干渉を伴わない糖類ワクチンの分析
【課題】髄膜炎菌の混合性結合体ワクチン内の個々の結合体を測定するために使用され得る方法を提供し、したがってワクチンの品質管理および一貫性における改良を提供する。
【解決手段】本発明は、複数の血清群に由来する混合した髄膜炎菌の糖類の分析を、これらの血清群が単糖類単位を共有するにもかかわらず可能にする方法に基づく。血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の糖類の組み合わせに関して、本発明は、シアル酸含有量、グルコース含有量およびガラクトース含有量を分析する。このグルコースの結果およびガラクトースの結果が使用されて、血清群Ｙ由来および血清群Ｗ１３５由来の糖類が、それぞれ直接定量化され、そしてこのグルコースおよびガラクトースの合わせた含有量は、このシアル酸含有量から減じられて、血清群Ｃ由来の糖類が定量化される。
【解決手段】本発明は、複数の血清群に由来する混合した髄膜炎菌の糖類の分析を、これらの血清群が単糖類単位を共有するにもかかわらず可能にする方法に基づく。血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の糖類の組み合わせに関して、本発明は、シアル酸含有量、グルコース含有量およびガラクトース含有量を分析する。このグルコースの結果およびガラクトースの結果が使用されて、血清群Ｙ由来および血清群Ｗ１３５由来の糖類が、それぞれ直接定量化され、そしてこのグルコースおよびガラクトースの合わせた含有量は、このシアル酸含有量から減じられて、血清群Ｃ由来の糖類が定量化される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンの分析および品質管理の分野にあり、このワクチンは、細菌の莢膜糖類を含み、そして特に、この糖類がキャリアに結合体化される糖類を含む。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
キャリアタンパク質に結合体化された莢膜糖類抗原を含む免疫原は、当該分野において周知である。結合体化は、Ｔ細胞非依存性抗原をＴ細胞依存性抗原に変換し、それによって記憶応答（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を増強し、そして防御免疫を発生させ、そして原型の結合体ワクチンは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ（Ｈｉｂ）に対するものであった（例えば、非特許文献１の第１４章を参照のこと）。Ｈｉｂワクチン以来、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）に対して保護するための結合型糖類ワクチンが、開発された。結合体ワクチンが目的とする他の生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）（非特許文献２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（非特許文献３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（非特許文献４）である。
【０００４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに対する結合体ワクチンは、ヒトに対する使用が認可され、そしてこれらとしては、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ（非特許文献５）、ＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭが挙げられる。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの各々からの結合体の混合物が、報告され（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献６および非特許文献７）、これらとしては、ＭｅｎａｃｔｒａＴＭ製品が挙げられる。結合型抗原の他の混合物としては、以下が挙げられる：（ｉ）髄膜炎菌性のＡ／Ｃの混合物（非特許文献８、非特許文献９）；（ｉｉ）７つの肺炎球菌の結合体を含むＰｒｅｖＮａｒＴＭ製品（非特許文献１０）；（ｉｉｉ）髄膜炎菌およびＨｉｂの混合した結合体（非特許文献１１、非特許文献１２）；および（ｉｖ）髄膜炎菌、肺炎球菌およびＨｉｂの合わせた結合体（非特許文献１３）。
【０００５】
結合体ワクチンを取り扱う工程が安定性およびバッチ間の一貫性を含む場合を示す。例えば、Ｈｉｂワクチンにおいて、糖類の触媒性解重合が、報告され（非特許文献１４）、そして血清群Ａの髄膜炎菌莢膜の結合体は、容易に加水分解される（特許文献３）。結合体の不安定性は、望ましくない、長期にわたる免疫原性結合体の有効量の減少、バッチ間の変動を生じ、そして特徴付けられない分解産物のレベルを増加させる。非特許文献１５および非特許文献１６は、Ｈｉｂ結合体ワクチンの安定性試験に関する問題を議論する。
【０００６】
定量的な複合糖質の分析は代表的に、糖類の加水分解の第１の工程を包含し、その後この分析は、遊離した単糖類に基づく分析を伴う。この分析は、単一の結合体に対して、相対的に分かりやすい（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー法は、Ｈｉｂの加水分解された結合体（非特許文献１７）および血清群Ａの髄膜炎菌の加水分解された結合体（非特許文献１８）を分析するために使用されてきた）のに対して、この状況は、特に異なる糖類が単糖類単位を共有する場合、ワクチンの組み合わせにおいて、より複雑である。例えば、髄膜炎菌の血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの莢膜糖類は、全てシアル酸を含み、したがって、遊離したシアル酸の測定に基づく任意の方法は、この３種の血清群を区別し得ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０５８７３７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／００７９８５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０８０６７８号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｌｏｔｋｉｎら編、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、第４版、ＩＳＢＮコード０７２１６９６８８０
【非特許文献２】Ｂａｋｅｒら、「Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ」、２００３年、第１８８巻、ｐ．６６−７３
【非特許文献３】Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒら、「Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ」、２００３年、第７１巻、ｐ．３８７５−８４
【非特許文献４】Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ、「Ｄｒｕｇｓ Ｒ Ｄ」、２００３年、第４巻、ｐ．３８３−５
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓ、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ」、２００１年、第２巻、ｐ．４７−４９
【非特許文献６】Ｒｅｎｎｅｌｓら、「Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ」、２００２年、第２１巻、ｐ．９７８−９７９
【非特許文献７】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、「Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ」、２００２年、第１８６巻、ｐ．１８４８−１８５１
【非特許文献８】Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９２年、第１０巻、ｐ．６９１−６９８
【非特許文献９】Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、「ＪＡＭＡ」、１９９６年、第２７５巻、ｐ．１４９９−１５０３
【非特許文献１０】ＤａｒｋｅｓおよびＰｌｏｓｋｅｒ、「Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｄｒｕｇｓ」、２００２年、第４巻、ｐ．６０９−６３０
【非特許文献１１】Ｕｇｏｚｚｏｌｉ、「Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ」、２００２年、第１８６巻、ｐ．１３５８−６１
【非特許文献１２】Ｇｒａｎｏｆｆら、「Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ」、１９９７年、第６５巻、ｐ．１７１０−５
【非特許文献１３】ＰａｒａｄｉｓｏおよびＬｉｎｄｂｅｒｇ、「Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ」、１９９６年、第８７巻、ｐ．２６９−２７５
【非特許文献１４】Ｃｏｒｂｅｌ、「Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ」、１９９６年、第８７巻、ｐ．１１３−１２４
【非特許文献１５】Ｋｌｕｇ、「Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ」、１９９６年、第８７巻、ｐ．２６３−２６７
【非特許文献１６】ＰｌｕｍｂおよびＹｏｓｔ、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９６年、第１４巻、ｐ．３９９−４０４
【非特許文献１７】Ｔｓａｉら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９４年、第１２巻、ｐ．７００−７０６
【非特許文献１８】Ｒｉｃｃｉら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、２００１年、第１９巻、ｐ．１９８９−１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
安定性および完全性を評価するための結合体ワクチン中の糖類の定量的評価における改良を提供することは、本発明の目的である。特に、髄膜炎菌の混合性結合体ワクチン内の個々の結合体を測定するために使用され得る方法を提供し、したがってワクチンの品質管理および一貫性における改良を提供することが、目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、複数の血清群に由来する混合した髄膜炎菌の糖類の分析を、これらの糖類が単糖類単位を共有するにもかかわらず可能にする方法に基づく。したがって、本発明は、組成物の糖類含有量を分析するためのプロセスであって、ここで：
（ａ）この組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）このプロセスが、この組成物のシアル酸含有量を分析する工程を包含し、そして：（ｉ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、この組成物のガラクトース含有量を分析する工程を包含し；（ｉｉ）この組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、この組成物のグルコース含有量を分析する工程を包含し；
（ｃ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、この組成物中の血清群Ｗ１３５の糖類の含有量が、工程（ｂ）から得たガラクトース分析の結果によって決定され；
（ｄ）この組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、この組成物中の血清群Ｙの糖類の含有量が、工程（ｂ）から得たグルコース分析の結果によって決定され；そして
（ｅ）この組成物中の血清群Ｃの糖類の含有量が、シアル酸分析の結果を：（ｉ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有するが、血清群Ｙの糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得たガラクトース分析の結果；（ｉｉ）この組成物が、血清群Ｙの糖類を含有するが、血清群Ｗ１３５の糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得たグルコース分析の結果；または（ｉｉｉ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類両方を含有する場合には工程（ｂ）から得たグルコース分析およびガラクトース分析の合わせた結果と比較することによって決定されるプロセスを提供する。
【００１１】
したがって、血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の糖類の組み合わせに関して、本発明は、シアル酸含有量、グルコース含有量およびガラクトース含有量を分析する。このグルコースの結果およびガラクトースの結果が使用されて、血清群Ｙ由来および血清群Ｗ１３５由来の糖類が、それぞれ直接定量化され、そしてこのグルコースおよびガラクトースの合わせた含有量は、このシアル酸含有量から減じられて、血清群Ｃ由来の糖類が定量化される。したがって、この３種の血清群は、これらの単糖類の含有量が重複するにもかかわらず決定され得る。本発明者らは、この３種の異なる単糖類の分析が、これらの単糖類の間の干渉および上記組成物中の任意の他の糖類物質（例えば、凍結乾燥安定剤）による干渉を伴わずに同じ材料に対して行われ得ることを有利に見出した。本方法が使用されて、結合体ワクチン中の全糖類および遊離糖類が分析され、そして複数の血清群の莢膜糖類を含むワクチンの品質管理が単純化される。
【００１２】
干渉を伴わずにアルドース、ヘキソサミンおよびシアル酸の混合物を分析するための方法が記載される［２２］が、これは酵素的処理および化学的誘導体化に依存する。対照的に、本発明のプロセスは、このような工程を必要とせず、したがって、より迅速かつ容易に実施される。さらに、参考文献２２中で扱われる状況は、共通の単糖類単位を共有する異なる糖類を分解を分離しなければならないという固有の問題に苦しむ。
【００１３】
本発明はまた、本発明のプロセスを実施するのに適合されるコンピューター装置を提供する。特に、本発明は、上記に定義されるような組成物の糖類含有量を分析するためのコンピュータープログラムであって、（ａ）サンプルのシアル酸含有量、ならびにグルコース含有量および／またはガラクトース含有量についてのデータを受容し；そして（ｂ）このデータから、血清群Ｃ由来の莢膜糖類の含有量、ならびに血清群Ｗ１３５由来の莢膜糖類の含有量および／または血清群Ｙの莢膜糖類の含有量を計算するためのプログラムモジュールを備えるコンピュータープログラムを提供する。本発明はまた、コンピューターが読み込み可能な記憶媒体を備えるコンピュータープログラム製品を提供し、この記憶媒体は、本発明のコンピュータープログラムを記憶する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
組成物の糖類含有量を分析するためのプロセスであって、ここで以下：
（ａ）該組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）該プロセスが、該組成物のシアル酸含有量を分析する工程を包含し、そして：（ｉ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、該組成物のガラクトース含有量を分析する工程を包含し；（ｉｉ）該組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、該組成物のグルコース含有量を分析する工程を包含し；
（ｃ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、該組成物中の血清群Ｗ１３５の糖類含有量が、工程（ｂ）から得た該ガラクトース分析の結果によって決定され；
（ｄ）該組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、該組成物中の血清群Ｙの糖類含有量が、工程（ｂ）から得た該グルコース分析の結果によって決定され；そして
（ｅ）該組成物中の血清群Ｃの糖類含有量が、該シアル酸分析の結果を：（ｉ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有するが、血清群Ｙの糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得た該ガラクトース分析の結果；（ｉｉ）該組成物が、血清群Ｙの糖類を含有するが、血清群Ｗ１３５の糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得た該グルコース分析の結果；または（ｉｉｉ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類両方を含有する場合には工程（ｂ）から得た該グルコース分析および該ガラクトース分析の合わせた結果と比較することによって決定される、
プロセス。
（項目２）
上記組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよび血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの３種全てに由来する莢膜糖類を含有する、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
上記組成物が、１種以上のさらなる莢膜糖類を含有する、項目２に記載のプロセス。
（項目４）
上記１種以上のさらなる莢膜糖類が、血清群ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類；およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ由来の莢膜糖類からなる群より選択される、項目３に記載のプロセス。
（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載のプロセスであって、上記莢膜糖類を解重合して、その構成単糖類を提供するために上記組成物を処理する工程を包含する、プロセス。
（項目６）
シアル酸含有量、グルコース含有量および／またはガラクトース含有量が、必要に応じてアンペロメトリック電気化学検出を伴う、高速アニオン交換クロマトグラフィーによって測定される、項目１〜５のいずれかに記載のプロセス。
（項目７）
項目１〜６のいずれかに記載のプロセスであって、以下：
重量オスモル濃度、ｐＨ、個々の糖類または結合体の重合度、タンパク質含有量、アルミニウム含有量、洗浄剤含有量、および保存剤含有量、
の構成要素または特性の１つ以上が分析される工程をまた包含する、プロセス。
（項目８）
上記莢膜糖類が、糖類−タンパク質結合体に由来する、項目１〜７のいずれかに記載のプロセス。
（項目９）
上記結合体中のタンパク質が、細菌毒素または細菌トキソイドである、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
上記毒素またはトキソイドが、ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素誘導体；およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤからなる群より選択される、項目９に記載のプロセス。
（項目１１）
組成物を分析するためのプロセスであって、以下：
（ａ）該組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）該組成物が、非結合型の形態である該莢膜糖類を含有し得；
（ｃ）任意の非結合型莢膜糖類の含有量が、項目１〜７のいずれか１項に記載のプロセスによって決定され；
（ｄ）結合型莢膜糖類の含有量が、項目１〜７のいずれか１項に記載のプロセスによって決定され；そして、必要に応じて
（ｅ）該組成物中の、結合型糖類：非結合型糖類の比が、該莢膜糖類の１種以上について計算される、
プロセス。
（項目１２）
少なくとも２種の異なる髄膜炎菌の血清群由来の莢膜糖類の混合物内の、個々の血清群由来の糖類を定量化するためのプロセスであって、ここで：（ａ）該異なる血清群が、血清群Ｃ、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５および／または（ｉｉ）血清群Ｙの一方または両方を含み；（ｂ）該プロセスが、該混合物内の該莢膜糖類を解重合して、解重合した混合物を提供する工程を包含し；そして（ｃ）該異なる血清群が、該解重合した混合物の単糖類の組成を比較することによって定量化される、プロセス。
（項目１３）
医師による使用のためのワクチンを販売するための方法であって、（ａ）血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含むワクチンを製造する工程；（ｂ）該莢膜糖類の各々についての該ワクチン中の、結合型糖類および／または非結合型糖類の量を分析する工程を包含し；そして工程（ｂ）から得た結果が、臨床使用において受容可能な糖類含有量を示す場合、（ｃ）医師による使用のための該ワクチンを販売する工程を包含する、方法。
（項目１４）
ワクチンの２つのバッチであって、ここで以下：
（ａ）ワクチンの該バッチの各々が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含み；
（ｂ）該第１のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ１であり；
（ｃ）該第２のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ２であり；
適用可能な場合、（ｄ）該第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ１であり；
適用可能な場合、（ｅ）該第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ２であり；
適用可能な場合、（ｆ）該第１のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ１であり；
適用可能な場合、（ｇ）該第２のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ２であり；
そしてここで（ｈ）Ｃ１／Ｃ２、Ｗ１／Ｗ２およびＹ１／Ｙ２の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間である、
バッチ。
（項目１５）
項目１４に記載のバッチであって、ここで：（ｉ）上記第１のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ３であり；（ｊ）上記第２のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ４であり；適用可能な場合、（ｋ）該第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ３であり；適用可能な場合、（ｌ）該第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ４であり；適用可能な場合、（ｍ）該第１のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ３であり；適用可能な場合、（ｎ）該第２のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ４であり；（ｏ）Ｃ３／Ｃ４、Ｗ３／Ｗ４およびＹ３／Ｙ４の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間であり、そして好ましくはそれぞれ０．９５と１．０５との間である、バッチ。
（項目１６）
項目１５に記載のバッチであって、（ｐ）Ｃ３／Ｃ１、Ｃ４／Ｃ２、Ｗ３／Ｗ１、Ｗ４／Ｗ２、Ｙ３／Ｙ１およびＹ４／Ｙ２の比が、それぞれ０．２０未満である、バッチ
（項目１７）
項目１〜１２のいずれか１項に記載のプロセスを実施するのに適合されるコンピューター装置。
（項目１８）
項目１に定義されるような組成物の糖類含有量を分析するためのコンピュータープログラムであって、（ａ）サンプルのシアル酸含有量、ならびにグルコース含有量および／またはガラクトース含有量についてのデータを受容し；そして（ｂ）該データから、血清群Ｃ由来の莢膜糖類含有量、ならびに血清群Ｗ１３５由来の莢膜糖類含有量および／または血清群Ｙの莢膜糖類含有量を計算するためのプログラムモジュールを備える、コンピュータープログラム。
【００１４】
（血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの莢膜糖類）
本発明の方法は、髄膜炎菌の莢膜糖類の混合物を分析するための方法である。この混合物は、（ｉ）血清群Ｃ由来の莢膜糖類、ならびに（ｉｉ）血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の莢膜糖類のいずれかまたは両方（すなわち、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、またはＣ＋Ｗ１３５＋Ｙ）を含む。さらなる糖類がまた、存在し得る。
【００１５】
上記血清群Ｃの莢膜糖類は、（α２→９）結合型シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。ほとんどの血清群Ｃ株は、シアル酸残基のＣ−７および／またはＣ−８にＯ−アセチル基を有するが、約１５％の臨床単離体は、これらのＯ−アセチル基を欠く［２３、２４］。このアセチル化は、保護性の効力に影響しないようである（例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ製品とは違って、ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ製品は、脱Ｏ−アセチル化糖類を使用するが、両方のワクチンは、有効である）。この糖類の構造は、図１３に示され、そして以下：
【００１６】
【化１】
のように記述される。
【００１７】
血清群Ｗ１３５の糖類は、シアル酸−ガラクトースの二糖類単位のポリマーである。血清群Ｃの糖類のように、血清群Ｗ１３５の糖類は、可変のＯ−アセチル化を有する（但し、シアル酸の７位および９位において）［２５］。この構造は、図１４に示され、そして以下：
【００１８】
【化２】
のように記述される。
【００１９】
血清群Ｙの糖類は、二糖類の反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除いて、血清群Ｗ１３５の糖類と同様である（図１６を参照のこと）。血清群Ｗ１３５の糖類のように、血清群Ｙの糖類は、シアル酸の７位および９位に可変のＯ−アセチル化を有する［２５］。血清群Ｙの構造は、図１５に示され、そして以下：
【００２０】
【化３】
のように記述される。
【００２１】
したがって、血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の莢膜糖類を含有する組成物中に、３種の異なる構成モノマー（グルコース、ガラクトース、およびシアル酸）が存在し、そしてこれらの３種のモノマーは、加水分解後の混合物中に存在する。このような混合物中のグルコースモノマーの量は、最初の組成物中の血清群Ｙの糖類の量に直接関連し、ガラクトースモノマーの量は、Ｗ１３５の糖類の量に直接関連する。しかし、血清群Ｃに関して、この状況は、より複雑であり：シアル酸は、血清群Ｃの糖類を定量化するのに利用可能な唯一のモノマーであるが、上記混合物中のシアル酸の含量のあらゆる測定は、血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類に由来するモノマーを含む。本発明は、ガラクトース、グルコースおよびシアル酸の各々の混合物中の含有量を（別々におよび／または同時に）測定し、次いで（ａ）ガラクトース含有量を使用して、加水分解前の血清群Ｗ１３５含有量を定量化し；（ｂ）グルコース含有量を使用して加水分解前の血清群Ｙ含有量を定量化し；（ｂ）シアル酸含有量とグルコースおよびガラクトースの合わせた含有量との間の差を使用して、加水分解前の血清群Ｃ含有量を定量化する（すなわち、血清群Ｃのモル濃度量は、シアル酸のモル濃度量から（グルコース＋ガラクトース）のモル濃度量を差し引くことによって計算される）ことによってこの分析の複雑性を克服する。シアル酸のモル濃度含有量からの、グルコースのモル濃度含有量およびガラクトースのモル濃度含有量の減算は、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙによる干渉を補正し、そして血清群Ｃからのシアル酸のみを残す。
【００２２】
本発明が使用されて、種々の長さの莢膜糖類が分析され得る。例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭが、血清群Ｃの完全長ポリ糖類からのサイズを選択したフラグメント（オリゴ糖）を含有するのに対して、ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭは、完全長のポリ糖類を使用する。本発明は、オリゴ糖および／または完全長ポリ糖類と共に使用され得る。オリゴ糖は、細菌中に存在するネイティブな莢膜ポリ糖類において見出される重合度（ＤＰ）より小さい重合度を有し、そして３０未満（例えば、１０と２５との間）の平均ＤＰを有し得る。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色定量アッセイによって簡便に測定され得る［２６］。
【００２３】
（単糖類含有量の分析）
本発明のプロセスは、シアル酸の含有量、ガラクトースの含有量（血清群Ｗ１３５が存在する場合）、およびグルコースの含有量（血清群Ｙが存在する場合）を分析する工程を包含する。プロセスが、組成物中の単糖類単位の存在をモニタリングするため（例えば、単に、生成の初期段階からの残留単糖類をモニタリングためか、または結合体からのモノマーの可能な加水分解性の遊離をモニタリングするため）に実施される場合、このプロセスは、この組成物に対して直接実施され得る。しかし、代表的に、このプロセスは、組成物の糖類の総含有量を測定するために使用され、しがたってこの組成物は、この分析前に単糖類まで加水分解される。したがって、本発明のプロセスは、代表的に、莢膜糖類を解重合してそれらの構成単糖類を得るために、組成物を処理する工程を包含する。その後、シアル酸含有量ならびにガラクトース含有量および／またはグルコース含有量の分析は、解重合された混合物の遊離した単糖類に対して進められ得る。
【００２４】
莢膜糖類をそれらの構成単糖類まで解重合するための条件は、当該分野において公知である。例えば、血清群Ｃの糖類は、糖類の総含有量の分析のために１００ｍＭ ＨＣｌによる８０℃で２時間の処理によって加水分解され得る［２７］。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用する酸加水分解は、血清群Ｃのシアル酸の分解を避けるために、血清群Ｃについて好ましいわずかに低いインキュベーション温度（１００℃よりもむしろ９０℃）によって、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの全てを加水分解するために使用され得る。代表的なＴＦＡ処理は、ＴＦＡを２Ｍの最終濃度まで添加し、次いで９０分間、９０℃〜１００℃に加熱する工程を包含する。解重合の後、糖類加水分解物は、例えば、減圧乾燥器（ｖａｃｕｕｍ ｄｒｉｅｒ）を使用して乾燥され得る。
【００２５】
解重合の後、組成物は、血清群Ｃならびに血清群Ｗ１３５および／または血清群Ｙに由来する混合した単糖類を含む。この混合物中のこれらの単糖類の量は、加水分解前の本来の組成物中の糖類の含量に直接関係し、したがって最初の糖類の含量は、上記のように決定され得る。量は、分子の数（例えば、モル）、質量、比または濃度の項目について決定され得る。シアル酸が、グルコース／ガラクトースと異なる分子量を有する場合、モルを用いることが代表的であるが、これらの測定値のいずれかが、上記混合物の糖類含有量を評価するために使用され、そして置き換えられ得る。定量的な測定のために、分析結果は、特定の糖類の公知の含有量を用いる基準と比較され得る。
【００２６】
上記解重合された混合物は、好ましくは単糖類まで完全に加水分解される。本発明者らは、ときとし不完全な加水分解が起こり、二糖類のフラグメント（すなわち、ＭｅｎＷ１３５に対するＧａｌ−ＮｅｕＮＡｃ、およびＭｅｎＹに対するＧｌｃ−ＮｅｕＮＡｃ）が存在する混合物を与えることを見出した。しかし、上記単糖類は、正確な理論上の比で遊離し、そして上記二糖類は、この単糖類の分析を干渉しないので、二糖類の存在は、困難性をもたらし得ない。
【００２７】
解重合の進行は、（例えば、オリゴ糖への部分的加水分解よりもむしろ、単糖類への完全な加水分解を確認するために）公知の技術（例えば、ＮＭＲ、質量分析など）を使用して、混合物中の重合度（ＤＰ）を測定することによって確認され得る。
【００２８】
グルコース、ガラクトースおよびシアル酸単糖類を定量化するための方法は、当該分野において周知である。方法は、直接的または間接的であり得る。（例えば、これらの方法は、その単糖類を誘導体化し、次いで本来の単糖類含有量と相関する分析を実施することを包含し得る）。方法は、２種／３種の異なる単糖類を互いから分離し、次いで別個に分析することを包含し、そしてこのような場合において、単糖類含有量の実際の測定は、この分離に起因する特異性を有するそれぞれの事例において同一であり得る。しかし、それらが分析前に互いから分離される必要がないように、互いの存在下においてこの糖類を分析し得る方法を使用することが好ましい。さらに、方法は、結合型糖類に対して使用され得、この結合型糖類において、キャリアおよび糖類は、解重合の後に分けられる必要がない。１つの好ましい方法は、アニオンクロマトグラフィーであり、そして特に、通常はアンペロメトリック電気化学検出（ＰＡＤ）を備える、高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）である［２８、２９］。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤシステムは、ＤｉｏｎｅｘＴＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって提供され（例えば、ＢｉｏＬＣＴＭシステム）、これは、ＰＡ１［ジビニルベンゼンと２％架橋し、第四級アンモニウム官能性化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ラテックスの５００ｎｍ ＭｉｃｒｏＢｅａｄと凝塊形成した（５％架橋した）、直径１０μｍのポリスチレン担体］またはＰＡ１０［ジビニルベンゼンと５５％架橋し、二官能性第四級アンモニウムイオンの４６０ｎｍ ＭｉｃｒｏＢｅａｄと凝塊形成した（５％架橋した）、直径１０μｍのエチレンビニルベンゼン担体］のようなカラムを用いる。これらのシステムは、誘導体化または分析前の分離を必要とせずに、混合物内の個々の糖類を定量的に分析し得る。糖類の分析のために、上記カラムへの流入前に他の化合物を濾過することが望まれ得、そしてＤｉｏｎｅｘＴＭは、前置カラムトラップ（例えば、アミノ酸を除去するアミノトラップ、ホウ酸トラップなど）を形成し、そしてこの目的を保護する。
【００２９】
解重合された混合物内の、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸である単糖類を定量化するための代替的方法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。しかし、使用の容易さおよび高い感度のために、本発明のクロマトグラフ法が、好ましい。
【００３０】
シアル酸含有量ならびにグルコース含有量および／またはガラクトース含有量が、一旦決定されると、上記混合物中の各単糖類のモル量を比較し、それによって最初の組成物中の莢膜糖類の量を計算することは、簡単である。
【００３１】
本発明のプロセスは、代表的には破壊性である。したがって、完全な組成物に対してこのプロセスを実施するよりもむしろ、目的の組成物からサンプルを採取し、次いでこのサンプルに対して分析を行うことが、より代表的である。
【００３２】
（結合体）
本発明は、ワクチンの糖類含有量を分析するために有用であり、そして特に、結合型糖類を含むワクチンに対して有用である。共有結合が使用されて、糖類を、Ｔ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原に変換し、したがって免疫記憶のための初回刺激が可能になることによって、この糖類の免疫原性が増強される。結合体は、小児用ワクチンに関して特に有用であり、そしてこれは、周知の技術である［例えば、参考文献３０〜３９に概説される］。糖類は、キャリアと直接連結され得る［４０、４１］が、リンカーまたはスペーサー（例えば、アジピン酸、β−プロピオンアミド［４２］、ニトロフェニル−エチルアミン［４３］、ハロアシルハライド［４４］、グリコシド連結［４５］、６−アミノカプロン酸［４６］、ＡＤＨ［４７］、Ｃ４〜Ｃ１２部分（ｍｏｉｔｉｅｓ）［４８］など）は、一般的に使用される。
【００３３】
結合体中の代表的なキャリアタンパク質は、細菌の毒度またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素誘導体［４９〜５１］は、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭ中のキャリアタンパク質であり、一方で、破傷風トキソイドは、ＮｅｉｓＶａｃＴＭに使用される。ジフテリアトキソイドは、ＭｅｎａｃｔｒａＴＭ中のキャリアとして使用される。他の公知であるキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［５２］、合成ペプチド［５３、５４］、熱ショックタンパク質［５５、５６］、百日咳タンパク質［５７、５８］、サイトカイン［５９］、リンフォカイン［５９］、ホルモン［５９］、成長因子［５９］、種々の病原体由来抗原から得た複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞のエピトープを含む人工タンパク質［６０］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［６１、６２］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［６３］、鉄取込みタンパク質［６４］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［６５］などが挙げられる。組成物は、例えば、キャリア抑制のリスクを減少するために１種より多いキャリアタンパク質を使用し得、そして単一のキャリアタンパク質は、１種より多い糖類抗原を保有し得る［６６］。結合体は、一般的に、１：５（すなわち、タンパク質過剰）と５：１（すなわち、糖類過剰）との間の、糖類：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する。組成物は、上記結合体に加えて、遊離キャリアタンパク質を含有し得る［６７］。
【００３４】
一般的に、結合型糖類を含有する組成物は、本発明を使用して２つの手段で分析され得る。第１に、組成物中の各血清群について、糖類の総濃度は、例えば、ワクチンの販売前（規制または品質管理の目的のため）か、または結合体が混合された後に濃度を確認する前に測定され得る。第２に、組成物中の遊離の非結合型糖類は、例えば、不完全な結合体化について確認するためか、または長期にわたって増加する遊離糖類をモニタリングすることによって結合体の加水分解を追跡するために測定され得る。両方の型の分析を行うことによって、全糖類に対する遊離糖類の比は、規制または品質管理の目的のために使用され得る、各血清群について評価され得る。一般的に、ワクチンが２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満など）の各糖類を遊離形態で含むことを保証することが、望ましい。高レベルの遊離糖類は、結合体のより低い免疫原性用量を意味する。
【００３５】
したがって本発明は、組成物を分析するための方法であって、ここで：
（ａ）この組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）この組成物が、非結合型の形態である莢膜糖類を含有し得；
（ｃ）任意の非結合型莢膜糖類の含有量が、上記の通り、本発明のプロセスによって決定され；
（ｄ）結合型莢膜糖類の含有量が、上記の通り、本発明のプロセスによって決定され；
そして、必要に応じて：
（ｅ）結合型糖類：非結合型糖類の比が、この莢膜糖類の１種以上について計算される方法を提供する。
【００３６】
工程（ｃ）および工程（ｄ）は、いずれかの順番で行われても同時に行われてもよい。
【００３７】
本発明はまた、医師による使用のためのワクチンを販売するための方法であって、（ａ）血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含むワクチンを製造する工程；（ｂ）上記莢膜糖類の各々についてのワクチン中の、結合型糖類および／または非結合型糖類の量を分析する工程を包含し；そして工程（ｂ）から得た結果が、臨床使用において受容可能な糖類含有量を示す場合、（ｃ）医師による使用のためのワクチンを販売する工程を包含する方法を提供する。工程（ｂ）は、糖類の最小濃度（例えば、１種の血清群あたり１μｇ〜２０μｇの間の全糖類）の評価、非結合型糖類：結合型糖類の比（例えば、２０重量％以下の非結合型糖類、好ましくは１０重量％以下または５重量％以下の非結合型糖類）の評価などに関し得る。工程（ｂ）は、パッケージ化されたワクチンに対して行われても、パッケージ化の前にバルクのワクチンに対して行われてもよい。
【００３８】
結合型糖類および非結合型糖類を別個に評価するために、これらは分離されなければならない。水性組成物中の遊離（すなわち、非結合型）の糖類は、種々の手段で結合型糖類から分離され得る。結合体化の反応は、上記糖類についての虫食い状（ｃａｒｉｏｕｓ）の化学的パラメーターおよび物理的パラメーターを変化させ、そしてこの違いは、分離のために活用され得る。例えば、この結合型物質がキャリアタンパク質に起因して、より高い質量を有する場合、サイズ分離が、遊離糖類および結合型糖類を分離するために使用され得る。限外濾過は、好ましいサイズ分離法であり、そして遊離糖類は、適切なカットオフ（例えば、ＣＲＭ１９７キャリアに対して３０ｋＤａ）を有する限外濾過膜を通過し得る一方で、結合体は保持される。代替的方法は、結合体を保持するが、遊離糖類を溶出物として通過させる、カラムまたは膜を使用する固相抽出（ＳＰＥ）を用いることである。ＳＰＥは、より迅速であり、そしてより一貫した傾向にあるが、サイズ分離は、より普遍的に適用可能である。さらなる代替的方法として、結合体がアジュバントに吸着された場合、遠心分離は、加水分解後に脱着する遊離糖類（上清）から、吸着された結合体（ペレット）を分離する。
【００３９】
したがって遊離糖類は、全糖類から分離され得、そして別個に分析され得、それによって組成物中の非結合型物質の量の決定を可能にする。この遊離の量を全量と比較することは、特にこの結合型物質が分離の間に支持体上に保持される場合、分離後の２つのプールを別個に分析することより容易である。
【００４０】
（さらなる莢膜糖類成分）
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ由来ならびに血清群Ｗ１３５由来および／または血清群Ｙ由来の莢膜糖類を含有する組成物の分析を可能にする。本発明はまた、さらなる莢膜糖類（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ由来の莢膜糖類、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ由来の莢膜糖類など）を含有する組成物の分析のために使用され得る。
【００４１】
血清群Ａの髄膜炎菌の莢膜糖類は、Ｃ３位およびＣ４位に部分的Ｏ−アセチル化を伴う、（α１→６）結合型のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである（図１７）。これらのアセチル基は、加水分解を防ぐために封鎖基で置換され得［１７］、そしてこのような改変糖類は、本発明の意味において、不活性（ｓｔｉｌｌ）な血清群Ａの糖類である。血清群Ａの莢膜糖類の解重合条件は、公知である（例えば、他の血清群について上記されるようなＴＦＡによる１００℃での加水分解）［２１］。代替的方法は、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｈ＋の後に、１００℃で１時間加熱する工程を包含する［６８］。遊離したマンノサミンホスフェートモノマーは、例えば、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸と並行して分析され得る［２１］。
【００４２】
Ｈｉｂの莢膜糖類は、リボースとリビトールとホスフェートとのポリマーである。この糖類は、「ＰＲＰ」（ポリ−３−β−Ｄ−リボース−（１，１）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート）として公知であり、そして図１８に示される。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析または３１Ｐ−ＮＭＲ分析のためにＰＲＰを単糖類まで解重合するための方法は、公知である（例えば、室温で一晩のＮａＯＨとのインキュベーションによる）［２０］。遊離したリボースおよびリビトールは、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸と並行して分析され得る。
【００４３】
血清群Ｃの莢膜ポリ糖類は、α２→９結合型のシアル酸（コロミン酸としても知られる）のホモポリマーである。本発明によって分析される組成物は、シアル酸の他のいずれのホモポリマー（例えば、血清群Ｂの髄膜炎菌の莢膜糖類（α２→８結合型のシアル酸）、またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２の莢膜糖類（α２→８結合およびα２→９結合を有する））も含有しないことが好ましい。より一般的に、分析されるべき組成物が、グルコース、ガラクトースまたはシアル酸であるモノマーを含む莢膜糖類を含有する場合、この莢膜糖類はまた、混合性の分析を容易にするために、その糖類に固有（その混合物内で）である、さらなるモノマーまたは複数のモノマーを含むことが好ましい。モノマーが糖類の間で共有される場合でさえ、固有のモノマーの存在は、異なる糖類を、髄膜炎菌の血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙを解析するために記載されたものと同じ原理を使用して、並行して分析することを可能にする。
【００４４】
（非莢膜糖類成分）
本発明が、分析下における組成物に由来する混合物の単糖類の分析に依存する場合、この組成物は、（莢膜糖類の加水分解に由来する任意のバックグラウンドの単糖類以外の）遊離形態の単糖類を含有しないことが好ましい。例えば、分析されるべき組成物中に遊離シアル酸を含有することは、血清群Ｃの含有量の過大評価を生じ得る。同じ原理は、二糖類などが含まれ、次いで加水分解される場合に適用する（例えば、血清群Ｙの過大評価を与え得るスクロース（グルコース＋フルクトース）の存在またはマルトースもしくはトレハロース（両方ともジ−グルコース）の存在、および血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの過大評価（ならびに血清群Ｃの過小評価）を与え得るラクトース（グルコース＋ガラクトース）の存在）。
【００４５】
しかし、このような糖類は、多くの場合、ワクチン処方物中で使用され（例えば、安定剤として［６９、７０］）、そしてこれらの干渉の問題が最小化されるかまたは回避され得る２つの一般的手段が存在する。第１に、これらの成分の最初のレベルが、測定され、次いで解重合された混合物において測定されたレベルから差し引かれ得る。第２に、これらの成分が、例えば、濾過または透析によって分析前に上記組成物から除去され得る。限外濾過膜が使用されて、低分子量成分が除去され得る（例えば、スクロース（ＭＷ：３６０）を除去する１Ｋ膜）。
【００４６】
分析される莢膜糖類中にも見出されない単糖類の存在は、通常は干渉の問題を生じない。例えば、糖アルコールは、凍結乾燥安定剤としてワクチンに含まれ得る［７１］が、ＨＰＡＥＣ−ＡＥＤは、単一の単糖類と対応するポリオールの単糖類との間（例えば、マンノース単糖類（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓの莢膜中に見出されるような［７２］）とマンニトール単糖類（安定剤）との間、およびリボースとリビトールとの間［７３］）を区別し得る。
【００４７】
（非糖類成分の分析）
組成物中の糖類の含有量を分析する工程と同様に、上記プロセスは、他の成分または特性（例えば、重量モル濃度、ｐＨ、個々の糖類または結合体についての重合度、タンパク質含有量（特にキャリアタンパク質について）、アルミニウム含有量、洗浄剤含有量、保存剤含有量など）の分析を包含し得る。
【００４８】
本発明は、ワクチン組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、ｐＨを測定し、次いでこの組成物のｐＨを所望の値（例えば、６と８との間、または約７）に調整する工程を含む、本発明にしたがって組成物を分析する工程を包含する。
【００４９】
本発明は、ワクチンをパッケージ化するための方法であって、以下の工程を包含する方法を提供する：（ａ）血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方または両方を含むバルクのワクチンを製造する工程；（ｂ）このバルクのワクチン中の結合型糖類および／または非結合型糖類の量を莢膜糖類の各々について分析する工程；（ｃ）必要に応じて、ｐＨおよび／または他の特性についてこのバルクのワクチンを分析する工程；そして工程（ｂ）および工程（ｃ）から得た結果が、このバルクのワクチンが臨床上の使用について受容可能であることを示す場合に、（ｄ）このバルクからヒトに対する使用のためのワクチンを調製し、そしてパッケージ化する工程。工程（ｃ）は、糖類の最小濃度の評価、非結合型糖類：結合型糖類の比の評価などを包含する（上記を参照のこと）。工程（ｄ）は、単位用量形態または複数用量形態（例えば、バイアルまたはシリンジ）にパッケージ化する工程を包含し得る。注射についての代表的なヒトの用量は、０．５ｍｌの容量を有する。
【００５０】
工程（ｃ）および／または工程（ｄ）は、上記バルクのワクチンと１種以上のさらなる抗原とを混合することによって進められ得、これらの抗原としては、以下が挙げられる：−血清群ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類抗原；
−血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質抗原；
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの微小胞［７４］、「ネイティブＯＭＶ」［７５］、ブレブまたは外膜小胞［例えば、参考文献７６〜８１など］；
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ由来の糖類抗原；
−多価結合型糖類抗原のようなＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、参考文献８２〜８４］；
−不活化ウイルスのようなＡ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、８５、８６］；
−表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、８６、８７］；
−必要に応じてペルタクチンならびに／または凝集原２および凝集原３［例えば、参考文献８８および８９］とも組み合わせられる、百日咳完全毒素（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）のようなＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（細胞性百日咳抗原が使用され得る）；
−ジフテリアトキソイドのようなジフテリア抗原［例えば、参考文献１の第１３章］（例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、９０］）；
−破傷風トキソイドのような破傷風抗原［例えば、参考文献１の第２７章］；
−ＩＰＶのようなポリオ抗原［例えば、９１，９２］。
このような抗原が、アルミニウム塩アジュバント（例えば、水酸化物またはリン酸塩）に吸着され得る。好ましくは、任意のさらなる糖類が、結合体として挙げられる。
【００５１】
（バッチ間の一貫性）
ヒト用ワクチンの製造に関して、結合型糖類は、結合体化の前（例えば、糖類とキャリアタンパク質）、結合体化の後、処方の後および混合の後に品質管理に供されるべきである。干渉が、シアル酸の複数の供給源を有することによって引き起こされるので、単糖類の分析に基づく先行技術の方法が使用されて、髄膜炎菌の血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の莢膜糖類を、これらが混合された後に区別し得ない。しかし、本発明によって、単糖類の分析が使用されて、混合した結合体が分析され得る。さらに、本発明のプロセスは、信頼性および一貫性があり、したがってこれが先行技術の方法では不可能であった、混合した結合体に関する異なるバッチの妥当な比較を可能にする。したがって、混合した結合体ワクチンの異なるバッチが、調製され、アッセイされ、次いでほとんど一貫したバッチが、販売および使用のために選択され得る一方で、異常なバッチは、拒絶され得る。
【００５２】
本発明は、少なくとも２種の異なる髄膜炎菌の血清群由来の莢膜糖類の混合物内の、個々の血清群由来の糖類を定量化するためのプロセスであって、ここで：（ａ）この異なる血清群が、血清群Ｃ、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５および／または（ｉｉ）血清群Ｙの一方または両方を含み；（ｂ）このプロセスが、この混合物内の莢膜糖類を解重合して、解重合した混合物を提供する工程を包含し；そして（ｃ）この異なる血清群が、この解重合した混合物の単糖類の組成を比較することによって定量化されるプロセスを提供する。
【００５３】
本発明はまた、ワクチンのｎ個のバッチであって、ここで：（ａ）ワクチンのｎ個のバッチの各々が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含み；（ｂ）第１のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ１であり；（ｃ）第２のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ２であり；適用可能な場合、（ｄ）第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ１であり；適用可能な場合、（ｅ）第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ２であり；適用可能な場合、（ｆ）第１のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ１であり；適用可能な場合、（ｇ）第２のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ２であり；（ｈ）Ｃ１／Ｃ２、Ｗ１／Ｗ２およびＹ１／Ｙ２の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間であり、そして好ましくはそれぞれ０．９５と１．０５との間であり；そして（ｉ）このｎの値は、２（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上）以上であるバッチを提供する。
【００５４】
（ｈ）において特定される比は、比較される各バッチからの単一のサンプルに基づき得るが、代表的には各バッチの複数のサンプルから得た平均の値（例えば、平均値）に基づき得る。したがって、ｎ個のバッチの各々は、複数のサンプリングに供され得、そして各サンプルは、次いで各バッチについて計算される平均値および必要な比を計算するために使用される平均値による、Ｃ１、Ｃ２、Ｗ１、Ｗ２、Ｙ１およびＹ２の複数の測定値に従い得る。
【００５５】
ワクチンの各バッチ（またはロット）は、別個に調製された。例えば、２つの異なるバッチは、同じバルクの単一結合体を別々に混合（ｓｅｐａｒａｔｅ ｍｉｘｉｎｇ）するか、または別個に調製されたバルクの単一結合体を混合することによって作製され得る。同じバルクの混合物の異なるサンプルは、異なるバッチではなく、これらのサンプルは、異なる結合体の混合物を調製するときに生じる違いに起因するバッチ間の変動に従わない。
【００５６】
上記で特定されるような特徴（ａ）〜（ｉ）に加えて、上記ｎ個のバッチは、以下によってさらに特徴付けられ得る：（ｊ）上記第１のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ３であり；（ｋ）上記第２のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ４であり；適用可能な場合、（ｌ）この第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ３であり；適用可能な場合、（ｍ）この第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ４であり；適用可能な場合、（ｎ）この第１のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ３であり；適用可能な場合、（ｏ）この第２のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ４であり；（ｐ）Ｃ３／Ｃ４、Ｗ３／Ｗ４およびＹ３／Ｙ４の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間であり、そして好ましくはそれぞれ０．９５と１．０５との間である。このバッチはまた、以下によって特徴付けられ得る：（ｑ）Ｃ３／Ｃ１、Ｃ４／Ｃ２、Ｗ３／Ｗ１、Ｗ４／Ｗ２、Ｙ３／Ｙ１およびＹ４／Ｙ２の比が、それぞれ０．２０未満（例えば、０．１５未満、０．１０未満、０．０５未満、０．０２未満、０）である。
【００５７】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなっても、さらに何かを含んでも（例えば、Ｘ＋Ｙ）よい。
【００５８】
言葉「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙから「実質的に遊離（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）する」組成物は、Ｙからから完全に遊離であり得る。必要な場合、言葉「実質的に」は、本発明の定義から除かれ得る。
【００５９】
数値ｘとの関係において用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００６０】
糖の環が開いた形態および閉じた形態で存在し得、閉じた形態が本明細書中の構造式において示される一方で、開いた形態はまた、本発明に包含されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、マンニトール安定剤を使用して凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図２】図２は、マンニトール安定剤を使用して凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図３】図３は、スクロースが安定剤として使用された場合の、凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図４】図４は、スクロースが安定剤として使用された場合の、凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図５】図５は、凍結乾燥されなかった血清群Ｙの結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図６】図６は、凍結乾燥されなかった血清群Ｙの結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図７】図７は、凍結乾燥されなかった血清群Ｗ１３５の結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図８】図８は、凍結乾燥されなかった血清群Ｗ１３５の結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図９】図９は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１０】図１０は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１１】図１１は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１２】図１２は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１３】図１３〜１５は、髄膜炎菌の血清群Ｃの莢膜糖類（１３）、血清群Ｗ１３５の莢膜糖類（１４）、および血清群Ｙの莢膜糖類（１５）についての構造式を示す。
【図１４】図１３〜１５は、髄膜炎菌の血清群Ｃの莢膜糖類（１３）、血清群Ｗ１３５の莢膜糖類（１４）、および血清群Ｙの莢膜糖類（１５）についての構造式を示す。
【図１５】図１３〜１５は、髄膜炎菌の血清群Ｃの莢膜糖類（１３）、血清群Ｗ１３５の莢膜糖類（１４）、および血清群Ｙの莢膜糖類（１５）についての構造式を示す。
【図１６】図１６は、血清群Ｗ１３５と血清群Ｙとの間の違いを示す。
【図１７】図１７は、血清群Ａの髄膜炎菌由来の莢膜糖類の構造式を示す。
【図１８】図１８は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ由来の莢膜糖類の構造式を示す。
【図１９】図１９は、血清群Ｃの結合体（黒菱形）、血清群Ｗ１３５の結合体（黒四角）および血清群Ｙの結合体（黒三角）を合わせた、６つの時点に対する遊離糖類の変化（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（発明を実施するための形態）
（結合体生成およびクロマトグラフ法）
莢膜糖類抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから調製され、そして参考文献７に記載されるように、ＣＲＭ１９７に結合体化された。
【００６３】
上記４種の結合体が組み合わされて、水性「ＭｅｎＡＣＷＹ」組成物が提供された。
【００６４】
分離作業において、血清群Ａの結合体は、スクロースまたはマンニトールのどちらかの存在下で凍結乾燥され、そして血清群Ｃの結合体と血清群Ｗ１３５の結合体と血清群Ｙの結合体との混合物（「ＭｅｎＣＷＹ」）が、調製された。
【００６５】
糖類含有量の分析は、製造業者の説明書に従ってＤｉｏｎｅｘＴＭ ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィーシステム上で行われた。この器具は、グラジエントポンプモジュール（ＧＰ４０またはＧＰ５０）およびアンペロメトリック電気化学検出器（ＥＤ４０またはＥＤ５０）およびオートサンプラー（ＡＳ３５００またはＡＳ５０）を有した。糖類は、金作用電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を伴う）の表面での糖類の酸化により生じた電流を測定することによって検出される。三重ポテンシャル波形は、以下の設定を使用して適用された：Ｅ１＝０．０５Ｖ；ｔｌ＝４００ｍｓ；Ｅ２＝０．７５Ｖ；ｔ２＝２００ｍｓ；Ｅ３＝−０．１５Ｖ；ｔ３＝４００ｍｓ。統合は、Ｅ１の適用の間の２００ｍｓ〜４００ｍｓで起きた。このクロマトグラフィーのデータは、ＰｅａｋＮｅｔ ６．４データ整理ソフトウェアを使用して積分され、そして処理された。
【００６６】
（血清群Ａ）
血清群Ａの糖類のマンニトール−凍結乾燥処方物は、４℃にて３ヶ月間保存された後にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって試験された。結合体含有組成物は、Ｃ４固相抽出（ＳＰＥ）カラムを使用して遊離糖類から分離された。この遊離糖類を含む溶液は、ＴＦＡを使用する１００℃にて２時間の酸加水分解に供された。次いで、この混合物は、マンノサミン−６−ホスフェートの検出のために、ＰＡ１保護、勾配溶離およびＰＡＤ検出を使用するＤｉｏｎｅｘＴＭ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムに適用された。結果は、図１に示される。
【００６７】
遊離糖類のＳＰＥ分離を伴わずに、同じ分析が行われた。この分析の結果は、図２に示される。図１と図２との比較（図１の分析に１：２の希釈を使用し、そして図２の分析に１：５の希釈を使用したことに注意する）は、マンノサミン−６−ホスフェートのピークが、図１において非常に低いことを示し、この組成物中の遊離糖類の低いレベルを示す。定量分析は、１バイアルあたり３．７％の遊離糖類を含む１０．７μｇの全糖類を示す。
【００６８】
スクロース−凍結乾燥物質は、１バイアルあたり６００μｌの水で再構成され、次いで１回の分析あたり２〜３ｍｌ提供されるようにサンプルがプールされた後に、同じ方法で分析された。しかし、ＳＰＥ Ｃ４の前に、この組成物は、１Ｋ膜を使用する限外濾過に供された（２ｍｌの水で洗浄し、２ｍｌのサンプル溶液をロードし、その度ごとに２ｍｌの水で３サイクル洗浄し、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を回収し、そして１ｍｌまで容量を調整し、ＳＰＥにロードするために１：１に希釈して０．９％の最終ＮａＣｌ濃度を与える）。図３は、この組成物中にごくわずかな遊離糖類が存在するが、結合型物質に対応する大きなピークが存在することを示す（図４）。
【００６９】
（血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ）
他の結合体と組み合わせる前に、バルクの血清群Ｙの結合体は、分析された。この結合体は、３０ｋＤａの限外濾過膜を使用して遊離糖類から分離された。分析されるべき物質は、ＴＦＡによって１００℃にて加水分解され、次いで製造業者の説明書に従って、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム、ＡｍｉｎｏＴｒａｐ、定組成溶離および再生工程、ならびにＰＡＤ検出を使用するＤｉｏｎｅｘＴＭ装置上で、グルコースについて定量分析された。ＣＲＭ１９７キャリアは、このカラムへの上記加水分解物の適用前に除去されることを必要としなかった。非結合型物質は、検出可能であった（図５）が、全グルコースより豊富ではなかった（図６）。異なる希釈に注目すると、これらの図の分析から、１．８％の遊離糖類画分が提供される。
【００７０】
バルクの血清群Ｗ１３５物質は、同じ方法で処理され、そして分析されたが、この方法は、グルコースの検出よりもむしろガラクトースの検出を伴った（図７および図８）。異なる希釈に注目すると、これらの図の分析から、６％の遊離糖類画分が提供される。
【００７１】
（混合した結合体）
血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙついての結合体は、参考文献７に記載されるように、リン酸アルミニウムアジュバントと組み合わされた。４℃にて２週間保存されたＭｅｎＣＷＹ結合体の組み合わせが使用されて、凍結乾燥したＭｅｎＡ結合体が再構成され、そして４８時間後に、結合体からこのアジュバントを分離するための遠心分離を伴って分析された。この混合した結合体は、３０ｋＤａの膜を使用する２サイクルの限外濾過によって遊離糖類から分離された。第２のサイクルは、ときとして第１のサイクルの透過物中に通り抜けることが見出される複合糖質による汚染を減少させた。糖類は、限外濾過の前および後における、ＴＦＡを使用する９０℃／１００℃での酸加水分解により、次いで２つを別個に、ＤｉｏｎｅｘＴＭ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムを使用してＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析することによって分析された。
【００７２】
血清群Ｃの分析のために、カラムは、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１保護を有し、そして勾配溶離工程を使用した。このカラムは、この方法のより迅速な様式として、グルコースとガラクトースとが分解されない様式において実行された。結果は、図９および図１０に示される。血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに関して、このカラムは、ＡｍｉｎｏＴｒａｐを有し、そしてグルコースおよびガラクトースを分解する定組成溶離および再生を使用した。結果は、図１１および図１２に示される。
【００７３】
それぞれの異なる糖類の量を計算するために、図９／１０の分析におけるシアル酸の量は、グルコースおよびガラクトースの合わせた量を差し引くことによって干渉について補正される。この値は、ＭｅｎＣの濃度を与える。その後、図１１／１２の分析におけるガラクトースおよびグルコースの量は、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙを定量化するために使用される。不完全な加水分解に起因して、図１１／１２から得たグルコースおよびガラクトースの合わせた量は、上記されるように、図９／１０から取得された量と一致し得ないが、このような矛盾は、全体の分析に影響を与えない。量は、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸の公知の量を含む基準と比較することによって計算された。
【００７４】
結合体中の全ＭｅｎＣ糖類および遊離ＭｅｎＣ糖類の代表的な２つ組（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の分析は、これらの結果を与えた：
【００７５】
【表１】
したがって、血清群Ｃの糖類を定量化するための固有な糖類の欠如にかかわらず、本発明は、この物質が血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類のバックグラウンドにおいて定量的にアッセイされることを可能にする。
【００７６】
図９および図１１の類似する分析は、ＭｅｎＡＣＷＹ組成物中のそれぞれの遊離糖類の量を示し、そして遊離糖類をこの組成物中の全糖類の％として示すことを可能にする。この分析は、１用量あたり１０μｇ（すなわち２０μｇ／ｍｌ）の各糖類を含むように処方されたＭｅｎＣＷＹの組み合わせ対して、１年間にわたる種々の時点において行われた。結果は、以下：
【００７７】
【表２】
の通りであった。
６つの時点における遊離糖類の％の変動は、図１９に示される。
【００７８】
第２の系列の実験において、ワクチンは、これまでの実験に対して半分（１用量あたり５μｇの各糖類）および４分の１の用量（２．５μｇ）で処方された。本発明のプロセスは、この組み合わせの中から異なる糖類を解析するために使用され、そして結果は、以下：
【００７９】
【表３】
の通りであった。
【００８０】
本発明が例の手段によってのみ記載され、そして改変が、本発明の範囲および精神内にありつつなされ得ることが理解される。
【００８１】
【化４】
【００８２】
【化５】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチンの分析および品質管理の分野にあり、このワクチンは、細菌の莢膜糖類を含み、そして特に、この糖類がキャリアに結合体化される糖類を含む。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
キャリアタンパク質に結合体化された莢膜糖類抗原を含む免疫原は、当該分野において周知である。結合体化は、Ｔ細胞非依存性抗原をＴ細胞依存性抗原に変換し、それによって記憶応答（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を増強し、そして防御免疫を発生させ、そして原型の結合体ワクチンは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ（Ｈｉｂ）に対するものであった（例えば、非特許文献１の第１４章を参照のこと）。Ｈｉｂワクチン以来、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）に対して保護するための結合型糖類ワクチンが、開発された。結合体ワクチンが目的とする他の生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）（非特許文献２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（非特許文献３）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（非特許文献４）である。
【０００４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに対する結合体ワクチンは、ヒトに対する使用が認可され、そしてこれらとしては、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ（非特許文献５）、ＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭが挙げられる。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの各々からの結合体の混合物が、報告され（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献６および非特許文献７）、これらとしては、ＭｅｎａｃｔｒａＴＭ製品が挙げられる。結合型抗原の他の混合物としては、以下が挙げられる：（ｉ）髄膜炎菌性のＡ／Ｃの混合物（非特許文献８、非特許文献９）；（ｉｉ）７つの肺炎球菌の結合体を含むＰｒｅｖＮａｒＴＭ製品（非特許文献１０）；（ｉｉｉ）髄膜炎菌およびＨｉｂの混合した結合体（非特許文献１１、非特許文献１２）；および（ｉｖ）髄膜炎菌、肺炎球菌およびＨｉｂの合わせた結合体（非特許文献１３）。
【０００５】
結合体ワクチンを取り扱う工程が安定性およびバッチ間の一貫性を含む場合を示す。例えば、Ｈｉｂワクチンにおいて、糖類の触媒性解重合が、報告され（非特許文献１４）、そして血清群Ａの髄膜炎菌莢膜の結合体は、容易に加水分解される（特許文献３）。結合体の不安定性は、望ましくない、長期にわたる免疫原性結合体の有効量の減少、バッチ間の変動を生じ、そして特徴付けられない分解産物のレベルを増加させる。非特許文献１５および非特許文献１６は、Ｈｉｂ結合体ワクチンの安定性試験に関する問題を議論する。
【０００６】
定量的な複合糖質の分析は代表的に、糖類の加水分解の第１の工程を包含し、その後この分析は、遊離した単糖類に基づく分析を伴う。この分析は、単一の結合体に対して、相対的に分かりやすい（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー法は、Ｈｉｂの加水分解された結合体（非特許文献１７）および血清群Ａの髄膜炎菌の加水分解された結合体（非特許文献１８）を分析するために使用されてきた）のに対して、この状況は、特に異なる糖類が単糖類単位を共有する場合、ワクチンの組み合わせにおいて、より複雑である。例えば、髄膜炎菌の血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの莢膜糖類は、全てシアル酸を含み、したがって、遊離したシアル酸の測定に基づく任意の方法は、この３種の血清群を区別し得ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０５８７３７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／００７９８５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０８０６７８号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｌｏｔｋｉｎら編、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、第４版、ＩＳＢＮコード０７２１６９６８８０
【非特許文献２】Ｂａｋｅｒら、「Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ」、２００３年、第１８８巻、ｐ．６６−７３
【非特許文献３】Ｔｈｅｉｌａｃｋｅｒら、「Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ」、２００３年、第７１巻、ｐ．３８７５−８４
【非特許文献４】Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ、「Ｄｒｕｇｓ Ｒ Ｄ」、２００３年、第４巻、ｐ．３８３−５
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓ、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ」、２００１年、第２巻、ｐ．４７−４９
【非特許文献６】Ｒｅｎｎｅｌｓら、「Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ」、２００２年、第２１巻、ｐ．９７８−９７９
【非特許文献７】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、「Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ」、２００２年、第１８６巻、ｐ．１８４８−１８５１
【非特許文献８】Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９２年、第１０巻、ｐ．６９１−６９８
【非特許文献９】Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、「ＪＡＭＡ」、１９９６年、第２７５巻、ｐ．１４９９−１５０３
【非特許文献１０】ＤａｒｋｅｓおよびＰｌｏｓｋｅｒ、「Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｄｒｕｇｓ」、２００２年、第４巻、ｐ．６０９−６３０
【非特許文献１１】Ｕｇｏｚｚｏｌｉ、「Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ」、２００２年、第１８６巻、ｐ．１３５８−６１
【非特許文献１２】Ｇｒａｎｏｆｆら、「Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ」、１９９７年、第６５巻、ｐ．１７１０−５
【非特許文献１３】ＰａｒａｄｉｓｏおよびＬｉｎｄｂｅｒｇ、「Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ」、１９９６年、第８７巻、ｐ．２６９−２７５
【非特許文献１４】Ｃｏｒｂｅｌ、「Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ」、１９９６年、第８７巻、ｐ．１１３−１２４
【非特許文献１５】Ｋｌｕｇ、「Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ」、１９９６年、第８７巻、ｐ．２６３−２６７
【非特許文献１６】ＰｌｕｍｂおよびＹｏｓｔ、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９６年、第１４巻、ｐ．３９９−４０４
【非特許文献１７】Ｔｓａｉら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、１９９４年、第１２巻、ｐ．７００−７０６
【非特許文献１８】Ｒｉｃｃｉら、「Ｖａｃｃｉｎｅ」、２００１年、第１９巻、ｐ．１９８９−１９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
安定性および完全性を評価するための結合体ワクチン中の糖類の定量的評価における改良を提供することは、本発明の目的である。特に、髄膜炎菌の混合性結合体ワクチン内の個々の結合体を測定するために使用され得る方法を提供し、したがってワクチンの品質管理および一貫性における改良を提供することが、目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、複数の血清群に由来する混合した髄膜炎菌の糖類の分析を、これらの糖類が単糖類単位を共有するにもかかわらず可能にする方法に基づく。したがって、本発明は、組成物の糖類含有量を分析するためのプロセスであって、ここで：
（ａ）この組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）このプロセスが、この組成物のシアル酸含有量を分析する工程を包含し、そして：（ｉ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、この組成物のガラクトース含有量を分析する工程を包含し；（ｉｉ）この組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、この組成物のグルコース含有量を分析する工程を包含し；
（ｃ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、この組成物中の血清群Ｗ１３５の糖類の含有量が、工程（ｂ）から得たガラクトース分析の結果によって決定され；
（ｄ）この組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、この組成物中の血清群Ｙの糖類の含有量が、工程（ｂ）から得たグルコース分析の結果によって決定され；そして
（ｅ）この組成物中の血清群Ｃの糖類の含有量が、シアル酸分析の結果を：（ｉ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有するが、血清群Ｙの糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得たガラクトース分析の結果；（ｉｉ）この組成物が、血清群Ｙの糖類を含有するが、血清群Ｗ１３５の糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得たグルコース分析の結果；または（ｉｉｉ）この組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類両方を含有する場合には工程（ｂ）から得たグルコース分析およびガラクトース分析の合わせた結果と比較することによって決定されるプロセスを提供する。
【００１１】
したがって、血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の糖類の組み合わせに関して、本発明は、シアル酸含有量、グルコース含有量およびガラクトース含有量を分析する。このグルコースの結果およびガラクトースの結果が使用されて、血清群Ｙ由来および血清群Ｗ１３５由来の糖類が、それぞれ直接定量化され、そしてこのグルコースおよびガラクトースの合わせた含有量は、このシアル酸含有量から減じられて、血清群Ｃ由来の糖類が定量化される。したがって、この３種の血清群は、これらの単糖類の含有量が重複するにもかかわらず決定され得る。本発明者らは、この３種の異なる単糖類の分析が、これらの単糖類の間の干渉および上記組成物中の任意の他の糖類物質（例えば、凍結乾燥安定剤）による干渉を伴わずに同じ材料に対して行われ得ることを有利に見出した。本方法が使用されて、結合体ワクチン中の全糖類および遊離糖類が分析され、そして複数の血清群の莢膜糖類を含むワクチンの品質管理が単純化される。
【００１２】
干渉を伴わずにアルドース、ヘキソサミンおよびシアル酸の混合物を分析するための方法が記載される［２２］が、これは酵素的処理および化学的誘導体化に依存する。対照的に、本発明のプロセスは、このような工程を必要とせず、したがって、より迅速かつ容易に実施される。さらに、参考文献２２中で扱われる状況は、共通の単糖類単位を共有する異なる糖類を分解を分離しなければならないという固有の問題に苦しむ。
【００１３】
本発明はまた、本発明のプロセスを実施するのに適合されるコンピューター装置を提供する。特に、本発明は、上記に定義されるような組成物の糖類含有量を分析するためのコンピュータープログラムであって、（ａ）サンプルのシアル酸含有量、ならびにグルコース含有量および／またはガラクトース含有量についてのデータを受容し；そして（ｂ）このデータから、血清群Ｃ由来の莢膜糖類の含有量、ならびに血清群Ｗ１３５由来の莢膜糖類の含有量および／または血清群Ｙの莢膜糖類の含有量を計算するためのプログラムモジュールを備えるコンピュータープログラムを提供する。本発明はまた、コンピューターが読み込み可能な記憶媒体を備えるコンピュータープログラム製品を提供し、この記憶媒体は、本発明のコンピュータープログラムを記憶する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
組成物の糖類含有量を分析するためのプロセスであって、ここで以下：
（ａ）該組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）該プロセスが、該組成物のシアル酸含有量を分析する工程を包含し、そして：（ｉ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、該組成物のガラクトース含有量を分析する工程を包含し；（ｉｉ）該組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、該組成物のグルコース含有量を分析する工程を包含し；
（ｃ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有する場合、該組成物中の血清群Ｗ１３５の糖類含有量が、工程（ｂ）から得た該ガラクトース分析の結果によって決定され；
（ｄ）該組成物が、血清群Ｙの糖類を含有する場合、該組成物中の血清群Ｙの糖類含有量が、工程（ｂ）から得た該グルコース分析の結果によって決定され；そして
（ｅ）該組成物中の血清群Ｃの糖類含有量が、該シアル酸分析の結果を：（ｉ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類を含有するが、血清群Ｙの糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得た該ガラクトース分析の結果；（ｉｉ）該組成物が、血清群Ｙの糖類を含有するが、血清群Ｗ１３５の糖類を含有しない場合には工程（ｂ）から得た該グルコース分析の結果；または（ｉｉｉ）該組成物が、血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類両方を含有する場合には工程（ｂ）から得た該グルコース分析および該ガラクトース分析の合わせた結果と比較することによって決定される、
プロセス。
（項目２）
上記組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよび血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの３種全てに由来する莢膜糖類を含有する、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
上記組成物が、１種以上のさらなる莢膜糖類を含有する、項目２に記載のプロセス。
（項目４）
上記１種以上のさらなる莢膜糖類が、血清群ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類；およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ由来の莢膜糖類からなる群より選択される、項目３に記載のプロセス。
（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載のプロセスであって、上記莢膜糖類を解重合して、その構成単糖類を提供するために上記組成物を処理する工程を包含する、プロセス。
（項目６）
シアル酸含有量、グルコース含有量および／またはガラクトース含有量が、必要に応じてアンペロメトリック電気化学検出を伴う、高速アニオン交換クロマトグラフィーによって測定される、項目１〜５のいずれかに記載のプロセス。
（項目７）
項目１〜６のいずれかに記載のプロセスであって、以下：
重量オスモル濃度、ｐＨ、個々の糖類または結合体の重合度、タンパク質含有量、アルミニウム含有量、洗浄剤含有量、および保存剤含有量、
の構成要素または特性の１つ以上が分析される工程をまた包含する、プロセス。
（項目８）
上記莢膜糖類が、糖類−タンパク質結合体に由来する、項目１〜７のいずれかに記載のプロセス。
（項目９）
上記結合体中のタンパク質が、細菌毒素または細菌トキソイドである、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
上記毒素またはトキソイドが、ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素誘導体；およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤからなる群より選択される、項目９に記載のプロセス。
（項目１１）
組成物を分析するためのプロセスであって、以下：
（ａ）該組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）該組成物が、非結合型の形態である該莢膜糖類を含有し得；
（ｃ）任意の非結合型莢膜糖類の含有量が、項目１〜７のいずれか１項に記載のプロセスによって決定され；
（ｄ）結合型莢膜糖類の含有量が、項目１〜７のいずれか１項に記載のプロセスによって決定され；そして、必要に応じて
（ｅ）該組成物中の、結合型糖類：非結合型糖類の比が、該莢膜糖類の１種以上について計算される、
プロセス。
（項目１２）
少なくとも２種の異なる髄膜炎菌の血清群由来の莢膜糖類の混合物内の、個々の血清群由来の糖類を定量化するためのプロセスであって、ここで：（ａ）該異なる血清群が、血清群Ｃ、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５および／または（ｉｉ）血清群Ｙの一方または両方を含み；（ｂ）該プロセスが、該混合物内の該莢膜糖類を解重合して、解重合した混合物を提供する工程を包含し；そして（ｃ）該異なる血清群が、該解重合した混合物の単糖類の組成を比較することによって定量化される、プロセス。
（項目１３）
医師による使用のためのワクチンを販売するための方法であって、（ａ）血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含むワクチンを製造する工程；（ｂ）該莢膜糖類の各々についての該ワクチン中の、結合型糖類および／または非結合型糖類の量を分析する工程を包含し；そして工程（ｂ）から得た結果が、臨床使用において受容可能な糖類含有量を示す場合、（ｃ）医師による使用のための該ワクチンを販売する工程を包含する、方法。
（項目１４）
ワクチンの２つのバッチであって、ここで以下：
（ａ）ワクチンの該バッチの各々が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含み；
（ｂ）該第１のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ１であり；
（ｃ）該第２のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ２であり；
適用可能な場合、（ｄ）該第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ１であり；
適用可能な場合、（ｅ）該第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ２であり；
適用可能な場合、（ｆ）該第１のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ１であり；
適用可能な場合、（ｇ）該第２のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ２であり；
そしてここで（ｈ）Ｃ１／Ｃ２、Ｗ１／Ｗ２およびＹ１／Ｙ２の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間である、
バッチ。
（項目１５）
項目１４に記載のバッチであって、ここで：（ｉ）上記第１のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ３であり；（ｊ）上記第２のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ４であり；適用可能な場合、（ｋ）該第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ３であり；適用可能な場合、（ｌ）該第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ４であり；適用可能な場合、（ｍ）該第１のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ３であり；適用可能な場合、（ｎ）該第２のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ４であり；（ｏ）Ｃ３／Ｃ４、Ｗ３／Ｗ４およびＹ３／Ｙ４の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間であり、そして好ましくはそれぞれ０．９５と１．０５との間である、バッチ。
（項目１６）
項目１５に記載のバッチであって、（ｐ）Ｃ３／Ｃ１、Ｃ４／Ｃ２、Ｗ３／Ｗ１、Ｗ４／Ｗ２、Ｙ３／Ｙ１およびＹ４／Ｙ２の比が、それぞれ０．２０未満である、バッチ
（項目１７）
項目１〜１２のいずれか１項に記載のプロセスを実施するのに適合されるコンピューター装置。
（項目１８）
項目１に定義されるような組成物の糖類含有量を分析するためのコンピュータープログラムであって、（ａ）サンプルのシアル酸含有量、ならびにグルコース含有量および／またはガラクトース含有量についてのデータを受容し；そして（ｂ）該データから、血清群Ｃ由来の莢膜糖類含有量、ならびに血清群Ｗ１３５由来の莢膜糖類含有量および／または血清群Ｙの莢膜糖類含有量を計算するためのプログラムモジュールを備える、コンピュータープログラム。
【００１４】
（血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの莢膜糖類）
本発明の方法は、髄膜炎菌の莢膜糖類の混合物を分析するための方法である。この混合物は、（ｉ）血清群Ｃ由来の莢膜糖類、ならびに（ｉｉ）血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の莢膜糖類のいずれかまたは両方（すなわち、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、またはＣ＋Ｗ１３５＋Ｙ）を含む。さらなる糖類がまた、存在し得る。
【００１５】
上記血清群Ｃの莢膜糖類は、（α２→９）結合型シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。ほとんどの血清群Ｃ株は、シアル酸残基のＣ−７および／またはＣ−８にＯ−アセチル基を有するが、約１５％の臨床単離体は、これらのＯ−アセチル基を欠く［２３、２４］。このアセチル化は、保護性の効力に影響しないようである（例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ製品とは違って、ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ製品は、脱Ｏ−アセチル化糖類を使用するが、両方のワクチンは、有効である）。この糖類の構造は、図１３に示され、そして以下：
【００１６】
【化１】
のように記述される。
【００１７】
血清群Ｗ１３５の糖類は、シアル酸−ガラクトースの二糖類単位のポリマーである。血清群Ｃの糖類のように、血清群Ｗ１３５の糖類は、可変のＯ−アセチル化を有する（但し、シアル酸の７位および９位において）［２５］。この構造は、図１４に示され、そして以下：
【００１８】
【化２】
のように記述される。
【００１９】
血清群Ｙの糖類は、二糖類の反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除いて、血清群Ｗ１３５の糖類と同様である（図１６を参照のこと）。血清群Ｗ１３５の糖類のように、血清群Ｙの糖類は、シアル酸の７位および９位に可変のＯ−アセチル化を有する［２５］。血清群Ｙの構造は、図１５に示され、そして以下：
【００２０】
【化３】
のように記述される。
【００２１】
したがって、血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の莢膜糖類を含有する組成物中に、３種の異なる構成モノマー（グルコース、ガラクトース、およびシアル酸）が存在し、そしてこれらの３種のモノマーは、加水分解後の混合物中に存在する。このような混合物中のグルコースモノマーの量は、最初の組成物中の血清群Ｙの糖類の量に直接関連し、ガラクトースモノマーの量は、Ｗ１３５の糖類の量に直接関連する。しかし、血清群Ｃに関して、この状況は、より複雑であり：シアル酸は、血清群Ｃの糖類を定量化するのに利用可能な唯一のモノマーであるが、上記混合物中のシアル酸の含量のあらゆる測定は、血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類に由来するモノマーを含む。本発明は、ガラクトース、グルコースおよびシアル酸の各々の混合物中の含有量を（別々におよび／または同時に）測定し、次いで（ａ）ガラクトース含有量を使用して、加水分解前の血清群Ｗ１３５含有量を定量化し；（ｂ）グルコース含有量を使用して加水分解前の血清群Ｙ含有量を定量化し；（ｂ）シアル酸含有量とグルコースおよびガラクトースの合わせた含有量との間の差を使用して、加水分解前の血清群Ｃ含有量を定量化する（すなわち、血清群Ｃのモル濃度量は、シアル酸のモル濃度量から（グルコース＋ガラクトース）のモル濃度量を差し引くことによって計算される）ことによってこの分析の複雑性を克服する。シアル酸のモル濃度含有量からの、グルコースのモル濃度含有量およびガラクトースのモル濃度含有量の減算は、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙによる干渉を補正し、そして血清群Ｃからのシアル酸のみを残す。
【００２２】
本発明が使用されて、種々の長さの莢膜糖類が分析され得る。例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭが、血清群Ｃの完全長ポリ糖類からのサイズを選択したフラグメント（オリゴ糖）を含有するのに対して、ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭは、完全長のポリ糖類を使用する。本発明は、オリゴ糖および／または完全長ポリ糖類と共に使用され得る。オリゴ糖は、細菌中に存在するネイティブな莢膜ポリ糖類において見出される重合度（ＤＰ）より小さい重合度を有し、そして３０未満（例えば、１０と２５との間）の平均ＤＰを有し得る。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色定量アッセイによって簡便に測定され得る［２６］。
【００２３】
（単糖類含有量の分析）
本発明のプロセスは、シアル酸の含有量、ガラクトースの含有量（血清群Ｗ１３５が存在する場合）、およびグルコースの含有量（血清群Ｙが存在する場合）を分析する工程を包含する。プロセスが、組成物中の単糖類単位の存在をモニタリングするため（例えば、単に、生成の初期段階からの残留単糖類をモニタリングためか、または結合体からのモノマーの可能な加水分解性の遊離をモニタリングするため）に実施される場合、このプロセスは、この組成物に対して直接実施され得る。しかし、代表的に、このプロセスは、組成物の糖類の総含有量を測定するために使用され、しがたってこの組成物は、この分析前に単糖類まで加水分解される。したがって、本発明のプロセスは、代表的に、莢膜糖類を解重合してそれらの構成単糖類を得るために、組成物を処理する工程を包含する。その後、シアル酸含有量ならびにガラクトース含有量および／またはグルコース含有量の分析は、解重合された混合物の遊離した単糖類に対して進められ得る。
【００２４】
莢膜糖類をそれらの構成単糖類まで解重合するための条件は、当該分野において公知である。例えば、血清群Ｃの糖類は、糖類の総含有量の分析のために１００ｍＭ ＨＣｌによる８０℃で２時間の処理によって加水分解され得る［２７］。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用する酸加水分解は、血清群Ｃのシアル酸の分解を避けるために、血清群Ｃについて好ましいわずかに低いインキュベーション温度（１００℃よりもむしろ９０℃）によって、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの全てを加水分解するために使用され得る。代表的なＴＦＡ処理は、ＴＦＡを２Ｍの最終濃度まで添加し、次いで９０分間、９０℃〜１００℃に加熱する工程を包含する。解重合の後、糖類加水分解物は、例えば、減圧乾燥器（ｖａｃｕｕｍ ｄｒｉｅｒ）を使用して乾燥され得る。
【００２５】
解重合の後、組成物は、血清群Ｃならびに血清群Ｗ１３５および／または血清群Ｙに由来する混合した単糖類を含む。この混合物中のこれらの単糖類の量は、加水分解前の本来の組成物中の糖類の含量に直接関係し、したがって最初の糖類の含量は、上記のように決定され得る。量は、分子の数（例えば、モル）、質量、比または濃度の項目について決定され得る。シアル酸が、グルコース／ガラクトースと異なる分子量を有する場合、モルを用いることが代表的であるが、これらの測定値のいずれかが、上記混合物の糖類含有量を評価するために使用され、そして置き換えられ得る。定量的な測定のために、分析結果は、特定の糖類の公知の含有量を用いる基準と比較され得る。
【００２６】
上記解重合された混合物は、好ましくは単糖類まで完全に加水分解される。本発明者らは、ときとし不完全な加水分解が起こり、二糖類のフラグメント（すなわち、ＭｅｎＷ１３５に対するＧａｌ−ＮｅｕＮＡｃ、およびＭｅｎＹに対するＧｌｃ−ＮｅｕＮＡｃ）が存在する混合物を与えることを見出した。しかし、上記単糖類は、正確な理論上の比で遊離し、そして上記二糖類は、この単糖類の分析を干渉しないので、二糖類の存在は、困難性をもたらし得ない。
【００２７】
解重合の進行は、（例えば、オリゴ糖への部分的加水分解よりもむしろ、単糖類への完全な加水分解を確認するために）公知の技術（例えば、ＮＭＲ、質量分析など）を使用して、混合物中の重合度（ＤＰ）を測定することによって確認され得る。
【００２８】
グルコース、ガラクトースおよびシアル酸単糖類を定量化するための方法は、当該分野において周知である。方法は、直接的または間接的であり得る。（例えば、これらの方法は、その単糖類を誘導体化し、次いで本来の単糖類含有量と相関する分析を実施することを包含し得る）。方法は、２種／３種の異なる単糖類を互いから分離し、次いで別個に分析することを包含し、そしてこのような場合において、単糖類含有量の実際の測定は、この分離に起因する特異性を有するそれぞれの事例において同一であり得る。しかし、それらが分析前に互いから分離される必要がないように、互いの存在下においてこの糖類を分析し得る方法を使用することが好ましい。さらに、方法は、結合型糖類に対して使用され得、この結合型糖類において、キャリアおよび糖類は、解重合の後に分けられる必要がない。１つの好ましい方法は、アニオンクロマトグラフィーであり、そして特に、通常はアンペロメトリック電気化学検出（ＰＡＤ）を備える、高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）である［２８、２９］。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤシステムは、ＤｉｏｎｅｘＴＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって提供され（例えば、ＢｉｏＬＣＴＭシステム）、これは、ＰＡ１［ジビニルベンゼンと２％架橋し、第四級アンモニウム官能性化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ラテックスの５００ｎｍ ＭｉｃｒｏＢｅａｄと凝塊形成した（５％架橋した）、直径１０μｍのポリスチレン担体］またはＰＡ１０［ジビニルベンゼンと５５％架橋し、二官能性第四級アンモニウムイオンの４６０ｎｍ ＭｉｃｒｏＢｅａｄと凝塊形成した（５％架橋した）、直径１０μｍのエチレンビニルベンゼン担体］のようなカラムを用いる。これらのシステムは、誘導体化または分析前の分離を必要とせずに、混合物内の個々の糖類を定量的に分析し得る。糖類の分析のために、上記カラムへの流入前に他の化合物を濾過することが望まれ得、そしてＤｉｏｎｅｘＴＭは、前置カラムトラップ（例えば、アミノ酸を除去するアミノトラップ、ホウ酸トラップなど）を形成し、そしてこの目的を保護する。
【００２９】
解重合された混合物内の、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸である単糖類を定量化するための代替的方法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。しかし、使用の容易さおよび高い感度のために、本発明のクロマトグラフ法が、好ましい。
【００３０】
シアル酸含有量ならびにグルコース含有量および／またはガラクトース含有量が、一旦決定されると、上記混合物中の各単糖類のモル量を比較し、それによって最初の組成物中の莢膜糖類の量を計算することは、簡単である。
【００３１】
本発明のプロセスは、代表的には破壊性である。したがって、完全な組成物に対してこのプロセスを実施するよりもむしろ、目的の組成物からサンプルを採取し、次いでこのサンプルに対して分析を行うことが、より代表的である。
【００３２】
（結合体）
本発明は、ワクチンの糖類含有量を分析するために有用であり、そして特に、結合型糖類を含むワクチンに対して有用である。共有結合が使用されて、糖類を、Ｔ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原に変換し、したがって免疫記憶のための初回刺激が可能になることによって、この糖類の免疫原性が増強される。結合体は、小児用ワクチンに関して特に有用であり、そしてこれは、周知の技術である［例えば、参考文献３０〜３９に概説される］。糖類は、キャリアと直接連結され得る［４０、４１］が、リンカーまたはスペーサー（例えば、アジピン酸、β−プロピオンアミド［４２］、ニトロフェニル−エチルアミン［４３］、ハロアシルハライド［４４］、グリコシド連結［４５］、６−アミノカプロン酸［４６］、ＡＤＨ［４７］、Ｃ４〜Ｃ１２部分（ｍｏｉｔｉｅｓ）［４８］など）は、一般的に使用される。
【００３３】
結合体中の代表的なキャリアタンパク質は、細菌の毒度またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素誘導体［４９〜５１］は、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭ中のキャリアタンパク質であり、一方で、破傷風トキソイドは、ＮｅｉｓＶａｃＴＭに使用される。ジフテリアトキソイドは、ＭｅｎａｃｔｒａＴＭ中のキャリアとして使用される。他の公知であるキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［５２］、合成ペプチド［５３、５４］、熱ショックタンパク質［５５、５６］、百日咳タンパク質［５７、５８］、サイトカイン［５９］、リンフォカイン［５９］、ホルモン［５９］、成長因子［５９］、種々の病原体由来抗原から得た複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞のエピトープを含む人工タンパク質［６０］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［６１、６２］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［６３］、鉄取込みタンパク質［６４］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［６５］などが挙げられる。組成物は、例えば、キャリア抑制のリスクを減少するために１種より多いキャリアタンパク質を使用し得、そして単一のキャリアタンパク質は、１種より多い糖類抗原を保有し得る［６６］。結合体は、一般的に、１：５（すなわち、タンパク質過剰）と５：１（すなわち、糖類過剰）との間の、糖類：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する。組成物は、上記結合体に加えて、遊離キャリアタンパク質を含有し得る［６７］。
【００３４】
一般的に、結合型糖類を含有する組成物は、本発明を使用して２つの手段で分析され得る。第１に、組成物中の各血清群について、糖類の総濃度は、例えば、ワクチンの販売前（規制または品質管理の目的のため）か、または結合体が混合された後に濃度を確認する前に測定され得る。第２に、組成物中の遊離の非結合型糖類は、例えば、不完全な結合体化について確認するためか、または長期にわたって増加する遊離糖類をモニタリングすることによって結合体の加水分解を追跡するために測定され得る。両方の型の分析を行うことによって、全糖類に対する遊離糖類の比は、規制または品質管理の目的のために使用され得る、各血清群について評価され得る。一般的に、ワクチンが２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満など）の各糖類を遊離形態で含むことを保証することが、望ましい。高レベルの遊離糖類は、結合体のより低い免疫原性用量を意味する。
【００３５】
したがって本発明は、組成物を分析するための方法であって、ここで：
（ａ）この組成物が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含有し；
（ｂ）この組成物が、非結合型の形態である莢膜糖類を含有し得；
（ｃ）任意の非結合型莢膜糖類の含有量が、上記の通り、本発明のプロセスによって決定され；
（ｄ）結合型莢膜糖類の含有量が、上記の通り、本発明のプロセスによって決定され；
そして、必要に応じて：
（ｅ）結合型糖類：非結合型糖類の比が、この莢膜糖類の１種以上について計算される方法を提供する。
【００３６】
工程（ｃ）および工程（ｄ）は、いずれかの順番で行われても同時に行われてもよい。
【００３７】
本発明はまた、医師による使用のためのワクチンを販売するための方法であって、（ａ）血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含むワクチンを製造する工程；（ｂ）上記莢膜糖類の各々についてのワクチン中の、結合型糖類および／または非結合型糖類の量を分析する工程を包含し；そして工程（ｂ）から得た結果が、臨床使用において受容可能な糖類含有量を示す場合、（ｃ）医師による使用のためのワクチンを販売する工程を包含する方法を提供する。工程（ｂ）は、糖類の最小濃度（例えば、１種の血清群あたり１μｇ〜２０μｇの間の全糖類）の評価、非結合型糖類：結合型糖類の比（例えば、２０重量％以下の非結合型糖類、好ましくは１０重量％以下または５重量％以下の非結合型糖類）の評価などに関し得る。工程（ｂ）は、パッケージ化されたワクチンに対して行われても、パッケージ化の前にバルクのワクチンに対して行われてもよい。
【００３８】
結合型糖類および非結合型糖類を別個に評価するために、これらは分離されなければならない。水性組成物中の遊離（すなわち、非結合型）の糖類は、種々の手段で結合型糖類から分離され得る。結合体化の反応は、上記糖類についての虫食い状（ｃａｒｉｏｕｓ）の化学的パラメーターおよび物理的パラメーターを変化させ、そしてこの違いは、分離のために活用され得る。例えば、この結合型物質がキャリアタンパク質に起因して、より高い質量を有する場合、サイズ分離が、遊離糖類および結合型糖類を分離するために使用され得る。限外濾過は、好ましいサイズ分離法であり、そして遊離糖類は、適切なカットオフ（例えば、ＣＲＭ１９７キャリアに対して３０ｋＤａ）を有する限外濾過膜を通過し得る一方で、結合体は保持される。代替的方法は、結合体を保持するが、遊離糖類を溶出物として通過させる、カラムまたは膜を使用する固相抽出（ＳＰＥ）を用いることである。ＳＰＥは、より迅速であり、そしてより一貫した傾向にあるが、サイズ分離は、より普遍的に適用可能である。さらなる代替的方法として、結合体がアジュバントに吸着された場合、遠心分離は、加水分解後に脱着する遊離糖類（上清）から、吸着された結合体（ペレット）を分離する。
【００３９】
したがって遊離糖類は、全糖類から分離され得、そして別個に分析され得、それによって組成物中の非結合型物質の量の決定を可能にする。この遊離の量を全量と比較することは、特にこの結合型物質が分離の間に支持体上に保持される場合、分離後の２つのプールを別個に分析することより容易である。
【００４０】
（さらなる莢膜糖類成分）
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ由来ならびに血清群Ｗ１３５由来および／または血清群Ｙ由来の莢膜糖類を含有する組成物の分析を可能にする。本発明はまた、さらなる莢膜糖類（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ由来の莢膜糖類、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ由来の莢膜糖類など）を含有する組成物の分析のために使用され得る。
【００４１】
血清群Ａの髄膜炎菌の莢膜糖類は、Ｃ３位およびＣ４位に部分的Ｏ−アセチル化を伴う、（α１→６）結合型のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーである（図１７）。これらのアセチル基は、加水分解を防ぐために封鎖基で置換され得［１７］、そしてこのような改変糖類は、本発明の意味において、不活性（ｓｔｉｌｌ）な血清群Ａの糖類である。血清群Ａの莢膜糖類の解重合条件は、公知である（例えば、他の血清群について上記されるようなＴＦＡによる１００℃での加水分解）［２１］。代替的方法は、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｈ＋の後に、１００℃で１時間加熱する工程を包含する［６８］。遊離したマンノサミンホスフェートモノマーは、例えば、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸と並行して分析され得る［２１］。
【００４２】
Ｈｉｂの莢膜糖類は、リボースとリビトールとホスフェートとのポリマーである。この糖類は、「ＰＲＰ」（ポリ−３−β−Ｄ−リボース−（１，１）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート）として公知であり、そして図１８に示される。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析または３１Ｐ−ＮＭＲ分析のためにＰＲＰを単糖類まで解重合するための方法は、公知である（例えば、室温で一晩のＮａＯＨとのインキュベーションによる）［２０］。遊離したリボースおよびリビトールは、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸と並行して分析され得る。
【００４３】
血清群Ｃの莢膜ポリ糖類は、α２→９結合型のシアル酸（コロミン酸としても知られる）のホモポリマーである。本発明によって分析される組成物は、シアル酸の他のいずれのホモポリマー（例えば、血清群Ｂの髄膜炎菌の莢膜糖類（α２→８結合型のシアル酸）、またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２の莢膜糖類（α２→８結合およびα２→９結合を有する））も含有しないことが好ましい。より一般的に、分析されるべき組成物が、グルコース、ガラクトースまたはシアル酸であるモノマーを含む莢膜糖類を含有する場合、この莢膜糖類はまた、混合性の分析を容易にするために、その糖類に固有（その混合物内で）である、さらなるモノマーまたは複数のモノマーを含むことが好ましい。モノマーが糖類の間で共有される場合でさえ、固有のモノマーの存在は、異なる糖類を、髄膜炎菌の血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙを解析するために記載されたものと同じ原理を使用して、並行して分析することを可能にする。
【００４４】
（非莢膜糖類成分）
本発明が、分析下における組成物に由来する混合物の単糖類の分析に依存する場合、この組成物は、（莢膜糖類の加水分解に由来する任意のバックグラウンドの単糖類以外の）遊離形態の単糖類を含有しないことが好ましい。例えば、分析されるべき組成物中に遊離シアル酸を含有することは、血清群Ｃの含有量の過大評価を生じ得る。同じ原理は、二糖類などが含まれ、次いで加水分解される場合に適用する（例えば、血清群Ｙの過大評価を与え得るスクロース（グルコース＋フルクトース）の存在またはマルトースもしくはトレハロース（両方ともジ−グルコース）の存在、および血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの過大評価（ならびに血清群Ｃの過小評価）を与え得るラクトース（グルコース＋ガラクトース）の存在）。
【００４５】
しかし、このような糖類は、多くの場合、ワクチン処方物中で使用され（例えば、安定剤として［６９、７０］）、そしてこれらの干渉の問題が最小化されるかまたは回避され得る２つの一般的手段が存在する。第１に、これらの成分の最初のレベルが、測定され、次いで解重合された混合物において測定されたレベルから差し引かれ得る。第２に、これらの成分が、例えば、濾過または透析によって分析前に上記組成物から除去され得る。限外濾過膜が使用されて、低分子量成分が除去され得る（例えば、スクロース（ＭＷ：３６０）を除去する１Ｋ膜）。
【００４６】
分析される莢膜糖類中にも見出されない単糖類の存在は、通常は干渉の問題を生じない。例えば、糖アルコールは、凍結乾燥安定剤としてワクチンに含まれ得る［７１］が、ＨＰＡＥＣ−ＡＥＤは、単一の単糖類と対応するポリオールの単糖類との間（例えば、マンノース単糖類（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓの莢膜中に見出されるような［７２］）とマンニトール単糖類（安定剤）との間、およびリボースとリビトールとの間［７３］）を区別し得る。
【００４７】
（非糖類成分の分析）
組成物中の糖類の含有量を分析する工程と同様に、上記プロセスは、他の成分または特性（例えば、重量モル濃度、ｐＨ、個々の糖類または結合体についての重合度、タンパク質含有量（特にキャリアタンパク質について）、アルミニウム含有量、洗浄剤含有量、保存剤含有量など）の分析を包含し得る。
【００４８】
本発明は、ワクチン組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、ｐＨを測定し、次いでこの組成物のｐＨを所望の値（例えば、６と８との間、または約７）に調整する工程を含む、本発明にしたがって組成物を分析する工程を包含する。
【００４９】
本発明は、ワクチンをパッケージ化するための方法であって、以下の工程を包含する方法を提供する：（ａ）血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方または両方を含むバルクのワクチンを製造する工程；（ｂ）このバルクのワクチン中の結合型糖類および／または非結合型糖類の量を莢膜糖類の各々について分析する工程；（ｃ）必要に応じて、ｐＨおよび／または他の特性についてこのバルクのワクチンを分析する工程；そして工程（ｂ）および工程（ｃ）から得た結果が、このバルクのワクチンが臨床上の使用について受容可能であることを示す場合に、（ｄ）このバルクからヒトに対する使用のためのワクチンを調製し、そしてパッケージ化する工程。工程（ｃ）は、糖類の最小濃度の評価、非結合型糖類：結合型糖類の比の評価などを包含する（上記を参照のこと）。工程（ｄ）は、単位用量形態または複数用量形態（例えば、バイアルまたはシリンジ）にパッケージ化する工程を包含し得る。注射についての代表的なヒトの用量は、０．５ｍｌの容量を有する。
【００５０】
工程（ｃ）および／または工程（ｄ）は、上記バルクのワクチンと１種以上のさらなる抗原とを混合することによって進められ得、これらの抗原としては、以下が挙げられる：−血清群ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類抗原；
−血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質抗原；
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの微小胞［７４］、「ネイティブＯＭＶ」［７５］、ブレブまたは外膜小胞［例えば、参考文献７６〜８１など］；
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ由来の糖類抗原；
−多価結合型糖類抗原のようなＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、参考文献８２〜８４］；
−不活化ウイルスのようなＡ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、８５、８６］；
−表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、８６、８７］；
−必要に応じてペルタクチンならびに／または凝集原２および凝集原３［例えば、参考文献８８および８９］とも組み合わせられる、百日咳完全毒素（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）のようなＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（細胞性百日咳抗原が使用され得る）；
−ジフテリアトキソイドのようなジフテリア抗原［例えば、参考文献１の第１３章］（例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、９０］）；
−破傷風トキソイドのような破傷風抗原［例えば、参考文献１の第２７章］；
−ＩＰＶのようなポリオ抗原［例えば、９１，９２］。
このような抗原が、アルミニウム塩アジュバント（例えば、水酸化物またはリン酸塩）に吸着され得る。好ましくは、任意のさらなる糖類が、結合体として挙げられる。
【００５１】
（バッチ間の一貫性）
ヒト用ワクチンの製造に関して、結合型糖類は、結合体化の前（例えば、糖類とキャリアタンパク質）、結合体化の後、処方の後および混合の後に品質管理に供されるべきである。干渉が、シアル酸の複数の供給源を有することによって引き起こされるので、単糖類の分析に基づく先行技術の方法が使用されて、髄膜炎菌の血清群Ｃ由来、血清群Ｗ１３５由来および血清群Ｙ由来の莢膜糖類を、これらが混合された後に区別し得ない。しかし、本発明によって、単糖類の分析が使用されて、混合した結合体が分析され得る。さらに、本発明のプロセスは、信頼性および一貫性があり、したがってこれが先行技術の方法では不可能であった、混合した結合体に関する異なるバッチの妥当な比較を可能にする。したがって、混合した結合体ワクチンの異なるバッチが、調製され、アッセイされ、次いでほとんど一貫したバッチが、販売および使用のために選択され得る一方で、異常なバッチは、拒絶され得る。
【００５２】
本発明は、少なくとも２種の異なる髄膜炎菌の血清群由来の莢膜糖類の混合物内の、個々の血清群由来の糖類を定量化するためのプロセスであって、ここで：（ａ）この異なる血清群が、血清群Ｃ、ならびに：（ｉ）血清群Ｗ１３５および／または（ｉｉ）血清群Ｙの一方または両方を含み；（ｂ）このプロセスが、この混合物内の莢膜糖類を解重合して、解重合した混合物を提供する工程を包含し；そして（ｃ）この異なる血清群が、この解重合した混合物の単糖類の組成を比較することによって定量化されるプロセスを提供する。
【００５３】
本発明はまた、ワクチンのｎ個のバッチであって、ここで：（ａ）ワクチンのｎ個のバッチの各々が、血清群ＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体、ならびに（ｉ）血清群Ｗ１３５のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体；および／または（ｉｉ）血清群ＹのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の莢膜糖類の結合体の一方もしくは両方を含み；（ｂ）第１のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ１であり；（ｃ）第２のバッチ中の血清群Ｃの結合型糖類の濃度が、Ｃ２であり；適用可能な場合、（ｄ）第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ１であり；適用可能な場合、（ｅ）第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の結合型糖類の濃度が、Ｗ２であり；適用可能な場合、（ｆ）第１のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ１であり；適用可能な場合、（ｇ）第２のバッチ中の血清群Ｙの結合型糖類の濃度が、Ｙ２であり；（ｈ）Ｃ１／Ｃ２、Ｗ１／Ｗ２およびＹ１／Ｙ２の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間であり、そして好ましくはそれぞれ０．９５と１．０５との間であり；そして（ｉ）このｎの値は、２（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上）以上であるバッチを提供する。
【００５４】
（ｈ）において特定される比は、比較される各バッチからの単一のサンプルに基づき得るが、代表的には各バッチの複数のサンプルから得た平均の値（例えば、平均値）に基づき得る。したがって、ｎ個のバッチの各々は、複数のサンプリングに供され得、そして各サンプルは、次いで各バッチについて計算される平均値および必要な比を計算するために使用される平均値による、Ｃ１、Ｃ２、Ｗ１、Ｗ２、Ｙ１およびＹ２の複数の測定値に従い得る。
【００５５】
ワクチンの各バッチ（またはロット）は、別個に調製された。例えば、２つの異なるバッチは、同じバルクの単一結合体を別々に混合（ｓｅｐａｒａｔｅ ｍｉｘｉｎｇ）するか、または別個に調製されたバルクの単一結合体を混合することによって作製され得る。同じバルクの混合物の異なるサンプルは、異なるバッチではなく、これらのサンプルは、異なる結合体の混合物を調製するときに生じる違いに起因するバッチ間の変動に従わない。
【００５６】
上記で特定されるような特徴（ａ）〜（ｉ）に加えて、上記ｎ個のバッチは、以下によってさらに特徴付けられ得る：（ｊ）上記第１のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ３であり；（ｋ）上記第２のバッチ中の血清群Ｃの非結合型糖類の濃度が、Ｃ４であり；適用可能な場合、（ｌ）この第１のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ３であり；適用可能な場合、（ｍ）この第２のバッチ中の血清群Ｗ１３５の非結合型糖類の濃度が、Ｗ４であり；適用可能な場合、（ｎ）この第１のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ３であり；適用可能な場合、（ｏ）この第２のバッチ中の血清群Ｙの非結合型糖類の濃度が、Ｙ４であり；（ｐ）Ｃ３／Ｃ４、Ｗ３／Ｗ４およびＹ３／Ｙ４の比が、それぞれ０．９０と１．１０との間であり、そして好ましくはそれぞれ０．９５と１．０５との間である。このバッチはまた、以下によって特徴付けられ得る：（ｑ）Ｃ３／Ｃ１、Ｃ４／Ｃ２、Ｗ３／Ｗ１、Ｗ４／Ｗ２、Ｙ３／Ｙ１およびＹ４／Ｙ２の比が、それぞれ０．２０未満（例えば、０．１５未満、０．１０未満、０．０５未満、０．０２未満、０）である。
【００５７】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなっても、さらに何かを含んでも（例えば、Ｘ＋Ｙ）よい。
【００５８】
言葉「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙから「実質的に遊離（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）する」組成物は、Ｙからから完全に遊離であり得る。必要な場合、言葉「実質的に」は、本発明の定義から除かれ得る。
【００５９】
数値ｘとの関係において用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００６０】
糖の環が開いた形態および閉じた形態で存在し得、閉じた形態が本明細書中の構造式において示される一方で、開いた形態はまた、本発明に包含されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、マンニトール安定剤を使用して凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図２】図２は、マンニトール安定剤を使用して凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図３】図３は、スクロースが安定剤として使用された場合の、凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図４】図４は、スクロースが安定剤として使用された場合の、凍結乾燥された髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図５】図５は、凍結乾燥されなかった血清群Ｙの結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図６】図６は、凍結乾燥されなかった血清群Ｙの結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図７】図７は、凍結乾燥されなかった血清群Ｗ１３５の結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図８】図８は、凍結乾燥されなかった血清群Ｗ１３５の結合体に対する、髄膜炎菌の血清群Ａの結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図９】図９は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１０】図１０は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１１】図１１は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１２】図１２は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから得た混合した結合体のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。
【図１３】図１３〜１５は、髄膜炎菌の血清群Ｃの莢膜糖類（１３）、血清群Ｗ１３５の莢膜糖類（１４）、および血清群Ｙの莢膜糖類（１５）についての構造式を示す。
【図１４】図１３〜１５は、髄膜炎菌の血清群Ｃの莢膜糖類（１３）、血清群Ｗ１３５の莢膜糖類（１４）、および血清群Ｙの莢膜糖類（１５）についての構造式を示す。
【図１５】図１３〜１５は、髄膜炎菌の血清群Ｃの莢膜糖類（１３）、血清群Ｗ１３５の莢膜糖類（１４）、および血清群Ｙの莢膜糖類（１５）についての構造式を示す。
【図１６】図１６は、血清群Ｗ１３５と血清群Ｙとの間の違いを示す。
【図１７】図１７は、血清群Ａの髄膜炎菌由来の莢膜糖類の構造式を示す。
【図１８】図１８は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ由来の莢膜糖類の構造式を示す。
【図１９】図１９は、血清群Ｃの結合体（黒菱形）、血清群Ｗ１３５の結合体（黒四角）および血清群Ｙの結合体（黒三角）を合わせた、６つの時点に対する遊離糖類の変化（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（発明を実施するための形態）
（結合体生成およびクロマトグラフ法）
莢膜糖類抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙから調製され、そして参考文献７に記載されるように、ＣＲＭ１９７に結合体化された。
【００６３】
上記４種の結合体が組み合わされて、水性「ＭｅｎＡＣＷＹ」組成物が提供された。
【００６４】
分離作業において、血清群Ａの結合体は、スクロースまたはマンニトールのどちらかの存在下で凍結乾燥され、そして血清群Ｃの結合体と血清群Ｗ１３５の結合体と血清群Ｙの結合体との混合物（「ＭｅｎＣＷＹ」）が、調製された。
【００６５】
糖類含有量の分析は、製造業者の説明書に従ってＤｉｏｎｅｘＴＭ ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィーシステム上で行われた。この器具は、グラジエントポンプモジュール（ＧＰ４０またはＧＰ５０）およびアンペロメトリック電気化学検出器（ＥＤ４０またはＥＤ５０）およびオートサンプラー（ＡＳ３５００またはＡＳ５０）を有した。糖類は、金作用電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を伴う）の表面での糖類の酸化により生じた電流を測定することによって検出される。三重ポテンシャル波形は、以下の設定を使用して適用された：Ｅ１＝０．０５Ｖ；ｔｌ＝４００ｍｓ；Ｅ２＝０．７５Ｖ；ｔ２＝２００ｍｓ；Ｅ３＝−０．１５Ｖ；ｔ３＝４００ｍｓ。統合は、Ｅ１の適用の間の２００ｍｓ〜４００ｍｓで起きた。このクロマトグラフィーのデータは、ＰｅａｋＮｅｔ ６．４データ整理ソフトウェアを使用して積分され、そして処理された。
【００６６】
（血清群Ａ）
血清群Ａの糖類のマンニトール−凍結乾燥処方物は、４℃にて３ヶ月間保存された後にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって試験された。結合体含有組成物は、Ｃ４固相抽出（ＳＰＥ）カラムを使用して遊離糖類から分離された。この遊離糖類を含む溶液は、ＴＦＡを使用する１００℃にて２時間の酸加水分解に供された。次いで、この混合物は、マンノサミン−６−ホスフェートの検出のために、ＰＡ１保護、勾配溶離およびＰＡＤ検出を使用するＤｉｏｎｅｘＴＭ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムに適用された。結果は、図１に示される。
【００６７】
遊離糖類のＳＰＥ分離を伴わずに、同じ分析が行われた。この分析の結果は、図２に示される。図１と図２との比較（図１の分析に１：２の希釈を使用し、そして図２の分析に１：５の希釈を使用したことに注意する）は、マンノサミン−６−ホスフェートのピークが、図１において非常に低いことを示し、この組成物中の遊離糖類の低いレベルを示す。定量分析は、１バイアルあたり３．７％の遊離糖類を含む１０．７μｇの全糖類を示す。
【００６８】
スクロース−凍結乾燥物質は、１バイアルあたり６００μｌの水で再構成され、次いで１回の分析あたり２〜３ｍｌ提供されるようにサンプルがプールされた後に、同じ方法で分析された。しかし、ＳＰＥ Ｃ４の前に、この組成物は、１Ｋ膜を使用する限外濾過に供された（２ｍｌの水で洗浄し、２ｍｌのサンプル溶液をロードし、その度ごとに２ｍｌの水で３サイクル洗浄し、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を回収し、そして１ｍｌまで容量を調整し、ＳＰＥにロードするために１：１に希釈して０．９％の最終ＮａＣｌ濃度を与える）。図３は、この組成物中にごくわずかな遊離糖類が存在するが、結合型物質に対応する大きなピークが存在することを示す（図４）。
【００６９】
（血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ）
他の結合体と組み合わせる前に、バルクの血清群Ｙの結合体は、分析された。この結合体は、３０ｋＤａの限外濾過膜を使用して遊離糖類から分離された。分析されるべき物質は、ＴＦＡによって１００℃にて加水分解され、次いで製造業者の説明書に従って、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム、ＡｍｉｎｏＴｒａｐ、定組成溶離および再生工程、ならびにＰＡＤ検出を使用するＤｉｏｎｅｘＴＭ装置上で、グルコースについて定量分析された。ＣＲＭ１９７キャリアは、このカラムへの上記加水分解物の適用前に除去されることを必要としなかった。非結合型物質は、検出可能であった（図５）が、全グルコースより豊富ではなかった（図６）。異なる希釈に注目すると、これらの図の分析から、１．８％の遊離糖類画分が提供される。
【００７０】
バルクの血清群Ｗ１３５物質は、同じ方法で処理され、そして分析されたが、この方法は、グルコースの検出よりもむしろガラクトースの検出を伴った（図７および図８）。異なる希釈に注目すると、これらの図の分析から、６％の遊離糖類画分が提供される。
【００７１】
（混合した結合体）
血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙついての結合体は、参考文献７に記載されるように、リン酸アルミニウムアジュバントと組み合わされた。４℃にて２週間保存されたＭｅｎＣＷＹ結合体の組み合わせが使用されて、凍結乾燥したＭｅｎＡ結合体が再構成され、そして４８時間後に、結合体からこのアジュバントを分離するための遠心分離を伴って分析された。この混合した結合体は、３０ｋＤａの膜を使用する２サイクルの限外濾過によって遊離糖類から分離された。第２のサイクルは、ときとして第１のサイクルの透過物中に通り抜けることが見出される複合糖質による汚染を減少させた。糖類は、限外濾過の前および後における、ＴＦＡを使用する９０℃／１００℃での酸加水分解により、次いで２つを別個に、ＤｉｏｎｅｘＴＭ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムを使用してＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析することによって分析された。
【００７２】
血清群Ｃの分析のために、カラムは、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１保護を有し、そして勾配溶離工程を使用した。このカラムは、この方法のより迅速な様式として、グルコースとガラクトースとが分解されない様式において実行された。結果は、図９および図１０に示される。血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに関して、このカラムは、ＡｍｉｎｏＴｒａｐを有し、そしてグルコースおよびガラクトースを分解する定組成溶離および再生を使用した。結果は、図１１および図１２に示される。
【００７３】
それぞれの異なる糖類の量を計算するために、図９／１０の分析におけるシアル酸の量は、グルコースおよびガラクトースの合わせた量を差し引くことによって干渉について補正される。この値は、ＭｅｎＣの濃度を与える。その後、図１１／１２の分析におけるガラクトースおよびグルコースの量は、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙを定量化するために使用される。不完全な加水分解に起因して、図１１／１２から得たグルコースおよびガラクトースの合わせた量は、上記されるように、図９／１０から取得された量と一致し得ないが、このような矛盾は、全体の分析に影響を与えない。量は、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸の公知の量を含む基準と比較することによって計算された。
【００７４】
結合体中の全ＭｅｎＣ糖類および遊離ＭｅｎＣ糖類の代表的な２つ組（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の分析は、これらの結果を与えた：
【００７５】
【表１】
したがって、血清群Ｃの糖類を定量化するための固有な糖類の欠如にかかわらず、本発明は、この物質が血清群Ｗ１３５の糖類および血清群Ｙの糖類のバックグラウンドにおいて定量的にアッセイされることを可能にする。
【００７６】
図９および図１１の類似する分析は、ＭｅｎＡＣＷＹ組成物中のそれぞれの遊離糖類の量を示し、そして遊離糖類をこの組成物中の全糖類の％として示すことを可能にする。この分析は、１用量あたり１０μｇ（すなわち２０μｇ／ｍｌ）の各糖類を含むように処方されたＭｅｎＣＷＹの組み合わせ対して、１年間にわたる種々の時点において行われた。結果は、以下：
【００７７】
【表２】
の通りであった。
６つの時点における遊離糖類の％の変動は、図１９に示される。
【００７８】
第２の系列の実験において、ワクチンは、これまでの実験に対して半分（１用量あたり５μｇの各糖類）および４分の１の用量（２．５μｇ）で処方された。本発明のプロセスは、この組み合わせの中から異なる糖類を解析するために使用され、そして結果は、以下：
【００７９】
【表３】
の通りであった。
【００８０】
本発明が例の手段によってのみ記載され、そして改変が、本発明の範囲および精神内にありつつなされ得ることが理解される。
【００８１】
【化４】
【００８２】
【化５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１１−１３２２６（Ｐ２０１１−１３２２６Ａ）
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８３５１５（Ｐ２０１０−１８３５１５）
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【分割の表示】特願２００７−５０３４４６（Ｐ２００７−５０３４４６）の分割
【原出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【分割の表示】特願２００７−５０３４４６（Ｐ２００７−５０３４４６）の分割
【原出願日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
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