尿沈渣染色試薬およびその調製方法
【構成】 この発明に係る尿沈渣染色試薬は、アルシアンブルー(Alcian blue）、ピロニンＢ(PyroninＢ) 、および浸透圧上昇物質を含有した水溶液よりなるものとしている。
【効果】 この発明に係る尿沈渣染色試薬は、赤血球溶血による赤血球数の算定が不正確になるということはなく、また尿中有形成分の視認性にも優れており、日常検査に用いる尿沈渣染色試薬として有用性の高いものとなった。
【効果】 この発明に係る尿沈渣染色試薬は、赤血球溶血による赤血球数の算定が不正確になるということはなく、また尿中有形成分の視認性にも優れており、日常検査に用いる尿沈渣染色試薬として有用性の高いものとなった。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、細胞成分や円柱などの尿沈渣の染色試薬、およびその染色試薬の調製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来の尿沈渣染色試薬には、ステルンハイマー(Sternheimer) 染色試薬、変法ステルンハイマー(New Sternheimer) 染色試薬、ステルンハイマー・マルビン(Sternheimer-Malbin)染色試薬などが存在する。ステルンハイマー染色試薬は、２％ナショナルファーストブルー (National fast blue) 水溶液のＩ液と、1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液のII液とからなり、この染色試薬を調製するには、Ｉ液とII液を１：１の割合で混合していた。
【０００３】変法ステルンハイマー染色試薬は、２％アルシアンブルー(Alcian blue）水溶液のＩ液と、1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液のII液とからなり、この染色試薬を調製するには、Ｉ液とII液を２：１の割合で混合していた。ステルンハイマー・マルビン染色試薬は、クリスタル紫 3.0ｇを95％エチルアルコール 20.0ml に溶解し、これにシュウ酸アンモニウム 0.8ｇを添加して精製水 80.0ml で希釈してなるＩ液と、サフラニンＯ 0.25 ｇを95％エチルアルコール 10.0ml に溶解し、これを精製水 100.0mlで希釈してなるII液とからなり、この染色試薬を調製するには、Ｉ液とII液を３：９７の割合で混合していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ステルンハイマー染色試薬および変法ステルンハイマー染色試薬を用いた尿沈渣の染色法は、尿中有形成分の視認性に優れた有用性の高い超生体染色法であるが、いくつかの課題を有しており、その中でも赤血球溶血作用による赤血球数の算定が不正確になるという大きな課題を有していた。
【０００５】ステルンハイマー・マルビン染色試薬を用いた尿沈渣の染色法は、白血球の核の染め分けについて上記染色法より劣るという課題を有していた。また、ステルンハイマー・マルビン染色試薬の調製は、Ｉ液とII液を混合する割合が掛け離れているので、調製無駄が生じるという課題を有していた。そこで、この発明は、上記ステルンハイマー染色試薬、変法ステルンハイマー染色試薬、およびステルンハイマー・マルビン染色試薬、ならびにこれらの染色試薬を用いた尿沈渣の染色法が有する課題を解決することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明に係る尿沈渣染色試薬は、アルシアンブルー(Alcian blue）、ピロニンＢ(PyroninＢ)、および浸透圧上昇物質を含有した水溶液よりなるものとしている。前記アルシアンブルー(Alcian blue）の濃度は、約0.7 〜1.3 ％とするのが好ましく、ピロニンＢ(PyroninＢ) の濃度は、約0.4 〜0.5 ％とするのが好ましい。さらに、前記尿沈渣染色試薬水溶液のｐＨは、約5.0 とするのが好ましい。
【０００７】浸透圧上昇物質としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、単糖類、二糖類、エチレンジアミン四酢酸塩など用いることができる。エチレンジアミン四酢酸塩を用いた場合は、その濃度を約４％とすれば、尿沈渣染色の際に赤血球の浸透圧を最適な値 (280 〜285osm) に上昇させることができる。また、このエチレンジアミン四酢酸塩を用いた場合は、尿中に析出してくる塩類を溶解させることができる。
【０００８】この発明に係る尿沈渣染色試薬の調製方法は、約１〜2.0％アルシアンブルー(Alcian blue）水溶液２容量と約1.2 〜1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液１容量とを混合し、この混合溶液に約４％の割合になるようにエチレンジアミン四酢酸塩を添加し、さらにこの混合溶液のｐＨを約5.0 にしている。この発明に係る尿沈渣染色試薬の最適なｐＨとエチレンジアミン四酢酸塩の濃度を決定するに当たって、次に示す実験を行った。実験結果は、表１〜３、表４〜５、および図１に示した。
【０００９】実験１．
（実験方法）先ず、生理食塩水に健常人全血を加えた試料 100μｌに、以下に示す各サンプルを20μｌ（無染色は生理食塩水20μｌ）添加し、添加５分後、１０分後、および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝１０）により算定した。
【００１０】次に、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに、以下に示す各サンプルを20μｌ（無染色は生理食塩水20μｌ）添加し、添加１０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。
各サンプルの組成（なお、ｐＨ調節は水酸化ナトリウムにより行った）
サンプル１…ｐＨを3.65とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを２％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル２…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを２％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル３…ｐＨを6.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを２％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル４…ｐＨを3.90とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル５…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル６…ｐＨを6.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル７…ステルンハイマー染色試薬サンプル８…ステルンハイマー・マルビン染色試薬（実験結果）表１〜３、図１よりサンプル２および５は、溶血作用が少ないことが確認できた。また、表４〜５よりサンプル５は、無染色（対照）との回帰式、相関係数が最も良好であった。
【００１１】以上によりサンプル５が最適なｐＨおよびエチレンジアミン四酢酸塩の含有濃度であった。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】
【表４】
【００１６】
【表５】
【００１７】この発明に係る尿沈渣染色試薬の最適なアルシアンブルー水溶液の濃度を決定するに当たって、次に示す実験を行った。実験結果は、表６に示した。
実験２．
（実験方法）以下に示す各サンプルを１滴を日常検査の尿沈渣200 μｌに滴下し、滴下１０分後に有形成分の染色性を観察した。
【００１８】各サンプルの組成サンプル９…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、2.0 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル10…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.0 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル11…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、0.75％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル12…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、0.5 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬（実験結果）表６に示すように、白血球の核、移行上皮細胞の核、硝子円柱、粘液糸の染色性に注目して観察した結果、サンプル10が最も鏡検し易く、サンプル９が次に鏡検し易い染色性であった。また、何れのサンプルもエチレンジアミン四酢酸の添加やｐＨ調節による塩類の消失や変形、赤血球塊の形成などは顕著に観察されなかった。
【００１９】
【表６】
【００２０】
【作用】この発明に係る尿沈渣染色試薬は、尿沈渣染色に用いた場合、浸透圧上昇物質の含有により、赤血球の浸透圧を適当な値に上昇させ、赤血球の溶血作用を防止することができる。
【００２１】
【実施例】以下、この発明を実施例に基づいて、さらに詳細に説明する。
実施例１．ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、アルシアンブルーを0.67％含有し、ピロニンＢを0.5％含有した水溶液よりなる染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２２】アルシアンブルー1.0 ｇを精製水100ml に、ピロニンＢ0.75ｇを精製水50mlにそれぞれ溶解し、両溶液を混合する。この混合溶液にエチレンジアミン四酢酸二カリウム６ｇを添加する。そして、この混合溶液に少量の水酸化ナトリウムを添加し混合溶液のｐＨを5.0に調製した。上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差は認められなかった。
実施例２．ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、アルシアンブルーを1.33％含有し、ピロニンＢ水溶液を0.5 ％含有した水溶液よりなる染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２３】アルシアンブルー2.0 ｇを精製水100ml に、ピロニンＢ0.75ｇを精製水50mlにそれぞれ溶解し、両溶液を混合する。この混合溶液にエチレンジアミン四酢酸二カリウム６ｇを添加する。そして、この混合溶液に少量の水酸化ナトリウムを添加し混合溶液のｐＨを5.0に調節した。上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差は認められなかった。
比較例１．ステルンハイマー染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２４】アルシアンブルー 2.0ｇを精製水100.0ml に溶解したものをＩ液とする。ピロニンＢ 1.5ｇを精製水100.0ml に溶解したものをII液とする。そして、Ｉ液の100.0ml とII液の50.0mlを混合する。上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差が認められた。
比較例２市販のＭ社製ステルンハイマー染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差が認められた。
比較例３市販のＫ社製ステルンハイマー染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差が認められた。
比較例４．ステルンハイマー・マルビン染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２５】クリスタル紫 3.0ｇを95％エチルアルコール 20.0ml に溶解し、これにシュウ酸アンモニウム 0.8ｇを添加して精製水 80.0ml で希釈したものをＩ液とする。サフラニンＯ 0.25 ｇを95％エチルアルコール 10.0ml に溶解し、これを精製水100.0ml で希釈したものをII液とする。そして、Ｉ液の 3.0mlとII液の97.0mlを混合する。
【００２６】上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差は認められなかった。
【００２７】
【表７】
【００２８】
【表８】
【００２９】
【発明の効果】この発明に係る尿沈渣染色試薬は、尿沈渣染色に用いた場合、赤血球の溶血作用を防止することができるので、赤血球溶血による赤血球数の算定が不正確になるということはなく、また尿中有形成分の視認性にも優れており、日常検査に用いる尿沈渣染色試薬として有用性の高いものとなった。
【００３０】また、この発明に係る尿沈渣染色試薬の調製方法は、ステルンハイマー・マルビン染色試薬の調製方法と比較して調製無駄が生じないものとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明に係る尿沈渣染色試薬および従来の尿沈渣染色試薬の尿沈渣染色試料への添加経過時間と赤血球数の増減率を示すグラフである。
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、細胞成分や円柱などの尿沈渣の染色試薬、およびその染色試薬の調製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来の尿沈渣染色試薬には、ステルンハイマー(Sternheimer) 染色試薬、変法ステルンハイマー(New Sternheimer) 染色試薬、ステルンハイマー・マルビン(Sternheimer-Malbin)染色試薬などが存在する。ステルンハイマー染色試薬は、２％ナショナルファーストブルー (National fast blue) 水溶液のＩ液と、1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液のII液とからなり、この染色試薬を調製するには、Ｉ液とII液を１：１の割合で混合していた。
【０００３】変法ステルンハイマー染色試薬は、２％アルシアンブルー(Alcian blue）水溶液のＩ液と、1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液のII液とからなり、この染色試薬を調製するには、Ｉ液とII液を２：１の割合で混合していた。ステルンハイマー・マルビン染色試薬は、クリスタル紫 3.0ｇを95％エチルアルコール 20.0ml に溶解し、これにシュウ酸アンモニウム 0.8ｇを添加して精製水 80.0ml で希釈してなるＩ液と、サフラニンＯ 0.25 ｇを95％エチルアルコール 10.0ml に溶解し、これを精製水 100.0mlで希釈してなるII液とからなり、この染色試薬を調製するには、Ｉ液とII液を３：９７の割合で混合していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ステルンハイマー染色試薬および変法ステルンハイマー染色試薬を用いた尿沈渣の染色法は、尿中有形成分の視認性に優れた有用性の高い超生体染色法であるが、いくつかの課題を有しており、その中でも赤血球溶血作用による赤血球数の算定が不正確になるという大きな課題を有していた。
【０００５】ステルンハイマー・マルビン染色試薬を用いた尿沈渣の染色法は、白血球の核の染め分けについて上記染色法より劣るという課題を有していた。また、ステルンハイマー・マルビン染色試薬の調製は、Ｉ液とII液を混合する割合が掛け離れているので、調製無駄が生じるという課題を有していた。そこで、この発明は、上記ステルンハイマー染色試薬、変法ステルンハイマー染色試薬、およびステルンハイマー・マルビン染色試薬、ならびにこれらの染色試薬を用いた尿沈渣の染色法が有する課題を解決することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明に係る尿沈渣染色試薬は、アルシアンブルー(Alcian blue）、ピロニンＢ(PyroninＢ)、および浸透圧上昇物質を含有した水溶液よりなるものとしている。前記アルシアンブルー(Alcian blue）の濃度は、約0.7 〜1.3 ％とするのが好ましく、ピロニンＢ(PyroninＢ) の濃度は、約0.4 〜0.5 ％とするのが好ましい。さらに、前記尿沈渣染色試薬水溶液のｐＨは、約5.0 とするのが好ましい。
【０００７】浸透圧上昇物質としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、単糖類、二糖類、エチレンジアミン四酢酸塩など用いることができる。エチレンジアミン四酢酸塩を用いた場合は、その濃度を約４％とすれば、尿沈渣染色の際に赤血球の浸透圧を最適な値 (280 〜285osm) に上昇させることができる。また、このエチレンジアミン四酢酸塩を用いた場合は、尿中に析出してくる塩類を溶解させることができる。
【０００８】この発明に係る尿沈渣染色試薬の調製方法は、約１〜2.0％アルシアンブルー(Alcian blue）水溶液２容量と約1.2 〜1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液１容量とを混合し、この混合溶液に約４％の割合になるようにエチレンジアミン四酢酸塩を添加し、さらにこの混合溶液のｐＨを約5.0 にしている。この発明に係る尿沈渣染色試薬の最適なｐＨとエチレンジアミン四酢酸塩の濃度を決定するに当たって、次に示す実験を行った。実験結果は、表１〜３、表４〜５、および図１に示した。
【０００９】実験１．
（実験方法）先ず、生理食塩水に健常人全血を加えた試料 100μｌに、以下に示す各サンプルを20μｌ（無染色は生理食塩水20μｌ）添加し、添加５分後、１０分後、および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝１０）により算定した。
【００１０】次に、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに、以下に示す各サンプルを20μｌ（無染色は生理食塩水20μｌ）添加し、添加１０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。
各サンプルの組成（なお、ｐＨ調節は水酸化ナトリウムにより行った）
サンプル１…ｐＨを3.65とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを２％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル２…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを２％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル３…ｐＨを6.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを２％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル４…ｐＨを3.90とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル５…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル６…ｐＨを6.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.6 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.2 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル７…ステルンハイマー染色試薬サンプル８…ステルンハイマー・マルビン染色試薬（実験結果）表１〜３、図１よりサンプル２および５は、溶血作用が少ないことが確認できた。また、表４〜５よりサンプル５は、無染色（対照）との回帰式、相関係数が最も良好であった。
【００１１】以上によりサンプル５が最適なｐＨおよびエチレンジアミン四酢酸塩の含有濃度であった。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】
【表４】
【００１６】
【表５】
【００１７】この発明に係る尿沈渣染色試薬の最適なアルシアンブルー水溶液の濃度を決定するに当たって、次に示す実験を行った。実験結果は、表６に示した。
実験２．
（実験方法）以下に示す各サンプルを１滴を日常検査の尿沈渣200 μｌに滴下し、滴下１０分後に有形成分の染色性を観察した。
【００１８】各サンプルの組成サンプル９…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、2.0 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル10…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、1.0 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル11…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、0.75％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬サンプル12…ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、0.5 ％のアルシアンブルー水溶液２容量と1.5 ％のピロニンＢ水溶液１容量とを混合した染色試薬（実験結果）表６に示すように、白血球の核、移行上皮細胞の核、硝子円柱、粘液糸の染色性に注目して観察した結果、サンプル10が最も鏡検し易く、サンプル９が次に鏡検し易い染色性であった。また、何れのサンプルもエチレンジアミン四酢酸の添加やｐＨ調節による塩類の消失や変形、赤血球塊の形成などは顕著に観察されなかった。
【００１９】
【表６】
【００２０】
【作用】この発明に係る尿沈渣染色試薬は、尿沈渣染色に用いた場合、浸透圧上昇物質の含有により、赤血球の浸透圧を適当な値に上昇させ、赤血球の溶血作用を防止することができる。
【００２１】
【実施例】以下、この発明を実施例に基づいて、さらに詳細に説明する。
実施例１．ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、アルシアンブルーを0.67％含有し、ピロニンＢを0.5％含有した水溶液よりなる染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２２】アルシアンブルー1.0 ｇを精製水100ml に、ピロニンＢ0.75ｇを精製水50mlにそれぞれ溶解し、両溶液を混合する。この混合溶液にエチレンジアミン四酢酸二カリウム６ｇを添加する。そして、この混合溶液に少量の水酸化ナトリウムを添加し混合溶液のｐＨを5.0に調製した。上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差は認められなかった。
実施例２．ｐＨを5.0 とし、エチレンジアミン四酢酸二カリウムを４％含有し、アルシアンブルーを1.33％含有し、ピロニンＢ水溶液を0.5 ％含有した水溶液よりなる染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２３】アルシアンブルー2.0 ｇを精製水100ml に、ピロニンＢ0.75ｇを精製水50mlにそれぞれ溶解し、両溶液を混合する。この混合溶液にエチレンジアミン四酢酸二カリウム６ｇを添加する。そして、この混合溶液に少量の水酸化ナトリウムを添加し混合溶液のｐＨを5.0に調節した。上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差は認められなかった。
比較例１．ステルンハイマー染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２４】アルシアンブルー 2.0ｇを精製水100.0ml に溶解したものをＩ液とする。ピロニンＢ 1.5ｇを精製水100.0ml に溶解したものをII液とする。そして、Ｉ液の100.0ml とII液の50.0mlを混合する。上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差が認められた。
比較例２市販のＭ社製ステルンハイマー染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差が認められた。
比較例３市販のＫ社製ステルンハイマー染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差が認められた。
比較例４．ステルンハイマー・マルビン染色試薬を、以下のようにして調製した。
【００２５】クリスタル紫 3.0ｇを95％エチルアルコール 20.0ml に溶解し、これにシュウ酸アンモニウム 0.8ｇを添加して精製水 80.0ml で希釈したものをＩ液とする。サフラニンＯ 0.25 ｇを95％エチルアルコール 10.0ml に溶解し、これを精製水100.0ml で希釈したものをII液とする。そして、Ｉ液の 3.0mlとII液の97.0mlを混合する。
【００２６】上記染色試薬（無染色は生理食塩水20μｌ）20μｌを、濾過健常人プール尿に健常人全血を加えた試料 200μｌに添加し、添加１０分後および３０分後の赤血球数をノウバウエル計算盤（Ｎ＝２０）により算定した。算定結果は表７〜８に示した。また、添加１０分後の赤血球数が、無染色と比較して統計学的有意差（Wilcoxon検定：Ｐ＜0.05）が認められるか否かを算出したところ、統計学的有意差は認められなかった。
【００２７】
【表７】
【００２８】
【表８】
【００２９】
【発明の効果】この発明に係る尿沈渣染色試薬は、尿沈渣染色に用いた場合、赤血球の溶血作用を防止することができるので、赤血球溶血による赤血球数の算定が不正確になるということはなく、また尿中有形成分の視認性にも優れており、日常検査に用いる尿沈渣染色試薬として有用性の高いものとなった。
【００３０】また、この発明に係る尿沈渣染色試薬の調製方法は、ステルンハイマー・マルビン染色試薬の調製方法と比較して調製無駄が生じないものとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明に係る尿沈渣染色試薬および従来の尿沈渣染色試薬の尿沈渣染色試料への添加経過時間と赤血球数の増減率を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 アルシアンブルー(Alcian blue）、ピロニンＢ(PyroninＢ)、および浸透圧上昇物質を含有した水溶液よりなることを特徴とする尿沈渣染色試薬。
【請求項２】 アルシアンブルー(Alcian blue）の濃度を約0.7 〜1.3 ％、ピロニンＢ(PyroninＢ) の濃度を約0.4 〜0.5 ％としたことを特徴とする請求項１記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項３】 水溶液のｐＨを約5.0 としたことを特徴とする請求項１または２記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項４】 浸透圧上昇物質として、エチレンジアミン四酢酸塩を用いたことを特徴とする請求項１、２、または３記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項５】 エチレンジアミン四酢酸塩の濃度を約４％としたことを特徴とする請求項４記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項６】 約１〜2.0 ％アルシアンブルー(Alcian blue）水溶液２容量と約1.2 〜1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液１容量とを混合し、この混合溶液に約４％の割合になるようにエチレンジアミン四酢酸塩を添加し、さらにこの混合溶液のｐＨを約5.0 にすることを特徴とする尿沈渣染色試薬の調製方法。
【請求項１】 アルシアンブルー(Alcian blue）、ピロニンＢ(PyroninＢ)、および浸透圧上昇物質を含有した水溶液よりなることを特徴とする尿沈渣染色試薬。
【請求項２】 アルシアンブルー(Alcian blue）の濃度を約0.7 〜1.3 ％、ピロニンＢ(PyroninＢ) の濃度を約0.4 〜0.5 ％としたことを特徴とする請求項１記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項３】 水溶液のｐＨを約5.0 としたことを特徴とする請求項１または２記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項４】 浸透圧上昇物質として、エチレンジアミン四酢酸塩を用いたことを特徴とする請求項１、２、または３記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項５】 エチレンジアミン四酢酸塩の濃度を約４％としたことを特徴とする請求項４記載の尿沈渣染色試薬。
【請求項６】 約１〜2.0 ％アルシアンブルー(Alcian blue）水溶液２容量と約1.2 〜1.5 ％ピロニンＢ(PyroninＢ) 水溶液１容量とを混合し、この混合溶液に約４％の割合になるようにエチレンジアミン四酢酸塩を添加し、さらにこの混合溶液のｐＨを約5.0 にすることを特徴とする尿沈渣染色試薬の調製方法。
【図１】
【公開番号】特開平５−４０１１８
【公開日】平成５年（１９９３）２月１９日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平３−１９６４８０
【出願日】平成３年（１９９１）８月６日
【出願人】（０００１８６５８８）小林製薬株式会社 (518)
【公開日】平成５年（１９９３）２月１９日
【国際特許分類】
【出願日】平成３年（１９９１）８月６日
【出願人】（０００１８６５８８）小林製薬株式会社 (518)
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