尿中トリプシンインヒビターを検出するためのモノクローナル抗体
一定のモノクローナル抗体は、ヒトの疾患に特徴的である尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）を検出することができる。特に、このＵＴＩは、本明細書に定義されたとおりのＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２を包含して、それらの断片および集合体も包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般的には、ヒトの尿中の尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）の検出に関するものである。ＵＴＩは、セリンプロテアーゼの一種またはそれ以上を阻害する。トリプシンは、セリンプロテアーゼのファミリー、すなわちトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、トロンビン、キモトリプシンおよびカテプシンをとりわけ包含する、酵素の一員である。インヒビターのこの群は、もっぱら、感染または炎症の際にエラスターゼが放出されるために、血中の白血球の数が増加した後に形成される。ＵＴＩは、健康な個体が産生する尿中には見出されないのが普通である。その量は、その身体が細菌感染および炎症性障害、またはとりわけ悪性腫瘍、腎疾患、心筋梗塞、肺気腫、外科的外傷および腎結石のような、その他の悪疾を有する者で増加する。
【背景技術】
【０００２】
感染および／または炎症が生じたとき、身体の応答は、好中球が放出するエラスターゼのようなセリンプロテアーゼの産生を伴う。ＵＴＩの非インヒビター形態（プロインヒビターと呼ばれる）、たとえばインターロイキンαインヒビター（Ｉ−α−Ｉ）およびプレインターロイキンαインヒビター（Ｐ−α−Ｉ）は、健康および疾患を有する者の血漿中を自由に循環する。セリンプロテアーゼは、プロインヒビターのタンパク質分解を引き起こし、低分子量のＵＴＩを活性機能へと解放する。放出された尿中トリプシンインヒビターは、セリンプロテアーゼに作用し、その後、尿中に排出される。１９０９年に発見された尿中トリプシンインヒビターは、クーニッツ（Kunitz）型プロテアーゼインヒビターであり、何年以上もＨＩ−３０、ミンギン、ウリナスタチン（Urinastatin）、セルピンおよびウリナスタチン（Ulinastatin）と名付けられてきたが、科学界では、３０Kda以下の分子量の有力な断片にちなんでビクニンなる名称に落ち着いた。ビクニンインヒビター断片のアミノ酸配列は、公知である。それは、二つのクーニッツ阻害結合ドメイン、および巨大な可変性コンドロイチン硫酸鎖を含む。International Journal of Biochemistry and Cell Biology 32 (2000) 125-137を参照されたい。
【０００３】
尿中トリプシンインヒビターの量は、いくつかの方法、たとえば酵素阻害、抗体染色、ラテックス凝集および放射免疫アッセイによって測定されているが、サンプル中のＵＴＩのすべてが測定される。インヒビターの一定の形態は、慢性的疾患の結果として生じうるものであり、より軽度の炎症を有する個体に存在するインヒビターと容易に区別されることは示されていない。その結果、ＵＴＩの診断における使用は、現在まで、感染および／または炎症の非特異的マーカーとしてのみであるにすぎない。非特異的な性質は、ＵＴＩの決定としての臨床的効用を低減し、介護士が感染の種類または部位を知る助けにならず、患者が治療を必要とする状態を一般的な軽疾から区別するのを困難にする。本発明は、そのような区別をつけることを対象とする。
【０００４】
尿サンプルのＵＴＩ含量を測定する一つの方法は、既知量のトリプシンのサンプルを加え、次いで、トリプシンが阻害された程度を測定することを含む。この手法の例は、３点の米国特許出願公開公報２００１／００５５８１６ Ａ１、２００２／０００４２１９ Ａ１および２００３／０１２５５７７ Ａ１に見出すことができる。これらの出願公開公報では、検出可能な応答を生じることができる、基質上の既知量のトリプシンを、尿サンプルに加える。基質をトリプシンによって切断して、検出可能な副生物を得る。トリプシンインヒビターが存在するならば、利用できる基質のいくらかが切断されないことから、応答は減る。したがって、存在するトリプシンの量を測定し、加えられた量に関連させて関数化することによって、ＵＴＩ含量を決定することができる。この方法は、トリプシン活性のいかなるインヒビターをも検出し、尿中に排出された、与えられたいかなるトリプシンインヒビターに対しても非特異的である。２００１年の特許出願公開公報は、サンプル中のカルシウムの干渉を阻害するのにポリカルボン酸キレート化剤を用いることを開示している。２００２年および２００３年に特許出願公開公報は、まさに記載された方法においてトリプシンに対する基質として役立つことが示された、アルギニンの特定の芳香族エステルに関する。
【０００５】
尿サンプル中のＵＴＩの量を直接決定するもう一つの方法は、尿中トリプシンインヒビターに結合する抗体の開発を含み、抗体を含む免疫アッセイ試薬の添加によって、応答シグナルを発生させる。本発明の抗体を適用するのに用いることができるような、様々な免疫アッセイ法、たとえば、微粒子捕捉免疫アッセイ（ＭＩＣ）、ラテックス凝集阻害（ＬＡＩ）、固相クロマトグラフィー（ＩＣ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光結合アッセイ（ＦＩＡ）、発光結合アッセイ（ＬＩＡ）、希土類金属標識アッセイ、化学発光アッセイ（ＣＬＡ）、ならびに着色ラテックス粒子およびコロイド状金のような光学的色彩標識アッセイ（ＯＡ）が存在する。電流測定、抵抗測定および電圧測定による検出法に基づく、電気化学的シグナル変換器（ＥＳＴ）を用いることも、実施可能である。
【０００６】
原則として、免疫アッセイは、分離工程を必要とする異種構成のものか、または分離なしの同種構成のもののいずれか、および競合的または非競合的性格のいずれかのものであることができる。異種アッセイのためには、固相を用いて、結合抗原を遊離抗原から分離することができ、またプラスチックのウエル、管、毛細管、膜、ラテックス粒子および磁性粒子を含むことができる。抗体は、検出可能な応答を直接または間接的に発生する試薬、その他の抗体もしくはその他の試薬に、様々な方式で結合またはコンジュゲート（標識化）させることもできる。免疫アッセイは、検出しようとする材料の検出上の必要に応じてサンドイッチアッセイ、二重標識アッセイ、および多重サンドイッチアッセイのような、様々な様式で、多数の、かつ異なる抗体を用いることもできる。
【０００７】
一般に、免疫アッセイ試薬は、変化を生じて、それがシグナルを発生させ、発生したシグナルの強さは、標本またはサンプル中で測定される分析対象の濃度に比例する。免疫アッセイ試薬は、指示染料、金属、酵素、重合体、抗体、界面活性剤、粒子、電気化学反応性成分、および乾燥させたか、または担体に充填したその他様々な化学物質を含有する。頻用される担体は、様々なサンプル量、摂取および輸送特性を有する、管、カップ、毛細管、小片、バイアル、紙、微量流体装置、カセット、膜または重合体である。
【０００８】
腎疾患を有する患者の尿から精製した尿中トリプシンインヒビターを接種された、ウサギから生成されたポリクローナル抗体は、健康な個体、および疾患を有する個体の双方からの、尿サンプル中の総ＵＴＩの量を測定するのに役立つ。しかし、ポリクローナル抗体は、ＵＴＩの様々な形態を相互に区別することができず、特にインターロイキンαインヒビター（Ｉ−α−Ｉ）およびプレインターロイキンαインヒビター（Ｐ−α−Ｉ）なるプロインヒビターから区別することができない。これらのタンパク質は、すべて、健康な患者に容易に存在することから、ポリクローナル抗体の交差反応性は、血液試料を用いて、罹病した患者を健康な患者から区別することの役に立たなくなる。尿試料の場合、Ｐ−α−ＩおよびＩ−α−Ｉの高い分子量は、それらが腎臓を通過し、そうしてポリクローナル抗体が、その低下した特異性にもかかわらず、より効果的であるという可能性を低くする。しかしながら、ポリクローナル抗体は、非特異的である性質のため、従来から論じられてきた一般的な酵素阻害法より効果的であると判明してはいない。ポリクローナル抗体は、尿中のすべての形態のＵＴＩに交差反応性であり、いかなる一形態にも特異的でなく、阻害性および非阻害性ＵＴＩの双方を測定すると思われる。
【０００９】
Journal of Immunoassay 1991; 12:347-69で、Trefzらは、高分子量（２４０ｋDa）のインター−α−トリプシンインヒビター（不活性プロインヒビター）で免疫されたマウスから生成されたモノクローナル抗体の、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における使用を開示している。結果は、この方法が健康個体と疾患を有する個体とを区別するのに効果的であることを示したが、それは、罹病した個体の尿中のＵＴＩレベルが、罹病していない個体のそれより高いからであった。著者らは、約２４０kDaの分子量を有するインター−α−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）は、ＩＴＩの崩壊の結果生じたと理解される、より低分子量のいくつかのペプチドを含むことに触れた。彼らのモノクローナル抗体、すなわちＩＡＴＩ５は、主要な３帯域、すなわち２４０kDa、１２０kDaおよび５０kDaの帯域を認識することが見出された。
【００１０】
２０００年７月１４日発行のJournal of Biological Chemistry、第２７５巻第２８号の２１，１８５〜２１，１９１ページに報告された論文で、小林浩らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析で約４０〜８０kDaの範囲内の分子量を有することが示されたＵＴＩの精製標品に対して、誘発したポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを比較した。誘導体は、約７kDa、３０kDaおよび６０kDaの分子量を有することが見出された。
【００１１】
Bayerが調製したＵＴＩに対するポリクローナル抗体の交差反応性の研究の際、本発明者らは、急性期の感染の際に、阻害性ビクニンの更なる崩壊が患者に発生して、両クーニッツインヒビタードメインを含み、コンドロイチン硫酸鎖を欠く、その他の阻害性ＵＴＩの形成へと導くことを発見して驚いた。このＵＴＩは、ウリスタチン（Uristatin）と呼ばれて、１７kDa以下の分子量を有した。尿中トリプシンインヒビターについてのディップスティックによる試験を報告する論文［Clinical Chemistry Acta (2004) 341:73-81］で、Pugiaらは、ディップスティックがＵＴＩに関する二形態；すなわちビクニンおよびウリスタチンの存在を記録したことを示した。彼らは、ビクニンの代表的な分子量（３０．９kDa）、およびウリスタチンの枢要な三形態を特定して、ウリスタチン１（５．９kDa）、ウリスタチン２（８．５kDa）、ならびにウリスタチンと呼ばれるウリスタチン１およびウリスタチン２の組合せ（１７．４kDa）を名付けた。ウリスタチンの形態は、すべて、コンドロイチン硫酸鎖を欠き、電気泳動によって分析したとき、患者の試料中に非常に多量であった。ウリスタチンの形態は、すべて、トリプシンファミリーのプロテアーゼに対して阻害的であり、そのため、結合するとプロテアーゼの活性部位を阻害する、二つのクーニッツ阻害性ドメインの少なくとも一つを含む。ウリスタチン１は、結合ドメイン２を含み、ウリスタチン２は、結合ドメイン１を含む。
【００１２】
更に、採集に用いられた患者の条件を考えると、ＵＴＩの代表的な分子量は、著しく変動し得ることにも触れられた。ビクニンおよびウリスタチンの更なる変動は、ペプチド構造の断片化、ペプチド配列の変動、ならびにビクニンおよびウリスタチンに結合した炭水化物配列の変動による。断片の結果として生じる分子量の変動は、ペプチド配列の切断によって生じる。炎症の際は、切断を生じることができるプロテアーゼにインヒビターが接触するため、高度の断片化が予測される。炭水化物部分の伸張および断片化も、炎症の際に、糖タンパク質が数多くの糖転移酵素およびグリコシダーゼによって代謝されて、ビクニンに結合したコンドロイチン硫酸鎖、およびウリスタチンに結合した糖鎖に非常に多くのあり得る変異型を生じるため、予測される。更なる変動は、特に炭水化物部分の会合および代謝を通じて、二量体またはより高分子のオリゴマーへの断片の集合によっても生じる。そのため、機能性ＵＴＩタンパク質は、代表的な分子量の前後の可能性のあるタンパク質の範囲を示す。
【００１３】
このスーパーファミリーの更なるタンパク質は、阻害性およびプロインヒビター形態の生合成を開始させる、前駆体タンパク質（ＡＭＢＫ）である。このタンパク質は、遺伝子が生合成を開始するためのアップレギュレーションを発信したときに、患者の血漿中に存在する。ＡＭＢＫは、ビクニンを含むが、阻害性ドメインを不活性化し、α１ミクログロブリンに結合した重鎖を欠く。インヒビターのこの形態の検出も、炎症および感染に対する身体の応答を決定するのに重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
健康な個体には見出されない特徴的な特定のＵＴＩを決定することによって、疾患の存在を検出することができる、特定の尿中トリプシンインヒビターを測定する方法に対する需要が存続している。本発明者らは、以下に詳述するとおり、特定のモノクローナル抗体を用いることによって、そのような決定を可能にする方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要約
本発明は、ヒトの疾患に特徴的な阻害性の尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）にそれ自身を結合させることができ、異種アッセイおよび同種アッセイの双方において、ＭＩＣ、ＬＡＩ、ＩＣ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＬＩＡ、ＣＬＡ、ＯＡおよびＥＳＴ（先に定義された頭字語）をはじめとする、標準的な分析手法によって検出することができる、一定のモノクローナル抗体を包含する。これらのモノクローナル抗体は、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２およびＡＭＢＫのような尿中トリプシンインヒビターの、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、タム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）、α１ミクログロブリン（α−１Ｍ）、α１アンチキモトリプシン（α−１ＡＣＴ）、ならびにＩ−α−ＩおよびＰ−α−Ｉのような非阻害性尿中トリプシンインヒビター（プロインヒビター形態）のような、その他の一般的なタンパク質の存在下での直接または間接的な測定を可能とする能力を特徴とする。
【００１６】
ＵＴＩの直接測定は、この特定のＵＴＩのみを認識する抗体をいずれにせよ用いることによって達成し得る。ＵＴＩの間接測定は、問題のもの以外のＵＴＩを認識する抗体と、および有力なＵＴＩの全部または大部分を認識する抗体との差し引きによって実施し得る。以下の実施例では、ハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６およびハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１が分泌する抗体が、尿中および血中双方のＵＴＩの量を決定するのに適切であることを示し、一方、ハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４は、交差反応性の補正、およびＵＴＩの量の決定に適切である。その他の抗体は、類似する特徴性を有することが示されることになる。
【００１７】
そのようなモノクローナル抗体は、精製されたＵＴＩを免疫原としてマウスに導入することによって生成し得る。ただ一種の抗体のみを産生する単一のハイブリドーマクローンは、KohlerおよびMilsteinの手順を実施することによって創出されている。モノクローナル抗体の特徴的な性質は、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）手法、ＥＬＩＳＡおよびその他の免疫アッセイ法を用いて研究されている。
【００１８】
もう一つの態様では、本発明は、問題の尿中トリプシンインヒビターの形態、すなわち疾患を有する者を特徴付けるそれを検出かつ測定するために、新規なモノクローナル抗体を用いる方法を包含する。モノクローナル抗体は、阻害性ＵＴＩ、たとえばビクニンおよびウリスタチン、または前駆体であるＡＭＢＫに特異的な場合に、直接測定することができる。モノクローナル抗体が二種類以上のウリスタチンに結合できるときは、二種類以上の抗体を用いることによって、問題の特定のＵＴＩの含量は、差によって決定し得る。先に参照した三種類のモノクローナル抗体は、ウリスタチンならびにウリスタチン１および２（Ｍａｂ４２１−５Ｇ８）、タム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）（Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１）、ならびに全ＵＴＩおよびＴＨＰに優先的に結合するが、プロインヒビター（４２１−３Ｇ５）には結合しないことが見出されている。
【００１９】
分析は、血液、尿、水、唾液、脊髄液、間質液、食物および血漿を非限定的に包含する、多くの生物学的流体のサンプルに対して実施し得る。血液および尿が特に問題となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
好ましい実施態様の記載
定義
文献は、酵素インヒビターに対して様々な名称を用いていることから、下記で、本明細書に用いられる用語について定義を与える。以下に考察されるＳＥＬＤＩ分析では、多くの変異型が検出されたことが見出されている。その結果、定義は、これらのインヒビターの主たる分子量ばかりでなく、ある範囲の関連する分子量のタンパク質も包含すべきと考えられる。
【００２１】
尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）は、セリンプロテアーゼを阻害するとして特定される、阻害が可能である断片ならびに変異型および集合体も含めて、ビクニン、ＨＩ−３０、ＡＭＢＫ、ウリスタチン、ウリスタチン１およびウリスタチン２を非限定的に包含する、すべてのインヒビターを意味する。
【００２２】
ＨＩ−３０は、ビクニンおよび集合体と同一であってもなくてもよい、高分子量尿中トリプシンインヒビターの断片を意味する。その単量体分子量は、３０kDaであって、断片および変異型については、２１〜４６kDaの範囲を有すると報告されている。
【００２３】
ＡＭＢＫは、三種類の結合したタンパク質、すなわちインヒビター部分（ＨＩ−３０）およびα１ミクログロブリン、ならびに２５kDaの未確認タンパク質を有し、４２〜７０kDaの範囲内で、コンドロイチン硫酸を伴って約６６kDa、コンドロイチン硫酸なしでは４２kDaの分子量を有する、プロインヒビターのタンパク質前駆体を意味する。それは、阻害性セリンプロテアーゼの生合成における機能に関係なく、本発明が目的とするＵＴＩの定義内にあると見なされる。
【００２４】
タム−ホースフォール糖タンパク質は、尿中に一般的に見出されるウロムコイドとしても公知であり、８０〜９１kDaの範囲を伴う、約８５kDaの代表的分子量を有し、その様々な断片および変異型を包含する、糖タンパク質を意味する。
【００２５】
ビクニンは、短いペプチド鎖によって結合され、ＮおよびＣ末端ポリペプチド鎖によって伸張されることができる、クーニッツ型の一つまたは二つのプロテイナーゼインヒビタードメインからなるタンパク質を意味する。このタンパク質は、硫酸化されたコンドロイチン鎖およびオリゴ糖に結合されており、約３３kDa（２１〜４６kDaの範囲）の分子量を有する。構造は、Clinical Biochemistry 32 (2002) 105-110でPugiaら、および先に論じた International Journal of Biochemistry & Cell BiologyのFriesおよびBlomによる2000年の論文によって示されている。ビクニンの算出された分子量は、コンドロイチン硫酸鎖（１３．５kDa）および糖側鎖（１．９kDa）の双方の存在下で３０．９kDaであって、これらの値は、ＨＩ−３０について以前に刊行された配列に基づく。
【００２６】
ウリスタチンは、ビクニンからコンドロイチン硫酸鎖を切断した結果生じた、断片および変異型については１１〜２２kDaの範囲を伴う、約１７kDaの単量体分子量を有する。ウリスタチンの算出された分子量は、１７．４kDaであって、コンドロイチン硫酸鎖（１３．５kDa）を欠き、これらの値は、ＨＩ−３０について以前に刊行された配列に基づく。
【００２７】
ウリスタチン１および２は、クーニッツ型インヒビタードメイン１または２のいずれかを含み、それぞれ、断片および変異型について２〜９kDaの範囲を伴う約６kDaの単量体分子量、ならびに断片および変異型について２〜１２kDaの範囲を伴う約８．５kDaの単量体分子量を有する、ウリスタチンのタンパク質断片を意味する。ウリスタチン１および２の算出された分子量は、それぞれ、５．９kDaおよび８．５kDaであって、これらの値は、ＨＩ−３０について以前に刊行された配列に基づく。
【００２８】
プロインヒビターは、尿中トリプシンインヒビターのタンパク質前駆体の非阻害性形態を意味して、Ｉ−α−ＩおよびＰ−α−Ｉのようなタンパク質を非限定的に包含する。これらの形態は、その測定された阻害活性がビクニンおよびウリスタチン形態より数倍も低いため、不活性ＵＴＩと見なされる。これらは、健康な患者および感染した患者に存在する。
【００２９】
Ｉ−α−Ｉは、二つの重鎖、代表的にはＨ1およびＨ2にコンドロイチン硫酸鎖によって結合されたビクニンを指すと理解される、インターαインヒビターを意味して、１８０〜２４０kDaの代表的な分子量を有する。Ｐ−α−Ｉは、一つの重鎖、代表的にはＨ3に結合されたビクニンを指すと理解される、プレαインヒビターを意味して、１２５kDaの代表的な分子量を有する。インターαインヒビターおよびプレαインヒビターの群は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４等と称する４本またはそれ以上の重（Ｈ）鎖の相異なるセットとは別個の、重鎖を有するビクニンの集合である。これらのＨ鎖は、進化の上で関連する１セットのＨ遺伝子によってコード化され、ビクニンは、α1ミクログロブリン／ビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＫ）によってコード化されている。
【００３０】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、同一であり、抗原の唯一のエピトープに自身を結合させることができるという点で、ポリクローナル抗体とは区別される。対照的に、ポリクローナル抗体は、同一ではなく、そのため、モノクローナル抗体が役に立つような精密な分析を与えることができない。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein［Nature 256:495 (1975)］の方法によって生成され得る。問題の免疫原（抗原）を、マウスに注入し、ある期間の後、この免疫原に応答して生成されたＢ細胞リンパ球を採集する。Ｂ細胞を、マウスから得られた骨髄腫細胞と組み合わせ、Ｂ細胞が骨髄腫細胞と融合するのを可能にする許す培地に導入して、ハイブリドーマを形成する。次いで、これらの融合細胞（ハイブリドーマ）を、微量滴定プレートの別個のウエルに入れ、モノクローナル抗体を産生するよう増殖させる。モノクローナル抗体を試験して、それらのいずれが、問題の抗原を検出するのに適切であるかを決定する。選別した後、モノクローナル抗体は、細胞培養でか、ハイブリドーマをマウスに注入することによって増殖させることができる。
【００３１】
好ましいモノクローナル抗体の生成および分離
マウスに、分析上の標的として精製したＵＴＩを注入する。抗体産生細胞を、動物から取り出す。抗体産生細胞を、培養中に持続的に増殖して、ハイブリドーマを形成する細胞と融合させる。単一のハイブリドーマは、唯一の抗体を産生する。単一のハイブリドーマは、分裂して、すべてが同じ「モノクローナルな」抗体を生成する、「クローン」の大集団を形成する。生ハイブリドーマを、液体窒素中で無期限に凍結させる。
【００３２】
モノクローナル抗体を調製するために本発明者らが用いた、特定の手順は、実施例中に詳しく記載されている。当業者には、これらの手順は、変更または増補することができ、本発明の範囲を限定すると見なされてはならないことが理解されると思われる。たとえば、ハイブリドーマを生成させる感作および融合のプロトコルの双方のその他の手法は、モノクローナル抗体の分野の作業者に周知である。
【００３３】
本発明は、一種類またはそれ以上のＵＴＩに結合することができ、かつ完全な分子の、その後にＵＴＩの分解が生じたならば、特定の断片上に出現する、特定のエピトープに優先的に結合することができるその能力を根拠に選別された、モノクローナル抗体を含む。
【００３４】
生物学的流体、たとえば尿中のトリプシンインヒビターの検出
選択的なモノクローナル抗体を特定したならば、それらを、慣用の手順によって増殖させ、ＥＬＩＳＡ試験、または感染および／または炎症に特徴的であるＵＴＩの存在を検出するための、先に記載された、その他のいかなる免疫アッセイの手法にも用いてよい。
【００３５】
ＥＬＩＳＡは、抗原を検出するための非常に敏感な方法を提供する。抗原ダウンＥＬＩＳＡでは、微量滴定プレートに、特定の抗原を含有すると思われるサンプルを与える。プレートへ抗原を吸着させ、結合しなかったすべての材料を洗い落とした後、モノクローナル抗体を加え、抗原に結合できるようにインキュベートし、過剰なものを洗い落とす。加えたモノクローナル抗体は、多数の手法によって読み取られるシグナルの発生を許すための、リポーター分子で既に標識化されていてよい。あるいは、抗体に結合できるリガンド（たとえば、リポーター分子に結合した抗マウス抗体）を加える。過剰量の酵素結合リガンドを洗い落とした後、必要ならば、色素原またはその他の基質を加え、発色した色を、存在する抗原の量の指標として用いる。
【００３６】
本発明の抗体を適用するのに用いることができるような、様々な免疫アッセイ法、たとえば、微粒子捕捉免疫アッセイ（ＭＩＣ）、ラテックス凝集阻害（ＬＡＩ）、固相クロマトグラフィー（ＩＣ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光結合アッセイ（ＦＩＡ）、発光結合アッセイ（ＬＩＡ）、希土類金属標識アッセイ、化学発光アッセイ（ＣＬＡ）、ならびに着色ラテックス粒子およびコロイド状金のような光学的色彩標識アッセイ（ＯＡ）が存在する。電流測定、抵抗測定および電圧測定による検出法に基づく、電気化学的シグナル変換器（ＥＳＴ）を用いることも、実施可能である。
【実施例１】
【００３７】
モノクローナル抗体の調製
SciPac Ltd., Sittingbourne, Kent（英国）によって腎臓患者から得られた、製品コードＰ２５０−１なる精製ＵＴＩ１００μg／マウスで、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを感作して、応答を生じさせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された限りでの免疫原の組成は、１５〜２０％の１７kDa、５０〜５５％の３５kDa、および２５〜３０％の６０〜８０kDaであって、多少の材料は、２〜１２kDaの範囲内にあった。１ヶ月後、各マウスから眼出血を採取し、ＥＬＩＳＡによって免疫原に対して滴定して、免疫応答を査定した。最高の応答を示すマウスを、１００μg／マウスの注入によって免疫原で追加刺激した。４日後、マウスを殺処分し、その脾臓を、KohlerおよびMilstein［Nature 256:495 (1975)］の方法による融合に用いた。脾臓細胞を、脾臓細胞対骨髄腫細胞の５：１の比率を有するＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を用いて、ＳＰ２−０Ａｇ１４なる骨髄腫細胞と融合させ、５０％ＰＥＧ／ＨＡＴの成長培地を用いて、９６ウェルプレートに播種した。３７℃で７〜１０日のインキュベートの後、融合培養体を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選別法を用い、３〜４日ごとに栄養補給することによって追跡し、次いで、ＨＡＴ成長培地で継代培養した。
【００３８】
２〜３週間後、ハイブリドーマコロニーの成長を有するウエルを、ＥＬＩＳＡによって試験して、どの成長がウリスタチンペプチドに対する抗体免疫応答を生起したかを決定した。９６ウェルプレートの培養体を、１μg/ml被覆プレートにてウリスタチンペプチドで試験した。プレートを２〜８℃で終夜被覆した後、すべてのプレートを、洗浄かつ遮断した。次いで、細胞培養上清を、室温で１時間、１ウエルあたり１００μg塗布した。プレートを洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼを、１：２０００の希釈にて１時間、１ウエルあたり１００μlで塗布した。再びプレートを洗浄し、次いで、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）なる基質を与え、Spectra Maxなるプレートリーダー上で、４９０nmについて読み取った。
【００３９】
陽性の応答を示すコロニーを、２４ウェルプレートに移して、更に展開し、陽性の結果を得るために再試験した。陽性を試験するコロニーを、６ウェルプレート内で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco Medium：ＩＭＤＭ）中で更に展開した。展開後、コロニーを−７０℃で凍結させ、次いで、長期間の貯蔵のために液体窒素に移した。
【００４０】
精製ＵＴＩを用いたＥＬＩＳＡの結果に基づき、様々なクローンを、ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ中で更に展開し、凍結させた。
【実施例２】
【００４１】
ポリクローナル抗体のスクリーニング手順
精製ＵＴＩに対して誘発したウサギポリクローナル抗体はＵＴＩの与えられたいかなる形態にも非特異的であると予測されたため、この抗体をスクリーニング工程に用いた。感染症を有する３名の患者、および健康な２名の対照からの血清および尿試料を、これらのポリクローナル抗体を用いた、ウエスタンブロット分析によって特徴付けした。ウエスタンブロット分析は、商業的なプレキャストゲルシステム（Invitrogen, San Diego, CA）を用いた。尿および血漿試料を、１レーンあたり１μgおよび５μlで装荷した。ウエスタンブロットは、WesternBreeze（登録商標）なる発色性免疫検出キット（Invitrogenより）を用い、製造者の教示に従って染色した。ウサギ抗ＵＴＩ抗血清は、１：２５０，０００の希釈でウエスタンブロット分析における一次抗体として用いた（表１参照）。これらのウエスタンブロット分析の結果は、ウサギポリクローナル抗血清がウリスタチン、ビクニン、ＡＭＢＫ、ＴＨＰ、Ｐ−α−ＩおよびＩ−α−Ｉを検出することを立証した。ＴＨＰの交差反応性は、予想外であり、おそらく尿中トリプシンインヒビターとＴＨＰとの間の共通ペプチド配列によるものと思われる。
【００４２】
【表１】
【００４３】
これらのウエスタンブロット試験は、ウリスタチンが、罹患した患者を健康な対照から、ビクニン、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−Ｉ、ＡＭＢＫおよびＴＨＰより充分に識別できることも立証した。すべての患者および対照は、尿中にＴＨＰがあった。同様に、すべて、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−ＩおよびＡＭＢＫが血漿中にあった。結果は、ビクニンが、感染症を有する患者３名の尿中に、しかし対照被験者１名の尿中にも見出されたことを示した。本発明者らは、ウリスタチンを、患者３名のすべてに見出したが、対照被験者のいずれにも見出さなかった。また、本発明者らは、一患者のウリスタチンの顕著な上昇を見出した。結果は、ＡＭＢＫが、感染症を有する患者３名の尿中に、しかし対照被験者１名の尿中にも見出されたことを示した。これは、ＵＴＩの特定の形態が、一定の患者では他の者より深く疾患に関連することができるとの本発明者らの考えを裏付ける。ここで、ビクニンおよび特にウリスタチンは、容易に腎臓に進入するために、プロインヒビターＩα−ＩおよびＰ−α−Ｉよりはるかに低い濃度で血中に存在することに注目すべきである。プロインヒビターは、腎臓から尿へと有意な量で通過することはないので、血中よりも、尿中にウリスタチンおよびビクニンを検出することを容易にする。ＴＨＰは、腎臓の近位尿細管に排出され、そのため、腎臓を通過することを必要とせず、試験された患者および対照における存在によって立証されるとおり、尿中の最も一般的なタンパク質である。ポリクローナル方の高い交差反応性は、血中または尿中のビクニンもしくはウリスタチンの相対的に低い濃度の検出を許さない。
【００４４】
尿中トリプシンインヒビターの存在は、数多くの疾患で深い意味があることが示されている。これらの疾患は、感染症（肺炎、尿路感染症、上部呼吸路感染症、新生児敗血症、髄膜炎、虫垂炎、細菌感染症、骨および関節感染症）、急性炎症（外傷、腎結石、外科的外傷、心肺バイパス、心筋梗塞および火傷）、慢性炎症（関節リウマチ、肺気腫、炎症性腸疾患、膵炎、クローン病、および心血管疾患に関する危険因子として）、新生物（白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンスリンパ腫、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、大腸癌）および腎臓疾患を包含する。
【００４５】
臨床的価値は、ある方法についての、疾患における方がより優勢である尿中トリプシンインヒビターの形態を検出できる能力によって査定される。また、尿ばかりでなく血中でも機能できる方法は、更なる臨床的価値を有すると思われる。血液は、一貫した結果を与える臨床研究室の分析に好ましい流体であるが、尿は、看護の現場での非侵襲的なサンプル採取をするのに好ましい流体である。
【００４６】
したがって、ＵＴＩの特定の形態のみ、たとえば、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−ＩまたはＴＨＰではなく、ウリスタチン、ビクニンおよびＡＭＢＫを検出するにすぎない免疫アッセイは、臨床的な効用を有すると思われる。本発明者らの試験の結果は、検出可能なＰ−α−ＩまたはＩ−α−Ｉは、対照および患者からの尿中には皆無であったが、すべての血漿試料中に存在したことも示した。血中の支配的な帯域は、患者および対照の双方で、６３kDaのＡＭＢＫ、１１５〜１２５kDaのＰ−α−Ｉ、および２２０kDaのＩ−α−Ｉにほぼ相当した。
【００４７】
すべてのモノクローナル抗体クローンを、実施例１に記載した手順を用いたＥＬＩＳＡアッセイでＵＴＩに結合できる能力、ならびに表１に記載した患者および健康体の試料を用いた抗体についてのウエスタンブロット試験で観察されたパターンに基づいてスクリーニングした。抗体を、パターンの類似性によって三群に類別し、各群の最も代表的な抗体を、ＵＴＩ標準に対するＥＬＩＳＡ試験に基づいて選別した。更なる研究のためのクローンの選別は、下記のとおり、群Ａ：４２１−３Ｇ５から、群Ｂ：４２１−５Ｇ８から、および群Ｃ：４２０−５Ｄ１１からであった。選ばれた母コロニーについて、細胞培養上清を、限界希釈法を用いて２回クローニングして、抗体がモノクローナルであることを確認した。これらのモノクローナル抗体をイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、３０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に分泌するハイブリドーマを、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、ＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４、ＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６およびＡＴＣＣ４２０−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１と名付けた。
【実施例３】
【００４８】
精製ウリスタチンおよびビクニン標準に対するモノクローナル抗体の特徴付け
尿中トリプシンインヒビターは、本発明者らの研究のためにSciPac Ltd.（Sittingbourne, Kent、英国）が製造した（製品コード：Ｐ２０５−１）。これらは、慢性腎不全の患者の尿から精製された。標準を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。本発明者らは、商業的なプレキャストゲルシステム（Invitrogen, San Diego, CA）、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴｒｉｓをＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）の泳動用緩衝液（還元性および非還元性）とともに製造者の手順に厳密に従って用いた。試料を、１レーンあたり２μgで装荷した。タンパク質の分子量の推定は、標準：すなわちMagicMark12（商標）（Invitrogen）およびSeeBlue（登録商標）Plus２（Invitrogen）の完全セットを根拠とした。タンパク質の帯域は、Colloidal Blue（登録商標）（Invitrogen）で染色した。
【００４９】
これらの試験の結果は、ＵＴＩのロット第２０−１２０号が、１５〜２０％の１７kDaタンパク質、５０〜５５％の３５kDaタンパク質、および２５〜３０％の６０〜８０kDaタンパク質を含有することを示した。ＵＴＩのロット第１２４−１１１号は、材料の約８５％を１７．４kDa帯域（ウリスタチン）として有したが、ある量のウリスタチン１（５．９kDa）、および１０〜１５％のビクニン（３０．９kDa）も含有したが、ＡＭＢＫは認められなかった。ＵＴＩのロット第８０−１１７号は、実質的に１７kDaのウリスタチンなる材料のみを含有するにすぎなかった。
【００５０】
これらの初期の結果を、以下に論じるＳＥＬＤＩの手法によって更に精緻化した。ＵＴＩのロット第２０−１２０号は、１０％の２〜１２kDaタンパク質（ウリスタチン１および２）、１５％の１７kDaタンパク質（ウリスタチン）、４５％の３５kDaタンパク質（ビクニン）、および３０％の６０〜８０kDaタンパク質（ＡＭＢＫまたはＴＨＰ）を含有することが見出された。ＵＴＩのロット第１２４−１１１号は、材料の約８０％を１７．４kDa帯域（ウリスタチン）として有したが、ある量（１０％）のウリスタチン１および２（５．９kDa）も含有したが、ＡＭＢＫは存在することが認められなかった。ＵＴＩのロット第８０−１１７号は、実質的に１７kDaのウリスタチンという材料、および２％未満のその他の分子量範囲のみを含有するにすぎなかった。
【００５１】
対照についての尿サンプルを、実施例１に記載のＥＬＩＳＡによって、実施例２で選んだ三種類のモノクローナル抗体、およびヤギ抗マウス二次抗体結合体を用いて検定した。Ａ群のクローン４２１−３Ｇ５、群Ｂのクローン４２１−５Ｇ８、および群Ｃのクローン４２０−５Ｄ１１についての結果を、表２に示し、対照としてのポリクローナル抗体と比較した。
【００５２】
ＯＰＤ基質によって発色させた色でなされた測定は、直前に記載した標準中の、ＵＴＩに結合したモノクローナル抗体の量を示して、その含量を、ウエスタンブロット法およびＳＥＬＤＩを用いた分子量によって決定した。値を、ポリクローナル抗体の値を用いて正規化し、下表に、ポリクローナル抗体の結果に対する百分率として提示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
モノクローナル抗体４２１−５Ｇ８は、ＵＴＩのロット第１２４−１１１号に強く、第２０−１２０号に同様な程度で、しかしロット第８０−１１７号には弱くのみ結合した。これは、双方のロットでは２〜１２kDaの材料（ウリスタチン１または２）に結合するが、１７kDaの材料（ウリスタチン）のみを含有するにすぎないロット第８０−１１７号では結合しないことと一致すると思われる。したがって、この抗体は、ビクニンおよびウリスタチンよりウリスタチン１または２に特異的であると思われる。機序に制約されたくはないが、このモノクローナル抗体による結合は、硫酸化されたコンドロイチン鎖からは生じないと考えられるが、それはこれらの部分が、抗体に対して高い抗原親和性を保有することが公知だからである。この結合は、阻害性アミノ酸配列に対して直接的であると考えられる。
【００５５】
モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１は、ＵＴＩのロット第２０−１２０号に強く、ロット第１２４−１１１号には非常に弱く結合し、ロット第８０−１１７号には結合しなかった。これは、ロット第２０−１２０号のみがこの材料を大量に含有するにすぎないために、ロット第２０−１２０号で８０kDaの材料（ＴＨＰ）に結合することと一致する。この抗体が、ウリスタチンまたはビクニンにも特異的であるならば、約６５％のウリスタチンを含有するロット第１２４−１１１号に強く応答することが予測されるはずである。機序に制約されたくはないが、このモノクローナル抗体による結合は、ＴＨＰとビクニンまたはウリスタチンとの共通アミノ酸領域からは生じないと考えられる。配列の合致照合は、ウリスタチン１および２のドメインにおける、これが可能であるのに充分な相同性を示した。
【００５６】
モノクローナル抗体４２１−３Ｇ５は、すべてのＵＴＩのロットに強く、また非特異的ポリクローナル抗体にも同様に結合したが、Ｐ−α−ＩおよびＩ−α−Ｉに対しては反応性を欠くことが注目すべき例外であった。したがって、４２１−３Ｇ５は、総ＵＴＩの尺度になると思われる。
【実施例４】
【００５７】
臨床試料によるモノクローナル抗体の試験
尿サンプルを、細菌感染を有する患者、およびそのような感染症がない対照患者から得た。感染症なしの患者は、「群１」の患者である。研究に含ませるのに、本発明者らは、陰性の尿および血液培養（１０5個の生物／ml）、ならびに正常血の白血球数（ＣＢＣ）のみを必要とした。患者の第二の群（「群２」）は、上部呼吸路または尿路のいずれかに感染症を有するものを含み、陽性の完全な血球数（ＣＢＣ）に全体として基づいて結論した。すべての患者および対照から、清浄捕捉中間尿の採集を得た。試料は、試験するまで４℃で貯蔵したが；２４時間以内に試験されない場合、試験するまで、貯蔵は−７０℃にて貯蔵された。すべての被験者について、常に、尿沈渣の評価、グラム染色、および尿の微生物学的培養を収集当日に実施した。本発明者らは、群２から、ＥＤＴＡ抗凝固化血を採集し、ＣＢＣ、高感度ＣＲＰ（Dade Behring、Ｃ反応性タンパク質についての免疫アッセイ）試験、および血液培養を実施し、これらのすべての試験を、血液採集の当日に実施した。
【００５８】
尿サンプルは、実施例２と同じポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイによっても検定した。抗体を、高結合性微量滴定プレート（ＰＮ３６９０、Corning Life Sciences, Acton, MA）のポリスチレン膜に固定し、次いで、ウエルを、Super Block（Pierce Chem. Co., Rockford, IL）で被覆して、以後の添加物がプレートに直接付着しないことを確保し、次いで、各患者からの尿サンプルに接触させて、サンプル中のＵＴＩに抗体を結合した。ＵＴＩ−抗体複合体を、アルカリホスファターゼに結合した第二抗体（ヤギ抗ウサギ抗体）と反応させ、次いで、未結合抗体をＴＢＳ／２％トゥイーン２０（ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液、Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY）で洗い落とし、固定化された抗体を、ジエタノールアミン緩衝液（Pierce Chem Co.）を加えると４０５nmでの吸光（黄色）を形成する、ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、二ナトリウム塩）の加水分解によって、プレート上でアルカリホスファターゼを決定することによって検定した。吸光は、分光光学用微量滴定プレート読取り装置（SpectroMax, Molecular Devices Corporations, Sunnyvale, CA）によって測定した。
【００５９】
三つの対照尿サンプルは、５１．４μg/ml、２７．９μg/mlおよび２４．８μg/mlのＵＴＩタンパク質（ビクニン、ウリスタチンおよびＡＭＢＫ）を含有するが、細菌感染症を有する患者からの二つのサンプルは、１４８μg/mlおよび４９．５μg/mlを含有することが見出された。この結果は、ポリクローナル抗体が、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−ＩおよびＴＨＰなるタンパク質と、望みの測定されたタンパク質であるビクニン、ウリスタチンおよびＡＭＢＫとの間の交差反応性によって予測されたとおり、健康な対照から、感染症を有する患者を貧弱にしか分離しないという、以前のウエスタンブロット試験の所見を確認するものである。
【００６０】
患者の尿および血漿中のＵＴＩの測定は、直接法、およびモノクローナル抗体、たとえば表２に示したものを用いる間接的な減算法によって、個別にすることができる。直接法の例として、尿または血液試料のいずれかの中のウリスタチン１もしくは２は、存在するもう一つのＵＴＩ、ＴＨＰおよびプロインヒビター上のクローン４２１−５Ｇ８によって直接測定することができる。更なる直接法更なる例では、尿または血液試料のいずれかの中のべてのＵＴＩ（ＩＵＴＩ）は、クローン４２１−３Ｇ５によって直接測定することができるが、プロインヒビターではできない。間接法の一例は、ＵＴＩの合計測定からの、特定の結果の一つまたはそれ以上の減算であると思われる。たとえば、患者１の尿中のビクニンを測定するには、ウリスタチン１または２を、クローン４２１−５Ｇ８で直接測定し、総ＩＵＴＩ４２１−３Ｇ５から減算して、ビクニンおよびＡＭＢＫの量に到達することであると思われる。加えて、ＴＨＰに対するいかなる交差反応性も、クローン４２０−５Ｄ１１によって直接測定することができ、ＴＨＰに対して交差反応性を有するＵＴＩ抗体、たとえばポリクローナル抗体から減算して、ＵＴＩの量に到達することができよう。合計測定は、上に論じたようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体クローン４２１−３Ｇ５または酵素阻害法によって実施することができよう。ポリクローナル抗体の場合、この合計は、プロインヒビターの量によって左右され、そのため、モノクローナル抗体クローン４２１−３Ｇ５または酵素阻害法は、好ましい、またはプロインヒビターの結果による減算による補正を用いることができよう。
【実施例５】
【００６１】
実施例３では、三種類のモノクローナル抗体を、精製ＵＴＩの三ロットに対するそれらの応答について試験した。本例は、追加の１６種類のモノクローナル抗体と併用した同じモノクローナル抗体を報告する。結果を図１および２に、一連の棒グラフで示す。
【００６２】
精製ＵＴＩの同じ三ロットを用いた。ＵＴＩのロット第２０−１２０号は、１０％の２〜１２kDaタンパク質（ウリスタチン１および２）、１５％の１７kDaタンパク質（ウリスタチン）、４５％の３５kDaタンパク質（ビクニン）、および３０％の６０〜８０kDaタンパク質（ＡＭＢＫまたはＴＨＰ）を含有した。ＵＴＩのロット第１２４−１１１号は、物質の約８０％を１７．４kDa帯域（ウリスタチン）として有したが、ある量（１０％）のウリスタチン１および２（５．９kDa）、ならびに１０％のビクニン（３０．９kDa）も含有したが、ＡＭＢＫは存在することが認められなかった。ＵＴＩのロット第８０−１１７号は、実質的に１７kDaのウリスタチンという物質、および２％未満のその他の分子量範囲のみを含有するにすぎなかった。
【００６３】
実質的に１７kDaの物質のみを含有するにすぎないロットは、概して、低および高分子量の種を含有するようなロットより弱く結合することを認めることができる。しかし、追加的なモノクローナル抗体は、３ロットのすべてに、ポリクローナル抗体の対照（たとえば４２１−１Ｄ１１、５２１−５Ｂ９および４２１−２Ｄ５）のそれと同様にして結合することが見出され、４２１−３Ｇ５に類似すると予測されると思われた。いくつかの抗体、たとえば４２１−１Ｃ１０、４２１−１Ｃ１２、４２１−２Ａ１１および４２１−２Ｇ４は、４２１−５Ｇ８と同様の三ロットに結合することが見出された、注目すべき例外は、やはり、モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１で確認されたが、これは、ロット第１２４−１１１号および８０−１１７号にではなく、ロット第２０−１２０号に対する親和性を示した。モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１は、より低分子量のウリスタチン（１７kDa）およびビクニン（３５kDa）には強く結合せずに、より高分子量の物質（６０〜８０kDaのＴＨＰおよびＡＭＢＫは、この範囲内にある）を優先した。４２０−５Ｄ１１は、４２０と名付けられた融合からの唯一のモノクローナル抗体であった（その他は、融合４２１から誘導された）。その独特の挙動は、モノクローナル抗体の更なる試験を示唆して、実施例６にそれを報告する。
【実施例６】
【００６４】
融合４２０からの９種類のモノクローナル抗体を、４２０−５Ｄ１１に追加して試験した。５ロットのＵＴＩを用いた。ロット第２０−１２０号、第１２４−１１１号および第８０−１１７号を再び含ませ、ロット第９３−９０号（第１２４−１１１号に類似）および第１５７−９０号（第２０−１２０号に類似）を追加した。図３に示した結果は、モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１が、４２０−１Ｂ７、４２０−１Ｇ４および４２０−４Ｅ１１に類似していて、主として、有意量のより高分子量の物質、すなわち、ロット第２０−１２０号および第１５７−９０号に見出された６０〜８０kDaを含有するロットに結合したことを示す。その他のモノクローナル抗体は、ＵＴＩの結合を実質的に全く示さなかった。これらの実験に用いた対照は、融合４２１からのモノクローナル抗体（４２１―５Ｂ９）であって、これらのモノクローナル抗体に類似する結合プロフィール像を有するが、プロインヒビター結合性はなく、すなわち４２１−５Ｂ９のモノクローナル抗体は、ＵＴＩのロットのそれぞれに強く結合することが見出された。
【実施例７】
【００６５】
以前のＥＬＩＳＡ試験に用いた、精製された総ＵＴＩの二つのサンプル、および患者からの二つのサンプルを、三種類の代表的なモノクローナル抗体、および一つのポリクローナル抗体と反応させ、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）の技術（Ciphergen, Fermont, CaliforniaからのＰＢＳIIＳＥＬＤＩ質量分析計）を用いて分析して、抗体に結合するタンパク質を決定した。結合は、標準的なインキュベーションの手順（高結合性ＰＳ２０チップ、および低結合性ＲＳ１００チップ）を用いて、二種類の表面で測定した。シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）は、有意性の尺度として、抗体に結合した各質量について決定した。
【００６６】
質量分析法によって分析したのは、抗体と反応させた、患者４および患者５からの二つの尿サンプルであった。両患者とも、炎症に冒されていて、白血球数（完全血球数による）、Ｃ−反応性タンパク質（高感度免疫アッセイによる）ＥＳＲ（赤血球沈降速度）、検尿（１０パネルのＭＵＬＴＩＳＴＩＸ ＰＲＯなる浸漬片による）および総尿中トリプシンインヒビター（インヒビターアッセイによる）の上昇を伴った。ともに微生物学的培養によれば、患者５は、血液細菌感染（毒素血症）について陽性であり、患者４は、尿細菌感染（尿路感染）について陽性であった。
【００６７】
追った手順は、下記のように概説される：
１．５０mMＮａＨＣＯ3３μl（pH８．０）を、タンパク質チップ上の各スポットに加え、プレートで被覆して、サンプルウエルを形成した。
２．１mg/mlの抗体１μlを、各スポットに加え、保湿チャンバー内で振盪しつつ、室温で２時間インキュベートした。
３．各スポットから溶液を除去し、スポットを洗浄用緩衝液、すなわちリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋０．５％トリトン界面活性剤）５μlで２回洗浄した。
４．非結合部位を、５μlもしくは２mg/mlのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、または１Mのエタノールアミンでブロックした。
５．室温でインキュベートした後、ＢＳＡまたはエタノールアミンを廃棄した。
６．スポットを、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％トリトン）５μlで２回洗浄した。
７．ＰＢＳ５μlを、各スポットに加え、チップを、バイオプロセッサーに入れた。各ウエルに、更に１０μlのＰＢＳを加えた。
８．試験しようとするサンプル（または対照としてのＰＢＳ）１０μlを、各ウエルに加え、次いで、ウエルを密封し、４℃で終夜振盪した。
９．ウエルを、洗浄用緩衝液およびＰＢＳで２回洗浄し、次いで、室温で２分間振盪した。
１０．ウエルを、シナピン酸で飽和させた脱イオン水３００μlで２回すすいだ。
１１．抗体およびサンプルを含有するチップを、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）によって分析した。
【００６８】
４種類の抗体に関するＳＥＬＤＩの結果を、表３および４に報告する。結果は、患者のＵＴＩおよび精製サンプルに接触後の抗体に結合したタンパク質の質量である。この方法の高い感度は、ＥＬＩＳＡ法によって検出されるよりはるかに多くの形態に結合した抗体を示す。形態が豊富であることは、ＵＴＩの機能分類群に関する分子量範囲の原因となる、断片化、伸張および集合から予測された。この方法は、結合した形態を正確に特定し、標準組成によるいかなる解釈にも依拠しない。そのため、たとえ結合したタンパク質が、小さな百分率の組成であるとしても、抗体との結合が存在するならば検出されることになる。抗体結合エピトープは、典型的には、小さく、抗体が、ペプチドまたは糖タンパク質配列に、タンパク質配列の三次構造に有利になるように結合したときに２〜５kDa前後である。したがって、共通配列は、すべての変異型で反復されると予測され、すべての結合事象を検出することができるＳＥＬＤＩの能力は、非常に多くの変異型を示すことを可能にする。すべてのサンプルからの結果を併せ、ウリスタチン１または２、ウリスタチン、ビクニン、ＡＭＢＫ、ＴＨＰおよびプロインヒビターの範囲に属する、観察された分子量に従って、タンパク質の機能群によって組織化した。結合事象のシグナル対ノイズ比によって決定された限りにおいて、高い親和性、頻度または重要性を有する結合事象を、太字で示した。主要な結合事象は、太字および下線で示した。弱い結合事象は、タンパク質における変異型を記録するために、標準文字で示した。これらは、適正にフォーマット化した場合、免疫アッセイに強く影響しないような種類の非常に弱い交差反応性を表す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
質量差は、最も近い０．１kDaに丸めた。その他のピークに比して最高のシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を有するピークを報告する。低いＳ／Ｎの観察は、表から排除した。この表は、可能な形態のほとんどを表すが、すべてではない。スペクトルは、ＳＥＬＤＩ分析のためのブロック処理に用いたアルブミンのために、６６．９〜６６．６および３３．３、ならびに１３３．０〜１３３．９にもピークを示した。トリエタノールアミンを用いてチップをブロックしたときは、これらのピークは観察されなかった。
【００７２】
結果は、三種類のモノクローナル抗体が、ＵＴＩの異なるパターンを検出し、これらのパターンは、ある範囲の変異型を包含することを立証した。モノクローナル抗体は、ＵＴＩに特異的であるのに対し、ポリクローナル抗体は、両ＵＴＩおよびプロインヒビターを検出した。本発明者らは、ＳＤＳのゲル中に表されたパターンに、クローンが検出するすべての尿中トリプシンインヒビターの断片を認めることができなかった。ゲル法は、抗体が結合できるＵＴＩのすべてを報告するのに充分に敏感ではない。実際に結合した更に多くの断片を、ＳＥＬＤＩデータに示す。結合したすべての断片は、様々な患者を試験するにつれて更なる変異型が形成されると思われたため、列挙しなかった。与えられたＵＴＩとの結合の程度または強さを、その他のＵＴＩと対比して推定した。最小の断片による最強の結合は、各抗体によって結合されたエピトープの最良の表示である。ウリスタチン１または２の機能群内の低分子量の配列は、強い結合を有する最小の線形配列である。
【００７３】
精製標準および患者を用いた表３および４では、Ｍａｂ４２１−３Ｇ５に関する一次結合は、ウリスタチン１または２、ウリスタチン、ビクニンおよびＡＭＢＫに対して強く、ＴＨＰに対してははるかに弱くて、有意なプロインヒビター結合は皆無であった。Ｍａｂ４２１−５Ｇ８に関する一次結合は、ウリスタチン１または２とともにあり、ウリスタチンに対しては弱く、ＴＨＰもしくはビクニンまたはプロインヒビターに対してははるかに弱かった。Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１に関する一次結合は、ＴＨＰ、ウリスタチンおよびウリスタチン１または２に対して強く、ビクニンまたはＡＭＢＫに対しては弱かった。ポリクローナル結合は、プロインヒビターをはじめとするすべての形態とともにあった。これらの結果は、ＳＤＳゲルに基づいて予測されたとおりであった。しかし、ＳＥＬＤＩの結果は、三種類の抗体が、すべて、標準中のウリスタチン１または２に３．９で非常に強く、かつ２．８および３．５で高い親和性を有して結合することも示した。ＳＥＬＤＩの結果は、特異性を妨げるには充分強くないが、測定可能ではある、いくつかの低親和性の結合事象も示している。
【００７４】
個々の患者サンプルを用いた表４の結果は、Ｍａｂ４２１−３Ｇ５、Ｍａｂ４２１−５Ｇ８、Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１、および標準によって示されたポリクローナルに関して、同じ一次結合パターン示している。やはり、これらの結果は、ＳＤＳゲルに基づいて予測されたとおりであった。しかし、ＳＥＬＤＩの結果は、三種類の抗体が、すべて、ウリスタチン１または２、ウリスタチン、ビクニンおよびＡＭＢＫのいくつかの新たな形態に、それぞれについて予測された範囲内で強く結合することも示した。特に、２．８、５．４、７．２、１１．８、２１．１および６７．０kDaとの一次結合が、患者サンプルで観察されたが、精製された標準では観察されなかった。これは、以前に述べた理由から病理学的状態で予測された変動を立証した。精製標準におけるこれらのピークの欠如は、多くの患者のプール、および標本の１５、３０および６０kDaという目的分子量までの精製の結果である。ＳＥＬＤＩは、ポリクローナルおよびＭａｂ４２０−５Ｄ１１の場合のＴＨＰとの少なくとも多少の交差反応性も示した。
【実施例８】
【００７５】
４種類のタンパク質、すなわちヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、タム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）、α１ミクロブロブリン（α−１Ｍ）およびα１アンチキモトリプシン（α−１ＡＣＴ）を、ウリスタチンのサンドイッチＥＬＩＳＡ試験で交差反応性について試験した。これらのタンパク質は、尿中での濃度が高いこと、またはこれらの抗体を尿サンプルとともに用いたウエスタンブロット分析もしくはＳＥＬＤＩによる作業の際に、あり得る交差反応物質として示唆されたことのいずれかの理由で選んだ。交差反応性の研究は、相対的な結合を比較するのを許す、競合的構成で実施した。たとえば、ウリスタチンとの抗体の結合は、ＴＨＰとのそれより有意に強く、ウリスタチンに関するアッセイは、ＴＨＰに干渉されなかった。競合的サンドイッチＥＬＩＳＡ試験で交差反応性を有することが見出された唯一のタンパク質および抗体は、Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１およびポリクローナル抗体とのＴＨＰであった。（表５を参照されたい）。
【００７６】
【表５】
【００７７】
本発明の広義の目的は、医学的な患者の尿を、その阻害性尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）との関連によって疾患の存在を特定するために、好都合に試験する方法を提供することである。尿中のＵＴＩの存在が疾患の指標となることは、以前から注目されている。これまでは、特定のＵＴＩを一定の疾患と関連付けることは、ＵＴＩが、一般に、個別にではなく集合体として測定されることから、可能ではなかった。本発明者らは、既知の腎臓病患者の尿から単離されたＵＴＩのサンプルを用いて、モノクローナル抗体を開発し、該モノクローナル抗体を、ＵＴＩの非インヒビター前駆体の様々な断片と関連付けた。実施例が示しているとおり、該モノクローナル抗体は、ＵＴＩのサンプルに対して様々な応答を有して、それらは、一定のＵＴＩに対する優先性を特定するのを可能にすることが見出された。質量分析による追加的な調査は、ＵＴＩのサンプルの組成、およびそれらに対するモノクローナル抗体の応答に関して、入手可能な情報を拡大した。一つの重要な知見は、約２．８、３．５、３．９および５．４kDaの、より低分子量のＵＴＩ断片が、サンプル中に観察された総ＵＴＩ中の重要な構成要素であるという発見であった。この結果は、最高濃度を有するタンパク質のみを可視化するにすぎないために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験では認められず、結果的に、モノクローナル抗体によるＥＬＩＳＡ試験の結果は、完全に説明することができなかった。定型的な臨床作業に質量分析を用いることは、実用的でなく、本発明者らは、質量分析から得られた情報を、より容易に臨床的設定で用い得る、ＥＬＩＳＡ試験の結果の説明に適用した。
【００７８】
尿サンプルを試験するための提唱される手順は、下記のように概説され得る：
１．一種類またはそれ以上のＵＴＩの既知の源に対してモノクローナル抗体を用意する。
２．このモノクローナル抗体を、ＵＴＩの既知の源に対して試験し、既知分子量を有するＵＴＩに対して優先性を有することが判明したものを選別する。
３．選ばれたモノクローナル抗体を、未知量のＵＴＩを含有する尿のサンプルに加え、どのＵＴＩが存在するか、およびそれらの相対量を決定する。
４．段階３で決定されたＵＴＩを、ＵＴＩの測定された分布に関連する疾患と相関させる。
【００７９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって特定し、ＥＬＩＳＡ試験と相関させたＵＴＩは、約６６kDa（ＡＭＢＫ）、３０kDa（ビクニンまたはＨＩ−３０）、１７kDa（ウリスタチン）、５kDa（ウリスタチン１）、８kDa（ウリスタチン２）の代表的な分子量、および断片化、変動および集合のためにこれらの平均の前後で画定される範囲を有する、Ｉ−α−ＩおよびＰ−α−Ｉなる非インヒビターの断片を包含する。特に、約２〜５kDaの分子量を有する、より小さい断片が存在することも見出された。これらは、ウリスタチン１および２の断片として指定された。ここで、質量分析からは、約２．８、３．５、３．８および５．０kDaでの断片がサンプル中に存在し、抗体によって結合されると思われたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によって明確に示されることはなかった。
【００８０】
モノクローナル抗体は、特定のＵＴＩの既知の分布を有するサンプルに対するその応答で類別されると思われた。すなわち、いくらかは、有意量の２〜１２kDa断片（ウリスタチン１または２）を含有するＵＴＩサンプルに結合すると思われたが、その他は、６２、３０および１７kDaのＡＭＢＫ、ビクニン、またはウリスタチン断片の大きい断片を含有するＵＴＩサンプルに結合すると思われた。更にその他は、ビクニン、ウリスタチン断片およびＴＨＰ共通配列に結合した。三種類のモノクローナル抗体を、その群に特徴的であるとして選び、これらの抗体を、ＡＴＣＣなる寄託先に寄託した。類似の特性を有するその他のモノクローナル抗体を特定し、その挙動を、これ以上の情報を求めて実施例に報告した。
【００８１】
一定のＵＴＩに対して優先性を有する抗体を特定することの利点は、言うまでもなく、それが、ＵＴＩ断片の特定の分布を有する一定の疾患、または他の医学的問題を識別できる可能性を開くことである。一定の抗体は、一定のＵＴＩ断片との結合にか、または断片の一定の組合せに特異的であり得る。そうして、これらのモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡまたはその他のそのような試験に用いることによって、ＵＴＩのいずれが存在するか、およびそれらの相対的な比率を特定することが可能になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例５の結果を示す棒グラフである。
【図２】実施例５の結果を示す第二の棒グラフである。
【図３】実施例６の結果を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般的には、ヒトの尿中の尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）の検出に関するものである。ＵＴＩは、セリンプロテアーゼの一種またはそれ以上を阻害する。トリプシンは、セリンプロテアーゼのファミリー、すなわちトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、プラスミン、トロンビン、キモトリプシンおよびカテプシンをとりわけ包含する、酵素の一員である。インヒビターのこの群は、もっぱら、感染または炎症の際にエラスターゼが放出されるために、血中の白血球の数が増加した後に形成される。ＵＴＩは、健康な個体が産生する尿中には見出されないのが普通である。その量は、その身体が細菌感染および炎症性障害、またはとりわけ悪性腫瘍、腎疾患、心筋梗塞、肺気腫、外科的外傷および腎結石のような、その他の悪疾を有する者で増加する。
【背景技術】
【０００２】
感染および／または炎症が生じたとき、身体の応答は、好中球が放出するエラスターゼのようなセリンプロテアーゼの産生を伴う。ＵＴＩの非インヒビター形態（プロインヒビターと呼ばれる）、たとえばインターロイキンαインヒビター（Ｉ−α−Ｉ）およびプレインターロイキンαインヒビター（Ｐ−α−Ｉ）は、健康および疾患を有する者の血漿中を自由に循環する。セリンプロテアーゼは、プロインヒビターのタンパク質分解を引き起こし、低分子量のＵＴＩを活性機能へと解放する。放出された尿中トリプシンインヒビターは、セリンプロテアーゼに作用し、その後、尿中に排出される。１９０９年に発見された尿中トリプシンインヒビターは、クーニッツ（Kunitz）型プロテアーゼインヒビターであり、何年以上もＨＩ−３０、ミンギン、ウリナスタチン（Urinastatin）、セルピンおよびウリナスタチン（Ulinastatin）と名付けられてきたが、科学界では、３０Kda以下の分子量の有力な断片にちなんでビクニンなる名称に落ち着いた。ビクニンインヒビター断片のアミノ酸配列は、公知である。それは、二つのクーニッツ阻害結合ドメイン、および巨大な可変性コンドロイチン硫酸鎖を含む。International Journal of Biochemistry and Cell Biology 32 (2000) 125-137を参照されたい。
【０００３】
尿中トリプシンインヒビターの量は、いくつかの方法、たとえば酵素阻害、抗体染色、ラテックス凝集および放射免疫アッセイによって測定されているが、サンプル中のＵＴＩのすべてが測定される。インヒビターの一定の形態は、慢性的疾患の結果として生じうるものであり、より軽度の炎症を有する個体に存在するインヒビターと容易に区別されることは示されていない。その結果、ＵＴＩの診断における使用は、現在まで、感染および／または炎症の非特異的マーカーとしてのみであるにすぎない。非特異的な性質は、ＵＴＩの決定としての臨床的効用を低減し、介護士が感染の種類または部位を知る助けにならず、患者が治療を必要とする状態を一般的な軽疾から区別するのを困難にする。本発明は、そのような区別をつけることを対象とする。
【０００４】
尿サンプルのＵＴＩ含量を測定する一つの方法は、既知量のトリプシンのサンプルを加え、次いで、トリプシンが阻害された程度を測定することを含む。この手法の例は、３点の米国特許出願公開公報２００１／００５５８１６ Ａ１、２００２／０００４２１９ Ａ１および２００３／０１２５５７７ Ａ１に見出すことができる。これらの出願公開公報では、検出可能な応答を生じることができる、基質上の既知量のトリプシンを、尿サンプルに加える。基質をトリプシンによって切断して、検出可能な副生物を得る。トリプシンインヒビターが存在するならば、利用できる基質のいくらかが切断されないことから、応答は減る。したがって、存在するトリプシンの量を測定し、加えられた量に関連させて関数化することによって、ＵＴＩ含量を決定することができる。この方法は、トリプシン活性のいかなるインヒビターをも検出し、尿中に排出された、与えられたいかなるトリプシンインヒビターに対しても非特異的である。２００１年の特許出願公開公報は、サンプル中のカルシウムの干渉を阻害するのにポリカルボン酸キレート化剤を用いることを開示している。２００２年および２００３年に特許出願公開公報は、まさに記載された方法においてトリプシンに対する基質として役立つことが示された、アルギニンの特定の芳香族エステルに関する。
【０００５】
尿サンプル中のＵＴＩの量を直接決定するもう一つの方法は、尿中トリプシンインヒビターに結合する抗体の開発を含み、抗体を含む免疫アッセイ試薬の添加によって、応答シグナルを発生させる。本発明の抗体を適用するのに用いることができるような、様々な免疫アッセイ法、たとえば、微粒子捕捉免疫アッセイ（ＭＩＣ）、ラテックス凝集阻害（ＬＡＩ）、固相クロマトグラフィー（ＩＣ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光結合アッセイ（ＦＩＡ）、発光結合アッセイ（ＬＩＡ）、希土類金属標識アッセイ、化学発光アッセイ（ＣＬＡ）、ならびに着色ラテックス粒子およびコロイド状金のような光学的色彩標識アッセイ（ＯＡ）が存在する。電流測定、抵抗測定および電圧測定による検出法に基づく、電気化学的シグナル変換器（ＥＳＴ）を用いることも、実施可能である。
【０００６】
原則として、免疫アッセイは、分離工程を必要とする異種構成のものか、または分離なしの同種構成のもののいずれか、および競合的または非競合的性格のいずれかのものであることができる。異種アッセイのためには、固相を用いて、結合抗原を遊離抗原から分離することができ、またプラスチックのウエル、管、毛細管、膜、ラテックス粒子および磁性粒子を含むことができる。抗体は、検出可能な応答を直接または間接的に発生する試薬、その他の抗体もしくはその他の試薬に、様々な方式で結合またはコンジュゲート（標識化）させることもできる。免疫アッセイは、検出しようとする材料の検出上の必要に応じてサンドイッチアッセイ、二重標識アッセイ、および多重サンドイッチアッセイのような、様々な様式で、多数の、かつ異なる抗体を用いることもできる。
【０００７】
一般に、免疫アッセイ試薬は、変化を生じて、それがシグナルを発生させ、発生したシグナルの強さは、標本またはサンプル中で測定される分析対象の濃度に比例する。免疫アッセイ試薬は、指示染料、金属、酵素、重合体、抗体、界面活性剤、粒子、電気化学反応性成分、および乾燥させたか、または担体に充填したその他様々な化学物質を含有する。頻用される担体は、様々なサンプル量、摂取および輸送特性を有する、管、カップ、毛細管、小片、バイアル、紙、微量流体装置、カセット、膜または重合体である。
【０００８】
腎疾患を有する患者の尿から精製した尿中トリプシンインヒビターを接種された、ウサギから生成されたポリクローナル抗体は、健康な個体、および疾患を有する個体の双方からの、尿サンプル中の総ＵＴＩの量を測定するのに役立つ。しかし、ポリクローナル抗体は、ＵＴＩの様々な形態を相互に区別することができず、特にインターロイキンαインヒビター（Ｉ−α−Ｉ）およびプレインターロイキンαインヒビター（Ｐ−α−Ｉ）なるプロインヒビターから区別することができない。これらのタンパク質は、すべて、健康な患者に容易に存在することから、ポリクローナル抗体の交差反応性は、血液試料を用いて、罹病した患者を健康な患者から区別することの役に立たなくなる。尿試料の場合、Ｐ−α−ＩおよびＩ−α−Ｉの高い分子量は、それらが腎臓を通過し、そうしてポリクローナル抗体が、その低下した特異性にもかかわらず、より効果的であるという可能性を低くする。しかしながら、ポリクローナル抗体は、非特異的である性質のため、従来から論じられてきた一般的な酵素阻害法より効果的であると判明してはいない。ポリクローナル抗体は、尿中のすべての形態のＵＴＩに交差反応性であり、いかなる一形態にも特異的でなく、阻害性および非阻害性ＵＴＩの双方を測定すると思われる。
【０００９】
Journal of Immunoassay 1991; 12:347-69で、Trefzらは、高分子量（２４０ｋDa）のインター−α−トリプシンインヒビター（不活性プロインヒビター）で免疫されたマウスから生成されたモノクローナル抗体の、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における使用を開示している。結果は、この方法が健康個体と疾患を有する個体とを区別するのに効果的であることを示したが、それは、罹病した個体の尿中のＵＴＩレベルが、罹病していない個体のそれより高いからであった。著者らは、約２４０kDaの分子量を有するインター−α−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）は、ＩＴＩの崩壊の結果生じたと理解される、より低分子量のいくつかのペプチドを含むことに触れた。彼らのモノクローナル抗体、すなわちＩＡＴＩ５は、主要な３帯域、すなわち２４０kDa、１２０kDaおよび５０kDaの帯域を認識することが見出された。
【００１０】
２０００年７月１４日発行のJournal of Biological Chemistry、第２７５巻第２８号の２１，１８５〜２１，１９１ページに報告された論文で、小林浩らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析で約４０〜８０kDaの範囲内の分子量を有することが示されたＵＴＩの精製標品に対して、誘発したポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを比較した。誘導体は、約７kDa、３０kDaおよび６０kDaの分子量を有することが見出された。
【００１１】
Bayerが調製したＵＴＩに対するポリクローナル抗体の交差反応性の研究の際、本発明者らは、急性期の感染の際に、阻害性ビクニンの更なる崩壊が患者に発生して、両クーニッツインヒビタードメインを含み、コンドロイチン硫酸鎖を欠く、その他の阻害性ＵＴＩの形成へと導くことを発見して驚いた。このＵＴＩは、ウリスタチン（Uristatin）と呼ばれて、１７kDa以下の分子量を有した。尿中トリプシンインヒビターについてのディップスティックによる試験を報告する論文［Clinical Chemistry Acta (2004) 341:73-81］で、Pugiaらは、ディップスティックがＵＴＩに関する二形態；すなわちビクニンおよびウリスタチンの存在を記録したことを示した。彼らは、ビクニンの代表的な分子量（３０．９kDa）、およびウリスタチンの枢要な三形態を特定して、ウリスタチン１（５．９kDa）、ウリスタチン２（８．５kDa）、ならびにウリスタチンと呼ばれるウリスタチン１およびウリスタチン２の組合せ（１７．４kDa）を名付けた。ウリスタチンの形態は、すべて、コンドロイチン硫酸鎖を欠き、電気泳動によって分析したとき、患者の試料中に非常に多量であった。ウリスタチンの形態は、すべて、トリプシンファミリーのプロテアーゼに対して阻害的であり、そのため、結合するとプロテアーゼの活性部位を阻害する、二つのクーニッツ阻害性ドメインの少なくとも一つを含む。ウリスタチン１は、結合ドメイン２を含み、ウリスタチン２は、結合ドメイン１を含む。
【００１２】
更に、採集に用いられた患者の条件を考えると、ＵＴＩの代表的な分子量は、著しく変動し得ることにも触れられた。ビクニンおよびウリスタチンの更なる変動は、ペプチド構造の断片化、ペプチド配列の変動、ならびにビクニンおよびウリスタチンに結合した炭水化物配列の変動による。断片の結果として生じる分子量の変動は、ペプチド配列の切断によって生じる。炎症の際は、切断を生じることができるプロテアーゼにインヒビターが接触するため、高度の断片化が予測される。炭水化物部分の伸張および断片化も、炎症の際に、糖タンパク質が数多くの糖転移酵素およびグリコシダーゼによって代謝されて、ビクニンに結合したコンドロイチン硫酸鎖、およびウリスタチンに結合した糖鎖に非常に多くのあり得る変異型を生じるため、予測される。更なる変動は、特に炭水化物部分の会合および代謝を通じて、二量体またはより高分子のオリゴマーへの断片の集合によっても生じる。そのため、機能性ＵＴＩタンパク質は、代表的な分子量の前後の可能性のあるタンパク質の範囲を示す。
【００１３】
このスーパーファミリーの更なるタンパク質は、阻害性およびプロインヒビター形態の生合成を開始させる、前駆体タンパク質（ＡＭＢＫ）である。このタンパク質は、遺伝子が生合成を開始するためのアップレギュレーションを発信したときに、患者の血漿中に存在する。ＡＭＢＫは、ビクニンを含むが、阻害性ドメインを不活性化し、α１ミクログロブリンに結合した重鎖を欠く。インヒビターのこの形態の検出も、炎症および感染に対する身体の応答を決定するのに重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
健康な個体には見出されない特徴的な特定のＵＴＩを決定することによって、疾患の存在を検出することができる、特定の尿中トリプシンインヒビターを測定する方法に対する需要が存続している。本発明者らは、以下に詳述するとおり、特定のモノクローナル抗体を用いることによって、そのような決定を可能にする方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要約
本発明は、ヒトの疾患に特徴的な阻害性の尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）にそれ自身を結合させることができ、異種アッセイおよび同種アッセイの双方において、ＭＩＣ、ＬＡＩ、ＩＣ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＬＩＡ、ＣＬＡ、ＯＡおよびＥＳＴ（先に定義された頭字語）をはじめとする、標準的な分析手法によって検出することができる、一定のモノクローナル抗体を包含する。これらのモノクローナル抗体は、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２およびＡＭＢＫのような尿中トリプシンインヒビターの、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、タム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）、α１ミクログロブリン（α−１Ｍ）、α１アンチキモトリプシン（α−１ＡＣＴ）、ならびにＩ−α−ＩおよびＰ−α−Ｉのような非阻害性尿中トリプシンインヒビター（プロインヒビター形態）のような、その他の一般的なタンパク質の存在下での直接または間接的な測定を可能とする能力を特徴とする。
【００１６】
ＵＴＩの直接測定は、この特定のＵＴＩのみを認識する抗体をいずれにせよ用いることによって達成し得る。ＵＴＩの間接測定は、問題のもの以外のＵＴＩを認識する抗体と、および有力なＵＴＩの全部または大部分を認識する抗体との差し引きによって実施し得る。以下の実施例では、ハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６およびハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１が分泌する抗体が、尿中および血中双方のＵＴＩの量を決定するのに適切であることを示し、一方、ハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４は、交差反応性の補正、およびＵＴＩの量の決定に適切である。その他の抗体は、類似する特徴性を有することが示されることになる。
【００１７】
そのようなモノクローナル抗体は、精製されたＵＴＩを免疫原としてマウスに導入することによって生成し得る。ただ一種の抗体のみを産生する単一のハイブリドーマクローンは、KohlerおよびMilsteinの手順を実施することによって創出されている。モノクローナル抗体の特徴的な性質は、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）手法、ＥＬＩＳＡおよびその他の免疫アッセイ法を用いて研究されている。
【００１８】
もう一つの態様では、本発明は、問題の尿中トリプシンインヒビターの形態、すなわち疾患を有する者を特徴付けるそれを検出かつ測定するために、新規なモノクローナル抗体を用いる方法を包含する。モノクローナル抗体は、阻害性ＵＴＩ、たとえばビクニンおよびウリスタチン、または前駆体であるＡＭＢＫに特異的な場合に、直接測定することができる。モノクローナル抗体が二種類以上のウリスタチンに結合できるときは、二種類以上の抗体を用いることによって、問題の特定のＵＴＩの含量は、差によって決定し得る。先に参照した三種類のモノクローナル抗体は、ウリスタチンならびにウリスタチン１および２（Ｍａｂ４２１−５Ｇ８）、タム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）（Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１）、ならびに全ＵＴＩおよびＴＨＰに優先的に結合するが、プロインヒビター（４２１−３Ｇ５）には結合しないことが見出されている。
【００１９】
分析は、血液、尿、水、唾液、脊髄液、間質液、食物および血漿を非限定的に包含する、多くの生物学的流体のサンプルに対して実施し得る。血液および尿が特に問題となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
好ましい実施態様の記載
定義
文献は、酵素インヒビターに対して様々な名称を用いていることから、下記で、本明細書に用いられる用語について定義を与える。以下に考察されるＳＥＬＤＩ分析では、多くの変異型が検出されたことが見出されている。その結果、定義は、これらのインヒビターの主たる分子量ばかりでなく、ある範囲の関連する分子量のタンパク質も包含すべきと考えられる。
【００２１】
尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）は、セリンプロテアーゼを阻害するとして特定される、阻害が可能である断片ならびに変異型および集合体も含めて、ビクニン、ＨＩ−３０、ＡＭＢＫ、ウリスタチン、ウリスタチン１およびウリスタチン２を非限定的に包含する、すべてのインヒビターを意味する。
【００２２】
ＨＩ−３０は、ビクニンおよび集合体と同一であってもなくてもよい、高分子量尿中トリプシンインヒビターの断片を意味する。その単量体分子量は、３０kDaであって、断片および変異型については、２１〜４６kDaの範囲を有すると報告されている。
【００２３】
ＡＭＢＫは、三種類の結合したタンパク質、すなわちインヒビター部分（ＨＩ−３０）およびα１ミクログロブリン、ならびに２５kDaの未確認タンパク質を有し、４２〜７０kDaの範囲内で、コンドロイチン硫酸を伴って約６６kDa、コンドロイチン硫酸なしでは４２kDaの分子量を有する、プロインヒビターのタンパク質前駆体を意味する。それは、阻害性セリンプロテアーゼの生合成における機能に関係なく、本発明が目的とするＵＴＩの定義内にあると見なされる。
【００２４】
タム−ホースフォール糖タンパク質は、尿中に一般的に見出されるウロムコイドとしても公知であり、８０〜９１kDaの範囲を伴う、約８５kDaの代表的分子量を有し、その様々な断片および変異型を包含する、糖タンパク質を意味する。
【００２５】
ビクニンは、短いペプチド鎖によって結合され、ＮおよびＣ末端ポリペプチド鎖によって伸張されることができる、クーニッツ型の一つまたは二つのプロテイナーゼインヒビタードメインからなるタンパク質を意味する。このタンパク質は、硫酸化されたコンドロイチン鎖およびオリゴ糖に結合されており、約３３kDa（２１〜４６kDaの範囲）の分子量を有する。構造は、Clinical Biochemistry 32 (2002) 105-110でPugiaら、および先に論じた International Journal of Biochemistry & Cell BiologyのFriesおよびBlomによる2000年の論文によって示されている。ビクニンの算出された分子量は、コンドロイチン硫酸鎖（１３．５kDa）および糖側鎖（１．９kDa）の双方の存在下で３０．９kDaであって、これらの値は、ＨＩ−３０について以前に刊行された配列に基づく。
【００２６】
ウリスタチンは、ビクニンからコンドロイチン硫酸鎖を切断した結果生じた、断片および変異型については１１〜２２kDaの範囲を伴う、約１７kDaの単量体分子量を有する。ウリスタチンの算出された分子量は、１７．４kDaであって、コンドロイチン硫酸鎖（１３．５kDa）を欠き、これらの値は、ＨＩ−３０について以前に刊行された配列に基づく。
【００２７】
ウリスタチン１および２は、クーニッツ型インヒビタードメイン１または２のいずれかを含み、それぞれ、断片および変異型について２〜９kDaの範囲を伴う約６kDaの単量体分子量、ならびに断片および変異型について２〜１２kDaの範囲を伴う約８．５kDaの単量体分子量を有する、ウリスタチンのタンパク質断片を意味する。ウリスタチン１および２の算出された分子量は、それぞれ、５．９kDaおよび８．５kDaであって、これらの値は、ＨＩ−３０について以前に刊行された配列に基づく。
【００２８】
プロインヒビターは、尿中トリプシンインヒビターのタンパク質前駆体の非阻害性形態を意味して、Ｉ−α−ＩおよびＰ−α−Ｉのようなタンパク質を非限定的に包含する。これらの形態は、その測定された阻害活性がビクニンおよびウリスタチン形態より数倍も低いため、不活性ＵＴＩと見なされる。これらは、健康な患者および感染した患者に存在する。
【００２９】
Ｉ−α−Ｉは、二つの重鎖、代表的にはＨ1およびＨ2にコンドロイチン硫酸鎖によって結合されたビクニンを指すと理解される、インターαインヒビターを意味して、１８０〜２４０kDaの代表的な分子量を有する。Ｐ−α−Ｉは、一つの重鎖、代表的にはＨ3に結合されたビクニンを指すと理解される、プレαインヒビターを意味して、１２５kDaの代表的な分子量を有する。インターαインヒビターおよびプレαインヒビターの群は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４等と称する４本またはそれ以上の重（Ｈ）鎖の相異なるセットとは別個の、重鎖を有するビクニンの集合である。これらのＨ鎖は、進化の上で関連する１セットのＨ遺伝子によってコード化され、ビクニンは、α1ミクログロブリン／ビクニン前駆体遺伝子（ＡＭＢＫ）によってコード化されている。
【００３０】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、同一であり、抗原の唯一のエピトープに自身を結合させることができるという点で、ポリクローナル抗体とは区別される。対照的に、ポリクローナル抗体は、同一ではなく、そのため、モノクローナル抗体が役に立つような精密な分析を与えることができない。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein［Nature 256:495 (1975)］の方法によって生成され得る。問題の免疫原（抗原）を、マウスに注入し、ある期間の後、この免疫原に応答して生成されたＢ細胞リンパ球を採集する。Ｂ細胞を、マウスから得られた骨髄腫細胞と組み合わせ、Ｂ細胞が骨髄腫細胞と融合するのを可能にする許す培地に導入して、ハイブリドーマを形成する。次いで、これらの融合細胞（ハイブリドーマ）を、微量滴定プレートの別個のウエルに入れ、モノクローナル抗体を産生するよう増殖させる。モノクローナル抗体を試験して、それらのいずれが、問題の抗原を検出するのに適切であるかを決定する。選別した後、モノクローナル抗体は、細胞培養でか、ハイブリドーマをマウスに注入することによって増殖させることができる。
【００３１】
好ましいモノクローナル抗体の生成および分離
マウスに、分析上の標的として精製したＵＴＩを注入する。抗体産生細胞を、動物から取り出す。抗体産生細胞を、培養中に持続的に増殖して、ハイブリドーマを形成する細胞と融合させる。単一のハイブリドーマは、唯一の抗体を産生する。単一のハイブリドーマは、分裂して、すべてが同じ「モノクローナルな」抗体を生成する、「クローン」の大集団を形成する。生ハイブリドーマを、液体窒素中で無期限に凍結させる。
【００３２】
モノクローナル抗体を調製するために本発明者らが用いた、特定の手順は、実施例中に詳しく記載されている。当業者には、これらの手順は、変更または増補することができ、本発明の範囲を限定すると見なされてはならないことが理解されると思われる。たとえば、ハイブリドーマを生成させる感作および融合のプロトコルの双方のその他の手法は、モノクローナル抗体の分野の作業者に周知である。
【００３３】
本発明は、一種類またはそれ以上のＵＴＩに結合することができ、かつ完全な分子の、その後にＵＴＩの分解が生じたならば、特定の断片上に出現する、特定のエピトープに優先的に結合することができるその能力を根拠に選別された、モノクローナル抗体を含む。
【００３４】
生物学的流体、たとえば尿中のトリプシンインヒビターの検出
選択的なモノクローナル抗体を特定したならば、それらを、慣用の手順によって増殖させ、ＥＬＩＳＡ試験、または感染および／または炎症に特徴的であるＵＴＩの存在を検出するための、先に記載された、その他のいかなる免疫アッセイの手法にも用いてよい。
【００３５】
ＥＬＩＳＡは、抗原を検出するための非常に敏感な方法を提供する。抗原ダウンＥＬＩＳＡでは、微量滴定プレートに、特定の抗原を含有すると思われるサンプルを与える。プレートへ抗原を吸着させ、結合しなかったすべての材料を洗い落とした後、モノクローナル抗体を加え、抗原に結合できるようにインキュベートし、過剰なものを洗い落とす。加えたモノクローナル抗体は、多数の手法によって読み取られるシグナルの発生を許すための、リポーター分子で既に標識化されていてよい。あるいは、抗体に結合できるリガンド（たとえば、リポーター分子に結合した抗マウス抗体）を加える。過剰量の酵素結合リガンドを洗い落とした後、必要ならば、色素原またはその他の基質を加え、発色した色を、存在する抗原の量の指標として用いる。
【００３６】
本発明の抗体を適用するのに用いることができるような、様々な免疫アッセイ法、たとえば、微粒子捕捉免疫アッセイ（ＭＩＣ）、ラテックス凝集阻害（ＬＡＩ）、固相クロマトグラフィー（ＩＣ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光結合アッセイ（ＦＩＡ）、発光結合アッセイ（ＬＩＡ）、希土類金属標識アッセイ、化学発光アッセイ（ＣＬＡ）、ならびに着色ラテックス粒子およびコロイド状金のような光学的色彩標識アッセイ（ＯＡ）が存在する。電流測定、抵抗測定および電圧測定による検出法に基づく、電気化学的シグナル変換器（ＥＳＴ）を用いることも、実施可能である。
【実施例１】
【００３７】
モノクローナル抗体の調製
SciPac Ltd., Sittingbourne, Kent（英国）によって腎臓患者から得られた、製品コードＰ２５０−１なる精製ＵＴＩ１００μg／マウスで、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを感作して、応答を生じさせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された限りでの免疫原の組成は、１５〜２０％の１７kDa、５０〜５５％の３５kDa、および２５〜３０％の６０〜８０kDaであって、多少の材料は、２〜１２kDaの範囲内にあった。１ヶ月後、各マウスから眼出血を採取し、ＥＬＩＳＡによって免疫原に対して滴定して、免疫応答を査定した。最高の応答を示すマウスを、１００μg／マウスの注入によって免疫原で追加刺激した。４日後、マウスを殺処分し、その脾臓を、KohlerおよびMilstein［Nature 256:495 (1975)］の方法による融合に用いた。脾臓細胞を、脾臓細胞対骨髄腫細胞の５：１の比率を有するＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を用いて、ＳＰ２−０Ａｇ１４なる骨髄腫細胞と融合させ、５０％ＰＥＧ／ＨＡＴの成長培地を用いて、９６ウェルプレートに播種した。３７℃で７〜１０日のインキュベートの後、融合培養体を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選別法を用い、３〜４日ごとに栄養補給することによって追跡し、次いで、ＨＡＴ成長培地で継代培養した。
【００３８】
２〜３週間後、ハイブリドーマコロニーの成長を有するウエルを、ＥＬＩＳＡによって試験して、どの成長がウリスタチンペプチドに対する抗体免疫応答を生起したかを決定した。９６ウェルプレートの培養体を、１μg/ml被覆プレートにてウリスタチンペプチドで試験した。プレートを２〜８℃で終夜被覆した後、すべてのプレートを、洗浄かつ遮断した。次いで、細胞培養上清を、室温で１時間、１ウエルあたり１００μg塗布した。プレートを洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼを、１：２０００の希釈にて１時間、１ウエルあたり１００μlで塗布した。再びプレートを洗浄し、次いで、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）なる基質を与え、Spectra Maxなるプレートリーダー上で、４９０nmについて読み取った。
【００３９】
陽性の応答を示すコロニーを、２４ウェルプレートに移して、更に展開し、陽性の結果を得るために再試験した。陽性を試験するコロニーを、６ウェルプレート内で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco Medium：ＩＭＤＭ）中で更に展開した。展開後、コロニーを−７０℃で凍結させ、次いで、長期間の貯蔵のために液体窒素に移した。
【００４０】
精製ＵＴＩを用いたＥＬＩＳＡの結果に基づき、様々なクローンを、ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ中で更に展開し、凍結させた。
【実施例２】
【００４１】
ポリクローナル抗体のスクリーニング手順
精製ＵＴＩに対して誘発したウサギポリクローナル抗体はＵＴＩの与えられたいかなる形態にも非特異的であると予測されたため、この抗体をスクリーニング工程に用いた。感染症を有する３名の患者、および健康な２名の対照からの血清および尿試料を、これらのポリクローナル抗体を用いた、ウエスタンブロット分析によって特徴付けした。ウエスタンブロット分析は、商業的なプレキャストゲルシステム（Invitrogen, San Diego, CA）を用いた。尿および血漿試料を、１レーンあたり１μgおよび５μlで装荷した。ウエスタンブロットは、WesternBreeze（登録商標）なる発色性免疫検出キット（Invitrogenより）を用い、製造者の教示に従って染色した。ウサギ抗ＵＴＩ抗血清は、１：２５０，０００の希釈でウエスタンブロット分析における一次抗体として用いた（表１参照）。これらのウエスタンブロット分析の結果は、ウサギポリクローナル抗血清がウリスタチン、ビクニン、ＡＭＢＫ、ＴＨＰ、Ｐ−α−ＩおよびＩ−α−Ｉを検出することを立証した。ＴＨＰの交差反応性は、予想外であり、おそらく尿中トリプシンインヒビターとＴＨＰとの間の共通ペプチド配列によるものと思われる。
【００４２】
【表１】
【００４３】
これらのウエスタンブロット試験は、ウリスタチンが、罹患した患者を健康な対照から、ビクニン、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−Ｉ、ＡＭＢＫおよびＴＨＰより充分に識別できることも立証した。すべての患者および対照は、尿中にＴＨＰがあった。同様に、すべて、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−ＩおよびＡＭＢＫが血漿中にあった。結果は、ビクニンが、感染症を有する患者３名の尿中に、しかし対照被験者１名の尿中にも見出されたことを示した。本発明者らは、ウリスタチンを、患者３名のすべてに見出したが、対照被験者のいずれにも見出さなかった。また、本発明者らは、一患者のウリスタチンの顕著な上昇を見出した。結果は、ＡＭＢＫが、感染症を有する患者３名の尿中に、しかし対照被験者１名の尿中にも見出されたことを示した。これは、ＵＴＩの特定の形態が、一定の患者では他の者より深く疾患に関連することができるとの本発明者らの考えを裏付ける。ここで、ビクニンおよび特にウリスタチンは、容易に腎臓に進入するために、プロインヒビターＩα−ＩおよびＰ−α−Ｉよりはるかに低い濃度で血中に存在することに注目すべきである。プロインヒビターは、腎臓から尿へと有意な量で通過することはないので、血中よりも、尿中にウリスタチンおよびビクニンを検出することを容易にする。ＴＨＰは、腎臓の近位尿細管に排出され、そのため、腎臓を通過することを必要とせず、試験された患者および対照における存在によって立証されるとおり、尿中の最も一般的なタンパク質である。ポリクローナル方の高い交差反応性は、血中または尿中のビクニンもしくはウリスタチンの相対的に低い濃度の検出を許さない。
【００４４】
尿中トリプシンインヒビターの存在は、数多くの疾患で深い意味があることが示されている。これらの疾患は、感染症（肺炎、尿路感染症、上部呼吸路感染症、新生児敗血症、髄膜炎、虫垂炎、細菌感染症、骨および関節感染症）、急性炎症（外傷、腎結石、外科的外傷、心肺バイパス、心筋梗塞および火傷）、慢性炎症（関節リウマチ、肺気腫、炎症性腸疾患、膵炎、クローン病、および心血管疾患に関する危険因子として）、新生物（白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンスリンパ腫、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、大腸癌）および腎臓疾患を包含する。
【００４５】
臨床的価値は、ある方法についての、疾患における方がより優勢である尿中トリプシンインヒビターの形態を検出できる能力によって査定される。また、尿ばかりでなく血中でも機能できる方法は、更なる臨床的価値を有すると思われる。血液は、一貫した結果を与える臨床研究室の分析に好ましい流体であるが、尿は、看護の現場での非侵襲的なサンプル採取をするのに好ましい流体である。
【００４６】
したがって、ＵＴＩの特定の形態のみ、たとえば、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−ＩまたはＴＨＰではなく、ウリスタチン、ビクニンおよびＡＭＢＫを検出するにすぎない免疫アッセイは、臨床的な効用を有すると思われる。本発明者らの試験の結果は、検出可能なＰ−α−ＩまたはＩ−α−Ｉは、対照および患者からの尿中には皆無であったが、すべての血漿試料中に存在したことも示した。血中の支配的な帯域は、患者および対照の双方で、６３kDaのＡＭＢＫ、１１５〜１２５kDaのＰ−α−Ｉ、および２２０kDaのＩ−α−Ｉにほぼ相当した。
【００４７】
すべてのモノクローナル抗体クローンを、実施例１に記載した手順を用いたＥＬＩＳＡアッセイでＵＴＩに結合できる能力、ならびに表１に記載した患者および健康体の試料を用いた抗体についてのウエスタンブロット試験で観察されたパターンに基づいてスクリーニングした。抗体を、パターンの類似性によって三群に類別し、各群の最も代表的な抗体を、ＵＴＩ標準に対するＥＬＩＳＡ試験に基づいて選別した。更なる研究のためのクローンの選別は、下記のとおり、群Ａ：４２１−３Ｇ５から、群Ｂ：４２１−５Ｇ８から、および群Ｃ：４２０−５Ｄ１１からであった。選ばれた母コロニーについて、細胞培養上清を、限界希釈法を用いて２回クローニングして、抗体がモノクローナルであることを確認した。これらのモノクローナル抗体をイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、３０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に分泌するハイブリドーマを、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、ＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４、ＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６およびＡＴＣＣ４２０−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１と名付けた。
【実施例３】
【００４８】
精製ウリスタチンおよびビクニン標準に対するモノクローナル抗体の特徴付け
尿中トリプシンインヒビターは、本発明者らの研究のためにSciPac Ltd.（Sittingbourne, Kent、英国）が製造した（製品コード：Ｐ２０５−１）。これらは、慢性腎不全の患者の尿から精製された。標準を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。本発明者らは、商業的なプレキャストゲルシステム（Invitrogen, San Diego, CA）、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴｒｉｓをＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）の泳動用緩衝液（還元性および非還元性）とともに製造者の手順に厳密に従って用いた。試料を、１レーンあたり２μgで装荷した。タンパク質の分子量の推定は、標準：すなわちMagicMark12（商標）（Invitrogen）およびSeeBlue（登録商標）Plus２（Invitrogen）の完全セットを根拠とした。タンパク質の帯域は、Colloidal Blue（登録商標）（Invitrogen）で染色した。
【００４９】
これらの試験の結果は、ＵＴＩのロット第２０−１２０号が、１５〜２０％の１７kDaタンパク質、５０〜５５％の３５kDaタンパク質、および２５〜３０％の６０〜８０kDaタンパク質を含有することを示した。ＵＴＩのロット第１２４−１１１号は、材料の約８５％を１７．４kDa帯域（ウリスタチン）として有したが、ある量のウリスタチン１（５．９kDa）、および１０〜１５％のビクニン（３０．９kDa）も含有したが、ＡＭＢＫは認められなかった。ＵＴＩのロット第８０−１１７号は、実質的に１７kDaのウリスタチンなる材料のみを含有するにすぎなかった。
【００５０】
これらの初期の結果を、以下に論じるＳＥＬＤＩの手法によって更に精緻化した。ＵＴＩのロット第２０−１２０号は、１０％の２〜１２kDaタンパク質（ウリスタチン１および２）、１５％の１７kDaタンパク質（ウリスタチン）、４５％の３５kDaタンパク質（ビクニン）、および３０％の６０〜８０kDaタンパク質（ＡＭＢＫまたはＴＨＰ）を含有することが見出された。ＵＴＩのロット第１２４−１１１号は、材料の約８０％を１７．４kDa帯域（ウリスタチン）として有したが、ある量（１０％）のウリスタチン１および２（５．９kDa）も含有したが、ＡＭＢＫは存在することが認められなかった。ＵＴＩのロット第８０−１１７号は、実質的に１７kDaのウリスタチンという材料、および２％未満のその他の分子量範囲のみを含有するにすぎなかった。
【００５１】
対照についての尿サンプルを、実施例１に記載のＥＬＩＳＡによって、実施例２で選んだ三種類のモノクローナル抗体、およびヤギ抗マウス二次抗体結合体を用いて検定した。Ａ群のクローン４２１−３Ｇ５、群Ｂのクローン４２１−５Ｇ８、および群Ｃのクローン４２０−５Ｄ１１についての結果を、表２に示し、対照としてのポリクローナル抗体と比較した。
【００５２】
ＯＰＤ基質によって発色させた色でなされた測定は、直前に記載した標準中の、ＵＴＩに結合したモノクローナル抗体の量を示して、その含量を、ウエスタンブロット法およびＳＥＬＤＩを用いた分子量によって決定した。値を、ポリクローナル抗体の値を用いて正規化し、下表に、ポリクローナル抗体の結果に対する百分率として提示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
モノクローナル抗体４２１−５Ｇ８は、ＵＴＩのロット第１２４−１１１号に強く、第２０−１２０号に同様な程度で、しかしロット第８０−１１７号には弱くのみ結合した。これは、双方のロットでは２〜１２kDaの材料（ウリスタチン１または２）に結合するが、１７kDaの材料（ウリスタチン）のみを含有するにすぎないロット第８０−１１７号では結合しないことと一致すると思われる。したがって、この抗体は、ビクニンおよびウリスタチンよりウリスタチン１または２に特異的であると思われる。機序に制約されたくはないが、このモノクローナル抗体による結合は、硫酸化されたコンドロイチン鎖からは生じないと考えられるが、それはこれらの部分が、抗体に対して高い抗原親和性を保有することが公知だからである。この結合は、阻害性アミノ酸配列に対して直接的であると考えられる。
【００５５】
モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１は、ＵＴＩのロット第２０−１２０号に強く、ロット第１２４−１１１号には非常に弱く結合し、ロット第８０−１１７号には結合しなかった。これは、ロット第２０−１２０号のみがこの材料を大量に含有するにすぎないために、ロット第２０−１２０号で８０kDaの材料（ＴＨＰ）に結合することと一致する。この抗体が、ウリスタチンまたはビクニンにも特異的であるならば、約６５％のウリスタチンを含有するロット第１２４−１１１号に強く応答することが予測されるはずである。機序に制約されたくはないが、このモノクローナル抗体による結合は、ＴＨＰとビクニンまたはウリスタチンとの共通アミノ酸領域からは生じないと考えられる。配列の合致照合は、ウリスタチン１および２のドメインにおける、これが可能であるのに充分な相同性を示した。
【００５６】
モノクローナル抗体４２１−３Ｇ５は、すべてのＵＴＩのロットに強く、また非特異的ポリクローナル抗体にも同様に結合したが、Ｐ−α−ＩおよびＩ−α−Ｉに対しては反応性を欠くことが注目すべき例外であった。したがって、４２１−３Ｇ５は、総ＵＴＩの尺度になると思われる。
【実施例４】
【００５７】
臨床試料によるモノクローナル抗体の試験
尿サンプルを、細菌感染を有する患者、およびそのような感染症がない対照患者から得た。感染症なしの患者は、「群１」の患者である。研究に含ませるのに、本発明者らは、陰性の尿および血液培養（１０5個の生物／ml）、ならびに正常血の白血球数（ＣＢＣ）のみを必要とした。患者の第二の群（「群２」）は、上部呼吸路または尿路のいずれかに感染症を有するものを含み、陽性の完全な血球数（ＣＢＣ）に全体として基づいて結論した。すべての患者および対照から、清浄捕捉中間尿の採集を得た。試料は、試験するまで４℃で貯蔵したが；２４時間以内に試験されない場合、試験するまで、貯蔵は−７０℃にて貯蔵された。すべての被験者について、常に、尿沈渣の評価、グラム染色、および尿の微生物学的培養を収集当日に実施した。本発明者らは、群２から、ＥＤＴＡ抗凝固化血を採集し、ＣＢＣ、高感度ＣＲＰ（Dade Behring、Ｃ反応性タンパク質についての免疫アッセイ）試験、および血液培養を実施し、これらのすべての試験を、血液採集の当日に実施した。
【００５８】
尿サンプルは、実施例２と同じポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイによっても検定した。抗体を、高結合性微量滴定プレート（ＰＮ３６９０、Corning Life Sciences, Acton, MA）のポリスチレン膜に固定し、次いで、ウエルを、Super Block（Pierce Chem. Co., Rockford, IL）で被覆して、以後の添加物がプレートに直接付着しないことを確保し、次いで、各患者からの尿サンプルに接触させて、サンプル中のＵＴＩに抗体を結合した。ＵＴＩ−抗体複合体を、アルカリホスファターゼに結合した第二抗体（ヤギ抗ウサギ抗体）と反応させ、次いで、未結合抗体をＴＢＳ／２％トゥイーン２０（ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液、Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY）で洗い落とし、固定化された抗体を、ジエタノールアミン緩衝液（Pierce Chem Co.）を加えると４０５nmでの吸光（黄色）を形成する、ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、二ナトリウム塩）の加水分解によって、プレート上でアルカリホスファターゼを決定することによって検定した。吸光は、分光光学用微量滴定プレート読取り装置（SpectroMax, Molecular Devices Corporations, Sunnyvale, CA）によって測定した。
【００５９】
三つの対照尿サンプルは、５１．４μg/ml、２７．９μg/mlおよび２４．８μg/mlのＵＴＩタンパク質（ビクニン、ウリスタチンおよびＡＭＢＫ）を含有するが、細菌感染症を有する患者からの二つのサンプルは、１４８μg/mlおよび４９．５μg/mlを含有することが見出された。この結果は、ポリクローナル抗体が、Ｐ−α−Ｉ、Ｉ−α−ＩおよびＴＨＰなるタンパク質と、望みの測定されたタンパク質であるビクニン、ウリスタチンおよびＡＭＢＫとの間の交差反応性によって予測されたとおり、健康な対照から、感染症を有する患者を貧弱にしか分離しないという、以前のウエスタンブロット試験の所見を確認するものである。
【００６０】
患者の尿および血漿中のＵＴＩの測定は、直接法、およびモノクローナル抗体、たとえば表２に示したものを用いる間接的な減算法によって、個別にすることができる。直接法の例として、尿または血液試料のいずれかの中のウリスタチン１もしくは２は、存在するもう一つのＵＴＩ、ＴＨＰおよびプロインヒビター上のクローン４２１−５Ｇ８によって直接測定することができる。更なる直接法更なる例では、尿または血液試料のいずれかの中のべてのＵＴＩ（ＩＵＴＩ）は、クローン４２１−３Ｇ５によって直接測定することができるが、プロインヒビターではできない。間接法の一例は、ＵＴＩの合計測定からの、特定の結果の一つまたはそれ以上の減算であると思われる。たとえば、患者１の尿中のビクニンを測定するには、ウリスタチン１または２を、クローン４２１−５Ｇ８で直接測定し、総ＩＵＴＩ４２１−３Ｇ５から減算して、ビクニンおよびＡＭＢＫの量に到達することであると思われる。加えて、ＴＨＰに対するいかなる交差反応性も、クローン４２０−５Ｄ１１によって直接測定することができ、ＴＨＰに対して交差反応性を有するＵＴＩ抗体、たとえばポリクローナル抗体から減算して、ＵＴＩの量に到達することができよう。合計測定は、上に論じたようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体クローン４２１−３Ｇ５または酵素阻害法によって実施することができよう。ポリクローナル抗体の場合、この合計は、プロインヒビターの量によって左右され、そのため、モノクローナル抗体クローン４２１−３Ｇ５または酵素阻害法は、好ましい、またはプロインヒビターの結果による減算による補正を用いることができよう。
【実施例５】
【００６１】
実施例３では、三種類のモノクローナル抗体を、精製ＵＴＩの三ロットに対するそれらの応答について試験した。本例は、追加の１６種類のモノクローナル抗体と併用した同じモノクローナル抗体を報告する。結果を図１および２に、一連の棒グラフで示す。
【００６２】
精製ＵＴＩの同じ三ロットを用いた。ＵＴＩのロット第２０−１２０号は、１０％の２〜１２kDaタンパク質（ウリスタチン１および２）、１５％の１７kDaタンパク質（ウリスタチン）、４５％の３５kDaタンパク質（ビクニン）、および３０％の６０〜８０kDaタンパク質（ＡＭＢＫまたはＴＨＰ）を含有した。ＵＴＩのロット第１２４−１１１号は、物質の約８０％を１７．４kDa帯域（ウリスタチン）として有したが、ある量（１０％）のウリスタチン１および２（５．９kDa）、ならびに１０％のビクニン（３０．９kDa）も含有したが、ＡＭＢＫは存在することが認められなかった。ＵＴＩのロット第８０−１１７号は、実質的に１７kDaのウリスタチンという物質、および２％未満のその他の分子量範囲のみを含有するにすぎなかった。
【００６３】
実質的に１７kDaの物質のみを含有するにすぎないロットは、概して、低および高分子量の種を含有するようなロットより弱く結合することを認めることができる。しかし、追加的なモノクローナル抗体は、３ロットのすべてに、ポリクローナル抗体の対照（たとえば４２１−１Ｄ１１、５２１−５Ｂ９および４２１−２Ｄ５）のそれと同様にして結合することが見出され、４２１−３Ｇ５に類似すると予測されると思われた。いくつかの抗体、たとえば４２１−１Ｃ１０、４２１−１Ｃ１２、４２１−２Ａ１１および４２１−２Ｇ４は、４２１−５Ｇ８と同様の三ロットに結合することが見出された、注目すべき例外は、やはり、モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１で確認されたが、これは、ロット第１２４−１１１号および８０−１１７号にではなく、ロット第２０−１２０号に対する親和性を示した。モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１は、より低分子量のウリスタチン（１７kDa）およびビクニン（３５kDa）には強く結合せずに、より高分子量の物質（６０〜８０kDaのＴＨＰおよびＡＭＢＫは、この範囲内にある）を優先した。４２０−５Ｄ１１は、４２０と名付けられた融合からの唯一のモノクローナル抗体であった（その他は、融合４２１から誘導された）。その独特の挙動は、モノクローナル抗体の更なる試験を示唆して、実施例６にそれを報告する。
【実施例６】
【００６４】
融合４２０からの９種類のモノクローナル抗体を、４２０−５Ｄ１１に追加して試験した。５ロットのＵＴＩを用いた。ロット第２０−１２０号、第１２４−１１１号および第８０−１１７号を再び含ませ、ロット第９３−９０号（第１２４−１１１号に類似）および第１５７−９０号（第２０−１２０号に類似）を追加した。図３に示した結果は、モノクローナル抗体４２０−５Ｄ１１が、４２０−１Ｂ７、４２０−１Ｇ４および４２０−４Ｅ１１に類似していて、主として、有意量のより高分子量の物質、すなわち、ロット第２０−１２０号および第１５７−９０号に見出された６０〜８０kDaを含有するロットに結合したことを示す。その他のモノクローナル抗体は、ＵＴＩの結合を実質的に全く示さなかった。これらの実験に用いた対照は、融合４２１からのモノクローナル抗体（４２１―５Ｂ９）であって、これらのモノクローナル抗体に類似する結合プロフィール像を有するが、プロインヒビター結合性はなく、すなわち４２１−５Ｂ９のモノクローナル抗体は、ＵＴＩのロットのそれぞれに強く結合することが見出された。
【実施例７】
【００６５】
以前のＥＬＩＳＡ試験に用いた、精製された総ＵＴＩの二つのサンプル、および患者からの二つのサンプルを、三種類の代表的なモノクローナル抗体、および一つのポリクローナル抗体と反応させ、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）の技術（Ciphergen, Fermont, CaliforniaからのＰＢＳIIＳＥＬＤＩ質量分析計）を用いて分析して、抗体に結合するタンパク質を決定した。結合は、標準的なインキュベーションの手順（高結合性ＰＳ２０チップ、および低結合性ＲＳ１００チップ）を用いて、二種類の表面で測定した。シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）は、有意性の尺度として、抗体に結合した各質量について決定した。
【００６６】
質量分析法によって分析したのは、抗体と反応させた、患者４および患者５からの二つの尿サンプルであった。両患者とも、炎症に冒されていて、白血球数（完全血球数による）、Ｃ−反応性タンパク質（高感度免疫アッセイによる）ＥＳＲ（赤血球沈降速度）、検尿（１０パネルのＭＵＬＴＩＳＴＩＸ ＰＲＯなる浸漬片による）および総尿中トリプシンインヒビター（インヒビターアッセイによる）の上昇を伴った。ともに微生物学的培養によれば、患者５は、血液細菌感染（毒素血症）について陽性であり、患者４は、尿細菌感染（尿路感染）について陽性であった。
【００６７】
追った手順は、下記のように概説される：
１．５０mMＮａＨＣＯ3３μl（pH８．０）を、タンパク質チップ上の各スポットに加え、プレートで被覆して、サンプルウエルを形成した。
２．１mg/mlの抗体１μlを、各スポットに加え、保湿チャンバー内で振盪しつつ、室温で２時間インキュベートした。
３．各スポットから溶液を除去し、スポットを洗浄用緩衝液、すなわちリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋０．５％トリトン界面活性剤）５μlで２回洗浄した。
４．非結合部位を、５μlもしくは２mg/mlのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、または１Mのエタノールアミンでブロックした。
５．室温でインキュベートした後、ＢＳＡまたはエタノールアミンを廃棄した。
６．スポットを、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％トリトン）５μlで２回洗浄した。
７．ＰＢＳ５μlを、各スポットに加え、チップを、バイオプロセッサーに入れた。各ウエルに、更に１０μlのＰＢＳを加えた。
８．試験しようとするサンプル（または対照としてのＰＢＳ）１０μlを、各ウエルに加え、次いで、ウエルを密封し、４℃で終夜振盪した。
９．ウエルを、洗浄用緩衝液およびＰＢＳで２回洗浄し、次いで、室温で２分間振盪した。
１０．ウエルを、シナピン酸で飽和させた脱イオン水３００μlで２回すすいだ。
１１．抗体およびサンプルを含有するチップを、表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）によって分析した。
【００６８】
４種類の抗体に関するＳＥＬＤＩの結果を、表３および４に報告する。結果は、患者のＵＴＩおよび精製サンプルに接触後の抗体に結合したタンパク質の質量である。この方法の高い感度は、ＥＬＩＳＡ法によって検出されるよりはるかに多くの形態に結合した抗体を示す。形態が豊富であることは、ＵＴＩの機能分類群に関する分子量範囲の原因となる、断片化、伸張および集合から予測された。この方法は、結合した形態を正確に特定し、標準組成によるいかなる解釈にも依拠しない。そのため、たとえ結合したタンパク質が、小さな百分率の組成であるとしても、抗体との結合が存在するならば検出されることになる。抗体結合エピトープは、典型的には、小さく、抗体が、ペプチドまたは糖タンパク質配列に、タンパク質配列の三次構造に有利になるように結合したときに２〜５kDa前後である。したがって、共通配列は、すべての変異型で反復されると予測され、すべての結合事象を検出することができるＳＥＬＤＩの能力は、非常に多くの変異型を示すことを可能にする。すべてのサンプルからの結果を併せ、ウリスタチン１または２、ウリスタチン、ビクニン、ＡＭＢＫ、ＴＨＰおよびプロインヒビターの範囲に属する、観察された分子量に従って、タンパク質の機能群によって組織化した。結合事象のシグナル対ノイズ比によって決定された限りにおいて、高い親和性、頻度または重要性を有する結合事象を、太字で示した。主要な結合事象は、太字および下線で示した。弱い結合事象は、タンパク質における変異型を記録するために、標準文字で示した。これらは、適正にフォーマット化した場合、免疫アッセイに強く影響しないような種類の非常に弱い交差反応性を表す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
質量差は、最も近い０．１kDaに丸めた。その他のピークに比して最高のシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を有するピークを報告する。低いＳ／Ｎの観察は、表から排除した。この表は、可能な形態のほとんどを表すが、すべてではない。スペクトルは、ＳＥＬＤＩ分析のためのブロック処理に用いたアルブミンのために、６６．９〜６６．６および３３．３、ならびに１３３．０〜１３３．９にもピークを示した。トリエタノールアミンを用いてチップをブロックしたときは、これらのピークは観察されなかった。
【００７２】
結果は、三種類のモノクローナル抗体が、ＵＴＩの異なるパターンを検出し、これらのパターンは、ある範囲の変異型を包含することを立証した。モノクローナル抗体は、ＵＴＩに特異的であるのに対し、ポリクローナル抗体は、両ＵＴＩおよびプロインヒビターを検出した。本発明者らは、ＳＤＳのゲル中に表されたパターンに、クローンが検出するすべての尿中トリプシンインヒビターの断片を認めることができなかった。ゲル法は、抗体が結合できるＵＴＩのすべてを報告するのに充分に敏感ではない。実際に結合した更に多くの断片を、ＳＥＬＤＩデータに示す。結合したすべての断片は、様々な患者を試験するにつれて更なる変異型が形成されると思われたため、列挙しなかった。与えられたＵＴＩとの結合の程度または強さを、その他のＵＴＩと対比して推定した。最小の断片による最強の結合は、各抗体によって結合されたエピトープの最良の表示である。ウリスタチン１または２の機能群内の低分子量の配列は、強い結合を有する最小の線形配列である。
【００７３】
精製標準および患者を用いた表３および４では、Ｍａｂ４２１−３Ｇ５に関する一次結合は、ウリスタチン１または２、ウリスタチン、ビクニンおよびＡＭＢＫに対して強く、ＴＨＰに対してははるかに弱くて、有意なプロインヒビター結合は皆無であった。Ｍａｂ４２１−５Ｇ８に関する一次結合は、ウリスタチン１または２とともにあり、ウリスタチンに対しては弱く、ＴＨＰもしくはビクニンまたはプロインヒビターに対してははるかに弱かった。Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１に関する一次結合は、ＴＨＰ、ウリスタチンおよびウリスタチン１または２に対して強く、ビクニンまたはＡＭＢＫに対しては弱かった。ポリクローナル結合は、プロインヒビターをはじめとするすべての形態とともにあった。これらの結果は、ＳＤＳゲルに基づいて予測されたとおりであった。しかし、ＳＥＬＤＩの結果は、三種類の抗体が、すべて、標準中のウリスタチン１または２に３．９で非常に強く、かつ２．８および３．５で高い親和性を有して結合することも示した。ＳＥＬＤＩの結果は、特異性を妨げるには充分強くないが、測定可能ではある、いくつかの低親和性の結合事象も示している。
【００７４】
個々の患者サンプルを用いた表４の結果は、Ｍａｂ４２１−３Ｇ５、Ｍａｂ４２１−５Ｇ８、Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１、および標準によって示されたポリクローナルに関して、同じ一次結合パターン示している。やはり、これらの結果は、ＳＤＳゲルに基づいて予測されたとおりであった。しかし、ＳＥＬＤＩの結果は、三種類の抗体が、すべて、ウリスタチン１または２、ウリスタチン、ビクニンおよびＡＭＢＫのいくつかの新たな形態に、それぞれについて予測された範囲内で強く結合することも示した。特に、２．８、５．４、７．２、１１．８、２１．１および６７．０kDaとの一次結合が、患者サンプルで観察されたが、精製された標準では観察されなかった。これは、以前に述べた理由から病理学的状態で予測された変動を立証した。精製標準におけるこれらのピークの欠如は、多くの患者のプール、および標本の１５、３０および６０kDaという目的分子量までの精製の結果である。ＳＥＬＤＩは、ポリクローナルおよびＭａｂ４２０−５Ｄ１１の場合のＴＨＰとの少なくとも多少の交差反応性も示した。
【実施例８】
【００７５】
４種類のタンパク質、すなわちヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、タム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）、α１ミクロブロブリン（α−１Ｍ）およびα１アンチキモトリプシン（α−１ＡＣＴ）を、ウリスタチンのサンドイッチＥＬＩＳＡ試験で交差反応性について試験した。これらのタンパク質は、尿中での濃度が高いこと、またはこれらの抗体を尿サンプルとともに用いたウエスタンブロット分析もしくはＳＥＬＤＩによる作業の際に、あり得る交差反応物質として示唆されたことのいずれかの理由で選んだ。交差反応性の研究は、相対的な結合を比較するのを許す、競合的構成で実施した。たとえば、ウリスタチンとの抗体の結合は、ＴＨＰとのそれより有意に強く、ウリスタチンに関するアッセイは、ＴＨＰに干渉されなかった。競合的サンドイッチＥＬＩＳＡ試験で交差反応性を有することが見出された唯一のタンパク質および抗体は、Ｍａｂ４２０−５Ｄ１１およびポリクローナル抗体とのＴＨＰであった。（表５を参照されたい）。
【００７６】
【表５】
【００７７】
本発明の広義の目的は、医学的な患者の尿を、その阻害性尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）との関連によって疾患の存在を特定するために、好都合に試験する方法を提供することである。尿中のＵＴＩの存在が疾患の指標となることは、以前から注目されている。これまでは、特定のＵＴＩを一定の疾患と関連付けることは、ＵＴＩが、一般に、個別にではなく集合体として測定されることから、可能ではなかった。本発明者らは、既知の腎臓病患者の尿から単離されたＵＴＩのサンプルを用いて、モノクローナル抗体を開発し、該モノクローナル抗体を、ＵＴＩの非インヒビター前駆体の様々な断片と関連付けた。実施例が示しているとおり、該モノクローナル抗体は、ＵＴＩのサンプルに対して様々な応答を有して、それらは、一定のＵＴＩに対する優先性を特定するのを可能にすることが見出された。質量分析による追加的な調査は、ＵＴＩのサンプルの組成、およびそれらに対するモノクローナル抗体の応答に関して、入手可能な情報を拡大した。一つの重要な知見は、約２．８、３．５、３．９および５．４kDaの、より低分子量のＵＴＩ断片が、サンプル中に観察された総ＵＴＩ中の重要な構成要素であるという発見であった。この結果は、最高濃度を有するタンパク質のみを可視化するにすぎないために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験では認められず、結果的に、モノクローナル抗体によるＥＬＩＳＡ試験の結果は、完全に説明することができなかった。定型的な臨床作業に質量分析を用いることは、実用的でなく、本発明者らは、質量分析から得られた情報を、より容易に臨床的設定で用い得る、ＥＬＩＳＡ試験の結果の説明に適用した。
【００７８】
尿サンプルを試験するための提唱される手順は、下記のように概説され得る：
１．一種類またはそれ以上のＵＴＩの既知の源に対してモノクローナル抗体を用意する。
２．このモノクローナル抗体を、ＵＴＩの既知の源に対して試験し、既知分子量を有するＵＴＩに対して優先性を有することが判明したものを選別する。
３．選ばれたモノクローナル抗体を、未知量のＵＴＩを含有する尿のサンプルに加え、どのＵＴＩが存在するか、およびそれらの相対量を決定する。
４．段階３で決定されたＵＴＩを、ＵＴＩの測定された分布に関連する疾患と相関させる。
【００７９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって特定し、ＥＬＩＳＡ試験と相関させたＵＴＩは、約６６kDa（ＡＭＢＫ）、３０kDa（ビクニンまたはＨＩ−３０）、１７kDa（ウリスタチン）、５kDa（ウリスタチン１）、８kDa（ウリスタチン２）の代表的な分子量、および断片化、変動および集合のためにこれらの平均の前後で画定される範囲を有する、Ｉ−α−ＩおよびＰ−α−Ｉなる非インヒビターの断片を包含する。特に、約２〜５kDaの分子量を有する、より小さい断片が存在することも見出された。これらは、ウリスタチン１および２の断片として指定された。ここで、質量分析からは、約２．８、３．５、３．８および５．０kDaでの断片がサンプル中に存在し、抗体によって結合されると思われたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によって明確に示されることはなかった。
【００８０】
モノクローナル抗体は、特定のＵＴＩの既知の分布を有するサンプルに対するその応答で類別されると思われた。すなわち、いくらかは、有意量の２〜１２kDa断片（ウリスタチン１または２）を含有するＵＴＩサンプルに結合すると思われたが、その他は、６２、３０および１７kDaのＡＭＢＫ、ビクニン、またはウリスタチン断片の大きい断片を含有するＵＴＩサンプルに結合すると思われた。更にその他は、ビクニン、ウリスタチン断片およびＴＨＰ共通配列に結合した。三種類のモノクローナル抗体を、その群に特徴的であるとして選び、これらの抗体を、ＡＴＣＣなる寄託先に寄託した。類似の特性を有するその他のモノクローナル抗体を特定し、その挙動を、これ以上の情報を求めて実施例に報告した。
【００８１】
一定のＵＴＩに対して優先性を有する抗体を特定することの利点は、言うまでもなく、それが、ＵＴＩ断片の特定の分布を有する一定の疾患、または他の医学的問題を識別できる可能性を開くことである。一定の抗体は、一定のＵＴＩ断片との結合にか、または断片の一定の組合せに特異的であり得る。そうして、これらのモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡまたはその他のそのような試験に用いることによって、ＵＴＩのいずれが存在するか、およびそれらの相対的な比率を特定することが可能になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例５の結果を示す棒グラフである。
【図２】実施例５の結果を示す第二の棒グラフである。
【図３】実施例６の結果を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患を有するヒトの体液中の尿中トリプシンインヒビターを検出するためのモノクローナル抗体であって、ＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２、ならびにそれらの断片および集合体からなる、尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）の群の少なくとも一員に優先的に結合する、抗体結合部位を含むモノクローナル抗体。
【請求項２】
該ＵＴＩがウリスタチンならびにウリスタチン１および２である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１が分泌する、請求項１記載のモノクローナル抗体
【請求項４】
該ＵＴＩがウリスタチンならびにウリスタチン１および２であり、該モノクローナル抗体が更にタム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＦ）に結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４が分泌する、請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＵＴＩであるＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチンならびにウリスタチン１および２に、そしてＴＨＰにも優先的に結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６が分泌する、請求項６記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
該体液が尿である、ＵＴＩを検出するための請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
該体液が血液である、ＵＴＩを検出するための請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）について体液を検定する方法であって、体液のサンプルを、疾患を有するヒトの体液を特徴付ける尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）に結合可能な少なくとも一種類のモノクローナル抗体に接触させ、そして結合したＵＴＩを特定する工程を含む方法。
【請求項１１】
疾患を有するヒトの尿を特徴付ける尿中トリプシンインヒビターが、ＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２、ならびにそれらの断片および集合体からなる群の一員である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるウリスタチン、ウリスタチン１および２に、そしてタム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）にも優先的に結合する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるウリスタチンならびにウリスタチン１および２に優先的に結合する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１および２に、そしてＴＨＰにも結合する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４によって分泌される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１によって分泌される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６によって分泌される、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
該ＵＴＩを免疫アッセイで特定する、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
該免疫アッセイが、本明細書で定義されるＭＲ、ＬＡＩ、ＩＣ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＣＬＡ、ＯＡおよび希土類金属標識アッセイからなる群より選ばれる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該体液が尿である、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
該体液が血液である、請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
ＵＴＩをモノクローナル抗体によって直接測定する、請求項１０記載の方法。
【請求項２３】
すべてのＵＴＩを、第一モノクローナル抗体によって測定し、第二抗体によって測定された特定のＵＴＩを、第一抗体によって測定されたＵＴＩから差し引いて、第一抗体によって見出されたが、第二抗体によっては見出されない、ＵＴＩを測定する、請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
該モノクローナル抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
該抗体がすべてのＵＴＩを測定するが、プロインヒビターを測定しない、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
該第一抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定し、該第二抗体がすべてのＵＴＩを測定し、ビクニンおよびＡＭＢＫを差によって測定する、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
該第一抗体がすべてのＵＴＩおよびＴＨＰを測定し、第二抗体がＴＨＰを測定し、ＵＴＩを差によって測定する、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）について体液を検定する方法であって、
（ａ）尿中トリプシンインヒビターを含有すると思われる体液サンプルを、基質に加える工程；
（ｂ）該（ａ）のサンプルに、疾患を有するヒトの体液を特徴付ける尿中トリプシンインヒビターに結合できるモノクローナル抗体を加える工程；
（ｃ）組み合わされた（ｂ）のモノクローナル抗体、および（ａ）の尿サンプルに、該モノクローナル抗体に結合できる、酵素に結合したリガンドを加える工程；
（ｄ）組み合わされた（ｂ）のモノクローナル抗体、（ａ）の体液サンプルおよび（ｃ）のリガンドから、該モノクローナル抗体に結合していない該リガンドの部分を洗浄する工程；
（ｅ）該モノクローナル抗体および該リガンドに結合に結合した該尿中トリプシンインヒビターの量を、該酵素との反応によってシグナルを発生できるリポーター分子を加え、発生したシグナルを該尿中トリプシンインヒビターの量と相関させることによって決定する工程；
を含む方法。
【請求項２９】
疾患を有するヒトの体液を特徴付ける該尿中トリプシンインヒビターが、ＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２、ならびにそれらの断片および集合体からなる群の少なくとも一員を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるウリスタチン、ウリスタチン１および２に、そしてタム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）にも優先的に結合する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該モノクローナル抗体がウリスタチン、ならびにウリスタチン１および２に優先的に結合する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチンならびにウリスタチン１および２に、そしてＴＨＰにも優先的に結合する、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４によって分泌される、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１によって分泌される、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６によって分泌される、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
該体液が尿である、請求項２８記載の方法。
【請求項３７】
該体液が血液である、請求項２８記載の方法。
【請求項３８】
ＵＴＩをモノクローナル抗体によって直接測定する、請求項２８記載の方法。
【請求項３９】
すべてのＵＴＩを、第一モノクローナル抗体によって測定し、第二抗体によって測定された特定のＵＴＩを、第一抗体によって測定されたＵＴＩから差し引いて、第一抗体によって見出されたが、第二抗体によっては見出されない、ＵＴＩを測定する、請求項２８記載の方法。
【請求項４０】
該抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定する、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
該抗体がすべてのＵＴＩを測定するが、プロインヒビターを測定しない、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
該第一抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定し、該第二抗体がすべてのＵＴＩを測定し、ビクニンおよびＡＭＢＫを差によって測定する、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
該第一抗体がすべてのＵＴＩおよびＴＨＰを測定し、第二抗体がＴＨＰを測定し、ＵＴＩを差によって測定する、請求項３９記載の方法。
【請求項１】
疾患を有するヒトの体液中の尿中トリプシンインヒビターを検出するためのモノクローナル抗体であって、ＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２、ならびにそれらの断片および集合体からなる、尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）の群の少なくとも一員に優先的に結合する、抗体結合部位を含むモノクローナル抗体。
【請求項２】
該ＵＴＩがウリスタチンならびにウリスタチン１および２である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１が分泌する、請求項１記載のモノクローナル抗体
【請求項４】
該ＵＴＩがウリスタチンならびにウリスタチン１および２であり、該モノクローナル抗体が更にタム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＦ）に結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４が分泌する、請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＵＴＩであるＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチンならびにウリスタチン１および２に、そしてＴＨＰにも優先的に結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６が分泌する、請求項６記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
該体液が尿である、ＵＴＩを検出するための請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
該体液が血液である、ＵＴＩを検出するための請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）について体液を検定する方法であって、体液のサンプルを、疾患を有するヒトの体液を特徴付ける尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）に結合可能な少なくとも一種類のモノクローナル抗体に接触させ、そして結合したＵＴＩを特定する工程を含む方法。
【請求項１１】
疾患を有するヒトの尿を特徴付ける尿中トリプシンインヒビターが、ＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２、ならびにそれらの断片および集合体からなる群の一員である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるウリスタチン、ウリスタチン１および２に、そしてタム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）にも優先的に結合する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるウリスタチンならびにウリスタチン１および２に優先的に結合する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１および２に、そしてＴＨＰにも結合する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４によって分泌される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１によって分泌される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６によって分泌される、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
該ＵＴＩを免疫アッセイで特定する、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
該免疫アッセイが、本明細書で定義されるＭＲ、ＬＡＩ、ＩＣ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＣＬＡ、ＯＡおよび希土類金属標識アッセイからなる群より選ばれる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該体液が尿である、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
該体液が血液である、請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
ＵＴＩをモノクローナル抗体によって直接測定する、請求項１０記載の方法。
【請求項２３】
すべてのＵＴＩを、第一モノクローナル抗体によって測定し、第二抗体によって測定された特定のＵＴＩを、第一抗体によって測定されたＵＴＩから差し引いて、第一抗体によって見出されたが、第二抗体によっては見出されない、ＵＴＩを測定する、請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
該モノクローナル抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
該抗体がすべてのＵＴＩを測定するが、プロインヒビターを測定しない、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
該第一抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定し、該第二抗体がすべてのＵＴＩを測定し、ビクニンおよびＡＭＢＫを差によって測定する、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
該第一抗体がすべてのＵＴＩおよびＴＨＰを測定し、第二抗体がＴＨＰを測定し、ＵＴＩを差によって測定する、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
尿中トリプシンインヒビター（ＵＴＩ）について体液を検定する方法であって、
（ａ）尿中トリプシンインヒビターを含有すると思われる体液サンプルを、基質に加える工程；
（ｂ）該（ａ）のサンプルに、疾患を有するヒトの体液を特徴付ける尿中トリプシンインヒビターに結合できるモノクローナル抗体を加える工程；
（ｃ）組み合わされた（ｂ）のモノクローナル抗体、および（ａ）の尿サンプルに、該モノクローナル抗体に結合できる、酵素に結合したリガンドを加える工程；
（ｄ）組み合わされた（ｂ）のモノクローナル抗体、（ａ）の体液サンプルおよび（ｃ）のリガンドから、該モノクローナル抗体に結合していない該リガンドの部分を洗浄する工程；
（ｅ）該モノクローナル抗体および該リガンドに結合に結合した該尿中トリプシンインヒビターの量を、該酵素との反応によってシグナルを発生できるリポーター分子を加え、発生したシグナルを該尿中トリプシンインヒビターの量と相関させることによって決定する工程；
を含む方法。
【請求項２９】
疾患を有するヒトの体液を特徴付ける該尿中トリプシンインヒビターが、ＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチン、ウリスタチン１、ウリスタチン２、ならびにそれらの断片および集合体からなる群の少なくとも一員を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるウリスタチン、ウリスタチン１および２に、そしてタム−ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）にも優先的に結合する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該モノクローナル抗体がウリスタチン、ならびにウリスタチン１および２に優先的に結合する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
該モノクローナル抗体が、ＵＴＩであるＡＭＢＫ、ビクニン、ウリスタチンならびにウリスタチン１および２に、そしてＴＨＰにも優先的に結合する、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｄ１１．５Ｇ８．１Ｅ４によって分泌される、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２０−５Ｇ８．１Ａ８．５Ｃ１によって分泌される、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
該モノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ４２１−３Ｇ５．４Ｃ５．３Ｂ６によって分泌される、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
該体液が尿である、請求項２８記載の方法。
【請求項３７】
該体液が血液である、請求項２８記載の方法。
【請求項３８】
ＵＴＩをモノクローナル抗体によって直接測定する、請求項２８記載の方法。
【請求項３９】
すべてのＵＴＩを、第一モノクローナル抗体によって測定し、第二抗体によって測定された特定のＵＴＩを、第一抗体によって測定されたＵＴＩから差し引いて、第一抗体によって見出されたが、第二抗体によっては見出されない、ＵＴＩを測定する、請求項２８記載の方法。
【請求項４０】
該抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定する、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
該抗体がすべてのＵＴＩを測定するが、プロインヒビターを測定しない、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
該第一抗体がウリスタチン１および／またはウリスタチン２を測定し、該第二抗体がすべてのＵＴＩを測定し、ビクニンおよびＡＭＢＫを差によって測定する、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
該第一抗体がすべてのＵＴＩおよびＴＨＰを測定し、第二抗体がＴＨＰを測定し、ＵＴＩを差によって測定する、請求項３９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５３６２０６（Ｐ２００７−５３６２０６Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３５４８０（Ｐ２００６−５３５４８０）
【出願日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２４８８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４０２２２
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０３１０６１１１）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (154)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２４８８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４０２２２
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０３１０６１１１）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (154)
【Ｆターム（参考）】
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