幹細胞の未分化維持剤及び増殖促進剤
【課題】 哺乳動物の幹細胞に対して未分化状態を維持させたまま、幹細胞に対して特異的な増殖促進効果を示す幹細胞の未分化維持及び増殖促進剤を開発し、かつ、移植時に組織への生着率の高い幹細胞とその調製技術を提供すること。
【解決手段】 哺乳動物の胚性幹細胞、又は、骨髄、血液、脂肪組織、皮膚組織をはじめとする生体組織における体性幹細胞及び人工的に調製した幹細胞に対して、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いることにより、幹細胞の未分化状態を維持したまま、幹細胞に対して特異的に増殖を促進し、さらに、該抽出物を含有させた培養液にて調製した幹細胞は、移植時における生体組織への生着率を向上させる効果がある。以上より、本発明は、再生医療や再生美容の分野において大きく貢献できるものである。
【解決手段】 哺乳動物の胚性幹細胞、又は、骨髄、血液、脂肪組織、皮膚組織をはじめとする生体組織における体性幹細胞及び人工的に調製した幹細胞に対して、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いることにより、幹細胞の未分化状態を維持したまま、幹細胞に対して特異的に増殖を促進し、さらに、該抽出物を含有させた培養液にて調製した幹細胞は、移植時における生体組織への生着率を向上させる効果がある。以上より、本発明は、再生医療や再生美容の分野において大きく貢献できるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を有効成分として含有することを特徴とする、幹細胞に対して特異的な未分化維持及び／又は増殖促進剤に関する。また、本発明は、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有する培養液を用いることで、移植時に生着率が極めて高い幹細胞を調製する方法及び／又は調製された幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞に分化する多能性を有しており、この性質により損傷部の細胞・組織を再生することで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。
【０００３】
哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、すべての血液細胞の再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の組織（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪組織など）へ分化可能な幹細胞が存在していることが報告されている（非特許文献１参照）。
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪組織など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。このような各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の根本的な再生にも利用できる可能性がある。また、近年では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に作製された幹細胞（人工多能性幹細胞：ｉＰＳ細胞）などの技術も進歩しており、様々な幹細胞が再生医療に活用できると期待されている（特許文献１〜２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ Ｐ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００１，７，２１１−２２８
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】特許第４４１１３６３号公報
【０００５】
このような中、これら幹細胞の能力（多能性）を細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）の分野において上手く活用するために、治療に用いる幹細胞を調製するための増殖技術や培養技術などの開発が進められている（非特許文献６〜７参照）。
【０００６】
【非特許文献６】馬渕 洋等，日本再生医療学会誌，２００７，６，２６３−２６８
【非特許文献７】北川 全等，日本再生医療学会誌，２００８，７，１４−１８
【０００７】
特に、幹細胞を生体外で増殖させる場合、幹細胞の能力である多能性を維持した状態、すなわち、未分化な状態を維持させたまま増殖させることが極めて重要である。また、この未分化な状態を保ちつつ、治療に必要な数になるまで幹細胞を増殖させる必要がある。もし、この増殖時に幹細胞の未分化状態が維持できず分化が進んでしまった場合、最終的に調製された幹細胞の能力（多能性）は失われていることになり、目的の治療効果（臓器、組織の再生など）は発揮されにくい。
【０００８】
また、幹細胞は様々な細胞へ分化する能力を備えていることから、幹細胞の増殖時に分化が進行した場合、幹細胞以外の細胞も混入し増殖してしまう可能性がある。この場合、最終的に調製された幹細胞には、幹細胞以外の細胞が含まれることになり、目的の治療効果（臓器、組織の再生など）は発揮されにくい。
【０００９】
以上より、今後、再生医療に幹細胞を用いることを考えた場合、幹細胞の未分化状態を維持させたまま移植に必要な数まで増殖させ、また、移植時には組織への生着率が高い幹細胞を調製する技術が必要である。これには、幹細胞の未分化状態を維持するとともに、幹細胞のみを特異的に増殖させ、かつ移植時に組織への生着が高い幹細胞を調製する技術が必要である。
【００１０】
現在までに、幹細胞の未分化状態を維持させたまま増殖させる技術について、幾つか報告はあるが、未だ発展途上である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や造血幹細胞は、支持細胞（ストローマ細胞、もしくはフィーダー細胞）と共培養することで未分化を維持することができる（非特許文献８〜１０、特許文献３参照）。しかし、最近になってフィーダー細胞由来の内在性ウイルスによる異種動物間の感染例が報告されており（非特許文献１１参照）、医療用途を目的とした幹細胞の培養には適していない。
【００１１】
【非特許文献８】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， １９９５，９２，７８４４−７８４８
【非特許文献９】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９８，２８２，１１４５−１１４７
【非特許文献１０】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ Ｂ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２０００，１８，３９９−４０４
【特許文献３】特開２００４−２４０８９号公報
【非特許文献１１】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ ＬｕｃＪ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００，４０７，９０−９４
【００１２】
その他の方法に、サイトカインを複雑に組合せることによって幹細胞の未分化状態を維持させる方法がある。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ））を培地に添加することによって、未分化性が維持される（非特許文献１２、特許文献４参照）。その他、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、未分化性を維持させることが胚性幹細胞、体性幹細胞などで報告されている（特許文献５、非特許文献１３参照）。
【００１３】
【非特許文献１２】Ｓｍｉｔｈ Ａ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１２１，１−９
【特許文献４】特表２００２−５２５０４２号公報
【特許文献５】特許第３５７３３５４号公報
【非特許文献１３】Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２００１，１０，４８１−４９２
【００１４】
さらに近年では、人工的に幹細胞を調製する技術やそれを増殖させるための技術として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などを添加する方法などが発明されている（特許文献６参照）。また、幹細胞を純化する技術として、特殊な培養液（ｂＦＧＦ含有）を用いることで幹細胞の未分化状態を維持させつつ増殖させる方法が発明されている（特許文献７参照）。いずれもｂＦＧＦなどの増殖因子やサイトカインを添加することで、幹細胞の未分化状態を維持させつつ増殖を促進する技術が開発されている。しかし、このような技術で使用されている増殖因子やサイトカインなどは、極めて高価であり、製造メーカーやロット間での品質や効能の違いなどの問題があり使用は難しい。加えて、これまで汎用されているＬＩＦなどの未分化維持に効果を示す成分は、極めて特定の細胞系統に限定的であり、特に霊長類のＥＳ細胞や体性幹細胞においては、ＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（非特許文献９参照）。
【００１５】
【特許文献６】特許第４４１１３６２号公報
【特許文献７】特表２０１０−５０００４７号公報
【００１６】
このように、これまでの技術では、特に幹細胞の未分化状態を維持する効果が不十分であり、幹細胞の増殖は可能ではあるが、同時に幹細胞から分化した細胞や初期段階に混入した幹細胞以外の細胞も増殖してしまい、最終的に調製された幹細胞には幹細胞以外の細胞が混在する状態になってしまう。
【００１７】
すなわち、現在までに報告されている幹細胞の未分化状態の維持及び増殖技術は、いずれも移植用の幹細胞を調製し、実際に移植した場合に満足いく効果を望めるものは少なく、開発途上の技術であると考えられている。また、これまでの技術は、煩雑な操作を必要としたり、幹細胞の未分化状態の維持効果が低いことから、最終的には幹細胞以外の細胞の増殖を招き、これを移植する際には、幹細胞以外の細胞を移植することになるため、幹細胞の組織への生着率が極めて低下する。故に、今後の再生医療において、治療に用いる幹細胞を調製する場合、幹細胞の未分化状態を維持させる技術と、かつこの未分化状態を維持させたまま、幹細胞のみを必要な数まで増殖させる技術の開発が望まれている。これには、幹細胞に対して選択的に未分化維持と増殖促進効果を示す成分や培養技術の開発が必要である。また、これらの技術により調製された幹細胞を、生体組織に効率よく生着させる必要がある。つまり、安全かつ簡便で効率的に、幹細胞特異的に未分化状態を維持させたまま増殖させ、その他の細胞に対しては増殖効果を示さず、かつ移植時の生体組織への生着率の高い幹細胞の調製技術が求められていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物の幹細胞に対して未分化状態を維持させたまま、幹細胞特異的な増殖促進効果を示す幹細胞の未分化維持及び／又は増殖促進剤を開発し、かつ、移植時に生体組織への生着率の高い幹細胞とその調製技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物に、幹細胞に対して特異的な未分化維持効果と増殖促進効果を見出し、さらに、当該化合物を含有した培養液を用いて調製した移植用の幹細胞を、実際に移植した際に組織への生着率が極めて向上することを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の未分化維持剤。
（化１）一般式（Ａ）
（式中、Ｒ１はＨ又はジカルボン酸エステル残基（その塩を含む）であり、Ｒ２は、カルボキシル基又はその塩である）
（２）一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
（３）一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
（４）（３）に記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
（５）一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞用途の培地。
【００２１】
本発明に用いるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、上記一般式（Ａ）で示される。
【００２２】
一般式（Ａ）で示される化合物は、ブリオノール酸から誘導することができる。ブリオノール酸とは、下記一般式（Ｂ）で示される酸性五環性トリテルペノイドであり、ウリ科植物の培養細胞を低濃度のオーキシンを含む培地中で暗所にて培養することによって生産することができる（特許文献８、非特許文献１４参照）。
【００２３】
【特許文献８】特開平２−１０７１９４号公報
【非特許文献１４】Ｐｌａｎｔ ａｎｄ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，２５（８）：１５７１−１５７４（１９８４）
【００２４】
（化２）一般式（Ｂ）
【００２５】
例えば、ウリ科植物（ヘチマ、メロンなど）のカルスを常法により誘導し、その懸濁培養細胞を作製する。この培養細胞を１０−６〜１０−８Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を含む液体培地に接種し、暗所で１〜３週間、回転振とう培養する。得られた培養細胞を乾燥した後、エタノールで抽出し、濃縮乾固する。得られた抽出物を結晶化させるとブリオノール酸が得られる。また、ウリ科植物、例えば、メロン、カボチャやカラスウリなどの根から同様にして抽出し、シリカゲルカラムで分画後、再結晶によりブリオノール酸を得ることができる。
【００２６】
ジカルボン酸エステル残基に関して、ジカルボン酸としては、分子内にカルボキシル基を２個有するものであれば特に限定されず、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などの脂肪族飽和ジカルボン酸、マレイン酸、フマル酸などの脂肪族不飽和ジカルボン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸などの芳香族ジカルボン酸などが例示される。上記ジカルボン酸エステルは、常法によりブリオノール酸を無水コハク酸や無水グルタル酸などと反応させることにより、容易に調製することができる。
【００２７】
ブリオノール酸又はブリオノール酸ジカルボン酸エステルは、塩を形成していてもよく、塩としては、カルボキシル基が、塩を形成しており、生理学的に許容されれば特に制限されるものではない。好適にはナトリウム、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛、アルミニウム、アンモニウム等の第四級アミン塩、及びリジン，アルギニン塩等のアミノ酸塩などが例示される。上記塩類は、ブリオノール酸又はブリオノール酸ジカルボン酸エステルから常法により容易に誘導することができる。
【００２８】
ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、本発明の未分化維持剤、増殖促進剤、培地などに対して、乾燥物として０．００００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０００１〜１重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．００００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。
【００２９】
また、本発明の幹細胞に対して特異的な未分化維持効果や増殖促進効果を示す化合物や、これにより調製された幹細胞、またその調製方法などは、細胞培養用添加剤、研究用試薬、医療用試薬、細胞移植剤をはじめとし、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への配合や応用が可能である。
【００３０】
本発明の幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、もしくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織、脳、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する、体性の幹細胞、さらには遺伝子導入などにより人工的に調製された幹細胞、また、当該細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞いずれであってもよい。好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。また、哺乳動物における、幹細胞の分化の方向性、および、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。
【００３１】
本発明の幹細胞を培養する培地、又は同時に用いる添加剤としては、例えば以下のものを使用できるが、限定されるものではない。
【００３２】
具体的には、細胞の生存に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０，Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら増殖因子の全てが含有されたものである。また、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質などが含有されてもよい。
【００３３】
また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００３４】
市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。
【００３５】
幹細胞の培養に用いられる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。
【００３６】
培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞外基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
【００３７】
培養条件としては、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃が良い。ＣＯ２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％が良い。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、幹細胞に対して極めて高い未分化状態の維持効果を示した。さらに、増殖促進効果に関しては、幹細胞以外の細胞に対しては増殖促進効果を示さず、幹細胞のみに対する極めて特異的な増殖促進効果を見出した。また、このブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いて調製した幹細胞を生体組織へ移植した場合、従来の方法に比べて組織への生着率が著しく向上した。以上より、本発明は、組織の再生治療、再生美容に役立つものであり、組織の再生の分野において大きく貢献できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的かつ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４０】
まず、実施例として本発明に用いるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物の製造例および幹細胞の未分化状態の維持効果を示す実験例を挙げる。
【実施例１】
【００４１】
以下に、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物の製造例を示す。
【００４２】
製造例１ ブリオノール酸
ヘチマの子葉を４．５×１０−６Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）及び２．３×１０−６Ｍ のカイネチンを含むムラシゲとスクーグの寒天培地に置床し、常法によりカルスを誘導した。一ヶ月後、このカルスを同液体培地に入れて９０ｒｐｍで回転振とう培養し、その懸濁培養細胞を調製した。この培養細胞を１０−７Ｍの２，４−Ｄを含むムラシゲとスクーグの液体培地に接種し、暗所で２週間、回転振とう培養した。得られた培養細胞を凍結乾燥した後、エタノールにて抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた抽出物をエタノールに再溶解させ、続いて再結晶させブリオノール酸の針状結晶を得た。ブリオノール酸含量は、細胞の乾燥重量に対して１．２％であった。
【００４３】
製造例２ サクシニルブリオノール酸
ブリオノール酸１０ｇ、無水コハク酸６４ｇをピリジン５５０ｍＬに溶解し、１００℃にて８時間反応させた。放冷後、１Ｎ塩酸６．５Ｌ中に反応液を加え、３℃にて放置し、析出した結晶をろ別し、精製水にて洗浄した。
ろ別した固形分をジエチルエーテル３Ｌに溶解し、精製水にて洗浄後、ジエチルエーテルを留去し、乾燥して固形分１３ｇを得た。 固形分１３ｇをエタノール１００ｍＬに加熱溶解し再結晶することにより、白色固形分としてサクシニルブリオノール酸１２ｇを得た。サクシニルブリオノール酸を一般式（Ｃ）に示す。
【００４４】
（化３）一般式（Ｃ）
【００４５】
製造例３ サクシニルブリオノール酸二カリウム
サクシニルブリオノール酸１２ｇを脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３００ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化カリウム水溶液４５ｍＬを添加した。追加でＴＨＦを徐々に加えて沈殿が生成し始めたら約１時間熟成し、総液量１２００ｍＬまでＴＨＦを加え、３℃、１日後、ろ別し、黄色固形分１５ｇを得た。
黄色固形分１５ｇを１００ｍＬエタノールに加熱溶解し、ＴＨＦを徐々に加え白濁し始めたらろ過をし、ろ液を３℃で１日放置した。固形分をろ別し、エタノール１００ｍＬに加熱溶解し、３℃、１日後、ろ過乾燥し、白色〜微黄色固形分のサクシニルブリオノール酸二カリウム１１ｇを得た。サクシニルブリオノール酸二カリウムを一般式（Ｄ）に示す。
【００４６】
（化４）一般式（Ｄ）
【実施例２】
【００４７】
以下に、実施例１で示した製造例１〜３のブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いた、幹細胞の未分化状態維持効果及び細胞増殖促進効果の実験例とその結果を示す。
【００４８】
実験例１ 幹細胞に対する未分化状態維持効果の評価
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ培養液（Ｇｉｂｃｏ社製）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１５％、Ｓｉｇｍａ社製）、ヌクレオシド液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、非必須アミノ酸液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、β２−メルカプトエタノール液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、Ｌ−グルタミン液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞：コスモバイオ社製）を、６ｃｍディッシュに１×１０５個播種し、各試料（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（Ｓｉｇｍａ社製）にてタンパク質を抽出し、未分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った（文献：豊岡やよい，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ臨時増刊号 再生医学，２００３，１０６−１１５）。すなわち、幹細胞の未分化状態を示しているオクタマーバインディングプロテイン３／４タンパク質（Ｏｃｔ３／４タンパク質）の発現量を指標に、培養開始時に播種した幹細胞（１×１０５個）が発現していたＯｃｔ３／４タンパク質の量を１００％未分化状態とし、各試料（製造例１〜３）を添加して３日間培養した後のＯｃｔ３／４タンパク質の量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、培養開始時と３日間培養後のＯｃｔ３／４タンパク質の量を比較することで、未分化状態の維持効果について評価した。なお、これまでに幹細胞の未分化維持効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（特表２０１０−５０００４７号公報）を陽性対照として用いて同様な評価を行った。
【００４９】
具体的な評価方法としては、ウエスタンブロッティング法にて培養開始時の幹細胞の単一細胞数（１×１０５個）に発現しているＯｃｔ３／４タンパク質量（Ａとする）と化合物を添加して３日間培養し、増殖させた後の単一細胞数（１×１０５個）で発現しているＯｃｔ３／４タンパク質量（Ｂとする）を求め、次の式より培養３日後の未分化状態（％）を算出した。培養３日後の未分化状態の算出式＝Ｂ／Ａ×１００（％）。
【００５０】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、陽性対照物質（ｂＦＧＦ）と比較して、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）全てにおいて顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。以上より、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物の極めて優れた幹細胞の未分化状態維持効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、体性の幹細胞や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果を認めた。
【００５１】
【表１】
【００５２】
実験例２ 幹細胞に対する特異的な細胞増殖促進効果の評価
生体組織は、大きく外胚葉、中胚葉、内胚葉の組織に分類され、これら組織を構成する細胞は、約２００種類程度存在すると考えられていることから、その中でも代表として、外胚葉組織の細胞である角化細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、中胚葉組織の細胞である線維芽細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、内胚葉組織の細胞である肝臓細胞（ＨＥＰＧ２）とヒト体性幹細胞を用いて、これら細胞に対するブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）の細胞特異的な増殖促進効果について評価を行った。すなわち、これら細胞の中で、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）が特異的に幹細胞のみに対して増殖促進効果を示すかについて評価した。具体的には、これら細胞を、それぞれを６ｃｍディッシュに１×１０６個播種し、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、それぞれの細胞をラバーポリスマンにて集め、細胞数をカウントした。
それぞれの細胞に対して化合物未添加時の総細胞数をコントロール（１００％）とした場合の、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）添加時のそれぞれの細胞数の増減（％）を算出し、各細胞に対する細胞増殖促進効果の評価を行った。なお、これまでに幹細胞の増殖促進効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（特許文献７参照）を陽性対照として用いて同様な評価を行った。
【００５３】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）は、幹細胞のみに対して顕著な細胞増殖促進効果を示した。この効果は、線維芽細胞、角化細胞や肝臓細胞に対しては見られず、幹細胞に対して特異的なものであった。また、これまで幹細胞増殖促進物質として使用されているｂＦＧＦは、幹細胞以外に角化細胞、線維芽細胞や肝臓細胞に対しても有意な増殖効果を示した。以上より、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、極めて優れた幹細胞に対する特異的な増殖促進効果を示した。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、幹細胞に対して顕著かつ特異的な増殖促進効果を認めた。
【００５４】
【表２】
【実施例３】
【００５５】
組織への移植用として、従来の技術により調製した幹細胞とブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を添加して調製した幹細胞を用いて、実際に移植を行い、移植後のそれぞれの生着率（％）を比較した。
【００５６】
実験例３ 移植用の幹細胞の調製
ヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を６ｃｍディッシュに１×１０６個播種し、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）を最終濃度が０．０１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に、それぞれの細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、無菌的にラバーポリスマンにて回収し、遠沈後、５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に分散し、移植用の幹細胞として用いた。その後、以下の方法にて、皮膚移植を行い、生着率（％）について測定した。
【００５７】
実験例４ 幹細胞の移植および生着率（％）の測定
実験例３で調製した幹細胞を、改めて１×１０６個サンプリングし、細胞の数を揃えた後、注射筒にてヌードマウスの皮下に移植し、移植後の生着率（％）を測定した。具体的な生着率（％）の測定法としては、移植用にサンプリングした１×１０６個の幹細胞を、予めＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（モレキュラープローブ社製）にて蛍光標識し、その時点の蛍光強度を測定し、移植細胞の総蛍光強度（１００％）とした。この細胞を、注射筒を用いて、ヌードマウス（雄性、４週齢）の皮下に移植した。移植部位をマジックにてマーキングし、移植３日後、７日後に移植部位を摘出し、酵素処理により細胞を分散させ、得られた細胞の総蛍光強度を測定し、移植時の総蛍光強度（１００％）と比較することで、生着率（％）を算出した。すなわち、生着した幹細胞が多いほど、最初に移植した蛍光強度と同等の蛍光が検出され、逆に、生着しなかった場合は、移植部位から蛍光が検出されないこととなる。
【００５８】
これらの試験結果を表３に示した。その結果、移植３日後、７日後ともに、従来の方法により調製した幹細胞に比べてブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）を用いて調製した幹細胞を移植した場合において極めて高い生着率を示した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
以上の結果より、従来の方法で調製した幹細胞よりもブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いて移植用の幹細胞を調製することで、幹細胞の組織への生着率を顕著に向上させることを確認した。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、幹細胞移植における有意な生着率の向上効果を認めた。
【００６１】
本発明の、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を幹細胞に対して用いることで、幹細胞の未分化状態を維持させたまま幹細胞のみを増殖促進させることが可能になり、さらに、この技術を用いることで、移植時に極めて生着率の高い幹細胞を簡便に調製することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の活用例として、再生医療、再生美容への応用が期待される。例えば、本発明を利用することで、再生医療、再生美容に用いる移植用の幹細胞を調製する場合に、幹細胞の未分化状態を維持しつつ移植に必要な数の幹細胞を選択的かつ効率的に増殖させることが可能である。さらに本発明技術により調製された幹細胞は、移植時に組織への高い生着率を示す性質を備えており、再生医療、再生美容において極めて有用な幹細胞の調製が可能になる。また、移植以外の用途として移植後又は組織に存在する幹細胞に対して、本発明のブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を、組織に対して直接的に注入又は経口投与、塗布、貼付などにより導入させることにより、幹細胞に対して特異的な未分化状態の維持効果及び増殖促進効果を見出すことが可能である。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞に対して特異的な未分化維持剤及び／又は増殖促進剤としての応用性と、かつ当該化合物を用いることで組織への生着率の高い幹細胞を調製することを可能にする技術である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を有効成分として含有することを特徴とする、幹細胞に対して特異的な未分化維持及び／又は増殖促進剤に関する。また、本発明は、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有する培養液を用いることで、移植時に生着率が極めて高い幹細胞を調製する方法及び／又は調製された幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞に分化する多能性を有しており、この性質により損傷部の細胞・組織を再生することで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。
【０００３】
哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、すべての血液細胞の再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の組織（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪組織など）へ分化可能な幹細胞が存在していることが報告されている（非特許文献１参照）。
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪組織など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。このような各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の根本的な再生にも利用できる可能性がある。また、近年では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に作製された幹細胞（人工多能性幹細胞：ｉＰＳ細胞）などの技術も進歩しており、様々な幹細胞が再生医療に活用できると期待されている（特許文献１〜２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ Ｍ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ Ｐ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００１，７，２１１−２２８
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】特許第４４１１３６３号公報
【０００５】
このような中、これら幹細胞の能力（多能性）を細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）の分野において上手く活用するために、治療に用いる幹細胞を調製するための増殖技術や培養技術などの開発が進められている（非特許文献６〜７参照）。
【０００６】
【非特許文献６】馬渕 洋等，日本再生医療学会誌，２００７，６，２６３−２６８
【非特許文献７】北川 全等，日本再生医療学会誌，２００８，７，１４−１８
【０００７】
特に、幹細胞を生体外で増殖させる場合、幹細胞の能力である多能性を維持した状態、すなわち、未分化な状態を維持させたまま増殖させることが極めて重要である。また、この未分化な状態を保ちつつ、治療に必要な数になるまで幹細胞を増殖させる必要がある。もし、この増殖時に幹細胞の未分化状態が維持できず分化が進んでしまった場合、最終的に調製された幹細胞の能力（多能性）は失われていることになり、目的の治療効果（臓器、組織の再生など）は発揮されにくい。
【０００８】
また、幹細胞は様々な細胞へ分化する能力を備えていることから、幹細胞の増殖時に分化が進行した場合、幹細胞以外の細胞も混入し増殖してしまう可能性がある。この場合、最終的に調製された幹細胞には、幹細胞以外の細胞が含まれることになり、目的の治療効果（臓器、組織の再生など）は発揮されにくい。
【０００９】
以上より、今後、再生医療に幹細胞を用いることを考えた場合、幹細胞の未分化状態を維持させたまま移植に必要な数まで増殖させ、また、移植時には組織への生着率が高い幹細胞を調製する技術が必要である。これには、幹細胞の未分化状態を維持するとともに、幹細胞のみを特異的に増殖させ、かつ移植時に組織への生着が高い幹細胞を調製する技術が必要である。
【００１０】
現在までに、幹細胞の未分化状態を維持させたまま増殖させる技術について、幾つか報告はあるが、未だ発展途上である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や造血幹細胞は、支持細胞（ストローマ細胞、もしくはフィーダー細胞）と共培養することで未分化を維持することができる（非特許文献８〜１０、特許文献３参照）。しかし、最近になってフィーダー細胞由来の内在性ウイルスによる異種動物間の感染例が報告されており（非特許文献１１参照）、医療用途を目的とした幹細胞の培養には適していない。
【００１１】
【非特許文献８】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， １９９５，９２，７８４４−７８４８
【非特許文献９】Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９８，２８２，１１４５−１１４７
【非特許文献１０】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ Ｂ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２０００，１８，３９９−４０４
【特許文献３】特開２００４−２４０８９号公報
【非特許文献１１】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ ＬｕｃＪ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０００，４０７，９０−９４
【００１２】
その他の方法に、サイトカインを複雑に組合せることによって幹細胞の未分化状態を維持させる方法がある。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ））を培地に添加することによって、未分化性が維持される（非特許文献１２、特許文献４参照）。その他、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、未分化性を維持させることが胚性幹細胞、体性幹細胞などで報告されている（特許文献５、非特許文献１３参照）。
【００１３】
【非特許文献１２】Ｓｍｉｔｈ Ａ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１２１，１−９
【特許文献４】特表２００２−５２５０４２号公報
【特許文献５】特許第３５７３３５４号公報
【非特許文献１３】Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２００１，１０，４８１−４９２
【００１４】
さらに近年では、人工的に幹細胞を調製する技術やそれを増殖させるための技術として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などを添加する方法などが発明されている（特許文献６参照）。また、幹細胞を純化する技術として、特殊な培養液（ｂＦＧＦ含有）を用いることで幹細胞の未分化状態を維持させつつ増殖させる方法が発明されている（特許文献７参照）。いずれもｂＦＧＦなどの増殖因子やサイトカインを添加することで、幹細胞の未分化状態を維持させつつ増殖を促進する技術が開発されている。しかし、このような技術で使用されている増殖因子やサイトカインなどは、極めて高価であり、製造メーカーやロット間での品質や効能の違いなどの問題があり使用は難しい。加えて、これまで汎用されているＬＩＦなどの未分化維持に効果を示す成分は、極めて特定の細胞系統に限定的であり、特に霊長類のＥＳ細胞や体性幹細胞においては、ＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（非特許文献９参照）。
【００１５】
【特許文献６】特許第４４１１３６２号公報
【特許文献７】特表２０１０−５０００４７号公報
【００１６】
このように、これまでの技術では、特に幹細胞の未分化状態を維持する効果が不十分であり、幹細胞の増殖は可能ではあるが、同時に幹細胞から分化した細胞や初期段階に混入した幹細胞以外の細胞も増殖してしまい、最終的に調製された幹細胞には幹細胞以外の細胞が混在する状態になってしまう。
【００１７】
すなわち、現在までに報告されている幹細胞の未分化状態の維持及び増殖技術は、いずれも移植用の幹細胞を調製し、実際に移植した場合に満足いく効果を望めるものは少なく、開発途上の技術であると考えられている。また、これまでの技術は、煩雑な操作を必要としたり、幹細胞の未分化状態の維持効果が低いことから、最終的には幹細胞以外の細胞の増殖を招き、これを移植する際には、幹細胞以外の細胞を移植することになるため、幹細胞の組織への生着率が極めて低下する。故に、今後の再生医療において、治療に用いる幹細胞を調製する場合、幹細胞の未分化状態を維持させる技術と、かつこの未分化状態を維持させたまま、幹細胞のみを必要な数まで増殖させる技術の開発が望まれている。これには、幹細胞に対して選択的に未分化維持と増殖促進効果を示す成分や培養技術の開発が必要である。また、これらの技術により調製された幹細胞を、生体組織に効率よく生着させる必要がある。つまり、安全かつ簡便で効率的に、幹細胞特異的に未分化状態を維持させたまま増殖させ、その他の細胞に対しては増殖効果を示さず、かつ移植時の生体組織への生着率の高い幹細胞の調製技術が求められていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物の幹細胞に対して未分化状態を維持させたまま、幹細胞特異的な増殖促進効果を示す幹細胞の未分化維持及び／又は増殖促進剤を開発し、かつ、移植時に生体組織への生着率の高い幹細胞とその調製技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物に、幹細胞に対して特異的な未分化維持効果と増殖促進効果を見出し、さらに、当該化合物を含有した培養液を用いて調製した移植用の幹細胞を、実際に移植した際に組織への生着率が極めて向上することを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の未分化維持剤。
（化１）一般式（Ａ）
（式中、Ｒ１はＨ又はジカルボン酸エステル残基（その塩を含む）であり、Ｒ２は、カルボキシル基又はその塩である）
（２）一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
（３）一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
（４）（３）に記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
（５）一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞用途の培地。
【００２１】
本発明に用いるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、上記一般式（Ａ）で示される。
【００２２】
一般式（Ａ）で示される化合物は、ブリオノール酸から誘導することができる。ブリオノール酸とは、下記一般式（Ｂ）で示される酸性五環性トリテルペノイドであり、ウリ科植物の培養細胞を低濃度のオーキシンを含む培地中で暗所にて培養することによって生産することができる（特許文献８、非特許文献１４参照）。
【００２３】
【特許文献８】特開平２−１０７１９４号公報
【非特許文献１４】Ｐｌａｎｔ ａｎｄ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，２５（８）：１５７１−１５７４（１９８４）
【００２４】
（化２）一般式（Ｂ）
【００２５】
例えば、ウリ科植物（ヘチマ、メロンなど）のカルスを常法により誘導し、その懸濁培養細胞を作製する。この培養細胞を１０−６〜１０−８Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を含む液体培地に接種し、暗所で１〜３週間、回転振とう培養する。得られた培養細胞を乾燥した後、エタノールで抽出し、濃縮乾固する。得られた抽出物を結晶化させるとブリオノール酸が得られる。また、ウリ科植物、例えば、メロン、カボチャやカラスウリなどの根から同様にして抽出し、シリカゲルカラムで分画後、再結晶によりブリオノール酸を得ることができる。
【００２６】
ジカルボン酸エステル残基に関して、ジカルボン酸としては、分子内にカルボキシル基を２個有するものであれば特に限定されず、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などの脂肪族飽和ジカルボン酸、マレイン酸、フマル酸などの脂肪族不飽和ジカルボン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸などの芳香族ジカルボン酸などが例示される。上記ジカルボン酸エステルは、常法によりブリオノール酸を無水コハク酸や無水グルタル酸などと反応させることにより、容易に調製することができる。
【００２７】
ブリオノール酸又はブリオノール酸ジカルボン酸エステルは、塩を形成していてもよく、塩としては、カルボキシル基が、塩を形成しており、生理学的に許容されれば特に制限されるものではない。好適にはナトリウム、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛、アルミニウム、アンモニウム等の第四級アミン塩、及びリジン，アルギニン塩等のアミノ酸塩などが例示される。上記塩類は、ブリオノール酸又はブリオノール酸ジカルボン酸エステルから常法により容易に誘導することができる。
【００２８】
ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、本発明の未分化維持剤、増殖促進剤、培地などに対して、乾燥物として０．００００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０００１〜１重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．００００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。
【００２９】
また、本発明の幹細胞に対して特異的な未分化維持効果や増殖促進効果を示す化合物や、これにより調製された幹細胞、またその調製方法などは、細胞培養用添加剤、研究用試薬、医療用試薬、細胞移植剤をはじめとし、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への配合や応用が可能である。
【００３０】
本発明の幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、もしくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織、脳、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する、体性の幹細胞、さらには遺伝子導入などにより人工的に調製された幹細胞、また、当該細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞いずれであってもよい。好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。また、哺乳動物における、幹細胞の分化の方向性、および、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。
【００３１】
本発明の幹細胞を培養する培地、又は同時に用いる添加剤としては、例えば以下のものを使用できるが、限定されるものではない。
【００３２】
具体的には、細胞の生存に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０，Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら増殖因子の全てが含有されたものである。また、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質などが含有されてもよい。
【００３３】
また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００３４】
市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。
【００３５】
幹細胞の培養に用いられる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。
【００３６】
培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞外基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
【００３７】
培養条件としては、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃が良い。ＣＯ２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％が良い。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、幹細胞に対して極めて高い未分化状態の維持効果を示した。さらに、増殖促進効果に関しては、幹細胞以外の細胞に対しては増殖促進効果を示さず、幹細胞のみに対する極めて特異的な増殖促進効果を見出した。また、このブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いて調製した幹細胞を生体組織へ移植した場合、従来の方法に比べて組織への生着率が著しく向上した。以上より、本発明は、組織の再生治療、再生美容に役立つものであり、組織の再生の分野において大きく貢献できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的かつ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４０】
まず、実施例として本発明に用いるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物の製造例および幹細胞の未分化状態の維持効果を示す実験例を挙げる。
【実施例１】
【００４１】
以下に、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物の製造例を示す。
【００４２】
製造例１ ブリオノール酸
ヘチマの子葉を４．５×１０−６Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）及び２．３×１０−６Ｍ のカイネチンを含むムラシゲとスクーグの寒天培地に置床し、常法によりカルスを誘導した。一ヶ月後、このカルスを同液体培地に入れて９０ｒｐｍで回転振とう培養し、その懸濁培養細胞を調製した。この培養細胞を１０−７Ｍの２，４−Ｄを含むムラシゲとスクーグの液体培地に接種し、暗所で２週間、回転振とう培養した。得られた培養細胞を凍結乾燥した後、エタノールにて抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた抽出物をエタノールに再溶解させ、続いて再結晶させブリオノール酸の針状結晶を得た。ブリオノール酸含量は、細胞の乾燥重量に対して１．２％であった。
【００４３】
製造例２ サクシニルブリオノール酸
ブリオノール酸１０ｇ、無水コハク酸６４ｇをピリジン５５０ｍＬに溶解し、１００℃にて８時間反応させた。放冷後、１Ｎ塩酸６．５Ｌ中に反応液を加え、３℃にて放置し、析出した結晶をろ別し、精製水にて洗浄した。
ろ別した固形分をジエチルエーテル３Ｌに溶解し、精製水にて洗浄後、ジエチルエーテルを留去し、乾燥して固形分１３ｇを得た。 固形分１３ｇをエタノール１００ｍＬに加熱溶解し再結晶することにより、白色固形分としてサクシニルブリオノール酸１２ｇを得た。サクシニルブリオノール酸を一般式（Ｃ）に示す。
【００４４】
（化３）一般式（Ｃ）
【００４５】
製造例３ サクシニルブリオノール酸二カリウム
サクシニルブリオノール酸１２ｇを脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３００ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化カリウム水溶液４５ｍＬを添加した。追加でＴＨＦを徐々に加えて沈殿が生成し始めたら約１時間熟成し、総液量１２００ｍＬまでＴＨＦを加え、３℃、１日後、ろ別し、黄色固形分１５ｇを得た。
黄色固形分１５ｇを１００ｍＬエタノールに加熱溶解し、ＴＨＦを徐々に加え白濁し始めたらろ過をし、ろ液を３℃で１日放置した。固形分をろ別し、エタノール１００ｍＬに加熱溶解し、３℃、１日後、ろ過乾燥し、白色〜微黄色固形分のサクシニルブリオノール酸二カリウム１１ｇを得た。サクシニルブリオノール酸二カリウムを一般式（Ｄ）に示す。
【００４６】
（化４）一般式（Ｄ）
【実施例２】
【００４７】
以下に、実施例１で示した製造例１〜３のブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いた、幹細胞の未分化状態維持効果及び細胞増殖促進効果の実験例とその結果を示す。
【００４８】
実験例１ 幹細胞に対する未分化状態維持効果の評価
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ培養液（Ｇｉｂｃｏ社製）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１５％、Ｓｉｇｍａ社製）、ヌクレオシド液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、非必須アミノ酸液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、β２−メルカプトエタノール液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、Ｌ−グルタミン液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞：コスモバイオ社製）を、６ｃｍディッシュに１×１０５個播種し、各試料（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（Ｓｉｇｍａ社製）にてタンパク質を抽出し、未分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った（文献：豊岡やよい，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ臨時増刊号 再生医学，２００３，１０６−１１５）。すなわち、幹細胞の未分化状態を示しているオクタマーバインディングプロテイン３／４タンパク質（Ｏｃｔ３／４タンパク質）の発現量を指標に、培養開始時に播種した幹細胞（１×１０５個）が発現していたＯｃｔ３／４タンパク質の量を１００％未分化状態とし、各試料（製造例１〜３）を添加して３日間培養した後のＯｃｔ３／４タンパク質の量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、培養開始時と３日間培養後のＯｃｔ３／４タンパク質の量を比較することで、未分化状態の維持効果について評価した。なお、これまでに幹細胞の未分化維持効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（特表２０１０−５０００４７号公報）を陽性対照として用いて同様な評価を行った。
【００４９】
具体的な評価方法としては、ウエスタンブロッティング法にて培養開始時の幹細胞の単一細胞数（１×１０５個）に発現しているＯｃｔ３／４タンパク質量（Ａとする）と化合物を添加して３日間培養し、増殖させた後の単一細胞数（１×１０５個）で発現しているＯｃｔ３／４タンパク質量（Ｂとする）を求め、次の式より培養３日後の未分化状態（％）を算出した。培養３日後の未分化状態の算出式＝Ｂ／Ａ×１００（％）。
【００５０】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、陽性対照物質（ｂＦＧＦ）と比較して、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）全てにおいて顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。以上より、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物の極めて優れた幹細胞の未分化状態維持効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、体性の幹細胞や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果を認めた。
【００５１】
【表１】
【００５２】
実験例２ 幹細胞に対する特異的な細胞増殖促進効果の評価
生体組織は、大きく外胚葉、中胚葉、内胚葉の組織に分類され、これら組織を構成する細胞は、約２００種類程度存在すると考えられていることから、その中でも代表として、外胚葉組織の細胞である角化細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、中胚葉組織の細胞である線維芽細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、内胚葉組織の細胞である肝臓細胞（ＨＥＰＧ２）とヒト体性幹細胞を用いて、これら細胞に対するブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）の細胞特異的な増殖促進効果について評価を行った。すなわち、これら細胞の中で、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）が特異的に幹細胞のみに対して増殖促進効果を示すかについて評価した。具体的には、これら細胞を、それぞれを６ｃｍディッシュに１×１０６個播種し、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、それぞれの細胞をラバーポリスマンにて集め、細胞数をカウントした。
それぞれの細胞に対して化合物未添加時の総細胞数をコントロール（１００％）とした場合の、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）添加時のそれぞれの細胞数の増減（％）を算出し、各細胞に対する細胞増殖促進効果の評価を行った。なお、これまでに幹細胞の増殖促進効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（特許文献７参照）を陽性対照として用いて同様な評価を行った。
【００５３】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）は、幹細胞のみに対して顕著な細胞増殖促進効果を示した。この効果は、線維芽細胞、角化細胞や肝臓細胞に対しては見られず、幹細胞に対して特異的なものであった。また、これまで幹細胞増殖促進物質として使用されているｂＦＧＦは、幹細胞以外に角化細胞、線維芽細胞や肝臓細胞に対しても有意な増殖効果を示した。以上より、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物は、極めて優れた幹細胞に対する特異的な増殖促進効果を示した。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、幹細胞に対して顕著かつ特異的な増殖促進効果を認めた。
【００５４】
【表２】
【実施例３】
【００５５】
組織への移植用として、従来の技術により調製した幹細胞とブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を添加して調製した幹細胞を用いて、実際に移植を行い、移植後のそれぞれの生着率（％）を比較した。
【００５６】
実験例３ 移植用の幹細胞の調製
ヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を６ｃｍディッシュに１×１０６個播種し、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）を最終濃度が０．０１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に、それぞれの細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、無菌的にラバーポリスマンにて回収し、遠沈後、５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に分散し、移植用の幹細胞として用いた。その後、以下の方法にて、皮膚移植を行い、生着率（％）について測定した。
【００５７】
実験例４ 幹細胞の移植および生着率（％）の測定
実験例３で調製した幹細胞を、改めて１×１０６個サンプリングし、細胞の数を揃えた後、注射筒にてヌードマウスの皮下に移植し、移植後の生着率（％）を測定した。具体的な生着率（％）の測定法としては、移植用にサンプリングした１×１０６個の幹細胞を、予めＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（モレキュラープローブ社製）にて蛍光標識し、その時点の蛍光強度を測定し、移植細胞の総蛍光強度（１００％）とした。この細胞を、注射筒を用いて、ヌードマウス（雄性、４週齢）の皮下に移植した。移植部位をマジックにてマーキングし、移植３日後、７日後に移植部位を摘出し、酵素処理により細胞を分散させ、得られた細胞の総蛍光強度を測定し、移植時の総蛍光強度（１００％）と比較することで、生着率（％）を算出した。すなわち、生着した幹細胞が多いほど、最初に移植した蛍光強度と同等の蛍光が検出され、逆に、生着しなかった場合は、移植部位から蛍光が検出されないこととなる。
【００５８】
これらの試験結果を表３に示した。その結果、移植３日後、７日後ともに、従来の方法により調製した幹細胞に比べてブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物（製造例１〜３）を用いて調製した幹細胞を移植した場合において極めて高い生着率を示した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
以上の結果より、従来の方法で調製した幹細胞よりもブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を用いて移植用の幹細胞を調製することで、幹細胞の組織への生着率を顕著に向上させることを確認した。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、幹細胞移植における有意な生着率の向上効果を認めた。
【００６１】
本発明の、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を幹細胞に対して用いることで、幹細胞の未分化状態を維持させたまま幹細胞のみを増殖促進させることが可能になり、さらに、この技術を用いることで、移植時に極めて生着率の高い幹細胞を簡便に調製することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の活用例として、再生医療、再生美容への応用が期待される。例えば、本発明を利用することで、再生医療、再生美容に用いる移植用の幹細胞を調製する場合に、幹細胞の未分化状態を維持しつつ移植に必要な数の幹細胞を選択的かつ効率的に増殖させることが可能である。さらに本発明技術により調製された幹細胞は、移植時に組織への高い生着率を示す性質を備えており、再生医療、再生美容において極めて有用な幹細胞の調製が可能になる。また、移植以外の用途として移植後又は組織に存在する幹細胞に対して、本発明のブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を、組織に対して直接的に注入又は経口投与、塗布、貼付などにより導入させることにより、幹細胞に対して特異的な未分化状態の維持効果及び増殖促進効果を見出すことが可能である。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞に対して特異的な未分化維持剤及び／又は増殖促進剤としての応用性と、かつ当該化合物を用いることで組織への生着率の高い幹細胞を調製することを可能にする技術である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の未分化維持剤。
（化１）一般式（Ａ）
（式中、Ｒ１はＨ又はジカルボン酸エステル残基（その塩を含む）であり、Ｒ２は、カルボキシル基又はその塩である）
【請求項２】
一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
【請求項３】
一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
【請求項４】
請求項３記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
【請求項５】
一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞用途の培地。
【請求項１】
下記一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の未分化維持剤。
（化１）一般式（Ａ）
（式中、Ｒ１はＨ又はジカルボン酸エステル残基（その塩を含む）であり、Ｒ２は、カルボキシル基又はその塩である）
【請求項２】
一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
【請求項３】
一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
【請求項４】
請求項３記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
【請求項５】
一般式（Ａ）で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる１種又は２種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞用途の培地。
【公開番号】特開２０１２−４４９１４（Ｐ２０１２−４４９１４Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８９１３６（Ｐ２０１０−１８９１３６）
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【出願人】（５０１１２３５４７）北海道三井化学株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【出願人】（５０１１２３５４７）北海道三井化学株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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