本発明の好ましい実施態様の１つである。抑肝散を含有する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤は、本発明の特に好ましい実施態様の１つである。抑肝散としては、上記のもの等が好適である。
【００２７】
本発明の予防又は治療剤は、上述したように、抑肝散を含有するか、又は、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を含有する。本発明の予防又は治療剤は、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬以外の成分を含まなくてもよく、含んでもよい。抑肝散、川きゅう及び柴胡以外の成分としては、医薬上許容される担体等を用いることができる。
【００２８】
本発明においては、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬をそのまま、又は適宜製剤化して本発明の予防又は治療剤として用いることができる。例えば、本発明の予防又は治療剤は、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬と、所望により配合される医薬上許容される担体とを、公知の方法により混合等して製剤化することにより容易に調製される。
【００２９】
本発明の予防又は治療剤の剤型として、経口投与用の製剤としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；乳剤、シロップ剤、懸濁剤等の液状製剤が挙げられる。非経口投与用の製剤としては、例えば注射剤、点滴剤等が挙げられる。本発明の予防又は治療剤の剤型は、経口投与の剤型が好ましい。
【００３０】
本発明における医薬上許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【００３１】
賦形剤の好適な例としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、マルトース、マンニトール等の糖又は糖アルコール；トウモロコシデンプン、デキストリン、α化デンプン等のデンプン又はデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロースやセルロース誘導体；軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００３２】
結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００３３】
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３４】
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
【００３５】
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００３６】
防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００３７】
本発明の予防又は治療剤が抑肝散を含有する場合、抑肝散の含有量は、例えば固形製剤であれば、抑肝散エキス末として、通常製剤の約１〜９９質量％であり、好ましくは約５〜９０質量％であり、より好ましくは、約１０〜８０質量％である。
【００３８】
本発明の予防又は治療剤が川きゅうを含有する場合、その含有量は、例えば固形製剤であれば、川きゅうエキス末として、通常製剤の約０．０００１〜９９重量％であり、好ましくは約０．００１〜７０重量％である。本発明の予防又は治療剤が柴胡を含有する場合、例えば固形製剤であれば、その含有量は、柴胡エキス末として、通常製剤の約０．０００１〜９９重量％であり、好ましくは約０．００１〜５０重量％である。
【００３９】
本発明の予防又は治療剤の投与方法は、経口投与が好ましい。また、本発明の予防又は治療剤は、食前又は食間に経口投与することがより好ましい。
本発明の予防又は治療剤の投与量および投与回数は、年齢、体重、投与形態等により異なるが、抑肝散を含有する製剤を経口投与する場合の投与量は、通常成人一日あたり抑肝散エキス末として、体重１ｋｇあたり約１０μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは約１００μｇ〜３００ｍｇとなるように投与する。この量を、通常１日１〜３回に分けて経口投与することが好ましい。抑肝散を含む製剤としては、上述したツムラ抑肝散エキス顆粒（医療用）（ツムラ社製）が好ましい。
【００４０】
本発明の予防又は治療剤として、川きゅうを含有する剤を経口投与する場合は、通常成人一日あたり川きゅうエキス末として、体重１ｋｇあたり約１μｇ〜５０ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３０ｍｇとなるように投与する。柴胡を含有する剤を経口投与する場合は、通常成人一日あたり柴胡エキス末として、体重１ｋｇあたり約１μｇ〜５０ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３０ｍｇとなるように投与する。この量を、通常１日１〜３回に分けて経口投与することが好ましい。川きゅう及び柴胡を含有する剤を投与する場合にも、川きゅう及び柴胡それぞれの投与量が上記量となるように投与することが好ましい。
【００４１】
本発明の予防又は治療剤は、神経細胞における小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる神経細胞死を効果的に予防又は抑制する作用を有することから、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療に好適に用いることができるものである。小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患とは、該疾患の発症又は病態進行に小胞体ストレスによる神経細胞死が関わっている疾患であればよい。本発明における小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患としては、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）、アルツハイマー型老年認知症）、パーキンソン病、ポリグルタミン病（ハンチントン病）、狂牛病（牛海綿状脳症（ＢＳＥ））、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等が好ましい。中でも、本発明の予防又は治療剤は、アルツハイマー病又は脳虚血の予防又は治療に好適に用いることができるものである。
【００４２】
本発明の予防又は治療剤の投与対象としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、サル、ブタ等の哺乳動物が好ましく、中でも、ヒトがより好ましい。また、投与対象としては、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を発症した又は発症する可能性がある哺乳動物が好ましい。例えば、上記神経細胞死関連疾患を発症した初期の段階から本発明の予防又は治療剤を投与することにより、その症状を効果的に改善、又は症状の進行を効果的に防ぐことができる。
【００４３】
本発明の予防又は治療剤は、副作用が少ないことから、上述したような神経細胞死関連疾患を予防するためにも好適に用いることができるものである。例えば、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を発症する可能性がある哺乳動物等に、該疾患を発症前に本発明の予防又は治療剤を投与することにより、該疾患の発症を遅延又は防ぐことができる。小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を発症する可能性がある哺乳動物としては、例えば、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）を発症するおそれのある哺乳動物（好ましくは、ヒト）等が好適である。
【００４４】
本発明の予防又は治療剤は、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を含むことから、細胞における小胞体ストレスを効果的に予防又は抑制することができるものである。このため、本発明の予防又は治療剤は、小胞体ストレスによる細胞死を効果的に予防又は抑制することができるものである。
【００４５】
抑肝散を含有する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
本発明の予防又は抑制剤は、上記作用を有することから、小胞体ストレスによる細胞死保護剤としても好適に用いることができるものである。本発明の予防又は抑制剤、及びその好ましい態様としては、上述した小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤と同様である。
【００４６】
「（神経）細胞における小胞体ストレスの抑制」とは、（神経）細胞における小胞体ストレスを完全に抑制することの他、完全に抑制しなくても小胞体ストレスの進展を抑制し、その進行をとどめることを意味する。また、「小胞体ストレスによる（神経）細胞死の抑制」とは、小胞体ストレスによる（神経）細胞死を完全に抑制することの他、完全に抑制しなくても小胞体ストレスによる（神経）細胞死の進展を抑制し、その進行をとどめることを意味する。
【００４７】
本発明の予防又は抑制剤は、例えば、神経細胞、骨細胞、すい臓の細胞等の内分泌腺細胞等における小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる該細胞の細胞死の予防又は抑制に好適に用いることができる。中でも、神経細胞における小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる該細胞の細胞死の予防又は抑制に特に好適に用いることができるものである。
【００４８】
抑肝散を含有する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
本発明の神経細胞死の予防又は抑制剤、及びその好ましい態様としては、上述した小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤と同様である。本発明の予防又は抑制剤は、小胞体ストレスによる神経細胞死保護剤としても好適に用いることができるものである。本発明の神経細胞死の予防又は抑制剤は、例えば、アルツハイマー病患者における小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制、脳虚血による小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制等に有効なものである。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５０】
本実施例中で使用した主な試薬、細胞及び培地は、以下の通りである。
抑肝散として、ツムラ社製の抑肝散エキス製剤、商品名「ツムラ５４番」を使用した。実験に用いたツムラ社製の抑肝散エキス製剤、商品名「ツムラ５４番」を、以下、単に「ＴＪ−５４」ともいう。抑肝散の構成生薬（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、釣藤鈎（チョウトウコウ））は、ツムラ社製のものを使用した。
サプシガルジン（thapsigargin）は、Sigma-Aldrich社製のものを、ツニカマイシン（tunicamycin）は、Sigma-Aldrich社製のものを、それぞれ使用した。ＤＭＳＯは、片山化学社製のものを使用した。
マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）は、大阪大学精神医学科講座から分与されたものを使用した。マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞の培養は、特にことわらない場合は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、培地中１０％となるようにＦＣＳ（ウシ胎児血清、ＦＢＳと同等である）を加えた培地（以下、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地という）を用い、３７℃で行った。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞は、理研CellBank：理化学研究所 バイオリソースセンターから入手した。ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の培養は、特にことわらない場合は、培地としてα−ＭＥＭ培地に、培地中１０％となるようにＦＣＳ（ウシ胎児血清、ＦＢＳと同等である）を加えた培地（以下、ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地という）を用い、３７℃で行った。
【００５１】
＜実施例１＞
一般的に栄養飢餓、虚血、低酸素や遺伝子変異などのストレスにより、小胞体ストレスが誘導されるが、この小胞体ストレスはツニカマイシン（tunicamycin、以下、単に「Ｔｍ」ともいう）、サプシガルジン（thapsigargin、以下、単に「ＴＧ」ともいう）等の投与により人工的に培養細胞に誘導することができる。
実施例１では、サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散の影響を調べた。すなわち、サプシガルジンの投与によって細胞に小胞体ストレス（ＥＲストレス）を誘導し、該小胞体ストレスによる細胞死に対する抑肝散の影響を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が４００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度１μＭとなるように該培地に添加した。対照（コントロール）群のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞の培地には、ＴＪ−５４及びサプシガルジンを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。後述の方法によって細胞死の評価を行なった。
【００５２】
（細胞死の評価）
細胞死の評価は、独立した４視野から少なくとも３００個の細胞を計測し、その中で、サプシガルジン（ＴＧ）添加６．５時間後に細胞にHoechst33342（Hoechst33342 bis-benzamide（商品名、Sigma-Aldrich社製）を１０μＭ、及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Sigma-Aldrich社製）を１０μＭ添加してHoechst陽性（青色の蛍光を発する）、ＰＩ陽性（赤色の蛍光を発する）且つ、核の断片化の起きている細胞を細胞死の起きている細胞として確定し、測定細胞における細胞死数の割合（測定細胞全体に対する細胞死を起こした細胞の割合、以下、「細胞死の割合」ともいう）を算出し、コントロール群（ＤＭＳＯ Ｙ＝０）における細胞死の割合を基準として、各群における細胞死が起きている細胞の数（細胞死数）の割合（細胞死の割合）を算出した。同様の実験を３回施行し、コントロール群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。
【００５３】
その結果、ＴＪ−５４は４００μｇ／ｍＬ前処置によってＴＧ刺激６．５時間後の細胞死をコントロール群に比べ５０％近く抑制した（図１及び図２）。
図１中、ＤＭＳＯは、ＤＭＳＯ添加群、Ｙ−０は、抑肝散（ＴＪ−５４）添加無し、Ｙ−４００は、抑肝散（４００μｇ／ｍＬ）添加群、ＴＧは、サプシガルジン添加群である。つまり、図１の（Ａ）ＤＭＳＯ Ｙ−０は、コントロール群である。（Ｂ）ＤＭＳＯ Ｙ−４００は、抑肝散を培地に４００μｇ／ｍＬ添加後、ＤＭＳＯを添加した群である。（Ｃ）ＴＧ Ｙ−０は、抑肝散を添加せず、ＴＧを添加した群である。（Ｄ）ＴＧ Ｙ−４００は、抑肝散を培地に４００μｇ／ｍＬ添加後、ＴＧを添加した群である。図１に示す結果は、ＴＧ刺激（添加）後６．５時間後の、コントロール群に対する、各群における細胞死の割合（コントロール群を１とした場合）である。
さらに、上記のＴＧ刺激（添加）後の抑肝散の効果を、時間依存的に検討した。この結果を、図２に示す。図２中、菱型（◇）は、抑肝散を添加せず、ＴＧを添加した群（図１の（Ｃ））である。四角（□）は、抑肝散を培地に４００μｇ／ｍＬ添加後、ＴＧを添加した群（図１の（Ｄ））である。
【００５４】
＜実施例２＞
実施例１と同様に、サプシガルジンの投与によって細胞に小胞体ストレス（ＥＲストレス）を誘導し、該小胞体ストレスによる細胞死に対する抑肝散の影響を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、又は８００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度１μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞には、ＴＪ−５４及びサプシガルジンを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。細胞死の評価を、実施例１と同様の方法で行った。結果を図３及び４に示す。図３は、培地中の抑肝散（ＴＪ−５４）濃度に対する細胞死の割合である。Ｙ−０〜Ｙ−８００は、それぞれ培地中のＴＪ−５４濃度が０〜８００μｇ／ｍＬの場合を意味する。図４は、ＴＧ添加後６．５時間後のＮ２Ａ細胞の蛍光顕微鏡写真である。図４（Ａ）は、培地にＴＪ−５４を添加しなかった場合（培地中の抑肝散０μｇ／ｍＬ）、（Ｂ）は、培地にＴＪ−５４を終濃度５０μｇ／ｍＬで添加した場合、（Ｃ）は、培地にＴＪ−５４を終濃度２００μｇ／ｍＬで添加した場合、（Ｄ）は、培地にＴＪ−５４を終濃度８００μｇ／ｍＬで添加した場合である。蛍光顕微鏡写真において、青又は赤く（グレースケールの写真では、白又は灰色に）見える部分が、細胞死が起こった細胞である。
図３及び４から、ＴＪ−５４は、培地中濃度４００μｇ／ｍＬまでは用量依存的にＴＧ刺激（添加）６．５時間後の細胞死をコントロール群に比べ抑制したが、８００μｇ／ｍＬでは過用量で、逆に抑肝散自体の細胞死促進作用が見られた。
【００５５】
＜実施例３＞
低酸素負荷によってもＥＲストレスが誘導される。実施例３では、低酸素負荷による細胞死に対する、抑肝散の効果を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が４００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４添加から１．５時間後、該マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞を低酸素チャンバーに入れ６時間低酸素刺激を加えた（低酸素（６時間）＋抑肝散（４００μｇ／ｍＬ））。比較として、マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞に抑肝散を添加せず、低酸素チャンバーに入れ６時間低酸素刺激を加えた（低酸素（６時間））。実施例１と同様に、ＴＪ−５４を添加せず正常酸素圧（Normoxia：通常の酸素濃度）で培養した細胞(コントロール：（Ａ）正常酸素圧）における細胞死割合を基準として、各群における細胞死割合を算出した。同様の実験を３回施行し、コントロール群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。結果を、図５及び図６に示す。
【００５６】
図５は、低酸素負荷による細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。図６（Ａ）は、ＴＪ−５４を添加せず、正常酸素下においたマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（コントロール）；（Ｂ）は、６時間低酸素刺激を加えたマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（ＴＪ−５４を添加せず）；（Ｃ）は、ＴＪ−５４を終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように添加後、６時間低酸素刺激を加えたマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞の蛍光顕微鏡写真である。図６の蛍光顕微鏡写真において、青又は赤く（グレースケールの写真では、白又は灰色に）見える部分が、細胞死が起こった細胞である。図６（Ａ）〜（Ｃ）から、（Ｃ）では、（Ｂ）と比較して細胞死が起こった細胞が少ないことが分かる。
図５及び６から分かるように、ＴＪ−５４は、４００μｇ／ｍＬ前処置により低酸素刺激６時間後の細胞死を低酸素群に比べ抑制した。
【００５７】
＜実施例４＞
抑肝散がサプシガルジンによるＥＲストレスに対する保護作用を示した理由を調べるために、シャペロンであるＧＲＰ７８の発現量を、Ｎ２Ａ細胞（マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞）で検討した。
Ｎ２Ａ細胞培養液を、抑肝散添加群、及び非添加群に分けた。抑肝散添加群には、培地濃度が４００μｇ／ｍＬとなるように抑肝散を添加した。抑肝散添加６時間後に各細胞を回収し、常法に従ってウェスタンブロットを行った。用いたＧＲＰ７８抗体はanti-Bip mAb(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)であり、二次抗体としてHRP-conjugated anti-mouse IgG Ab(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)を用いた。
ウェスタンブロットの結果を図７に示す。図７において、Ｙ−は、抑肝散なし１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地の場合である。Ｙ＋は、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中に抑肝散を４００μｇ／ｍＬ添加した場合である。図７から明らかなように、抑肝散（ＴＪ−５４）を投与した細胞では、ＧＲＰ７８の発現上昇を認めた。この結果から、抑肝散によるＧＲＰ７８発現上昇の効果が示唆された。
【００５８】
＜実施例５＞
ＥＲストレス誘導剤としてツニカマイシン（Ｔｍ）を用い、ＥＲストレスセンサーの１つであるＧＲＰ７８（ＢｉＰ）の発現に対するＴＪ−５４の効果を調べた。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が７００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４の添加から２４時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ又は５ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群の細胞にはＴＪ−５４及びＴｍを添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加０時間、６時間、２４時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＧＲＰ７８増幅用プライマー5’-ga aaggatggtt aatgatgctg ag-3’（配列番号１）、5’-gtcttcaatgtcagcatct-3’（配列番号２）を用いてＰＣＲ（９５℃０．５分、５５℃１分、７２℃１分、を３０サイクル）を行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。アガロース電気泳動の結果を、図８及び９に示す。図８及び９は、ツニカマイシン（Ｔｍ）を終濃度５μｇ／ｍＬ（図８）又は２μｇ／ｍＬ（図９）で培地に添加後、各経過時間におけるＧＲＰ７８遺伝子の発現を調べた結果である。図８及び９において、Ｃは、コントロール（Ｔｍで処理していない）、ＴＪは、ＴＪ−５４を培地に７００μｇ／ｍＬ添加したものである。図８及び９中の時間は、Ｔｍを培地に添加してからの経過時間（０、６及び２４時間）である。なお、Ｔｍ添加の２４時間前に、前記濃度のＴＪ−５４が培地に添加されている。
【００５９】
図８及び９から、ＴＪ−５４添加後２４時間の時点でＴｍ刺激（添加）のない状態でもＴＪ−５４非添加群に対して、ＧＲＰ７８の発現が上昇していた。一方、ＴＪ−５４非添加群（コントロール細胞：Ｃ）ではＴｍ５μｇ／ｍＬ刺激（添加）後、６時間、２４時間とＧＲＰ７８発現が著しく上昇した。ＴＪ−５４添加群では０時間のＧＲＰ７８発現量と比べて６時間で２倍程度のＧＲＰ７８発現量の増加が見られたが、２４時間後ではＴＪ−５４非添加群のＴｍ刺激前のＧＲＰ７８発現レベルにまで回復していた（図８）。同じ傾向がＴｍ２μｇ／ｍＬ刺激（添加）群でも見られた（図９）。これらの結果から、抑肝散の添加によって、ＥＲストレス状態にない場合でも転写レベルでＧＲＰ７８の発現が上昇していることが分かった。
【００６０】
＜実施例６＞
ＥＲストレス誘導剤としてツニカマイシン（Ｔｍ）を用い、ＥＲストレスセンサーの１つであるＣＨＯＰ（ＧＡＤＤ１５３）の発現に対するＴＪ−５４の効果を調べた。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が７００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４の添加から２４時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群の細胞には抑肝散及びＴｍを添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加０時間、６時間、２４時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＣＨＯＰ増幅用プライマー5’-catacaccaccacacctgaaag-3’（配列番号３）、5’-ccgtttcctagttcttccttgc-3’（配列番号４）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＣＨＯＰ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。結果を、図１０及び１１に示す。
【００６１】
図１０及び１１は、ツニカマイシン（Ｔｍ）を終濃度５μｇ／ｍＬ（図１０）又は２μｇ／ｍＬ（図１１）で培地に添加後、各経過時間におけるＣＨＯＰ遺伝子の発現を調べた結果である。図１０及び１１において、Ｃは、コントロール（Ｔｍで処理していない）、ＴＪは、ＴＪ−５４を培地に７００μｇ／ｍＬ添加したものである。図１０及び１１中の時間は、Ｔｍを培地に添加してからの経過時間（０、６及び２４時間）である。なお、Ｔｍ添加の２４時間前に、前記濃度のＴＪ−５４が培地に添加されている。
【００６２】
図１０及び１１から、ＴＪ−５４を添加すると、ＴＪ−５４添加後２４時間の時点では、Ｔｍ刺激（添加）のない状態で僅かにＴＪ−５４非添加群に対して、ＣＨＯＰの発現が上昇していた。一方、ＴＪ−５４非添加群（コントロール細胞：Ｃ）ではＴｍ５μｇ／ｍＬ刺激後、６時間、２４時間とＣＨＯＰ発現が著しく上昇した。ＴＪ−５４添加群では０時間のＣＨＯＰ発現量と比べて６時間で２倍程度のＣＨＯＰ発現量の増加が見られたが、２４時間後ではＴｍ刺激前のＣＨＯＰ発現レベルにまで回復していた（図１０）。Ｔｍ２μｇ／ｍＬ刺激（添加）群では刺激６時間後のＣＨＯＰの発現は刺激前と同程度であった（図１１）。
【００６３】
実施例１〜６の結果から、抑肝散（ＴＪ−５４）がＴＧ、Ｔｍ、低酸素刺激のようなＥＲストレス刺激に対して細胞死抑制（細胞保護）効果があること、この細胞死抑制効果は、抑肝散のＧＲＰ７８発現上昇作用によることが分かった（図８及び９）。また、ＴＪ−５４を添加した場合、細胞死誘導作用のあるＣＨＯＰの発現はＧＲＰ７８の発現上昇に比べて弱く、ＥＲストレス刺激後のＣＨＯＰの発現上昇は、ＴＪ−５４添加なしの群に比べてＴＪ−５４添加群の方が低かった（図１０及び１１）。このため、通常、ＥＲストレス下にある細胞では、ＣＨＯＰの発現がＧＲＰ７８同様に上昇し、その結果細胞死が誘導されるが、抑肝散を予め添加した細胞では、細胞がＥＲストレス下にない状態であっても転写レベルでＧＲＰ７８の発現が上昇し、さらにＣＨＯＰの発現がＧＲＰ７８の上昇に比して低いことから、細胞死が抑制されると考えられた。
次に、抑肝散（ＴＪ−５４）のどの構成生薬が、これらの細胞死抑制作用に寄与しているのかを調べた。
【００６４】
＜実施例７＞
ＴＪ−５４の各構成生薬のＴＧ誘発細胞死に対する効果を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（N2A)にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤：図１２中Ｇ８）又は抑肝散構成生薬７種類（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、及び釣藤鈎（チョウトウコウ））の何れかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬の添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＴＧ）（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度が１μＭとなるように培地に添加した。対照群（コントロール）群の細胞にはＴＪ−５４、構成生薬及びＴＧを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。
【００６５】
（細胞死の評価）
細胞死の評価は、独立した４視野から少なくとも３００個の細胞を計測し、その中で、ＴＧ負荷（添加）２０時間後に細胞にHoechst33342（商品名、Hoechst33342 bis-benzamide、Sigma-Aldorich社製）を１０μＭ、及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Sigma-Aldorich社製）を１０μＭ添加してHoechst陽性、ＰＩ陽性且つ、核の断片化の起きている細胞を細胞死の起きている細胞として確定し、測定細胞における細胞死数の割合（細胞死の割合）を算出し、Ｇ０（コントロール：ＴＧを添加せず、抑肝散及び構成生薬のいずれも添加しなかったもの)における細胞死の割合を基準として、各群における細胞死が起きている細胞の数（細胞死数）の割合（細胞死の割合）を算出した。同様の実験を３回施行し、Ｇ０群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。
【００６６】
結果を、図１２に示す。図１２中の記載は、以下の通りである。
Ｇ０：コントロール（ＴＧを添加せず、抑肝散及び構成生薬のいずれも添加しなかったもの）、Ｇ１：蒼朮（ソウジュツ）、Ｇ２：茯苓（ブクリョウ）、Ｇ３：川きゅう（センキュウ）、Ｇ４：当帰（トウキ）、Ｇ５：柴胡（サイコ）、Ｇ６：甘草（カンゾウ）、Ｇ７：釣藤鈎（チョウトウコウ）、Ｇ８：抑肝散（ＴＪ−５４）。
なお、各生薬は、全て２００μｇ／ｍＬで培地に添加した。ＴＧの負荷時間は、２０時間である。
図１２から、茯苓（Ｇ２）、川きゅう（Ｇ３）、及び当帰（Ｇ４）については、ＴＧ添加２０時間後の細胞死の割合がＧ０（コントロール）に比べ有意に低かった。釣藤鈎（チョウトウコウ）（Ｇ７）については細胞死促進作用が観察された。
【００６７】
＜実施例８＞
抑肝散に含まれる各生薬について、単独毒性を検討した。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤：図１３中、抑肝散と表示）又は抑肝散構成生薬７種類（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、及び釣藤鈎（チョウトウコウ））の何れかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬の添加から２４時間後の細胞死の程度を評価した。細胞死の評価は、実施例７と同様に行った。コントロール（抑肝散及び構成生薬のいずれも添加しなかったもの）の細胞死の割合（全細胞中の細胞死を起こした細胞の割合）を基準として、各群における細胞死の割合を算出した。同様の実験を３回施行し、コントロール群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。
その結果、甘草、又は釣藤鈎添加２４時間後の細胞死の割合がコントロールに比べ有意に高く、これらの生薬については細胞死促進作用が観察された。つまり、甘草及び釣藤鈎については、それぞれ単独で神経細胞に対する毒性をもつことが有意に示された。
結果を、図１３及び表１に示す。図３及び表１中、「生薬なし」がコントロールである。
【００６８】
【表１】
【００６９】
＜実施例９＞
WTS-1 assayによって、ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＴＧ負荷による細胞死に対する各生薬成分の効果を検討した。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）、又は抑肝散構成生薬７種類（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、及び釣藤鈎（チョウトウコウ））の何れかを図１４に示す終濃度（０〜２００μｇ／ｍＬ）で添加した。ＴＪ−５４又は生薬の添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度が３μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群には生薬及びサプシガルジンを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。細胞死の評価は、ＴＧ刺激３時間後培養上清を回収し、ＷＳＴ−１アッセイキット（同仁化学社製）を用いて、溶媒のみ添加した対照群における細胞死に対する抑制率として表した。同様の実験を３回施行し、対照群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。その結果、ヨクカンサン（抑肝散）、センキュウ（川きゅう）、及びサイコ（柴胡）は、ＴＧ刺激（添加）３時間後の細胞死を有意に抑制した。結果を、図１４に示す。また、特に良好な細胞死抑制効果が認められた構成生薬について、図１４からの抜粋を、図１５〜１７に示す。図１５〜１７から、培地濃度１００μｇ／ｍＬでは柴胡、及び蒼朮の２成分が抑肝散によく似た傾向を示した。さらに培地濃度２００μｇ／ｍＬでは柴胡、及び川きゅうが顕著な効果を示した。
【００７０】
＜実施例１０＞
抑肝散に含まれる構成生薬が、ＧＲＰ７８の発現に影響するのかを調べた。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養液中に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度２００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。添加から６．５時間後に各細胞を回収し、常法に従ってウェスタンブロットを行った。用いたＧＲＰ７８抗体はanti-Bip mAb(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)であり、二次抗体としてHRP-conjugated anti-mouse IgG Ab(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)を用いた。
その結果、釣藤鈎及び抑肝散は、ＧＲＰ７８発現を著明に上昇させた。その他の成分も、甘草を除きＧＲＰ７８の発現を上昇させる傾向を示した。結果を図１８に示す。
【００７１】
＜実施例１１＞
ＴＧ刺激に対する抑肝散及び各構成生薬の効果を調べた。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＴＧ）（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）を終濃度２μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びサプシガルジンのいずれも添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。ＴＧ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＧＲＰ７８増幅用プライマー5’-ga aaggatggtt aatgatgctg ag-3’（配列番号１）、5’-gtcttcaatgtcagcatct-3’（配列番号２）を用いて実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４構成生薬のうち柴胡（サイコ）又は川きゅう（センキュウ）で前処置した群において著しいＧＲＰ７８発現の誘導抑制が見られた。結果を図１９に示す。図１９及び以下で説明する図２０〜２２中、（−）は、ＴＧ（又はＴｍ）刺激（添加）を行なわなかったことを示す。（＋）は、ＴＧ（又はＴｍ）刺激（添加）を行なったことを示す。
【００７２】
＜実施例１２＞
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、ＴＪ−５４又は生薬を培地に添加して１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＴＧ）（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度２μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びサプシガルジンのいずれも添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。ＴＧ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＣＨＯＰ増幅用プライマー 5’-catacaccaccacacctgaaag-3’（配列番号３）、5’-ccgtttcctagttcttccttgc-3’（配列番号４）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＣＨＯＰ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４構成生薬のうち柴胡（サイコ）、川きゅう（センキュウ）、又は当帰（トウキ）で前処置した群においてＣＨＯＰ発現の誘導抑制が見られた。結果を図２０に示す。
【００７３】
＜実施例１３＞
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬添加から１．５時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びツニカマイシンのいずれも添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＧＲＰ７８増幅用プライマー5’-ga aaggatggtt aatgatgctg ag-3’（配列番号１）、5’-gtcttcaatgtcagcatct-3’（配列番号２）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４構成生薬のうち柴胡（サイコ）又は釣藤鈎（チョウトウコウ）で前処置した群において弱いＧＲＰ７８発現の誘導抑制が見られたが、ＴＧ刺激後に見られた反応に比べてその作用は弱かった。結果を図２１に示す。
【００７４】
＜実施例１４＞
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬添加から１．５時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように培地中添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びツニカマイシンのいずれも添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＣＨＯＰ増幅用プライマー 5’-catacaccaccacacctgaaag-3’（配列番号３）、5’-ccgtttcctagttcttccttgc-3’（配列番号４）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＣＨＯＰ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４と添加群以外の構成生薬添加群でＴＧ刺激の際見られたような劇的なＣＨＯＰ発現の誘導抑制は見られなかった。結果を図２２に示す。
【００７５】
＜実施例１５＞
ＥＲストレスに脆弱になったアルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞に対する抑肝散の効果を調べた。
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に家族性アルツハイマー病患者（ＦＡＤ）の持つ変異体Presenilin-1deltaエクソン9（PS1△E9)を強制発現させた細胞（PS1△E9を定常的に発現する細胞、「変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞」ともいう）を用いて、抑肝散のＥＲストレス誘発細胞死に対する効果を検討した。コントロールとして、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に野生型Presnilin-1（ＰＳ１Ｗｔ）を強制発現させた細胞（ＰＳ１Ｗｔを定常的に発現する細胞）を用いた。これらの変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞及びコントロールの細胞はいずれも、Presenilin-1 mutation activates the signaling pathway of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis：Yukioka F, et.al. Neurochem Int. 2008 Mar-Apr;52(4-5):683-7. に記載の方法により作製されたものである。細胞培養方法、及びＴＧ刺激（添加）条件は、実施例１１と同様の方法で行った。細胞死アッセイはＭＴＳアッセイキット（プロメガ社製）を用いて行った。その結果、ＦＡＤ患者に見られる変異ＰＳ１△Ｅ９を発現する細胞では、ＴＧ２μＭ刺激３時間後、ＰＳ１Ｗｔ発現細胞（コントロール：正常細胞）における生存細胞の割合を基準とすると６０％以上生存細胞の割合が減少した。これに対してＴＪ−５４をＴＧ負荷１．５時間前に終濃度４００μｇ／ｍＬで培地に添加しておくと、同生存細胞の割合は８割程度まで回復した。このように、抑肝散はＰＳ１ΔＥ９が誘導する細胞死にも効果を示した（Ｎ＝４）。結果を図２３に示す。図２３中、ＮＴは、ＴＧを添加しなかった細胞、ＴＧは、ＴＧ添加（刺激）した細胞である。Δ９は、変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞にＴＪ−５４を添加しなかった場合であり、Δ９＋ｙは、変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞にＴＪ−５４（培地中４００μｇ／ｍＬ）を添加した場合である。
【００７６】
＜実施例１６＞
アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞に対する抑肝散及の構成生薬柴胡、及び川きゅうの効果を調べた。
実施例１５と同様に、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に家族性アルツハイマー病患者（ＦＡＤ）の持つ変異体Presenilin-1deltaエクソン9（PS1△E9)を強制発現させた細胞（PS1△E9を定常的に発現する細胞、「変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞」ともいう）を用いて、ＴＪ−５４の構成生薬柴胡、川きゅうのＥＲストレス誘発細胞死に対する効果を検討した。実施例１５と同様に、コントロールとして、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に野生型Presnilin-1（ＰＳ１Ｗｔ）を強制発現させた細胞（ＰＳ１Ｗｔを定常的に発現する細胞）を用いた。細胞培養方法及びＴＧ刺激（添加）条件は、実施例１１と同様の方法で行った。細胞死アッセイは、実施例１５と同様にＭＴＳアッセイキットを用いて行った。その結果、ＦＡＤ患者に見られる変異ＰＳ１△Ｅ９を発現する細胞では、ＴＧ２μＭ刺激３時間後、ＴＧ刺激（添加）無し群（ＤＭＳＯ２）での生存細胞の割合を基準とすると川きゅう２〜２００μｇ／ｍＬでの前処置により川きゅう添加量依存的にＴＧ刺激による生存細胞の減少が抑制された（図２４、Ｎ＝４）。これに対して柴胡前処置群では効果が見られた群もあったが用量依存性が見られなかった（図２５）。図２４及び２５において、ＤＭＳＯ２は、ＴＧ刺激（添加）せず、川きゅう及び柴胡をいずれも添加しなかった群（コントロール）；ＴＧ２は、ＴＧ２μＭで刺激した群である。図２４において、ＴＧ２＋ｓｅｎ２５は、川きゅう２５μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓｅｎ５０は、川きゅう５０μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓｅｎ１００は、川きゅう１００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓｅｎ２００は、川きゅう２００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群である。図２５において、ＴＧ２＋ｓａｉ２５は、柴胡２５μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓａｉ５０は、柴胡５０μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓａｉ１００は、柴胡１００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓａｉ２００は、柴胡２００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群である。
【００７７】
＜実施例１７＞
川きゅう及び抑肝散のＧＲＰ７８発現への影響を調べた。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養液中に、抑肝散及び川きゅうのいずれかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように添加した（コントロールの細胞には、抑肝散及び川きゅうのいずれも添加しなかった）。添加６．５時間後に各細胞を回収し、実施例１３で用いた方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。用いたＧＲＰ７８プライマー、及びＰＣＲ条件は実施例１３で用いたプライマー及び条件と同じである。
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において抑肝散及び川きゅうのいずれによってもＧＲＰ７８の発現が有意に上昇した。結果を、図２６に示す。
【００７８】
＜実施例１８＞
川きゅう及び抑肝散のＣＨＯＰ発現への影響を調べた。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養液中に抑肝散及び川きゅうのいずれかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように添加した。添加１．５時間後にＴＧ１μＭを添加した。コントロールの細胞には、抑肝散及び川きゅうのいずれも添加しなかった。４時間後各細胞を回収し、実施例１４で用いた方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。用いたＣＨＯＰプライマー、及びＰＣＲ条件は実施例１４で用いたＣＨＯＰプライマー、及びＰＣＲ条件と同じである。
その結果、川きゅう及び抑肝散のいずれの前処置によってもＴＧ負荷時のＣＨＯＰ誘導が有意に抑制された。結果を図２７に示す。
【００７９】
実施例１〜１８の結果に示されるように、ＥＲストレス誘導性細胞死、アルツハイマー病モデル細胞おける細胞死促進効果に対し、抑肝散、及び抑肝散の構成生薬川きゅうが顕著な抑制効果を示した。抑肝散及び川きゅうによる細胞死抑制効果には、ＧＲＰ７８の発現上昇、ＣＨＯＰ誘導抑制効果が関与していた。これらの結果から、抑肝散はＥＲストレス応答を上昇させ、神経変性疾患や脳虚血などに見られる周辺症状のみならず、中核症状にも有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防及び治療に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレスによる細胞死、特に神経細胞死を予防又は抑制するための医薬に関するものである。本発明はまた、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を予防又は治療するための医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
小胞体は、分泌系タンパク質及び膜タンパク質が正しく折りたたまれ、その立体構造を整える場である。また、小胞体は、細胞内カルシウムの貯蔵庫等として、多岐にわたる生理作用を有している。しかしながら、虚血、低酸素、遺伝子変異などの物理化学的ストレスによって、小胞体内に正常な折りたたみ構造を持たないタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）が増加したり、小胞体のカルシウムホメオスタシス（カルシウム恒常性）が撹乱されたりすることにより、小胞体の機能障害を引き起こすことが知られている。このような小胞体の機能が障害される状態及び小胞体の機能障害の状態は、小胞体ストレスと呼ばれている。
【０００３】
小胞体ストレスが加わると細胞は直ちにストレスから回避するための防御システムを活性化させる。小胞体膜上には、ストレスシグナル伝達に関与する膜タンパク質ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１α及びＡＴＦ６が存在する。これらの膜タンパク質は、小胞体ストレスセンサーとして異常タンパク質の蓄積を感知し、細胞質又は核内にシグナルを伝える。例えば、ＰＥＲＫが活性化されると、翻訳開始因子２のαサブユニット（ｅＩＦ２α）がリン酸化されてタンパク質の合成を抑制する。また、これらのストレスセンサーが活性化されることにより、分子シャペロンの転写が促進される。これがいわゆる小胞体ストレス応答又はunfolded protein response（UPR）といわれる応答機構である。しかしながら、強い小胞体ストレスの状態が継続すると、細胞がストレスに抵抗しきれず、自ら細胞死（アポトーシス）を選択することが明らかになってきている。
【０００４】
小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる細胞死が、種々の疾患に関与していることが指摘されている。例えば、アルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン−１）の変異が発現している神経細胞では、小胞体ストレス化での細胞死が促進される。これは、プレセニリン−１の変異が、小胞体ストレスセンサーの活性化を抑制し、その結果神経細胞死に導くためである。アルツハイマー病の原因遺伝子プレセニリン−２の変異によっても、小胞体ストレス下での細胞死が促進されることが報告されている（非特許文献１）。さらに、パーキンソン病、ポリグルタミン病（ハンチントン病）、狂牛病（プリオン病又は牛海面状脳症（ＢＳＥ）ともいう）、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の難治性神経変性疾患の発症及び病態進行にも、小胞体ストレスによる神経細胞死が関与していることが報告されている。これらの難治性神経変性疾患の患者は増加しており、有効な予防及び治療法の開発が望まれている。
【０００５】
例えば、アルツハイマー病治療薬として、アセチルコリンの分解を防ぎ、大脳皮質ニューロンの活性化をもたらすことにより認知症の進行を遅らせる薬剤（アセチルコリン分解阻害剤）が使用されている。しかしながらこのような薬剤では、アルツハイマー病の原因である神経細胞死を抑制できない。このため、アルツハイマー病の症状は改善するものの、その原因を治療することはできず、根本的治療薬とはいえなかった。また、アミロイド仮説に基づき、アミロイドβタンパク質の切り出し抑制、アミロイドβタンパク質に対する免疫療法等の開発が進められている。しかしながら、副作用の問題があり、さらに、症状改善の点からも望ましい結果が得られていない。さらに、脳虚血後の神経細胞死についても、現在のところ、予防又は治療の手段はない。
【０００６】
神経細胞は、一度成熟すると細胞分裂をすることができない。このため、小胞体ストレスによる神経細胞死及びこれに関連する疾患の発症機構の理解及び治療法の開発が急務となっている。しかしながら、小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる神経細胞死を効果的に予防又は抑制する活性を有する物質又は成分は、未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Journal of Chemical Neuroanatomy 28 (2004) 67-78
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる神経細胞死を予防又は抑制することにより、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を効果的に予防又は治療することができ、かつ副作用が少ない医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ね、漢方方剤（漢方薬）である抑肝散が、サプシガルジンに誘導される小胞体ストレスによる神経細胞死を有意に予防及び抑制することを見出し、この知見に基づきさらに研究を重ねた。その結果本発明者らは、抑肝散が、アルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン１）の変異が発現している神経細胞において、小胞体ストレス下での神経細胞死を有意に予防及び抑制することを見出した。抑肝散は、これまでの臨床使用において副作用が少ないことが証明されている安全性が高い漢方方剤である。また、脳虚血における神経細胞死を予防又は抑制する有効な治療薬はこれまでなかったが、本発明者らは、抑肝散が、低酸素状態（脳虚血モデル）によって誘導される小胞体ストレスによる神経細胞死も有意に予防及び抑制することを見出した。
【００１０】
本発明者らはさらに、抑肝散の構成生薬の中でも、川きゅう（センキュウ）が、このアルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン１）の変異が発現している神経細胞における小胞体ストレスによる神経細胞死を有意に予防及び抑制することを見出した。また、川きゅうは、低酸素状態（脳虚血モデル）によって誘導される小胞体ストレスによる神経細胞死も有意に予防及び抑制することを見出した。また、抑肝散の構成生薬の１つである柴胡（サイコ）が、これらの小胞体ストレスによる神経細胞死を抑制する傾向を示すことを見出した。
【００１１】
神経細胞にカルシウム恒常性の破綻等を誘導する、又は神経細胞を低酸素状態に暴露すると、神経細胞を守るＧＲＰ７８／Ｂｉｐ等の発現が誘導される。また、その一方で、細胞死の引き金となるＣＨＯＰ等の誘導も生じる。両者のバランスが崩れ、ＣＨＯＰの発現が優位となると、神経細胞は死に至る。例えば、アルツハイマー病の原因遺伝子（プレセニリン１等）の変異が発現している細胞では、これらのバランスが崩れやすい状態になっており、細胞死が促進されている。本発明者らは、抑肝散及びその構成生薬の川きゅうは、ＧＲＰ７８／Ｂｉｐの発現を高める作用があり、この作用によって小胞体ストレスによる細胞死を抑制することを見出した。また、抑肝散、並びにその構成生薬の川きゅう及び柴胡は、ＣＨＯＰの誘導を抑制する作用があり、この作用によって小胞体ストレスによる細胞死を抑制することを見出した。
これらの知見から本発明者らは、抑肝散、並びにその構成生薬である川きゅう及び柴胡は、神経細胞における小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制に有効であり、さらに副作用も少ないことから、アルツハイマー病、脳虚血等の小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療に有用であることに想到した。
【００１２】
このように小胞体ストレスによる神経細胞死を予防及び抑制できる医薬は、例えば、現在アルツハイマー病の唯一の治療薬とされているアセチルコリン分解阻害剤に比して、アルツハイマー病発症進展機序を抑制するという点において、大きく異なる画期的な医薬である。しかも、生薬である抑肝散、並びに川きゅう及び柴胡には副作用が少ないことから、予防的に投与しても安全性が高く、例えば、家族性アルツハイマー病（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＤ：ＦＡＤ）家系での未発症家族に対する発症の予防等、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防に好適に用いることができるものである。
本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１３】
（１）抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
（２）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である前記（１）に記載の予防又は治療剤。
（３）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である前記（１）又は（２）に記載の予防又は治療剤。
【００１４】
（４）川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
（５）生薬が、川きゅうである前記（４）に記載の予防又は治療剤。
（６）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である前記（４）又は（５）に記載の予防又は治療剤。
（７）小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である前記（５）又は（６）に記載の予防又は治療剤。
【００１５】
（８）抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
（９）川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
（１０）抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤。
【００１６】
本発明はまた、
抑肝散を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療方法、
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療方法、
抑肝散を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制方法、
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を哺乳類に投与する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制方法、
抑肝散を哺乳類に投与する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制方法、及び
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を哺乳類に投与する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制方法、
に関する。
【００１７】
本発明はさらに、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、抑肝散の使用、及び、
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤の製造のための、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬の使用、
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる神経細胞等の細胞死を効果的に、しかも副作用が少ないため安全に予防又は抑制することができる。このため、本発明によれば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病（ＢＳＥ）、脳虚血及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を効果的に、しかも安全に予防又は治療することができる。本発明の予防又は治療剤は、例えば、現在アルツハイマー病の唯一の治療薬とされているアセチルコリン分解阻害剤に比して、アルツハイマー病発症進展機序を抑制するという点において、大きく異なる画期的な予防又は治療剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、サプシガルジン（ＴＧ）による細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。
【図２】図２は、サプシガルジン（ＴＧ）による細胞死に対する抑肝散の時間依存的効果を示す図である。
【図３】図３は、サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散の効果（濃度依存性）を示す図である。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｄ）は、サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散の効果（濃度依存性）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】図５は、低酸素負荷による細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｃ）は、低酸素負荷による細胞死に対する抑肝散の効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】ＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散の作用を調べたウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】ツニカマイシン（培地中終濃度５μｇ／ｍＬ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図９】ツニカマイシン（培地中終濃度２μｇ／ｍＬ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図１０】ツニカマイシン（培地中終濃度５μｇ／ｍＬ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図１１】ツニカマイシン（培地中終濃度２μｇ／ｍＬ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現の経時変化を示す図である。
【図１２】抑肝散の各構成生薬の、サプシガルジン誘発細胞死に対する効果を示す図である。
【図１３】抑肝散の構成生薬それぞれの単独毒性を示す図である。
【図１４】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び各生薬成分の効果を示す図である。
【図１５】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び茯苓の効果を示す図である。
【図１６】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び柴胡の効果を示す図である。
【図１７】サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散及び川きゅうの効果を示す図である。
【図１８】ＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及び各生薬成分の効果を示す図である。
【図１９】サプシガルジン（ＴＧ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２０】サプシガルジン（ＴＧ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２１】ツニカマイシン（Ｔｍ）により誘導されるＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２２】ツニカマイシン（Ｔｍ）により誘導されるＣＨＯＰ遺伝子の発現に対する抑肝散及びその構成生薬の効果を示す図である。
【図２３】アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞（Δ９）におけるＥＲストレスによる細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。
【図２４】アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞におけるＥＲストレスによる細胞死に対する川きゅうの効果を示す図である。
【図２５】アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞におけるＥＲストレスによる細胞死に対する柴胡の効果を示す図である。
【図２６】ＧＲＰ７８遺伝子の発現に対する抑肝散及び川きゅうの効果を示す図である。
【図２７】ＣＨＯＰ遺伝子の発現に対する抑肝散及び川きゅうの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤は、抑肝散を含有するものである。
本発明の予防又は治療剤の別の態様の１つは、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤である。
【００２１】
本発明において、「予防」とは、症状又は疾病及びその付随する症候の発症を遅延し、又は防止すること、対象が、症状若しくは疾病を獲得しないようにすること、又は、対象が症状若しくは疾病を獲得するリスクを低減することを意味する。
「治療」とは、症状又は疾病を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、症状又は疾病の進行をとどめること、又は症状又は疾病の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを意味する。
【００２２】
抑肝散としては、市販の漢方方剤を使用することができる。市販の漢方方剤として、例えば、医療用漢方薬であるツムラ抑肝散エキス顆粒（商品名）（ツムラ社製）、オースギ抑肝散料（商品名）（常盤薬品工業社製）；第二類医薬である一元 抑肝散（商品名、一元製薬社製）等が好ましい。中でも、医療用漢方薬であるツムラ抑肝散エキス顆粒（商品名）（ツムラ社製）が好ましい。
【００２３】
本発明の予防又は治療剤に含有される川きゅう（センキュウ）（Cnidii Rhizoma）は、漢方薬である抑肝散等に使用されている生薬である。川きゅうは、セリ科（Umbelliferae）の植物センキュウ（学名：Cnidium officinale Makino）の根茎である。
柴胡（サイコ）（Bupleuri Radix）は、抑肝散等に使用されている生薬である。柴胡は、セリ科のミシマサイコ（学名：Bupleurum scorzonerifolium, B.falcatum）又はその変種の根である。
【００２４】
本発明の予防又は治療剤は、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を含有する場合には、少なくとも川きゅうを含有することが好ましい。川きゅうを含有することにより、アルツハイマー病、脳虚血等の神経細胞死関連疾患の予防又は治療に特に効果が高いものとなる。
【００２５】
本発明の予防又は治療剤の有効成分として用いられる川きゅう及び柴胡は、何れも公知のものであり、例えば生薬末等として市販されているものである。本発明においては、これらの生薬として、市販の生薬末などを使用することができる。
【００２６】
川きゅう及び柴胡は、通常、抑肝散等の漢方方剤（漢方薬）にエキス末（エキス乾燥物）として含まれている。本発明の予防又は治療剤として、川きゅう及び柴胡に更に生薬を組合せて提供されている漢方方剤（漢方薬）を用いることも好ましい。このような漢方薬としては、抑肝散が好ましい。本発明の予防又は治療剤として抑肝散を用いることは、本発明の好ましい実施態様の１つである。抑肝散を含有する小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤は、本発明の特に好ましい実施態様の１つである。抑肝散としては、上記のもの等が好適である。
【００２７】
本発明の予防又は治療剤は、上述したように、抑肝散を含有するか、又は、川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を含有する。本発明の予防又は治療剤は、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬以外の成分を含まなくてもよく、含んでもよい。抑肝散、川きゅう及び柴胡以外の成分としては、医薬上許容される担体等を用いることができる。
【００２８】
本発明においては、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬をそのまま、又は適宜製剤化して本発明の予防又は治療剤として用いることができる。例えば、本発明の予防又は治療剤は、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬と、所望により配合される医薬上許容される担体とを、公知の方法により混合等して製剤化することにより容易に調製される。
【００２９】
本発明の予防又は治療剤の剤型として、経口投与用の製剤としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；乳剤、シロップ剤、懸濁剤等の液状製剤が挙げられる。非経口投与用の製剤としては、例えば注射剤、点滴剤等が挙げられる。本発明の予防又は治療剤の剤型は、経口投与の剤型が好ましい。
【００３０】
本発明における医薬上許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【００３１】
賦形剤の好適な例としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、マルトース、マンニトール等の糖又は糖アルコール；トウモロコシデンプン、デキストリン、α化デンプン等のデンプン又はデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロースやセルロース誘導体；軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００３２】
結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００３３】
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３４】
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
【００３５】
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００３６】
防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００３７】
本発明の予防又は治療剤が抑肝散を含有する場合、抑肝散の含有量は、例えば固形製剤であれば、抑肝散エキス末として、通常製剤の約１〜９９質量％であり、好ましくは約５〜９０質量％であり、より好ましくは、約１０〜８０質量％である。
【００３８】
本発明の予防又は治療剤が川きゅうを含有する場合、その含有量は、例えば固形製剤であれば、川きゅうエキス末として、通常製剤の約０．０００１〜９９重量％であり、好ましくは約０．００１〜７０重量％である。本発明の予防又は治療剤が柴胡を含有する場合、例えば固形製剤であれば、その含有量は、柴胡エキス末として、通常製剤の約０．０００１〜９９重量％であり、好ましくは約０．００１〜５０重量％である。
【００３９】
本発明の予防又は治療剤の投与方法は、経口投与が好ましい。また、本発明の予防又は治療剤は、食前又は食間に経口投与することがより好ましい。
本発明の予防又は治療剤の投与量および投与回数は、年齢、体重、投与形態等により異なるが、抑肝散を含有する製剤を経口投与する場合の投与量は、通常成人一日あたり抑肝散エキス末として、体重１ｋｇあたり約１０μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは約１００μｇ〜３００ｍｇとなるように投与する。この量を、通常１日１〜３回に分けて経口投与することが好ましい。抑肝散を含む製剤としては、上述したツムラ抑肝散エキス顆粒（医療用）（ツムラ社製）が好ましい。
【００４０】
本発明の予防又は治療剤として、川きゅうを含有する剤を経口投与する場合は、通常成人一日あたり川きゅうエキス末として、体重１ｋｇあたり約１μｇ〜５０ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３０ｍｇとなるように投与する。柴胡を含有する剤を経口投与する場合は、通常成人一日あたり柴胡エキス末として、体重１ｋｇあたり約１μｇ〜５０ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３０ｍｇとなるように投与する。この量を、通常１日１〜３回に分けて経口投与することが好ましい。川きゅう及び柴胡を含有する剤を投与する場合にも、川きゅう及び柴胡それぞれの投与量が上記量となるように投与することが好ましい。
【００４１】
本発明の予防又は治療剤は、神経細胞における小胞体ストレス及び小胞体ストレスによる神経細胞死を効果的に予防又は抑制する作用を有することから、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療に好適に用いることができるものである。小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患とは、該疾患の発症又は病態進行に小胞体ストレスによる神経細胞死が関わっている疾患であればよい。本発明における小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患としては、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）、アルツハイマー型老年認知症）、パーキンソン病、ポリグルタミン病（ハンチントン病）、狂牛病（牛海綿状脳症（ＢＳＥ））、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等が好ましい。中でも、本発明の予防又は治療剤は、アルツハイマー病又は脳虚血の予防又は治療に好適に用いることができるものである。
【００４２】
本発明の予防又は治療剤の投与対象としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、サル、ブタ等の哺乳動物が好ましく、中でも、ヒトがより好ましい。また、投与対象としては、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を発症した又は発症する可能性がある哺乳動物が好ましい。例えば、上記神経細胞死関連疾患を発症した初期の段階から本発明の予防又は治療剤を投与することにより、その症状を効果的に改善、又は症状の進行を効果的に防ぐことができる。
【００４３】
本発明の予防又は治療剤は、副作用が少ないことから、上述したような神経細胞死関連疾患を予防するためにも好適に用いることができるものである。例えば、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を発症する可能性がある哺乳動物等に、該疾患を発症前に本発明の予防又は治療剤を投与することにより、該疾患の発症を遅延又は防ぐことができる。小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患を発症する可能性がある哺乳動物としては、例えば、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）を発症するおそれのある哺乳動物（好ましくは、ヒト）等が好適である。
【００４４】
本発明の予防又は治療剤は、抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を含むことから、細胞における小胞体ストレスを効果的に予防又は抑制することができるものである。このため、本発明の予防又は治療剤は、小胞体ストレスによる細胞死を効果的に予防又は抑制することができるものである。
【００４５】
抑肝散を含有する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有する小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
本発明の予防又は抑制剤は、上記作用を有することから、小胞体ストレスによる細胞死保護剤としても好適に用いることができるものである。本発明の予防又は抑制剤、及びその好ましい態様としては、上述した小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤と同様である。
【００４６】
「（神経）細胞における小胞体ストレスの抑制」とは、（神経）細胞における小胞体ストレスを完全に抑制することの他、完全に抑制しなくても小胞体ストレスの進展を抑制し、その進行をとどめることを意味する。また、「小胞体ストレスによる（神経）細胞死の抑制」とは、小胞体ストレスによる（神経）細胞死を完全に抑制することの他、完全に抑制しなくても小胞体ストレスによる（神経）細胞死の進展を抑制し、その進行をとどめることを意味する。
【００４７】
本発明の予防又は抑制剤は、例えば、神経細胞、骨細胞、すい臓の細胞等の内分泌腺細胞等における小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる該細胞の細胞死の予防又は抑制に好適に用いることができる。中でも、神経細胞における小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる該細胞の細胞死の予防又は抑制に特に好適に用いることができるものである。
【００４８】
抑肝散を含有する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有する小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤も、本発明の１つである。
本発明の神経細胞死の予防又は抑制剤、及びその好ましい態様としては、上述した小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤と同様である。本発明の予防又は抑制剤は、小胞体ストレスによる神経細胞死保護剤としても好適に用いることができるものである。本発明の神経細胞死の予防又は抑制剤は、例えば、アルツハイマー病患者における小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制、脳虚血による小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制等に有効なものである。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５０】
本実施例中で使用した主な試薬、細胞及び培地は、以下の通りである。
抑肝散として、ツムラ社製の抑肝散エキス製剤、商品名「ツムラ５４番」を使用した。実験に用いたツムラ社製の抑肝散エキス製剤、商品名「ツムラ５４番」を、以下、単に「ＴＪ−５４」ともいう。抑肝散の構成生薬（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、釣藤鈎（チョウトウコウ））は、ツムラ社製のものを使用した。
サプシガルジン（thapsigargin）は、Sigma-Aldrich社製のものを、ツニカマイシン（tunicamycin）は、Sigma-Aldrich社製のものを、それぞれ使用した。ＤＭＳＯは、片山化学社製のものを使用した。
マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）は、大阪大学精神医学科講座から分与されたものを使用した。マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞の培養は、特にことわらない場合は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、培地中１０％となるようにＦＣＳ（ウシ胎児血清、ＦＢＳと同等である）を加えた培地（以下、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地という）を用い、３７℃で行った。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞は、理研CellBank：理化学研究所 バイオリソースセンターから入手した。ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の培養は、特にことわらない場合は、培地としてα−ＭＥＭ培地に、培地中１０％となるようにＦＣＳ（ウシ胎児血清、ＦＢＳと同等である）を加えた培地（以下、ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地という）を用い、３７℃で行った。
【００５１】
＜実施例１＞
一般的に栄養飢餓、虚血、低酸素や遺伝子変異などのストレスにより、小胞体ストレスが誘導されるが、この小胞体ストレスはツニカマイシン（tunicamycin、以下、単に「Ｔｍ」ともいう）、サプシガルジン（thapsigargin、以下、単に「ＴＧ」ともいう）等の投与により人工的に培養細胞に誘導することができる。
実施例１では、サプシガルジンによる細胞死に対する抑肝散の影響を調べた。すなわち、サプシガルジンの投与によって細胞に小胞体ストレス（ＥＲストレス）を誘導し、該小胞体ストレスによる細胞死に対する抑肝散の影響を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が４００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度１μＭとなるように該培地に添加した。対照（コントロール）群のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞の培地には、ＴＪ−５４及びサプシガルジンを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。後述の方法によって細胞死の評価を行なった。
【００５２】
（細胞死の評価）
細胞死の評価は、独立した４視野から少なくとも３００個の細胞を計測し、その中で、サプシガルジン（ＴＧ）添加６．５時間後に細胞にHoechst33342（Hoechst33342 bis-benzamide（商品名、Sigma-Aldrich社製）を１０μＭ、及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Sigma-Aldrich社製）を１０μＭ添加してHoechst陽性（青色の蛍光を発する）、ＰＩ陽性（赤色の蛍光を発する）且つ、核の断片化の起きている細胞を細胞死の起きている細胞として確定し、測定細胞における細胞死数の割合（測定細胞全体に対する細胞死を起こした細胞の割合、以下、「細胞死の割合」ともいう）を算出し、コントロール群（ＤＭＳＯ Ｙ＝０）における細胞死の割合を基準として、各群における細胞死が起きている細胞の数（細胞死数）の割合（細胞死の割合）を算出した。同様の実験を３回施行し、コントロール群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。
【００５３】
その結果、ＴＪ−５４は４００μｇ／ｍＬ前処置によってＴＧ刺激６．５時間後の細胞死をコントロール群に比べ５０％近く抑制した（図１及び図２）。
図１中、ＤＭＳＯは、ＤＭＳＯ添加群、Ｙ−０は、抑肝散（ＴＪ−５４）添加無し、Ｙ−４００は、抑肝散（４００μｇ／ｍＬ）添加群、ＴＧは、サプシガルジン添加群である。つまり、図１の（Ａ）ＤＭＳＯ Ｙ−０は、コントロール群である。（Ｂ）ＤＭＳＯ Ｙ−４００は、抑肝散を培地に４００μｇ／ｍＬ添加後、ＤＭＳＯを添加した群である。（Ｃ）ＴＧ Ｙ−０は、抑肝散を添加せず、ＴＧを添加した群である。（Ｄ）ＴＧ Ｙ−４００は、抑肝散を培地に４００μｇ／ｍＬ添加後、ＴＧを添加した群である。図１に示す結果は、ＴＧ刺激（添加）後６．５時間後の、コントロール群に対する、各群における細胞死の割合（コントロール群を１とした場合）である。
さらに、上記のＴＧ刺激（添加）後の抑肝散の効果を、時間依存的に検討した。この結果を、図２に示す。図２中、菱型（◇）は、抑肝散を添加せず、ＴＧを添加した群（図１の（Ｃ））である。四角（□）は、抑肝散を培地に４００μｇ／ｍＬ添加後、ＴＧを添加した群（図１の（Ｄ））である。
【００５４】
＜実施例２＞
実施例１と同様に、サプシガルジンの投与によって細胞に小胞体ストレス（ＥＲストレス）を誘導し、該小胞体ストレスによる細胞死に対する抑肝散の影響を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、又は８００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度１μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞には、ＴＪ−５４及びサプシガルジンを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。細胞死の評価を、実施例１と同様の方法で行った。結果を図３及び４に示す。図３は、培地中の抑肝散（ＴＪ−５４）濃度に対する細胞死の割合である。Ｙ−０〜Ｙ−８００は、それぞれ培地中のＴＪ−５４濃度が０〜８００μｇ／ｍＬの場合を意味する。図４は、ＴＧ添加後６．５時間後のＮ２Ａ細胞の蛍光顕微鏡写真である。図４（Ａ）は、培地にＴＪ−５４を添加しなかった場合（培地中の抑肝散０μｇ／ｍＬ）、（Ｂ）は、培地にＴＪ−５４を終濃度５０μｇ／ｍＬで添加した場合、（Ｃ）は、培地にＴＪ−５４を終濃度２００μｇ／ｍＬで添加した場合、（Ｄ）は、培地にＴＪ−５４を終濃度８００μｇ／ｍＬで添加した場合である。蛍光顕微鏡写真において、青又は赤く（グレースケールの写真では、白又は灰色に）見える部分が、細胞死が起こった細胞である。
図３及び４から、ＴＪ−５４は、培地中濃度４００μｇ／ｍＬまでは用量依存的にＴＧ刺激（添加）６．５時間後の細胞死をコントロール群に比べ抑制したが、８００μｇ／ｍＬでは過用量で、逆に抑肝散自体の細胞死促進作用が見られた。
【００５５】
＜実施例３＞
低酸素負荷によってもＥＲストレスが誘導される。実施例３では、低酸素負荷による細胞死に対する、抑肝散の効果を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が４００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４添加から１．５時間後、該マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞を低酸素チャンバーに入れ６時間低酸素刺激を加えた（低酸素（６時間）＋抑肝散（４００μｇ／ｍＬ））。比較として、マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞に抑肝散を添加せず、低酸素チャンバーに入れ６時間低酸素刺激を加えた（低酸素（６時間））。実施例１と同様に、ＴＪ−５４を添加せず正常酸素圧（Normoxia：通常の酸素濃度）で培養した細胞(コントロール：（Ａ）正常酸素圧）における細胞死割合を基準として、各群における細胞死割合を算出した。同様の実験を３回施行し、コントロール群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。結果を、図５及び図６に示す。
【００５６】
図５は、低酸素負荷による細胞死に対する抑肝散の効果を示す図である。図６（Ａ）は、ＴＪ−５４を添加せず、正常酸素下においたマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（コントロール）；（Ｂ）は、６時間低酸素刺激を加えたマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（ＴＪ−５４を添加せず）；（Ｃ）は、ＴＪ−５４を終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように添加後、６時間低酸素刺激を加えたマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞の蛍光顕微鏡写真である。図６の蛍光顕微鏡写真において、青又は赤く（グレースケールの写真では、白又は灰色に）見える部分が、細胞死が起こった細胞である。図６（Ａ）〜（Ｃ）から、（Ｃ）では、（Ｂ）と比較して細胞死が起こった細胞が少ないことが分かる。
図５及び６から分かるように、ＴＪ−５４は、４００μｇ／ｍＬ前処置により低酸素刺激６時間後の細胞死を低酸素群に比べ抑制した。
【００５７】
＜実施例４＞
抑肝散がサプシガルジンによるＥＲストレスに対する保護作用を示した理由を調べるために、シャペロンであるＧＲＰ７８の発現量を、Ｎ２Ａ細胞（マウス神経芽細胞種Neuro2A細胞）で検討した。
Ｎ２Ａ細胞培養液を、抑肝散添加群、及び非添加群に分けた。抑肝散添加群には、培地濃度が４００μｇ／ｍＬとなるように抑肝散を添加した。抑肝散添加６時間後に各細胞を回収し、常法に従ってウェスタンブロットを行った。用いたＧＲＰ７８抗体はanti-Bip mAb(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)であり、二次抗体としてHRP-conjugated anti-mouse IgG Ab(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)を用いた。
ウェスタンブロットの結果を図７に示す。図７において、Ｙ−は、抑肝散なし１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地の場合である。Ｙ＋は、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中に抑肝散を４００μｇ／ｍＬ添加した場合である。図７から明らかなように、抑肝散（ＴＪ−５４）を投与した細胞では、ＧＲＰ７８の発現上昇を認めた。この結果から、抑肝散によるＧＲＰ７８発現上昇の効果が示唆された。
【００５８】
＜実施例５＞
ＥＲストレス誘導剤としてツニカマイシン（Ｔｍ）を用い、ＥＲストレスセンサーの１つであるＧＲＰ７８（ＢｉＰ）の発現に対するＴＪ−５４の効果を調べた。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が７００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４の添加から２４時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ又は５ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群の細胞にはＴＪ−５４及びＴｍを添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加０時間、６時間、２４時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＧＲＰ７８増幅用プライマー5’-ga aaggatggtt aatgatgctg ag-3’（配列番号１）、5’-gtcttcaatgtcagcatct-3’（配列番号２）を用いてＰＣＲ（９５℃０．５分、５５℃１分、７２℃１分、を３０サイクル）を行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。アガロース電気泳動の結果を、図８及び９に示す。図８及び９は、ツニカマイシン（Ｔｍ）を終濃度５μｇ／ｍＬ（図８）又は２μｇ／ｍＬ（図９）で培地に添加後、各経過時間におけるＧＲＰ７８遺伝子の発現を調べた結果である。図８及び９において、Ｃは、コントロール（Ｔｍで処理していない）、ＴＪは、ＴＪ−５４を培地に７００μｇ／ｍＬ添加したものである。図８及び９中の時間は、Ｔｍを培地に添加してからの経過時間（０、６及び２４時間）である。なお、Ｔｍ添加の２４時間前に、前記濃度のＴＪ−５４が培地に添加されている。
【００５９】
図８及び９から、ＴＪ−５４添加後２４時間の時点でＴｍ刺激（添加）のない状態でもＴＪ−５４非添加群に対して、ＧＲＰ７８の発現が上昇していた。一方、ＴＪ−５４非添加群（コントロール細胞：Ｃ）ではＴｍ５μｇ／ｍＬ刺激（添加）後、６時間、２４時間とＧＲＰ７８発現が著しく上昇した。ＴＪ−５４添加群では０時間のＧＲＰ７８発現量と比べて６時間で２倍程度のＧＲＰ７８発現量の増加が見られたが、２４時間後ではＴＪ−５４非添加群のＴｍ刺激前のＧＲＰ７８発現レベルにまで回復していた（図８）。同じ傾向がＴｍ２μｇ／ｍＬ刺激（添加）群でも見られた（図９）。これらの結果から、抑肝散の添加によって、ＥＲストレス状態にない場合でも転写レベルでＧＲＰ７８の発現が上昇していることが分かった。
【００６０】
＜実施例６＞
ＥＲストレス誘導剤としてツニカマイシン（Ｔｍ）を用い、ＥＲストレスセンサーの１つであるＣＨＯＰ（ＧＡＤＤ１５３）の発現に対するＴＪ−５４の効果を調べた。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）を終濃度が７００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４の添加から２４時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群の細胞には抑肝散及びＴｍを添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加０時間、６時間、２４時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＣＨＯＰ増幅用プライマー5’-catacaccaccacacctgaaag-3’（配列番号３）、5’-ccgtttcctagttcttccttgc-3’（配列番号４）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＣＨＯＰ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。結果を、図１０及び１１に示す。
【００６１】
図１０及び１１は、ツニカマイシン（Ｔｍ）を終濃度５μｇ／ｍＬ（図１０）又は２μｇ／ｍＬ（図１１）で培地に添加後、各経過時間におけるＣＨＯＰ遺伝子の発現を調べた結果である。図１０及び１１において、Ｃは、コントロール（Ｔｍで処理していない）、ＴＪは、ＴＪ−５４を培地に７００μｇ／ｍＬ添加したものである。図１０及び１１中の時間は、Ｔｍを培地に添加してからの経過時間（０、６及び２４時間）である。なお、Ｔｍ添加の２４時間前に、前記濃度のＴＪ−５４が培地に添加されている。
【００６２】
図１０及び１１から、ＴＪ−５４を添加すると、ＴＪ−５４添加後２４時間の時点では、Ｔｍ刺激（添加）のない状態で僅かにＴＪ−５４非添加群に対して、ＣＨＯＰの発現が上昇していた。一方、ＴＪ−５４非添加群（コントロール細胞：Ｃ）ではＴｍ５μｇ／ｍＬ刺激後、６時間、２４時間とＣＨＯＰ発現が著しく上昇した。ＴＪ−５４添加群では０時間のＣＨＯＰ発現量と比べて６時間で２倍程度のＣＨＯＰ発現量の増加が見られたが、２４時間後ではＴｍ刺激前のＣＨＯＰ発現レベルにまで回復していた（図１０）。Ｔｍ２μｇ／ｍＬ刺激（添加）群では刺激６時間後のＣＨＯＰの発現は刺激前と同程度であった（図１１）。
【００６３】
実施例１〜６の結果から、抑肝散（ＴＪ−５４）がＴＧ、Ｔｍ、低酸素刺激のようなＥＲストレス刺激に対して細胞死抑制（細胞保護）効果があること、この細胞死抑制効果は、抑肝散のＧＲＰ７８発現上昇作用によることが分かった（図８及び９）。また、ＴＪ−５４を添加した場合、細胞死誘導作用のあるＣＨＯＰの発現はＧＲＰ７８の発現上昇に比べて弱く、ＥＲストレス刺激後のＣＨＯＰの発現上昇は、ＴＪ−５４添加なしの群に比べてＴＪ−５４添加群の方が低かった（図１０及び１１）。このため、通常、ＥＲストレス下にある細胞では、ＣＨＯＰの発現がＧＲＰ７８同様に上昇し、その結果細胞死が誘導されるが、抑肝散を予め添加した細胞では、細胞がＥＲストレス下にない状態であっても転写レベルでＧＲＰ７８の発現が上昇し、さらにＣＨＯＰの発現がＧＲＰ７８の上昇に比して低いことから、細胞死が抑制されると考えられた。
次に、抑肝散（ＴＪ−５４）のどの構成生薬が、これらの細胞死抑制作用に寄与しているのかを調べた。
【００６４】
＜実施例７＞
ＴＪ−５４の各構成生薬のＴＧ誘発細胞死に対する効果を調べた。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（N2A)にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤：図１２中Ｇ８）又は抑肝散構成生薬７種類（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、及び釣藤鈎（チョウトウコウ））の何れかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬の添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＴＧ）（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度が１μＭとなるように培地に添加した。対照群（コントロール）群の細胞にはＴＪ−５４、構成生薬及びＴＧを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。
【００６５】
（細胞死の評価）
細胞死の評価は、独立した４視野から少なくとも３００個の細胞を計測し、その中で、ＴＧ負荷（添加）２０時間後に細胞にHoechst33342（商品名、Hoechst33342 bis-benzamide、Sigma-Aldorich社製）を１０μＭ、及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Sigma-Aldorich社製）を１０μＭ添加してHoechst陽性、ＰＩ陽性且つ、核の断片化の起きている細胞を細胞死の起きている細胞として確定し、測定細胞における細胞死数の割合（細胞死の割合）を算出し、Ｇ０（コントロール：ＴＧを添加せず、抑肝散及び構成生薬のいずれも添加しなかったもの)における細胞死の割合を基準として、各群における細胞死が起きている細胞の数（細胞死数）の割合（細胞死の割合）を算出した。同様の実験を３回施行し、Ｇ０群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。
【００６６】
結果を、図１２に示す。図１２中の記載は、以下の通りである。
Ｇ０：コントロール（ＴＧを添加せず、抑肝散及び構成生薬のいずれも添加しなかったもの）、Ｇ１：蒼朮（ソウジュツ）、Ｇ２：茯苓（ブクリョウ）、Ｇ３：川きゅう（センキュウ）、Ｇ４：当帰（トウキ）、Ｇ５：柴胡（サイコ）、Ｇ６：甘草（カンゾウ）、Ｇ７：釣藤鈎（チョウトウコウ）、Ｇ８：抑肝散（ＴＪ−５４）。
なお、各生薬は、全て２００μｇ／ｍＬで培地に添加した。ＴＧの負荷時間は、２０時間である。
図１２から、茯苓（Ｇ２）、川きゅう（Ｇ３）、及び当帰（Ｇ４）については、ＴＧ添加２０時間後の細胞死の割合がＧ０（コントロール）に比べ有意に低かった。釣藤鈎（チョウトウコウ）（Ｇ７）については細胞死促進作用が観察された。
【００６７】
＜実施例８＞
抑肝散に含まれる各生薬について、単独毒性を検討した。
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中のマウス神経芽細胞種Neuro2A細胞（Ｎ２Ａ）にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤：図１３中、抑肝散と表示）又は抑肝散構成生薬７種類（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、及び釣藤鈎（チョウトウコウ））の何れかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬の添加から２４時間後の細胞死の程度を評価した。細胞死の評価は、実施例７と同様に行った。コントロール（抑肝散及び構成生薬のいずれも添加しなかったもの）の細胞死の割合（全細胞中の細胞死を起こした細胞の割合）を基準として、各群における細胞死の割合を算出した。同様の実験を３回施行し、コントロール群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。
その結果、甘草、又は釣藤鈎添加２４時間後の細胞死の割合がコントロールに比べ有意に高く、これらの生薬については細胞死促進作用が観察された。つまり、甘草及び釣藤鈎については、それぞれ単独で神経細胞に対する毒性をもつことが有意に示された。
結果を、図１３及び表１に示す。図３及び表１中、「生薬なし」がコントロールである。
【００６８】
【表１】
【００６９】
＜実施例９＞
WTS-1 assayによって、ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＴＧ負荷による細胞死に対する各生薬成分の効果を検討した。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）、又は抑肝散構成生薬７種類（蒼朮（ソウジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、川きゅう（センキュウ）、当帰（トウキ）、柴胡（サイコ）、甘草（カンゾウ）、及び釣藤鈎（チョウトウコウ））の何れかを図１４に示す終濃度（０〜２００μｇ／ｍＬ）で添加した。ＴＪ−５４又は生薬の添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度が３μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群には生薬及びサプシガルジンを添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。細胞死の評価は、ＴＧ刺激３時間後培養上清を回収し、ＷＳＴ−１アッセイキット（同仁化学社製）を用いて、溶媒のみ添加した対照群における細胞死に対する抑制率として表した。同様の実験を３回施行し、対照群に対する有意差をstudent’s-t検定により統計処理を行って求めた（＊Ｐ＜０．０５）。その結果、ヨクカンサン（抑肝散）、センキュウ（川きゅう）、及びサイコ（柴胡）は、ＴＧ刺激（添加）３時間後の細胞死を有意に抑制した。結果を、図１４に示す。また、特に良好な細胞死抑制効果が認められた構成生薬について、図１４からの抜粋を、図１５〜１７に示す。図１５〜１７から、培地濃度１００μｇ／ｍＬでは柴胡、及び蒼朮の２成分が抑肝散によく似た傾向を示した。さらに培地濃度２００μｇ／ｍＬでは柴胡、及び川きゅうが顕著な効果を示した。
【００７０】
＜実施例１０＞
抑肝散に含まれる構成生薬が、ＧＲＰ７８の発現に影響するのかを調べた。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養液中に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度２００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。添加から６．５時間後に各細胞を回収し、常法に従ってウェスタンブロットを行った。用いたＧＲＰ７８抗体はanti-Bip mAb(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)であり、二次抗体としてHRP-conjugated anti-mouse IgG Ab(Cell Signaling Tchnology, Beverly, MA)を用いた。
その結果、釣藤鈎及び抑肝散は、ＧＲＰ７８発現を著明に上昇させた。その他の成分も、甘草を除きＧＲＰ７８の発現を上昇させる傾向を示した。結果を図１８に示す。
【００７１】
＜実施例１１＞
ＴＧ刺激に対する抑肝散及び各構成生薬の効果を調べた。
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬添加から１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＴＧ）（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）を終濃度２μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びサプシガルジンのいずれも添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。ＴＧ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＧＲＰ７８増幅用プライマー5’-ga aaggatggtt aatgatgctg ag-3’（配列番号１）、5’-gtcttcaatgtcagcatct-3’（配列番号２）を用いて実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＧＲＰ７８ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４構成生薬のうち柴胡（サイコ）又は川きゅう（センキュウ）で前処置した群において著しいＧＲＰ７８発現の誘導抑制が見られた。結果を図１９に示す。図１９及び以下で説明する図２０〜２２中、（−）は、ＴＧ（又はＴｍ）刺激（添加）を行なわなかったことを示す。（＋）は、ＴＧ（又はＴｍ）刺激（添加）を行なったことを示す。
【００７２】
＜実施例１２＞
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、ＴＪ−５４又は生薬を培地に添加して１．５時間後、ＤＭＳＯに溶解させたサプシガルジン（ＴＧ）（ＤＭＳＯ中５００μＭ）を終濃度２μＭとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びサプシガルジンのいずれも添加せず、溶媒として用いたＤＭＳＯを培地量（容量）の１／５００量添加した。ＴＧ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＣＨＯＰ増幅用プライマー 5’-catacaccaccacacctgaaag-3’（配列番号３）、5’-ccgtttcctagttcttccttgc-3’（配列番号４）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＣＨＯＰ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４構成生薬のうち柴胡（サイコ）、川きゅう（センキュウ）、又は当帰（トウキ）で前処置した群においてＣＨＯＰ発現の誘導抑制が見られた。結果を図２０に示す。
【００７３】
＜実施例１３＞
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬添加から１．５時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びツニカマイシンのいずれも添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＧＲＰ７８増幅用プライマー5’-ga aaggatggtt aatgatgctg ag-3’（配列番号１）、5’-gtcttcaatgtcagcatct-3’（配列番号２）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４構成生薬のうち柴胡（サイコ）又は釣藤鈎（チョウトウコウ）で前処置した群において弱いＧＲＰ７８発現の誘導抑制が見られたが、ＴＧ刺激後に見られた反応に比べてその作用は弱かった。結果を図２１に示す。
【００７４】
＜実施例１４＞
ＦＣＳ添加ＭＥＭ培地中のヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にＴＪ−５４（抑肝散エキス製剤）については終濃度８００μｇ／ｍＬ、各構成生薬については終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＴＪ−５４又は生薬を培地に添加した。ＴＪ−５４又は生薬添加から１．５時間後、蒸留水に溶解させたツニカマイシン（Ｔｍ）（蒸留水中２ｍｇ／ｍＬ）を終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように培地中添加した。対照（コントロール）群にはＴＪ−５４、生薬及びツニカマイシンのいずれも添加せず、溶媒として用いた蒸留水を培地量（容量）の１／１０００量添加した。Ｔｍ添加６時間後に細胞を回収し、RNAeasy kit（キアゲン社製）にてtotalRNAを回収した。このＲＮＡを鋳型に、SuperScript（登録商標）II Reverse Transcriptase（商品名、Invitrogen社製）によりｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型にＣＨＯＰ増幅用プライマー 5’-catacaccaccacacctgaaag-3’（配列番号３）、5’-ccgtttcctagttcttccttgc-3’（配列番号４）を用いて、実施例５と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を用いてアガロース電気泳動を行ない、ＣＨＯＰ ｍＲＮＡの発現を評価した。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現をコントロールとして用いた。その結果、ＴＪ−５４と添加群以外の構成生薬添加群でＴＧ刺激の際見られたような劇的なＣＨＯＰ発現の誘導抑制は見られなかった。結果を図２２に示す。
【００７５】
＜実施例１５＞
ＥＲストレスに脆弱になったアルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞に対する抑肝散の効果を調べた。
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に家族性アルツハイマー病患者（ＦＡＤ）の持つ変異体Presenilin-1deltaエクソン9（PS1△E9)を強制発現させた細胞（PS1△E9を定常的に発現する細胞、「変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞」ともいう）を用いて、抑肝散のＥＲストレス誘発細胞死に対する効果を検討した。コントロールとして、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に野生型Presnilin-1（ＰＳ１Ｗｔ）を強制発現させた細胞（ＰＳ１Ｗｔを定常的に発現する細胞）を用いた。これらの変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞及びコントロールの細胞はいずれも、Presenilin-1 mutation activates the signaling pathway of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis：Yukioka F, et.al. Neurochem Int. 2008 Mar-Apr;52(4-5):683-7. に記載の方法により作製されたものである。細胞培養方法、及びＴＧ刺激（添加）条件は、実施例１１と同様の方法で行った。細胞死アッセイはＭＴＳアッセイキット（プロメガ社製）を用いて行った。その結果、ＦＡＤ患者に見られる変異ＰＳ１△Ｅ９を発現する細胞では、ＴＧ２μＭ刺激３時間後、ＰＳ１Ｗｔ発現細胞（コントロール：正常細胞）における生存細胞の割合を基準とすると６０％以上生存細胞の割合が減少した。これに対してＴＪ−５４をＴＧ負荷１．５時間前に終濃度４００μｇ／ｍＬで培地に添加しておくと、同生存細胞の割合は８割程度まで回復した。このように、抑肝散はＰＳ１ΔＥ９が誘導する細胞死にも効果を示した（Ｎ＝４）。結果を図２３に示す。図２３中、ＮＴは、ＴＧを添加しなかった細胞、ＴＧは、ＴＧ添加（刺激）した細胞である。Δ９は、変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞にＴＪ−５４を添加しなかった場合であり、Δ９＋ｙは、変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞にＴＪ−５４（培地中４００μｇ／ｍＬ）を添加した場合である。
【００７６】
＜実施例１６＞
アルツハイマー病原因遺伝子ＰＳ１変異細胞に対する抑肝散及の構成生薬柴胡、及び川きゅうの効果を調べた。
実施例１５と同様に、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に家族性アルツハイマー病患者（ＦＡＤ）の持つ変異体Presenilin-1deltaエクソン9（PS1△E9)を強制発現させた細胞（PS1△E9を定常的に発現する細胞、「変異ＰＳ１△Ｅ９発現細胞」ともいう）を用いて、ＴＪ−５４の構成生薬柴胡、川きゅうのＥＲストレス誘発細胞死に対する効果を検討した。実施例１５と同様に、コントロールとして、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に野生型Presnilin-1（ＰＳ１Ｗｔ）を強制発現させた細胞（ＰＳ１Ｗｔを定常的に発現する細胞）を用いた。細胞培養方法及びＴＧ刺激（添加）条件は、実施例１１と同様の方法で行った。細胞死アッセイは、実施例１５と同様にＭＴＳアッセイキットを用いて行った。その結果、ＦＡＤ患者に見られる変異ＰＳ１△Ｅ９を発現する細胞では、ＴＧ２μＭ刺激３時間後、ＴＧ刺激（添加）無し群（ＤＭＳＯ２）での生存細胞の割合を基準とすると川きゅう２〜２００μｇ／ｍＬでの前処置により川きゅう添加量依存的にＴＧ刺激による生存細胞の減少が抑制された（図２４、Ｎ＝４）。これに対して柴胡前処置群では効果が見られた群もあったが用量依存性が見られなかった（図２５）。図２４及び２５において、ＤＭＳＯ２は、ＴＧ刺激（添加）せず、川きゅう及び柴胡をいずれも添加しなかった群（コントロール）；ＴＧ２は、ＴＧ２μＭで刺激した群である。図２４において、ＴＧ２＋ｓｅｎ２５は、川きゅう２５μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓｅｎ５０は、川きゅう５０μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓｅｎ１００は、川きゅう１００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓｅｎ２００は、川きゅう２００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群である。図２５において、ＴＧ２＋ｓａｉ２５は、柴胡２５μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓａｉ５０は、柴胡５０μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓａｉ１００は、柴胡１００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群；ＴＧ２＋ｓａｉ２００は、柴胡２００μｇ／ｍＬの前処置後、ＴＧ２μＭで刺激した群である。
【００７７】
＜実施例１７＞
川きゅう及び抑肝散のＧＲＰ７８発現への影響を調べた。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養液中に、抑肝散及び川きゅうのいずれかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように添加した（コントロールの細胞には、抑肝散及び川きゅうのいずれも添加しなかった）。添加６．５時間後に各細胞を回収し、実施例１３で用いた方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。用いたＧＲＰ７８プライマー、及びＰＣＲ条件は実施例１３で用いたプライマー及び条件と同じである。
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において抑肝散及び川きゅうのいずれによってもＧＲＰ７８の発現が有意に上昇した。結果を、図２６に示す。
【００７８】
＜実施例１８＞
川きゅう及び抑肝散のＣＨＯＰ発現への影響を調べた。
ヒト神経芽細胞種ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養液中に抑肝散及び川きゅうのいずれかを終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように添加した。添加１．５時間後にＴＧ１μＭを添加した。コントロールの細胞には、抑肝散及び川きゅうのいずれも添加しなかった。４時間後各細胞を回収し、実施例１４で用いた方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。用いたＣＨＯＰプライマー、及びＰＣＲ条件は実施例１４で用いたＣＨＯＰプライマー、及びＰＣＲ条件と同じである。
その結果、川きゅう及び抑肝散のいずれの前処置によってもＴＧ負荷時のＣＨＯＰ誘導が有意に抑制された。結果を図２７に示す。
【００７９】
実施例１〜１８の結果に示されるように、ＥＲストレス誘導性細胞死、アルツハイマー病モデル細胞おける細胞死促進効果に対し、抑肝散、及び抑肝散の構成生薬川きゅうが顕著な抑制効果を示した。抑肝散及び川きゅうによる細胞死抑制効果には、ＧＲＰ７８の発現上昇、ＣＨＯＰ誘導抑制効果が関与していた。これらの結果から、抑肝散はＥＲストレス応答を上昇させ、神経変性疾患や脳虚血などに見られる周辺症状のみならず、中核症状にも有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防及び治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である請求項１又は２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
生薬が、川きゅうである請求項４に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である請求項４又は５に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である請求項５又は６に記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
【請求項９】
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
【請求項１０】
抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤。
【請求項１】
抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である請求項１又は２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
生薬が、川きゅうである請求項４に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、狂牛病、脳虚血、又は筋萎縮性側索硬化症である請求項４又は５に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
小胞体ストレスによる神経細胞死関連疾患が、アルツハイマー病又は脳虚血である請求項５又は６に記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
抑肝散を含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
【請求項９】
川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレスによる神経細胞死の予防又は抑制剤。
【請求項１０】
抑肝散、又は川きゅう及び柴胡からなる群より選択される少なくとも１種の生薬を有効成分として含有することを特徴とする小胞体ストレス又は小胞体ストレスによる細胞死の予防又は抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２６】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図５】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２６】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【公開番号】特開２０１１−３７７２２（Ｐ２０１１−３７７２２Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８３７７２（Ｐ２００９−１８３７７２）
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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