平面支持体上での細胞付着及び培養のための方法及び組成物
本発明は、吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体上での多能性幹細胞の成長、増殖、及び分化のための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許出願番号第６１／１１６，４５２号（２００８年１１月２０日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体上での多能性幹細胞の成長、増殖及び分化のための方法を目的とする。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物細胞の培養は、生命及び健康科学における多くのプロセスの１つである。足場依存性細胞を用いた哺乳動物細胞の培養及び分析用の容器は、容器の表面に細胞を付着させるために更なる表面処理を頻繁に必要とする、ガラス又は例えば、ポリスチレンのようなポリマーからしばしば形成される。こうした処理では、例えば、吸着、グラフト又はプラズマ重合法によって表面に吸着層を適用することを含む場合がある。また、こうした表面処理は、容器表面自体の化学改質によって行ってよく、これは、例えば、大気コロナ放電、高周波真空プラズマ、直流グロー放電、及びマイクロ波プラズマ処理によって行うことができる。
【０００４】
現在用いられている多能性幹細胞、特に胚性幹（ＥＳ）細胞の培養法は、例えば、胚性幹細胞を固体支持体表面上でフィーダー細胞層とともに培養する、又は固体支持体表面上で細胞外マトリクスタンパク質の吸着層とともに培養するといった複雑な培養条件を必要とする。これらの方法を用いた培養系では、培養される幹細胞の生物種とは異なる種から得られたフィーダー細胞又は細胞外マトリクスタンパク質（異種材料）をしばしば用いる。フィーダー細胞に接触させることで得られる培地、すなわち未分化のＥＳ細胞以外の細胞で調整した培地を使用してＥＳ細胞を培養することが可能であり、培地に動物血清を添加してもよい。
【０００５】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９〜４０４，２０００）及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７，１９９８）は、マウス胚性繊維芽細胞のフィーダー細胞層を用いたヒト胚盤胞からのＥＳ細胞株の培養について発表している。
【０００６】
別の例では、Ｘｕら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：９７１〜９７４，２００１）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体支持体表面を処理するためのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）及びラミニンの使用について発表している。別の例では、Ｖａｌｌｉｅｒら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１８：４４９５〜４５０９，２００５）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体支持体表面を処理するためのウシ胎児血清の使用について発表している。
【０００７】
別の例として、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて作製される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と呼ばれる分化かつ不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって調整される」と述べている。
【０００８】
別の例として、Ｗａｎａｔａｂｅら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：６８１〜６８６，２００７）は、「ＲＯＣＫ阻害剤は、解離したヒト胚性幹細胞を生存させる」と記述しており、解離誘導性アポトーシスの低下によりクローニング効率が高くなる（約１％から約２７％へと）こと、及び、フィーダー細胞としてマウス胚性線維芽細胞を、細胞外マトリクスタンパク質としてコラーゲン及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、及びＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２すなわちファスジルを使用することにより、遺伝子導入後のサブクローニングが促進されることを示している。更に、Ｙ−２７６３２で処理した解離ヒトＥＳ細胞は、無血清懸濁培養中でアポトーシスから保護された。
【０００９】
別の例として、Ｐｅｅｒａｎｉら（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２６：４７４４〜４７５５，２００７）は、「ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養の空間的構造の複雑さにより、ｈＥＳＣの運命に影響する異成分からなる微小環境（ニッチ）が形成される」と記述している。この研究により、ｈＥＳＣ分化の速度及び道筋を、ｈＥＳＣのニッチの性質を操作することによって制御することが可能であることが示された。ニッチのサイズ及び組成によって、分化誘導因子と分化阻害因子とのバランスが調節される。機構的には、ｈＥＳＣとｈＥＳＣ由来の胚体外内胚葉（ＥｘＥ）とのアンタゴニスト相互作用によってＳｍａｄ１によるシグナル伝達のニッチサイズに依存した空間的勾配が生ずる。こうした相互作用は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）のＥｘＥによる、及びそのアンタゴニストである増殖分化因子３（ＧＤＦ３）のｈＥＣＳによる局所的分泌によって媒介される。ＧＤＦ３、ＢＭＰ２及びＳｍａｄ１に対し低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡによる処理、及びＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤による処理を行ったｈＥＳＣのマイクロパターニングによって、Ｓｍａｄ１活性化の独立した制御により、ｈＥＳＣのコロニーサイズ依存性分化が防御されることが示された。我々の結果は、ｈＥＳＣの自己複製及び分化の空間的情報の集積及びニッチサイズ依存性制御におけるＳｍａｄ１の役割を初めて示したものである。
【００１０】
別の例として、Ｋｏｙａｎａｇｉ，Ｍら（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２００８ Ｆｅｂ １；８６（２）：２７０〜８０）は、「Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼは、ニューロンを含む多くの細胞種のアポトーシスに関わっているが、その作用機構は完全に理解されていない」と記述している。今回、我々は胚性幹細胞由来の神経前駆細胞を移植した際のアポトーシスにおけるＲｈｏ及びＲＯＣＫの役割を調べた。我々は、神経前駆細胞の解離によってＲｈｏが活性化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。Ｒｈｏ阻害剤であるＣ３菌体外酵素及び／又はＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２による処理によって解離誘導性アポトーシス（アノイキス）が２０〜３０％減少した。アポトーシスの初期の形態的兆候である膜泡形成、カスパーゼ３の開裂、及びミトコンドリアからのシトクロムｃの放出もＲＯＣＫの阻害によって低減した。これらの結果は、神経前駆細胞の解離によって、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路を介して少なくとも部分的に媒介される内在的な細胞死の経路が誘導されることを示唆するものである。更に、動物移植モデルにおいて、Ｒｈｏ及び／又はＲＯＣＫの阻害によって移植細胞の急性アポトーシスが抑制された。移植後、移植片の周辺において腫瘍壊死因子α及びプロ神経成長因子の強い発現が認められた。ＲＯＣＫの阻害により、これらの炎症性サイトカインによって亢進するアポトーシスも抑制される。以上を総合すると、これらの結果は、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫによるシグナル伝達の阻害によって細胞置換療法における移植細胞の生存率が向上し得ることを示している。
【００１１】
異種成分材料の使用は、多能性幹細胞を用いる特定の用途では不適当な場合がある。代替的な材料を使用することが可能である。例えば、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：８９５〜９０２，２００５）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体支持体表面を処理するためのヒト血清の使用について発表している。
【００１２】
代替的な一培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。
【００１３】
例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０；１９ Ｏｃｔ ２００５）は、ＥＳ細胞の自己複製を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非条件血清置換培地中でＥＳ細胞を維持する無フィーダー細胞、無血清培地システムを発表している。
【００１４】
別の例として、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、繊維芽細胞又は条件培地の非存在下で、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を添加した培地を使用してヒトＥＳ細胞を長期間培養する方法を発表している。
【００１５】
別の例として、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１種類のトランスフェリン又はトランスフェリン代用物質、少なくとも１種類のインスリン又はインスリン代用物質を含有する培地中で幹細胞を培養することを含む、無血清、無フィーダー線維芽細胞の合成培地中でヒトＥＳ細胞を培養するための方法であって、その培地は、哺乳動物胎児血清を基本的に含有せず、ＦＧＦシグナル伝達受容体を活性化することが可能な少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含有し、増殖因子は線維芽細胞フィーダー層以外の供給源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は条件培地なしで未分化状態の幹細胞の増殖を支持するようなものである方法を開示している。
【００１６】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。特定の培養中、この特定の培地は、基本培地、並びに実質的に未分化の始原幹細胞の増殖を支持するうえで必要とされる塩基性ＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン酸のそれぞれの所定量を含有する。
【００１７】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態において、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで有効な低浸透圧、低内毒素の基本培地を含む、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地が提供される」と記述している。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導される細胞外支持体成分からなる群から選択される支持体と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を更に含む。
【００１８】
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する」と記述している。１つの方法は、哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい１つの形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。
【００１９】
別の例として、国際特許出願公開ＷＯ２００５０６５３５４号は、ａ．基本培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量の塩基性線維芽細胞増殖因子、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量のアスコルビン酸を含む、基本的に無フィーダーかつ無血清の等張培地を開示している。
【００２０】
別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、未分化の幹細胞を維持するための方法であって、その方法が幹細胞を未分化状態に維持するのに充分な量のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のタンパク質ファミリーのメンバー、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のタンパク質ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間だけ、幹細胞を曝露することを含む方法、を開示している。
【００２１】
多能性幹細胞は、研究及び薬剤スクリーニングの潜在的供給源となる。現在のところ、ヒトＥＳ細胞株の大規模培養には問題が多く、大きな課題がある。これらの課題に対する可能な解決策の１つは、ヒトＥＳ細胞を単一細胞として継代及び培養することである。単一細胞は、例えば、細胞数測定、トランスフェクションなどの標準的な組織培養法により適合する。
【００２２】
例えば、Ｎｉｃｏｌａｓらは、レンチウイルスベクターによる遺伝子改変の後、蛍光活性化細胞選別法によって単離された単一細胞からヒトＥＳ細胞株を取得及び増殖させるための方法を提供している（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．１６：１０９〜１１８，２００７）。
【００２３】
別の例として、米国特許出願第２００５１５８８５２号は、「単一のヒト胚性幹細胞の増殖及び生存を向上させるための方法」を開示している。この方法は、単一の未分化ｈＥＳ細胞を得る工程と、単一の未分化細胞を細胞外マトリクスと混合して細胞を包囲する工程と、混合物を増殖環境中で栄養培地とともにフィーダー細胞上に接種する工程とを含む。
【００２４】
別の例として、Ｓｉｄｈｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．１５：６１〜６９，２００６）は、フローサイトメトリーによる単一細胞調製物の選別によって親細胞株ｈＥＳ３から誘導された３つのヒトＥＳ細胞クローンｈＥＳ３．１、３．２及び３．３について最初に報告している。
【００２５】
しかしながら、ヒトＥＳ細胞の単一細胞としての継代及び培養は、遺伝子的異常及び多能性の喪失につながる。培養条件は多能性及び遺伝子の安定性の維持に重要である。一般に、ヒトＥＳ細胞株の継代は人の手で行うか、あるいはコラゲナーゼ、リベラーゼ又はジスパーゼなどの酵素剤を使用して行われる。
【００２６】
例えば、Ｄｒａｐｅｒらは、「３系統の独立したヒト胚性幹細胞株において５回の独立した場合の１７ｑ染色体が獲得される核型の変化」の存在について記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５３〜５４，２００４）。
【００２７】
別の例として、Ｂｕｚｚａｒｄらは、「我々はこれまでに１つの核型変化の事象を検出したに過ぎない．．．我々の方法が他の多くのグループが使用した方法とは明らかに異なっていることを考えると、使用した培養方法が我々の結果になんらかの影響を与えた可能性がある。通常、我々は７日後のヒトＥＳ細胞を、折れたピペットの角で最初にコロニーを壊すことによって継代する．．．この方法では細胞を解離させるために酵素的又は化学的な方法を一切用いない。我々は、このことが我々のｈＥＳ（ヒトＥＳ）細胞が比較的細胞遺伝学的な回復力が高かったことを説明するのではないかと考えている。」と記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３８１〜３８２，２００４）。
【００２８】
別の例として、Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａらは、「大量継代法は．．．培養中で長期の継代の後、異数体の細胞集団を永続させ得るものであるが、核型に支障をきたすことなくより短期間（少なくとも継代数１５まで）で使用することも可能である．．．人の手による継代法のみによって得られるよりも大量のｈＥＳ細胞を必要とする実験では、人の手による継代条件下で長期の継代の後、限られた大量継代を行ってｈＥＳ細胞の正常な核型を維持することが可能かもしれない」と記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１９〜２０，２００５）。
【００２９】
別の例として、Ｈｅｎｇらは、「これらの結果により、第２のプロトコール（トリプシン処理をして静かにピペット攪拌）は、第１のプロトコール（コラゲナーゼ処理をして掻き落とす）よりも細胞の生存率に対する悪影響は大幅に低いことが示された。これは、ひいてはより高い凍結解凍後の生存率に結びついた。」と記述している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：３３〜３７，２００７）。
【００３０】
別の例として、Ｈａｓｅｇａｗａらは、「我々は完全な解離に耐えうるｈＥＳＣ亜系統を確立した。これらの細胞は、高い再プレーティング効率、更に高いクローニング効率を示し、三胚葉への分化能を維持している。」と記述している（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：２６４９〜２６６０，２００６）。
【００３１】
別の例として、米国特許出願第６１／０３０，５４４号は、少なくとも約０．９％〜少なくとも約１１％の窒素、及び少なくとも約１２％〜少なくとも約３０％の酸素を含み、吸着層及びフィーダー細胞を欠く固体支持体表面への細胞の付着、同表面での培養、及び同表面からの剥離のための方法及び組成物を提供する。本発明の一実施形態では、細胞をＲｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物で処理する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
細胞の多能性を維持しつつフィーダー細胞及び吸着層の非存在下で、多能性幹細胞を含む細胞の培養のための方法及び組成物が強く求められている。本発明は、吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体上での多能性幹細胞の成長、増殖及び分化のための方法を提供し、ここで細胞は、平面支持体に結合するために、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物での処理を必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
一実施形態では、本発明は、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着、培養及び分化のための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】平面支持体へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を示す。パネルａ）：混合セルロースエステル膜（表１の膜番号２）上への細胞付着を示す。パネルｂ）：ナイロン膜（表１の膜番号４）上への細胞付着を示す。パネルｃ）：セルロースアセテート膜（表１の膜番号５）上への細胞付着を示す。パネルｄ）：ポリカーボネート膜（表１の膜番号７）上への細胞付着を示す。パネルｅ）：ポリエチレンテレフタレート膜（表１の膜番号１２）上への細胞付着を示す。
【図２】混合セルロースエステル膜（表１の膜番号１）へのヒト胚性幹細胞株Ｈ９の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２６７３２の影響を示す。パネルａ）：対照ウェル内での細胞付着を示す。パネルｂ）：１０μＭのＹ−２６７３２で処理した細胞における細胞付着を示す。パネルｃ）：２０μＭのＹ−２６７３２で処理した細胞における細胞付着を示す。
【図３】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティング面上（実線）及び混合セルロースエステル膜（表１の膜番号１）上（破線）のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の増殖曲線を示す。
【図４】ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の代表的な細胞のＧバンド染色した染色体を示す。パネルａ）：ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティング面で１０回継代培養された細胞の染色体を示す。パネルｂ）：混合セルロースエステル膜（表１の膜番号１）上で１０回継代培養された細胞の染色体を示す。
【図５】ポリカーボネート膜（表１の膜番号７）へのヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２６７３２の影響を示す。パネルａ）：対照ウェル内での細胞付着を示す。パネルｂ）：１０μＭのＹ−２６７３２で処理後の細胞における細胞付着を示す。パネルｃ）：２０μＭのＹ−２６７３２で処理後の細胞における細胞付着を示す。
【図６】ポリカーボネート膜（表１の膜番号７）へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を示す。パネルａ）：対照ウェル内での細胞付着を示す。パネルｂ）：０．０３μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｃ）：０．１μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｄ）：０．３μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｅ）：１μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｆ）：３μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。
【図７】細胞培地からＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２を除去した後の、ポリカーボネート膜（表１の膜番号９）からのヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の剥離を示す。パネルａ）：３μＭのＨ−１１５２を培地中に維持したときの細胞の付着を示す。パネルｂ）：Ｈ−１１５２を培地から除去したときの細胞の剥離を示す。
【図８】表１の番号１０のポリカーボネート膜（パネルａ及びｃ）及び表１の番号１１のポリカーボネート膜（パネルｂ及びｄ）を含む平面支持体へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の付着に対する、膜の孔径及びＲｈｏキナーゼ阻害剤処理の影響を示す。パネルａ及びｂ）：３μＭのＨ−１１５２を培地中に維持したときの細胞の付着を示す。パネルｃ及びｄ）：Ｈ−１１５２を培地から除去したときの細胞の剥離を示す。
【図９】ポリカーボネート膜（表１の膜番号８）上で３回継代培養されたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の、多能性に関連するマーカー発現の維持を示す。図中に示される遺伝子発現は、リアルタイムＰＣＲで決定した。白抜き棒は、未分化ヒト胚性幹細胞株Ｈ１から得られたデータを示す。斜線棒は、ポリカーボネート膜上で培養された細胞から得られたデータを示す。
【図１０】ポリカーボネート膜（表１の膜番号８）上での１２回継代培養後における、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の胚様体形成能を示す。この図は、１回の実験から得られたデータを示す。
【図１１】本発明の平面支持体の走査電子顕微鏡写真を示す。
【図１２】ＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）平面支持体の走査電子顕微鏡写真を示す。
【図１３】ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の種々平面支持体への結合における、合成培地ｍＴＥＳＲ（商標）の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００３６】
定義
本明細書で使用するとき、「吸着層」とは、共有結合（グラフトとしても知られる）又は非共有結合（吸着としても知られる）によって固体支持体の表面上に分子を付着させることによって表面上に形成された層を指して言う。吸着層の形成に用いられる分子は、例えば、細胞外マトリクスタンパク質、アミノ酸などを含むタンパク性分子、及び例えば、ポリエチレンイミンなどの非生体分子であってよい。
【００３７】
「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１及び以下の転写因子：ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６の少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞を含む。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー：ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６．１、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー：ＨＮＦ３ β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカー：ＳＯＸ７、ＡＦＰ、又はＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す。
【００４３】
「細胞外マトリクスタンパク質」とは、身体又は胎盤の細胞間に通常見られるタンパク性分子を指して言う。細胞外マトリクスタンパク質は、組織、例えば、血液などの体液、又は非組み換え細胞若しくは組み換え細胞若しくは細菌によって調整した培地に由来するものを用いることができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象の細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー：ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、又はＧＡＴＡ６のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」は、以下のマーカー：Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８の少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」は、以下のマーカー：短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４の少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４９】
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００５０】
幹細胞は、それらの発達能力により：（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系統の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官又は生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系統の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系統を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００５１】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞等の特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００５２】
本明細書で使用するとき、「表面」は、細胞の培養又は分析に使用することを目的とした固体支持体容器又はマトリクスの分子の最外層を指して言う。表面の元素組成、粗さ、及び濡れ性は、それぞれ、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、及び接触角測定によって分析することができる。
【００５３】
様々な用語を用いて培養中の細胞を説明する。「維持」は、一般に、細胞集団の増加をもたらし得る又はもたらし得ない、細胞の成長及び／又は分裂を促進する条件下で、成長培地中に細胞を置くことを意味する。「継代」は、１つの培養容器から細胞を取り、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下で、それらを第２の培養容器に入れる工程を意味する。
【００５４】
特定の細胞集団又は細胞株は、しばしば継代された回数によって呼称されるか又は特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団はＰ１０培養と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と称される。最初の継代培養の後、細胞は２次培養（Ｐ１又は継代数１）と称される。２回目の継代培養の後では細胞は３次培養（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者であれば、継代期間中に集団は何度も倍加しうるものであり、したがってある培養の集団倍加の回数は継代数よりも大きいことは理解されるであろう。それぞれの継代間の期間における細胞の増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、支持体、培地、培養条件、及び継代間の時間等を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。
【００５５】
本発明の平面支持体
本発明で使用するのに好適な平面支持体は、その上に多能性細胞が付着できる支持体を提供することが可能な任意の材料で構成されてよい。例えば、平面支持体は、ポリカーボネートで構成されてよい。あるいは、平面支持体は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）で構成されてよい。あるいは、平面支持体は、ナイロンで構成されてよい。あるいは、平面支持体は、セルロースアセテートで構成されてよい。あるいは、平面支持体は、混合セルロースエステルで構成されてよい。本発明で使用するのに好適な平面支持体の例は表１に見出すことができる。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着、培養及び分化のための方法を提供する。少なくとも約８％〜少なくとも約１２％のＮ、及び少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含む平面支持体は、粗い線維性表面、又はあるいは、平滑な表面であってよい。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着方法を提供し、これは以下の工程を含む。
ａ．多能性幹細胞の懸濁液を得る工程
ｂ．平面支持体に細胞懸濁液を付加し、細胞を付着させる工程。
【００５８】
一実施形態では、多能性幹細胞は、表面に細胞が付着した後に培養中で維持される。一実施形態では、多能性幹細胞は、表面に細胞が付着した後に平面支持体上で分化される。
【００５９】
一実施形態では、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着は、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有するもので細胞を処理することにより増強される。Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物は、細胞が付着した後に除去されてよい。
【００６０】
Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物は、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２及びヒドロキシファスジルからなる群から選択される。
【００６１】
一実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物は、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、約１０μＭの濃度で使用される。
【００６２】
本発明の平面支持体の特徴
一実施形態では、本発明の平面支持体の表面の元素組成は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で分析できる。ＸＰＳは、化学分析用電子分光法（ＥＳＣＡ）としても知られ、固体支持体の表面にどのような元素又は原子が存在するかを調べ（水素及びヘリウムを除き、０．１原子％超の濃度のすべての元素を検出可能）、こうした元素又は原子の結合環境を調べるための方法として用いられる。
【００６３】
一実施形態では、本発明の平面支持体の表面の粗さは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）で分析できる。ＡＦＭによって表面の原子又は分子を横方向の解像度１オングストローム、縦方向の解像度０．１Åにまで画像化することが可能である。
【００６４】
一実施形態では、本発明の平面支持体の表面の濡れ性は、接触角測定により分析できる。例えば、静的固着液滴法による接触角測定により、固体支持体の表面と液体との間の相互作用についての情報が与えられる。接触角は、固体支持体の表面上に静止している液滴の形状を定義するものであり、液体、固体及び気体が出会う接触線において液体内部で測定される、固体支持体の表面上の液体の接触角である。水接触角が９０°よりも大きい表面は疎水性であるとされ、水接触角が９０°よりも小さい表面は親水性であるとされる。親水性が極めて高い表面、すなわち水に親和性が高い表面上では、水滴は完全に拡がる（有効接触角＝０°）。
【００６５】
一実施形態では、本発明の平面支持体の負電荷密度を、表面とクリスタルバイオレットとの反応性を測定することによって分析することができる。クリスタルバイオレットは正電荷を有し、これにより負に帯電した分子及び分子の部分、例えば、ポリマー表面上に存在する負に帯電した官能基に結合することができる。クリスタルバイオレット反応性が高い表面は、クリスタルバイオレット反応性が低い表面と比較した場合、これらの表面が同じ粗さ、したがって面積を有するものと仮定すると、負電荷の密度が高い。
【００６６】
多能性幹細胞
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現している（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現を消失させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増大させる。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ．）により説明されるように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、支持体としてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを使用して展開することにより検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、典型的にＯＣＴ−４及びＴＥＲＴも発現している。
【００６７】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３胚葉からの細胞型の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００６８】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいない。
【００６９】
多能性幹細胞の源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）等のヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。例えば、成体の体細胞などの非多能性細胞由来の多能性幹細胞も好適である。
【００７０】
一実施形態では、ヒト胚幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４、１９９５年）に記載されているように調製される。
【００７１】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞を、本発明の方法にしたがって培養するのに先立って、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞又は細胞外マトリクスタンパク質の層上で培養する。例えば、多能性幹細胞を、細胞を大きく分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するフィーダー細胞層上で培養する。フィーダー細胞層上での分化をともなわない多能性幹細胞の増殖は、（ｉ）フィーダー細胞層を含んだ培養容器を得て、（ｉｉ）別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は例えば、無血清又は更には化学合成培地などの非条件培地を用いることで支持される。
【００７２】
別の例では、多能性幹細胞を、基本的にフィーダー細胞を含まないにも関わらず、多能性幹細胞を大きく分化させることなくその増殖を支持する培養システム中で培養する。無フィーダー細胞培養中での分化をともなわない多能性幹細胞の増殖は、（ｉ）１以上の細胞外マトリクスタンパク質を有する固体支持体表面上の吸着層、及び（ｉｉ）別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は例えば、無血清又は更には化学合成培地などの非条件培地を用いることで支持される。
【００７３】
別の実施形態では、多能性幹細胞は、別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は例えば、無血清若しくは更には化学合成培地などの非条件培地中で、混合セルロースエステルを含む平面上で培養される。
【００７４】
培地：本発明における使用に適した細胞培地の一実施例を、米国特許出願公開第２００２００７２１１７号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許第６６４２０４８号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００７００１００１１号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０；１９ Ｏｃｔ ２００５）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許第６８００４８０号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０６５３５４号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０８６８４５号に見出すことができる。
【００７５】
好適な培地はまた、以下の成分、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９等から調製することもできる。
【００７６】
多能性幹細胞の分化
本発明の一実施形態では、多能性幹細胞をその多能性を維持しつつ培養中で増殖させる。細胞の多能性の時間による変化を、多能性に関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって調べることができる。また、多能性の変化を、分化に関連したマーカー又は別の細胞型に関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって監視することもできる。
【００７７】
別の実施形態では、多能性幹細胞を培養中で増殖させた後、別の細胞型への分化を促進するように処理する。他の細胞型は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。また、細胞型は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。また、細胞型は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。また、細胞型は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。
【００７８】
本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、当該術分野における任意の適当な方法によって他の様々な細胞型に分化させることができる。
【００７９】
例えば、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞などに分化させることができる。
【００８０】
例えば、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、国際特許出願公開第ＷＯ２００７０３０８７０号に開示される方法にしたがって神経前駆細胞及び心筋細胞に分化させることができる。
【００８１】
別の例では、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、米国特許第６，４５８，５８９号に開示される方法にしたがって肝細胞に分化させることができる。
【００８２】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１５３４〜１５４１，２００５に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８３】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１：１６５１〜１６６２，２００４に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８４】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：２９〜３８，２００７に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８５】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８６】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８７】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８８】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【００８９】
多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法によって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９０】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９１】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法により膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９２】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現している細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってよい。
【００９３】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現している。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【００９４】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：本発明の平面支持体へのヒト胚性幹細胞の付着。
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２６７３２は、表面修飾したプレート上へのヒト胚性幹細胞の付着を亢進することが示されている（米国特許出願第６１／０３０，５４４号参照）。本発明の実験の目的は、他の平面へのヒト胚性幹細胞の付着能を確認することであった。本発明において試験した平面を表１に示す。
【００９６】
試験前に、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、成長因子を１：３０に希釈して低減したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコーティングした細胞培養プレート上に広げた。細胞を、１００ｍｍ培養皿上で、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが添加されたＭＥＦ条件培地（ＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦ）１０ｍＬに播種した。この細胞を、５％ ＣＯ2雰囲気で加湿下、３７℃で培養した。培地は、毎日新しいＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦに交換した。細胞が約８０％コンフルエントに達したら、１ｍｇ／ｍＬのＬＩＢＥＲＡＳＥで５分間３７℃で処理することにより、細胞を継代した。皿から酵素を除き、細胞をＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦで洗うことによりダイジェスチョンを止めた。細胞を１０ｍＬのＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦ中に手作業でかき取って集め、５０ｍＬ容のコニカルチューブに移した。卓上型遠心分離器を用いて２００×ｇ（１０００ｒｐｍ）で細胞を遠心し、沈殿物を形成させた。上清を除いた後、細胞を４０ｍＬのＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦに再懸濁し、成長因子を１：３０に希釈して低減したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコーティングした１００ｍｍ培養皿４枚に均等に分けた。
【００９７】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、１００，０００細胞／ｃｍ2の密度で、表１に示す種々の平面支持体上に播種した。これら平面支持体は、吸着層及び線維芽細胞フィーダー細胞層を欠いていた。上記のように、ＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦ中で細胞を培養した。平面支持体への細胞付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を確認した。３μＭのＨ−１１５２を細胞播種に用いた培地に添加した。細胞を２４時間付着させた。この後、４％パラホルムアルデヒドを用いて５分間室温で細胞を固定した。次いで細胞を１％ヘマトキシリンで染色し、細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【００９８】
以下の膜：混合セルロースエステル膜（膜番号２、図１、パネルａ）、ナイロン膜（膜番号４、図１、パネルｂ）、及びセルロースアセテート膜（膜番号５、図１、パネルｃ）に、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞がＲｈｏキナーゼ阻害剤非依存的に付着した。これらの膜への細胞付着は、３μＭのＨ−１１５２の添加により増強した（図１、パネルａ〜ｃ参照）。
【００９９】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞は、以下の平面支持体：ポリカーボネート膜（膜番号７、図１、パネルｄ）及びポリエチレンテレフタレート膜（膜番号１２、図１、パネルｅ）への付着に、３μＭのＨ−１１５２の存在を必要とした。培地からＨ−１１５２を除くと、Ｈ１細胞の両方の種類の膜から剥離する結果となった。Ｈ−１１５２非存在下では、これらの膜への付着は観察されなかった。
【０１００】
実施例２：混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）へのヒト胚性幹細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ処理の影響。
実験操作に先立ち、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした皿上で培養した。混合セルロースエステル膜（膜番号１）に、ＭＥＦ条件培地中１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で細胞を播種した。この平面支持体は、吸着層及び線維芽細胞フィーダー細胞層を欠いていた。平面支持体への付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤処理の影響を調べた。細胞を、０、１０、又は２０μＭのＹ２６７３２で処理した。２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１０１】
Ｙ２６７３２非存在下で、細胞が平面支持体に付着することが観察された（図２、パネルａ）。１０及び２０μＭでＹ２６７３２を添加すると、平面支持体への細胞の付着が増加した（図２、パネルｂ及びｃ）。Ｙ２６７３２を培地から２４時間除いても、平面支持体から細胞が剥離する結果とならなかった。
【０１０２】
実施例３：ヒト胚性幹細胞の増殖速度に対する平面支持体膜番号１上での培養の影響。
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした皿上で培養されたヒト胚性幹細胞株の細胞、及び膜番号１上で培養された細胞の増殖速度を比較した。細胞を、両支持体上に同じ密度で播種した。細胞をＴｒｙｐＬＥ処理により支持体からはがし、単一細胞懸濁液を作製して、細胞数を計測した。細胞は、図３に示す時間にサンプリングした。同程度の速度で細胞が増殖することが観察された。倍加時間は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）及び膜番号１上で、それぞれ約１．１５１日及び１．１３８日である。
【０１０３】
実施例４：ヒト胚性幹細胞は、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上で３回継代する間、多能性を維持する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、混合セルロースエステル膜を含む平面支持体（膜番号１）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ−ＣＭ中、７５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。継代する前に、上記の方法に従って、約７５〜９０％コンフルエントに達するまで細胞を５〜６日間培養した。培地は毎日交換した。３回継代培養後、細胞を集め、多能性に関連するマーカーの発現をフローサイトメトリーで測定した。表２に示す様に、９５％を超える細胞が、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４など多能性に関連する細胞表面マーカーの発現を維持し、これらの細胞が依然として多能性であることを示した。
【０１０４】
実施例５：ヒト胚性幹細胞は、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上で１０回継代する間安定核型を維持する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした培養プレート、又は混合セルロースエステル膜のいずれかの上で、１０回継代して培養した。上記の方法に従って細胞を培養した。２０個のＧバンド染色した中期細胞を解析する細胞遺伝学的解析により、核型を決定した。図４に示すように、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした培養プレート（図４、パネルａ）上で培養した代表的な細胞、及び混合セルロース膜（図４、パネルｂ）上で培養した別の細胞のＧバンド染色した染色体は、正常な雄性核型を示した。
【０１０５】
染色体１２ｐプローブ及び１７ｑプローブを用いる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により２００個の間期核を調べて核型もまた決定し、通常の細胞遺伝学的手法では検出できない、１２番及び１７番染色体のコピー数が変化しているごくわずかな細胞集団を同定した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）上及び混合セルロースエステル膜上で培養した細胞では、１２及び／又は１７トリソミーである異常細胞は検出されなかった。
【０１０６】
実施例６：ヒト胚性幹細胞は、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上でインスリン産生細胞に分化できる。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ条件培地中、１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。表３に概略を示す分化手順に従って細胞を処理することにより、細胞はインスリン産生細胞に分化した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ条件培地中で、約７５〜９０％コンフルエントに達するまで細胞を３〜４日間培養した。細胞を、２％の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で２日間処理し、続いて、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、２％脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで更に２日間処理した。次に、細胞を、２％ ＢＳＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、及び２５０ｎＭシクロパミン−ＫＡＡＤを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で３日間処理し、続いて、１％ Ｂ２７サプリメント、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、２５０ｎＭシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で４日間処理した。細胞を、１％ Ｂ２７サプリメント、１μＭのＡＬＫ５阻害剤２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号：ＡＬＸ−２７０−４４５−Ｍ００１）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン−４、及び１μＭのＤＡＰＴを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で３日間処理した。細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、１％ Ｂ２７サプリメント、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤２中で７日間、１％ Ｂ２７サプリメントを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で更に７日間培養した。
【０１０７】
分化手順の終了時にＲＮＡサンプルを回収し、膵臓内分泌系統の特徴を示すマーカーの発現を測定した。インスリンのＣＴ値である約１７が観察された。ＧＡＰＤＨに相当するＣＴ値は約１９であり、これらのデータは、細胞が、処置後に高濃度のインスリンを発現したことを示唆した。
【０１０８】
実施例７：ヒト胚性幹細胞は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤依存的にポリカーボネート膜を含む平面支持体に付着する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ポリカーボネートを含む平面支持体（膜番号７）上に、ＭＥＦ条件培地中、１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。付着におけるＲｈｏキナーゼ阻害剤処理の影響を調べた。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２６７３２を０、１０、又は２０μＭの濃度で培地に添加した。２４時間後、膜上の細胞を室温で４％パラホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１０９】
対照皿において、細胞は膜に付着しない（図５、パネルａ）。Ｙ２６７３２を添加すると、膜上に細胞が付着する結果となった（図５、パネルｂ及びｃ）。
【０１１０】
別の実験で、膜番号７へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を測定した。細胞を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号７）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ−ＣＭ中、１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２を、０、０．０３、０．１、０．３、１、及び３μＭの濃度で培地に添加した。２４時間後、膜上の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１１１】
対照皿（図６、パネルａ）及び０．０３又は０．１μＭのＨ−１１５２を含む皿（図６、パネルｂ及びｃ）では、細胞は膜に付着しない。しかし、０．３、１、及び３μＭのＨ−１１５２で処理した培養細胞（図６、パネルｄ〜ｆ）では、付着がみられた。
【０１１２】
実施例８：培地からＲｈｏキナーゼ阻害剤を除去すると、ポリカーボネート膜を含む平面支持体からヒト胚性幹細胞が剥離する結果となる。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ポリカーボネートを含む平面支持体（膜番号９）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び３μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２を含有するＭＥＦ条件培地中、１００，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。細胞を２４時間培養した。その後、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、Ｈ−１１５２を欠くＭＥＦ条件培地に培地交換した。２４時間後、膜上の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。Ｈ−１１５２を含むウェルを対照として含めた。Ｈ−１１５２を培地から除くと、平面支持体から細胞が剥離する結果となった（図７）。
【０１１３】
実施例９：平面支持体の多孔性がヒト胚性幹細胞の付着に影響する。
以下の平面支持体：膜番号１０（孔径０．４μＭ）、及び膜番号１１（孔径３μＭ）上に、継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ条件培地中、１００，０００細胞／ｃｍ2の密度で細胞を播種した。平面支持体への細胞付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤の影響もまた調べた。細胞培地に、．３μＭのＨ−１１５２を添加した。２４時間後、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、Ｈ−１１５２を欠くＭＥＦ条件培地に培地交換した。更に２４時間培養後、膜上の細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。１μＭのＨ−１１５２を含むウェルを対照として含めた。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１１４】
膜番号１０（図８、パネルａ）に、膜番号１１（図８、パネルｂ）よりも多くの細胞が付着した。培地中に１μＭのＨ−１１５２が存在することが、膜上へのＨ１細胞付着の維持に必要である（図８、パネルａ及びｂ）。Ｈ−１１５２を培地から除くと、膜番号１０及び膜番号１１から細胞が剥離する結果となった（図８、パネルｃ及びｄ）。
【０１１５】
実施例１０：ヒト胚性幹細胞は、ポリカーボネート膜を含む平面支持体上で、複数回継代後も多能性を維持する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、３μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で細胞を培養した。細胞培地は毎日交換した。培地からＨ−１１５２を除去することにより細胞を継代し、細胞を穏やかにかき混ぜることにより平面支持体から取り除いた。細胞を３回継代して培養し、フローサイトメトリー及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために回収した。表４に示す様に、９５％を超える細胞が、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４などフローサイトメトリーで測定される多能性に関連する細胞表面マーカーを発現した。図９は、定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示しており、ポリカーボネート膜上で３回継代して培養されたＨ１で発現される複数の遺伝子が、未分化Ｈ１細胞でのレベルに匹敵することが示される。
【０１１６】
別の実験で、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、１μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で細胞を培養した。細胞培地は毎日交換した。培地からＨ−１１５２を除去することにより細胞を継代し、細胞を穏やかにかき混ぜることにより平面支持体から取り除いた。細胞を９回継代して培養し、フローサイトメトリーのために回収した。表５に示す様に、９５％を超える細胞が、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４など多能性に関連する細胞表面マーカーを発現する。
【０１１７】
多能性を評価する別の方法は、細胞の胚様体形成能によるものである。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、３μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で細胞を培養した。細胞培地は毎日交換した。培地からＨ−１１５２を除去することにより細胞を継代し、細胞を穏やかにかき混ぜることにより平面支持体から取り除いた。細胞を１２回継代して培養した。
【０１１８】
胚様体形成を以下の手順により行った。Ｈ１細胞を回収し、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号：３４７１）で、２０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。１日おきに培地の５０％を交換することにより、細胞に栄養分を供給した。１４日後に胚様体が形成された（図１０）。
【０１１９】
実施例１１：ヒト胚性幹細胞は、ポリカーボネート膜を含む平面支持体上で培養された後も胚体内胚葉を形成できる。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネートを含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、３μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で、まず細胞を培養した。続いて、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、１μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で、実験操作に先立ち、細胞を１０回継代して培養した。
【０１２０】
次いで、１：３０希釈ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした１００ｍｍの細胞培養プレート上に細胞を播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ条件培地中で、３日間細胞を培養した。次に、２％の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２内で２日間細胞を処理し、続いて、２％の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン、及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で更に２日間処理した。この後、ＴｒｙｐＬＥ処理により細胞を遊離させて単一細胞懸濁液を作製し、胚体内胚葉系の特徴を示すマーカーの発現をフローサイトメトリーにより判定した。
【０１２１】
表６に示すように、９０％を超える細胞が、ＣＤ９９及びＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の両方に陽性であり、１２％の細胞がＣＤ９に陽性でＣＸＣＲ４に陰性である。これらのデータは、細胞が胚体内胚葉に分化する能力を保持していることを示唆する。
【０１２２】
実施例１２：本発明の平面支持体の物理的特性。
本発明の平面支持体の表面の化学状態を測定した。表７〜１０は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）分析及び接触角を示す。ＸＰＳでは、約５０〜１００Åの分析深さを用いた。典型的には、９５％のシグナルが、この深さ内で生じる。
【０１２３】
膜１〜３は、同程度の濃度の酸素、炭素（主にＣ−Ｏ、及びＣ−（Ｃ，Ｈ）、高い確実性でＯ−Ｃ−Ｏとして）、及び窒素（ＮＯ3、ＮＯ2、及び、恐らくはＣ−Ｎ、及びＲ4−Ｎ+として）を含有していた。膜３は、微量のＮａ+及びＳＯx、並びにより高濃度のＣ−（Ｃ，Ｈ）も含有していた。膜４は、Ｃ−（Ｃ，Ｈ）、Ｃ−（Ｏ，Ｎ）、及び（Ｏ，Ｎ）−Ｃ＝Ｏ、並びに恐らくは微量のナトリウムを含んでいた。膜５は、主にＣ−Ｏを、またＣ−（Ｃ，Ｈ）及びＯ−Ｃ−Ｏ並びに／又はＯ−Ｃ＝Ｏを含んでいた。微量のＮａ+及びＳＯxも検出された。膜６〜１１は、Ｃ−（Ｃ，Ｈ）、Ｃ−Ｏ、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｎ、ＣＯ３、ｐ−ｐ*、及び微量のＲ4−Ｎ+、ＳＯx、並びにＮａ+又はＣｒ3+のいずれかを含んでいた。膜６の表面は、微量の塩素もまた含んでいる場合がある。微量のクロムは膜１０及び１１にのみ検出され、一方Ｎａ+は膜６〜９で検出された。膜１２の表面は、ＰＥＴに一致するＣ−（Ｃ，Ｈ）、Ｃ−Ｏ、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、及びｐｉ−ｐｉ*を含んでいた。微量の窒素及びナトリウムもまた検出された。
【０１２４】
図１１は、本発明の平面支持体の走査電子顕微鏡写真を示す。２種類の形態が観察された。１つ目の種類は、開いた網状線維を特徴とした。２つ目の種類は、表面全体に丸い穴が分散している平滑シートを特徴とした。
【０１２５】
表１０は、本発明の表面の接触角の測定値を示す。表面１〜５は、約１８°〜約３２°の接触角測定値を有した。多能性幹細胞は、表面１〜５への付着のためにＲｈｏキナーゼ活性の阻害剤の存在を必要としなかった。
【０１２６】
表面６〜１２は、約３２°を超える接触角測定値を有した。多能性幹細胞は、これら表面への付着のためにＲｈｏキナーゼ活性の阻害剤の存在を必要とした。
【０１２７】
実施例１３：ポリアミンからなる平面支持体への多能性幹細胞の付着。
ポリアミンからなる平面支持体を、米国特許第６７４３２７３、及びＳｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｍら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２６（２８）：５６２４〜５６３１；２００５に開示される方法に従って製造した。この平面支持体は、商標ＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）として市販されている。ＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）合成表面は、平均線維直径が２８０ｎｍのランダムに向いた電界紡糸ポリアミドナノ線維でできている。線維寸法の分布は、２００〜４００ｎｍである。最初に試験したＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）表面は、わずかに親水性の表面を有しており（カタログＮｏ．３８７０ＸＸ１）、一方２つ目の表面（カタログＮｏ．３８７１ＸＸ１）は、わずかに親水性で、正味正電荷のために遊離アミン基を有するナノ線維を提供するポリアミン材料でコーティングされていた。両表面とも、疎水性相互作用によるタンパク質吸収に非常に有効である。解像度５マイクロメートル及び倍率１０，０００Ｘの走査電子顕微鏡写真を図１２に示す。しかし、試験したＵＴＲＡＷＥＢ（商標）表面のどちらにも、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞は付着できなかった。
【０１２８】
実施例１４：本発明の平面支持体への多能性幹細胞の付着に対する合成培地の使用の影響。
以下の平面支持体：膜１（混合セルロースエステル）、膜４（ナイロン）、膜５（セルロースアセテート）及びニトロセルロース上に、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を播種した。合成培地ｍＴＥＳＲ（商標）で１：３に希釈して細胞を播種し、２４時間培養した。平行してＭＥＦ−条件培地で培養したものを対照として含めた。ｍＴＥＳＲ（商標）中での細胞の培養は、細胞の平面への付着能に影響しなかった。細胞は、膜１、４、及び５、及びニトロセルロースへ付着することができた。ｍＴＥＳＲ（商標）を用いて細胞の結合力が一番高い膜は、膜４であり、続いて膜５、これはニトロセルロースと同等であり、続いて膜１であった。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
【表５】
【０１３４】
【表６】
【０１３５】
【表７】
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
【表１０】
【０１３９】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許出願番号第６１／１１６，４５２号（２００８年１１月２０日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体上での多能性幹細胞の成長、増殖及び分化のための方法を目的とする。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物細胞の培養は、生命及び健康科学における多くのプロセスの１つである。足場依存性細胞を用いた哺乳動物細胞の培養及び分析用の容器は、容器の表面に細胞を付着させるために更なる表面処理を頻繁に必要とする、ガラス又は例えば、ポリスチレンのようなポリマーからしばしば形成される。こうした処理では、例えば、吸着、グラフト又はプラズマ重合法によって表面に吸着層を適用することを含む場合がある。また、こうした表面処理は、容器表面自体の化学改質によって行ってよく、これは、例えば、大気コロナ放電、高周波真空プラズマ、直流グロー放電、及びマイクロ波プラズマ処理によって行うことができる。
【０００４】
現在用いられている多能性幹細胞、特に胚性幹（ＥＳ）細胞の培養法は、例えば、胚性幹細胞を固体支持体表面上でフィーダー細胞層とともに培養する、又は固体支持体表面上で細胞外マトリクスタンパク質の吸着層とともに培養するといった複雑な培養条件を必要とする。これらの方法を用いた培養系では、培養される幹細胞の生物種とは異なる種から得られたフィーダー細胞又は細胞外マトリクスタンパク質（異種材料）をしばしば用いる。フィーダー細胞に接触させることで得られる培地、すなわち未分化のＥＳ細胞以外の細胞で調整した培地を使用してＥＳ細胞を培養することが可能であり、培地に動物血清を添加してもよい。
【０００５】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９〜４０４，２０００）及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７，１９９８）は、マウス胚性繊維芽細胞のフィーダー細胞層を用いたヒト胚盤胞からのＥＳ細胞株の培養について発表している。
【０００６】
別の例では、Ｘｕら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：９７１〜９７４，２００１）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体支持体表面を処理するためのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）及びラミニンの使用について発表している。別の例では、Ｖａｌｌｉｅｒら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１８：４４９５〜４５０９，２００５）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体支持体表面を処理するためのウシ胎児血清の使用について発表している。
【０００７】
別の例として、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための条件培地を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて作製される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と呼ばれる分化かつ不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって調整される」と述べている。
【０００８】
別の例として、Ｗａｎａｔａｂｅら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：６８１〜６８６，２００７）は、「ＲＯＣＫ阻害剤は、解離したヒト胚性幹細胞を生存させる」と記述しており、解離誘導性アポトーシスの低下によりクローニング効率が高くなる（約１％から約２７％へと）こと、及び、フィーダー細胞としてマウス胚性線維芽細胞を、細胞外マトリクスタンパク質としてコラーゲン及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、及びＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２すなわちファスジルを使用することにより、遺伝子導入後のサブクローニングが促進されることを示している。更に、Ｙ−２７６３２で処理した解離ヒトＥＳ細胞は、無血清懸濁培養中でアポトーシスから保護された。
【０００９】
別の例として、Ｐｅｅｒａｎｉら（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２６：４７４４〜４７５５，２００７）は、「ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養の空間的構造の複雑さにより、ｈＥＳＣの運命に影響する異成分からなる微小環境（ニッチ）が形成される」と記述している。この研究により、ｈＥＳＣ分化の速度及び道筋を、ｈＥＳＣのニッチの性質を操作することによって制御することが可能であることが示された。ニッチのサイズ及び組成によって、分化誘導因子と分化阻害因子とのバランスが調節される。機構的には、ｈＥＳＣとｈＥＳＣ由来の胚体外内胚葉（ＥｘＥ）とのアンタゴニスト相互作用によってＳｍａｄ１によるシグナル伝達のニッチサイズに依存した空間的勾配が生ずる。こうした相互作用は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）のＥｘＥによる、及びそのアンタゴニストである増殖分化因子３（ＧＤＦ３）のｈＥＣＳによる局所的分泌によって媒介される。ＧＤＦ３、ＢＭＰ２及びＳｍａｄ１に対し低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡによる処理、及びＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤による処理を行ったｈＥＳＣのマイクロパターニングによって、Ｓｍａｄ１活性化の独立した制御により、ｈＥＳＣのコロニーサイズ依存性分化が防御されることが示された。我々の結果は、ｈＥＳＣの自己複製及び分化の空間的情報の集積及びニッチサイズ依存性制御におけるＳｍａｄ１の役割を初めて示したものである。
【００１０】
別の例として、Ｋｏｙａｎａｇｉ，Ｍら（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２００８ Ｆｅｂ １；８６（２）：２７０〜８０）は、「Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼは、ニューロンを含む多くの細胞種のアポトーシスに関わっているが、その作用機構は完全に理解されていない」と記述している。今回、我々は胚性幹細胞由来の神経前駆細胞を移植した際のアポトーシスにおけるＲｈｏ及びＲＯＣＫの役割を調べた。我々は、神経前駆細胞の解離によってＲｈｏが活性化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。Ｒｈｏ阻害剤であるＣ３菌体外酵素及び／又はＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２による処理によって解離誘導性アポトーシス（アノイキス）が２０〜３０％減少した。アポトーシスの初期の形態的兆候である膜泡形成、カスパーゼ３の開裂、及びミトコンドリアからのシトクロムｃの放出もＲＯＣＫの阻害によって低減した。これらの結果は、神経前駆細胞の解離によって、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路を介して少なくとも部分的に媒介される内在的な細胞死の経路が誘導されることを示唆するものである。更に、動物移植モデルにおいて、Ｒｈｏ及び／又はＲＯＣＫの阻害によって移植細胞の急性アポトーシスが抑制された。移植後、移植片の周辺において腫瘍壊死因子α及びプロ神経成長因子の強い発現が認められた。ＲＯＣＫの阻害により、これらの炎症性サイトカインによって亢進するアポトーシスも抑制される。以上を総合すると、これらの結果は、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫによるシグナル伝達の阻害によって細胞置換療法における移植細胞の生存率が向上し得ることを示している。
【００１１】
異種成分材料の使用は、多能性幹細胞を用いる特定の用途では不適当な場合がある。代替的な材料を使用することが可能である。例えば、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：８９５〜９０２，２００５）は、ヒトＥＳ細胞を分化させることなく無フィーダー細胞培養を行う前に固体支持体表面を処理するためのヒト血清の使用について発表している。
【００１２】
代替的な一培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。
【００１３】
例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０；１９ Ｏｃｔ ２００５）は、ＥＳ細胞の自己複製を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非条件血清置換培地中でＥＳ細胞を維持する無フィーダー細胞、無血清培地システムを発表している。
【００１４】
別の例として、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、繊維芽細胞又は条件培地の非存在下で、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を添加した培地を使用してヒトＥＳ細胞を長期間培養する方法を発表している。
【００１５】
別の例として、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１種類のトランスフェリン又はトランスフェリン代用物質、少なくとも１種類のインスリン又はインスリン代用物質を含有する培地中で幹細胞を培養することを含む、無血清、無フィーダー線維芽細胞の合成培地中でヒトＥＳ細胞を培養するための方法であって、その培地は、哺乳動物胎児血清を基本的に含有せず、ＦＧＦシグナル伝達受容体を活性化することが可能な少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含有し、増殖因子は線維芽細胞フィーダー層以外の供給源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は条件培地なしで未分化状態の幹細胞の増殖を支持するようなものである方法を開示している。
【００１６】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。特定の培養中、この特定の培地は、基本培地、並びに実質的に未分化の始原幹細胞の増殖を支持するうえで必要とされる塩基性ＦＧＦ、インスリン及びアスコルビン酸のそれぞれの所定量を含有する。
【００１７】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態において、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで有効な低浸透圧、低内毒素の基本培地を含む、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地が提供される」と記述している。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導される細胞外支持体成分からなる群から選択される支持体と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を更に含む。
【００１８】
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する」と記述している。１つの方法は、哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい１つの形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。
【００１９】
別の例として、国際特許出願公開ＷＯ２００５０６５３５４号は、ａ．基本培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量の塩基性線維芽細胞増殖因子、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な所定量のアスコルビン酸を含む、基本的に無フィーダーかつ無血清の等張培地を開示している。
【００２０】
別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、未分化の幹細胞を維持するための方法であって、その方法が幹細胞を未分化状態に維持するのに充分な量のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のタンパク質ファミリーのメンバー、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のタンパク質ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間だけ、幹細胞を曝露することを含む方法、を開示している。
【００２１】
多能性幹細胞は、研究及び薬剤スクリーニングの潜在的供給源となる。現在のところ、ヒトＥＳ細胞株の大規模培養には問題が多く、大きな課題がある。これらの課題に対する可能な解決策の１つは、ヒトＥＳ細胞を単一細胞として継代及び培養することである。単一細胞は、例えば、細胞数測定、トランスフェクションなどの標準的な組織培養法により適合する。
【００２２】
例えば、Ｎｉｃｏｌａｓらは、レンチウイルスベクターによる遺伝子改変の後、蛍光活性化細胞選別法によって単離された単一細胞からヒトＥＳ細胞株を取得及び増殖させるための方法を提供している（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．１６：１０９〜１１８，２００７）。
【００２３】
別の例として、米国特許出願第２００５１５８８５２号は、「単一のヒト胚性幹細胞の増殖及び生存を向上させるための方法」を開示している。この方法は、単一の未分化ｈＥＳ細胞を得る工程と、単一の未分化細胞を細胞外マトリクスと混合して細胞を包囲する工程と、混合物を増殖環境中で栄養培地とともにフィーダー細胞上に接種する工程とを含む。
【００２４】
別の例として、Ｓｉｄｈｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．１５：６１〜６９，２００６）は、フローサイトメトリーによる単一細胞調製物の選別によって親細胞株ｈＥＳ３から誘導された３つのヒトＥＳ細胞クローンｈＥＳ３．１、３．２及び３．３について最初に報告している。
【００２５】
しかしながら、ヒトＥＳ細胞の単一細胞としての継代及び培養は、遺伝子的異常及び多能性の喪失につながる。培養条件は多能性及び遺伝子の安定性の維持に重要である。一般に、ヒトＥＳ細胞株の継代は人の手で行うか、あるいはコラゲナーゼ、リベラーゼ又はジスパーゼなどの酵素剤を使用して行われる。
【００２６】
例えば、Ｄｒａｐｅｒらは、「３系統の独立したヒト胚性幹細胞株において５回の独立した場合の１７ｑ染色体が獲得される核型の変化」の存在について記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５３〜５４，２００４）。
【００２７】
別の例として、Ｂｕｚｚａｒｄらは、「我々はこれまでに１つの核型変化の事象を検出したに過ぎない．．．我々の方法が他の多くのグループが使用した方法とは明らかに異なっていることを考えると、使用した培養方法が我々の結果になんらかの影響を与えた可能性がある。通常、我々は７日後のヒトＥＳ細胞を、折れたピペットの角で最初にコロニーを壊すことによって継代する．．．この方法では細胞を解離させるために酵素的又は化学的な方法を一切用いない。我々は、このことが我々のｈＥＳ（ヒトＥＳ）細胞が比較的細胞遺伝学的な回復力が高かったことを説明するのではないかと考えている。」と記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３８１〜３８２，２００４）。
【００２８】
別の例として、Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａらは、「大量継代法は．．．培養中で長期の継代の後、異数体の細胞集団を永続させ得るものであるが、核型に支障をきたすことなくより短期間（少なくとも継代数１５まで）で使用することも可能である．．．人の手による継代法のみによって得られるよりも大量のｈＥＳ細胞を必要とする実験では、人の手による継代条件下で長期の継代の後、限られた大量継代を行ってｈＥＳ細胞の正常な核型を維持することが可能かもしれない」と記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１９〜２０，２００５）。
【００２９】
別の例として、Ｈｅｎｇらは、「これらの結果により、第２のプロトコール（トリプシン処理をして静かにピペット攪拌）は、第１のプロトコール（コラゲナーゼ処理をして掻き落とす）よりも細胞の生存率に対する悪影響は大幅に低いことが示された。これは、ひいてはより高い凍結解凍後の生存率に結びついた。」と記述している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：３３〜３７，２００７）。
【００３０】
別の例として、Ｈａｓｅｇａｗａらは、「我々は完全な解離に耐えうるｈＥＳＣ亜系統を確立した。これらの細胞は、高い再プレーティング効率、更に高いクローニング効率を示し、三胚葉への分化能を維持している。」と記述している（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：２６４９〜２６６０，２００６）。
【００３１】
別の例として、米国特許出願第６１／０３０，５４４号は、少なくとも約０．９％〜少なくとも約１１％の窒素、及び少なくとも約１２％〜少なくとも約３０％の酸素を含み、吸着層及びフィーダー細胞を欠く固体支持体表面への細胞の付着、同表面での培養、及び同表面からの剥離のための方法及び組成物を提供する。本発明の一実施形態では、細胞をＲｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物で処理する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
細胞の多能性を維持しつつフィーダー細胞及び吸着層の非存在下で、多能性幹細胞を含む細胞の培養のための方法及び組成物が強く求められている。本発明は、吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体上での多能性幹細胞の成長、増殖及び分化のための方法を提供し、ここで細胞は、平面支持体に結合するために、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物での処理を必要としない。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
一実施形態では、本発明は、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着、培養及び分化のための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】平面支持体へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を示す。パネルａ）：混合セルロースエステル膜（表１の膜番号２）上への細胞付着を示す。パネルｂ）：ナイロン膜（表１の膜番号４）上への細胞付着を示す。パネルｃ）：セルロースアセテート膜（表１の膜番号５）上への細胞付着を示す。パネルｄ）：ポリカーボネート膜（表１の膜番号７）上への細胞付着を示す。パネルｅ）：ポリエチレンテレフタレート膜（表１の膜番号１２）上への細胞付着を示す。
【図２】混合セルロースエステル膜（表１の膜番号１）へのヒト胚性幹細胞株Ｈ９の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２６７３２の影響を示す。パネルａ）：対照ウェル内での細胞付着を示す。パネルｂ）：１０μＭのＹ−２６７３２で処理した細胞における細胞付着を示す。パネルｃ）：２０μＭのＹ−２６７３２で処理した細胞における細胞付着を示す。
【図３】ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティング面上（実線）及び混合セルロースエステル膜（表１の膜番号１）上（破線）のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の増殖曲線を示す。
【図４】ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の代表的な細胞のＧバンド染色した染色体を示す。パネルａ）：ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティング面で１０回継代培養された細胞の染色体を示す。パネルｂ）：混合セルロースエステル膜（表１の膜番号１）上で１０回継代培養された細胞の染色体を示す。
【図５】ポリカーボネート膜（表１の膜番号７）へのヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２６７３２の影響を示す。パネルａ）：対照ウェル内での細胞付着を示す。パネルｂ）：１０μＭのＹ−２６７３２で処理後の細胞における細胞付着を示す。パネルｃ）：２０μＭのＹ−２６７３２で処理後の細胞における細胞付着を示す。
【図６】ポリカーボネート膜（表１の膜番号７）へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を示す。パネルａ）：対照ウェル内での細胞付着を示す。パネルｂ）：０．０３μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｃ）：０．１μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｄ）：０．３μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｅ）：１μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。パネルｆ）：３μＭのＨ−１１５２を培地に添加したときの細胞付着を示す。
【図７】細胞培地からＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２を除去した後の、ポリカーボネート膜（表１の膜番号９）からのヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の剥離を示す。パネルａ）：３μＭのＨ−１１５２を培地中に維持したときの細胞の付着を示す。パネルｂ）：Ｈ−１１５２を培地から除去したときの細胞の剥離を示す。
【図８】表１の番号１０のポリカーボネート膜（パネルａ及びｃ）及び表１の番号１１のポリカーボネート膜（パネルｂ及びｄ）を含む平面支持体へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の付着に対する、膜の孔径及びＲｈｏキナーゼ阻害剤処理の影響を示す。パネルａ及びｂ）：３μＭのＨ−１１５２を培地中に維持したときの細胞の付着を示す。パネルｃ及びｄ）：Ｈ−１１５２を培地から除去したときの細胞の剥離を示す。
【図９】ポリカーボネート膜（表１の膜番号８）上で３回継代培養されたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の、多能性に関連するマーカー発現の維持を示す。図中に示される遺伝子発現は、リアルタイムＰＣＲで決定した。白抜き棒は、未分化ヒト胚性幹細胞株Ｈ１から得られたデータを示す。斜線棒は、ポリカーボネート膜上で培養された細胞から得られたデータを示す。
【図１０】ポリカーボネート膜（表１の膜番号８）上での１２回継代培養後における、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の胚様体形成能を示す。この図は、１回の実験から得られたデータを示す。
【図１１】本発明の平面支持体の走査電子顕微鏡写真を示す。
【図１２】ＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）平面支持体の走査電子顕微鏡写真を示す。
【図１３】ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の種々平面支持体への結合における、合成培地ｍＴＥＳＲ（商標）の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００３６】
定義
本明細書で使用するとき、「吸着層」とは、共有結合（グラフトとしても知られる）又は非共有結合（吸着としても知られる）によって固体支持体の表面上に分子を付着させることによって表面上に形成された層を指して言う。吸着層の形成に用いられる分子は、例えば、細胞外マトリクスタンパク質、アミノ酸などを含むタンパク性分子、及び例えば、ポリエチレンイミンなどの非生体分子であってよい。
【００３７】
「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ−１及び以下の転写因子：ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６の少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞を含む。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー：ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６．１、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー：ＨＮＦ３ β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカー：ＳＯＸ７、ＡＦＰ、又はＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す。
【００４３】
「細胞外マトリクスタンパク質」とは、身体又は胎盤の細胞間に通常見られるタンパク性分子を指して言う。細胞外マトリクスタンパク質は、組織、例えば、血液などの体液、又は非組み換え細胞若しくは組み換え細胞若しくは細菌によって調整した培地に由来するものを用いることができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象の細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー：ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、又はＧＡＴＡ６のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」は、以下のマーカー：Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８の少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」は、以下のマーカー：短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４の少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００４９】
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００５０】
幹細胞は、それらの発達能力により：（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系統の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官又は生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系統の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系統を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００５１】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞等の特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００５２】
本明細書で使用するとき、「表面」は、細胞の培養又は分析に使用することを目的とした固体支持体容器又はマトリクスの分子の最外層を指して言う。表面の元素組成、粗さ、及び濡れ性は、それぞれ、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、及び接触角測定によって分析することができる。
【００５３】
様々な用語を用いて培養中の細胞を説明する。「維持」は、一般に、細胞集団の増加をもたらし得る又はもたらし得ない、細胞の成長及び／又は分裂を促進する条件下で、成長培地中に細胞を置くことを意味する。「継代」は、１つの培養容器から細胞を取り、細胞の増殖及び／又は分裂を促進する条件下で、それらを第２の培養容器に入れる工程を意味する。
【００５４】
特定の細胞集団又は細胞株は、しばしば継代された回数によって呼称されるか又は特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団はＰ１０培養と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養はＰ０と称される。最初の継代培養の後、細胞は２次培養（Ｐ１又は継代数１）と称される。２回目の継代培養の後では細胞は３次培養（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者であれば、継代期間中に集団は何度も倍加しうるものであり、したがってある培養の集団倍加の回数は継代数よりも大きいことは理解されるであろう。それぞれの継代間の期間における細胞の増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、支持体、培地、培養条件、及び継代間の時間等を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。
【００５５】
本発明の平面支持体
本発明で使用するのに好適な平面支持体は、その上に多能性細胞が付着できる支持体を提供することが可能な任意の材料で構成されてよい。例えば、平面支持体は、ポリカーボネートで構成されてよい。あるいは、平面支持体は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）で構成されてよい。あるいは、平面支持体は、ナイロンで構成されてよい。あるいは、平面支持体は、セルロースアセテートで構成されてよい。あるいは、平面支持体は、混合セルロースエステルで構成されてよい。本発明で使用するのに好適な平面支持体の例は表１に見出すことができる。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着、培養及び分化のための方法を提供する。少なくとも約８％〜少なくとも約１２％のＮ、及び少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含む平面支持体は、粗い線維性表面、又はあるいは、平滑な表面であってよい。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着方法を提供し、これは以下の工程を含む。
ａ．多能性幹細胞の懸濁液を得る工程
ｂ．平面支持体に細胞懸濁液を付加し、細胞を付着させる工程。
【００５８】
一実施形態では、多能性幹細胞は、表面に細胞が付着した後に培養中で維持される。一実施形態では、多能性幹細胞は、表面に細胞が付着した後に平面支持体上で分化される。
【００５９】
一実施形態では、約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着は、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有するもので細胞を処理することにより増強される。Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物は、細胞が付着した後に除去されてよい。
【００６０】
Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物は、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２及びヒドロキシファスジルからなる群から選択される。
【００６１】
一実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物は、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する少なくとも１つの化合物は、約１０μＭの濃度で使用される。
【００６２】
本発明の平面支持体の特徴
一実施形態では、本発明の平面支持体の表面の元素組成は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で分析できる。ＸＰＳは、化学分析用電子分光法（ＥＳＣＡ）としても知られ、固体支持体の表面にどのような元素又は原子が存在するかを調べ（水素及びヘリウムを除き、０．１原子％超の濃度のすべての元素を検出可能）、こうした元素又は原子の結合環境を調べるための方法として用いられる。
【００６３】
一実施形態では、本発明の平面支持体の表面の粗さは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）で分析できる。ＡＦＭによって表面の原子又は分子を横方向の解像度１オングストローム、縦方向の解像度０．１Åにまで画像化することが可能である。
【００６４】
一実施形態では、本発明の平面支持体の表面の濡れ性は、接触角測定により分析できる。例えば、静的固着液滴法による接触角測定により、固体支持体の表面と液体との間の相互作用についての情報が与えられる。接触角は、固体支持体の表面上に静止している液滴の形状を定義するものであり、液体、固体及び気体が出会う接触線において液体内部で測定される、固体支持体の表面上の液体の接触角である。水接触角が９０°よりも大きい表面は疎水性であるとされ、水接触角が９０°よりも小さい表面は親水性であるとされる。親水性が極めて高い表面、すなわち水に親和性が高い表面上では、水滴は完全に拡がる（有効接触角＝０°）。
【００６５】
一実施形態では、本発明の平面支持体の負電荷密度を、表面とクリスタルバイオレットとの反応性を測定することによって分析することができる。クリスタルバイオレットは正電荷を有し、これにより負に帯電した分子及び分子の部分、例えば、ポリマー表面上に存在する負に帯電した官能基に結合することができる。クリスタルバイオレット反応性が高い表面は、クリスタルバイオレット反応性が低い表面と比較した場合、これらの表面が同じ粗さ、したがって面積を有するものと仮定すると、負電荷の密度が高い。
【００６６】
多能性幹細胞
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現している（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現を消失させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増大させる。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ．）により説明されるように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、支持体としてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを使用して展開することにより検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、典型的にＯＣＴ−４及びＴＥＲＴも発現している。
【００６７】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３胚葉からの細胞型の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００６８】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいない。
【００６９】
多能性幹細胞の源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）等のヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。例えば、成体の体細胞などの非多能性細胞由来の多能性幹細胞も好適である。
【００７０】
一実施形態では、ヒト胚幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４、１９９５年）に記載されているように調製される。
【００７１】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞を、本発明の方法にしたがって培養するのに先立って、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞又は細胞外マトリクスタンパク質の層上で培養する。例えば、多能性幹細胞を、細胞を大きく分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するフィーダー細胞層上で培養する。フィーダー細胞層上での分化をともなわない多能性幹細胞の増殖は、（ｉ）フィーダー細胞層を含んだ培養容器を得て、（ｉｉ）別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は例えば、無血清又は更には化学合成培地などの非条件培地を用いることで支持される。
【００７２】
別の例では、多能性幹細胞を、基本的にフィーダー細胞を含まないにも関わらず、多能性幹細胞を大きく分化させることなくその増殖を支持する培養システム中で培養する。無フィーダー細胞培養中での分化をともなわない多能性幹細胞の増殖は、（ｉ）１以上の細胞外マトリクスタンパク質を有する固体支持体表面上の吸着層、及び（ｉｉ）別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は例えば、無血清又は更には化学合成培地などの非条件培地を用いることで支持される。
【００７３】
別の実施形態では、多能性幹細胞は、別の細胞型と予め培養することによって調整した培地、又は例えば、無血清若しくは更には化学合成培地などの非条件培地中で、混合セルロースエステルを含む平面上で培養される。
【００７４】
培地：本発明における使用に適した細胞培地の一実施例を、米国特許出願公開第２００２００７２１１７号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許第６６４２０４８号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０１４７９９号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００７００１００１１号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０；１９ Ｏｃｔ ２００５）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許第６８００４８０号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０６５３５４号に見出すことができる。本発明における使用に適した細胞培地の別の実施例を、国際特許出願公開第ＷＯ２００５０８６８４５号に見出すことができる。
【００７５】
好適な培地はまた、以下の成分、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９等から調製することもできる。
【００７６】
多能性幹細胞の分化
本発明の一実施形態では、多能性幹細胞をその多能性を維持しつつ培養中で増殖させる。細胞の多能性の時間による変化を、多能性に関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって調べることができる。また、多能性の変化を、分化に関連したマーカー又は別の細胞型に関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって監視することもできる。
【００７７】
別の実施形態では、多能性幹細胞を培養中で増殖させた後、別の細胞型への分化を促進するように処理する。他の細胞型は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。また、細胞型は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。また、細胞型は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。また、細胞型は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってよい。
【００７８】
本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、当該術分野における任意の適当な方法によって他の様々な細胞型に分化させることができる。
【００７９】
例えば、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞などに分化させることができる。
【００８０】
例えば、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、国際特許出願公開第ＷＯ２００７０３０８７０号に開示される方法にしたがって神経前駆細胞及び心筋細胞に分化させることができる。
【００８１】
別の例では、本発明の方法にしたがって処理された多能性幹細胞は、米国特許第６，４５８，５８９号に開示される方法にしたがって肝細胞に分化させることができる。
【００８２】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１５３４〜１５４１，２００５に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８３】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１：１６５１〜１６６２，２００４に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８４】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：２９〜３８，２００７に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８５】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８６】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８７】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００８８】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【００８９】
多能性幹細胞は、当該技術分野における任意の方法によって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９０】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法にしたがって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９１】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１３９２〜１４０１，２００６に開示される方法により膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
【００９２】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ−１ αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現している細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってよい。
【００９３】
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現している。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【００９４】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：本発明の平面支持体へのヒト胚性幹細胞の付着。
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２６７３２は、表面修飾したプレート上へのヒト胚性幹細胞の付着を亢進することが示されている（米国特許出願第６１／０３０，５４４号参照）。本発明の実験の目的は、他の平面へのヒト胚性幹細胞の付着能を確認することであった。本発明において試験した平面を表１に示す。
【００９６】
試験前に、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、成長因子を１：３０に希釈して低減したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコーティングした細胞培養プレート上に広げた。細胞を、１００ｍｍ培養皿上で、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが添加されたＭＥＦ条件培地（ＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦ）１０ｍＬに播種した。この細胞を、５％ ＣＯ2雰囲気で加湿下、３７℃で培養した。培地は、毎日新しいＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦに交換した。細胞が約８０％コンフルエントに達したら、１ｍｇ／ｍＬのＬＩＢＥＲＡＳＥで５分間３７℃で処理することにより、細胞を継代した。皿から酵素を除き、細胞をＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦで洗うことによりダイジェスチョンを止めた。細胞を１０ｍＬのＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦ中に手作業でかき取って集め、５０ｍＬ容のコニカルチューブに移した。卓上型遠心分離器を用いて２００×ｇ（１０００ｒｐｍ）で細胞を遠心し、沈殿物を形成させた。上清を除いた後、細胞を４０ｍＬのＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦに再懸濁し、成長因子を１：３０に希釈して低減したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をコーティングした１００ｍｍ培養皿４枚に均等に分けた。
【００９７】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、１００，０００細胞／ｃｍ2の密度で、表１に示す種々の平面支持体上に播種した。これら平面支持体は、吸着層及び線維芽細胞フィーダー細胞層を欠いていた。上記のように、ＭＥＦ−ＣＭ／ｂＦＧＦ中で細胞を培養した。平面支持体への細胞付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を確認した。３μＭのＨ−１１５２を細胞播種に用いた培地に添加した。細胞を２４時間付着させた。この後、４％パラホルムアルデヒドを用いて５分間室温で細胞を固定した。次いで細胞を１％ヘマトキシリンで染色し、細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【００９８】
以下の膜：混合セルロースエステル膜（膜番号２、図１、パネルａ）、ナイロン膜（膜番号４、図１、パネルｂ）、及びセルロースアセテート膜（膜番号５、図１、パネルｃ）に、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞がＲｈｏキナーゼ阻害剤非依存的に付着した。これらの膜への細胞付着は、３μＭのＨ−１１５２の添加により増強した（図１、パネルａ〜ｃ参照）。
【００９９】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞は、以下の平面支持体：ポリカーボネート膜（膜番号７、図１、パネルｄ）及びポリエチレンテレフタレート膜（膜番号１２、図１、パネルｅ）への付着に、３μＭのＨ−１１５２の存在を必要とした。培地からＨ−１１５２を除くと、Ｈ１細胞の両方の種類の膜から剥離する結果となった。Ｈ−１１５２非存在下では、これらの膜への付着は観察されなかった。
【０１００】
実施例２：混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）へのヒト胚性幹細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ処理の影響。
実験操作に先立ち、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした皿上で培養した。混合セルロースエステル膜（膜番号１）に、ＭＥＦ条件培地中１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で細胞を播種した。この平面支持体は、吸着層及び線維芽細胞フィーダー細胞層を欠いていた。平面支持体への付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤処理の影響を調べた。細胞を、０、１０、又は２０μＭのＹ２６７３２で処理した。２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１０１】
Ｙ２６７３２非存在下で、細胞が平面支持体に付着することが観察された（図２、パネルａ）。１０及び２０μＭでＹ２６７３２を添加すると、平面支持体への細胞の付着が増加した（図２、パネルｂ及びｃ）。Ｙ２６７３２を培地から２４時間除いても、平面支持体から細胞が剥離する結果とならなかった。
【０１０２】
実施例３：ヒト胚性幹細胞の増殖速度に対する平面支持体膜番号１上での培養の影響。
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした皿上で培養されたヒト胚性幹細胞株の細胞、及び膜番号１上で培養された細胞の増殖速度を比較した。細胞を、両支持体上に同じ密度で播種した。細胞をＴｒｙｐＬＥ処理により支持体からはがし、単一細胞懸濁液を作製して、細胞数を計測した。細胞は、図３に示す時間にサンプリングした。同程度の速度で細胞が増殖することが観察された。倍加時間は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）及び膜番号１上で、それぞれ約１．１５１日及び１．１３８日である。
【０１０３】
実施例４：ヒト胚性幹細胞は、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上で３回継代する間、多能性を維持する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、混合セルロースエステル膜を含む平面支持体（膜番号１）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ−ＣＭ中、７５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。継代する前に、上記の方法に従って、約７５〜９０％コンフルエントに達するまで細胞を５〜６日間培養した。培地は毎日交換した。３回継代培養後、細胞を集め、多能性に関連するマーカーの発現をフローサイトメトリーで測定した。表２に示す様に、９５％を超える細胞が、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４など多能性に関連する細胞表面マーカーの発現を維持し、これらの細胞が依然として多能性であることを示した。
【０１０４】
実施例５：ヒト胚性幹細胞は、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上で１０回継代する間安定核型を維持する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした培養プレート、又は混合セルロースエステル膜のいずれかの上で、１０回継代して培養した。上記の方法に従って細胞を培養した。２０個のＧバンド染色した中期細胞を解析する細胞遺伝学的解析により、核型を決定した。図４に示すように、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした培養プレート（図４、パネルａ）上で培養した代表的な細胞、及び混合セルロース膜（図４、パネルｂ）上で培養した別の細胞のＧバンド染色した染色体は、正常な雄性核型を示した。
【０１０５】
染色体１２ｐプローブ及び１７ｑプローブを用いる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により２００個の間期核を調べて核型もまた決定し、通常の細胞遺伝学的手法では検出できない、１２番及び１７番染色体のコピー数が変化しているごくわずかな細胞集団を同定した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）上及び混合セルロースエステル膜上で培養した細胞では、１２及び／又は１７トリソミーである異常細胞は検出されなかった。
【０１０６】
実施例６：ヒト胚性幹細胞は、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上でインスリン産生細胞に分化できる。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、混合セルロースエステルを含む平面支持体（膜番号１）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ条件培地中、１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。表３に概略を示す分化手順に従って細胞を処理することにより、細胞はインスリン産生細胞に分化した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ条件培地中で、約７５〜９０％コンフルエントに達するまで細胞を３〜４日間培養した。細胞を、２％の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で２日間処理し、続いて、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、２％脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで更に２日間処理した。次に、細胞を、２％ ＢＳＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、及び２５０ｎＭシクロパミン−ＫＡＡＤを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で３日間処理し、続いて、１％ Ｂ２７サプリメント、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、２５０ｎＭシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で４日間処理した。細胞を、１％ Ｂ２７サプリメント、１μＭのＡＬＫ５阻害剤２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号：ＡＬＸ−２７０−４４５−Ｍ００１）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン−４、及び１μＭのＤＡＰＴを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で３日間処理した。細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、１％ Ｂ２７サプリメント、及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤２中で７日間、１％ Ｂ２７サプリメントを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で更に７日間培養した。
【０１０７】
分化手順の終了時にＲＮＡサンプルを回収し、膵臓内分泌系統の特徴を示すマーカーの発現を測定した。インスリンのＣＴ値である約１７が観察された。ＧＡＰＤＨに相当するＣＴ値は約１９であり、これらのデータは、細胞が、処置後に高濃度のインスリンを発現したことを示唆した。
【０１０８】
実施例７：ヒト胚性幹細胞は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤依存的にポリカーボネート膜を含む平面支持体に付着する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ポリカーボネートを含む平面支持体（膜番号７）上に、ＭＥＦ条件培地中、１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。付着におけるＲｈｏキナーゼ阻害剤処理の影響を調べた。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２６７３２を０、１０、又は２０μＭの濃度で培地に添加した。２４時間後、膜上の細胞を室温で４％パラホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１０９】
対照皿において、細胞は膜に付着しない（図５、パネルａ）。Ｙ２６７３２を添加すると、膜上に細胞が付着する結果となった（図５、パネルｂ及びｃ）。
【０１１０】
別の実験で、膜番号７へのヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞の付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２の影響を測定した。細胞を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号７）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ−ＣＭ中、１５０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２を、０、０．０３、０．１、０．３、１、及び３μＭの濃度で培地に添加した。２４時間後、膜上の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１１１】
対照皿（図６、パネルａ）及び０．０３又は０．１μＭのＨ−１１５２を含む皿（図６、パネルｂ及びｃ）では、細胞は膜に付着しない。しかし、０．３、１、及び３μＭのＨ−１１５２で処理した培養細胞（図６、パネルｄ〜ｆ）では、付着がみられた。
【０１１２】
実施例８：培地からＲｈｏキナーゼ阻害剤を除去すると、ポリカーボネート膜を含む平面支持体からヒト胚性幹細胞が剥離する結果となる。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ポリカーボネートを含む平面支持体（膜番号９）上に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び３μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｈ−１１５２を含有するＭＥＦ条件培地中、１００，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。細胞を２４時間培養した。その後、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、Ｈ−１１５２を欠くＭＥＦ条件培地に培地交換した。２４時間後、膜上の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。Ｈ−１１５２を含むウェルを対照として含めた。Ｈ−１１５２を培地から除くと、平面支持体から細胞が剥離する結果となった（図７）。
【０１１３】
実施例９：平面支持体の多孔性がヒト胚性幹細胞の付着に影響する。
以下の平面支持体：膜番号１０（孔径０．４μＭ）、及び膜番号１１（孔径３μＭ）上に、継代数４２のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ条件培地中、１００，０００細胞／ｃｍ2の密度で細胞を播種した。平面支持体への細胞付着に対するＲｈｏキナーゼ阻害剤の影響もまた調べた。細胞培地に、．３μＭのＨ−１１５２を添加した。２４時間後、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、Ｈ−１１５２を欠くＭＥＦ条件培地に培地交換した。更に２４時間培養後、膜上の細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢＳで洗浄し、風乾し、クリスタルバイオレット染料で染色した。１μＭのＨ−１１５２を含むウェルを対照として含めた。細胞数を光学顕微鏡検査で計測した。溶媒を含むウェルを対照として含めた。
【０１１４】
膜番号１０（図８、パネルａ）に、膜番号１１（図８、パネルｂ）よりも多くの細胞が付着した。培地中に１μＭのＨ−１１５２が存在することが、膜上へのＨ１細胞付着の維持に必要である（図８、パネルａ及びｂ）。Ｈ−１１５２を培地から除くと、膜番号１０及び膜番号１１から細胞が剥離する結果となった（図８、パネルｃ及びｄ）。
【０１１５】
実施例１０：ヒト胚性幹細胞は、ポリカーボネート膜を含む平面支持体上で、複数回継代後も多能性を維持する。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、３μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で細胞を培養した。細胞培地は毎日交換した。培地からＨ−１１５２を除去することにより細胞を継代し、細胞を穏やかにかき混ぜることにより平面支持体から取り除いた。細胞を３回継代して培養し、フローサイトメトリー及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために回収した。表４に示す様に、９５％を超える細胞が、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４などフローサイトメトリーで測定される多能性に関連する細胞表面マーカーを発現した。図９は、定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示しており、ポリカーボネート膜上で３回継代して培養されたＨ１で発現される複数の遺伝子が、未分化Ｈ１細胞でのレベルに匹敵することが示される。
【０１１６】
別の実験で、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、１μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で細胞を培養した。細胞培地は毎日交換した。培地からＨ−１１５２を除去することにより細胞を継代し、細胞を穏やかにかき混ぜることにより平面支持体から取り除いた。細胞を９回継代して培養し、フローサイトメトリーのために回収した。表５に示す様に、９５％を超える細胞が、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４など多能性に関連する細胞表面マーカーを発現する。
【０１１７】
多能性を評価する別の方法は、細胞の胚様体形成能によるものである。ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネート膜を含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、３μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で細胞を培養した。細胞培地は毎日交換した。培地からＨ−１１５２を除去することにより細胞を継代し、細胞を穏やかにかき混ぜることにより平面支持体から取り除いた。細胞を１２回継代して培養した。
【０１１８】
胚様体形成を以下の手順により行った。Ｈ１細胞を回収し、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号：３４７１）で、２０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。１日おきに培地の５０％を交換することにより、細胞に栄養分を供給した。１４日後に胚様体が形成された（図１０）。
【０１１９】
実施例１１：ヒト胚性幹細胞は、ポリカーボネート膜を含む平面支持体上で培養された後も胚体内胚葉を形成できる。
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１を、ポリカーボネートを含む平面支持体（膜番号８）上に播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、３μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で、まず細胞を培養した。続いて、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有し、１μＭのＨ−１１５２を添加したＭＥＦ条件培地中で、実験操作に先立ち、細胞を１０回継代して培養した。
【０１２０】
次いで、１：３０希釈ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングした１００ｍｍの細胞培養プレート上に細胞を播種した。２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＭＥＦ条件培地中で、３日間細胞を培養した。次に、２％の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２内で２日間細胞を処理し、続いて、２％の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン、及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で更に２日間処理した。この後、ＴｒｙｐＬＥ処理により細胞を遊離させて単一細胞懸濁液を作製し、胚体内胚葉系の特徴を示すマーカーの発現をフローサイトメトリーにより判定した。
【０１２１】
表６に示すように、９０％を超える細胞が、ＣＤ９９及びＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の両方に陽性であり、１２％の細胞がＣＤ９に陽性でＣＸＣＲ４に陰性である。これらのデータは、細胞が胚体内胚葉に分化する能力を保持していることを示唆する。
【０１２２】
実施例１２：本発明の平面支持体の物理的特性。
本発明の平面支持体の表面の化学状態を測定した。表７〜１０は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）分析及び接触角を示す。ＸＰＳでは、約５０〜１００Åの分析深さを用いた。典型的には、９５％のシグナルが、この深さ内で生じる。
【０１２３】
膜１〜３は、同程度の濃度の酸素、炭素（主にＣ−Ｏ、及びＣ−（Ｃ，Ｈ）、高い確実性でＯ−Ｃ−Ｏとして）、及び窒素（ＮＯ3、ＮＯ2、及び、恐らくはＣ−Ｎ、及びＲ4−Ｎ+として）を含有していた。膜３は、微量のＮａ+及びＳＯx、並びにより高濃度のＣ−（Ｃ，Ｈ）も含有していた。膜４は、Ｃ−（Ｃ，Ｈ）、Ｃ−（Ｏ，Ｎ）、及び（Ｏ，Ｎ）−Ｃ＝Ｏ、並びに恐らくは微量のナトリウムを含んでいた。膜５は、主にＣ−Ｏを、またＣ−（Ｃ，Ｈ）及びＯ−Ｃ−Ｏ並びに／又はＯ−Ｃ＝Ｏを含んでいた。微量のＮａ+及びＳＯxも検出された。膜６〜１１は、Ｃ−（Ｃ，Ｈ）、Ｃ−Ｏ、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｎ、ＣＯ３、ｐ−ｐ*、及び微量のＲ4−Ｎ+、ＳＯx、並びにＮａ+又はＣｒ3+のいずれかを含んでいた。膜６の表面は、微量の塩素もまた含んでいる場合がある。微量のクロムは膜１０及び１１にのみ検出され、一方Ｎａ+は膜６〜９で検出された。膜１２の表面は、ＰＥＴに一致するＣ−（Ｃ，Ｈ）、Ｃ−Ｏ、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、及びｐｉ−ｐｉ*を含んでいた。微量の窒素及びナトリウムもまた検出された。
【０１２４】
図１１は、本発明の平面支持体の走査電子顕微鏡写真を示す。２種類の形態が観察された。１つ目の種類は、開いた網状線維を特徴とした。２つ目の種類は、表面全体に丸い穴が分散している平滑シートを特徴とした。
【０１２５】
表１０は、本発明の表面の接触角の測定値を示す。表面１〜５は、約１８°〜約３２°の接触角測定値を有した。多能性幹細胞は、表面１〜５への付着のためにＲｈｏキナーゼ活性の阻害剤の存在を必要としなかった。
【０１２６】
表面６〜１２は、約３２°を超える接触角測定値を有した。多能性幹細胞は、これら表面への付着のためにＲｈｏキナーゼ活性の阻害剤の存在を必要とした。
【０１２７】
実施例１３：ポリアミンからなる平面支持体への多能性幹細胞の付着。
ポリアミンからなる平面支持体を、米国特許第６７４３２７３、及びＳｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｍら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２６（２８）：５６２４〜５６３１；２００５に開示される方法に従って製造した。この平面支持体は、商標ＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）として市販されている。ＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）合成表面は、平均線維直径が２８０ｎｍのランダムに向いた電界紡糸ポリアミドナノ線維でできている。線維寸法の分布は、２００〜４００ｎｍである。最初に試験したＵＬＴＲＡＷＥＢ（商標）表面は、わずかに親水性の表面を有しており（カタログＮｏ．３８７０ＸＸ１）、一方２つ目の表面（カタログＮｏ．３８７１ＸＸ１）は、わずかに親水性で、正味正電荷のために遊離アミン基を有するナノ線維を提供するポリアミン材料でコーティングされていた。両表面とも、疎水性相互作用によるタンパク質吸収に非常に有効である。解像度５マイクロメートル及び倍率１０，０００Ｘの走査電子顕微鏡写真を図１２に示す。しかし、試験したＵＴＲＡＷＥＢ（商標）表面のどちらにも、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞は付着できなかった。
【０１２８】
実施例１４：本発明の平面支持体への多能性幹細胞の付着に対する合成培地の使用の影響。
以下の平面支持体：膜１（混合セルロースエステル）、膜４（ナイロン）、膜５（セルロースアセテート）及びニトロセルロース上に、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を播種した。合成培地ｍＴＥＳＲ（商標）で１：３に希釈して細胞を播種し、２４時間培養した。平行してＭＥＦ−条件培地で培養したものを対照として含めた。ｍＴＥＳＲ（商標）中での細胞の培養は、細胞の平面への付着能に影響しなかった。細胞は、膜１、４、及び５、及びニトロセルロースへ付着することができた。ｍＴＥＳＲ（商標）を用いて細胞の結合力が一番高い膜は、膜４であり、続いて膜５、これはニトロセルロースと同等であり、続いて膜１であった。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
【表５】
【０１３４】
【表６】
【０１３５】
【表７】
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
【表１０】
【０１３９】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着方法であって、
ａ．多能性幹細胞の懸濁液を得る工程と、
ｂ．平面支持体に該細胞懸濁液を加え、該細胞を付着させる工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が支持体に付着した後に、前記細胞が培養液中で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が支持体に付着した後に、前記細胞が分化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体への多能性幹細胞の付着が、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物で前記細胞懸濁液を処理することにより増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する前記化合物が、前記多能性幹細胞が支持体に付着した後に除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する前記化合物が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２及びヒドロキシファスジルからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１】
約１２％までのＮ、少なくとも約１２％〜少なくとも約５５％のＯを含み、接触角が約１８度〜約３２度であり、かつ吸着層及びフィーダー細胞層を欠く平面支持体への、多能性幹細胞の付着方法であって、
ａ．多能性幹細胞の懸濁液を得る工程と、
ｂ．平面支持体に該細胞懸濁液を加え、該細胞を付着させる工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が支持体に付着した後に、前記細胞が培養液中で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が支持体に付着した後に、前記細胞が分化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体への多能性幹細胞の付着が、Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する化合物で前記細胞懸濁液を処理することにより増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する前記化合物が、前記多能性幹細胞が支持体に付着した後に除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒｈｏキナーゼ活性の阻害能を有する前記化合物が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２及びヒドロキシファスジルからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５０９０８６（Ｐ２０１２−５０９０８６Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７６０４（Ｐ２０１１−５３７６０４）
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５０６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７７８
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５０６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７７８
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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