差次的抽出のための方法および系
差次的抽出は、細胞の分離に用いることができるいくつかの抽出法を表現するために用いられる広義の用語である。少なくとも２つの異なる細胞タイプからＤＮＡを差次的抽出するための方法が提供される。差次的抽出法を実施するための系もまた提供される。多区画容器を用いる、少なくとも２つの異なる細胞タイプからＤＮＡを差次的抽出するためのキットも提供される。法医学的なＤＮＡ分析は、精子細胞由来のＤＮＡ、および上皮細胞などの他の細胞由来のＤＮＡの分析を伴うことが多い。特定の実施形態において、精子細胞の差次的抽出のための系が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年５月９日に出願された米国仮特許出願第６０／９１６，９９９号の利益を主張し、２００７年１月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／８８０，７８７号、２００７年２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／８９９，１０６号、２００８年１月１６日に出願された米国特許出願第１２／０１５，４１４号、および２００８年２月１５日に出願された米国特許出願第１２／０３２，２７０号に関連する。これらの出願の開示は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
限定はしないが、特許、特許出願、論文、本、論説、およびインターネットウェブページを含む、本出願において引用されるすべての文献および類似の資料は、そのような文献および類似の資料の形式にかかわらず、参照することにより、任意の目的でその全体が明らかに組み込まれる。限定はしないが、定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含む、組み込まれた文献および類似の資料の１つまたは複数が、本出願と異なるかまたは矛盾する場合、本出願が優先される。
【０００３】
少なくとも２つの異なる細胞タイプからＤＮＡを差次的抽出するための方法が提供される。差次的抽出法を実施するための系もまた提供される。
【背景技術】
【０００４】
性的暴力事件の法医学的なＤＮＡ分析は、精子細胞由来のＤＮＡ、および上皮細胞などの他の細胞由来のＤＮＡの分析を伴うことが多い。被害者から得られた試料は、精子と上皮細胞などの他の細胞との混合物を含んでいることが多い。上皮細胞などの他の細胞は、精子細胞の何倍も数が多い場合があるため、精子のＤＮＡが抽出されている間、ＤＮＡの１つまたは複数の他の由来源からの汚染が生じ得る。したがって、分析の前に、精子細胞と上皮細胞とを分離すること、または上皮のＤＮＡから精子のＤＮＡを可能な限り多く分離することが望ましい場合が多い。特定の場合において、正確なプロフィールを得るために特定のＤＮＡを分離および単離することが、加害者を同定するために重要である。
【０００５】
差次的抽出は、細胞の分離に用いることができるいくつかの抽出法を表現するために用いられる広義の用語である。特定の場合において、精子細胞の固有の特徴により、精子細胞からの上皮細胞の差次的抽出が可能になる。差次的抽出の１つの手順は、１９８５年に記載された（非特許文献１）。特定の場合において、被害者のＤＮＡプロフィールから精子細胞画分を分離することで、結果の曖昧性が減少し、強姦のケースにおける加害者のＤＮＡプロフィールの解釈が容易になる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｉｌｌら、（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ ３１８巻：５５７〜９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の実施形態において、精子細胞の差次的抽出のための系が提供される。特定の実施形態において、系は複数の区画を含み、少なくとも１つの区画は選択的精子溶解緩衝液を含む。特定の実施形態において、系は、細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、選択的精子溶解緩衝液を含む第２の区画とを含む。特定の実施形態において、系はさらに、複数のＤＮＡ結合粒子を含む第３の区画を含む。特定の実施形態において、系はさらに、溶出緩衝液を含む第４の区画を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、精子細胞の差次的抽出のための系は、細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、細胞洗浄緩衝液を含む第２の区画と、選択的精子溶解緩衝液を含む第３の区画と、複数のＤＮＡ結合粒子を含む第４の区画と、ＤＮＡ洗浄緩衝液を含む第５の区画と、溶出緩衝液を含む第６の区画とを含む。特定の実施形態において、系はさらに、ＤＮＡ結合緩衝液を含む第７の区画を含む。特定の実施形態において、第７の区画はさらに、第２の複数のＤＮＡ結合粒子を含む。特定の実施形態において、系はさらに、第２の複数のＤＮＡ結合粒子を含む第８の区画を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、系は複数の区画を含み、複数の区画は、取り外し可能なカートリッジの一部である。
【００１０】
特定の実施形態において、精子細胞および非精子細胞を含む生物学的試料における、精子細胞の差次的抽出の方法が提供される。特定の実施形態において、その方法は、（ａ）生物学的試料を、細胞捕捉マトリクスを含む、系の第１の区画内に置くステップと、（ｂ）細胞捕捉マトリクスで精子細胞および非精子細胞を捕捉するステップと、（ｃ）細胞捕捉マトリクスと捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートして、精子細胞溶解物を形成するステップと、（ｄ）精子細胞溶解物の精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップと、（ｅ）ＤＮＡ結合粒子から精子細胞ＤＮＡを溶出するステップとを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスで精子細胞および非精子細胞を捕捉するステップは、細胞捕捉マトリクスに磁力を加えるステップを含む。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスと捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートするステップは、系の第１の区画で行う。特定の実施形態において、精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子から精子細胞ＤＮＡを溶出するステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、精子細胞溶解物は、第１の区画から第２の区画へ運ばれる。
【００１２】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスと捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートするステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子から精子細胞ＤＮＡを溶出するステップは、系の第３の区画で行う。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスならびに捕捉された精子細胞および非精子細胞は、磁力を用いて第１の区画から第２の区画へ運ばれる。
【００１３】
特定の実施形態において、非精子細胞は、選択的精子溶解緩衝液内での細胞捕捉マトリクスのインキュベーションの後、細胞捕捉マトリクス上に捕捉されたまま残る。特定の実施形態において、非精子細胞は溶解され、非精子細胞ＤＮＡは、細胞捕捉マトリクスに結合する。特定の実施形態において、非精子細胞は溶解され、非精子細胞ＤＮＡは、第２の複数のＤＮＡ結合粒子に結合する。
【００１４】
当業者には、以下に記載する図面が例示のみを目的とすることが理解されよう。図面は、決して、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図１の系は、区画間の流体の移動を伴うものである。図１の系は、非精子細胞を溶解しないが、その代わり、細胞捕捉マトリクスへの細胞の捕捉の後に試料内に存在する残留ＤＮＡを回収する。
【図２】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図２の系は、区画間の流体の移動を伴うものである。図２の系は、細胞捕捉マトリクスを、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合粒子として用いる。
【図３】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図３の系は、区画間の流体の移動を伴うものである。図３の系は、ＤＮＡ結合粒子の２つの個別の区画を含む。
【図４】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図４の系は、区画間の粒子の移動を伴うものであり、場合によっては、液体の移動を伴うものである。図４に示される系においては、細胞捕捉マトリクスは、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとして用いられる。
【図５】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図５の系は、区画間の粒子の移動を伴うものである。図５に示される系においては、細胞捕捉マトリクスは、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとして用いられる。
【図６】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図６の系は、ＤＮＡ結合粒子を、ＤＮＡ結合緩衝液とは別に保存する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において用いられる節の見出しは、編成を目的としたものにすぎず、記載される対象を限定するものであると解釈されるものではない。限定はしないが、特許、特許出願、論文、本、および論説を含む、本明細書において引用されるすべての文献または文献の一部は、参照することにより、任意の目的でその全体が明らかに本明細書に組み込まれる。限定はしないが、定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含む、組み込まれた文献または文献の一部の１つまたは複数が定義する用語が、本出願におけるその用語の定義と矛盾する場合、本出願が優先される。
【００１７】
単数形の使用には、別段の記載がない限り、複数形が含まれる。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は、別段の記載がない限り、「少なくとも１つの」を意味する。「または」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。複数の請求項を引用する従属請求項の状況における「または」の使用は、選択的であることのみを意味する。「少なくとも１つ」という表現の意味は、「１つまたは複数」という表現の意味に等しい。さらに、「含んでいる」という用語、ならびに「含む」および「含まれる」などの他の形態の使用は、限定的なものではない。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、別段の記載がない限り、１つのユニットを含む要素または構成要素と、２つ以上のユニットを含む要素または構成要素との両方を包含するものである。
【００１８】
本明細書において、標的分析物などの「１つの」部分の検出についての議論は、別段の記載がない限り、１つまたは複数のその部分を包含するものである。本明細書において論じられるすべての範囲には、両境界点および境界点の間のすべての値が含まれる。
【００１９】
定義
「生物学的試料」という用語は、少なくとも１つの生物学的材料を含む任意の試料を言う。例示的な生物学的材料には、限定はしないが、血液、唾液、皮膚、便、尿、精子細胞、上皮細胞（限定はしないが、膣上皮細胞を含む）、筋肉組織、および骨が含まれる。
【００２０】
「カートリッジ」という用語は、複数の区画を含んでおり、かつ個別の流体処理装置および／または磁気粒子処理装置を独立して機能させるのに十分な流体処理メカニズムおよび／または磁気粒子処理メカニズムを有していない系を言う。カートリッジは、特定の実施形態において、使い捨て用に設計することができ、使用の後、廃棄される。特定の実施形態において、カートリッジ内の区画の１つまたは複数は、試薬を有する。特定の実施形態において、カートリッジの区画のすべては、単一のユニット内に含まれる。特定の実施形態において、カートリッジの区画は、共にカートリッジを形成する２つ以上のユニットの間で分けられている。様々な実施形態において、単一のカートリッジは、１、２、４、６、８、１２、１６、２４、４８、９６、または９６個超の試料を処理するように設計される。様々な実施形態において、カートリッジは、１から４８個の試料、または１から２４個の試料、または２から２４個の試料、または１から１６個の試料、または２から１６個の試料を処理するように設計される。特定の実施形態において、カートリッジが少なくとも２つの試料を処理するように設計されている場合、カートリッジは、試料の少なくとも２つを同時に処理するように設計される。特定の実施形態において、カートリッジは、試料のすべてを同時に処理するように設計される。
【００２１】
「細胞混合物」という用語は、少なくとも２つ以上の異なる細胞タイプの異種的な集合体を言う。
【００２２】
「細胞捕捉マトリクス」という用語は、限定はしないが精子細胞および上皮細胞を含む細胞を捕捉するマトリクスを言う。特定の例示的な細胞捕捉マトリクスは、例えば、米国仮特許出願第６０／８９０，４６０号に記載されている。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞洗浄緩衝液の存在下では、細胞は捕捉するがＤＮＡは結合せず、しかしＤＮＡ結合緩衝液においてはＤＮＡを結合する能力を有する。
【００２３】
「細胞洗浄緩衝液」という用語は、その中において細胞が細胞捕捉マトリクスに捕捉されるが溶解はされない緩衝液を言う。特定の実施形態において、ＤＮＡは、細胞洗浄緩衝液の存在下では細胞捕捉マトリクスに結合しない。例示的な細胞洗浄緩衝液には、限定はしないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）（ｐＨ７．５）、Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）（ｐＨ８．５）、およびＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）（ｐＨ８）が含まれる。様々な実施形態において、当業者は、選択された細胞捕捉マトリクスおよび細胞タイプに従って、適切な細胞洗浄緩衝液を選択することができる。
【００２４】
「区画」という用語は、流体を保持するように構成された個別の空間を規定する、任意の貯蔵構造を言う。例えば、区画は、流体を保持するように構成された内部空間を規定する、独立した容器または入れ物であり得る。あるいは、区画は、流体を保持するように構成された、容器または入れ物内の、複数の区分けされた空間の１つであり得る。さらに、区画により規定される、流体を保持する空間は、実質的に密封されているか、あるいは、少なくとも部分的に大気に通じている。
【００２５】
「差次的抽出」という用語は、異種的な細胞集団から細胞タイプの小集団を抽出するために用いられる抽出法を言う。特定の実施形態において、差次的抽出には、精子細胞と、限定はしないが上皮細胞を含む非精子細胞との混合物における、精子細胞の選択的な溶解が含まれる。
【００２６】
「ＤＮＡ結合粒子」という用語は、適切な緩衝条件下においてＤＮＡを結合することが可能な磁気粒子を言う。例示的な磁気粒子には、限定はしないが、強磁性の、常磁性の、および超常磁性の粒子が含まれる。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子は、ＤＮＡ結合緩衝液の存在下でＤＮＡを結合する。
【００２７】
「ＤＮＡ結合緩衝液」という用語は、その中においてＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスがＤＮＡを結合し得る緩衝液を言う。
【００２８】
「選択的精子溶解緩衝液」という用語は、精子細胞と少なくとも１つのタイプの非精子細胞とを含む混合物において優先的に精子細胞を溶解し得る緩衝液を言う。特定の例示的な選択的精子溶解緩衝液は、例えば米国仮特許出願第６０／８９９，１０６号および米国仮特許出願第６０／８９０，４７０号に記載されている。「優先的に精子細胞を溶解する」とは、主に精子細胞が溶解されることを意味する。特定の実施形態において、ごく少量の非精子細胞が溶解される。様々な実施形態において、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の精子細胞が溶解される。様々な実施形態において、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の非精子細胞が溶解されない。
【００２９】
「希釈緩衝液」という用語は、選択的精子溶解緩衝液を希釈して、この緩衝液をＤＮＡ結合緩衝液とするために用いることができる緩衝液を言う。希釈緩衝液は、様々な実施形態において、カオトロピック塩、一価塩、および／またはアルコールを含み得る。
【００３０】
「溶出緩衝液」という用語は、ＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスからＤＮＡを放出させる緩衝液を言う。特定の例示的な溶出緩衝液には、限定はしないが、低塩緩衝液（限定はしないが、ＴＥおよび脱イオン水を含む）が含まれる。様々な実施形態において、当業者は、用いられるＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスに従って適切な溶出緩衝液を選択することができる。特定の実施形態において、溶出緩衝液の存在下でのＤＮＡの溶出を容易にするために、熱が加えられる。
【００３１】
「法医学的な試料」という用語は、限定はしないが、殺人、強姦、外傷、暴行、殴打、窃盗、強盗、他の刑事事件、身元確定検査、親確定検査、または実父確定検査を含む法的状況において生じる身元問題への対処に用いるために得られた生物学的試料、および入り混じった試料（ｍｉｘｅｄ−ｕｐ ｓａｍｐｌｅｓ）を言う。
【００３２】
「一般的な溶解緩衝液」という用語は、非精子細胞を溶解し、かつ精子細胞も溶解し得るかまたはし得ない緩衝液を言う。特定の例示的な一般的な溶解緩衝液は、当技術分野において知られており、様々な実施形態において、当業者は、意図した使用に基づいて一般的な溶解緩衝液を選択することができる。非限定的な例示的な一般的な溶解緩衝液は、２％ＳＤＳ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、および５００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む。
【００３３】
「溶解物」という用語は、溶解した細胞の残屑およびＤＮＡを有する液相を言う。
【００３４】
「医学的試料」という用語は、限定はしないが、研究、診断、ならびに組織および器官の移植片を含む医学的問題に対処するために得られた試料を言う。
【００３５】
「塩」または「塩試薬」または「塩溶液」という用語は、正および／または負に帯電したイオン試薬を言う。特定の実施形態において、塩試薬は、精子のクロマチンを崩壊させる。塩試薬は、様々な実施形態において、一価の、二価の、または多価のイオンであり得る。例示的な塩試薬には、限定はしないが、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｌｉ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＳＯ４、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、およびＣａ（ＮＯ３）２が含まれる。
【００３６】
「ジスルフィド結合還元剤」という用語は、例えばタンパク質におけるジスルフィド結合を還元する作用物質を言う。特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元剤は、精子細胞におけるプロタミンのジスルフィド架橋を崩壊させる。ジスルフィド結合還元剤は、不水溶性または水溶性であり得る。例示的な不水溶性作用物質には、限定はしないが、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）が含まれる。例示的な水溶性作用物質には、限定はしないが、グルタチオン（ＧＳＨ）およびメルカプトエタノール（ＭＥ）が含まれる。
【００３７】
特定の例示的な選択的精子溶解緩衝液
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つのジスルフィド結合還元試薬および少なくとも１つの塩試薬を含む。
【００３８】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元剤は、ＭＥ、ＤＴＴ、ＧＳＨ、およびＴＣＥＰから選択される。
【００３９】
特定の実施形態において、少なくとも１つの塩試薬は、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｌｉ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＳＯ４、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、およびＣａ（ＮＯ３）２から選択される。特定の実施形態において、少なくとも１つの塩試薬は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２から選択される。
【００４０】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つの塩試薬を、少なくとも０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、または２Ｍの濃度で含む。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つの塩試薬を、０．１Ｍから２Ｍの濃度で含む。
【００４１】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つのジスルフィド結合還元試薬を、少なくとも０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．７Ｍ、または０．８Ｍの濃度で含む。
【００４２】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＭＥ、ＤＴＴ、ＧＳＨ、およびＴＣＥＰから選択される少なくとも１つのジスルフィド結合還元試薬、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびＣａＣｌ２から選択される少なくとも１つの塩試薬を含む。特定の実施形態において、塩および還元剤の濃度は、選択的精子溶解緩衝液が優先的に精子細胞を溶解するようなものである。
【００４３】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液はＮａＣｌを含む。特定の実施形態において、ＮａＣｌの濃度は少なくとも０．８Ｍである。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液はＫＣｌを含む。特定の実施形態において、ＫＣｌの濃度は少なくとも０．８Ｍである。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液はＭｇＣｌ２を含む。特定の実施形態において、ＭｇＣｌ２の濃度は少なくとも０．２５Ｍである。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＤＴＴを少なくとも５０ｍＭの濃度で含む。
【００４４】
様々な実施形態において、当業者は、最終的な塩濃度のレベルを、優先的に精子細胞を溶解するように最適化することができる。
【００４５】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＤＮＡ結合緩衝液となるように、希釈緩衝液で希釈される。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＤＮＡ結合緩衝液で希釈され、それにより得られた緩衝液はＤＮＡ結合緩衝液である。様々な実施形態において、当業者は、選択的精子溶解緩衝液と混合した後に、ＤＮＡ結合緩衝液が生じるかまたはＤＮＡ結合緩衝液のＤＮＡ結合特性が維持されるように、適切な希釈緩衝液および／または適切な希釈量を選択することができる。
【００４６】
特定の例示的な細胞捕捉マトリクスおよびＤＮＡ結合粒子
細胞捕捉マトリクスは、限定はしないが精子細胞および上皮細胞を含む細胞を捕捉するマトリクスである。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞を捕捉するために用いられる条件と同一であり得るかまたは異なり得る適切な条件下で、ＤＮＡを結合する。様々な実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁気粒子からなる。例示的な磁気粒子には、限定はしないが、強磁性の、常磁性の、および超常磁性の粒子が含まれる。
【００４７】
例示的な細胞捕捉マトリクスおよび／またはＤＮＡ結合粒子には、限定はしないが、超磁性のコアを有する多孔質シリカビーズが含まれる。超磁性のコアを有する例示的な多孔質シリカビーズには、限定はしないが、ＭＰ−５０（６．５μｍ）およびＭＰ−８５（＞８μｍ）（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）、ＤＮＡ ＩＱ（商標）シリカ粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）シリカ粒子（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＢｃＭａｇ（登録商標）シリカ修飾磁気ビーズ（５μｍまたは１μｍ）（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ならびに超磁気シリカ粒子（１μｍまたは０．７５μｍ、Ｇ．Ｋｉｓｋｅｒ ＧｂＲ、Ｓｔｅｉｎｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。特定の例示的な非シリカ細胞捕捉マトリクスには、限定はしないが、ストレプトアビジンで固定された酸化鉄（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、酸化鉄（ＩＩＩ）粉末（５μｍ）（Ｓｉｇｍａ）、ＭａｇＭＡＸ（登録商標）磁気粒子（１μｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれ、これらは、異なるタイプの表面官能基（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＷＣＸ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＴＡＬＯＮ、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅトシル活性化）を含み得る。
【００４８】
特定の例示的な細胞捕捉方法
様々な実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁気粒子を含む。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁場の不存在下で細胞を捕捉する。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁場の存在下で細胞を捕捉する。細胞の捕捉のタイミングおよびメカニズムは、様々な実施形態において、用いられる細胞捕捉マトリクスおよび緩衝液の条件に依存する。
【００４９】
細胞捕捉マトリクスは、任意の様々なメカニズムによって細胞を捕捉し得る。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、非共有結合的な相互作用を介して細胞を捕捉する。特定の例示的な非共有結合的な相互作用には、限定はしないが、水素結合、陽イオン−Π相互作用、Π−Π相互作用、イオン結合、疎水性相互作用、双極子−双極子相互作用、双極子誘発性の双極子相互作用、電荷−双極子相互作用、およびファンデルワールス相互作用が含まれる。特定の実施形態において、細胞は、イオン相互作用を介して細胞捕捉マトリクスによって捕捉される。特定の実施形態において、細胞は、抗体／抗原相互作用を介して細胞捕捉マトリクスによって捕捉される。
【００５０】
特定の実施形態において、非共有結合的な相互作用の継続時間および強さは、細胞が細胞捕捉マトリクスにより捕捉され続けるがマトリクスが１つの位置から別の位置へ移動するようなものである。特定のこのような実施形態において、細胞捕捉マトリクスは磁気粒子を含み、移動は、磁場を加えることにより生じる。細胞と細胞捕捉マトリクスとの間の非共有結合的な関連のタイプ、継続時間、および強さは、様々な実施形態において、マトリクスのサイズ、形状、表面特性、表面形態、および／もしくは密度、捕捉される細胞のサイズ、形状、表面特性、表面形態、および／もしくは密度、ならびに／または緩衝液の組成、ｐＨ、および／もしくは温度によって決定される。
【００５１】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、例えば磁場を加えた場合に、物理的に細胞を捕捉する。このような物理的捕捉は、特定の実施形態において、磁場における細胞捕捉マトリクス粒子の凝集に起因し得る。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞のこのような物理的捕捉を容易にするために、不規則な形状をした粒子を含む。様々な実施形態において、細胞捕捉マトリクス粒子は、捕捉される細胞よりも小さいかもしくは大きいものであり得るか、または、捕捉されるいくつかの細胞よりも大きく、かつ捕捉される他の細胞よりも小さいものであり得る。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞を磁場源の方向に押して、細胞を上清から隔離することにより、細胞を捕捉し得る。特定のこのような実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、粒子間の空間が、試料内の最も小さい細胞のサイズよりも小さくなるような密度にある粒子からなる。
【００５２】
特定の実施形態において、２つ以上のタイプの非共有結合的な相互作用が、細胞と細胞捕捉マトリクスとの間に存在する。特定のこのような実施形態において、非共有結合的な相互作用の１つのタイプは細胞の捕捉にさらに寄与し得、その相互作用の優位性は、試料内の細胞タイプごとに変化し得る。
【００５３】
精子細胞は、約５μｍの直径を有し、上皮細胞は、約５０μμの直径を有する。様々な実施形態において、精子細胞および上皮細胞を捕捉するために用いられる細胞捕捉マトリクスは、０．５μｍから１００μｍの直径を有する粒子を含む。特定の実施形態において、粒子は１μｍから１０μｍの直径を有する。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスにおける少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の粒子が、０．５μｍから１００μｍ、または１μｍから１０μｍの直径を有する。当業者は、様々な実施形態において、特定の適用に従って細胞を捕捉するために、粒子の適切なサイズ、形状、密度、および表面特性を選択することができる。
【００５４】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、１つまたは複数の抗体を含む。特定のこのような実施形態において、抗体の１つまたは複数は、試料内の細胞の少なくとも１つのタイプ上に存在する細胞表面抗原を結合する。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、試料内の２つ以上の細胞タイプ上の少なくとも１つの細胞表面抗原に共に結合する、１つまたは複数の抗体を含む。非制限的な例として、特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、上皮細胞上の細胞表面抗原を結合する抗体で被覆された粒子の第１のセット、および精子細胞上の細胞表面抗原を結合する抗体で被覆された粒子の第２のセットを含み得る。
【００５５】
精子細胞および／または上皮細胞を結合する特定の例示的な抗体には、限定はしないが、ヒト上皮抗原であるＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）を結合するモノクローナル抗体ＢｅｒＥＰ４、精子プロタミンに対する抗体、ヒト精子凝集抗原Ｉ（ＳＡＧＡ−Ｉ）上に位置する炭水化物エピトープに対する抗体（例えば、米国特許第５，６０５，８０３号を参照されたい）、核空胞および精子の核の冗長膜内に存在する精子タンパク質であるＳＰＡＮ−Ｘに対する抗体（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４９７３を参照されたい）、Ｃ５８またはＳＭＡＲＣ３２に対する抗体（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１８２７５１号を参照されたい）が含まれる。特定の実施形態において、抗体は、複数の細胞タイプ上に存在する細胞表面抗原（例えば、タンパク質または炭水化物）を結合する。
【００５６】
特定の実施形態において、区画の下に磁場が加えられると、細胞は、細胞捕捉マトリクスによって、区画の底部に押されるか、引っ張られるか、または運ばれる。特定の実施形態において、区画の側面から磁場が加えられると、細胞は、細胞捕捉マトリクスによって、区画の側面に押されるか、引っ張られるか、または運ばれる。特定の実施形態において、細胞は、細胞捕捉マトリクスによって、区画内に挿入された磁性の棒に押されるか、引っ張られるか、または運ばれる。特定のこのような実施形態において、磁性の棒は、例えば磁性の棒の汚染を防ぐための取り外し可能な保護物で覆われている。特定の実施形態において、磁性の棒は、細胞捕捉マトリクスを１つの区画から別の区画へ移動させるために用いることができる。
【００５７】
特定の実施形態において、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が、細胞を捕捉するための細胞捕捉マトリクスとして用いられる。粒子は１μｍであり、特定の実施形態において、約５５個細胞／μＬを含む試料１μｌに対して約１０６個の粒子の密度で用いられる（例えば、約１０００個の精子細胞および約１万個の上皮細胞を含む２００μＬ）。特定の実施形態において、１μｌ当たり１０６個超の粒子が用いられ得る。特定の実施形態において、１μｌ当たり１０６個未満の粒子が用いられる。
【００５８】
様々な実施形態において、試料内の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のインタクトな細胞が、細胞捕捉マトリクスにより捕捉される。様々な実施形態において、１つの細胞タイプが溶解された後、試料内の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の残存しているインタクトな細胞が、細胞捕捉マトリクスに捕捉されるか、または、捕捉されたまま残る。
【００５９】
特定の例示的なＤＮＡ結合緩衝液
特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子がシリカビーズである場合、ＤＮＡ結合緩衝液はカオトロピック塩を含む。特定の例示的なカオトロピック塩には、限定はしないが、グアニジウムイソチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）および塩化グアニジウムが含まれる。特定の実施形態において、例えばＤＮＡ結合粒子が非シリカビーズである場合、ＤＮＡ結合緩衝液はカオトロピック塩およびアルコールを含む。特定のこのような実施形態において、ＤＮＡ結合緩衝液はさらに、一価の塩を含む。特定の例示的な一価の塩には、限定はしないが、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、および塩化アンモニウムが含まれる。特定の例示的なアルコールには、限定はしないが、イソプロパノールおよびエタノールが含まれる。特定の実施形態において、アルコールは、ＤＮＡ結合緩衝液において、３０％以上の濃度である。特定の実施形態において、カオトロピック塩およびアルコールを含むＤＮＡ結合緩衝液は、「ＤＮＡ沈殿緩衝液」と呼ばれる。特定の例示的なＤＮＡ結合緩衝液は、例えば、米国特許第５，２３４，８０９号、米国特許第５，５２３，２３１号、および米国特許第５，７０５，６２８号に記載されている。当業者は、用いられるＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスに従って、適切なＤＮＡ結合緩衝液を選択することができる。
【００６０】
シリカベースのＤＮＡ結合粒子に適した、例示的なＤＮＡ結合緩衝液には、限定はしないが、ＢｌｏｏｄＰｒｅｐ（商標）ＤＮＡ精製溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤＮＡ ＩＱ（商標）溶解溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。様々な実施形態において、非シリカＤＮＡ結合粒子では、当業者は、ＢｌｏｏｄＰｒｅｐ（商標）ＤＮＡ精製溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＤＮＡ ＩＱ（商標）溶解溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、適切な量のアルコールを加えることができる。非限定的な例として、様々な実施形態において、ＤＮＡ沈殿緩衝液を作製するために、これらの溶液の１つにイソプロパノールが３０％の最終濃度まで加えられる。さらなる非限定的な例として、様々な実施形態において、ＤＮＡ沈殿緩衝液を作製するために、これらの溶液の１つにエタノールが４０〜５０％の最終濃度まで加えられる。
【００６１】
特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子は、本明細書において記載される系においてＤＮＡ結合緩衝液内に保存される。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子は、本明細書において記載される系においてＤＮＡ結合緩衝液とは別に保存される。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合緩衝液がＤＮＡ沈殿緩衝液である場合、ＤＮＡ結合粒子は個別に保存される。
【００６２】
特定の実施形態において、非精子細胞はＤＮＡ結合緩衝液内で溶解される。特定の実施形態において、非精子細胞は、ＤＮＡ結合緩衝液内で熱を加えながら溶解される。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合緩衝液がＤＮＡ沈殿緩衝液である場合、非精子細胞はまず、アルコールを含まないＤＮＡ結合緩衝液内で溶解される。特定の実施形態において、次に、ＤＮＡ沈殿緩衝液を作製するために、溶解物にアルコールが加えられる。
【００６３】
特定の例示的なＤＮＡ洗浄緩衝液
特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は、ゲノムＤＮＡがＤＮＡ洗浄緩衝液に実質的にまったく溶解しないように調製される。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は、大きなＤＮＡ（例えば、約１ｋｂ超）がＤＮＡ洗浄緩衝液に実質的にまったく溶解しないように調製される。特定の例示的なＤＮＡ洗浄緩衝液は、当技術分野において知られており、通常は少なくとも１つのアルコールを含む。ＤＮＡ洗浄緩衝液において用い得る特定の例示的なアルコールには、限定はしないが、エタノールおよびイソプロパノールが含まれる。
【００６４】
特定の実施形態において、１つのＤＮＡ洗浄緩衝液が用いられる場合、それは９０％エタノールを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡが２回洗浄される場合、同一のＤＮＡ洗浄緩衝液が両方の洗浄に用いられる。特定の実施形態において、ＤＮＡが２回洗浄される場合、２つの異なるＤＮＡ洗浄緩衝液が用いられる。特定の実施形態において、２つの異なるＤＮＡ洗浄緩衝液が用いられる場合、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、第１のＤＮＡ洗浄緩衝液よりも高いアルコール濃度を有する。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液はＧｕＳＣＮおよび／またはＧｕＣｌを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は、ＧｕＳＣＮおよびイソプロパノールを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は７０％エタノールを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は９０％エタノールを含む。
【００６５】
様々な実施形態において、当業者は、選択された適用に従って１つまたは複数のＤＮＡ洗浄緩衝液を調製することができる。
【００６６】
特定の例示的なＤＮＡ分析法
ＤＮＡが単離された後、様々な方法を、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析などのＤＮＡ分析、および、限定はしないが短鎖縦列反復（ＳＴＲ）分析を含む、様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた方法に用いることができる。
【００６７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、限定はしないが少量のＤＮＡを含む核酸を増幅するために用いることができる反応を言う。ＰＣＲは、標的ＤＮＡのさらなるコピーを生じさせるために、変性、１つまたは複数のプライマーとのアニーリング、および１つまたは複数のＤＮＡポリメラーゼでの伸長からなるサイクルを用いる技術である。特定の実施形態において、ＰＣＲはＤＮＡ配列を１０６倍超増幅する。特定の例示的なＰＣＲ法は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，９６５，１８８号、および米国特許第４，６８３，２０２号、ならびに欧州特許第２０１１８４号および欧州特許第２００３６２号に記載されている。
【００６８】
特定の実施形態において、ＤＮＡサンプルは、例えば目的のＳＴＲを含むそれぞれの遺伝子座に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅に供される。ＳＴＲの遺伝子座は、それぞれが例えば２から７ｂｐの長さである縦列反復配列からなる。様々な実施形態において、４ｂｐ（テトラヌクレオチド）および／または５ｂｐの反復配列を含む遺伝子座が、ヒトの同定に用いられる。４および５ｂｐの反復配列は、ヒトゲノムの全体にわたって見られ、特定の場合において、高度に多型である。テトラヌクレオチド反復のＳＴＲの遺伝子座での対立遺伝子の数は、様々な実施形態において、約４から２０である。
【００６９】
特定の実施形態において、単離されたＤＮＡが多型ＳＴＲの検出に用いられる場合、個別のＤＮＡ試料から増幅された対立遺伝子を、１つまたは複数のサイズ標準、例えば市販のＤＮＡマーカーおよび／または遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーと比較して、それぞれの遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定することができる。特定の実施形態において、対立遺伝子ラダーは、特定の遺伝子座に由来する２つ以上の既知の対立遺伝子に相当する、２つ以上の異なる長さのＤＮＡを含む。様々な実施形態において、ＤＮＡは、限定はしないが、銀染色、放射性標識、蛍光標識、様々な色素および染料を含む、任意の技術によって、視覚化することができる。特定の実施形態において、視覚化の前に、変性ゲル電気泳動もしくは未変性ゲル電気泳動、または任意の他のサイズ分離法を用いて、ＤＮＡを分離する。
【００７０】
特定の実施形態において、増幅された対立遺伝子は、ＤＮＡ配列分析に供される。
【００７１】
特定の例示的なＤＮＡ増幅および分析の方法は、当技術分野において知られており、例えば、Ｂｕｄｏｗｌｅら（ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：ＭＡ、ＵＳＡ（２０００年））に記載されている。
【００７２】
特定の例示的な磁気粒子処理装置
特定の実施形態において、差次的抽出系は、磁気粒子処理装置、および複数の区画を含む取り外し可能なカートリッジを含み、ここで、区画の少なくとも１つは、差次的抽出系において用いられる少なくとも１つの試薬を含む。
【００７３】
特定の実施形態において、磁気粒子処理装置は、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）に類似したものである。例えば、ＥＺ１ ＤＮＡ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版（２００４年２月）（Ｑｉａｇｅｎ）を参照されたい。ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎは、床面と平行な面を移動し得るステージ、ステージに対して上方および下方に移動し得るピペット、ならびにピペットの方におよびピペットから離れるように移動し得る磁石を含む。ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎは、区画間で磁気粒子および液体の両方を移動させることが可能である。特定の実施形態において、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎは、以下のように機能する。複数の液体試薬を含む複数の区画を有する、取り外し可能なカートリッジは、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎのステージ上に置かれている。取り外し可能なカートリッジはまた、磁気粒子を有する少なくとも１つの区画を含む。ステージは、磁気粒子を有する区画を、ピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは区画内へ下降し、磁気粒子を含む溶液を吸い上げる。磁石はピペットの方へ移動して、ピペット内部の磁気粒子を保持し、一方で、ピペットは、磁気粒子を残して溶液を吐き出す。ステージは、次に、試薬を有する第２の区画を、磁石によって保持されている磁気粒子を有するピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは第２の区画から試薬を吸い上げ、磁石はピペットから離れるように移動し、そしてピペットは、試薬および磁気粒子を第２の区画内に吐き出す。
【００７４】
特定の実施形態において、磁気粒子処理装置は、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に類似したものである。例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（２００５年９月）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を参照されたい。Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、床面と平行な面を移動し得るステージ、ステージに対して上方および下方に移動し得るプランジャー、ならびに、プランジャー内部に位置し、プランジャーの端部に対して上方および下方に移動し得る磁石を含む。Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、区画間で磁気粒子を移動させ得るが、液体は移動させ得ない。特定の実施形態において、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、以下のように機能する。複数の液体試薬を含む複数の区画を有する、取り外し可能なカートリッジは、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのステージ上に置かれている。取り外し可能なカートリッジはまた、磁気粒子を含む少なくとも１つの区画を含む。ステージは、磁気粒子を有する区画を、プランジャーの真下の位置に移動させる。プランジャーピペットは区画内へ下降し、磁石はプランジャー内部を下降し、プランジャーの端部に磁気粒子を引き付ける。プランジャーおよび磁石は次に上昇し、ステージは、試薬を有する第２の区画を、磁石によって保持されている磁気粒子を有するプランジャーの真下の位置に移動させる。プランジャーは第２の区画内に下降し、磁石はプランジャーの端部から離れるように上昇し、磁気粒子を第２の区画内に放出する。
【００７５】
特定の実施形態において、磁気粒子処理装置は、床面と平行な面を移動し得るステージ、ステージに対して上方および下方に移動し得るピペット、ならびに、ステージ上に置かれたカートリッジへの磁石の接触を可能にする位置にある磁石を含む。様々な実施形態において、磁石は、カートリッジの真下、またはカートリッジの１つもしくは複数の側面上に位置し得る。特定の実施形態において、磁石は、カートリッジの少なくとも１つの区画に対して磁力を付与および放出するために、カートリッジの方におよびカートリッジから離れるように移動し得る。特定の実施形態において、磁石は静止しており、カートリッジの少なくとも１つの区画に対して磁力を付与および放出するために、電子的にオンおよびオフされ得る。そのような例示的な磁気粒子処理装置は、以下のように機能する。複数の液体試薬を含む複数の区画を有する取り外し可能なカートリッジは、装置のステージ上に置かれている。取り外し可能なカートリッジはまた、磁気粒子を有する少なくとも１つの区画を含む。ステージは、試薬を有する区画を、ピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは試薬を吸い上げ、ステージは、磁気粒子を有する区画を、ピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは次に、試薬を区画内に吐き出す。磁石は、ピペットから離れた、区画内の１つの位置に磁気粒子を引き付け、ピペットは次に、磁気粒子を残して液体を吸い上げる。このようにして、ピペットは、磁気粒子に試薬をもたらすため、および磁気粒子から試薬を取り除くために用いることができ、一方、磁石は、磁気粒子をピペットの通り道から離れたところに保持するために用いられる。
【００７６】
様々な実施形態において、当業者は、本明細書において記載される方法を実施するための装置を設計および／またはプログラムすることができる。特定の実施形態において、このような装置は、上述した装置の１つまたは複数に類似し得る。
【００７７】
差次的抽出のための特定の例示的な系および方法
様々な実施形態において、差次的抽出のための系は、複数の区画を含むカートリッジを含み、区画の少なくとも１つは、選択的精子溶解緩衝液を含む。差次的抽出のための特定の例示的な系および方法が、本明細書において記載される。特定の実施形態において、その方法は、区画間で流体を移動させるステップを含む。特定の実施形態において、その方法は、区画間でＤＮＡ結合粒子を移動させるステップを含む。特定の実施形態において、その方法は、区画間で流体およびＤＮＡ結合粒子を移動させるステップを含む。
【００７８】
差次的抽出系の以下の例は、非限定的なものである。例えば、図面に示される、および本明細書において記載される区画の配置は、比喩的なものであり、非限定的なものである。様々な実施形態において、当業者は、本明細書における教示、目的とされる使用、および選択される装置に基づいて、系を設計することができる。様々な実施形態において、このような系は、本明細書において記載される任意の以下の例示的な系よりも多いかまたは少ない区画を含む。様々な実施形態において、このような系は、以下の例示的な系の１つまたは複数において組み合わせて示されている個別の区画内に試薬を分離する。
【００７９】
区画間の流体の移動を用いる特定の例示的な系および方法
図１は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第１の非限定的な例示的な系を示す。例えば試料が精子細胞と比較して過剰な非精子細胞を含む（例えば、精子細胞よりも非精子細胞が少なくとも１０倍多い）場合、図１に示された系が用いられる。図１の系は、非精子細胞を溶解しないが、その代わり、細胞捕捉マトリクス上に細胞が捕捉された後に試料内に存在している残留ＤＮＡを回収する。このような残留ＤＮＡは、系の中に試料を置く前の細胞の破砕に起因して存在し得る。このような細胞の破砕は、様々な実施形態において、回収の前、回収の最中、保存の最中、輸送の最中、および１つの容器から別の容器への試料の移動の最中に生じ得る。試料中で精子細胞と比較して非精子細胞が過剰であることにより、残留ＤＮＡは、精子細胞ＤＮＡと比較して過剰な非精子細胞ＤＮＡを含む。
【００８０】
図１に記載された実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。区画１の上清を次に、回収管に取り出す（図示はしていない）。元の試料が、精子細胞と比較して、過剰な非精子細胞、例えば上皮細胞を含んでいた（例えば、精子細胞よりも非精子細胞が１０倍超多い）場合、試料の結合から得られた上清は、分析に十分な非精子細胞ＤＮＡを含んでいる可能性がある。
【００８１】
区画２に位置している細胞洗浄緩衝液は、次に、区画１に移される。区画１からの細胞洗浄上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。廃棄物入れは、図１に示される系の連続した部分であって良いか、またはそうでなくても良い。特定の実施形態において、図１の区画１から６がカートリッジ内に含まれる場合、廃棄物区画０はカートリッジの一部ではない。特定の実施形態において、カートリッジは、図１の区画０から６を含む。
【００８２】
区画１から細胞洗浄上清が取り除かれた後、選択的精子溶解緩衝液は、区画３から区画１に移される。選択的精子溶解緩衝液は、区画１において、細胞捕捉マトリクスに結合した精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、溶解物の上清は区画１から区画４に移され、この区画４は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する、希釈緩衝液とを有する。ＤＮＡ結合の後、区画４の上清は、廃棄物区画０に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画５から区画４に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４から廃棄物区画０に移される。
【００８３】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画７（図１には示されていない）内に含まれる。特定のこのような実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画４に移される。第２のＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４から廃棄物区画０に移される。
【００８４】
最後に、溶出緩衝液が、区画６から区画４に移される。溶出緩衝液は、ＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に精子細胞ＤＮＡを放出する。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画４から第２の回収管（図１には示されていない）に移される。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【００８５】
図２は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第２の非限定的な例示的な系を示す。図２に示される系において、細胞捕捉マトリクスはまた、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとしても機能する。
【００８６】
図２に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。区画１の上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。廃棄物入れは、図２に示される系の連続した部分であって良いか、またはそうでなくても良い。特定の実施形態において、図２の区画１から７がカートリッジ内に含まれる場合、廃棄物区画０はカートリッジの一部ではない。特定の実施形態において、カートリッジは、図２の区画０から７を含む。
【００８７】
区画２内に位置する細胞洗浄緩衝液は、次に、区画１に移される。区画１からの細胞洗浄上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。区画１から細胞洗浄上清が取り除かれた後、選択的精子溶解緩衝液は、区画３から区画１に移される。選択的精子溶解緩衝液は、区画１において、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、溶解物の上清は区画１から区画５に移され、この区画５は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する、希釈緩衝液とを有する。ＤＮＡ結合緩衝液は次に、区画４から区画１に移され、この区画１は今や、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された非精子細胞を含む。ＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図２には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または磁気粒子処理装置の一部である。非精子細胞ＤＮＡは、ＤＮＡ結合緩衝液内において、細胞捕捉マトリクスに結合する。
【００８８】
区画１および５におけるＤＮＡの結合の後、区画１および５の上清は、廃棄物区画０に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画６から区画１および５のそれぞれに移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画１および５から廃棄物区画０に移される。
【００８９】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画８（図２には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画１および５に移される。第２のＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画１および５から廃棄物区画０に移される。
【００９０】
最後に、溶出緩衝液が、区画７から区画１および５のそれぞれに移される。溶出緩衝液は、区画５においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に精子細胞ＤＮＡを放出し、区画１においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に非精子細胞ＤＮＡを放出する。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画５から回収管（図３には示されていない）に移される。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画１から第２の回収管（図３には示されていない）に移される。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【００９１】
図３は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第３の非限定的な例示的な系を示す。図３に示される系は、一方は精子細胞ＤＮＡを結合するために用いられ、もう一方は非精子細胞ＤＮＡを結合するために用いられる、ＤＮＡ結合粒子を含む２つの個別の区画を含む。
【００９２】
図３に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。区画１の上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。廃棄物入れは、図３に示される系の連続した部分であって良いか、またはそうでなくても良い。特定の実施形態において、図３の区画１から７がカートリッジ内に含まれる場合、廃棄物区画０はカートリッジの一部ではない。特定の実施形態において、カートリッジは、図３の区画０から７を含む。
【００９３】
区画２に位置している細胞洗浄緩衝液は、次に、区画１に移される。区画１からの細胞洗浄上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。区画１から細胞洗浄上清が取り除かれた後、選択的精子溶解緩衝液は、区画３から区画１に移される。選択的精子溶解緩衝液は、区画１において、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、溶解物の上清は区画１から区画５に移され、この区画５は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する、希釈緩衝液とを有する。ＤＮＡ結合緩衝液は次に、区画４から区画１に移され、この区画１は今や、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された非精子細胞を含む。特定の実施形態において、区画４からのＤＮＡ結合緩衝液の移動の間に、ＤＮＡ結合粒子は、ＤＮＡ結合粒子がＤＮＡ結合緩衝液と共に除去されることを防ぐために、流体処理装置上の磁石により区画４において保持される。ＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図３には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または粒子処理装置の一部である。ＤＮＡ結合緩衝液／溶解物の上清は次に、区画１から、ＤＮＡ結合粒子を含む区画４に戻される。
【００９４】
区画４および５におけるＤＮＡの結合の後、区画４および５の上清は、廃棄物区画０に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画６から区画４および５のそれぞれに移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４および５から廃棄物区画０に移される。
【００９５】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画８（図３には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画４および５に移される。第２のＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４および５から廃棄物区画０に移される。
【００９６】
最後に、溶出緩衝液が、区画７から区画４および５のそれぞれに移される。溶出緩衝液は、区画５においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に精子細胞ＤＮＡを放出し、区画４においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に非精子細胞ＤＮＡを放出する。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画５から回収管（図３には示されていない）に移され得る。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画４から第２の回収管（図３には示されていない）に移され得る。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【００９７】
特定の実施形態において、希釈緩衝液および／またはＤＮＡ結合緩衝液は、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、系内においてＤＮＡ結合粒子から分離したまま維持される。特定の実施形態において、希釈緩衝液またはＤＮＡ結合緩衝液がアルコールを含む場合、このような構成要素を分離したまま維持することが望ましい場合がある。当業者であれば、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、ＤＮＡ結合粒子を希釈緩衝液および／またはＤＮＡ結合緩衝液から分離したまま維持するために、図１から３の系のいずれかを修飾することができる。
【００９８】
特定の実施形態において、細胞の捕捉を容易にするために、磁力が細胞捕捉マトリクスに加えられる。磁力は、特定の実施形態において、差次的抽出系の装置部分によって加えられる。
【００９９】
区画間でのＤＮＡ結合粒子の移動を用いる特定の例示的な系および方法
図４は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第４の非限定的な例示的な系を示す。図４に示される系は、区画間で液体を移動させることも可能な磁気粒子処理装置のために設計されたものである。例えば、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を参照されたい。図４に示される系は、区画３から６において精子細胞ＤＮＡを処理し、区画７から９において非精子細胞ＤＮＡを処理する。細胞捕捉マトリクスはまた、図４に示される例示的な系における非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとしても機能する。その系における細胞捕捉マトリクスは磁性である。
【０１００】
図４に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。細胞捕捉マトリクスは、細胞洗浄緩衝液を有する区画２に移される。細胞捕捉マトリクスは次に、選択的精子溶解緩衝液を有する区画３に移される。選択的精子溶解緩衝液は、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、依然として非精子細胞を捕捉している細胞捕捉マトリクスは、区画７内のＤＮＡ結合緩衝液に移される。区画７内のＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図４には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または粒子処理装置の一部である。非精子細胞ＤＮＡは、ＤＮＡ結合緩衝液内において、細胞捕捉マトリクスに結合する。結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、次に、細胞洗浄緩衝液を有する区画８に移される。最後に、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出緩衝液を有する区画９に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画９から回収管（図４には示されていない）に移され得る。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０１】
区画３における選択的精子溶解緩衝液の上清は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する希釈緩衝液とを有する、区画４に移される。結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、次に、ＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画５に移される。最後に、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、溶出緩衝液を有する区画６に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画６から第２の回収管（図４には示されていない）に移され得る。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画１０および区画１１（図４には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画１０に移される。特定のこのような実施形態において、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画１１に移される。
【０１０３】
図５は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第５の非限定的な例示的な系を示す。図５に示される系は、区画間で液体を移動させることも不可能な磁気粒子処理装置のために設計されたものである。例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を参照されたい。図５に示される系は、区画３から５において精子細胞ＤＮＡを処理し、区画６から８において非精子細胞ＤＮＡを処理する。細胞捕捉マトリクスはまた、図５に示される例示的な系における非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとしても機能する。その系における細胞捕捉マトリクスは磁性である。
【０１０４】
図５に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。細胞捕捉マトリクスは、細胞洗浄緩衝液を有する区画２に移される。細胞捕捉マトリクスは次に、区画３に移される。図５における区画３は、互いに分割された２つの区域を含む。区域間の分割部は、例えば物理的な力により、磁気粒子処理装置によって破壊可能である。区画３の上部は、選択的精子溶解緩衝液を含む。上部から分割されている、区画３の下部は、ＤＮＡ結合粒子および希釈緩衝液を有する。細胞捕捉マトリクスは、最初に上部に移される。選択的精子溶解緩衝液は、細胞捕捉マトリクスに捕捉されている精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、依然として非精子細胞を捕捉している細胞捕捉マトリクスは、区画６内のＤＮＡ結合緩衝液に移される。ＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図５には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または粒子処理装置の一部である。非精子細胞ＤＮＡは、ＤＮＡ結合緩衝液内において、細胞捕捉マトリクスに結合する。結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、次に、ＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画７に移される。最後に、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出緩衝液を有する区画８に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画８から回収管（図５には示されていない）に移され得る。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０５】
細胞捕捉マトリクスが取り除かれた後、装置は、区画３の上部と区画３の下部との間の破壊可能な分割部を破壊して、ＤＮＡ結合粒子を有する選択的精子溶解緩衝液の上清と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する希釈緩衝液とを混合する。結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、次に、ＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画４に移される。最後に、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、溶出緩衝液を有する区画５に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画５から第２の回収管（図５には示されていない）に移される。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画９および区画１０（図５には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画９に移される。特定のこのような実施形態において、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画１０に移される。
【０１０７】
図６は、特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡを結合するために用いられるＤＮＡ結合粒子が希釈緩衝液とは別の区画（区画４）内に維持されることを除いて、図５の系と類似している系を示す。図６に示される実施形態において、区画３は、図５の系の区画３に類似した、破壊可能な封印により分離された２つの個別の区域を有する。しかし、図６に示される実施形態において、下方の区画は希釈緩衝液のみを有しており、したがって、装置が封印を破壊する場合、選択的精子溶解緩衝液および希釈緩衝液はＤＮＡ結合緩衝液を形成する。装置は次に、ＤＮＡ結合粒子を区画４から区画３に移動させ、精子細胞ＤＮＡを結合させる。
【０１０８】
特定の実施形態において、希釈緩衝液またはＤＮＡ結合緩衝液は、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、系内においてＤＮＡ結合粒子から分離したまま維持される。特定の実施形態において、希釈緩衝液またはＤＮＡ結合緩衝液がアルコールを含む場合、このような構成要素を分離したまま維持することが望ましい場合がある。様々な実施形態において、当業者であれば、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、ＤＮＡ結合粒子を希釈緩衝液および／またはＤＮＡ結合緩衝液から分離したまま維持するために、図３から６の系のいずれかを修飾することができる。
【０１０９】
特定の実施形態において、系は１つまたは複数の空の区画を含む。１つまたは複数の空の区画は、特定の実施形態において、例えば洗浄後および溶出前に、ＤＮＡ結合粒子を乾燥させるための場所として用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年５月９日に出願された米国仮特許出願第６０／９１６，９９９号の利益を主張し、２００７年１月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／８８０，７８７号、２００７年２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／８９９，１０６号、２００８年１月１６日に出願された米国特許出願第１２／０１５，４１４号、および２００８年２月１５日に出願された米国特許出願第１２／０３２，２７０号に関連する。これらの出願の開示は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
限定はしないが、特許、特許出願、論文、本、論説、およびインターネットウェブページを含む、本出願において引用されるすべての文献および類似の資料は、そのような文献および類似の資料の形式にかかわらず、参照することにより、任意の目的でその全体が明らかに組み込まれる。限定はしないが、定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含む、組み込まれた文献および類似の資料の１つまたは複数が、本出願と異なるかまたは矛盾する場合、本出願が優先される。
【０００３】
少なくとも２つの異なる細胞タイプからＤＮＡを差次的抽出するための方法が提供される。差次的抽出法を実施するための系もまた提供される。
【背景技術】
【０００４】
性的暴力事件の法医学的なＤＮＡ分析は、精子細胞由来のＤＮＡ、および上皮細胞などの他の細胞由来のＤＮＡの分析を伴うことが多い。被害者から得られた試料は、精子と上皮細胞などの他の細胞との混合物を含んでいることが多い。上皮細胞などの他の細胞は、精子細胞の何倍も数が多い場合があるため、精子のＤＮＡが抽出されている間、ＤＮＡの１つまたは複数の他の由来源からの汚染が生じ得る。したがって、分析の前に、精子細胞と上皮細胞とを分離すること、または上皮のＤＮＡから精子のＤＮＡを可能な限り多く分離することが望ましい場合が多い。特定の場合において、正確なプロフィールを得るために特定のＤＮＡを分離および単離することが、加害者を同定するために重要である。
【０００５】
差次的抽出は、細胞の分離に用いることができるいくつかの抽出法を表現するために用いられる広義の用語である。特定の場合において、精子細胞の固有の特徴により、精子細胞からの上皮細胞の差次的抽出が可能になる。差次的抽出の１つの手順は、１９８５年に記載された（非特許文献１）。特定の場合において、被害者のＤＮＡプロフィールから精子細胞画分を分離することで、結果の曖昧性が減少し、強姦のケースにおける加害者のＤＮＡプロフィールの解釈が容易になる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｉｌｌら、（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ ３１８巻：５５７〜９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の実施形態において、精子細胞の差次的抽出のための系が提供される。特定の実施形態において、系は複数の区画を含み、少なくとも１つの区画は選択的精子溶解緩衝液を含む。特定の実施形態において、系は、細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、選択的精子溶解緩衝液を含む第２の区画とを含む。特定の実施形態において、系はさらに、複数のＤＮＡ結合粒子を含む第３の区画を含む。特定の実施形態において、系はさらに、溶出緩衝液を含む第４の区画を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、精子細胞の差次的抽出のための系は、細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、細胞洗浄緩衝液を含む第２の区画と、選択的精子溶解緩衝液を含む第３の区画と、複数のＤＮＡ結合粒子を含む第４の区画と、ＤＮＡ洗浄緩衝液を含む第５の区画と、溶出緩衝液を含む第６の区画とを含む。特定の実施形態において、系はさらに、ＤＮＡ結合緩衝液を含む第７の区画を含む。特定の実施形態において、第７の区画はさらに、第２の複数のＤＮＡ結合粒子を含む。特定の実施形態において、系はさらに、第２の複数のＤＮＡ結合粒子を含む第８の区画を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、系は複数の区画を含み、複数の区画は、取り外し可能なカートリッジの一部である。
【００１０】
特定の実施形態において、精子細胞および非精子細胞を含む生物学的試料における、精子細胞の差次的抽出の方法が提供される。特定の実施形態において、その方法は、（ａ）生物学的試料を、細胞捕捉マトリクスを含む、系の第１の区画内に置くステップと、（ｂ）細胞捕捉マトリクスで精子細胞および非精子細胞を捕捉するステップと、（ｃ）細胞捕捉マトリクスと捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートして、精子細胞溶解物を形成するステップと、（ｄ）精子細胞溶解物の精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップと、（ｅ）ＤＮＡ結合粒子から精子細胞ＤＮＡを溶出するステップとを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスで精子細胞および非精子細胞を捕捉するステップは、細胞捕捉マトリクスに磁力を加えるステップを含む。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスと捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートするステップは、系の第１の区画で行う。特定の実施形態において、精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子から精子細胞ＤＮＡを溶出するステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、精子細胞溶解物は、第１の区画から第２の区画へ運ばれる。
【００１２】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスと捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートするステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップは、系の第２の区画で行う。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子から精子細胞ＤＮＡを溶出するステップは、系の第３の区画で行う。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスならびに捕捉された精子細胞および非精子細胞は、磁力を用いて第１の区画から第２の区画へ運ばれる。
【００１３】
特定の実施形態において、非精子細胞は、選択的精子溶解緩衝液内での細胞捕捉マトリクスのインキュベーションの後、細胞捕捉マトリクス上に捕捉されたまま残る。特定の実施形態において、非精子細胞は溶解され、非精子細胞ＤＮＡは、細胞捕捉マトリクスに結合する。特定の実施形態において、非精子細胞は溶解され、非精子細胞ＤＮＡは、第２の複数のＤＮＡ結合粒子に結合する。
【００１４】
当業者には、以下に記載する図面が例示のみを目的とすることが理解されよう。図面は、決して、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図１の系は、区画間の流体の移動を伴うものである。図１の系は、非精子細胞を溶解しないが、その代わり、細胞捕捉マトリクスへの細胞の捕捉の後に試料内に存在する残留ＤＮＡを回収する。
【図２】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図２の系は、区画間の流体の移動を伴うものである。図２の系は、細胞捕捉マトリクスを、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合粒子として用いる。
【図３】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図３の系は、区画間の流体の移動を伴うものである。図３の系は、ＤＮＡ結合粒子の２つの個別の区画を含む。
【図４】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図４の系は、区画間の粒子の移動を伴うものであり、場合によっては、液体の移動を伴うものである。図４に示される系においては、細胞捕捉マトリクスは、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとして用いられる。
【図５】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図５の系は、区画間の粒子の移動を伴うものである。図５に示される系においては、細胞捕捉マトリクスは、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとして用いられる。
【図６】特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡおよび非精子細胞ＤＮＡを差次的抽出するための例示的な系を示す図である。図６の系は、ＤＮＡ結合粒子を、ＤＮＡ結合緩衝液とは別に保存する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において用いられる節の見出しは、編成を目的としたものにすぎず、記載される対象を限定するものであると解釈されるものではない。限定はしないが、特許、特許出願、論文、本、および論説を含む、本明細書において引用されるすべての文献または文献の一部は、参照することにより、任意の目的でその全体が明らかに本明細書に組み込まれる。限定はしないが、定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含む、組み込まれた文献または文献の一部の１つまたは複数が定義する用語が、本出願におけるその用語の定義と矛盾する場合、本出願が優先される。
【００１７】
単数形の使用には、別段の記載がない限り、複数形が含まれる。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は、別段の記載がない限り、「少なくとも１つの」を意味する。「または」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。複数の請求項を引用する従属請求項の状況における「または」の使用は、選択的であることのみを意味する。「少なくとも１つ」という表現の意味は、「１つまたは複数」という表現の意味に等しい。さらに、「含んでいる」という用語、ならびに「含む」および「含まれる」などの他の形態の使用は、限定的なものではない。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、別段の記載がない限り、１つのユニットを含む要素または構成要素と、２つ以上のユニットを含む要素または構成要素との両方を包含するものである。
【００１８】
本明細書において、標的分析物などの「１つの」部分の検出についての議論は、別段の記載がない限り、１つまたは複数のその部分を包含するものである。本明細書において論じられるすべての範囲には、両境界点および境界点の間のすべての値が含まれる。
【００１９】
定義
「生物学的試料」という用語は、少なくとも１つの生物学的材料を含む任意の試料を言う。例示的な生物学的材料には、限定はしないが、血液、唾液、皮膚、便、尿、精子細胞、上皮細胞（限定はしないが、膣上皮細胞を含む）、筋肉組織、および骨が含まれる。
【００２０】
「カートリッジ」という用語は、複数の区画を含んでおり、かつ個別の流体処理装置および／または磁気粒子処理装置を独立して機能させるのに十分な流体処理メカニズムおよび／または磁気粒子処理メカニズムを有していない系を言う。カートリッジは、特定の実施形態において、使い捨て用に設計することができ、使用の後、廃棄される。特定の実施形態において、カートリッジ内の区画の１つまたは複数は、試薬を有する。特定の実施形態において、カートリッジの区画のすべては、単一のユニット内に含まれる。特定の実施形態において、カートリッジの区画は、共にカートリッジを形成する２つ以上のユニットの間で分けられている。様々な実施形態において、単一のカートリッジは、１、２、４、６、８、１２、１６、２４、４８、９６、または９６個超の試料を処理するように設計される。様々な実施形態において、カートリッジは、１から４８個の試料、または１から２４個の試料、または２から２４個の試料、または１から１６個の試料、または２から１６個の試料を処理するように設計される。特定の実施形態において、カートリッジが少なくとも２つの試料を処理するように設計されている場合、カートリッジは、試料の少なくとも２つを同時に処理するように設計される。特定の実施形態において、カートリッジは、試料のすべてを同時に処理するように設計される。
【００２１】
「細胞混合物」という用語は、少なくとも２つ以上の異なる細胞タイプの異種的な集合体を言う。
【００２２】
「細胞捕捉マトリクス」という用語は、限定はしないが精子細胞および上皮細胞を含む細胞を捕捉するマトリクスを言う。特定の例示的な細胞捕捉マトリクスは、例えば、米国仮特許出願第６０／８９０，４６０号に記載されている。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞洗浄緩衝液の存在下では、細胞は捕捉するがＤＮＡは結合せず、しかしＤＮＡ結合緩衝液においてはＤＮＡを結合する能力を有する。
【００２３】
「細胞洗浄緩衝液」という用語は、その中において細胞が細胞捕捉マトリクスに捕捉されるが溶解はされない緩衝液を言う。特定の実施形態において、ＤＮＡは、細胞洗浄緩衝液の存在下では細胞捕捉マトリクスに結合しない。例示的な細胞洗浄緩衝液には、限定はしないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）（ｐＨ７．５）、Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）（ｐＨ８．５）、およびＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）（ｐＨ８）が含まれる。様々な実施形態において、当業者は、選択された細胞捕捉マトリクスおよび細胞タイプに従って、適切な細胞洗浄緩衝液を選択することができる。
【００２４】
「区画」という用語は、流体を保持するように構成された個別の空間を規定する、任意の貯蔵構造を言う。例えば、区画は、流体を保持するように構成された内部空間を規定する、独立した容器または入れ物であり得る。あるいは、区画は、流体を保持するように構成された、容器または入れ物内の、複数の区分けされた空間の１つであり得る。さらに、区画により規定される、流体を保持する空間は、実質的に密封されているか、あるいは、少なくとも部分的に大気に通じている。
【００２５】
「差次的抽出」という用語は、異種的な細胞集団から細胞タイプの小集団を抽出するために用いられる抽出法を言う。特定の実施形態において、差次的抽出には、精子細胞と、限定はしないが上皮細胞を含む非精子細胞との混合物における、精子細胞の選択的な溶解が含まれる。
【００２６】
「ＤＮＡ結合粒子」という用語は、適切な緩衝条件下においてＤＮＡを結合することが可能な磁気粒子を言う。例示的な磁気粒子には、限定はしないが、強磁性の、常磁性の、および超常磁性の粒子が含まれる。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子は、ＤＮＡ結合緩衝液の存在下でＤＮＡを結合する。
【００２７】
「ＤＮＡ結合緩衝液」という用語は、その中においてＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスがＤＮＡを結合し得る緩衝液を言う。
【００２８】
「選択的精子溶解緩衝液」という用語は、精子細胞と少なくとも１つのタイプの非精子細胞とを含む混合物において優先的に精子細胞を溶解し得る緩衝液を言う。特定の例示的な選択的精子溶解緩衝液は、例えば米国仮特許出願第６０／８９９，１０６号および米国仮特許出願第６０／８９０，４７０号に記載されている。「優先的に精子細胞を溶解する」とは、主に精子細胞が溶解されることを意味する。特定の実施形態において、ごく少量の非精子細胞が溶解される。様々な実施形態において、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の精子細胞が溶解される。様々な実施形態において、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の非精子細胞が溶解されない。
【００２９】
「希釈緩衝液」という用語は、選択的精子溶解緩衝液を希釈して、この緩衝液をＤＮＡ結合緩衝液とするために用いることができる緩衝液を言う。希釈緩衝液は、様々な実施形態において、カオトロピック塩、一価塩、および／またはアルコールを含み得る。
【００３０】
「溶出緩衝液」という用語は、ＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスからＤＮＡを放出させる緩衝液を言う。特定の例示的な溶出緩衝液には、限定はしないが、低塩緩衝液（限定はしないが、ＴＥおよび脱イオン水を含む）が含まれる。様々な実施形態において、当業者は、用いられるＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスに従って適切な溶出緩衝液を選択することができる。特定の実施形態において、溶出緩衝液の存在下でのＤＮＡの溶出を容易にするために、熱が加えられる。
【００３１】
「法医学的な試料」という用語は、限定はしないが、殺人、強姦、外傷、暴行、殴打、窃盗、強盗、他の刑事事件、身元確定検査、親確定検査、または実父確定検査を含む法的状況において生じる身元問題への対処に用いるために得られた生物学的試料、および入り混じった試料（ｍｉｘｅｄ−ｕｐ ｓａｍｐｌｅｓ）を言う。
【００３２】
「一般的な溶解緩衝液」という用語は、非精子細胞を溶解し、かつ精子細胞も溶解し得るかまたはし得ない緩衝液を言う。特定の例示的な一般的な溶解緩衝液は、当技術分野において知られており、様々な実施形態において、当業者は、意図した使用に基づいて一般的な溶解緩衝液を選択することができる。非限定的な例示的な一般的な溶解緩衝液は、２％ＳＤＳ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、および５００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む。
【００３３】
「溶解物」という用語は、溶解した細胞の残屑およびＤＮＡを有する液相を言う。
【００３４】
「医学的試料」という用語は、限定はしないが、研究、診断、ならびに組織および器官の移植片を含む医学的問題に対処するために得られた試料を言う。
【００３５】
「塩」または「塩試薬」または「塩溶液」という用語は、正および／または負に帯電したイオン試薬を言う。特定の実施形態において、塩試薬は、精子のクロマチンを崩壊させる。塩試薬は、様々な実施形態において、一価の、二価の、または多価のイオンであり得る。例示的な塩試薬には、限定はしないが、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｌｉ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＳＯ４、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、およびＣａ（ＮＯ３）２が含まれる。
【００３６】
「ジスルフィド結合還元剤」という用語は、例えばタンパク質におけるジスルフィド結合を還元する作用物質を言う。特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元剤は、精子細胞におけるプロタミンのジスルフィド架橋を崩壊させる。ジスルフィド結合還元剤は、不水溶性または水溶性であり得る。例示的な不水溶性作用物質には、限定はしないが、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）が含まれる。例示的な水溶性作用物質には、限定はしないが、グルタチオン（ＧＳＨ）およびメルカプトエタノール（ＭＥ）が含まれる。
【００３７】
特定の例示的な選択的精子溶解緩衝液
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つのジスルフィド結合還元試薬および少なくとも１つの塩試薬を含む。
【００３８】
特定の実施形態において、ジスルフィド結合還元剤は、ＭＥ、ＤＴＴ、ＧＳＨ、およびＴＣＥＰから選択される。
【００３９】
特定の実施形態において、少なくとも１つの塩試薬は、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｌｉ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＳＯ４、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、およびＣａ（ＮＯ３）２から選択される。特定の実施形態において、少なくとも１つの塩試薬は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２から選択される。
【００４０】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つの塩試薬を、少なくとも０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、または２Ｍの濃度で含む。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つの塩試薬を、０．１Ｍから２Ｍの濃度で含む。
【００４１】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、少なくとも１つのジスルフィド結合還元試薬を、少なくとも０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．７Ｍ、または０．８Ｍの濃度で含む。
【００４２】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＭＥ、ＤＴＴ、ＧＳＨ、およびＴＣＥＰから選択される少なくとも１つのジスルフィド結合還元試薬、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびＣａＣｌ２から選択される少なくとも１つの塩試薬を含む。特定の実施形態において、塩および還元剤の濃度は、選択的精子溶解緩衝液が優先的に精子細胞を溶解するようなものである。
【００４３】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液はＮａＣｌを含む。特定の実施形態において、ＮａＣｌの濃度は少なくとも０．８Ｍである。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液はＫＣｌを含む。特定の実施形態において、ＫＣｌの濃度は少なくとも０．８Ｍである。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液はＭｇＣｌ２を含む。特定の実施形態において、ＭｇＣｌ２の濃度は少なくとも０．２５Ｍである。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＤＴＴを少なくとも５０ｍＭの濃度で含む。
【００４４】
様々な実施形態において、当業者は、最終的な塩濃度のレベルを、優先的に精子細胞を溶解するように最適化することができる。
【００４５】
特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＤＮＡ結合緩衝液となるように、希釈緩衝液で希釈される。特定の実施形態において、選択的精子溶解緩衝液は、ＤＮＡ結合緩衝液で希釈され、それにより得られた緩衝液はＤＮＡ結合緩衝液である。様々な実施形態において、当業者は、選択的精子溶解緩衝液と混合した後に、ＤＮＡ結合緩衝液が生じるかまたはＤＮＡ結合緩衝液のＤＮＡ結合特性が維持されるように、適切な希釈緩衝液および／または適切な希釈量を選択することができる。
【００４６】
特定の例示的な細胞捕捉マトリクスおよびＤＮＡ結合粒子
細胞捕捉マトリクスは、限定はしないが精子細胞および上皮細胞を含む細胞を捕捉するマトリクスである。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞を捕捉するために用いられる条件と同一であり得るかまたは異なり得る適切な条件下で、ＤＮＡを結合する。様々な実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁気粒子からなる。例示的な磁気粒子には、限定はしないが、強磁性の、常磁性の、および超常磁性の粒子が含まれる。
【００４７】
例示的な細胞捕捉マトリクスおよび／またはＤＮＡ結合粒子には、限定はしないが、超磁性のコアを有する多孔質シリカビーズが含まれる。超磁性のコアを有する例示的な多孔質シリカビーズには、限定はしないが、ＭＰ−５０（６．５μｍ）およびＭＰ−８５（＞８μｍ）（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）、ＤＮＡ ＩＱ（商標）シリカ粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）シリカ粒子（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＢｃＭａｇ（登録商標）シリカ修飾磁気ビーズ（５μｍまたは１μｍ）（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ならびに超磁気シリカ粒子（１μｍまたは０．７５μｍ、Ｇ．Ｋｉｓｋｅｒ ＧｂＲ、Ｓｔｅｉｎｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。特定の例示的な非シリカ細胞捕捉マトリクスには、限定はしないが、ストレプトアビジンで固定された酸化鉄（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、酸化鉄（ＩＩＩ）粉末（５μｍ）（Ｓｉｇｍａ）、ＭａｇＭＡＸ（登録商標）磁気粒子（１μｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれ、これらは、異なるタイプの表面官能基（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＷＣＸ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＴＡＬＯＮ、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅトシル活性化）を含み得る。
【００４８】
特定の例示的な細胞捕捉方法
様々な実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁気粒子を含む。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁場の不存在下で細胞を捕捉する。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、磁場の存在下で細胞を捕捉する。細胞の捕捉のタイミングおよびメカニズムは、様々な実施形態において、用いられる細胞捕捉マトリクスおよび緩衝液の条件に依存する。
【００４９】
細胞捕捉マトリクスは、任意の様々なメカニズムによって細胞を捕捉し得る。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、非共有結合的な相互作用を介して細胞を捕捉する。特定の例示的な非共有結合的な相互作用には、限定はしないが、水素結合、陽イオン−Π相互作用、Π−Π相互作用、イオン結合、疎水性相互作用、双極子−双極子相互作用、双極子誘発性の双極子相互作用、電荷−双極子相互作用、およびファンデルワールス相互作用が含まれる。特定の実施形態において、細胞は、イオン相互作用を介して細胞捕捉マトリクスによって捕捉される。特定の実施形態において、細胞は、抗体／抗原相互作用を介して細胞捕捉マトリクスによって捕捉される。
【００５０】
特定の実施形態において、非共有結合的な相互作用の継続時間および強さは、細胞が細胞捕捉マトリクスにより捕捉され続けるがマトリクスが１つの位置から別の位置へ移動するようなものである。特定のこのような実施形態において、細胞捕捉マトリクスは磁気粒子を含み、移動は、磁場を加えることにより生じる。細胞と細胞捕捉マトリクスとの間の非共有結合的な関連のタイプ、継続時間、および強さは、様々な実施形態において、マトリクスのサイズ、形状、表面特性、表面形態、および／もしくは密度、捕捉される細胞のサイズ、形状、表面特性、表面形態、および／もしくは密度、ならびに／または緩衝液の組成、ｐＨ、および／もしくは温度によって決定される。
【００５１】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、例えば磁場を加えた場合に、物理的に細胞を捕捉する。このような物理的捕捉は、特定の実施形態において、磁場における細胞捕捉マトリクス粒子の凝集に起因し得る。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞のこのような物理的捕捉を容易にするために、不規則な形状をした粒子を含む。様々な実施形態において、細胞捕捉マトリクス粒子は、捕捉される細胞よりも小さいかもしくは大きいものであり得るか、または、捕捉されるいくつかの細胞よりも大きく、かつ捕捉される他の細胞よりも小さいものであり得る。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、細胞を磁場源の方向に押して、細胞を上清から隔離することにより、細胞を捕捉し得る。特定のこのような実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、粒子間の空間が、試料内の最も小さい細胞のサイズよりも小さくなるような密度にある粒子からなる。
【００５２】
特定の実施形態において、２つ以上のタイプの非共有結合的な相互作用が、細胞と細胞捕捉マトリクスとの間に存在する。特定のこのような実施形態において、非共有結合的な相互作用の１つのタイプは細胞の捕捉にさらに寄与し得、その相互作用の優位性は、試料内の細胞タイプごとに変化し得る。
【００５３】
精子細胞は、約５μｍの直径を有し、上皮細胞は、約５０μμの直径を有する。様々な実施形態において、精子細胞および上皮細胞を捕捉するために用いられる細胞捕捉マトリクスは、０．５μｍから１００μｍの直径を有する粒子を含む。特定の実施形態において、粒子は１μｍから１０μｍの直径を有する。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスにおける少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の粒子が、０．５μｍから１００μｍ、または１μｍから１０μｍの直径を有する。当業者は、様々な実施形態において、特定の適用に従って細胞を捕捉するために、粒子の適切なサイズ、形状、密度、および表面特性を選択することができる。
【００５４】
特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、１つまたは複数の抗体を含む。特定のこのような実施形態において、抗体の１つまたは複数は、試料内の細胞の少なくとも１つのタイプ上に存在する細胞表面抗原を結合する。特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、試料内の２つ以上の細胞タイプ上の少なくとも１つの細胞表面抗原に共に結合する、１つまたは複数の抗体を含む。非制限的な例として、特定の実施形態において、細胞捕捉マトリクスは、上皮細胞上の細胞表面抗原を結合する抗体で被覆された粒子の第１のセット、および精子細胞上の細胞表面抗原を結合する抗体で被覆された粒子の第２のセットを含み得る。
【００５５】
精子細胞および／または上皮細胞を結合する特定の例示的な抗体には、限定はしないが、ヒト上皮抗原であるＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）を結合するモノクローナル抗体ＢｅｒＥＰ４、精子プロタミンに対する抗体、ヒト精子凝集抗原Ｉ（ＳＡＧＡ−Ｉ）上に位置する炭水化物エピトープに対する抗体（例えば、米国特許第５，６０５，８０３号を参照されたい）、核空胞および精子の核の冗長膜内に存在する精子タンパク質であるＳＰＡＮ−Ｘに対する抗体（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４９７３を参照されたい）、Ｃ５８またはＳＭＡＲＣ３２に対する抗体（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１８２７５１号を参照されたい）が含まれる。特定の実施形態において、抗体は、複数の細胞タイプ上に存在する細胞表面抗原（例えば、タンパク質または炭水化物）を結合する。
【００５６】
特定の実施形態において、区画の下に磁場が加えられると、細胞は、細胞捕捉マトリクスによって、区画の底部に押されるか、引っ張られるか、または運ばれる。特定の実施形態において、区画の側面から磁場が加えられると、細胞は、細胞捕捉マトリクスによって、区画の側面に押されるか、引っ張られるか、または運ばれる。特定の実施形態において、細胞は、細胞捕捉マトリクスによって、区画内に挿入された磁性の棒に押されるか、引っ張られるか、または運ばれる。特定のこのような実施形態において、磁性の棒は、例えば磁性の棒の汚染を防ぐための取り外し可能な保護物で覆われている。特定の実施形態において、磁性の棒は、細胞捕捉マトリクスを１つの区画から別の区画へ移動させるために用いることができる。
【００５７】
特定の実施形態において、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅカルボン酸ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が、細胞を捕捉するための細胞捕捉マトリクスとして用いられる。粒子は１μｍであり、特定の実施形態において、約５５個細胞／μＬを含む試料１μｌに対して約１０６個の粒子の密度で用いられる（例えば、約１０００個の精子細胞および約１万個の上皮細胞を含む２００μＬ）。特定の実施形態において、１μｌ当たり１０６個超の粒子が用いられ得る。特定の実施形態において、１μｌ当たり１０６個未満の粒子が用いられる。
【００５８】
様々な実施形態において、試料内の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のインタクトな細胞が、細胞捕捉マトリクスにより捕捉される。様々な実施形態において、１つの細胞タイプが溶解された後、試料内の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の残存しているインタクトな細胞が、細胞捕捉マトリクスに捕捉されるか、または、捕捉されたまま残る。
【００５９】
特定の例示的なＤＮＡ結合緩衝液
特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子がシリカビーズである場合、ＤＮＡ結合緩衝液はカオトロピック塩を含む。特定の例示的なカオトロピック塩には、限定はしないが、グアニジウムイソチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）および塩化グアニジウムが含まれる。特定の実施形態において、例えばＤＮＡ結合粒子が非シリカビーズである場合、ＤＮＡ結合緩衝液はカオトロピック塩およびアルコールを含む。特定のこのような実施形態において、ＤＮＡ結合緩衝液はさらに、一価の塩を含む。特定の例示的な一価の塩には、限定はしないが、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、および塩化アンモニウムが含まれる。特定の例示的なアルコールには、限定はしないが、イソプロパノールおよびエタノールが含まれる。特定の実施形態において、アルコールは、ＤＮＡ結合緩衝液において、３０％以上の濃度である。特定の実施形態において、カオトロピック塩およびアルコールを含むＤＮＡ結合緩衝液は、「ＤＮＡ沈殿緩衝液」と呼ばれる。特定の例示的なＤＮＡ結合緩衝液は、例えば、米国特許第５，２３４，８０９号、米国特許第５，５２３，２３１号、および米国特許第５，７０５，６２８号に記載されている。当業者は、用いられるＤＮＡ結合粒子および／または細胞捕捉マトリクスに従って、適切なＤＮＡ結合緩衝液を選択することができる。
【００６０】
シリカベースのＤＮＡ結合粒子に適した、例示的なＤＮＡ結合緩衝液には、限定はしないが、ＢｌｏｏｄＰｒｅｐ（商標）ＤＮＡ精製溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤＮＡ ＩＱ（商標）溶解溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。様々な実施形態において、非シリカＤＮＡ結合粒子では、当業者は、ＢｌｏｏｄＰｒｅｐ（商標）ＤＮＡ精製溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＤＮＡ ＩＱ（商標）溶解溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、適切な量のアルコールを加えることができる。非限定的な例として、様々な実施形態において、ＤＮＡ沈殿緩衝液を作製するために、これらの溶液の１つにイソプロパノールが３０％の最終濃度まで加えられる。さらなる非限定的な例として、様々な実施形態において、ＤＮＡ沈殿緩衝液を作製するために、これらの溶液の１つにエタノールが４０〜５０％の最終濃度まで加えられる。
【００６１】
特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子は、本明細書において記載される系においてＤＮＡ結合緩衝液内に保存される。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合粒子は、本明細書において記載される系においてＤＮＡ結合緩衝液とは別に保存される。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合緩衝液がＤＮＡ沈殿緩衝液である場合、ＤＮＡ結合粒子は個別に保存される。
【００６２】
特定の実施形態において、非精子細胞はＤＮＡ結合緩衝液内で溶解される。特定の実施形態において、非精子細胞は、ＤＮＡ結合緩衝液内で熱を加えながら溶解される。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合緩衝液がＤＮＡ沈殿緩衝液である場合、非精子細胞はまず、アルコールを含まないＤＮＡ結合緩衝液内で溶解される。特定の実施形態において、次に、ＤＮＡ沈殿緩衝液を作製するために、溶解物にアルコールが加えられる。
【００６３】
特定の例示的なＤＮＡ洗浄緩衝液
特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は、ゲノムＤＮＡがＤＮＡ洗浄緩衝液に実質的にまったく溶解しないように調製される。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は、大きなＤＮＡ（例えば、約１ｋｂ超）がＤＮＡ洗浄緩衝液に実質的にまったく溶解しないように調製される。特定の例示的なＤＮＡ洗浄緩衝液は、当技術分野において知られており、通常は少なくとも１つのアルコールを含む。ＤＮＡ洗浄緩衝液において用い得る特定の例示的なアルコールには、限定はしないが、エタノールおよびイソプロパノールが含まれる。
【００６４】
特定の実施形態において、１つのＤＮＡ洗浄緩衝液が用いられる場合、それは９０％エタノールを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡが２回洗浄される場合、同一のＤＮＡ洗浄緩衝液が両方の洗浄に用いられる。特定の実施形態において、ＤＮＡが２回洗浄される場合、２つの異なるＤＮＡ洗浄緩衝液が用いられる。特定の実施形態において、２つの異なるＤＮＡ洗浄緩衝液が用いられる場合、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、第１のＤＮＡ洗浄緩衝液よりも高いアルコール濃度を有する。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液はＧｕＳＣＮおよび／またはＧｕＣｌを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は、ＧｕＳＣＮおよびイソプロパノールを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は７０％エタノールを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ洗浄緩衝液は９０％エタノールを含む。
【００６５】
様々な実施形態において、当業者は、選択された適用に従って１つまたは複数のＤＮＡ洗浄緩衝液を調製することができる。
【００６６】
特定の例示的なＤＮＡ分析法
ＤＮＡが単離された後、様々な方法を、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析などのＤＮＡ分析、および、限定はしないが短鎖縦列反復（ＳＴＲ）分析を含む、様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた方法に用いることができる。
【００６７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、限定はしないが少量のＤＮＡを含む核酸を増幅するために用いることができる反応を言う。ＰＣＲは、標的ＤＮＡのさらなるコピーを生じさせるために、変性、１つまたは複数のプライマーとのアニーリング、および１つまたは複数のＤＮＡポリメラーゼでの伸長からなるサイクルを用いる技術である。特定の実施形態において、ＰＣＲはＤＮＡ配列を１０６倍超増幅する。特定の例示的なＰＣＲ法は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，９６５，１８８号、および米国特許第４，６８３，２０２号、ならびに欧州特許第２０１１８４号および欧州特許第２００３６２号に記載されている。
【００６８】
特定の実施形態において、ＤＮＡサンプルは、例えば目的のＳＴＲを含むそれぞれの遺伝子座に特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅に供される。ＳＴＲの遺伝子座は、それぞれが例えば２から７ｂｐの長さである縦列反復配列からなる。様々な実施形態において、４ｂｐ（テトラヌクレオチド）および／または５ｂｐの反復配列を含む遺伝子座が、ヒトの同定に用いられる。４および５ｂｐの反復配列は、ヒトゲノムの全体にわたって見られ、特定の場合において、高度に多型である。テトラヌクレオチド反復のＳＴＲの遺伝子座での対立遺伝子の数は、様々な実施形態において、約４から２０である。
【００６９】
特定の実施形態において、単離されたＤＮＡが多型ＳＴＲの検出に用いられる場合、個別のＤＮＡ試料から増幅された対立遺伝子を、１つまたは複数のサイズ標準、例えば市販のＤＮＡマーカーおよび／または遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーと比較して、それぞれの遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定することができる。特定の実施形態において、対立遺伝子ラダーは、特定の遺伝子座に由来する２つ以上の既知の対立遺伝子に相当する、２つ以上の異なる長さのＤＮＡを含む。様々な実施形態において、ＤＮＡは、限定はしないが、銀染色、放射性標識、蛍光標識、様々な色素および染料を含む、任意の技術によって、視覚化することができる。特定の実施形態において、視覚化の前に、変性ゲル電気泳動もしくは未変性ゲル電気泳動、または任意の他のサイズ分離法を用いて、ＤＮＡを分離する。
【００７０】
特定の実施形態において、増幅された対立遺伝子は、ＤＮＡ配列分析に供される。
【００７１】
特定の例示的なＤＮＡ増幅および分析の方法は、当技術分野において知られており、例えば、Ｂｕｄｏｗｌｅら（ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：ＭＡ、ＵＳＡ（２０００年））に記載されている。
【００７２】
特定の例示的な磁気粒子処理装置
特定の実施形態において、差次的抽出系は、磁気粒子処理装置、および複数の区画を含む取り外し可能なカートリッジを含み、ここで、区画の少なくとも１つは、差次的抽出系において用いられる少なくとも１つの試薬を含む。
【００７３】
特定の実施形態において、磁気粒子処理装置は、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）に類似したものである。例えば、ＥＺ１ ＤＮＡ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版（２００４年２月）（Ｑｉａｇｅｎ）を参照されたい。ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎは、床面と平行な面を移動し得るステージ、ステージに対して上方および下方に移動し得るピペット、ならびにピペットの方におよびピペットから離れるように移動し得る磁石を含む。ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎは、区画間で磁気粒子および液体の両方を移動させることが可能である。特定の実施形態において、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎは、以下のように機能する。複数の液体試薬を含む複数の区画を有する、取り外し可能なカートリッジは、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎのステージ上に置かれている。取り外し可能なカートリッジはまた、磁気粒子を有する少なくとも１つの区画を含む。ステージは、磁気粒子を有する区画を、ピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは区画内へ下降し、磁気粒子を含む溶液を吸い上げる。磁石はピペットの方へ移動して、ピペット内部の磁気粒子を保持し、一方で、ピペットは、磁気粒子を残して溶液を吐き出す。ステージは、次に、試薬を有する第２の区画を、磁石によって保持されている磁気粒子を有するピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは第２の区画から試薬を吸い上げ、磁石はピペットから離れるように移動し、そしてピペットは、試薬および磁気粒子を第２の区画内に吐き出す。
【００７４】
特定の実施形態において、磁気粒子処理装置は、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に類似したものである。例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（２００５年９月）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を参照されたい。Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、床面と平行な面を移動し得るステージ、ステージに対して上方および下方に移動し得るプランジャー、ならびに、プランジャー内部に位置し、プランジャーの端部に対して上方および下方に移動し得る磁石を含む。Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、区画間で磁気粒子を移動させ得るが、液体は移動させ得ない。特定の実施形態において、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、以下のように機能する。複数の液体試薬を含む複数の区画を有する、取り外し可能なカートリッジは、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのステージ上に置かれている。取り外し可能なカートリッジはまた、磁気粒子を含む少なくとも１つの区画を含む。ステージは、磁気粒子を有する区画を、プランジャーの真下の位置に移動させる。プランジャーピペットは区画内へ下降し、磁石はプランジャー内部を下降し、プランジャーの端部に磁気粒子を引き付ける。プランジャーおよび磁石は次に上昇し、ステージは、試薬を有する第２の区画を、磁石によって保持されている磁気粒子を有するプランジャーの真下の位置に移動させる。プランジャーは第２の区画内に下降し、磁石はプランジャーの端部から離れるように上昇し、磁気粒子を第２の区画内に放出する。
【００７５】
特定の実施形態において、磁気粒子処理装置は、床面と平行な面を移動し得るステージ、ステージに対して上方および下方に移動し得るピペット、ならびに、ステージ上に置かれたカートリッジへの磁石の接触を可能にする位置にある磁石を含む。様々な実施形態において、磁石は、カートリッジの真下、またはカートリッジの１つもしくは複数の側面上に位置し得る。特定の実施形態において、磁石は、カートリッジの少なくとも１つの区画に対して磁力を付与および放出するために、カートリッジの方におよびカートリッジから離れるように移動し得る。特定の実施形態において、磁石は静止しており、カートリッジの少なくとも１つの区画に対して磁力を付与および放出するために、電子的にオンおよびオフされ得る。そのような例示的な磁気粒子処理装置は、以下のように機能する。複数の液体試薬を含む複数の区画を有する取り外し可能なカートリッジは、装置のステージ上に置かれている。取り外し可能なカートリッジはまた、磁気粒子を有する少なくとも１つの区画を含む。ステージは、試薬を有する区画を、ピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは試薬を吸い上げ、ステージは、磁気粒子を有する区画を、ピペットの真下の位置に移動させる。ピペットは次に、試薬を区画内に吐き出す。磁石は、ピペットから離れた、区画内の１つの位置に磁気粒子を引き付け、ピペットは次に、磁気粒子を残して液体を吸い上げる。このようにして、ピペットは、磁気粒子に試薬をもたらすため、および磁気粒子から試薬を取り除くために用いることができ、一方、磁石は、磁気粒子をピペットの通り道から離れたところに保持するために用いられる。
【００７６】
様々な実施形態において、当業者は、本明細書において記載される方法を実施するための装置を設計および／またはプログラムすることができる。特定の実施形態において、このような装置は、上述した装置の１つまたは複数に類似し得る。
【００７７】
差次的抽出のための特定の例示的な系および方法
様々な実施形態において、差次的抽出のための系は、複数の区画を含むカートリッジを含み、区画の少なくとも１つは、選択的精子溶解緩衝液を含む。差次的抽出のための特定の例示的な系および方法が、本明細書において記載される。特定の実施形態において、その方法は、区画間で流体を移動させるステップを含む。特定の実施形態において、その方法は、区画間でＤＮＡ結合粒子を移動させるステップを含む。特定の実施形態において、その方法は、区画間で流体およびＤＮＡ結合粒子を移動させるステップを含む。
【００７８】
差次的抽出系の以下の例は、非限定的なものである。例えば、図面に示される、および本明細書において記載される区画の配置は、比喩的なものであり、非限定的なものである。様々な実施形態において、当業者は、本明細書における教示、目的とされる使用、および選択される装置に基づいて、系を設計することができる。様々な実施形態において、このような系は、本明細書において記載される任意の以下の例示的な系よりも多いかまたは少ない区画を含む。様々な実施形態において、このような系は、以下の例示的な系の１つまたは複数において組み合わせて示されている個別の区画内に試薬を分離する。
【００７９】
区画間の流体の移動を用いる特定の例示的な系および方法
図１は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第１の非限定的な例示的な系を示す。例えば試料が精子細胞と比較して過剰な非精子細胞を含む（例えば、精子細胞よりも非精子細胞が少なくとも１０倍多い）場合、図１に示された系が用いられる。図１の系は、非精子細胞を溶解しないが、その代わり、細胞捕捉マトリクス上に細胞が捕捉された後に試料内に存在している残留ＤＮＡを回収する。このような残留ＤＮＡは、系の中に試料を置く前の細胞の破砕に起因して存在し得る。このような細胞の破砕は、様々な実施形態において、回収の前、回収の最中、保存の最中、輸送の最中、および１つの容器から別の容器への試料の移動の最中に生じ得る。試料中で精子細胞と比較して非精子細胞が過剰であることにより、残留ＤＮＡは、精子細胞ＤＮＡと比較して過剰な非精子細胞ＤＮＡを含む。
【００８０】
図１に記載された実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。区画１の上清を次に、回収管に取り出す（図示はしていない）。元の試料が、精子細胞と比較して、過剰な非精子細胞、例えば上皮細胞を含んでいた（例えば、精子細胞よりも非精子細胞が１０倍超多い）場合、試料の結合から得られた上清は、分析に十分な非精子細胞ＤＮＡを含んでいる可能性がある。
【００８１】
区画２に位置している細胞洗浄緩衝液は、次に、区画１に移される。区画１からの細胞洗浄上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。廃棄物入れは、図１に示される系の連続した部分であって良いか、またはそうでなくても良い。特定の実施形態において、図１の区画１から６がカートリッジ内に含まれる場合、廃棄物区画０はカートリッジの一部ではない。特定の実施形態において、カートリッジは、図１の区画０から６を含む。
【００８２】
区画１から細胞洗浄上清が取り除かれた後、選択的精子溶解緩衝液は、区画３から区画１に移される。選択的精子溶解緩衝液は、区画１において、細胞捕捉マトリクスに結合した精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、溶解物の上清は区画１から区画４に移され、この区画４は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する、希釈緩衝液とを有する。ＤＮＡ結合の後、区画４の上清は、廃棄物区画０に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画５から区画４に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４から廃棄物区画０に移される。
【００８３】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画７（図１には示されていない）内に含まれる。特定のこのような実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画４に移される。第２のＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４から廃棄物区画０に移される。
【００８４】
最後に、溶出緩衝液が、区画６から区画４に移される。溶出緩衝液は、ＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に精子細胞ＤＮＡを放出する。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画４から第２の回収管（図１には示されていない）に移される。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【００８５】
図２は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第２の非限定的な例示的な系を示す。図２に示される系において、細胞捕捉マトリクスはまた、非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとしても機能する。
【００８６】
図２に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。区画１の上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。廃棄物入れは、図２に示される系の連続した部分であって良いか、またはそうでなくても良い。特定の実施形態において、図２の区画１から７がカートリッジ内に含まれる場合、廃棄物区画０はカートリッジの一部ではない。特定の実施形態において、カートリッジは、図２の区画０から７を含む。
【００８７】
区画２内に位置する細胞洗浄緩衝液は、次に、区画１に移される。区画１からの細胞洗浄上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。区画１から細胞洗浄上清が取り除かれた後、選択的精子溶解緩衝液は、区画３から区画１に移される。選択的精子溶解緩衝液は、区画１において、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、溶解物の上清は区画１から区画５に移され、この区画５は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する、希釈緩衝液とを有する。ＤＮＡ結合緩衝液は次に、区画４から区画１に移され、この区画１は今や、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された非精子細胞を含む。ＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図２には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または磁気粒子処理装置の一部である。非精子細胞ＤＮＡは、ＤＮＡ結合緩衝液内において、細胞捕捉マトリクスに結合する。
【００８８】
区画１および５におけるＤＮＡの結合の後、区画１および５の上清は、廃棄物区画０に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画６から区画１および５のそれぞれに移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画１および５から廃棄物区画０に移される。
【００８９】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画８（図２には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画１および５に移される。第２のＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画１および５から廃棄物区画０に移される。
【００９０】
最後に、溶出緩衝液が、区画７から区画１および５のそれぞれに移される。溶出緩衝液は、区画５においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に精子細胞ＤＮＡを放出し、区画１においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に非精子細胞ＤＮＡを放出する。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画５から回収管（図３には示されていない）に移される。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画１から第２の回収管（図３には示されていない）に移される。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【００９１】
図３は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第３の非限定的な例示的な系を示す。図３に示される系は、一方は精子細胞ＤＮＡを結合するために用いられ、もう一方は非精子細胞ＤＮＡを結合するために用いられる、ＤＮＡ結合粒子を含む２つの個別の区画を含む。
【００９２】
図３に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。区画１の上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。廃棄物入れは、図３に示される系の連続した部分であって良いか、またはそうでなくても良い。特定の実施形態において、図３の区画１から７がカートリッジ内に含まれる場合、廃棄物区画０はカートリッジの一部ではない。特定の実施形態において、カートリッジは、図３の区画０から７を含む。
【００９３】
区画２に位置している細胞洗浄緩衝液は、次に、区画１に移される。区画１からの細胞洗浄上清は次に、区画０と示される廃棄物入れに移される。区画１から細胞洗浄上清が取り除かれた後、選択的精子溶解緩衝液は、区画３から区画１に移される。選択的精子溶解緩衝液は、区画１において、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、溶解物の上清は区画１から区画５に移され、この区画５は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する、希釈緩衝液とを有する。ＤＮＡ結合緩衝液は次に、区画４から区画１に移され、この区画１は今や、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された非精子細胞を含む。特定の実施形態において、区画４からのＤＮＡ結合緩衝液の移動の間に、ＤＮＡ結合粒子は、ＤＮＡ結合粒子がＤＮＡ結合緩衝液と共に除去されることを防ぐために、流体処理装置上の磁石により区画４において保持される。ＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図３には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または粒子処理装置の一部である。ＤＮＡ結合緩衝液／溶解物の上清は次に、区画１から、ＤＮＡ結合粒子を含む区画４に戻される。
【００９４】
区画４および５におけるＤＮＡの結合の後、区画４および５の上清は、廃棄物区画０に移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画６から区画４および５のそれぞれに移される。ＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４および５から廃棄物区画０に移される。
【００９５】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画８（図３には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は次に、区画４および５に移される。第２のＤＮＡ洗浄緩衝液の上清は次に、区画４および５から廃棄物区画０に移される。
【００９６】
最後に、溶出緩衝液が、区画７から区画４および５のそれぞれに移される。溶出緩衝液は、区画５においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に精子細胞ＤＮＡを放出し、区画４においてＤＮＡ結合粒子から溶出上清内に非精子細胞ＤＮＡを放出する。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画５から回収管（図３には示されていない）に移され得る。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画４から第２の回収管（図３には示されていない）に移され得る。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【００９７】
特定の実施形態において、希釈緩衝液および／またはＤＮＡ結合緩衝液は、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、系内においてＤＮＡ結合粒子から分離したまま維持される。特定の実施形態において、希釈緩衝液またはＤＮＡ結合緩衝液がアルコールを含む場合、このような構成要素を分離したまま維持することが望ましい場合がある。当業者であれば、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、ＤＮＡ結合粒子を希釈緩衝液および／またはＤＮＡ結合緩衝液から分離したまま維持するために、図１から３の系のいずれかを修飾することができる。
【００９８】
特定の実施形態において、細胞の捕捉を容易にするために、磁力が細胞捕捉マトリクスに加えられる。磁力は、特定の実施形態において、差次的抽出系の装置部分によって加えられる。
【００９９】
区画間でのＤＮＡ結合粒子の移動を用いる特定の例示的な系および方法
図４は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第４の非限定的な例示的な系を示す。図４に示される系は、区画間で液体を移動させることも可能な磁気粒子処理装置のために設計されたものである。例えば、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を参照されたい。図４に示される系は、区画３から６において精子細胞ＤＮＡを処理し、区画７から９において非精子細胞ＤＮＡを処理する。細胞捕捉マトリクスはまた、図４に示される例示的な系における非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとしても機能する。その系における細胞捕捉マトリクスは磁性である。
【０１００】
図４に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。細胞捕捉マトリクスは、細胞洗浄緩衝液を有する区画２に移される。細胞捕捉マトリクスは次に、選択的精子溶解緩衝液を有する区画３に移される。選択的精子溶解緩衝液は、細胞捕捉マトリクスにより捕捉された精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、依然として非精子細胞を捕捉している細胞捕捉マトリクスは、区画７内のＤＮＡ結合緩衝液に移される。区画７内のＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図４には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または粒子処理装置の一部である。非精子細胞ＤＮＡは、ＤＮＡ結合緩衝液内において、細胞捕捉マトリクスに結合する。結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、次に、細胞洗浄緩衝液を有する区画８に移される。最後に、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出緩衝液を有する区画９に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画９から回収管（図４には示されていない）に移され得る。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０１】
区画３における選択的精子溶解緩衝液の上清は、ＤＮＡ結合粒子と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する希釈緩衝液とを有する、区画４に移される。結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、次に、ＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画５に移される。最後に、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、溶出緩衝液を有する区画６に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画６から第２の回収管（図４には示されていない）に移され得る。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画１０および区画１１（図４には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画１０に移される。特定のこのような実施形態において、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画１１に移される。
【０１０３】
図５は、特定の実施形態に従った、精子細胞と、例えば上皮細胞である非精子細胞との差次的抽出のための、第５の非限定的な例示的な系を示す。図５に示される系は、区画間で液体を移動させることも不可能な磁気粒子処理装置のために設計されたものである。例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を参照されたい。図５に示される系は、区画３から５において精子細胞ＤＮＡを処理し、区画６から８において非精子細胞ＤＮＡを処理する。細胞捕捉マトリクスはまた、図５に示される例示的な系における非精子細胞ＤＮＡのためのＤＮＡ結合マトリクスとしても機能する。その系における細胞捕捉マトリクスは磁性である。
【０１０４】
図５に示される実施形態において、精子細胞と非精子細胞との混合物を含む試料は、区画１内に置かれる。区画１は、精子細胞および非精子細胞を捕捉する、細胞捕捉マトリクスを含む。細胞捕捉マトリクスは、細胞洗浄緩衝液を有する区画２に移される。細胞捕捉マトリクスは次に、区画３に移される。図５における区画３は、互いに分割された２つの区域を含む。区域間の分割部は、例えば物理的な力により、磁気粒子処理装置によって破壊可能である。区画３の上部は、選択的精子溶解緩衝液を含む。上部から分割されている、区画３の下部は、ＤＮＡ結合粒子および希釈緩衝液を有する。細胞捕捉マトリクスは、最初に上部に移される。選択的精子溶解緩衝液は、細胞捕捉マトリクスに捕捉されている精子細胞を溶解する。精子細胞の溶解の後、依然として非精子細胞を捕捉している細胞捕捉マトリクスは、区画６内のＤＮＡ結合緩衝液に移される。ＤＮＡ結合緩衝液は、例えば上皮細胞である非精子細胞を溶解するために、細胞捕捉マトリクスと共に、約７０℃まで加熱しながら（加熱要素は図５には示されていない）５分間インキュベートされる。加熱要素は、特定の実施形態において、流体処理装置または粒子処理装置の一部である。非精子細胞ＤＮＡは、ＤＮＡ結合緩衝液内において、細胞捕捉マトリクスに結合する。結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、次に、ＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画７に移される。最後に、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出緩衝液を有する区画８に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画８から回収管（図５には示されていない）に移され得る。非精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０５】
細胞捕捉マトリクスが取り除かれた後、装置は、区画３の上部と区画３の下部との間の破壊可能な分割部を破壊して、ＤＮＡ結合粒子を有する選択的精子溶解緩衝液の上清と、選択的精子溶解緩衝液と組み合わされた場合にはＤＮＡ結合緩衝液を形成する希釈緩衝液とを混合する。結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、次に、ＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画４に移される。最後に、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合粒子は、溶出緩衝液を有する区画５に移される。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡの溶出を容易にするために加熱される。特定の実施形態において、溶出上清は次に、区画５から第２の回収管（図５には示されていない）に移される。精子細胞ＤＮＡは次に、ＤＮＡ分析に供され得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液は、区画９および区画１０（図５には示されていない）に含まれる。特定のこのような実施形態において、結合した非精子細胞ＤＮＡを有する細胞捕捉マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画９に移される。特定のこのような実施形態において、結合した精子細胞ＤＮＡを有するＤＮＡ結合マトリクスは、溶出区画に移される前に、第２のＤＮＡ洗浄緩衝液を有する区画１０に移される。
【０１０７】
図６は、特定の実施形態に従った、精子細胞ＤＮＡを結合するために用いられるＤＮＡ結合粒子が希釈緩衝液とは別の区画（区画４）内に維持されることを除いて、図５の系と類似している系を示す。図６に示される実施形態において、区画３は、図５の系の区画３に類似した、破壊可能な封印により分離された２つの個別の区域を有する。しかし、図６に示される実施形態において、下方の区画は希釈緩衝液のみを有しており、したがって、装置が封印を破壊する場合、選択的精子溶解緩衝液および希釈緩衝液はＤＮＡ結合緩衝液を形成する。装置は次に、ＤＮＡ結合粒子を区画４から区画３に移動させ、精子細胞ＤＮＡを結合させる。
【０１０８】
特定の実施形態において、希釈緩衝液またはＤＮＡ結合緩衝液は、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、系内においてＤＮＡ結合粒子から分離したまま維持される。特定の実施形態において、希釈緩衝液またはＤＮＡ結合緩衝液がアルコールを含む場合、このような構成要素を分離したまま維持することが望ましい場合がある。様々な実施形態において、当業者であれば、ＤＮＡ結合反応が実施されるまで、ＤＮＡ結合粒子を希釈緩衝液および／またはＤＮＡ結合緩衝液から分離したまま維持するために、図３から６の系のいずれかを修飾することができる。
【０１０９】
特定の実施形態において、系は１つまたは複数の空の区画を含む。１つまたは複数の空の区画は、特定の実施形態において、例えば洗浄後および溶出前に、ＤＮＡ結合粒子を乾燥させるための場所として用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の区画を含む、精子細胞の差次的抽出のための系であって、少なくとも１つの区画が選択的精子溶解緩衝液を含む系。
【請求項２】
細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、選択的精子溶解緩衝液を含む第２の区画とを含む、請求項１に記載の系。
【請求項３】
複数のＤＮＡ結合粒子を含む第３の区画をさらに含む、請求項２に記載の系。
【請求項４】
溶出緩衝液を含む第４の区画をさらに含む、請求項３に記載の系。
【請求項５】
細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、
細胞洗浄緩衝液を含む第２の区画と、
選択的精子溶解緩衝液を含む第３の区画と、
複数のＤＮＡ結合粒子を含む第４の区画と、
ＤＮＡ洗浄緩衝液を含む第５の区画と、
溶出緩衝液を含む第６の区画と
を含む、請求項１に記載の系。
【請求項６】
前記第１、第２、第３、第４、第５、および第６の区画が、取り外し可能なカートリッジの一部である、請求項５に記載の系。
【請求項７】
ＤＮＡ結合緩衝液を含む第７の区画をさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項８】
前記第７の区画が、第２の複数のＤＮＡ結合粒子をさらに含む、請求項７に記載の系。
【請求項９】
第２の複数のＤＮＡ結合粒子を含む第８の区画をさらに含む、請求項７に記載の系。
【請求項１０】
精子細胞および非精子細胞を含む生物学的試料における、精子細胞の差次的抽出の方法であって、
（ａ）前記生物学的試料を、系の第１の区画内に置くステップであって、ここで該第１の区画が細胞捕捉マトリクスを含む、ステップと、
（ｂ）前記細胞捕捉マトリクスで前記精子細胞および前記非精子細胞を捕捉するステップと、
（ｃ）前記細胞捕捉マトリクスと前記捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートして、精子細胞溶解物を形成するステップと、
（ｄ）前記精子細胞溶解物由来の精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップと、
（ｅ）前記ＤＮＡ結合粒子から前記精子細胞ＤＮＡを溶出するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記細胞捕捉マトリクスで前記精子細胞および前記非精子細胞を捕捉する前記ステップが、前記細胞捕捉マトリクスに磁力を加えるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞捕捉マトリクスと前記捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートする前記ステップを、前記系の前記第１の区画で行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させる前記ステップを、前記系の第２の区画で行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ結合粒子から前記精子細胞ＤＮＡを溶出する前記ステップを、前記系の前記第２の区画で行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記精子細胞溶解物が前記第１の区画から前記第２の区画へ運ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞捕捉マトリクスと前記捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートする前記ステップを、前記系の第２の区画で行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させる前記ステップを、前記系の第２の区画で行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ結合粒子から前記精子細胞ＤＮＡを溶出する前記ステップを、前記系の第３の区画で行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞捕捉マトリクスならびに前記捕捉された精子細胞および非精子細胞が、磁力を用いて前記第１の区画から前記第２の区画へ運ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記非精子細胞が、前記選択的精子溶解緩衝液内での前記細胞捕捉マトリクスのインキュベーションの後、前記細胞捕捉マトリクス上に捕捉されたまま残る、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記非精子細胞が溶解され、前記非精子細胞ＤＮＡが前記細胞捕捉マトリクスに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記非精子細胞が溶解され、前記非精子細胞ＤＮＡが、第２の複数のＤＮＡ結合粒子に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
多区画容器を含む、精子細胞の差次的抽出のためのキットであって、少なくとも１つの区画が選択的精子溶解緩衝液を含むキット。
【請求項２４】
前記多区画容器の少なくとも１つの区画が、細胞捕捉マトリクスを含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【請求項２５】
前記多区画容器の少なくとも１つの区画が、複数のＤＮＡ結合粒子を含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【請求項２６】
前記多区画容器の少なくとも１つの区画が、溶出緩衝液を含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【請求項２７】
前記多区画容器が、
細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、
細胞洗浄緩衝液を含む第２の区画と、
選択的精子溶解緩衝液を含む第３の区画と、
複数のＤＮＡ結合粒子を含む第４の区画と、
ＤＮＡ洗浄緩衝液を含む第５の区画と、
溶出緩衝液を含む第６の区画と
を含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【請求項１】
複数の区画を含む、精子細胞の差次的抽出のための系であって、少なくとも１つの区画が選択的精子溶解緩衝液を含む系。
【請求項２】
細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、選択的精子溶解緩衝液を含む第２の区画とを含む、請求項１に記載の系。
【請求項３】
複数のＤＮＡ結合粒子を含む第３の区画をさらに含む、請求項２に記載の系。
【請求項４】
溶出緩衝液を含む第４の区画をさらに含む、請求項３に記載の系。
【請求項５】
細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、
細胞洗浄緩衝液を含む第２の区画と、
選択的精子溶解緩衝液を含む第３の区画と、
複数のＤＮＡ結合粒子を含む第４の区画と、
ＤＮＡ洗浄緩衝液を含む第５の区画と、
溶出緩衝液を含む第６の区画と
を含む、請求項１に記載の系。
【請求項６】
前記第１、第２、第３、第４、第５、および第６の区画が、取り外し可能なカートリッジの一部である、請求項５に記載の系。
【請求項７】
ＤＮＡ結合緩衝液を含む第７の区画をさらに含む、請求項５に記載の系。
【請求項８】
前記第７の区画が、第２の複数のＤＮＡ結合粒子をさらに含む、請求項７に記載の系。
【請求項９】
第２の複数のＤＮＡ結合粒子を含む第８の区画をさらに含む、請求項７に記載の系。
【請求項１０】
精子細胞および非精子細胞を含む生物学的試料における、精子細胞の差次的抽出の方法であって、
（ａ）前記生物学的試料を、系の第１の区画内に置くステップであって、ここで該第１の区画が細胞捕捉マトリクスを含む、ステップと、
（ｂ）前記細胞捕捉マトリクスで前記精子細胞および前記非精子細胞を捕捉するステップと、
（ｃ）前記細胞捕捉マトリクスと前記捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートして、精子細胞溶解物を形成するステップと、
（ｄ）前記精子細胞溶解物由来の精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させるステップと、
（ｅ）前記ＤＮＡ結合粒子から前記精子細胞ＤＮＡを溶出するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記細胞捕捉マトリクスで前記精子細胞および前記非精子細胞を捕捉する前記ステップが、前記細胞捕捉マトリクスに磁力を加えるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞捕捉マトリクスと前記捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートする前記ステップを、前記系の前記第１の区画で行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させる前記ステップを、前記系の第２の区画で行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ結合粒子から前記精子細胞ＤＮＡを溶出する前記ステップを、前記系の前記第２の区画で行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記精子細胞溶解物が前記第１の区画から前記第２の区画へ運ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞捕捉マトリクスと前記捕捉された精子細胞および非精子細胞とを、選択的精子溶解緩衝液内でインキュベートする前記ステップを、前記系の第２の区画で行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記精子細胞ＤＮＡを複数のＤＮＡ結合粒子に結合させる前記ステップを、前記系の第２の区画で行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ結合粒子から前記精子細胞ＤＮＡを溶出する前記ステップを、前記系の第３の区画で行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞捕捉マトリクスならびに前記捕捉された精子細胞および非精子細胞が、磁力を用いて前記第１の区画から前記第２の区画へ運ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記非精子細胞が、前記選択的精子溶解緩衝液内での前記細胞捕捉マトリクスのインキュベーションの後、前記細胞捕捉マトリクス上に捕捉されたまま残る、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記非精子細胞が溶解され、前記非精子細胞ＤＮＡが前記細胞捕捉マトリクスに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記非精子細胞が溶解され、前記非精子細胞ＤＮＡが、第２の複数のＤＮＡ結合粒子に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
多区画容器を含む、精子細胞の差次的抽出のためのキットであって、少なくとも１つの区画が選択的精子溶解緩衝液を含むキット。
【請求項２４】
前記多区画容器の少なくとも１つの区画が、細胞捕捉マトリクスを含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【請求項２５】
前記多区画容器の少なくとも１つの区画が、複数のＤＮＡ結合粒子を含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【請求項２６】
前記多区画容器の少なくとも１つの区画が、溶出緩衝液を含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【請求項２７】
前記多区画容器が、
細胞捕捉マトリクスを含む第１の区画と、
細胞洗浄緩衝液を含む第２の区画と、
選択的精子溶解緩衝液を含む第３の区画と、
複数のＤＮＡ結合粒子を含む第４の区画と、
ＤＮＡ洗浄緩衝液を含む第５の区画と、
溶出緩衝液を含む第６の区画と
を含む、請求項２３に記載の精子細胞の差次的抽出のためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５２７４４２（Ｐ２０１０−５２７４４２Ａ）
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０７７０１（Ｐ２０１０−５０７７０１）
【出願日】平成２０年５月９日（２００８．５．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３２７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４１２０３
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月９日（２００８．５．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３２７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４１２０３
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
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