平坦な表面の効率的な薄膜液体処理のための方法および装置
本発明は、洗浄を工程の間に挟むことなく、生体試料の薄膜液体処理をするための方法および装置に関し、この装置は、向かい合った表面を有し、それらの間で空間を規定する第一（９６）および第二（８６）の基材を包含し、該空間内で生体試料を液体試薬（９４）で処理でき、該第一の基材はスライド試料（９６）のような相対的に液体非透過性の要素からなり、該第二の基材は膜シート（８６）のような相対的に可撓性の気体透過性要素からなる、生体試料を液体試薬で処理するための処理帯域を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、表面の液体処理において有用な方法および装置に関するものである。それは、処理用液体を指定された処理帯域に固有の薄膜の形に拡げることにより液体消費を極小化するのに有用である。本発明は、平坦な基材の液体処理、より詳しくはスライドガラス上の生体組織試料の染色に関連して特に有用であり、他の有用性も考えられるが、以下、かかる有用性との関連から本発明を記述する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織試料の分析は、病理医が多くの疾患を診断するのに、また医学研究者が細胞構造についての情報を得るために、使用する貴重な診断手段である。
【０００３】
生体組織試料から情報を得るためには、分析用の試料を調製するためのいくつかの予備操作を行なう必要がある。試験のための組織試料を調製する操作法には多くの変法があるが、これらの変法は、そのプロセスを個々の組織に適合させるための改良であると考えることもでき、あるいは、組織試料内の特定の化学物質または酵素を同定・確認するのにある特定の手法がより適しているからでもある。しかし、基本的な調製手法は、本質的には同じである。生体組織試料は、組織生検などからの固体組織から導くことも、塗抹標本（たとえばＰＡＰ塗抹標本）などからの細胞懸濁液という液体を主成分とするサンプルから導くこともある。
【０００４】
概して、そのような操作は、固定、脱水、浸潤および包埋による組織の処理；該組織のスライドガラス上への搭載、次いでの試料の染色；種々の構成成分の検出を通じての組織の標識；組織切片の、たとえば電子顕微鏡による碁盤目分析または培養皿中での試料細胞の培養を包含することになろう。
【０００５】
実施すべき分析または試験に応じて、試料は、それが含む情報の分析の用意ができるまでに、多くの予備の段階または処理あるいは操作を受けなければならないかもしれない。概して、それらの操作は複雑で、時間を要するものであり、高価で毒性のある材料を使用することの多いいくつかのきちんと順序だった工程を包含する。
【０００６】
たとえば、ある典型的な組織試料は、種々の細胞の相互の関係を調べ、あるいは異常を発見すべく、光学顕微鏡検査を受けるであろう。それに伴って、その組織試料は、光が透過できるよう、きわめて薄い組織片でなければならない。組織試料または薄片（しばしば切片と呼ばれる）の平均厚みは、２〜１０マイクロメートル程度（１マイクロメートル＝１ｍｍの１／１０００）である。概して、組織試料は、凍結するか、または、細胞構造を維持するだけでなく、組織の腐敗または自己融解をきたす可能性のあるさらなる酵素の作用をも停止させる物質（固定液）中で固定する。
【０００７】
固定後、組織試料は次に、濃度を増しながらのアルコールの使用により試料から水を除去することによって脱水する。次に、蝋と混合する化学薬品、あるいは、組織試料に浸透でき、崩壊または分裂なしに薄い切片を調製するのに適したコンシステンシーをこれに与えることのできる他の可塑性物質含浸剤でアルコールを置換する。
【０００８】
次に、ミクロトームを用いて、組織試料から薄い切片を切り出す。それらの切片は、厚さが５〜６マイクロメートル程度で、直径は５０００〜２００００ミクロン程度の長さであってよい。切り出した薄い切片は、水に浮かべて切片を拡げ、あるいは平らにする。次に、この切片を、普通寸法が約８×２．５ｃｍ（１×３インチ）のスライドガラスに載せる。
【０００９】
次に、試料を溶媒に曝露して、蝋または他の含浸剤を除去し、その溶媒をアルコールにより除去し、最終的にもう一度水が組織に浸透するまで、アルコール濃度を低下させることによってアルコールを除去する。試料への水の浸透により、水溶性染料による細胞構成要素の染色が可能になる。
【００１０】
組織試料調製のための自動操作を展開するに先立って、組織を顕微鏡下で調べることができるまでに、２から１０日間を要することがしばしばであった。より近年では、所定の間隔で試料を一つの液体から他の液体へ移動させる装置を利用する自動化されたプロセスが開発されており、その結果、調製時間が１２〜３６時間まで有意に減じている。
【００１１】
上記先行技術の考察は、主として、バーンスタインらに付与された特許文献１に由来するものであるが、この明細書は、ｘ座標およびｙ座標に沿って配置された複数の処理ステーションに沿って異なる組織試料を移動させるロボットアームを同時に包含し、それらのステーションで組織試料が種々の処理過程に付されるようになっている、複数の個別分析操作を実施するための自動化されたシステムを記述している。試料支持回転コンベヤと共同して、前もって選択された一連の試薬を試料の各々に供給する試薬回転コンベヤを包含し、それと共同する混合、インキュベーションおよびすすぎの各工程が挿入された自動化スライド処理システムを記述しているコウプランドらの特許文献２も参照されたい。特許文献３および特許文献４等に従って作成された装置は、アリゾナ州トゥーソンのヴェンタナ・メディカル・システムズ社から市販されており、実質的な商業的成功を収めており、生体試料検査の時間および費用を有意に減少させている。
【００１２】
生体組織試料は、最後に、スライドガラスに搭載されたままの状態で、病理学者が観察する。それゆえ、生体試料の処理の多くは、１インチｘ３インチのスライドガラスフォーマットの上の実質的に二次元の処理帯域への多種の液体の順次の適用および除去に適応させられる。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５６７５７１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５５９５７０７号明細書
【特許文献３】米国特許第５６７５７１５号明細書
【特許文献４】米国特許第５５９５７０１号明細書
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、所望の生物学的反応を実施するために必要な液体の体積量の減少を可能ならしめることによって、上記およびその他の先行技術に比しての改善をもたらすものである。反応物の液体体積の減少は、試薬費用の節約となり、また、必要な洗浄液の量の減少にもつながり、このことは、処理する必要のある廃液量の減少を意味する。液量の減少は、さらに、液体管理の複雑さを軽減させることとなり、そのことが、結局は、処理のより高い信頼性を可能にする。それは、廃液処理の軽減を可能にし、あるいは無視することをも可能にする。
【００１５】
本発明は、さらに、生体試料を処理するための処理時間を短縮することによって、改善をもたらす。液体所要量の減少は、迅速な処理およびそれらの順次実施を可能にし、これにより、時間を中心としてのより大きい処理量および／または試料回転が可能になる。さらに、本発明は、一つ以上の処理が驚くべきことに洗浄それ自体を必要としないことを規定し、さらに所要液量および処理時間の減少を可能ならしめる。
【００１６】
本発明は、ミクロの液量を扱うためのシステム、すなわち方法および装置を提供する。本発明は、一側面では、スライドと疎水性要素などの対向要素との間に形成された染色室または反応室を設けることにより、染色または生物学的反応を実施するための所要液量および処理時間を極小化するための方法および装置を提供する。より詳しくは、本発明は、閉じ込められた気泡の制御された受動的逃げ道を設け、同時に有意の蒸発損失を避けながら、スライド表面に少量の液体を展着する方法および装置を提供する。
【００１７】
本発明の好ましい一具体化態様では、スライドを、前記対向要素に向けてある角度をなして運び、気泡の閉じ込めが行なわれないようにする。
【００１８】
本発明は、向かい合った表面を有し、それらの間で空間を規定する第一および第二の基材を包含し、該空間内で生体試料を液体試薬で処理でき、該第一の基材が相対的に液体非透過性の要素からなり、該第二の基材は相対的に可撓性の気体透過性要素からなる、生体試料を液体試薬で処理するための処理帯域を有する装置に向けられる。
【００１９】
本発明は、また、向かい合った表面の間に規定された空間内に試料および液体試薬を供給する工程と、それらの表面を押し合わせて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に閉じ込められた気体を排出する工程からなる、生体試料を液体試薬で処理する方法に向けられる。
【００２０】
本発明は、さらに、向かい合った表面を有し、それらの間で空間を規定する第一および第二の基材を包含し、該空間内で処理帯域内において生体試料を液体試薬で処理でき、該第一の基材が相対的に液体非透過性の要素からなり、該第二の基材は気体透過性要素からなり、さらに、該第一および第二の基材を該処理帯域の下流で分離する機構を包含する、生体試料を液体試薬で処理するための装置に向けられる。
【００２１】
本発明は、また、生体試料処理のための前記装置を準備し、前記の向かい合った表面の間で規定された空間に液体試薬中の該試料を供給し、両基材を押し合わせて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に閉じ込められた気体を排出し、該両基材を分離する諸工程を包含する、生体試料を液体試薬で処理する方法に向けられる。
【００２２】
本発明のさらなるその他の特徴は、添付の図面を参照しての以下の詳細な説明から理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を詳細に考察するに先立ち、濡れおよび展着性という現象を見直すことが本発明の適切な理解に有用であろう。
【００２４】
展着性とは、液体の表面上での関係をいう。ある液体が該表面に対して拡がる傾向をもつか否かを決定する下記の力のバランスが存在する：
ｉ） 液−液相互作用（張力）
ｉｉ） 液−表面相互作用
ｉｉｉ）液および表面との環境（通常は空気）の相互作用
【００２５】
図１を参照しながら、水平面２２上に静止している液滴２０を考える。他の力がなければ、液滴は、その表面積を極小化しようとして、その表面張力によって引寄せられて球になろうとする。言い換えれば、液−液間力が優勢なときには、液体は、表面よりもより強くそれ自体と相互作用する。たとえば、水性（Ｈ２Ｏ）系に当てはめれば、Ｈ２Ｏ系液体中の水素結合が十分に強いので、多くの環境下で水性液体は、可能性として、液−表面よりも液−液相互作用をするであろう；たとえば、その液体が脱イオンＨ２Ｏであって、表面がその液体と比較的低い相互作用を示すとき、すなわちその表面が「疎水性」であるときである。その液体は表面上で「球状になる」傾向があり、容易に不安定化されうる。たとえば少し揺り動かして、表面から転がり落とすことができる。しかし、重力および液滴とその環境との間の表面張力が通常はこの表面張力に反して作用するので、液滴は他の形態をとる。親水性表面は、水性系液と表面との相互作用が顕著な場合である。液−表面相互作用力が強いときには、液体は表面に接触することを優先し、それによりその表面上に拡がる。
【００２６】
接触角は、この力のバランスを示す。９０°より大きい接触角は、液−表面相互作用力が比較的弱いことを示す；９０°より小さい接触角は、液−表面相互作用が相対的に強く、展着性の状態を示す。表面「湿潤性」は、液−表面相互作用が強く、液体が展着する傾向があることであると定義される。
【００２７】
展着可能な状態では、液体は展着しようとする。これは熱力学的な状態である。速度論的限定によって、それが展着しなかったり、展着が抑制されたり、時間的に影響されたりすることもある。対向接触面を使用すると、液体をきわめて速やかに展着させて、熱力学的状態を満足させることができる。その接触面は、液体に対して展着性であっても、なくてもよい。液体が２つの対向する表面の間にあれば、一方の面のみが液体と相互作用して、それを展着させればよい。すなわち、液体で湿潤されうる表面の場合、液滴２０は表面２２に沿って拡がる。液体と固体との間に形成される角θは、二面角または接触角と呼ばれる。完全な湿潤の場合、θは０°である。しかし、展着の過程では、気孔が偶然に混入し、生じた液体層の中に閉じ込められる可能性がある。本発明は、一部では、混入し、閉じ込められた気孔を消散させるための解決法を提供する。
【００２８】
図２ａ〜２ｃおよび図３は、液−表面が湿潤性および非湿潤性の場合のスライドと基材を先行技術に従って合わせたときに何が起るかを示している。特に図２ａ〜２ｃを参照すると、表面２２ａと２２ｂがぴったり合わせられたとき、まず、液滴２０が合わさって、より大きい液体２４を形成する。液が表面２２ａと２２ｂとの間の面間間隙中を拡がり、液体が薄い液膜の形状をとるとき、１個以上の気孔２６が閉じ込められる可能性がある。液の体積が十分であれば、直接２つの対向面の間にある実質的にすべての空間が液で満たされ、上記の形状をとるであろう。その形状の若干の部分は他の部分よりも先に充満し、他の進行してくる液部分と接触する。このようにして、より遅い部分は湿潤のチャンスをもつことができないかもしれない。それらが先行する部分によって取り囲まれ、かくして付随する気孔により「ベーパーロック」を受けるからである。これの代わりに、展着後に、局所の圧力および／または温度の変化により、溶解していた気体が飽和溶液から出てくるために、気孔が生じることもある。
【００２９】
処理液は、特に少量のとき、なんとかして全処理領域に確実に付与し、空間的にそこに保持する必要がある。たとえば、１インチ×３インチの顕微鏡スライド上に置かれた生体試料を染色するためには、液をまず載せ、次に長方形の平坦面から除去する必要がある。上で説明したように、少量の液は、液と雰囲気との間に熱力学的に生じる表面張力を極小化すべく、小液滴形成状態に留まろうとする傾向がある。その結果、表面にわたっての液の展着性は、特に液量が極小のときには、現実の難題となりうる。たとえば、液は、連続的な薄膜よりもむしろ小液滴として表面上に位置しているかもしれない。表面に大量の液を充満させることが、この問題を解決する一方法である；しかし、大量充満には大量の液の使用が必要で、これは経済的ではなく、また大型の貯槽、排水システムおよび複雑な配管の運用・管理も必要である。スライドの長方形をすみずみまで満たすには、さらなる量が必要でもある。これらの流体工学的難題を解決する一つの単純なアプローチは、基材全体または基材の処理区画を液体中に単に浸漬することである。以前の処理方法ならびに若干の慣用的な手による操作法は、この「バケツ化学」アプローチを利用してきている。しかし、現在の技術水準は、「スライド上の液体」というアプローチを、特に液体処理の自動化の点で、きわめて効果的に利用するのに成功している。このアプローチでは、多量使用アプローチを用いる（たとえばデンマーク国コペンハーゲンのダコサイトメーション（株）から入手可能な装置におけるように）のでなければ、スライド上で液量をよりよく管理（極小化、制御）するために、いくつかの装填手段が採用される。以前の先行技術の方法は、正確な体積制御に努めており、ときには体積極小化を念頭において（試薬コストゆえの混成プロセス）、種々の装填形態を採用してきている（たとえばＬＩＱＵＩＤ ＣＯＶＥＲＳＬＩＰＴＭ−アリゾナ州ツーソンのヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド；スライドチェンバーズ−マサチューセッツ州ケンブリッジのサイトロジックス社；チェンバーウォールズ−カリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジーズ社；チェンバーウォールズ−ニュージャージー州ピスカタウェイのアマーシャム・バイオサイエンシズ；ＴｅｃｈＭａｔｅＴＭキャピラリーガラススライド−カリフォルニア州サンタバーバラのバイオテク・ソリューションズ社）。通常は、なんらかの種類のシールを用い、固定された小室（チェンバー）の境界を介してスライド上の体積を制御している。「液密性」小室を設けることにより、さらに、液体の加圧が可能になり、場合によっては、壁を機械的に動かして、液体の小室への、または小室からの輸送および／または混合を行なうことも可能になる。
【００３０】
しかし、液を含有し、基材に対して液を明確に配置する必要性が、種々の技術的難題、問題を提起する。シール手段は、各要素の厳密で正確な結合を必要とするが、それらは通常はプロセスの妨げとなる。シールを介在させた２つの対向要素は、通常、不可欠な面の正確な配列と適切な維持への配慮（たとえば清潔さ）を必要とする。シールには、欠陥や破損が付き物である。たとえば、２表面の間に捕捉されたＯ−リング（またはガスケット）を介在させたシールは、Ｏ−リング中の欠陥、Ｏ−リングのねじれ、または不可欠な対合面のいずれかの表面の汚染粒子によって損なわれる可能性がある。他の例では、接着剤を用いたシールは、接着剤の欠陥、接着剤中の空隙、あるいは汚染粒子によって損なわれうる。また、シーリングは、基材自体へ直接に行なわれるのが普通である。種々の顧客による異なるプロセスで到来する基材のシーリングの質は、確固としたシール依存プロセスを管理するのが困難な重大な変数である。本発明は、上記およびその他の技術的問題に取り組むものであり、その一方で、シール手段に頼らずに液体薄膜中の取り込まれた気泡という重要な問題をも解決し、また有意な蒸発損失をも回避するものである。本発明では、小室の「側面」は物理的に結合されず、対向基材の表面は固定されていてもよく、あるいは互いに対して移動できるようになっていてもよい。
【００３１】
本発明は、スライド上の生体試料の染色または生体反応を有利に実施するのに用いられる。図４ａ〜４ｃ、５、６ａおよび６ｂを参照すれば、操作原理は次の通りである。水性系液滴３０を、２表面３４、３６の間に置かれた薄層３２として拡げることができる。両面が親水性であれば、表面相互作用が、液の展着に寄与するであろう。しかし、気泡３８（図３参照）が、液の展着の間に、または展着後に、溶液由来の溶解気体のために、２面間に空隙を形成するかもしれない。両面が気体非透過性（たとえばガラス）であれば、閉じ込められたまたは形成性の気孔が実質的にその場に固定されて、液層の連続性を破壊する（あるいは「ベーパーロック」の状態と記述される）。その気泡が及ぼす蒸気圧によって液の張力がその気泡を崩壊させるのを妨げられる。言い換えると、気体の行き場所がない。さらに、細い毛管形態中で粘性力が優勢となり、気泡３８の取り除きがきわめて困難となりうる。特に図４ｃおよび５を参照すれば、本発明に従って表面の一方として気体透過性材料４０を使用すれば、液の張力の影響下に気体が逃げ出すための通路４２が提供される。気体透過性材料４０の表面が液と強く相互作用すれば、液が吸収され、その透過性材料への接近を阻害し、図６ａに示したように、気泡が液で被覆された２つの表面の間に捕捉されたままとなるだろうゆえに、表面の性質は重要である。他方、表面が液体と十分に非相互作用的であれば、閉塞は起らず、図６ｂに示したように、液張力の駆動力（受動的）によって気泡が効果的に追い出される。この過程に好都合なのは、この面での液の低い展着性である；たとえば、表面の高い疎水性および水性系液の高い表面張力である。
【００３２】
かくして、本発明は、その一面では、薄い液膜の内部から気孔を「ゲップのように放出」させるための圧力軽減をもたらすために、側面の開いた反応小室の境界面を形成するための疎水性で、気体透過性の高い材料４０を準備することに基づいている。Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（登録商標）などのミクロ細孔性疎水性材料が、そのきわめて高い気体透過性のゆえに好ましい。液の吹き抜けを防止するためには、水入り込み圧（ＷＥＰ）の高い材料がさらに好ましい。高い水入り込み圧は、細孔寸法の小さい（０．０５〜２００ミクロン）材料を用いるか、図７に示したように、液透過性裏当て材５０に積層された多孔性の疎水性材料を使用することによって達成できる。液透過性裏当て材は、多孔性の疎水性材料が大きい細孔寸法（たとえば２００〜２０００ミクロン）をもっていても、液の吹き抜けを防止してくれる。材料４０は、効率的な液の展着のために平らで平滑な表面を呈していることが好ましい。いかなる表面くぼみも、液の局所的たまりを生ぜしめ、きわめて少量の適用の場合には展着効率に悪影響を及ぼすからである。細孔寸法のより小さい疎水性材料（約２００ミクロン未満）は、より平滑な表面をもたらす。さらに、材料中のいかなる有意の反り、ゆがみも、液被覆の欠如という結果をもたらしうる。材料４０は、寸法が安定しているが、操作できる程度に可撓性であり、すなわち、面上を滑らせることができ、またはたとえばローラーに巻きつけることができることも、好ましい。
【００３３】
現在好ましい材料４０は、水漏れ防止のためにパイプのねじ接続時に普通に用いられる「配管工用テープ」、すなわちテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））テープである。配管工用テープは、次の基準に適合するゆえに有用である：
１）それは疎水性であり、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）からなる；
２）それはミクロ細孔性である；Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）は伸展させると、０．０５〜５ミクロンの範囲のミクロ細孔性となる；
３）それは比較的高い水入り込み圧をもつ；それは非常に小さい細孔をもちながら比較的に稠密である；
４）それは可撓性で、順応性がある；それは裏当て要素または面の次元性（平坦さと平滑さ）を呈することができる；そして、
５）「静止摩擦」が高い；平滑で硬い表面に押し付ければ、それはそのような表面を把持する傾向がある。
【００３４】
表面透過性の高い材料を通しての蒸発は、高度なこともあるので、蒸発を制御するために、材料４０に実質的に非透過性材料５０を裏当てすることが好ましい。かくして、液相と雰囲気との間の蒸気圧（そしてベーパーロックの解除）が透過性材料４０を介して側面方向へ取り次がれ、物品のちょうど末端５２における露出された表面領域に限定される。疎水性ミクロ細孔性透過性材料５０として好ましいのは、ジョージア州アトランタのマックマスター・カー・サプライ社から入手可能な１．５インチ幅の軍隊用等級のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）製のねじ山テープＰ／Ｎ６８０２Ｋ６６（「配管工用テープ」）であり、これは実質的に非透過性の可撓性膜または被覆によって裏当てされていて、速やかな圧力平衡をもたらす。他の適当な多孔性の疎水性材料としては、シリコーン処理紙および多孔性ポリプロピレン膜がある。
【００３５】
図４ａ〜４ｃは、基材３４、液滴３０および試料スライドガラス３６を本発明に従って集合させる方法を一般的に示している。見られるように、試料スライドガラス３６と基材３４を互いにより近づけるとき、液滴３０が、対向表面の間で薄く、一様に拡がり始め、気泡は膜表面で有効裏に排除され、物品の末端を通して排出される。
【００３６】
顕微鏡用スライドガラスの寸法は、公称では１インチ×３インチである。ニューハンプシャー州ポーツマスのエリー・サイエンティフィック社が市販している通常のＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＴＭスライドは、スライドの末端に０．７５インチのラベル領域を含んでおり、約２．２５インチ×１インチの活用可能な領域を残している。いくつかのマイクロアレースライドはより広い活用可能領域を使用しており、従ってラベル領域はより小さいか、またはない。今回の場合には、活用可能領域は２インチ×１インチ、すなわち５．０×２．５ｃｍであると仮定する。従って、活用可能領域は、用途に応じて、上下いずれかに向けて調整できる。
【００３７】
５．０×２．５ｃｍの領域は１２．５ｃｍ２に相当する。これが、以下の実施例で染色処理および特性評価の体積範囲のために用いた実際の試験面積であった。全体よりも狭いスライドガラス面積を使用すると、ラベル末端を把持してのスライドの取扱いが可能になる。全体より小さい膜物品領域の使用により、該物品の取扱い／把持が可能になる。
【００３８】
適用する液量の範囲は、実用的な上限および下限を記述することによって規定できる。これは、スライド１枚当りとして規定できる；しかし、上に説明したように、活用可能領域は変化しうるから、１ｃｍ２当りで規定するのがより明瞭である。
【００３９】
液量の下端０．０００７ｍｌ／ｃｍ２では、液層厚みが７μｍで、所与の水性系液、スライドガラスおよび所与の接触膜について、全接触面にわたってほぼ完全に拡げることができるだけの薄さであった。展着は自然には起らず、若干の仕事を必要とした；すなわち、２つの表面は、展着を容易にするために若干の圧Ｐを必要とした。さらに、一方の表面を他方に対して移動または動揺させて、それらの面の間の隙間を通して液を「押し込む」のを助けることが有利であった。この下限では、液の粘性力が有意で、液の「流れ」が遅延させられる。かくして、下端の体積では、間隙を通して液を動かして、完全に濡れた接触面の熱力学平衡を達成するための追加の一工程が必要なことがあるかもしれない。さらに、下端の体積では、閉じ込められた気孔が容易に「吐き出される」ようには思われなかった。遅い吐き出しが、閉じ込められた気体と液との境界の移動／崩壊を遅らせる高い粘性力と関連していることはきわめてありうることである。
【００４０】
０．００２〜０．００５５ｍｌ／ｃｍ２の液量（２０〜５５ミクロン厚みの液層）が中間範囲であることが見いだされ、そこでは、深刻な粘性問題を招くことなく、液量を極小化できた。この範囲内では、展着も吐き出しも通常は自然に起り、体積が多いほど、より自然に起る。
【００４１】
０．００５５ｍｌ／ｃｍ２より多く、およそ０．０３６ｍｌ／ｃｍ２までの液量も有用でありうる（５５〜３６０ミクロン厚みの層）。吐き出しおよび展着は容易に進行する。しかし、体積が増すと、境界の液が接触領域から偶然的に搾り出され、主液体から切り取られる傾向が大きくなりうる。そのとき、小液滴は、スライドおよび／または膜のへりまたは外面で制御不可能に終わる可能性がある。かくして、体積増大につれて、不注意な液滴形成は、接触圧およびそれの制御により敏感なものとなる。不注意による液滴は、必ずしもそれ自体が問題であるわけではないが、取扱いに関して若干の注意を必要とする。
【００４２】
さらに、比較的大きい量は、一方の基材の他方の上での「浮遊」に通じる；粘性力はもはやあまり優勢ではないように思われる。一つの作用は、液層が「液体ベアリング」として作用するというものである；たとえば、装置がわずかに傾くと、上方の基材が容易に下方基材から滑り落ちる可能性がある。この性質は、処理後の２つの基材の分離に利用できる。処理中の制御不可能な分離を防止するには２つの基材を固定する必要もあるであろう。逆に、体積が少ないと、そこに働く高い粘性力のために２つの基材の分離が行なえずに、装置を著しく傾けることになりうる。
【００４３】
このように、最低量形態だけでなく、これらの３つの規定体積範囲のいずれもが有用でありうる。体積要求量は、特定の設計可能性を提供するいくつかの特徴点との取引対象となる。かくして、好ましい設計空間に応じて、現在使用されているよりも多い試薬量が好ましいこともありうる。
【００４４】
実際の範囲値は、使用する特定の液および表面に応じて変化しうる。先の例では、諸値は、脱イオン水とＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＴＭガラスおよびＴｅｆｌｏｎ（登録商標）配管工用テープ軍隊等級品を反映していた。実際の値はしかるべく変更できたが、低い、中等度および高い範囲がこのように特徴があり、考慮すべき特定の設計空間を規定するものである。スライドの場合、目標とする「処理帯域」は、接触領域によってもたらされる。その接触領域は、中間の液を含めて一緒にされたときに第一および第二の基材（基材およびスライドの面）の対向によって規定される。２つの面の一方が特定の境界で終わっているならば、液の境界はやはりこの境界で実質的に同時終結する；事実上、我々は、薄い液体の形を規定する「制御面」をもつこととなる。逆に、代わりの面が、非制御性であるゆえに液の形状に影響することなく伸びていてもよい。いずれの面が制御性であってもよい。これは図１０ａおよび１０ｂに示されている。これは、薄い液層の境界がこのように統御可能であり、その一方、面の一方の物理的寸法（一度に、境界当り）は、たとえばスライドガラスのラベル領域の無処理を可能にするために、またたとえば後述のように取扱い目的で基材を大きくするために、融通できるゆえに、重要である。
【００４５】
気泡を排除し、比較的大きい表面積に比較的少量の液を展着させるという本発明の能力は、有利な一方、特に少量のときの試料スライドと基材との間の液の有意な接着力ゆえに、その後に試料スライドを基材から分離する際に技術的問題を生じる可能性もある。かくして、本発明は、他の一面において、この分離を容易にするシステムを提供する。図７、８ａおよび８ｂは、可撓性基材３４を試料スライド３６から「剥離する」ことによって、試料スライド３６と基材３４との間に生じる有意の液体張力を処理するやり方で、試料スライドガラス３６を基材３４から分離することを示している。可撓性基材３４を横たえ、背後から剥いで、試料スライド３６から剥離する種々の手作業による方法および／または機械的手段が考えられる。図８ａおよび８ｂは、手による分離を示しており、図９ａおよび９ｂは、ベルト駆動装置６０、６２が試料スライド３６からの可撓性基材３４の剥離および分離の双方を起させ、同時に使用済み液量をベルト駆動装置６０、６２によって運ばれる吸収剤ベルト６４、６６上へ投棄し、運び去らせる具体化例を示している。
【００４６】
第一の基材は、相対的に液体非透過性要素からなる。典型的には、この基材は、生体基質試料を保持するガラス、プラスチックまたは金属である。第二の基材は、比較的に可撓性で気体透過性の要素からなり、上記のＧｏｒｔｅｘ（登録商標）膜がそれに包含される。
【００４７】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、それらは本発明を説明することを意図したものであって、なんらそれを限定するものではない。
【００４８】
材料リスト
基材： 予備洗浄したＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）プラス顕微鏡用スライド、２５×７５×１ｍｍ（エリー・サイエンティフィック社）に載せたパラフィン包埋扁桃腺切片を風乾し、処理に先立ち数日間スライドボックス中に保存した。
液体装置接触膜要素： Ｍｅｔｒｉｃｅｌ（登録商標）４７ｍｍディスク０．１μｍ、多孔性ポリプロピレン、ニューヨーク州イーストヒルズのポール・コーポレーション、Ｐ／Ｎ Ｍ５Ｐ４０４７。
流体装置裏当て要素： 透明片側粘着性シリコーンシート、厚さ０．０２０インチ、マックマスター−カー・サプライ社、Ｐ／Ｎ Ｒ７００５４９ＰＫ。
流体装置構築物： シリコーンシートから、約２．７ｘ約６．５ｃｍの長方形切片を切り出した。各切片の最後の約２ｃｍを残して、その全体から粘着剤裏当て材を除去した；この末端は、最終装置の取っ手として役立つ。露出させた粘着剤の上に、４７ｍｍのディスクを配置し、粘着させる。次に、積層物を、過剰の張り出した材料を除去するように仕上げする。ディスクの湾曲のゆえに、シリコーンシートを、長方形の四隅にわずかな湾曲を付けて仕上げして、利用可能な処理用接触領域を極小化する。（図１０ａ参照。）膜表面の最終面積は約２．７×４．４ｃｍである。免疫組織化学的染色（ＩＨＣ）を通じて包含されるすべての水性工程を通じて同じ装置構成を用いた。
溶媒流体装置： 無極性溶媒は上述の装置をすっかり濡らすので、脱パラフィンおよび脱水の操作を通じての試料の処理には、他の材料を用いた。約７ｃｍ長さのＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＳＣＡＴＭカバースリップフィルム（カリフォルニア州トランスのサクラ・ファインテクＵＳＡ、Ｐ／Ｎ ４７７０）を用いた。片面が粘着剤を含んでおり、非粘着面を用いて、試料処理用溶媒を展着させた。脱パラフィンおよび脱水におけるすべての無極性工程を通じて、同じ材料を用いた。
カバースリップ： 長さ５．２ｃｍの同じカバースリップ材料を用いて、最終操作時の試料を被覆保護した。
吸収パッド： 水性溶液を吸収するためのものと、無極性溶媒を集めるためのものの２種類を用いた。ニューハンプシャー州キーンのシュライヘル＆シュール・バイオサイエンス社から入手したゲルブロットペーパーＰ／Ｎ ＧＢ００３を、３ｘ６ｃｍの切片に切断して使用した。小片のＳｏｔｃｈ（登録商標）テープ（ミネソタ州セントポールの３Ｍ社）を最後の約０．５ｃｍの両端までテープ留めし、折り返して自身に粘着させて、取っ手として働かせた。水性パッドの場合：それを、脱イオン水で１：１０に希釈した反応用緩衝液濃縮物（１０×）（ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド、カタログ番号９５０−３００）に浸漬させた。浸漬後、濡れたパッドを軽く圧縮して、過剰を搾り出した。その目的は、効果的な吸収のために湿潤吸収材を入手することであった。当初に吸収された溶液の大部分は、搾り出して、パッドが「ずぶぬれ」であるよりも「湿っている」ものとした。
載物領域： ５×７．５×９．５ｃｍのアルミニウムブロック８０を、処理の間にスライドおよび物品を置くための載物台として用いた［図１１］。
道具： 正確な試薬量の採取と配量のために、０．０１０〜０．１００ｍＬの範囲のＶＷＲブランドのピペット（ペンシルバニア州ウエストチェスターのＶＷＲインターナショナル社）を用いた。
試薬： ＣｏｎｆｉｒｍＴＭ抗ＣＤ３４（クローンＱＢＥｎｄ／１０）ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド、カタログ番号７９０−２９２７を、血管内皮細胞染色用の一次抗体として用いた。二次抗体は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ、ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド、Ｐ／Ｎ ７６０−４２０５であった。その他の試薬は、ＤＡＢ ＭＡＰＴＭキット、カタログ番号７６０−１２４、ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッドであった。この実施例では、ブロッカーＤ試薬は、ブロッカーの手助けなしには処理の結果としていかに悪いバックグラウンドが得られるかを証明するために、使用しなかった。各試薬（約０．１００ｍｌ）は、０．２ｍｌの微量遠心管に移して使用した。
【００４９】
方法
載物： 図１１および１２を参照して、実験台上で、上面が平坦なアルミニウムブロックまたは載物台８０を直立して据え付ける。方位選択の自由がある−スライドガラスをまずブロックに載せ、液を間に挟んで膜物品を上に載せてもよく、あるいは、膜物品をまず置いて、スライドガラスを上に載せてもよい。処理という観点からは、いずれの操作を選択しても、重要ではないことが見出されている。液滴は、中間工程として配量されるので、手によって適用する場合には、まず膜を置き、次に液を配量し、続いてスライドガラスをその上に対向させる（サンドイッチにする）のがより便利であることが一般的に見出された。これには、透明なガラスの裏面を通して上面から流体の挙動を目視観察できるという追加の利益もあった。小体積を適用するときには、境界への液の過剰発現は、ごくわずかの過剰しかなく、液が高度に粘性的に挙動して液の配置の制御を容易にするので、ほとんど重要でないかまたはまったく重要でない。しかし、比較的大きい体積を適用するときには、液が境界に過剰に現われる傾向があり、過剰分の処理が関心事となりうる。過剰に現われる場合には、載物台からの吸収または接触面がいかなる液境界の近くにもないように載物台の設計に関して注意を払うべきである（たとえば、搭載される基材よりも寸法のわずかに小さい載物台を使用する）。かかる設計は、広い範囲の体積量が用いられるエラー強さのある処理領域に備えるものである。今の場合、膜物品は、ブロックの上に、平らに、多少とも中心に配置して、スライドを次に載せたときに、スライドのラベル端８２が載物台のへりから張り出すようにした。（図１１参照）。これにより、スライドに容易に接近し、これを取り扱うことが可能になった。スライドを持ち上げることは、液を介してスライドに「接着」されている膜物品を持ち上げることでもあった。この「サンドイッチ」は、諸要素、液を崩壊させることなく、またそれらの相対配置を乱すことなく、空間内で安全に取り扱うことができ、回転させ、ひっくり返すことができた。
接触領域： 膜の表面積は約２．７×４．４ｃｍである。指定されたスライドガラスの処理領域は２．５×約５．０ｃｍである。スライドガラスの幅（２．５ｃｍ）が接触領域の幅を規定し、膜の長さ（４．４ｃｍ）が接触領域の長さを規定する。換言すれば、膜がガラスの幅寸法から張り出しており、ガラスは膜の長さ寸法から張り出している。（図１０ａおよび１０ｂ参照）。かくして、生じた接触領域は、２．５×４．４＝１１ｃｍ２である。組織切片はこの処理帯域内にうまく載った。すべての液の適用に０．０２０ｍｌの液量を用いた。被覆と気泡吐き出しの両目的にこれが十分であることが先に確定されていたからである。これが、０．０２０ｍｌ／１１ｃｍ２または０．００１８ｍｌ／ｃｍ２という「流体工学的操作」値という結果になった。これは、体積の下端または粘性処方に当る。高い粘度が明瞭に観察されたが、いずれの工程においても一回の失敗例も気泡吐き出しの遅延もなかった。
ＩＨＣ処理−配量：適切な免疫組織化学的染色を行なうためには、特定の系列の試薬を特定された時間の曝露のために適用しなければならない。濃度はキットメーカーによって確立されている。すべての試薬を、希釈することなく、十分に濃縮された形で使用することに決定した。これは、処理を加速して、いずれの工程にも標準的な２分間という曝露時間を採用できるようにするためであった。異なる曝露時間を試験することも、この設定を越えて最適化することもしなかった。各配量について、０．０２０ｍｌという液量をスライドに適用した。ＳＡ−ＨＲＰ処理後に適用した１回を除いて、すべての洗浄液配量を削除することも決定した。予想外の知見は、他の手段で試薬量の大部分を除去できるならば、一つの例外を除いて、試薬工程のいずれにおいても洗浄液の適用は必要でないということであった。該単一の洗浄工程には、反応用濃縮緩衝液（１０Ｘ）を１：１０に希釈したものを用いた（０．０２０ｍｌ）。適用量の配置は、サンドイッチの作用が液を対向面の間で一様に拡げてくれるので、重大なことではなかった。このことは、自動化の場合、装置設計をこの点では緩和できるゆえに、意味のあることである。適用量は、通常、流体装置物品のほぼ中央に配置した。最初の適用量はインヒビターＤを含んでいた。０．０２０ｍｌが全接触領域をかろうじて覆うことが見出された。他方、他の試薬のその後の適用では、被覆範囲についての困難性は示されなかった。処女的膜表面の最初の使用が最適条件に及ばず、好ましくなかった可能性がある。かくして、その膜をタンパク質吸収に曝露したときの条件整備がその後の工程での展着性を増強したのかもしれない。
【００５０】
処理順序：
１）インヒビター、２）抗ＣＤ３４、３）ユニバーサル二次抗体、４）ＳＡ−ＨＲＰ、５）反応用緩衝液洗浄、６）ＤＡＢ＋ＤＡＢ Ｈ２Ｏ２、７）銅。
工程６では、２種の試薬をともに適用した。本件の場合、スライドへの配量の直前に、０．０２０ｍｌのＤＡＢを０．０２０ｍｌのＤＡＢ Ｈ２Ｏ２と予備混合した。混合物の０．０２０ｍｌのみを適用した。
ＩＨＣ処理−液体除去： ２分間の各処理の後、サンドイッチを、スライドガラスのラベル端をつかんで空中へ持ち上げ、流体装置物品の取っ手端をつかみ、膜をスライド表面から剥離した。次に、流体装置をアルミニウムブロック、すなわち載物台に戻し、湿潤ブロットペーパーを上に載せ、次にスライドガラスをブロットペーパーの上に置いた。この新しいサンドイッチの上からわずかな圧力を加えて、流体装置とスライドの双方の面の過剰の液がブロットペーパーの両面に同時に容易に吸収されうるようにした。かかる吸収操作を実施するための合計時間は、１０〜２０秒間の間であって、主として手の器用さに依存した。実際の吸収時間は、おそらく５秒間未満であったであろう。
溶媒による脱パラフィン処理： パラフィンを効果的に除去し、組織を含水状態に戻すために、特定の一連の溶媒曝露を適用した。処理操作は、若干の顕著な相違を除いて、ＩＨＣ操作について記述したところと実質的に同じである。スライドガラスを載物台上に上向きに置き、流体装置物品をその上に置いて液をサンドイッチした。すなわち、水性処理に対して上下を逆にした。流体装置物品（サクラ・カバースリッププラスチック片）はきわめて薄く、その濡れた面を載物台面の上方１ｍｍのところに位置するスライドガラスとの境界を液が越えるのを防止する方がより容易であった。さらに、そのプラスチックは透明で、可視化が十分であった。もっとも有意な差は、流体装置がこの場合には気泡吐き出しが不可能なことである。そのプラスチック片を「液体ベアリング」の上で前後に滑らせることで、閉じ込められた気孔にもかかわらず組織を溶媒に適切に曝露させることができた。この方法は、完全な被覆処理を保証する重要でユニークな代替法であり、閉じ込められた気孔の作用を弱める方法である。
各液は、処理帯域に直接適用されるので、流体装置をスライドで直ちに挟み込んで、均質な処理を行なうことが重要である。いずれの場合にも、溶媒類は、１回の適用当り約１０秒間だけ適用した。吸収は、ＩＨＣ水性例の場合と同様に実施したが、過剰の無極性溶媒を集めるために別個の吸収パッド（乾燥品）を使用した。１回の適用当り、０．０２０ｍｌ量を用いた。
【００５１】
処理順序：
１）キシレン（反復３回）、２）１００％ＥｔＯＨ（反復２回）、３）反応用緩衝液（１回のみ）
処理（工程３における間の）の終わりに、組織が押し固まってきたので、ＩＨＣプロセスが進行していたこともあり、反応用緩衝液に数分間「浸漬」した。
脱水処理： 実質的に脱パラフィンと同じ操作を、ただし逆の順序で、適用した。同じ溶媒吸収パッドを用いた。
【００５２】
処理順序：
１）１００％ＥｔＯＨ（３回反復）、２）キシレン（１回）、３）キシレン＋サクラ・カバーガラス。
カバーガラス工程３には、０．０２０ｍｌが不十分な量であることが認められた。仕上げカバーガラスの周囲に追加の０．０２０ｍｌを加えて、空気を除去し、最初に適用した量に追加した。
ＩＨＣ処理の間の銅試薬吸収最終処理と脱水との間に中間工程はなかった−試料はＩＨＣから溶媒適用へと直接に進んだ。
【００５３】
最終結果および利点：
ワックスからカバーガラスまでの総処理時間＝２０分。慣用的な先行技術手法を用いる類似プロセスが脱パラフィン＋ＩＨＣ操作だけで約９０分を要することからすれば、これはきわめて迅速である。
総液体消費量：水性０．１６０ｍｌ；キシレン０．１２０ｍｌ；ＥｔＯＨ ０．１００ｍｌ。これは、慣用のプロセスと比較して約１０００Ｘの低減である。
総液体流廃液：なし；２枚の濡れた吸収膜のみ。
高価な試薬の体積の８０％の低減（ＢｅｎｃｈＭａｒｋでの試薬当り０．１００ｍｌと比較して０．０２０ｍｌ処理）。
１洗浄工程を除いてすべての洗浄工程の削除。より経済的；より迅速。
すべての混合要件の無視；混合経費なし。
染色およびバックグラウンドとも良好。
脱パラフィン、ＩＨＣ、脱水およびカバースライド操作の間の保持・待機工程の削除−脱パラフィンからカバーグラスかけまでの連続プロセス。
【００５４】
きわめて少量の液体試薬で操作できることから、先行技術と比較してのいくつかの特徴および長所が生じる。一つには、染色液および試薬を、濃縮された、希釈されていない形で使用できる。その結果、液量が有意に減少し、洗浄液またはすすぎ液の量も有意に減少する。また、試薬または染色液およびその後の操作の性格に応じて、１つ以上の洗浄またはすすぎ工程を省略することが可能である。この後者の本発明の特徴および利点は、まったく予測しなかったもので、スライドの適切な（すなわち明瞭な）染色に含まれるプロセスには、順次の試薬の適用の間に洗浄を行なうことが固有のことであるとこれまで認められてきた先行技術の現行の実際に相反するものである。本発明に従って疎水性で可撓性の基材３２を採用することによって、使用済み試薬または染色液を洗浄以外の手段で除去することが可能である。言い換えれば、染色を通じてのスライドの処理には、試薬の置換のみで十分なこともあるということが見出されたのである。それゆえ、本発明の他の側面に従えば、いかなる洗浄操作の必要性も排除する代替置換手段を提供できる。たとえば、ゲルブロットペーパー（ＧＢ００２またはＧＢ００３，シュライヘル＆シュール・バイオサイエンス社から入手可能）（図９ａ，９ｂ参照）などのブロットペーパーまたはクロスを用いての吸収により、使用済みの染色液または試薬を除去でき、スライドをなんら洗浄なしにさらに処理できる。これに替えて、使用済み染色液または試薬を、エアナイフィングまたはスピニングによって除去することもできる（図１３ｂ参照）。これには、現在市販されているシステムと比較して総液量が約１０００分の１に減少するという利点がある。廃液流を生じさせる必要がない；関連する唯一の廃棄物は、試薬収集で生じた水性液で濡れたおよび無極性溶媒で濡れた小型の吸収パッドである。換言すれば、本発明は、一つ以上の染色または試薬工程の間でのすすぎまたは洗浄を省略することによって、液体消耗品および廃液を減少させることを可能にする。
【００５５】
洗浄またはすすぎを間に挟むことなく一つ以上の試薬工程を満足裏に実施できるということは、予測されないことであり、古い「バケツ化学」の時代からの現在でも受け入れられている伝承、深く浸透した教義、バックグラウンド、持ち越しおよび化学的単離という理想をめぐる一般的な高い関心に反するところである。体積の減少、プロセスの加速および装置の信頼性の向上への圧力のもとに、すすぎなどのプロセスはより厳密な吟味の対象となってきている。本発明は、先行技術のシステムに内在する短所の多くを排除する最適なスライドの自動染色法を提供する。
【００５６】
図１３ａおよび１３ｂを参照すると、スライドの到来角度の制御および気泡の閉じ込めを阻止する運動の制御ならびに意図しない気泡の閉じ込めを軽減することを可能にする本発明の他の代替具体化態様が示されている。図１３ａでは、当該システムは、基本ステーション８０を包含し、その上に置換可能な表面要素８４が据え付けられる。要素８４は、射出成形されたプラスチックプレートなどの、定期的に新しい一片と置換できる固定された物品からなりうる。このようにして、よく管理された流体表面特性を維持することができる。これに替えて、図１３（ｂ）に示した場合には、表面要素は、供給ローラー８８と必要に応じて新しい膜の前進を可能にする引取りローラー９０との間にわたされ、緊張下に保持された膜シート８６を包含していてもよく、かくして、新しい表面を確保するよく管理された流体表面品質をもたらしうる。ディスペンサー９２が、既知量の液滴９４を、場合に応じて要素８４または８６の正しい到来側へ配量する。スライド９６が最初は液滴９４と接触するようにある角度をなして運ばれてきて（分りやすくするために運搬手段の詳細は示していない）、次いで、さらに左へ運ばれるときに、場合に応じて要素８４または８６の表面平面に平行に配向される。スライド９６の運搬は、場合に応じての要素８４または８６の運搬から独立していてもよい。角度をなしてのスライドの液滴９４との接触および場合に応じての要素８４または８６との平行配向への運動と組合せての場合に応じての要素８４または８６に対するスライド９６の相対運動とは独立しての運搬を維持することによって、結果として生じた毛管間隙内への実質的に気泡のない液の展着および被覆が保証される。毛管間隙は、液が充満することのできるスライド９６と場合に応じての要素８４または８６との任意の連続した対向であると定義される。スライド９６は、装置表面を越えて運ばれ、左の遠方側に達する。運搬速度が、毛管間隙液へのスライド９６の表面の曝露（インキュベーション）の時間を制御する。台８０の長さを増すことにより、および／または台８０の内部に加熱手段９８または１０６を組み込むことによって、処理量を増大させることができる。加熱しながら、運搬速度を増して、均等なインキュベーション効果を維持し、それにより能力を増大させてより多くのスライドを処理することもできる。スライド９６がさらに運搬されると、それは漸次装置から取り去られる。液の大部分は、減少していく残留毛管間隙の中に留まる傾向がある。場合に応じての要素８４または８６の境界を過ぎて運ばれると、液の大部分は液滴１００として装置の側面をこぼれ落ちて、過剰の残留液がほとんどない処理されたスライド９６面を残す。スライド９６はさらに他の場所へ運ばれて、必要ならば、たとえばエアナイフ１０２処理または吸収性多孔性膜表面要素１０４処理により、さらなる表面液の除去のための処理を受けてもよい。同様にして一連の化学的表面処理を行なうために、同様の基礎ステーションおよび配量装置などを追加して使用してもよい。
【００５７】
また、加熱素子９８または１０６を要素８４に組み込んでもよく、システム全体を、制御された加熱能力をもつ小室内に配置してもよい。
【００５８】
かくして、本発明が、基材表面上で微小体積を染色またはインキュベートするための有意義な方法およびシステムを提供することが分かる。２０〜５０μｌの規模の液量を、大表面積のスライドガラス（面積１２．５ｃｍ２、＞１．６〜４．０μｌ／ｃｍ２）上に薄層として展着させることができる。スライド上の液は、シールなしに維持して、特定の処理領域が適切な流体曝露のために接触するようにできる。崩壊なしに連続した水性薄層を維持することは、よく認識された問題である。本発明は、少液量を、有意な蒸発損失を回避しつつ、閉じ込められたまたは形成性の気孔を制御下に受動的に逃避させながら、広い表面積に展着するシステムを提供する。
【００５９】
本発明には他の利点もある。濃縮された試薬を直接適用して、プロセスを加速することができ、試薬と希釈剤との混合の必要を排除することができる。濃縮試薬の適用は、体積ではなく濃度が制御因子となるから、液量分配の精度を緩和できることをも意味する。
【００６０】
本発明は、特定の化学物質のよく制御された連続インキュベーションを行なうのに有用である。小液量の試薬の適用に関連する骨の折れる洗浄の排除／低減は、小型化、システム統合、複雑なサブシステム（たとえば、廃液処理システム）の排除など、新しい構造体系上の機会を示唆する。たとえば、より高い構造レベルでは、平行処理による高い処理量を目指して多数のスライドステーションを配列することができる。本システムは膜物品を適用し、次にスライド面から剥離するという追加の工程を必要するが、これらの追加工程の「コスト」は、速度、液消費量の低減、廃液量の減少／撤廃によって補われる以上のものである。
【００６１】
本発明は他の利点をもたらす。たとえば、なんらかの組織試験システムの大部分または全部を単純な小型化ステーションに統合できるであろう。たとえば、７種の試薬プラス２種の洗浄液を一個の使い捨ての「マイクロ流体カード」上に個々のウエルとして包装して、単一スライドのＩＨＣ染色具を提供できるであろう。マイクロ流体アプローチは、個別化したスライド流体を統合して、異なる装置設計空間を可能にするという可能性をもたらす。ステーション全体を、たとえば小型掌中カメラの寸法とすることができよう。配管および大規模な機械的作業を排除できよう。小型化および統合により、単純性、品質管理のための設計、エラー強さおよび種々のタイプの費用低減がもたらされる。モジュールを組にそろえ、真の平行処理手段を提供して、より高い処理量を達成できよう。
【００６２】
以上、本発明を主に水性系液との関連で記述したが、本発明は、非水性液にも有利に使用できる。かかる場合には、上に述べたように、第二基材として疎水性の要素を採用する必要がないであろう。このように、本発明の概念、範囲のうちにとどまる多くの変法が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】先行技術に従ったときの液滴による表面の濡れおよび濡れなしを比較したものである。
【図２ａ】先行技術に従ったときの２つの表面の間に置かれた複数の液体の濡れおよび濡れなしの液滴挙動を示す。
【図２ｂ】先行技術に従ったときの２つの表面の間に置かれた複数の液体の濡れおよび濡れなしの液滴挙動を示す。
【図２ｃ】先行技術に従ったときの２つの表面の間に置かれた複数の液体の濡れおよび濡れなしの液滴挙動を示す。
【図３】先行技術に従ったときの、液体を２つの表面の間に置いたときに共通する蒸気閉じ込め問題を示す。
【図４ａ】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示す。
【図４ｂ】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示す。
【図４ｃ】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示す。
【図５】図７に類似の図であり、本発明の他の一具体化態様を示す。
【図６ａ】図７に類似の図であり、本発明の他の一具体化態様を示す。
【図６ｂ】図７に類似の図であり、本発明の他の一具体化態様を示す。
【図７】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示した図４ａ−ｃの断面図を示す。
【図８ａ】本発明に従っての基材からのスライドの手による分離を示す。
【図８ｂ】本発明に従っての基材からのスライドの手による分離を示す。
【図９ａ】本発明に従っての基材からのスライドの機械的補助による分離を示す。
【図９ｂ】本発明に従っての基材からのスライドの機械的補助による分離を示す。
【図１０ａ】本発明の積層膜物品を示す。
【図１０ｂ】本発明の積層膜物品を示す。
【図１１】本発明に従って作成されたベンチシステムを示す。
【図１２】本発明の一具体化態様のプロセスの概要を図式で示す。
【図１３ａ】本発明に従って作成された他の一システムの図９ａおよび９ｂに類似の図である。
【図１３ｂ】本発明に従って作成された他の一システムの図９ａおよび９ｂに類似の図である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、表面の液体処理において有用な方法および装置に関するものである。それは、処理用液体を指定された処理帯域に固有の薄膜の形に拡げることにより液体消費を極小化するのに有用である。本発明は、平坦な基材の液体処理、より詳しくはスライドガラス上の生体組織試料の染色に関連して特に有用であり、他の有用性も考えられるが、以下、かかる有用性との関連から本発明を記述する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織試料の分析は、病理医が多くの疾患を診断するのに、また医学研究者が細胞構造についての情報を得るために、使用する貴重な診断手段である。
【０００３】
生体組織試料から情報を得るためには、分析用の試料を調製するためのいくつかの予備操作を行なう必要がある。試験のための組織試料を調製する操作法には多くの変法があるが、これらの変法は、そのプロセスを個々の組織に適合させるための改良であると考えることもでき、あるいは、組織試料内の特定の化学物質または酵素を同定・確認するのにある特定の手法がより適しているからでもある。しかし、基本的な調製手法は、本質的には同じである。生体組織試料は、組織生検などからの固体組織から導くことも、塗抹標本（たとえばＰＡＰ塗抹標本）などからの細胞懸濁液という液体を主成分とするサンプルから導くこともある。
【０００４】
概して、そのような操作は、固定、脱水、浸潤および包埋による組織の処理；該組織のスライドガラス上への搭載、次いでの試料の染色；種々の構成成分の検出を通じての組織の標識；組織切片の、たとえば電子顕微鏡による碁盤目分析または培養皿中での試料細胞の培養を包含することになろう。
【０００５】
実施すべき分析または試験に応じて、試料は、それが含む情報の分析の用意ができるまでに、多くの予備の段階または処理あるいは操作を受けなければならないかもしれない。概して、それらの操作は複雑で、時間を要するものであり、高価で毒性のある材料を使用することの多いいくつかのきちんと順序だった工程を包含する。
【０００６】
たとえば、ある典型的な組織試料は、種々の細胞の相互の関係を調べ、あるいは異常を発見すべく、光学顕微鏡検査を受けるであろう。それに伴って、その組織試料は、光が透過できるよう、きわめて薄い組織片でなければならない。組織試料または薄片（しばしば切片と呼ばれる）の平均厚みは、２〜１０マイクロメートル程度（１マイクロメートル＝１ｍｍの１／１０００）である。概して、組織試料は、凍結するか、または、細胞構造を維持するだけでなく、組織の腐敗または自己融解をきたす可能性のあるさらなる酵素の作用をも停止させる物質（固定液）中で固定する。
【０００７】
固定後、組織試料は次に、濃度を増しながらのアルコールの使用により試料から水を除去することによって脱水する。次に、蝋と混合する化学薬品、あるいは、組織試料に浸透でき、崩壊または分裂なしに薄い切片を調製するのに適したコンシステンシーをこれに与えることのできる他の可塑性物質含浸剤でアルコールを置換する。
【０００８】
次に、ミクロトームを用いて、組織試料から薄い切片を切り出す。それらの切片は、厚さが５〜６マイクロメートル程度で、直径は５０００〜２００００ミクロン程度の長さであってよい。切り出した薄い切片は、水に浮かべて切片を拡げ、あるいは平らにする。次に、この切片を、普通寸法が約８×２．５ｃｍ（１×３インチ）のスライドガラスに載せる。
【０００９】
次に、試料を溶媒に曝露して、蝋または他の含浸剤を除去し、その溶媒をアルコールにより除去し、最終的にもう一度水が組織に浸透するまで、アルコール濃度を低下させることによってアルコールを除去する。試料への水の浸透により、水溶性染料による細胞構成要素の染色が可能になる。
【００１０】
組織試料調製のための自動操作を展開するに先立って、組織を顕微鏡下で調べることができるまでに、２から１０日間を要することがしばしばであった。より近年では、所定の間隔で試料を一つの液体から他の液体へ移動させる装置を利用する自動化されたプロセスが開発されており、その結果、調製時間が１２〜３６時間まで有意に減じている。
【００１１】
上記先行技術の考察は、主として、バーンスタインらに付与された特許文献１に由来するものであるが、この明細書は、ｘ座標およびｙ座標に沿って配置された複数の処理ステーションに沿って異なる組織試料を移動させるロボットアームを同時に包含し、それらのステーションで組織試料が種々の処理過程に付されるようになっている、複数の個別分析操作を実施するための自動化されたシステムを記述している。試料支持回転コンベヤと共同して、前もって選択された一連の試薬を試料の各々に供給する試薬回転コンベヤを包含し、それと共同する混合、インキュベーションおよびすすぎの各工程が挿入された自動化スライド処理システムを記述しているコウプランドらの特許文献２も参照されたい。特許文献３および特許文献４等に従って作成された装置は、アリゾナ州トゥーソンのヴェンタナ・メディカル・システムズ社から市販されており、実質的な商業的成功を収めており、生体試料検査の時間および費用を有意に減少させている。
【００１２】
生体組織試料は、最後に、スライドガラスに搭載されたままの状態で、病理学者が観察する。それゆえ、生体試料の処理の多くは、１インチｘ３インチのスライドガラスフォーマットの上の実質的に二次元の処理帯域への多種の液体の順次の適用および除去に適応させられる。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５６７５７１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５５９５７０７号明細書
【特許文献３】米国特許第５６７５７１５号明細書
【特許文献４】米国特許第５５９５７０１号明細書
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、所望の生物学的反応を実施するために必要な液体の体積量の減少を可能ならしめることによって、上記およびその他の先行技術に比しての改善をもたらすものである。反応物の液体体積の減少は、試薬費用の節約となり、また、必要な洗浄液の量の減少にもつながり、このことは、処理する必要のある廃液量の減少を意味する。液量の減少は、さらに、液体管理の複雑さを軽減させることとなり、そのことが、結局は、処理のより高い信頼性を可能にする。それは、廃液処理の軽減を可能にし、あるいは無視することをも可能にする。
【００１５】
本発明は、さらに、生体試料を処理するための処理時間を短縮することによって、改善をもたらす。液体所要量の減少は、迅速な処理およびそれらの順次実施を可能にし、これにより、時間を中心としてのより大きい処理量および／または試料回転が可能になる。さらに、本発明は、一つ以上の処理が驚くべきことに洗浄それ自体を必要としないことを規定し、さらに所要液量および処理時間の減少を可能ならしめる。
【００１６】
本発明は、ミクロの液量を扱うためのシステム、すなわち方法および装置を提供する。本発明は、一側面では、スライドと疎水性要素などの対向要素との間に形成された染色室または反応室を設けることにより、染色または生物学的反応を実施するための所要液量および処理時間を極小化するための方法および装置を提供する。より詳しくは、本発明は、閉じ込められた気泡の制御された受動的逃げ道を設け、同時に有意の蒸発損失を避けながら、スライド表面に少量の液体を展着する方法および装置を提供する。
【００１７】
本発明の好ましい一具体化態様では、スライドを、前記対向要素に向けてある角度をなして運び、気泡の閉じ込めが行なわれないようにする。
【００１８】
本発明は、向かい合った表面を有し、それらの間で空間を規定する第一および第二の基材を包含し、該空間内で生体試料を液体試薬で処理でき、該第一の基材が相対的に液体非透過性の要素からなり、該第二の基材は相対的に可撓性の気体透過性要素からなる、生体試料を液体試薬で処理するための処理帯域を有する装置に向けられる。
【００１９】
本発明は、また、向かい合った表面の間に規定された空間内に試料および液体試薬を供給する工程と、それらの表面を押し合わせて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に閉じ込められた気体を排出する工程からなる、生体試料を液体試薬で処理する方法に向けられる。
【００２０】
本発明は、さらに、向かい合った表面を有し、それらの間で空間を規定する第一および第二の基材を包含し、該空間内で処理帯域内において生体試料を液体試薬で処理でき、該第一の基材が相対的に液体非透過性の要素からなり、該第二の基材は気体透過性要素からなり、さらに、該第一および第二の基材を該処理帯域の下流で分離する機構を包含する、生体試料を液体試薬で処理するための装置に向けられる。
【００２１】
本発明は、また、生体試料処理のための前記装置を準備し、前記の向かい合った表面の間で規定された空間に液体試薬中の該試料を供給し、両基材を押し合わせて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に閉じ込められた気体を排出し、該両基材を分離する諸工程を包含する、生体試料を液体試薬で処理する方法に向けられる。
【００２２】
本発明のさらなるその他の特徴は、添付の図面を参照しての以下の詳細な説明から理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を詳細に考察するに先立ち、濡れおよび展着性という現象を見直すことが本発明の適切な理解に有用であろう。
【００２４】
展着性とは、液体の表面上での関係をいう。ある液体が該表面に対して拡がる傾向をもつか否かを決定する下記の力のバランスが存在する：
ｉ） 液−液相互作用（張力）
ｉｉ） 液−表面相互作用
ｉｉｉ）液および表面との環境（通常は空気）の相互作用
【００２５】
図１を参照しながら、水平面２２上に静止している液滴２０を考える。他の力がなければ、液滴は、その表面積を極小化しようとして、その表面張力によって引寄せられて球になろうとする。言い換えれば、液−液間力が優勢なときには、液体は、表面よりもより強くそれ自体と相互作用する。たとえば、水性（Ｈ２Ｏ）系に当てはめれば、Ｈ２Ｏ系液体中の水素結合が十分に強いので、多くの環境下で水性液体は、可能性として、液−表面よりも液−液相互作用をするであろう；たとえば、その液体が脱イオンＨ２Ｏであって、表面がその液体と比較的低い相互作用を示すとき、すなわちその表面が「疎水性」であるときである。その液体は表面上で「球状になる」傾向があり、容易に不安定化されうる。たとえば少し揺り動かして、表面から転がり落とすことができる。しかし、重力および液滴とその環境との間の表面張力が通常はこの表面張力に反して作用するので、液滴は他の形態をとる。親水性表面は、水性系液と表面との相互作用が顕著な場合である。液−表面相互作用力が強いときには、液体は表面に接触することを優先し、それによりその表面上に拡がる。
【００２６】
接触角は、この力のバランスを示す。９０°より大きい接触角は、液−表面相互作用力が比較的弱いことを示す；９０°より小さい接触角は、液−表面相互作用が相対的に強く、展着性の状態を示す。表面「湿潤性」は、液−表面相互作用が強く、液体が展着する傾向があることであると定義される。
【００２７】
展着可能な状態では、液体は展着しようとする。これは熱力学的な状態である。速度論的限定によって、それが展着しなかったり、展着が抑制されたり、時間的に影響されたりすることもある。対向接触面を使用すると、液体をきわめて速やかに展着させて、熱力学的状態を満足させることができる。その接触面は、液体に対して展着性であっても、なくてもよい。液体が２つの対向する表面の間にあれば、一方の面のみが液体と相互作用して、それを展着させればよい。すなわち、液体で湿潤されうる表面の場合、液滴２０は表面２２に沿って拡がる。液体と固体との間に形成される角θは、二面角または接触角と呼ばれる。完全な湿潤の場合、θは０°である。しかし、展着の過程では、気孔が偶然に混入し、生じた液体層の中に閉じ込められる可能性がある。本発明は、一部では、混入し、閉じ込められた気孔を消散させるための解決法を提供する。
【００２８】
図２ａ〜２ｃおよび図３は、液−表面が湿潤性および非湿潤性の場合のスライドと基材を先行技術に従って合わせたときに何が起るかを示している。特に図２ａ〜２ｃを参照すると、表面２２ａと２２ｂがぴったり合わせられたとき、まず、液滴２０が合わさって、より大きい液体２４を形成する。液が表面２２ａと２２ｂとの間の面間間隙中を拡がり、液体が薄い液膜の形状をとるとき、１個以上の気孔２６が閉じ込められる可能性がある。液の体積が十分であれば、直接２つの対向面の間にある実質的にすべての空間が液で満たされ、上記の形状をとるであろう。その形状の若干の部分は他の部分よりも先に充満し、他の進行してくる液部分と接触する。このようにして、より遅い部分は湿潤のチャンスをもつことができないかもしれない。それらが先行する部分によって取り囲まれ、かくして付随する気孔により「ベーパーロック」を受けるからである。これの代わりに、展着後に、局所の圧力および／または温度の変化により、溶解していた気体が飽和溶液から出てくるために、気孔が生じることもある。
【００２９】
処理液は、特に少量のとき、なんとかして全処理領域に確実に付与し、空間的にそこに保持する必要がある。たとえば、１インチ×３インチの顕微鏡スライド上に置かれた生体試料を染色するためには、液をまず載せ、次に長方形の平坦面から除去する必要がある。上で説明したように、少量の液は、液と雰囲気との間に熱力学的に生じる表面張力を極小化すべく、小液滴形成状態に留まろうとする傾向がある。その結果、表面にわたっての液の展着性は、特に液量が極小のときには、現実の難題となりうる。たとえば、液は、連続的な薄膜よりもむしろ小液滴として表面上に位置しているかもしれない。表面に大量の液を充満させることが、この問題を解決する一方法である；しかし、大量充満には大量の液の使用が必要で、これは経済的ではなく、また大型の貯槽、排水システムおよび複雑な配管の運用・管理も必要である。スライドの長方形をすみずみまで満たすには、さらなる量が必要でもある。これらの流体工学的難題を解決する一つの単純なアプローチは、基材全体または基材の処理区画を液体中に単に浸漬することである。以前の処理方法ならびに若干の慣用的な手による操作法は、この「バケツ化学」アプローチを利用してきている。しかし、現在の技術水準は、「スライド上の液体」というアプローチを、特に液体処理の自動化の点で、きわめて効果的に利用するのに成功している。このアプローチでは、多量使用アプローチを用いる（たとえばデンマーク国コペンハーゲンのダコサイトメーション（株）から入手可能な装置におけるように）のでなければ、スライド上で液量をよりよく管理（極小化、制御）するために、いくつかの装填手段が採用される。以前の先行技術の方法は、正確な体積制御に努めており、ときには体積極小化を念頭において（試薬コストゆえの混成プロセス）、種々の装填形態を採用してきている（たとえばＬＩＱＵＩＤ ＣＯＶＥＲＳＬＩＰＴＭ−アリゾナ州ツーソンのヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド；スライドチェンバーズ−マサチューセッツ州ケンブリッジのサイトロジックス社；チェンバーウォールズ−カリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジーズ社；チェンバーウォールズ−ニュージャージー州ピスカタウェイのアマーシャム・バイオサイエンシズ；ＴｅｃｈＭａｔｅＴＭキャピラリーガラススライド−カリフォルニア州サンタバーバラのバイオテク・ソリューションズ社）。通常は、なんらかの種類のシールを用い、固定された小室（チェンバー）の境界を介してスライド上の体積を制御している。「液密性」小室を設けることにより、さらに、液体の加圧が可能になり、場合によっては、壁を機械的に動かして、液体の小室への、または小室からの輸送および／または混合を行なうことも可能になる。
【００３０】
しかし、液を含有し、基材に対して液を明確に配置する必要性が、種々の技術的難題、問題を提起する。シール手段は、各要素の厳密で正確な結合を必要とするが、それらは通常はプロセスの妨げとなる。シールを介在させた２つの対向要素は、通常、不可欠な面の正確な配列と適切な維持への配慮（たとえば清潔さ）を必要とする。シールには、欠陥や破損が付き物である。たとえば、２表面の間に捕捉されたＯ−リング（またはガスケット）を介在させたシールは、Ｏ−リング中の欠陥、Ｏ−リングのねじれ、または不可欠な対合面のいずれかの表面の汚染粒子によって損なわれる可能性がある。他の例では、接着剤を用いたシールは、接着剤の欠陥、接着剤中の空隙、あるいは汚染粒子によって損なわれうる。また、シーリングは、基材自体へ直接に行なわれるのが普通である。種々の顧客による異なるプロセスで到来する基材のシーリングの質は、確固としたシール依存プロセスを管理するのが困難な重大な変数である。本発明は、上記およびその他の技術的問題に取り組むものであり、その一方で、シール手段に頼らずに液体薄膜中の取り込まれた気泡という重要な問題をも解決し、また有意な蒸発損失をも回避するものである。本発明では、小室の「側面」は物理的に結合されず、対向基材の表面は固定されていてもよく、あるいは互いに対して移動できるようになっていてもよい。
【００３１】
本発明は、スライド上の生体試料の染色または生体反応を有利に実施するのに用いられる。図４ａ〜４ｃ、５、６ａおよび６ｂを参照すれば、操作原理は次の通りである。水性系液滴３０を、２表面３４、３６の間に置かれた薄層３２として拡げることができる。両面が親水性であれば、表面相互作用が、液の展着に寄与するであろう。しかし、気泡３８（図３参照）が、液の展着の間に、または展着後に、溶液由来の溶解気体のために、２面間に空隙を形成するかもしれない。両面が気体非透過性（たとえばガラス）であれば、閉じ込められたまたは形成性の気孔が実質的にその場に固定されて、液層の連続性を破壊する（あるいは「ベーパーロック」の状態と記述される）。その気泡が及ぼす蒸気圧によって液の張力がその気泡を崩壊させるのを妨げられる。言い換えると、気体の行き場所がない。さらに、細い毛管形態中で粘性力が優勢となり、気泡３８の取り除きがきわめて困難となりうる。特に図４ｃおよび５を参照すれば、本発明に従って表面の一方として気体透過性材料４０を使用すれば、液の張力の影響下に気体が逃げ出すための通路４２が提供される。気体透過性材料４０の表面が液と強く相互作用すれば、液が吸収され、その透過性材料への接近を阻害し、図６ａに示したように、気泡が液で被覆された２つの表面の間に捕捉されたままとなるだろうゆえに、表面の性質は重要である。他方、表面が液体と十分に非相互作用的であれば、閉塞は起らず、図６ｂに示したように、液張力の駆動力（受動的）によって気泡が効果的に追い出される。この過程に好都合なのは、この面での液の低い展着性である；たとえば、表面の高い疎水性および水性系液の高い表面張力である。
【００３２】
かくして、本発明は、その一面では、薄い液膜の内部から気孔を「ゲップのように放出」させるための圧力軽減をもたらすために、側面の開いた反応小室の境界面を形成するための疎水性で、気体透過性の高い材料４０を準備することに基づいている。Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（登録商標）などのミクロ細孔性疎水性材料が、そのきわめて高い気体透過性のゆえに好ましい。液の吹き抜けを防止するためには、水入り込み圧（ＷＥＰ）の高い材料がさらに好ましい。高い水入り込み圧は、細孔寸法の小さい（０．０５〜２００ミクロン）材料を用いるか、図７に示したように、液透過性裏当て材５０に積層された多孔性の疎水性材料を使用することによって達成できる。液透過性裏当て材は、多孔性の疎水性材料が大きい細孔寸法（たとえば２００〜２０００ミクロン）をもっていても、液の吹き抜けを防止してくれる。材料４０は、効率的な液の展着のために平らで平滑な表面を呈していることが好ましい。いかなる表面くぼみも、液の局所的たまりを生ぜしめ、きわめて少量の適用の場合には展着効率に悪影響を及ぼすからである。細孔寸法のより小さい疎水性材料（約２００ミクロン未満）は、より平滑な表面をもたらす。さらに、材料中のいかなる有意の反り、ゆがみも、液被覆の欠如という結果をもたらしうる。材料４０は、寸法が安定しているが、操作できる程度に可撓性であり、すなわち、面上を滑らせることができ、またはたとえばローラーに巻きつけることができることも、好ましい。
【００３３】
現在好ましい材料４０は、水漏れ防止のためにパイプのねじ接続時に普通に用いられる「配管工用テープ」、すなわちテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））テープである。配管工用テープは、次の基準に適合するゆえに有用である：
１）それは疎水性であり、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）からなる；
２）それはミクロ細孔性である；Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）は伸展させると、０．０５〜５ミクロンの範囲のミクロ細孔性となる；
３）それは比較的高い水入り込み圧をもつ；それは非常に小さい細孔をもちながら比較的に稠密である；
４）それは可撓性で、順応性がある；それは裏当て要素または面の次元性（平坦さと平滑さ）を呈することができる；そして、
５）「静止摩擦」が高い；平滑で硬い表面に押し付ければ、それはそのような表面を把持する傾向がある。
【００３４】
表面透過性の高い材料を通しての蒸発は、高度なこともあるので、蒸発を制御するために、材料４０に実質的に非透過性材料５０を裏当てすることが好ましい。かくして、液相と雰囲気との間の蒸気圧（そしてベーパーロックの解除）が透過性材料４０を介して側面方向へ取り次がれ、物品のちょうど末端５２における露出された表面領域に限定される。疎水性ミクロ細孔性透過性材料５０として好ましいのは、ジョージア州アトランタのマックマスター・カー・サプライ社から入手可能な１．５インチ幅の軍隊用等級のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）製のねじ山テープＰ／Ｎ６８０２Ｋ６６（「配管工用テープ」）であり、これは実質的に非透過性の可撓性膜または被覆によって裏当てされていて、速やかな圧力平衡をもたらす。他の適当な多孔性の疎水性材料としては、シリコーン処理紙および多孔性ポリプロピレン膜がある。
【００３５】
図４ａ〜４ｃは、基材３４、液滴３０および試料スライドガラス３６を本発明に従って集合させる方法を一般的に示している。見られるように、試料スライドガラス３６と基材３４を互いにより近づけるとき、液滴３０が、対向表面の間で薄く、一様に拡がり始め、気泡は膜表面で有効裏に排除され、物品の末端を通して排出される。
【００３６】
顕微鏡用スライドガラスの寸法は、公称では１インチ×３インチである。ニューハンプシャー州ポーツマスのエリー・サイエンティフィック社が市販している通常のＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＴＭスライドは、スライドの末端に０．７５インチのラベル領域を含んでおり、約２．２５インチ×１インチの活用可能な領域を残している。いくつかのマイクロアレースライドはより広い活用可能領域を使用しており、従ってラベル領域はより小さいか、またはない。今回の場合には、活用可能領域は２インチ×１インチ、すなわち５．０×２．５ｃｍであると仮定する。従って、活用可能領域は、用途に応じて、上下いずれかに向けて調整できる。
【００３７】
５．０×２．５ｃｍの領域は１２．５ｃｍ２に相当する。これが、以下の実施例で染色処理および特性評価の体積範囲のために用いた実際の試験面積であった。全体よりも狭いスライドガラス面積を使用すると、ラベル末端を把持してのスライドの取扱いが可能になる。全体より小さい膜物品領域の使用により、該物品の取扱い／把持が可能になる。
【００３８】
適用する液量の範囲は、実用的な上限および下限を記述することによって規定できる。これは、スライド１枚当りとして規定できる；しかし、上に説明したように、活用可能領域は変化しうるから、１ｃｍ２当りで規定するのがより明瞭である。
【００３９】
液量の下端０．０００７ｍｌ／ｃｍ２では、液層厚みが７μｍで、所与の水性系液、スライドガラスおよび所与の接触膜について、全接触面にわたってほぼ完全に拡げることができるだけの薄さであった。展着は自然には起らず、若干の仕事を必要とした；すなわち、２つの表面は、展着を容易にするために若干の圧Ｐを必要とした。さらに、一方の表面を他方に対して移動または動揺させて、それらの面の間の隙間を通して液を「押し込む」のを助けることが有利であった。この下限では、液の粘性力が有意で、液の「流れ」が遅延させられる。かくして、下端の体積では、間隙を通して液を動かして、完全に濡れた接触面の熱力学平衡を達成するための追加の一工程が必要なことがあるかもしれない。さらに、下端の体積では、閉じ込められた気孔が容易に「吐き出される」ようには思われなかった。遅い吐き出しが、閉じ込められた気体と液との境界の移動／崩壊を遅らせる高い粘性力と関連していることはきわめてありうることである。
【００４０】
０．００２〜０．００５５ｍｌ／ｃｍ２の液量（２０〜５５ミクロン厚みの液層）が中間範囲であることが見いだされ、そこでは、深刻な粘性問題を招くことなく、液量を極小化できた。この範囲内では、展着も吐き出しも通常は自然に起り、体積が多いほど、より自然に起る。
【００４１】
０．００５５ｍｌ／ｃｍ２より多く、およそ０．０３６ｍｌ／ｃｍ２までの液量も有用でありうる（５５〜３６０ミクロン厚みの層）。吐き出しおよび展着は容易に進行する。しかし、体積が増すと、境界の液が接触領域から偶然的に搾り出され、主液体から切り取られる傾向が大きくなりうる。そのとき、小液滴は、スライドおよび／または膜のへりまたは外面で制御不可能に終わる可能性がある。かくして、体積増大につれて、不注意な液滴形成は、接触圧およびそれの制御により敏感なものとなる。不注意による液滴は、必ずしもそれ自体が問題であるわけではないが、取扱いに関して若干の注意を必要とする。
【００４２】
さらに、比較的大きい量は、一方の基材の他方の上での「浮遊」に通じる；粘性力はもはやあまり優勢ではないように思われる。一つの作用は、液層が「液体ベアリング」として作用するというものである；たとえば、装置がわずかに傾くと、上方の基材が容易に下方基材から滑り落ちる可能性がある。この性質は、処理後の２つの基材の分離に利用できる。処理中の制御不可能な分離を防止するには２つの基材を固定する必要もあるであろう。逆に、体積が少ないと、そこに働く高い粘性力のために２つの基材の分離が行なえずに、装置を著しく傾けることになりうる。
【００４３】
このように、最低量形態だけでなく、これらの３つの規定体積範囲のいずれもが有用でありうる。体積要求量は、特定の設計可能性を提供するいくつかの特徴点との取引対象となる。かくして、好ましい設計空間に応じて、現在使用されているよりも多い試薬量が好ましいこともありうる。
【００４４】
実際の範囲値は、使用する特定の液および表面に応じて変化しうる。先の例では、諸値は、脱イオン水とＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＴＭガラスおよびＴｅｆｌｏｎ（登録商標）配管工用テープ軍隊等級品を反映していた。実際の値はしかるべく変更できたが、低い、中等度および高い範囲がこのように特徴があり、考慮すべき特定の設計空間を規定するものである。スライドの場合、目標とする「処理帯域」は、接触領域によってもたらされる。その接触領域は、中間の液を含めて一緒にされたときに第一および第二の基材（基材およびスライドの面）の対向によって規定される。２つの面の一方が特定の境界で終わっているならば、液の境界はやはりこの境界で実質的に同時終結する；事実上、我々は、薄い液体の形を規定する「制御面」をもつこととなる。逆に、代わりの面が、非制御性であるゆえに液の形状に影響することなく伸びていてもよい。いずれの面が制御性であってもよい。これは図１０ａおよび１０ｂに示されている。これは、薄い液層の境界がこのように統御可能であり、その一方、面の一方の物理的寸法（一度に、境界当り）は、たとえばスライドガラスのラベル領域の無処理を可能にするために、またたとえば後述のように取扱い目的で基材を大きくするために、融通できるゆえに、重要である。
【００４５】
気泡を排除し、比較的大きい表面積に比較的少量の液を展着させるという本発明の能力は、有利な一方、特に少量のときの試料スライドと基材との間の液の有意な接着力ゆえに、その後に試料スライドを基材から分離する際に技術的問題を生じる可能性もある。かくして、本発明は、他の一面において、この分離を容易にするシステムを提供する。図７、８ａおよび８ｂは、可撓性基材３４を試料スライド３６から「剥離する」ことによって、試料スライド３６と基材３４との間に生じる有意の液体張力を処理するやり方で、試料スライドガラス３６を基材３４から分離することを示している。可撓性基材３４を横たえ、背後から剥いで、試料スライド３６から剥離する種々の手作業による方法および／または機械的手段が考えられる。図８ａおよび８ｂは、手による分離を示しており、図９ａおよび９ｂは、ベルト駆動装置６０、６２が試料スライド３６からの可撓性基材３４の剥離および分離の双方を起させ、同時に使用済み液量をベルト駆動装置６０、６２によって運ばれる吸収剤ベルト６４、６６上へ投棄し、運び去らせる具体化例を示している。
【００４６】
第一の基材は、相対的に液体非透過性要素からなる。典型的には、この基材は、生体基質試料を保持するガラス、プラスチックまたは金属である。第二の基材は、比較的に可撓性で気体透過性の要素からなり、上記のＧｏｒｔｅｘ（登録商標）膜がそれに包含される。
【００４７】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、それらは本発明を説明することを意図したものであって、なんらそれを限定するものではない。
【００４８】
材料リスト
基材： 予備洗浄したＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）プラス顕微鏡用スライド、２５×７５×１ｍｍ（エリー・サイエンティフィック社）に載せたパラフィン包埋扁桃腺切片を風乾し、処理に先立ち数日間スライドボックス中に保存した。
液体装置接触膜要素： Ｍｅｔｒｉｃｅｌ（登録商標）４７ｍｍディスク０．１μｍ、多孔性ポリプロピレン、ニューヨーク州イーストヒルズのポール・コーポレーション、Ｐ／Ｎ Ｍ５Ｐ４０４７。
流体装置裏当て要素： 透明片側粘着性シリコーンシート、厚さ０．０２０インチ、マックマスター−カー・サプライ社、Ｐ／Ｎ Ｒ７００５４９ＰＫ。
流体装置構築物： シリコーンシートから、約２．７ｘ約６．５ｃｍの長方形切片を切り出した。各切片の最後の約２ｃｍを残して、その全体から粘着剤裏当て材を除去した；この末端は、最終装置の取っ手として役立つ。露出させた粘着剤の上に、４７ｍｍのディスクを配置し、粘着させる。次に、積層物を、過剰の張り出した材料を除去するように仕上げする。ディスクの湾曲のゆえに、シリコーンシートを、長方形の四隅にわずかな湾曲を付けて仕上げして、利用可能な処理用接触領域を極小化する。（図１０ａ参照。）膜表面の最終面積は約２．７×４．４ｃｍである。免疫組織化学的染色（ＩＨＣ）を通じて包含されるすべての水性工程を通じて同じ装置構成を用いた。
溶媒流体装置： 無極性溶媒は上述の装置をすっかり濡らすので、脱パラフィンおよび脱水の操作を通じての試料の処理には、他の材料を用いた。約７ｃｍ長さのＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＳＣＡＴＭカバースリップフィルム（カリフォルニア州トランスのサクラ・ファインテクＵＳＡ、Ｐ／Ｎ ４７７０）を用いた。片面が粘着剤を含んでおり、非粘着面を用いて、試料処理用溶媒を展着させた。脱パラフィンおよび脱水におけるすべての無極性工程を通じて、同じ材料を用いた。
カバースリップ： 長さ５．２ｃｍの同じカバースリップ材料を用いて、最終操作時の試料を被覆保護した。
吸収パッド： 水性溶液を吸収するためのものと、無極性溶媒を集めるためのものの２種類を用いた。ニューハンプシャー州キーンのシュライヘル＆シュール・バイオサイエンス社から入手したゲルブロットペーパーＰ／Ｎ ＧＢ００３を、３ｘ６ｃｍの切片に切断して使用した。小片のＳｏｔｃｈ（登録商標）テープ（ミネソタ州セントポールの３Ｍ社）を最後の約０．５ｃｍの両端までテープ留めし、折り返して自身に粘着させて、取っ手として働かせた。水性パッドの場合：それを、脱イオン水で１：１０に希釈した反応用緩衝液濃縮物（１０×）（ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド、カタログ番号９５０−３００）に浸漬させた。浸漬後、濡れたパッドを軽く圧縮して、過剰を搾り出した。その目的は、効果的な吸収のために湿潤吸収材を入手することであった。当初に吸収された溶液の大部分は、搾り出して、パッドが「ずぶぬれ」であるよりも「湿っている」ものとした。
載物領域： ５×７．５×９．５ｃｍのアルミニウムブロック８０を、処理の間にスライドおよび物品を置くための載物台として用いた［図１１］。
道具： 正確な試薬量の採取と配量のために、０．０１０〜０．１００ｍＬの範囲のＶＷＲブランドのピペット（ペンシルバニア州ウエストチェスターのＶＷＲインターナショナル社）を用いた。
試薬： ＣｏｎｆｉｒｍＴＭ抗ＣＤ３４（クローンＱＢＥｎｄ／１０）ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド、カタログ番号７９０−２９２７を、血管内皮細胞染色用の一次抗体として用いた。二次抗体は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＡｎｔｉｂｏｄｙＴＭ、ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド、Ｐ／Ｎ ７６０−４２０５であった。その他の試薬は、ＤＡＢ ＭＡＰＴＭキット、カタログ番号７６０−１２４、ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッドであった。この実施例では、ブロッカーＤ試薬は、ブロッカーの手助けなしには処理の結果としていかに悪いバックグラウンドが得られるかを証明するために、使用しなかった。各試薬（約０．１００ｍｌ）は、０．２ｍｌの微量遠心管に移して使用した。
【００４９】
方法
載物： 図１１および１２を参照して、実験台上で、上面が平坦なアルミニウムブロックまたは載物台８０を直立して据え付ける。方位選択の自由がある−スライドガラスをまずブロックに載せ、液を間に挟んで膜物品を上に載せてもよく、あるいは、膜物品をまず置いて、スライドガラスを上に載せてもよい。処理という観点からは、いずれの操作を選択しても、重要ではないことが見出されている。液滴は、中間工程として配量されるので、手によって適用する場合には、まず膜を置き、次に液を配量し、続いてスライドガラスをその上に対向させる（サンドイッチにする）のがより便利であることが一般的に見出された。これには、透明なガラスの裏面を通して上面から流体の挙動を目視観察できるという追加の利益もあった。小体積を適用するときには、境界への液の過剰発現は、ごくわずかの過剰しかなく、液が高度に粘性的に挙動して液の配置の制御を容易にするので、ほとんど重要でないかまたはまったく重要でない。しかし、比較的大きい体積を適用するときには、液が境界に過剰に現われる傾向があり、過剰分の処理が関心事となりうる。過剰に現われる場合には、載物台からの吸収または接触面がいかなる液境界の近くにもないように載物台の設計に関して注意を払うべきである（たとえば、搭載される基材よりも寸法のわずかに小さい載物台を使用する）。かかる設計は、広い範囲の体積量が用いられるエラー強さのある処理領域に備えるものである。今の場合、膜物品は、ブロックの上に、平らに、多少とも中心に配置して、スライドを次に載せたときに、スライドのラベル端８２が載物台のへりから張り出すようにした。（図１１参照）。これにより、スライドに容易に接近し、これを取り扱うことが可能になった。スライドを持ち上げることは、液を介してスライドに「接着」されている膜物品を持ち上げることでもあった。この「サンドイッチ」は、諸要素、液を崩壊させることなく、またそれらの相対配置を乱すことなく、空間内で安全に取り扱うことができ、回転させ、ひっくり返すことができた。
接触領域： 膜の表面積は約２．７×４．４ｃｍである。指定されたスライドガラスの処理領域は２．５×約５．０ｃｍである。スライドガラスの幅（２．５ｃｍ）が接触領域の幅を規定し、膜の長さ（４．４ｃｍ）が接触領域の長さを規定する。換言すれば、膜がガラスの幅寸法から張り出しており、ガラスは膜の長さ寸法から張り出している。（図１０ａおよび１０ｂ参照）。かくして、生じた接触領域は、２．５×４．４＝１１ｃｍ２である。組織切片はこの処理帯域内にうまく載った。すべての液の適用に０．０２０ｍｌの液量を用いた。被覆と気泡吐き出しの両目的にこれが十分であることが先に確定されていたからである。これが、０．０２０ｍｌ／１１ｃｍ２または０．００１８ｍｌ／ｃｍ２という「流体工学的操作」値という結果になった。これは、体積の下端または粘性処方に当る。高い粘度が明瞭に観察されたが、いずれの工程においても一回の失敗例も気泡吐き出しの遅延もなかった。
ＩＨＣ処理−配量：適切な免疫組織化学的染色を行なうためには、特定の系列の試薬を特定された時間の曝露のために適用しなければならない。濃度はキットメーカーによって確立されている。すべての試薬を、希釈することなく、十分に濃縮された形で使用することに決定した。これは、処理を加速して、いずれの工程にも標準的な２分間という曝露時間を採用できるようにするためであった。異なる曝露時間を試験することも、この設定を越えて最適化することもしなかった。各配量について、０．０２０ｍｌという液量をスライドに適用した。ＳＡ−ＨＲＰ処理後に適用した１回を除いて、すべての洗浄液配量を削除することも決定した。予想外の知見は、他の手段で試薬量の大部分を除去できるならば、一つの例外を除いて、試薬工程のいずれにおいても洗浄液の適用は必要でないということであった。該単一の洗浄工程には、反応用濃縮緩衝液（１０Ｘ）を１：１０に希釈したものを用いた（０．０２０ｍｌ）。適用量の配置は、サンドイッチの作用が液を対向面の間で一様に拡げてくれるので、重大なことではなかった。このことは、自動化の場合、装置設計をこの点では緩和できるゆえに、意味のあることである。適用量は、通常、流体装置物品のほぼ中央に配置した。最初の適用量はインヒビターＤを含んでいた。０．０２０ｍｌが全接触領域をかろうじて覆うことが見出された。他方、他の試薬のその後の適用では、被覆範囲についての困難性は示されなかった。処女的膜表面の最初の使用が最適条件に及ばず、好ましくなかった可能性がある。かくして、その膜をタンパク質吸収に曝露したときの条件整備がその後の工程での展着性を増強したのかもしれない。
【００５０】
処理順序：
１）インヒビター、２）抗ＣＤ３４、３）ユニバーサル二次抗体、４）ＳＡ−ＨＲＰ、５）反応用緩衝液洗浄、６）ＤＡＢ＋ＤＡＢ Ｈ２Ｏ２、７）銅。
工程６では、２種の試薬をともに適用した。本件の場合、スライドへの配量の直前に、０．０２０ｍｌのＤＡＢを０．０２０ｍｌのＤＡＢ Ｈ２Ｏ２と予備混合した。混合物の０．０２０ｍｌのみを適用した。
ＩＨＣ処理−液体除去： ２分間の各処理の後、サンドイッチを、スライドガラスのラベル端をつかんで空中へ持ち上げ、流体装置物品の取っ手端をつかみ、膜をスライド表面から剥離した。次に、流体装置をアルミニウムブロック、すなわち載物台に戻し、湿潤ブロットペーパーを上に載せ、次にスライドガラスをブロットペーパーの上に置いた。この新しいサンドイッチの上からわずかな圧力を加えて、流体装置とスライドの双方の面の過剰の液がブロットペーパーの両面に同時に容易に吸収されうるようにした。かかる吸収操作を実施するための合計時間は、１０〜２０秒間の間であって、主として手の器用さに依存した。実際の吸収時間は、おそらく５秒間未満であったであろう。
溶媒による脱パラフィン処理： パラフィンを効果的に除去し、組織を含水状態に戻すために、特定の一連の溶媒曝露を適用した。処理操作は、若干の顕著な相違を除いて、ＩＨＣ操作について記述したところと実質的に同じである。スライドガラスを載物台上に上向きに置き、流体装置物品をその上に置いて液をサンドイッチした。すなわち、水性処理に対して上下を逆にした。流体装置物品（サクラ・カバースリッププラスチック片）はきわめて薄く、その濡れた面を載物台面の上方１ｍｍのところに位置するスライドガラスとの境界を液が越えるのを防止する方がより容易であった。さらに、そのプラスチックは透明で、可視化が十分であった。もっとも有意な差は、流体装置がこの場合には気泡吐き出しが不可能なことである。そのプラスチック片を「液体ベアリング」の上で前後に滑らせることで、閉じ込められた気孔にもかかわらず組織を溶媒に適切に曝露させることができた。この方法は、完全な被覆処理を保証する重要でユニークな代替法であり、閉じ込められた気孔の作用を弱める方法である。
各液は、処理帯域に直接適用されるので、流体装置をスライドで直ちに挟み込んで、均質な処理を行なうことが重要である。いずれの場合にも、溶媒類は、１回の適用当り約１０秒間だけ適用した。吸収は、ＩＨＣ水性例の場合と同様に実施したが、過剰の無極性溶媒を集めるために別個の吸収パッド（乾燥品）を使用した。１回の適用当り、０．０２０ｍｌ量を用いた。
【００５１】
処理順序：
１）キシレン（反復３回）、２）１００％ＥｔＯＨ（反復２回）、３）反応用緩衝液（１回のみ）
処理（工程３における間の）の終わりに、組織が押し固まってきたので、ＩＨＣプロセスが進行していたこともあり、反応用緩衝液に数分間「浸漬」した。
脱水処理： 実質的に脱パラフィンと同じ操作を、ただし逆の順序で、適用した。同じ溶媒吸収パッドを用いた。
【００５２】
処理順序：
１）１００％ＥｔＯＨ（３回反復）、２）キシレン（１回）、３）キシレン＋サクラ・カバーガラス。
カバーガラス工程３には、０．０２０ｍｌが不十分な量であることが認められた。仕上げカバーガラスの周囲に追加の０．０２０ｍｌを加えて、空気を除去し、最初に適用した量に追加した。
ＩＨＣ処理の間の銅試薬吸収最終処理と脱水との間に中間工程はなかった−試料はＩＨＣから溶媒適用へと直接に進んだ。
【００５３】
最終結果および利点：
ワックスからカバーガラスまでの総処理時間＝２０分。慣用的な先行技術手法を用いる類似プロセスが脱パラフィン＋ＩＨＣ操作だけで約９０分を要することからすれば、これはきわめて迅速である。
総液体消費量：水性０．１６０ｍｌ；キシレン０．１２０ｍｌ；ＥｔＯＨ ０．１００ｍｌ。これは、慣用のプロセスと比較して約１０００Ｘの低減である。
総液体流廃液：なし；２枚の濡れた吸収膜のみ。
高価な試薬の体積の８０％の低減（ＢｅｎｃｈＭａｒｋでの試薬当り０．１００ｍｌと比較して０．０２０ｍｌ処理）。
１洗浄工程を除いてすべての洗浄工程の削除。より経済的；より迅速。
すべての混合要件の無視；混合経費なし。
染色およびバックグラウンドとも良好。
脱パラフィン、ＩＨＣ、脱水およびカバースライド操作の間の保持・待機工程の削除−脱パラフィンからカバーグラスかけまでの連続プロセス。
【００５４】
きわめて少量の液体試薬で操作できることから、先行技術と比較してのいくつかの特徴および長所が生じる。一つには、染色液および試薬を、濃縮された、希釈されていない形で使用できる。その結果、液量が有意に減少し、洗浄液またはすすぎ液の量も有意に減少する。また、試薬または染色液およびその後の操作の性格に応じて、１つ以上の洗浄またはすすぎ工程を省略することが可能である。この後者の本発明の特徴および利点は、まったく予測しなかったもので、スライドの適切な（すなわち明瞭な）染色に含まれるプロセスには、順次の試薬の適用の間に洗浄を行なうことが固有のことであるとこれまで認められてきた先行技術の現行の実際に相反するものである。本発明に従って疎水性で可撓性の基材３２を採用することによって、使用済み試薬または染色液を洗浄以外の手段で除去することが可能である。言い換えれば、染色を通じてのスライドの処理には、試薬の置換のみで十分なこともあるということが見出されたのである。それゆえ、本発明の他の側面に従えば、いかなる洗浄操作の必要性も排除する代替置換手段を提供できる。たとえば、ゲルブロットペーパー（ＧＢ００２またはＧＢ００３，シュライヘル＆シュール・バイオサイエンス社から入手可能）（図９ａ，９ｂ参照）などのブロットペーパーまたはクロスを用いての吸収により、使用済みの染色液または試薬を除去でき、スライドをなんら洗浄なしにさらに処理できる。これに替えて、使用済み染色液または試薬を、エアナイフィングまたはスピニングによって除去することもできる（図１３ｂ参照）。これには、現在市販されているシステムと比較して総液量が約１０００分の１に減少するという利点がある。廃液流を生じさせる必要がない；関連する唯一の廃棄物は、試薬収集で生じた水性液で濡れたおよび無極性溶媒で濡れた小型の吸収パッドである。換言すれば、本発明は、一つ以上の染色または試薬工程の間でのすすぎまたは洗浄を省略することによって、液体消耗品および廃液を減少させることを可能にする。
【００５５】
洗浄またはすすぎを間に挟むことなく一つ以上の試薬工程を満足裏に実施できるということは、予測されないことであり、古い「バケツ化学」の時代からの現在でも受け入れられている伝承、深く浸透した教義、バックグラウンド、持ち越しおよび化学的単離という理想をめぐる一般的な高い関心に反するところである。体積の減少、プロセスの加速および装置の信頼性の向上への圧力のもとに、すすぎなどのプロセスはより厳密な吟味の対象となってきている。本発明は、先行技術のシステムに内在する短所の多くを排除する最適なスライドの自動染色法を提供する。
【００５６】
図１３ａおよび１３ｂを参照すると、スライドの到来角度の制御および気泡の閉じ込めを阻止する運動の制御ならびに意図しない気泡の閉じ込めを軽減することを可能にする本発明の他の代替具体化態様が示されている。図１３ａでは、当該システムは、基本ステーション８０を包含し、その上に置換可能な表面要素８４が据え付けられる。要素８４は、射出成形されたプラスチックプレートなどの、定期的に新しい一片と置換できる固定された物品からなりうる。このようにして、よく管理された流体表面特性を維持することができる。これに替えて、図１３（ｂ）に示した場合には、表面要素は、供給ローラー８８と必要に応じて新しい膜の前進を可能にする引取りローラー９０との間にわたされ、緊張下に保持された膜シート８６を包含していてもよく、かくして、新しい表面を確保するよく管理された流体表面品質をもたらしうる。ディスペンサー９２が、既知量の液滴９４を、場合に応じて要素８４または８６の正しい到来側へ配量する。スライド９６が最初は液滴９４と接触するようにある角度をなして運ばれてきて（分りやすくするために運搬手段の詳細は示していない）、次いで、さらに左へ運ばれるときに、場合に応じて要素８４または８６の表面平面に平行に配向される。スライド９６の運搬は、場合に応じての要素８４または８６の運搬から独立していてもよい。角度をなしてのスライドの液滴９４との接触および場合に応じての要素８４または８６との平行配向への運動と組合せての場合に応じての要素８４または８６に対するスライド９６の相対運動とは独立しての運搬を維持することによって、結果として生じた毛管間隙内への実質的に気泡のない液の展着および被覆が保証される。毛管間隙は、液が充満することのできるスライド９６と場合に応じての要素８４または８６との任意の連続した対向であると定義される。スライド９６は、装置表面を越えて運ばれ、左の遠方側に達する。運搬速度が、毛管間隙液へのスライド９６の表面の曝露（インキュベーション）の時間を制御する。台８０の長さを増すことにより、および／または台８０の内部に加熱手段９８または１０６を組み込むことによって、処理量を増大させることができる。加熱しながら、運搬速度を増して、均等なインキュベーション効果を維持し、それにより能力を増大させてより多くのスライドを処理することもできる。スライド９６がさらに運搬されると、それは漸次装置から取り去られる。液の大部分は、減少していく残留毛管間隙の中に留まる傾向がある。場合に応じての要素８４または８６の境界を過ぎて運ばれると、液の大部分は液滴１００として装置の側面をこぼれ落ちて、過剰の残留液がほとんどない処理されたスライド９６面を残す。スライド９６はさらに他の場所へ運ばれて、必要ならば、たとえばエアナイフ１０２処理または吸収性多孔性膜表面要素１０４処理により、さらなる表面液の除去のための処理を受けてもよい。同様にして一連の化学的表面処理を行なうために、同様の基礎ステーションおよび配量装置などを追加して使用してもよい。
【００５７】
また、加熱素子９８または１０６を要素８４に組み込んでもよく、システム全体を、制御された加熱能力をもつ小室内に配置してもよい。
【００５８】
かくして、本発明が、基材表面上で微小体積を染色またはインキュベートするための有意義な方法およびシステムを提供することが分かる。２０〜５０μｌの規模の液量を、大表面積のスライドガラス（面積１２．５ｃｍ２、＞１．６〜４．０μｌ／ｃｍ２）上に薄層として展着させることができる。スライド上の液は、シールなしに維持して、特定の処理領域が適切な流体曝露のために接触するようにできる。崩壊なしに連続した水性薄層を維持することは、よく認識された問題である。本発明は、少液量を、有意な蒸発損失を回避しつつ、閉じ込められたまたは形成性の気孔を制御下に受動的に逃避させながら、広い表面積に展着するシステムを提供する。
【００５９】
本発明には他の利点もある。濃縮された試薬を直接適用して、プロセスを加速することができ、試薬と希釈剤との混合の必要を排除することができる。濃縮試薬の適用は、体積ではなく濃度が制御因子となるから、液量分配の精度を緩和できることをも意味する。
【００６０】
本発明は、特定の化学物質のよく制御された連続インキュベーションを行なうのに有用である。小液量の試薬の適用に関連する骨の折れる洗浄の排除／低減は、小型化、システム統合、複雑なサブシステム（たとえば、廃液処理システム）の排除など、新しい構造体系上の機会を示唆する。たとえば、より高い構造レベルでは、平行処理による高い処理量を目指して多数のスライドステーションを配列することができる。本システムは膜物品を適用し、次にスライド面から剥離するという追加の工程を必要するが、これらの追加工程の「コスト」は、速度、液消費量の低減、廃液量の減少／撤廃によって補われる以上のものである。
【００６１】
本発明は他の利点をもたらす。たとえば、なんらかの組織試験システムの大部分または全部を単純な小型化ステーションに統合できるであろう。たとえば、７種の試薬プラス２種の洗浄液を一個の使い捨ての「マイクロ流体カード」上に個々のウエルとして包装して、単一スライドのＩＨＣ染色具を提供できるであろう。マイクロ流体アプローチは、個別化したスライド流体を統合して、異なる装置設計空間を可能にするという可能性をもたらす。ステーション全体を、たとえば小型掌中カメラの寸法とすることができよう。配管および大規模な機械的作業を排除できよう。小型化および統合により、単純性、品質管理のための設計、エラー強さおよび種々のタイプの費用低減がもたらされる。モジュールを組にそろえ、真の平行処理手段を提供して、より高い処理量を達成できよう。
【００６２】
以上、本発明を主に水性系液との関連で記述したが、本発明は、非水性液にも有利に使用できる。かかる場合には、上に述べたように、第二基材として疎水性の要素を採用する必要がないであろう。このように、本発明の概念、範囲のうちにとどまる多くの変法が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】先行技術に従ったときの液滴による表面の濡れおよび濡れなしを比較したものである。
【図２ａ】先行技術に従ったときの２つの表面の間に置かれた複数の液体の濡れおよび濡れなしの液滴挙動を示す。
【図２ｂ】先行技術に従ったときの２つの表面の間に置かれた複数の液体の濡れおよび濡れなしの液滴挙動を示す。
【図２ｃ】先行技術に従ったときの２つの表面の間に置かれた複数の液体の濡れおよび濡れなしの液滴挙動を示す。
【図３】先行技術に従ったときの、液体を２つの表面の間に置いたときに共通する蒸気閉じ込め問題を示す。
【図４ａ】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示す。
【図４ｂ】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示す。
【図４ｃ】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示す。
【図５】図７に類似の図であり、本発明の他の一具体化態様を示す。
【図６ａ】図７に類似の図であり、本発明の他の一具体化態様を示す。
【図６ｂ】図７に類似の図であり、本発明の他の一具体化態様を示す。
【図７】本発明の好ましい一具体化態様を概念的に示した図４ａ−ｃの断面図を示す。
【図８ａ】本発明に従っての基材からのスライドの手による分離を示す。
【図８ｂ】本発明に従っての基材からのスライドの手による分離を示す。
【図９ａ】本発明に従っての基材からのスライドの機械的補助による分離を示す。
【図９ｂ】本発明に従っての基材からのスライドの機械的補助による分離を示す。
【図１０ａ】本発明の積層膜物品を示す。
【図１０ｂ】本発明の積層膜物品を示す。
【図１１】本発明に従って作成されたベンチシステムを示す。
【図１２】本発明の一具体化態様のプロセスの概要を図式で示す。
【図１３ａ】本発明に従って作成された他の一システムの図９ａおよび９ｂに類似の図である。
【図１３ｂ】本発明に従って作成された他の一システムの図９ａおよび９ｂに類似の図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を液体試薬で処理することができる空間をそれらの間に規定する対向面を有する第一および第二の基材を包含し、該第一の基材が相対的に剛性の流体不透過性要素を包含し、該第二の基材が相対的に可撓性の液体不透過性要素を包含する、生体試料を液体試薬で処理するための装置。
【請求項２】
該試料が該第一の基材に担持されている請求項１の装置。
【請求項３】
該第一の基材がスライドガラスを包含する請求項２の装置。
【請求項４】
該生体試料が該スライドに担持された組織切片試料を包含する請求項２の装置。
【請求項５】
該生体試料が該スライドに担持された細胞標本を包含する請求項２の装置。
【請求項６】
該生体試料が該スライドに担持された組織試料アレーを包含する請求項２の装置。
【請求項７】
該生体試料が該スライドに担持されたＤＮＡマイクロアレーを包含する請求項２の装置。
【請求項８】
該生体試料が該スライドに担持されたタンパク質マイクロアレーを包含する請求項２の装置。
【請求項９】
該第二の基材が気体透過性の疎水性要素を包含する請求項１の装置。
【請求項１０】
該第二の基材が気体透過性、疎水性、多孔性の可撓性膜を包含する請求項１の装置。
【請求項１１】
該気体透過性、疎水性の多孔性膜がポリテトラフルオロエチレンテープまたはシートを包含する請求項１０の装置。
【請求項１２】
該気体透過性、疎水性の多孔性膜がミクロ細孔性の半透性テープまたはシートを包含する請求項１０の装置。
【請求項１３】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性要素によって裏当てされている請求項１０の装置。
【請求項１４】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性裏当て要素に積層されている請求項１３の装置。
【請求項１５】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性基材と接触して配置されている請求項１３の装置。
【請求項１６】
該液体試薬が生物学的染色液または生物学的試薬を包含する請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
該液体試薬が水性系溶液を包含する請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
該液体試薬が該対向面の間に実質的に一様に拡げられる請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
該液体が実質的に気泡を含まない請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
該液体が約７〜３６０μｍの膜厚みを有する請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
該液体が約１００〜３００マイクロリットルの体積をもつ請求項１の装置。
【請求項２２】
該液体が約５〜５０マイクロリットルの体積をもつ請求項２１の装置。
【請求項２３】
該液体が約２０マイクロリットルの体積をもつ請求項２２の装置。
【請求項２４】
試料と液体試薬を対向面の間に規定された空間へ供給し、該両面を互いに押し付けて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に捕捉された気体を排出する各工程を包含する生体試料の液体試薬による処理方法。
【請求項２５】
一方の基材を他方の基材から剥離することによって該両面を分離する工程をさらに包含する請求項２４の方法。
【請求項２６】
該液体試薬を一方または両方の面から除去する工程を包含する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該試薬を吸収によって除去する請求項２６の方法。
【請求項２８】
該試薬をエアナイフィングによって除去する請求項２６の方法。
【請求項２９】
該試薬をスピニングによって除去する請求項２６の方法。
【請求項３０】
生体試料を液体試薬で処理することができる空間をそれらの間に規定する対向面を有する第一および第二の基材を包含し、該第一の基材が相対的に剛性の流体不透過性要素を包含し、該第二の基材が相対的に可撓性の液体不透過性要素を包含し、さらに該第一および第二の基材を分離する機構を含む、生体試料を液体試薬で処理するための装置。
【請求項３１】
該分離機構が、該第一および第二の基材の一方または双方から液体試薬を除去するための多孔性材料を含む請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
該第二の基材が相対的に可撓性の基材を包含している請求項３０に記載の装置。
【請求項３３】
該第一および第二の基材の少なくとも一方を加熱するための加熱器をさらに含む請求項３０の装置。
【請求項３４】
該第一の基材を移動させるためのコンベヤをさらに含む請求項３０に記載の装置。
【請求項３５】
該コンベヤが該第一の基材を垂直に対して角度をなして移動させるのに適合している請求項３５に記載の装置。
【請求項３６】
該第二の基材が細長い可撓性膜を包含する請求項３０の装置。
【請求項３７】
該細長い可撓性テープが供給ローラーと引取りローラーとの間に渡される請求項３６の装置。
【請求項３８】
エアナイフをさらに含む請求項３０に記載の装置。
【請求項３９】
ブロッティング装置をさらに含む請求項３０の装置。
【請求項４０】
該第二の基材が気体透過性の疎水性要素を包含する請求項３０に記載の装置。
【請求項４１】
該気体透過性の疎水性要素が気体透過性の多孔性膜を包含する請求項４０の装置。
【請求項４２】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性裏当て要素に積層されている請求項４１の装置。
【請求項４３】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性基材と接触して配置されている請求項４１の装置。
【請求項４４】
請求項３０に記載の装置を準備し、該対向面の間に規定された該空間に液体試薬中の生体試料を供給し、該両基材を押し合わせて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に閉じ込められた気体を追い出し、該両基材を分離する各工程を包含する、生体試料を液体試薬で処理する方法。
【請求項４５】
該両基材の一方または双方から過剰の試薬を多孔性材料との接触によって除去する工程を含む請求項４４の方法。
【請求項４６】
生体試料を液体試薬で処理することができる空間をそれらの間に規定する対向面を有する第一および第二の基材を包含し、該第一の基材が相対的に流体不透過性の要素を包含し、該第二の基材が相対的に可撓性で気体透過性の疎水性要素を包含し、該基材の一方が他の基材を部分的に越えて延びている、生体試料を液体試薬で処理するための処理帯域を有する装置。
【請求項４７】
該第一の基材が相対的に剛性の要素を包含する請求項１に記載の装置。
【請求項４８】
該第一の基材が相対的に剛性の要素を包含する請求項３０に記載の装置。
【請求項４９】
該第一の基材が相対的に剛性の要素を包含する請求項４６に記載の装置。
【請求項５０】
該第一および第二の基材の少なくとも一方が平面図では長方形である請求項４６に記載の装置。
【請求項５１】
該第一および第二の基材がともに平面図では長方形である請求項４６に記載の装置。
【請求項１】
生体試料を液体試薬で処理することができる空間をそれらの間に規定する対向面を有する第一および第二の基材を包含し、該第一の基材が相対的に剛性の流体不透過性要素を包含し、該第二の基材が相対的に可撓性の液体不透過性要素を包含する、生体試料を液体試薬で処理するための装置。
【請求項２】
該試料が該第一の基材に担持されている請求項１の装置。
【請求項３】
該第一の基材がスライドガラスを包含する請求項２の装置。
【請求項４】
該生体試料が該スライドに担持された組織切片試料を包含する請求項２の装置。
【請求項５】
該生体試料が該スライドに担持された細胞標本を包含する請求項２の装置。
【請求項６】
該生体試料が該スライドに担持された組織試料アレーを包含する請求項２の装置。
【請求項７】
該生体試料が該スライドに担持されたＤＮＡマイクロアレーを包含する請求項２の装置。
【請求項８】
該生体試料が該スライドに担持されたタンパク質マイクロアレーを包含する請求項２の装置。
【請求項９】
該第二の基材が気体透過性の疎水性要素を包含する請求項１の装置。
【請求項１０】
該第二の基材が気体透過性、疎水性、多孔性の可撓性膜を包含する請求項１の装置。
【請求項１１】
該気体透過性、疎水性の多孔性膜がポリテトラフルオロエチレンテープまたはシートを包含する請求項１０の装置。
【請求項１２】
該気体透過性、疎水性の多孔性膜がミクロ細孔性の半透性テープまたはシートを包含する請求項１０の装置。
【請求項１３】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性要素によって裏当てされている請求項１０の装置。
【請求項１４】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性裏当て要素に積層されている請求項１３の装置。
【請求項１５】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性基材と接触して配置されている請求項１３の装置。
【請求項１６】
該液体試薬が生物学的染色液または生物学的試薬を包含する請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
該液体試薬が水性系溶液を包含する請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
該液体試薬が該対向面の間に実質的に一様に拡げられる請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
該液体が実質的に気泡を含まない請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
該液体が約７〜３６０μｍの膜厚みを有する請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
該液体が約１００〜３００マイクロリットルの体積をもつ請求項１の装置。
【請求項２２】
該液体が約５〜５０マイクロリットルの体積をもつ請求項２１の装置。
【請求項２３】
該液体が約２０マイクロリットルの体積をもつ請求項２２の装置。
【請求項２４】
試料と液体試薬を対向面の間に規定された空間へ供給し、該両面を互いに押し付けて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に捕捉された気体を排出する各工程を包含する生体試料の液体試薬による処理方法。
【請求項２５】
一方の基材を他方の基材から剥離することによって該両面を分離する工程をさらに包含する請求項２４の方法。
【請求項２６】
該液体試薬を一方または両方の面から除去する工程を包含する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該試薬を吸収によって除去する請求項２６の方法。
【請求項２８】
該試薬をエアナイフィングによって除去する請求項２６の方法。
【請求項２９】
該試薬をスピニングによって除去する請求項２６の方法。
【請求項３０】
生体試料を液体試薬で処理することができる空間をそれらの間に規定する対向面を有する第一および第二の基材を包含し、該第一の基材が相対的に剛性の流体不透過性要素を包含し、該第二の基材が相対的に可撓性の液体不透過性要素を包含し、さらに該第一および第二の基材を分離する機構を含む、生体試料を液体試薬で処理するための装置。
【請求項３１】
該分離機構が、該第一および第二の基材の一方または双方から液体試薬を除去するための多孔性材料を含む請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
該第二の基材が相対的に可撓性の基材を包含している請求項３０に記載の装置。
【請求項３３】
該第一および第二の基材の少なくとも一方を加熱するための加熱器をさらに含む請求項３０の装置。
【請求項３４】
該第一の基材を移動させるためのコンベヤをさらに含む請求項３０に記載の装置。
【請求項３５】
該コンベヤが該第一の基材を垂直に対して角度をなして移動させるのに適合している請求項３５に記載の装置。
【請求項３６】
該第二の基材が細長い可撓性膜を包含する請求項３０の装置。
【請求項３７】
該細長い可撓性テープが供給ローラーと引取りローラーとの間に渡される請求項３６の装置。
【請求項３８】
エアナイフをさらに含む請求項３０に記載の装置。
【請求項３９】
ブロッティング装置をさらに含む請求項３０の装置。
【請求項４０】
該第二の基材が気体透過性の疎水性要素を包含する請求項３０に記載の装置。
【請求項４１】
該気体透過性の疎水性要素が気体透過性の多孔性膜を包含する請求項４０の装置。
【請求項４２】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性裏当て要素に積層されている請求項４１の装置。
【請求項４３】
該気体透過性の多孔性膜が液体不透過性基材と接触して配置されている請求項４１の装置。
【請求項４４】
請求項３０に記載の装置を準備し、該対向面の間に規定された該空間に液体試薬中の生体試料を供給し、該両基材を押し合わせて、それらの間の空間を縮小させ、それらの間に閉じ込められた気体を追い出し、該両基材を分離する各工程を包含する、生体試料を液体試薬で処理する方法。
【請求項４５】
該両基材の一方または双方から過剰の試薬を多孔性材料との接触によって除去する工程を含む請求項４４の方法。
【請求項４６】
生体試料を液体試薬で処理することができる空間をそれらの間に規定する対向面を有する第一および第二の基材を包含し、該第一の基材が相対的に流体不透過性の要素を包含し、該第二の基材が相対的に可撓性で気体透過性の疎水性要素を包含し、該基材の一方が他の基材を部分的に越えて延びている、生体試料を液体試薬で処理するための処理帯域を有する装置。
【請求項４７】
該第一の基材が相対的に剛性の要素を包含する請求項１に記載の装置。
【請求項４８】
該第一の基材が相対的に剛性の要素を包含する請求項３０に記載の装置。
【請求項４９】
該第一の基材が相対的に剛性の要素を包含する請求項４６に記載の装置。
【請求項５０】
該第一および第二の基材の少なくとも一方が平面図では長方形である請求項４６に記載の装置。
【請求項５１】
該第一および第二の基材がともに平面図では長方形である請求項４６に記載の装置。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【公表番号】特表２００７−５１６４４７（Ｐ２００７−５１６４４７Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４７２４８（Ｐ２００６−５４７２４８）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２８６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６４３０９
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５００５５５８４８）ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２８６４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６４３０９
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５００５５５８４８）ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]