小胞体ストレスモデル
【課題】新規な方法により作製されたin vitro小胞体ストレスモデルの提供。
【解決手段】培養細胞にＵＶＡを照射する工程を含む小胞体ストレスモデルの作製方法、及び当該作製方法により作製された小胞体ストレスモデル。
【解決手段】培養細胞にＵＶＡを照射する工程を含む小胞体ストレスモデルの作製方法、及び当該作製方法により作製された小胞体ストレスモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な小胞体ストレスモデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体には様々な種類のタンパク質が存在し、各々が生体の構造形成や酵素作用など、生命活動に不可欠な機能を担っている。これらのタンパク質の機能は、その立体構造と密接に関連しており、タンパク質がその機能を果たすには適切な立体構造をとっていることが不可欠である。異常な構造を有するタンパク質は、本来の機能を果たすことができず、そればかりか、ときには毒性を有し、又は疾患の原因となり得る。
【０００３】
タンパク質は、生体内で最初に合成されたときは“ひも”上の一次構造であるが、その後小胞体内で高次構造へとフォールディング（folding）される。小胞体内で正しい立体構造を獲得したタンパク質は、ゴルジ装置へと輸送され、そこから分泌経路を介して生体各所に輸送されて、機能を発揮する。一方、不適切なフォールディングによって誤った立体構造を有するタンパク質は、小胞体シャペロンの働きによって正しい構造へと再構成されるか、あるいは小胞体タンパク質分解機構（ER-associated degradation; ERAD）によって分解される。こうしたタンパク質のフォールディングと分解からなる適正な構造のタンパク質を供給するシステムを「タンパク質の品質管理」と呼ぶ。このシステムによって、生体は、異常な構造を有するタンパク質からの悪影響を防いでいる。
【０００４】
何らかの原因でタンパク質の品質管理システムが十分に機能しない場合、結果として誤った立体構造を有する異常タンパク質が小胞体内に蓄積する。この状態を小胞体ストレスという。小胞体ストレスに対して、細胞は、タンパク質翻訳の抑制や調節、小胞体シャペロンの発現亢進によるフォールディングの増強、ＥＲＡＤ活性化による異常タンパク質分解促進などの手段によって、異常タンパク質を減少させる。しかし、これらの手段によっても状態が改善しない場合、細胞はアポトーシスを起こして死滅し、異常タンパク質から生体を防御する。これらの一連の応答は、小胞体ストレス応答（unfolded protein response; UPR）と称される。
【０００５】
近年、上記小胞体ストレス応答のメカニズムが次第に明らかになってきた。例えば、上記応答手段のうち、翻訳の抑制や調節にはPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4等の分子が、フォールディング増強にはATF6、BiP/GRP78、Hspファミリー等の分子が、ＥＲＡＤ活性化にはIRE1、XBP1、RLG1等の分子が、そしてアポトーシスにはCaspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR、TDAG51等の分子が関与していることが知られている（例えば、非特許文献１）。このうち、IRE1、ATF6、XBP1、GRP78等は小胞体ストレスのセンサータンパク質であり、小胞体ストレスの指標として知られている。特に、XBP1は、ATF6によって転写誘導され、またIRE1によってフレームスイッチ型スプライシングを受けるため、ATF6とIRE1の両因子のシグナルを反映する指標である。スプライシングされたXBP1 mRNAを測定することで小胞体ストレスを検出する方法が提唱されている（特許文献１）。
【０００６】
また近年、小胞体ストレスが、生体の様々な障害、例えば、糖尿病、神経変性疾患、躁うつ病等の種々の疾患や、免疫応答などの生理機能に深く関与していることが報告されている。生体機能に関する基礎研究のため、又は種々の疾患の診断及び治療手段を開発するためのツールとして小胞体ストレスが注目されている。
【０００７】
したがって、小胞体ストレスについて研究するための実験系、すなわち小胞体ストレスモデルを確立することが望まれる。現在までに、小胞体ストレスモデルとしては、ヒトメグシン遺伝子導入トランスジェニックラットモデル（特許文献２）、薬物添加培養細胞モデル（非特許文献２）、ＵＶ照射マウスモデル又はヒト皮膚切片モデル（非特許文献３）等が知られている。このうち、トランスジェニックモデルは、作製手順が煩雑であり、また導入遺伝子発現量の制御が難しい。
【０００８】
in vitroモデルは、標的細胞へ因子の影響が迅速に現れ、且つ生体の他の組織からの影響を受けることがないことから、因子と細胞応答との関係を詳細に調べるためのモデルとして好ましい。in vitro小胞体ストレスモデルとしては、薬物tunicamycin又はthapsigarginを添加して小胞体ストレスを誘導する培養細胞モデルが知られている（非特許文献２）。しかし、薬物添加によりストレスを誘導する場合、添加した薬物が細胞内に浸透して標的部位に到達するまでの時間、及び薬物の影響が細胞から除去されるまでの時間を制御することが困難である。また、細胞内に浸透した薬物は代謝により分解されるため、添加薬物量は必ずしも誘導ストレス量に反映されない。
【０００９】
ＵＶ照射によるストレス誘導は、操作が簡便であり、且つ照射後直ちに標的部位に到達し、また照射を止めれば直ちにその影響は細胞内から消えるため、ストレス誘導の時間的制御に有効である。また、ＵＶは薬物のように代謝を受けることがないので、与えた線量が直接的にストレス誘導量として反映され得る。従って、ＵＶ照射は、小胞体ストレスモデル作製のための好ましい方法である。しかしながら、ＵＶ照射による小胞体ストレスモデルとしては、従来、上記のマウスモデル及びヒト皮膚切片モデル（非特許文献３）のようなin vivoモデルが知られているのみであり、培養細胞モデルのようなin vitroモデルは、ＵＶ照射によって作製することはできないことが報告されていた（非特許文献３）。
【００１０】
小胞体ストレスのより詳細な研究を可能にするin vitro小胞体ストレスモデルの確立が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１２９９７０号公報
【特許文献２】特開２００４−３１３１９２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】吉田秀朗, 生化学, 2004, 第７６巻第７号, pp617-630
【非特許文献２】Yoshida et al., Cell, 2001, 107:881-891
【非特許文献３】Anand et al., J. Invest. Dermatol., 2005, 125:323-333
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、新規な方法により作製されたin vitro小胞体ストレスモデルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、培養細胞に特定の条件下でＵＶ照射を行うことにより、従来作製できないと考えられていたＵＶ照射によるin vitro小胞体ストレスモデルを作製することに成功した。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
（１）培養細胞にＵＶＡを照射する工程を含む小胞体ストレスモデルの作製方法。
（２）ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である（１）記載の方法。
（３）ＵＶＡを照射する工程の後に前記細胞を培養する工程をさらに含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＵＶＡを照射する工程により、前記細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させる、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれか１に記載の方法によって作製された小胞体ストレスモデル。
（６）培養細胞に被験物質を添加する工程と、当該細胞をＵＶＡ照射する工程と、当該細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を測定する工程を含む、小胞体ストレス制御剤のスクリーニング方法。
（７）ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である（６）記載の方法。
（８）前記発現を測定する工程の前に当該細胞を培養する工程をさらに含む、(６)又は（７）に記載の方法。
（９）前記分子又はそのｍＲＮＡの発現の量を定量する工程をさらに含む、(６)〜（８）のいずれか１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、従来よりも簡便な手順で、ストレス負荷量がより精密に制御されたin vitro小胞体ストレスモデルを提供することができる。本発明のin vitro小胞体ストレスモデルによれば、従来よりも迅速且つ正確に小胞体ストレスを評価し、また小胞体ストレスを制御する物質を探索することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト正常線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞における、XBP1 mRNAスプライシングに対するＵＶＡ照射の影響。照射４時間後に測定。
【図２】ヒト正常線維芽細胞におけるXBP1 mRNAスプライシングに対するＵＶＡ照射後の時間の影響。ＵＶＡ線量１０Ｊ／ｃｍ2。
【図３】ヒト正常線維芽細胞におけるXBP1 mRNAスプライシングに対するＵＶＡ線量の影響。照射４時間後に測定。
【図４】ＵＰＲ誘導下における遺伝子発現。Ａ：ヒト正常角化細胞におけるBiP/GRP78 mRNA発現、Ｂ：ヒト正常線維芽細胞におけるHsp47 mRNA発現。照射６時間後に測定。
【図５】ＵＰＲ誘導下における遺伝子発現。Ａ：ヒト正常線維芽細胞におけるGADD34 mRNA発現、Ｂ：ヒト正常線維芽細胞におけるGADD153 mRNA発現。照射６時間後に測定。
【図６】ＵＰＲ誘導下における遺伝子発現の経時変化。Ａ：ヒト正常角化細胞におけるGADD34 mRNA発現、Ｂ：ヒト正常角化細胞におけるGADD153 mRNA発現。照射６〜４８時間後に測定。
【図７】リポーターアッセイ手順の概念図。
【図８】リポーターアッセイ結果。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の小胞体ストレスモデルは、培養細胞にＡ波紫外線（ＵＶＡ）を照射することにより作製される。
【００１９】
本発明の方法においては、培養細胞をＵＶＡ照射することにより、当該細胞に小胞体ストレス応答（unfolded protein response; UPR）を誘導する。ＵＶＡを照射される培養細胞は、由来する種や組織又は特定の系統には限定されないが、培養哺乳類細胞が好ましく、培養ヒト細胞がより好ましい。あるいは、培養細胞としては、好ましくは角化細胞、線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞が挙げられる。
【００２０】
ＵＶＡ照射においては、照射エネルギーとして１〜１００Ｊ／ｃｍ2、好ましくは１０〜６０Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ（波長320〜400nm）に上記培養細胞を曝露する。照射の際、上記範囲内で照射エネルギー量を調節することによって、細胞に与える小胞体ストレスの量を制御することができる。所定の照射エネルギーに細胞を曝露することができる限り、照射の強度及び時間は特に限定されない。照射は連続照射でもよく、あるいは任意の間隔をあけた繰り返し照射でもよい。細胞をＵＶＡ照射する具体的手順は当業者に周知である。
【００２１】
照射により、細胞に小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）が誘導される。ＵＰＲの典型的な例としては、タンパク質翻訳抑制、小胞体シャペロンの発現亢進によるフォールディングの増強、小胞体タンパク質分解機構（ER-associated degradation; ERAD）の活性化による異常タンパク質分解促進等の異常タンパク質を減少させるための応答、アポトーシス誘導等のような異常タンパク質から生体を防御する応答、及び細胞のタンパク質翻訳抑制及び調節が挙げられる。すなわち、上記ＵＶＡ照射により、細胞内のタンパク質翻訳抑制、フォールディングの増強、ＥＲＡＤ活性化又はアポトーシス誘導、又は細胞のタンパク質翻訳抑制及び調節が促進される。
【００２２】
細胞のタンパク質翻訳抑制に関与する分子としては、PERK、GADD34、p58IPK、CReP等が挙げられる。フォールディング増強に関与する分子としては、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47等が挙げられる。ＥＲＡＤ活性化に関与する分子としては、IRE1、XBP1、RLG1等が挙げられる。アポトーシスに関与する分子としては、Caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR、TDAG51等が挙げられる。細胞のタンパク質翻訳抑制及び調節に関与する分子としては、ATF4が挙げられる。これらの分子は全て細胞のＵＰＲに関与する分子（ＵＰＲ関連分子）である。
【００２３】
上記細胞内のＵＰＲ関連分子の発現は、上記ＵＶＡ照射により増加する。当該分子の発現増加は、細胞のＵＰＲの増強を反映している。特に、XBP1は、ATF6によって転写誘導され、またIRE1によってフレームスイッチ型スプライシングを受けるため、ATF6とIRE1の両因子のシグナルを反映する分子である。XBP1のスプライシング型mRNA（XBP1（S）mRNA）は、細胞のＵＰＲの指標として従来知られている。
【００２４】
したがって、一態様において、本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法は、培養細胞にＵＶＡを照射する工程により、当該細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子の少なくとも１の発現、あるいはこれらの分子のｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させる工程を含み得る。当該態様においては、上記の分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させればよいが、上記の分子又はそのｍＲＮＡのうちの複数の発現を増加させてもよい。より好ましくは、GADD34、BiP/GRP78、Hsp47、XBP1及びCHOP/GADD153のうちの少なくとも１の発現を増加させる。さらに好ましくは、GADD34 mRNA、BiP/GRP78 mRNA、Hsp47 mRNA、XBP1(S) mRNA及びCHOP/GADD153 mRNAうちの少なくとも１の発現を増加させる。
【００２５】
本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法においては、好ましくは、培養細胞へのＵＶＡ照射の後、当該細胞を培養する。培養時間は、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは４時間以上であり、さらに好ましくは１〜４８時間であり、なお好ましくは４〜４８時間である。上記培養により、当該細胞におけるＵＰＲはより増強される。
【００２６】
上記のとおりＵＰＲが誘導された細胞は、in vitro小胞体ストレスモデル細胞として利用され得る。例えば、後記実施例１に示されるように、ＵＶＡ照射により、培養細胞内で、ＵＰＲの指標として従来知られている分子であるXBP1（S）mRNAが増加する。したがって、ＵＶＡ照射により当該細胞にＵＰＲが誘導されており、この細胞をin vitro小胞体ストレスモデルとして使用できることが分かる。また、後記実施例２〜４に示されるように、上記XBP1（S）mRNAが増加するＵＶＡ照射条件と同じ照射条件下で、他のＵＰＲ関連分子の発現が培養細胞内で増加する。したがって、本発明の小胞体ストレスモデル細胞においては、ＵＰＲ関連分子、好ましくは、PERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子の少なくとも１又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現、より好ましくは、GADD34、BiP/GRP78、Hsp47、XBP1及びCHOP/GADD153のうちの少なくとも１の発現、さらに好ましくは、GADD34 mRNA、BiP/GRP78 mRNA、Hsp47 mRNA、XBP1(S) mRNA及びCHOP/GADD153 mRNAうちの少なくとも１の発現が増加している。
【００２７】
また本発明は、上記小胞体ストレスモデルを利用した、小胞体ストレス制御剤のスクリーニング方法を提供する。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、培養細胞に被験物質を添加する工程と、当該細胞をＵＶＡ照射する工程と、当該細胞におけるＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程とを含む。当該スクリーニング方法において、ＵＶＡ照射される培養細胞の種類、ＵＶＡ照射の方法、発現を測定されるＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの種類は、本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法の場合と同じである。
【００２８】
被験物質は、ＵＶＡ照射前に添加されても、ＵＶＡ照射後に添加されても、又はＵＶＡ照射と並行して添加されてもよい。その後、細胞のＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定し、被験物質の添加による影響を評価する。例えば、被験物質の添加前後で細胞のＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定し、必要に応じて測定値を定量した後、添加前後で発現を比較する。あるいは、被験物質添加群と対照物質添加群におけるＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定し、必要に応じて測定値を定量した後、両群間で発現の違いを比較する。上記分子又はそのｍＲＮＡの発現を変化させる物質を小胞体ストレス制御剤として選択することができる。例えば、被験物質のうち、ＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を増加させる物質は小胞体ストレス亢進剤として、当該分子又はそのｍＲＮＡ発現を低下させる物質は小胞体ストレス抑制剤として、選択され得る。
【００２９】
好ましくは、本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法は、培養細胞をＵＶＡ照射する工程の後、且つ上記発現を測定する工程の前に、当該細胞を培養する工程をさらに含む。培養時間は、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは４時間以上であり、さらに好ましくは１〜４８時間であり、なお好ましくは４〜４８時間である。
【００３０】
本発明において、ＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現の測定には、例えば、ＲＩ標識、蛍光標識、発光標識、ゲル電気泳動法、免疫沈降、イムノブロッティング、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるリポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡ又はプロテインマイクロアレイ等の、当該分野で通常行われる任意の方法を用いることができる。このうち、ウエスタンブロット法、リポーターアッセイ及びＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
【００３２】
実施例１：ＵＶＡ照射による小胞体ストレス応答の誘導
１．細胞の準備
６０ｍｍディッシュに１０％のコンフルエンシーで正常ヒト線維芽細胞又はＨｅＬａ細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーターで７２時間培養した。
【００３３】
２．ＵＶＡ照射
ディッシュから培地を除去し、２．５ｍｌのＰＢＳを添加した後、細胞にＵＶＡを照射した。
紫外線照射光源としては、キセノン光源装置（MAX-301型、朝日分光（株））にＵＶＡ域全体（320-400nm）を透過する広帯域バンドパスフィルタ（朝日分光（株）製）を取り付けたものを使用した。射出光を石英ファイバーで細胞シャーレの真上に誘導した。培養ディッシュの１０ｃｍの上方に光出射口を配置して、光源装置に標準装備されているタイマーを使って照射時間をコントロールした。出射光線のエネルギーは、分光放射計測装置（MSR-7000、（株）オプトリサーチ社）を用いて、実使用条件での細胞位置における線量を予め測定した。
培養ディッシュを光ファイバー射出口の直下に置き、射出口の蓋を開けて、細胞に決められた照射エネルギー（０．１Ｊ／ｃｍ2〜１００Ｊ／ｃｍ2）が与えられるように、所定距離から所定の時間、光を照射した。非照射群をコントロールとした。照射後、ＰＢＳを培地と交換し、炭酸ガスインキュベーターで４時間培養した。
あるいは、同様の手順で１０Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡを細胞に照射し、照射後、ＰＢＳを培地と交換し、炭酸ガスインキュベーターで１〜４８時間培養した。培養なし（０時間）の群をコントロールとした。
【００３４】
３．薬物による小胞体ストレス応答誘導
上記と同様の手順で調製した培養細胞に、Yoshida et al., Cell 2001, 107:881-891に記載の手順に従って１μＭ thapsigarginを添加し、細胞の小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を誘導した。
【００３５】
４．ＲＮＡの調製
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Sepasol １ｍｌを加えて細胞溶解液を回収した。クロロホルムを２００μｌ添加し、良く混合した後に遠心し、水相を回収した。2-プロパノールを６００μｌ加えて良く混合し、遠心して沈殿を回収した。沈殿を７０％ＥｔＯＨで洗浄し、沈殿を風乾し、１０μｌのＨ2Ｏに溶解した。ＲＮＡ量を定量し、１μｇ／μｌの濃度に調整した。
【００３６】
５．逆転写反応
４．で調製したＲＮＡ １μｇから、SuperScript VILO cDNA合成キット（Invitrogen社）を用いて下記のとおり反応液を調製した。これを逆転写反応（２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、８５℃で５分間）にかけ、ｃＤＮＡ合成を行った。これにＨ2Ｏを１０μl加え、１μlを分取し、ＰＣＲ反応に使用した。
5×VILO（商標）Reaction Mix 2μl
10×SuperScript（登録商標）Enzyme Mix 1μl
RNA (1μg) 1μl
H2O 6μl
【００３７】
６．ＰＣＲ反応
５．で調製した逆転写反応産物１μlとKOD-FX DNA polymerase(東洋紡製)を用いて、指示書に従ってＰＣＲ反応を実施した。下記のとおりＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で２分→９８℃で１０秒→６８℃又は６０℃で６０秒の反応サイクルを２５〜４０回繰り返し、XBP1(S) mRNAのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
2×KOD-FX Buffer 5.0μl
2mM dNTP mix 2.0μl
5μM Forward Primer 0.6μl
5μM Reverse Primer 0.6μl
Template（逆転写反応産物） 1.0μl
KOD-FX（登録商標） 0.2μl
H2O 0.6μl
使用したプライマー配列を以下に示す。
Forward Primer（pXBP1-454FW）: AAGCCAAGGGGAATGAAGTG（配列番号１）
Reverse Primer（pXBP1-593RV）: AGTCAATACCGCCAGAATCC（配列番号２）
ＰＣＲ産物を５／２０％ＴＡＥ−ＰＡＧＥ上で展開し、ＥｔＢｒで染色して検出した。
【００３８】
結果を図１〜３に示す。図１に示すように、細胞にＵＶＡを照射した場合、ＵＰＲ誘導剤thapsigarginを添加した場合と同様に、XBP1(S) mRNAの増加が観察された。XBP1(S) mRNAの増加は、細胞内における構造異常蛋白質の増加を反映しており、よって細胞内でＵＰＲが誘導されたことを表している。したがって、細胞にＵＶＡを照射することにより、細胞のＵＰＲを誘導することができることが示された。
図２に示すように、XBP1(S) mRNAの発現の増加はＵＶＡ照射の１時間後から観察され、２４時間経過後にもなお高いレベルを維持していた。また図３Ａ及び図３Ｂに示すように、照射エネルギーが１．０Ｊ／ｃｍ2以上の場合、それ以下のエネルギーでＵＶＡ照射した場合や非照射の場合と比較して、XBP1(S) mRNAの発現が増加した。発現の増加は１．０〜１００Ｊ／ｃｍ2の範囲で観察されたが、６０Ｊ／ｃｍ2を超えるとむしろ発現増加の程度は小さくなる傾向にあった。
【００３９】
実施例２：ＵＰＲ誘導下におけるＵＰＲ関連分子の発現
１．細胞の準備
正常ヒト表皮角化細胞（Cascade Biologics社）を凍結バイアルで購入し、融解後に培養フラスコ（T75)内で、無血清増殖培地（EpiLife-KG2、Cascade Biologics社）で添付書の指示通り培養した。シャーレ（直径35 mm）に１回継代した細胞がサブコンフルエンシーまで増殖した時点で照射実験に用いた。
正常ヒト線維芽細胞（Cascade Biologics社）を凍結バイアルで購入し、融解後に培養フラスコ（T75)内で、10％ FBS添加DMEM培地（高Glucose、Invitrogen社）で添付書の指示通り培養した。シャーレに継代した細胞がサブコンフルエンシーまで増殖した時点で照射実験に用いた。
【００４０】
２．紫外線照射
照射前に培地を３７℃のハンクス平衡塩溶液ＨＢＳ（Ca，Mg含有、フェノールレッド不含）に交換する点を除いて、実施例１と同様の手順でＵＶＡ照射を行った。照射後、ハンクス平衡塩溶液を培地に交換して培養インキュベータに戻し、通常通り培養した。
【００４１】
３．遺伝子発現解析
遺伝子発現解析は、蛋白質フォールディングの増強に関わる遺伝子であるBiP/GRP78及びHsp47、タンパク質翻訳抑制に関わる分子であるGADD34、ならびにアポトーシス誘導に関連する分子であるGADD153について行った。
ＵＶＡ照射後、所定の時間培養した細胞ディッシュを２ｍＬ ＰＢＳ（−）で２回洗浄してから、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離には、RNeasy（登録商標）RNA 単離キット（QIAGEN社）を取り扱い説明書に従って用いた。細胞溶解には、キットの細胞溶解溶液をシャーレ当たり３５０μＬ使用した。取り扱い指示書通りに処理した後、ＲＮＡを５０μＬに溶出・回収した。回収ＲＮＡの１０μＬをｃＤＮＡ合成に用いた（SuperScript（登録商標）VILO（商標）cDNA合成キット、Invitrogen社）。ｃＤＮＡサンプルの遺伝子解析は、TaqMan（登録商標）Gene Expression System（Applied Biosystems社）を用いて、リアルタイム定量ＰＣＲ装置（ABI7500、Applied Biosystems社）で標準的なプロトコルに従って行なった。
サンプル間の遺伝子発現量の相対比較においては、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを内部標準とし、対象遺伝子の発現変化率をＧＡＰＤＨの発現変化率で除して標準化した。
【００４２】
BiP/GRP78及びHsp47の遺伝子発現解析の結果を図４Ａ及び図４Ｂに、GADD34及びGADD153の遺伝子発現解析の結果を、それぞれ図５Ａ及び図５Ｂに示す。これらの遺伝子の発現は、XBP1(S) mRNAの発現が増加するＵＶＡ照射線量において増加した。
また、ＵＶＡ照射後におけるGADD34及びGADD153の遺伝子発現の経時変化を図６Ａ及び図６Ｂに示す。これらの遺伝子の発現は、XBP1(S) mRNAの発現が増加するＵＶＡ照射後時間帯と同様の時間帯で増加した。
したがって、これらの分子又はその遺伝子の発現は、XBP1(S)mRNAと同様に、細胞におけるＵＰＲの指標となる。
【００４３】
実施例３：リポーターアッセイによる転写誘導の検出
９６ウェルプレートに１０％のコンフルエンシーで正常ヒト線維芽細胞を播種した。炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した。
以下の試薬を混合し、この混合液を、２×ＨＢＳ溶液 １００μｌに混合しながら滴下した。これを室温で３０分静置し、共沈殿を調製した。
250mM CaCl2 10μl
測定用プラスミド 2μl (2μg)
補正用プラスミド 2μl (0.2μg)
H2O 86μl
（細胞10ウェルあたりの分量）
測定用プラスミドとしては、図８に示すプラスミドのいずれかを用いた。
補正用プラスミドとしては、DUAL LUCIFERASE（登録商標） Reporter ASSAY System（Promega社製）に添付されているpRLuc-SV40 promoter plasmidを用いた。
【００４４】
図８に示すプラスミドpGL3-(-132CCC)は、human BiP/GRP78 promoterの転写開始点から-132から+7までの配列をpGL3-basic vector（Promega社製）に挿入することにより作製された。このプラスミドの発現は、ＵＰＲにおけるフォールディング増強に関与する分子であるATF6が活性化されていることを示す。プラスミドpGL3-(-132MMM)は、human BiP promoterにおいて３つのERSE配列を破壊し、これをpGL3-basic vectorに挿入することにより作製された（Yoshida et al., J Biol. Chem., 1998, 273: 33741-33749）。これは小胞体ストレスで活性化されない陰性対照プラスミドである。プラスミドpGL3-(UPRE)×5は、XBP1が結合する配列(UPRE配列)を５回繋げたものをpGL3-promotervectorに挿入することにより作製された（Wang et al., J. Biol. Chem., 2000, 275: 27013-27020）。このプラスミドの発現はXBP1の活性化を表す。プラスミドpGL3-CHOP UASは、human CHOP/GADD153 promoter（転写開始点から-870〜+17）をpGL3-basic vectorに挿入することにより作製された（Yoshida et al., Mol. Cell. Biol., 2000, 20: 6755-6767）。CHOP promoterには転写因子ATF4が結合する配列があり、その活性化はATF4の活性化を表している（Jousse et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 313: 447-452）。
【００４５】
９６ウェルプレート中の細胞に共沈殿を添加し（１５μl/ウェル）、炭酸ガスインキュベーターで１２時間培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、新しい培地に交換し、炭酸ガスインキュベーターでさらに１２時間培養した。培地を除去し、ＰＢＳを200μl添加した後、細胞にＵＶＡを照射した。照射後、ＰＢＳを除去し、培地を添加して、炭酸ガスインキュベーターで１６時間培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳを除去し、ＰＬＢ（細胞溶解液）を加えて細胞を溶解した。細胞溶解液2.5μlにDUAL LUCIFERASE ASSAY（Promega社製）溶液（各２５μlずつ）を加えてluciferaseとRenilla luciferaseの活性を定量した。Renilla luciferase活性測定値でluciferase活性測定値を補正し、得られた値を遺伝子の発現量とした（図７）。陽性対照として、ＵＶＡ照射の代わりに小胞体ストレス誘導剤として知られているthapsigargin（ＴＧ）を添加した細胞を調製した。
結果を図８に示す。これらの結果から、ＵＶＡがＴＧ同様に小胞体ストレスを惹起することが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な小胞体ストレスモデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体には様々な種類のタンパク質が存在し、各々が生体の構造形成や酵素作用など、生命活動に不可欠な機能を担っている。これらのタンパク質の機能は、その立体構造と密接に関連しており、タンパク質がその機能を果たすには適切な立体構造をとっていることが不可欠である。異常な構造を有するタンパク質は、本来の機能を果たすことができず、そればかりか、ときには毒性を有し、又は疾患の原因となり得る。
【０００３】
タンパク質は、生体内で最初に合成されたときは“ひも”上の一次構造であるが、その後小胞体内で高次構造へとフォールディング（folding）される。小胞体内で正しい立体構造を獲得したタンパク質は、ゴルジ装置へと輸送され、そこから分泌経路を介して生体各所に輸送されて、機能を発揮する。一方、不適切なフォールディングによって誤った立体構造を有するタンパク質は、小胞体シャペロンの働きによって正しい構造へと再構成されるか、あるいは小胞体タンパク質分解機構（ER-associated degradation; ERAD）によって分解される。こうしたタンパク質のフォールディングと分解からなる適正な構造のタンパク質を供給するシステムを「タンパク質の品質管理」と呼ぶ。このシステムによって、生体は、異常な構造を有するタンパク質からの悪影響を防いでいる。
【０００４】
何らかの原因でタンパク質の品質管理システムが十分に機能しない場合、結果として誤った立体構造を有する異常タンパク質が小胞体内に蓄積する。この状態を小胞体ストレスという。小胞体ストレスに対して、細胞は、タンパク質翻訳の抑制や調節、小胞体シャペロンの発現亢進によるフォールディングの増強、ＥＲＡＤ活性化による異常タンパク質分解促進などの手段によって、異常タンパク質を減少させる。しかし、これらの手段によっても状態が改善しない場合、細胞はアポトーシスを起こして死滅し、異常タンパク質から生体を防御する。これらの一連の応答は、小胞体ストレス応答（unfolded protein response; UPR）と称される。
【０００５】
近年、上記小胞体ストレス応答のメカニズムが次第に明らかになってきた。例えば、上記応答手段のうち、翻訳の抑制や調節にはPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4等の分子が、フォールディング増強にはATF6、BiP/GRP78、Hspファミリー等の分子が、ＥＲＡＤ活性化にはIRE1、XBP1、RLG1等の分子が、そしてアポトーシスにはCaspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR、TDAG51等の分子が関与していることが知られている（例えば、非特許文献１）。このうち、IRE1、ATF6、XBP1、GRP78等は小胞体ストレスのセンサータンパク質であり、小胞体ストレスの指標として知られている。特に、XBP1は、ATF6によって転写誘導され、またIRE1によってフレームスイッチ型スプライシングを受けるため、ATF6とIRE1の両因子のシグナルを反映する指標である。スプライシングされたXBP1 mRNAを測定することで小胞体ストレスを検出する方法が提唱されている（特許文献１）。
【０００６】
また近年、小胞体ストレスが、生体の様々な障害、例えば、糖尿病、神経変性疾患、躁うつ病等の種々の疾患や、免疫応答などの生理機能に深く関与していることが報告されている。生体機能に関する基礎研究のため、又は種々の疾患の診断及び治療手段を開発するためのツールとして小胞体ストレスが注目されている。
【０００７】
したがって、小胞体ストレスについて研究するための実験系、すなわち小胞体ストレスモデルを確立することが望まれる。現在までに、小胞体ストレスモデルとしては、ヒトメグシン遺伝子導入トランスジェニックラットモデル（特許文献２）、薬物添加培養細胞モデル（非特許文献２）、ＵＶ照射マウスモデル又はヒト皮膚切片モデル（非特許文献３）等が知られている。このうち、トランスジェニックモデルは、作製手順が煩雑であり、また導入遺伝子発現量の制御が難しい。
【０００８】
in vitroモデルは、標的細胞へ因子の影響が迅速に現れ、且つ生体の他の組織からの影響を受けることがないことから、因子と細胞応答との関係を詳細に調べるためのモデルとして好ましい。in vitro小胞体ストレスモデルとしては、薬物tunicamycin又はthapsigarginを添加して小胞体ストレスを誘導する培養細胞モデルが知られている（非特許文献２）。しかし、薬物添加によりストレスを誘導する場合、添加した薬物が細胞内に浸透して標的部位に到達するまでの時間、及び薬物の影響が細胞から除去されるまでの時間を制御することが困難である。また、細胞内に浸透した薬物は代謝により分解されるため、添加薬物量は必ずしも誘導ストレス量に反映されない。
【０００９】
ＵＶ照射によるストレス誘導は、操作が簡便であり、且つ照射後直ちに標的部位に到達し、また照射を止めれば直ちにその影響は細胞内から消えるため、ストレス誘導の時間的制御に有効である。また、ＵＶは薬物のように代謝を受けることがないので、与えた線量が直接的にストレス誘導量として反映され得る。従って、ＵＶ照射は、小胞体ストレスモデル作製のための好ましい方法である。しかしながら、ＵＶ照射による小胞体ストレスモデルとしては、従来、上記のマウスモデル及びヒト皮膚切片モデル（非特許文献３）のようなin vivoモデルが知られているのみであり、培養細胞モデルのようなin vitroモデルは、ＵＶ照射によって作製することはできないことが報告されていた（非特許文献３）。
【００１０】
小胞体ストレスのより詳細な研究を可能にするin vitro小胞体ストレスモデルの確立が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１２９９７０号公報
【特許文献２】特開２００４−３１３１９２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】吉田秀朗, 生化学, 2004, 第７６巻第７号, pp617-630
【非特許文献２】Yoshida et al., Cell, 2001, 107:881-891
【非特許文献３】Anand et al., J. Invest. Dermatol., 2005, 125:323-333
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、新規な方法により作製されたin vitro小胞体ストレスモデルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、培養細胞に特定の条件下でＵＶ照射を行うことにより、従来作製できないと考えられていたＵＶ照射によるin vitro小胞体ストレスモデルを作製することに成功した。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
（１）培養細胞にＵＶＡを照射する工程を含む小胞体ストレスモデルの作製方法。
（２）ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である（１）記載の方法。
（３）ＵＶＡを照射する工程の後に前記細胞を培養する工程をさらに含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＵＶＡを照射する工程により、前記細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させる、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれか１に記載の方法によって作製された小胞体ストレスモデル。
（６）培養細胞に被験物質を添加する工程と、当該細胞をＵＶＡ照射する工程と、当該細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を測定する工程を含む、小胞体ストレス制御剤のスクリーニング方法。
（７）ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である（６）記載の方法。
（８）前記発現を測定する工程の前に当該細胞を培養する工程をさらに含む、(６)又は（７）に記載の方法。
（９）前記分子又はそのｍＲＮＡの発現の量を定量する工程をさらに含む、(６)〜（８）のいずれか１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、従来よりも簡便な手順で、ストレス負荷量がより精密に制御されたin vitro小胞体ストレスモデルを提供することができる。本発明のin vitro小胞体ストレスモデルによれば、従来よりも迅速且つ正確に小胞体ストレスを評価し、また小胞体ストレスを制御する物質を探索することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト正常線維芽細胞及びＨｅＬａ細胞における、XBP1 mRNAスプライシングに対するＵＶＡ照射の影響。照射４時間後に測定。
【図２】ヒト正常線維芽細胞におけるXBP1 mRNAスプライシングに対するＵＶＡ照射後の時間の影響。ＵＶＡ線量１０Ｊ／ｃｍ2。
【図３】ヒト正常線維芽細胞におけるXBP1 mRNAスプライシングに対するＵＶＡ線量の影響。照射４時間後に測定。
【図４】ＵＰＲ誘導下における遺伝子発現。Ａ：ヒト正常角化細胞におけるBiP/GRP78 mRNA発現、Ｂ：ヒト正常線維芽細胞におけるHsp47 mRNA発現。照射６時間後に測定。
【図５】ＵＰＲ誘導下における遺伝子発現。Ａ：ヒト正常線維芽細胞におけるGADD34 mRNA発現、Ｂ：ヒト正常線維芽細胞におけるGADD153 mRNA発現。照射６時間後に測定。
【図６】ＵＰＲ誘導下における遺伝子発現の経時変化。Ａ：ヒト正常角化細胞におけるGADD34 mRNA発現、Ｂ：ヒト正常角化細胞におけるGADD153 mRNA発現。照射６〜４８時間後に測定。
【図７】リポーターアッセイ手順の概念図。
【図８】リポーターアッセイ結果。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の小胞体ストレスモデルは、培養細胞にＡ波紫外線（ＵＶＡ）を照射することにより作製される。
【００１９】
本発明の方法においては、培養細胞をＵＶＡ照射することにより、当該細胞に小胞体ストレス応答（unfolded protein response; UPR）を誘導する。ＵＶＡを照射される培養細胞は、由来する種や組織又は特定の系統には限定されないが、培養哺乳類細胞が好ましく、培養ヒト細胞がより好ましい。あるいは、培養細胞としては、好ましくは角化細胞、線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞が挙げられる。
【００２０】
ＵＶＡ照射においては、照射エネルギーとして１〜１００Ｊ／ｃｍ2、好ましくは１０〜６０Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ（波長320〜400nm）に上記培養細胞を曝露する。照射の際、上記範囲内で照射エネルギー量を調節することによって、細胞に与える小胞体ストレスの量を制御することができる。所定の照射エネルギーに細胞を曝露することができる限り、照射の強度及び時間は特に限定されない。照射は連続照射でもよく、あるいは任意の間隔をあけた繰り返し照射でもよい。細胞をＵＶＡ照射する具体的手順は当業者に周知である。
【００２１】
照射により、細胞に小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）が誘導される。ＵＰＲの典型的な例としては、タンパク質翻訳抑制、小胞体シャペロンの発現亢進によるフォールディングの増強、小胞体タンパク質分解機構（ER-associated degradation; ERAD）の活性化による異常タンパク質分解促進等の異常タンパク質を減少させるための応答、アポトーシス誘導等のような異常タンパク質から生体を防御する応答、及び細胞のタンパク質翻訳抑制及び調節が挙げられる。すなわち、上記ＵＶＡ照射により、細胞内のタンパク質翻訳抑制、フォールディングの増強、ＥＲＡＤ活性化又はアポトーシス誘導、又は細胞のタンパク質翻訳抑制及び調節が促進される。
【００２２】
細胞のタンパク質翻訳抑制に関与する分子としては、PERK、GADD34、p58IPK、CReP等が挙げられる。フォールディング増強に関与する分子としては、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47等が挙げられる。ＥＲＡＤ活性化に関与する分子としては、IRE1、XBP1、RLG1等が挙げられる。アポトーシスに関与する分子としては、Caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR、TDAG51等が挙げられる。細胞のタンパク質翻訳抑制及び調節に関与する分子としては、ATF4が挙げられる。これらの分子は全て細胞のＵＰＲに関与する分子（ＵＰＲ関連分子）である。
【００２３】
上記細胞内のＵＰＲ関連分子の発現は、上記ＵＶＡ照射により増加する。当該分子の発現増加は、細胞のＵＰＲの増強を反映している。特に、XBP1は、ATF6によって転写誘導され、またIRE1によってフレームスイッチ型スプライシングを受けるため、ATF6とIRE1の両因子のシグナルを反映する分子である。XBP1のスプライシング型mRNA（XBP1（S）mRNA）は、細胞のＵＰＲの指標として従来知られている。
【００２４】
したがって、一態様において、本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法は、培養細胞にＵＶＡを照射する工程により、当該細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子の少なくとも１の発現、あるいはこれらの分子のｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させる工程を含み得る。当該態様においては、上記の分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させればよいが、上記の分子又はそのｍＲＮＡのうちの複数の発現を増加させてもよい。より好ましくは、GADD34、BiP/GRP78、Hsp47、XBP1及びCHOP/GADD153のうちの少なくとも１の発現を増加させる。さらに好ましくは、GADD34 mRNA、BiP/GRP78 mRNA、Hsp47 mRNA、XBP1(S) mRNA及びCHOP/GADD153 mRNAうちの少なくとも１の発現を増加させる。
【００２５】
本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法においては、好ましくは、培養細胞へのＵＶＡ照射の後、当該細胞を培養する。培養時間は、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは４時間以上であり、さらに好ましくは１〜４８時間であり、なお好ましくは４〜４８時間である。上記培養により、当該細胞におけるＵＰＲはより増強される。
【００２６】
上記のとおりＵＰＲが誘導された細胞は、in vitro小胞体ストレスモデル細胞として利用され得る。例えば、後記実施例１に示されるように、ＵＶＡ照射により、培養細胞内で、ＵＰＲの指標として従来知られている分子であるXBP1（S）mRNAが増加する。したがって、ＵＶＡ照射により当該細胞にＵＰＲが誘導されており、この細胞をin vitro小胞体ストレスモデルとして使用できることが分かる。また、後記実施例２〜４に示されるように、上記XBP1（S）mRNAが増加するＵＶＡ照射条件と同じ照射条件下で、他のＵＰＲ関連分子の発現が培養細胞内で増加する。したがって、本発明の小胞体ストレスモデル細胞においては、ＵＰＲ関連分子、好ましくは、PERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子の少なくとも１又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現、より好ましくは、GADD34、BiP/GRP78、Hsp47、XBP1及びCHOP/GADD153のうちの少なくとも１の発現、さらに好ましくは、GADD34 mRNA、BiP/GRP78 mRNA、Hsp47 mRNA、XBP1(S) mRNA及びCHOP/GADD153 mRNAうちの少なくとも１の発現が増加している。
【００２７】
また本発明は、上記小胞体ストレスモデルを利用した、小胞体ストレス制御剤のスクリーニング方法を提供する。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、培養細胞に被験物質を添加する工程と、当該細胞をＵＶＡ照射する工程と、当該細胞におけるＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定する工程とを含む。当該スクリーニング方法において、ＵＶＡ照射される培養細胞の種類、ＵＶＡ照射の方法、発現を測定されるＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの種類は、本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法の場合と同じである。
【００２８】
被験物質は、ＵＶＡ照射前に添加されても、ＵＶＡ照射後に添加されても、又はＵＶＡ照射と並行して添加されてもよい。その後、細胞のＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定し、被験物質の添加による影響を評価する。例えば、被験物質の添加前後で細胞のＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定し、必要に応じて測定値を定量した後、添加前後で発現を比較する。あるいは、被験物質添加群と対照物質添加群におけるＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を測定し、必要に応じて測定値を定量した後、両群間で発現の違いを比較する。上記分子又はそのｍＲＮＡの発現を変化させる物質を小胞体ストレス制御剤として選択することができる。例えば、被験物質のうち、ＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現を増加させる物質は小胞体ストレス亢進剤として、当該分子又はそのｍＲＮＡ発現を低下させる物質は小胞体ストレス抑制剤として、選択され得る。
【００２９】
好ましくは、本発明の小胞体ストレスモデルの作製方法は、培養細胞をＵＶＡ照射する工程の後、且つ上記発現を測定する工程の前に、当該細胞を培養する工程をさらに含む。培養時間は、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは４時間以上であり、さらに好ましくは１〜４８時間であり、なお好ましくは４〜４８時間である。
【００３０】
本発明において、ＵＰＲ関連分子又はそのｍＲＮＡの発現の測定には、例えば、ＲＩ標識、蛍光標識、発光標識、ゲル電気泳動法、免疫沈降、イムノブロッティング、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるリポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡ又はプロテインマイクロアレイ等の、当該分野で通常行われる任意の方法を用いることができる。このうち、ウエスタンブロット法、リポーターアッセイ及びＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
【００３２】
実施例１：ＵＶＡ照射による小胞体ストレス応答の誘導
１．細胞の準備
６０ｍｍディッシュに１０％のコンフルエンシーで正常ヒト線維芽細胞又はＨｅＬａ細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーターで７２時間培養した。
【００３３】
２．ＵＶＡ照射
ディッシュから培地を除去し、２．５ｍｌのＰＢＳを添加した後、細胞にＵＶＡを照射した。
紫外線照射光源としては、キセノン光源装置（MAX-301型、朝日分光（株））にＵＶＡ域全体（320-400nm）を透過する広帯域バンドパスフィルタ（朝日分光（株）製）を取り付けたものを使用した。射出光を石英ファイバーで細胞シャーレの真上に誘導した。培養ディッシュの１０ｃｍの上方に光出射口を配置して、光源装置に標準装備されているタイマーを使って照射時間をコントロールした。出射光線のエネルギーは、分光放射計測装置（MSR-7000、（株）オプトリサーチ社）を用いて、実使用条件での細胞位置における線量を予め測定した。
培養ディッシュを光ファイバー射出口の直下に置き、射出口の蓋を開けて、細胞に決められた照射エネルギー（０．１Ｊ／ｃｍ2〜１００Ｊ／ｃｍ2）が与えられるように、所定距離から所定の時間、光を照射した。非照射群をコントロールとした。照射後、ＰＢＳを培地と交換し、炭酸ガスインキュベーターで４時間培養した。
あるいは、同様の手順で１０Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡを細胞に照射し、照射後、ＰＢＳを培地と交換し、炭酸ガスインキュベーターで１〜４８時間培養した。培養なし（０時間）の群をコントロールとした。
【００３４】
３．薬物による小胞体ストレス応答誘導
上記と同様の手順で調製した培養細胞に、Yoshida et al., Cell 2001, 107:881-891に記載の手順に従って１μＭ thapsigarginを添加し、細胞の小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を誘導した。
【００３５】
４．ＲＮＡの調製
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Sepasol １ｍｌを加えて細胞溶解液を回収した。クロロホルムを２００μｌ添加し、良く混合した後に遠心し、水相を回収した。2-プロパノールを６００μｌ加えて良く混合し、遠心して沈殿を回収した。沈殿を７０％ＥｔＯＨで洗浄し、沈殿を風乾し、１０μｌのＨ2Ｏに溶解した。ＲＮＡ量を定量し、１μｇ／μｌの濃度に調整した。
【００３６】
５．逆転写反応
４．で調製したＲＮＡ １μｇから、SuperScript VILO cDNA合成キット（Invitrogen社）を用いて下記のとおり反応液を調製した。これを逆転写反応（２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、８５℃で５分間）にかけ、ｃＤＮＡ合成を行った。これにＨ2Ｏを１０μl加え、１μlを分取し、ＰＣＲ反応に使用した。
5×VILO（商標）Reaction Mix 2μl
10×SuperScript（登録商標）Enzyme Mix 1μl
RNA (1μg) 1μl
H2O 6μl
【００３７】
６．ＰＣＲ反応
５．で調製した逆転写反応産物１μlとKOD-FX DNA polymerase(東洋紡製)を用いて、指示書に従ってＰＣＲ反応を実施した。下記のとおりＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で２分→９８℃で１０秒→６８℃又は６０℃で６０秒の反応サイクルを２５〜４０回繰り返し、XBP1(S) mRNAのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
2×KOD-FX Buffer 5.0μl
2mM dNTP mix 2.0μl
5μM Forward Primer 0.6μl
5μM Reverse Primer 0.6μl
Template（逆転写反応産物） 1.0μl
KOD-FX（登録商標） 0.2μl
H2O 0.6μl
使用したプライマー配列を以下に示す。
Forward Primer（pXBP1-454FW）: AAGCCAAGGGGAATGAAGTG（配列番号１）
Reverse Primer（pXBP1-593RV）: AGTCAATACCGCCAGAATCC（配列番号２）
ＰＣＲ産物を５／２０％ＴＡＥ−ＰＡＧＥ上で展開し、ＥｔＢｒで染色して検出した。
【００３８】
結果を図１〜３に示す。図１に示すように、細胞にＵＶＡを照射した場合、ＵＰＲ誘導剤thapsigarginを添加した場合と同様に、XBP1(S) mRNAの増加が観察された。XBP1(S) mRNAの増加は、細胞内における構造異常蛋白質の増加を反映しており、よって細胞内でＵＰＲが誘導されたことを表している。したがって、細胞にＵＶＡを照射することにより、細胞のＵＰＲを誘導することができることが示された。
図２に示すように、XBP1(S) mRNAの発現の増加はＵＶＡ照射の１時間後から観察され、２４時間経過後にもなお高いレベルを維持していた。また図３Ａ及び図３Ｂに示すように、照射エネルギーが１．０Ｊ／ｃｍ2以上の場合、それ以下のエネルギーでＵＶＡ照射した場合や非照射の場合と比較して、XBP1(S) mRNAの発現が増加した。発現の増加は１．０〜１００Ｊ／ｃｍ2の範囲で観察されたが、６０Ｊ／ｃｍ2を超えるとむしろ発現増加の程度は小さくなる傾向にあった。
【００３９】
実施例２：ＵＰＲ誘導下におけるＵＰＲ関連分子の発現
１．細胞の準備
正常ヒト表皮角化細胞（Cascade Biologics社）を凍結バイアルで購入し、融解後に培養フラスコ（T75)内で、無血清増殖培地（EpiLife-KG2、Cascade Biologics社）で添付書の指示通り培養した。シャーレ（直径35 mm）に１回継代した細胞がサブコンフルエンシーまで増殖した時点で照射実験に用いた。
正常ヒト線維芽細胞（Cascade Biologics社）を凍結バイアルで購入し、融解後に培養フラスコ（T75)内で、10％ FBS添加DMEM培地（高Glucose、Invitrogen社）で添付書の指示通り培養した。シャーレに継代した細胞がサブコンフルエンシーまで増殖した時点で照射実験に用いた。
【００４０】
２．紫外線照射
照射前に培地を３７℃のハンクス平衡塩溶液ＨＢＳ（Ca，Mg含有、フェノールレッド不含）に交換する点を除いて、実施例１と同様の手順でＵＶＡ照射を行った。照射後、ハンクス平衡塩溶液を培地に交換して培養インキュベータに戻し、通常通り培養した。
【００４１】
３．遺伝子発現解析
遺伝子発現解析は、蛋白質フォールディングの増強に関わる遺伝子であるBiP/GRP78及びHsp47、タンパク質翻訳抑制に関わる分子であるGADD34、ならびにアポトーシス誘導に関連する分子であるGADD153について行った。
ＵＶＡ照射後、所定の時間培養した細胞ディッシュを２ｍＬ ＰＢＳ（−）で２回洗浄してから、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離には、RNeasy（登録商標）RNA 単離キット（QIAGEN社）を取り扱い説明書に従って用いた。細胞溶解には、キットの細胞溶解溶液をシャーレ当たり３５０μＬ使用した。取り扱い指示書通りに処理した後、ＲＮＡを５０μＬに溶出・回収した。回収ＲＮＡの１０μＬをｃＤＮＡ合成に用いた（SuperScript（登録商標）VILO（商標）cDNA合成キット、Invitrogen社）。ｃＤＮＡサンプルの遺伝子解析は、TaqMan（登録商標）Gene Expression System（Applied Biosystems社）を用いて、リアルタイム定量ＰＣＲ装置（ABI7500、Applied Biosystems社）で標準的なプロトコルに従って行なった。
サンプル間の遺伝子発現量の相対比較においては、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを内部標準とし、対象遺伝子の発現変化率をＧＡＰＤＨの発現変化率で除して標準化した。
【００４２】
BiP/GRP78及びHsp47の遺伝子発現解析の結果を図４Ａ及び図４Ｂに、GADD34及びGADD153の遺伝子発現解析の結果を、それぞれ図５Ａ及び図５Ｂに示す。これらの遺伝子の発現は、XBP1(S) mRNAの発現が増加するＵＶＡ照射線量において増加した。
また、ＵＶＡ照射後におけるGADD34及びGADD153の遺伝子発現の経時変化を図６Ａ及び図６Ｂに示す。これらの遺伝子の発現は、XBP1(S) mRNAの発現が増加するＵＶＡ照射後時間帯と同様の時間帯で増加した。
したがって、これらの分子又はその遺伝子の発現は、XBP1(S)mRNAと同様に、細胞におけるＵＰＲの指標となる。
【００４３】
実施例３：リポーターアッセイによる転写誘導の検出
９６ウェルプレートに１０％のコンフルエンシーで正常ヒト線維芽細胞を播種した。炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した。
以下の試薬を混合し、この混合液を、２×ＨＢＳ溶液 １００μｌに混合しながら滴下した。これを室温で３０分静置し、共沈殿を調製した。
250mM CaCl2 10μl
測定用プラスミド 2μl (2μg)
補正用プラスミド 2μl (0.2μg)
H2O 86μl
（細胞10ウェルあたりの分量）
測定用プラスミドとしては、図８に示すプラスミドのいずれかを用いた。
補正用プラスミドとしては、DUAL LUCIFERASE（登録商標） Reporter ASSAY System（Promega社製）に添付されているpRLuc-SV40 promoter plasmidを用いた。
【００４４】
図８に示すプラスミドpGL3-(-132CCC)は、human BiP/GRP78 promoterの転写開始点から-132から+7までの配列をpGL3-basic vector（Promega社製）に挿入することにより作製された。このプラスミドの発現は、ＵＰＲにおけるフォールディング増強に関与する分子であるATF6が活性化されていることを示す。プラスミドpGL3-(-132MMM)は、human BiP promoterにおいて３つのERSE配列を破壊し、これをpGL3-basic vectorに挿入することにより作製された（Yoshida et al., J Biol. Chem., 1998, 273: 33741-33749）。これは小胞体ストレスで活性化されない陰性対照プラスミドである。プラスミドpGL3-(UPRE)×5は、XBP1が結合する配列(UPRE配列)を５回繋げたものをpGL3-promotervectorに挿入することにより作製された（Wang et al., J. Biol. Chem., 2000, 275: 27013-27020）。このプラスミドの発現はXBP1の活性化を表す。プラスミドpGL3-CHOP UASは、human CHOP/GADD153 promoter（転写開始点から-870〜+17）をpGL3-basic vectorに挿入することにより作製された（Yoshida et al., Mol. Cell. Biol., 2000, 20: 6755-6767）。CHOP promoterには転写因子ATF4が結合する配列があり、その活性化はATF4の活性化を表している（Jousse et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 313: 447-452）。
【００４５】
９６ウェルプレート中の細胞に共沈殿を添加し（１５μl/ウェル）、炭酸ガスインキュベーターで１２時間培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、新しい培地に交換し、炭酸ガスインキュベーターでさらに１２時間培養した。培地を除去し、ＰＢＳを200μl添加した後、細胞にＵＶＡを照射した。照射後、ＰＢＳを除去し、培地を添加して、炭酸ガスインキュベーターで１６時間培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳを除去し、ＰＬＢ（細胞溶解液）を加えて細胞を溶解した。細胞溶解液2.5μlにDUAL LUCIFERASE ASSAY（Promega社製）溶液（各２５μlずつ）を加えてluciferaseとRenilla luciferaseの活性を定量した。Renilla luciferase活性測定値でluciferase活性測定値を補正し、得られた値を遺伝子の発現量とした（図７）。陽性対照として、ＵＶＡ照射の代わりに小胞体ストレス誘導剤として知られているthapsigargin（ＴＧ）を添加した細胞を調製した。
結果を図８に示す。これらの結果から、ＵＶＡがＴＧ同様に小胞体ストレスを惹起することが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞にＵＶＡを照射する工程を含む小胞体ストレスモデルの作製方法。
【請求項２】
ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＵＶＡを照射する工程の後に前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＵＶＡを照射する工程により、前記細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって作製された小胞体ストレスモデル。
【請求項６】
培養細胞に被験物質を添加する工程と、当該細胞をＵＶＡ照射する工程と、当該細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を測定する工程を含む、小胞体ストレス制御剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記発現を測定する工程の前に当該細胞を培養する工程をさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子又はそのｍＲＮＡの発現の量を定量する工程をさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
培養細胞にＵＶＡを照射する工程を含む小胞体ストレスモデルの作製方法。
【請求項２】
ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＵＶＡを照射する工程の後に前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＵＶＡを照射する工程により、前記細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を増加させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって作製された小胞体ストレスモデル。
【請求項６】
培養細胞に被験物質を添加する工程と、当該細胞をＵＶＡ照射する工程と、当該細胞におけるPERK、GADD34、p58IPK、CReP、ATF4、ATF6、BiP/GRP78、Hsp47、IRE1、XBP1、RLG1、caspase-12、CHOP/GADD153、ASK1、c-Abl、PUMA、PKR及びTDAG51からなる群から選択される分子又はそのｍＲＮＡのうちの少なくとも１の発現を測定する工程を含む、小胞体ストレス制御剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＵＶＡ照射が１〜１００Ｊ／ｃｍ2のＵＶＡ照射である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記発現を測定する工程の前に当該細胞を培養する工程をさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子又はそのｍＲＮＡの発現の量を定量する工程をさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１６７０８１（Ｐ２０１１−１６７０８１Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３１０８７（Ｐ２０１０−３１０８７）
【出願日】平成２２年２月１６日（２０１０．２．１６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１６日（２０１０．２．１６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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