幹細胞／前駆細胞の多分化能の維持方法
本発明は、幹細胞／前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法に関する。本発明は、細胞中における遺伝子発現を調節する方法にも関する。本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させることを含む。少なくとも２つの転写因子の一方はＰＯＵおよびホメオドメイン含有転写因子から選択される。少なくとも２つの転写因子の他方はＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される。本方法は、さらに、少なくとも２つの転写因子がｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにすることを含む。このようにして形成された複合体は転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（０００１）本発明は、幹細胞／前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法に関する。本発明は、細胞内の遺伝子発現を調節するための方法にも関する。本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させることを含む。少なくとも２つの転写因子のうちの一方は、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択される。少なくとも２つの転写因子のうちの他方は、ＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される。本方法は、少なくとも２つの転写因子が、ｎａｎｏｇのプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにすることをさらに含む。このようにして形成される複合体は、転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子の発現を調節する。
【背景技術】
【０００２】
（０００２）幹細胞は、再生医療に対する鍵を握っていることがわかってきている。というのも幹細胞は、疾患、感染または先天性異常によって損傷した対応組織の代わりとなる細胞源を供給できるためである。これは、幹細胞が、無制限に増殖できる能力を持つとともに、心臓、肝臓、脳細胞などの機能的な成熟細胞に分化しうる未分化細胞であるためである。ギュンター病、ハンター症候群、およびハーラー症候群は、たとえば、幹細胞を用いて治療されてきた。白血病やリンパ腫などの病状を有するがん患者の治療は、骨髄からの成人幹細胞を用いて行われてきた。化学療法投薬量の段階的増大による血球減少に苦しむがん患者の造血系は、幹細胞の静脈内注射によって回復させることができた。韓国の研究者は、臍帯血からの成人幹細胞をうまく用いて、脊髄損傷を煩う麻痺をもつ女性が、歩行器の助けを借りて歩行できるようになったことを報告している。パーキンソン病、心筋梗塞、若年発症糖尿病をはじめとするさらに多くの疾病が、現在のところ、幹細胞または幹細胞由来の細胞の治療的移植によって治療可能であると考えられている。
【０００３】
（０００３）この点に関する特に実現可能なツールは、哺乳類の多分化性幹細胞であるが、これは当該細胞が、任意の器官、細胞タイプまたは組織タイプへ分化可能であり、少なくとも潜在的には完全な生命体へと分化することができるためである。このような多分化性幹細胞は、着床前胚および多くの成人組織のいずれにおいても見られる。特に優れているのは、哺乳類の胚盤胞の段階にある胚の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来する胚幹細胞（ＥＳＣ）である。ＥＳＣは、特定の細胞培養条件下で、より長い時間、自己再生的に細胞分裂することにより、その多分化能を維持する（たとえば、非特許文献１または非特許文献２を参照のこと）。
【０００４】
（０００４）ＥＳＣは、たとえば、神経成長因子とレチノイン酸の共存下に、ニューロンへと制御的に分化させることができるが（非特許文献３）、そのように容易に分化できることが、実践上の大きな難問をつきつけるのである。ＥＳＣを多分化性状態に維持するためには、取扱時および培養増殖時の分化を防止しなければならない。こうした理由から、ＥＳＣは、伝統的にはフィーダー細胞層上でウシ胎仔血清の共存下で（たとえば、特許文献１および特許文献２を参照のこと）、または線維芽細胞調整培地（ＣＭ）中で培養されてきた。にもかかわらず、念入りに制御された条件下においてさえ、ＥＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖のあいだに自発的に分化することがある。マウスＥＳＣにおける自己再生を媒介する因子である白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、マウスＥＳＣの分化を阻害することがわかっているが、ヒトＥＳＣの分化を阻害する際のフィーダー細胞の役割に変わるものではない。したがって、ＥＣＳの多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する手段は、幹細胞治療の完全な商業的潜在性の実現に向けての多大な功績となるであろう。
【０００５】
（０００５）成人幹細胞は、ＥＳＣのような多分化性ではないものの、自己再生可能であり、その発生能を、より未成熟な多分化性ＥＳＣの発生能と同等にする可塑性を持つことがわかっている。一例として、成人幹細胞は、その元となる組織とは異なる細胞系統に分化することができる。
【０００６】
（０００６）幹細胞は、２以上の発生学上の層が混ざり合った組織を生み出す、様々な組織（精巣および卵巣のものであることが多い）の奇形腫と呼ばれる癌においても見つかっている。このような癌の悪性型は、奇形癌とも呼ばれている。マウス奇形癌における幹細胞の発達は、正常な胚における事象と平行したものである。これらの存在は、化学治療で大量の腫瘍塊を除去しても、腫瘍の再発を防止できない場合が多いことの説明となる（非特許文献４）。したがって、このような腫瘍において幹細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を無効にする手段は、典型的にはこのような癌の永久的除去のための前提条件となるであろう。
【０００７】
（０００７）いまのところ数種のタンパク質が、多分化性細胞の正常な発達のために、かつ／または多分化性の細胞状態を維持するために重要であることが確認されている。そうしたタンパク質としては、Ｏｃｔ４（非特許文献５）、Ｓｏｘ２（非特許文献６）、Ｎａｎｏｇ（非特許文献７、非特許文献８）、およびＦｏｘＤ３（非特許文献９）が挙げられる。他のタンパク質、たとえば、ＬＩＦ（上記参照）またはＲｅｘｌ（Ｚｆｐ４２）も、このような機能に関与することが示唆されている。しかしながら、それらのタンパク質の作用機構、ならびに多分化性細胞の発生または多分化性細胞状態の維持における、当該タンパク質の特異的役割については今のところ知られていない。
【特許文献１】米国特許第５，８４３，７８０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０９０，６２２号明細書
【非特許文献１】ロエベル、ディー．エイ．（Ｌｏｅｂｅｌ，Ｄ．Ａ．）ら、２００３年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第２６４巻、ｐ．１〜１４
【非特許文献２】スミス、エイ．ジー．（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｇ．）、２００１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１７巻、ｐ．４３５〜４６２
【非特許文献３】シュルディナー（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ）ら、２００１年、Ｂｒ．Ｒｅｓ．第９１３巻、ｐ．２０１〜２０５
【非特許文献４】チャンバース、アイ．、スミス、エイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ）、２００４年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第２３巻、ｐ．７１５０〜７１６０
【非特許文献５】ニコルス、ジェイ．（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．）ら、１９９８年、Ｃｅｌｌ 第９５巻、ｐ．３７９〜３９１
【非特許文献６】アビリオン、エイ．エイ．（Ａｖｉｌｉｏｎ，Ａ．Ａ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．１２６〜１４０
【非特許文献７】ミツイ（Ｍｉｔｓｕｉ）ら、２００３年、Ｃｅｌｌ 第１１３巻、ｐ．６３１〜６４２
【非特許文献８】チャンバース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ）ら、２００３年、Ｃｅｌｌ 第１１３巻、ｐ．６４３〜６５５
【非特許文献９】ハンナ（Ｈａｎｎａ）ら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１６巻、ｐ．２６５０〜２６５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（０００８）したがって、本発明の目的は、幹細胞／前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を制御的に維持する方法、ならびに、たとえば、奇形腫中の幹細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を無効にするために、細胞内の遺伝子発現を調節する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（０００９）一つの態様において、本発明は、幹細胞／前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法を提供する。本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させることを含む。少なくとも２つの転写因子のうちの一方は、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択される。少なくとも２つの転写因子のうちの他方は、ＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される。本方法は、少なくとも２つの転写因子が、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにすることをさらに含む。このように形成された複合体は、転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節する。
【００１０】
（００１０）別の態様において、本発明は、細胞内の遺伝子発現を調節する方法を提供する。本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片をｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させることを含む。少なくとも２つの転写因子のうちの一方は、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択される。少なくとも２つの転写因子のうちの他方は、ＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される。本方法は、少なくとも２つの転写因子が、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにすることをさらに含む。このように形成された複合体は、転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（００１１）本発明は、非限定的な実施例および図面と組み合わせて、以下の詳細な説明を参照してより良く理解されるであろう。
（００１９）本発明は、ＰＯＵ特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子、ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいてもｎａｎｏｇのプロモータと複合体を形成し、さらに、この複合体の形成がタンパク質Ｎａｎｏｇの発現を調節するという驚くべき発見に基づいている。さらに驚くべきことに、このような結合領域の少なくとも１つが累積して２億五千万年以上もの進化の間、不変のままであることが判った。
【００１２】
（００２０）本願発明者の知見は、特に実用的に関係がある。というのも、ＰＯＵ特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子がタンパク質Ｏｃｔ４であり、ＨＭＧドメインを含む転写因子がタンパク質Ｓｏｘ２（参考：上記および下記）であるためである。Ｏｃｔ３としても知られるＯｃｔ４は、細胞の未分化状態に関するマーカーとしてよく使用される。Ｏｃｔ４は、ヒトおよびマウスＥＳＣにおいて高度に発現され、その発現は、これらの細胞が分化して多分化能を失うときに減衰する（パルミエリ（Ｐａｌｍｉｅｒｉ）ら、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻、ｐ．２５９〜２６７）。また、Ｏｃｔ４は成人幹細胞、腫瘍細胞、および不死化非腫瘍原性細胞においても発現されるが、分化した組織の細胞においては発現されない（たとえば、モンク、エム．（Ｍｏｎｋ，Ｍ．）、ホールディング、シー．（Ｈｏｌｄｉｎｇ，Ｃ．）、２００１年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第２０巻、ｐ．８０８５〜８０９１を参照のこと）。
【００１３】
（００２１）Ｓｏｘ２は転写因子であり、Ｏｃｔ４と同様に、分化中のＥＳＣと比べて、未分化ヒトＥＳＣ内で強くアップレギュレートされる（ブランデンバーガー、アール（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ）ら、２００４年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第２２巻、ｐ．７０７〜７１６）。Ｓｏｘ２は、たとえば、胚発生の初期段階における全ＣＮＳの神経上皮の未熟な未分化細胞においても発現される。分化が起こると、Ｓｏｘ２がダウンレギュレートされる（ステバノヴィク、エム（Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｍ）、２００３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第３０巻
第２号、ｐ．１２７〜１３２）。Ｓｏｘ２とＯｃｔ４のいずれも、他の細胞タイプを決定する際に独立した役割を果たし（ニワ、エイチ．（Ｎｉｗａ，Ｈ．）ら、２０００年、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ 第２４巻、ｐ．３７２〜３７；非特許文献６）、多分化性細胞におけるそれらの機能の少なくとも一部は、標的遺伝子の転写を駆動するために２者の間の相乗作用を介する。
【００１４】
（００２２）転写因子という用語は、ＤＮＡからのＲＮＡの合成（転写）のレベルを変えるタンパク質の能力のことをいう。典型的には、このような因子は、エンハンサ要素またはプロモータ要素などのような、各ＤＮＡ上に見られる遺伝子の所定の領域に結合して、該ＤＮＡと複合体を形成する、細胞質タンパク質または核タンパク質である。
【００１５】
（００２３）Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の相乗作用の標的としては現在、ｆｇｆ４，ｕｔｆｌ，およびｆｂｘ１５の３種が知られており（ユアン、エイチ．（Ｙｕａｎ，Ｈ．）ら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第９巻、ｐ．２６３５〜２６４５；ニシモト、エム．（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、１９９９年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１９巻、ｐ．５４５３〜５４６５；トクザワ、ワイ．（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．）ら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第２３巻、ｐ．２６９９〜２７０８）、４つ目は、ｓｏｘ２自身であると思われる（トミオカ、エム．（Ｔｏｍｉｏｋａ，Ｍ．）ら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第３０巻、ｐ．３２０２〜３２１３）が、対応するシス要素は多分化性細胞発現に対しては省略可能であると思われる（ハヤシ、エス．（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．）ら、２００２年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．第１１９巻、追補１，Ｓ９７〜Ｓ１０１）。これらの標的遺伝子のそれぞれは、８量体およびｓｏｘ結合部位を含む複合要素を有する。
【００１６】
（００２４）本発明の方法において、上述のような転写因子（以下も参照）は、新しく同定されＮａｎｏｇと命名されたタンパク質をコードする遺伝子のプロモータとともに複合体を形成する。これは、細胞の多分化性状態の維持、ならびに初期胚盤葉上層／内細胞塊（ＩＣＭ）の多分化性細胞の正常な発達、およびこの細胞集団からのＥＳ細胞の派生にも必要なタンパク質である（ミツイ（Ｍｉｔｓｕｉ）ら、前掲）。またこのタンパク質は、たとえば分化中のＥＳＣ中よりも未分化のＥＳＣ中にはるかに多く存在することから、未分化状態の細胞、たとえば、幹細胞または胚性生殖細胞に対するマーカーとして使われることも多い（ブランデンバーガー、アール（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ）ら、前掲）。Ｎａｎｏｇは、成人骨髄中でも発現されており、腎細胞やある種のがんなどの様々な成人組織において、低レベルで発現されている。Ｏｃｔ−４と同様に、Ｎａｎｏｇは、成人の成熟細胞にいくらかの胚様の可塑性を回復させうることで知られている（たとえば、シース、エヌエックス．（Ｔｈｅｉｓｅ，ＮＸ．）、ウィルマット、アイ．（Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ）、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ 第４２５巻、ｐ．２１を参照）。
【００１７】
（００２５）Ｎａｎｏｇはホメオボックスを含み、転写因子として作用する場合もある。ｎａｎｏｇの過剰発現により、通常は分化を誘発する培養条件において、ＥＳＣの多分化能および自己再生特性を維持することができる（チャンバース、アイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．）ら、前掲）。標準増殖条件下でｎａｎｏｇ発現をダウンレギュレートすると、ＥＳＣにおける分化が誘導される（図１を参照）。多分化性細胞の維持においてこの必須機能に付随するのが、ｎａｎｏｇの限局的な発現パターンである。ｎａｎｏｇ転写物は、胚盤胞形成前に、まず桑実胚の内部細胞内に現れ（チャンバース、アイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．）ら、前掲；ミツイ、ケイ．（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．）ら、前掲）、胚盤胞内では発現は内細胞塊（ＩＣＭ）に限られ（ワン、エス．エイチ．（Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｈ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ 第３巻、ｐ．９９〜１０３）、着床時にはすでに検出不能である。
【００１８】
（００２６）本願発明者による知見を考慮すると、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２がマウスの着床前発生において類似の発現パターンを有するという最近発表された研究結果（アビロン、エイ．エイ．（Ａｖｉｌｌｏｎ，Ａ．Ａ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．１２６〜１４０）が容易に理解できるようになる。Ｎａｎｏｇは、幹細胞の多分化性細胞状態および自己再生特性の維持のための鍵となる要素であるという知識に基づいて、本発明者らは、幹細胞および前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法を確立することができた。本発明者らは、さらに、それらの方法が細胞内の遺伝子発現を調節するのに適していることを発見した。
【００１９】
（００２７）ｎａｎｏｇ遺伝子は、凝縮後に現れ桑実胚の内部細胞に特異的な第１の既知の転写因子をコードし、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のいずれも、すべての割球において凝縮の前に発現される。本明細書中で用いる「ｎａｎｏｇ遺伝子」という用語は、あらゆる哺乳類のｎａｎｏｇ遺伝子、たとえば、ハート、エイ．エイチ．（Ｈａｒｔ，Ａ．Ｈ．）ら（２００４年、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ 第２３０巻、ｐ．１８７〜１９８）に記載されるようなマウスおよびヒトのｎａｎｏｇ遺伝子、ウシの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５３８９５１）、ブタの遺伝子（ＥＭＢＬアクセス番号Ｑ５ＧＭＱ０およびＱ６４ＨＸ３）、ディンゴの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４８６７０１）、チンパンジーの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４５２４３８）、マカクの遺伝子（ＥＭＢＬアクセス番号Ｑ５ＴＭ８４）、ラットの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４１４０６５（Ｌｏｃｕｓタグ：ＲＧＤ：１３０３１７８））、ＮＣＢＩアクセス番号ＡＹ７８６４３７のＲＮＡを転写し、ＮＣＢＩアクセス番号ＡＡＷ５０７０９の転写因子をコードするヤギ遺伝子、ならびにこれらのオーソログを含む。また、まだ同定されてないｎａｎｏｇ遺伝子も含まれる。また、たとえばアンネ（Ａｎｎｅ）ら（２００４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 第８４巻、ｐ．２２９〜２３８）によって同定され、当技術分野で周知の標準的な方法（たとえば、部位特異的変異法）によって機能するように改変されたもののようなｎａｎｏｇの偽遺伝子も含まれる。さらに、既知のｎａｎｏｇ配列と比較すると核酸配列に逸脱が見られる形態の遺伝子も含まれる。その差異は、たとえば、多型、１つのヌクレオチドの変化または修飾、（連続する一続きの）置換、欠失または挿入、および対応する天然の核酸配列に導入されたＮ末端および／またはＣ末端への付加によるものであってよい。本発明の方法において用いるｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域は、任意の生物種のもの、または任意の生物種に由来するものであってよい。２つの例示的実施例は、ヒトおよびマウスのｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域である。
【００２０】
（００２８）Ｎａｎｏｇは、マウスおよびヒトの多分化性細胞のいずれにおいても発現されるので、この遺伝子の多分化性転写は、シス調節要素の機能保存を通して維持されており、同時に、これらの要素の位置および配列は、浄化選択を経ても保存されると思われる。したがって、マウスおよびヒトのｎａｎｏｇゲノム配列を、配列比較のために公開データベースから得た。驚いたことに、マウスｎａｎｏｇおよびｓｌｃ２ａ３のタンデム重複の結果として、２コピーのヒトｎａｎｏｇ遺伝子が同定された（ブース、エイチ．エイ．（Ｂｏｏｔｈ，Ｈ．Ａ．）およびホランド、ピー．ダブリュ．（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｗ．）、２００４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 第８４巻、ｐ．２２９〜２３８；ハート、エイ．エイチ．（Ｈａｒｔ，Ａ．Ｈ．）ら、前掲）。ヒトＥＳＴデータ（Ｈｓ．３２９２９６）に基づけば、ＮＡＮＯＧ／ＮＡＮＯＧｌは活発に転写されるが、ＮＡＮＯＧＰ１／ＮＡＮＯＧ２は検出不能レベルを維持している。以下の実施例においては、活発に転写されるＮＡＮＯＧを用いて、マウスのホモログｎａｎｏｇと比較した。
【００２１】
（００２９）本発明の方法は、少なくとも２つの転写因子、またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域、すなわち、転写開始時にＲＮＡポリメラーゼによって認識され結合されるｎａｎｏｇ遺伝子の核酸配列と接触させることを含む。これらの転写因子のうちの一方は、Ｐｉｔ，Ｏｃｔ，Ｕｎｃ（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオ
ドメインを含む転写因子から選択される。多くの実施形態において、ホメオドメインはＰＯＵ−ホメオドメインである。ＰＯＵ特異的ドメインは一般には７５〜８２アミノ酸長であり、ＰＯＵ−ホメオドメインは約６０アミノ酸長である。天然の転写因子において、これらの２つのドメインは典型的には一緒になっていわゆるＰＯＵドメインを構成し、この場合、ＰＯＵ特異的ドメインはＮ末端領域を形成し、ＰＯＵ−ホメオドメインはＣ末端領域を形成する。ＰＯＵ特異的ドメインおよびＰＯＵホメオドメインのいずれも本発明において必要ではあるが、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータとの複合体形成が起こりさえすれば、該ドメインを任意の配置構成で選択することができる。多くの実施形態において、該ドメインは適切な長さのリンカー領域によって連結される。当業者であれば、ＰＯＵドメイン外の非保存配列が標的配列のトランス活性化に参加するとの報告を認識しているであろう。したがって、人工的に作成した転写因子、またはその機能的断片の、本発明の方法への適合性は、該転写因子または断片のｎａｎｏｇへの結合に関して調べる必要がある（下記およびたとえば、実施例２または３、図２または図３を参照）。適切な転写因子の例としては、限定はされないが、Ｐｉｔ−１，Ｏｃｔ−１，Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ−４、Ｏｃｔ−６、Ｏｃｔ−１１、Ｂｒｎ−３、Ｂｒｎ−３Ａ、ＢおよびＣ、肝細胞核因子ｌαおよびβ、網膜由来ＰＯＵドメイン因子−１、精子１ＰＯＵ−ドメイン転写因子、ラットタンパク質Ｒｏｖ−１、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の転写因子ＰＯＵｌ、ＰＯＵ２、ＧＢＸ−２およびＯｃｔ−１．５、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の転写因子Ｃｆｌａ、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の因子（ＮＣＢＩアクセス番号ＢＡＥ０６６５０）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）遺伝子ｕｎｃ−８６によってコードされるタンパク質、線虫の因子ｃｅｈ−６、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）タンパク質ｄＰＯＵ−１９／ｐｄｍ−１およびｄＰＯＵ−１９／ｐｄｍ−２、およびゼブラフィッシュの因子ｐｏｕ５ｆｌ／ｐｏｕ２が挙げられる。説明的な例としては、転写因子Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−４およびＯｃｔ−６が、ｎａｎｏｇプロモータ上の領域に結合することが示されている（ウー、ディー．（Ｗｕ，Ｄ）、ヤオ、ズィー．（Ｙａｏ，Ｚ）、２００５年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１５巻、第５号、ｐ．３１７〜３２４）。
【００２２】
（００３０）上記少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片の他方は、ＨＭＧ（高移動度群）ドメイン含有転写因子から選択される。ＨＭＧ ＤＮＡ結合ドメインは、４方向接合（４‐ｗａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）など湾曲ＤＮＡに対する著しい優先性を与える。このような転写因子の例としては、限定はされないが、Ｓｒｙ ＨＭＧボックス（Ｓｏｘ）転写因子、ＨｒＳｏｘＢ１、リンパ球エンハンサ結合因子１（ＬＥＦ−Ｉ，Ｔ細胞特異的転写因子１−α）、ＨＭＧＢ１ａタンパク質、ＨＭＧＢ１ｂタンパク質、上流結合因子（ＵＢＦ）、ＣＣＡＡＴ結合転写因子２（ＣＴＦ２）、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）、ＹＡＢＢＹファミリーのタンパク質、ミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）、顆粒膜細胞高移動度群ボックスタンパク質１（ＧＣＸ−１）、Ｔ細胞特異的転写因子７、黒穂菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓのＰｒｆｌ、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）のＳｔｅｌｌｐ因子および未命名の因子（ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ５９５６７２）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＴＣＦ／ＬＥＦ−１、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のＸＴｃｆ３、睾丸決定因子ＳＲＹ、ＸＳＯＸ３、ウニ遺伝子Ｕｎｉｃｈｒｏｍの転写産物、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来の交配型タンパク質Ａ２、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のタンパク質ＣＧ１７９６４−ＰＨアイソフォームＨ（ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ００１０１４６８５）、およびＮＣＢＩアクセス番号Ｔ１２１１３を有するソラマメの転写因子が挙げられる。
【００２３】
（００３１）いくつかの実施形態において、第２の転写因子は、ＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）タンパク質であり、例として、限定はされないが、Ｓｏｘ−１，Ｓｏｘ−２，Ｓｏｘ−３，Ｓｏｘ−４，Ｓｏｘ６，Ｓｏｘ７，Ｓｏｘ８，Ｓｏｘ９，Ｓｏｘ１０，
Ｓｏｘ１１，Ｓｏｘ−１３，Ｓｏｘ１４，Ｓｏｘ１５，Ｓｏｘ１８，Ｓｏｘ２０，Ｓｏｘ２１，Ｓｏｘ３０，Ｓｏｘ３２またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の因子Ｓｏｘ−１１−Ｄ、またはこれらの機能的断片が挙げられる。
【００２４】
（００３２）各転写因子のうち一方の機能的断片は、任意の長さのものであってよく、２つの基準によって定義することができる。第１に、機能的断片は、ｎａｎｏｇプロモータの結合領域と結合して複合体を形成することができ、前記複合体は、たとえばｎａｎｏｇ遺伝子などの当該プロモータによって駆動されるそれぞれの遺伝子の活性に影響するのに十分な安定性を有する。第２に、このような機能的断片は、ＰＯＵおよびホメオドメイン（たとえばＰＯＵ−ホメオドメイン）またはＨＭＧドメインをそれぞれ含む天然に存在する転写因子の対応するアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有しうる。いくつかの実施形態において、各断片は、既知の各転写因子の対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を、一部の実施形態においては少なくとも９５％の配列同一性を有する。「配列同一性」という用語は、既知のＰＯＵおよびホメオドメイン含有転写因子またはＨＭＧドメイン含有転写因子それぞれのアミノ酸配列と、問題とするアミノ酸配列との相同性アラインメント後に得られる、ペアワイズな同一残基の割合（％）を意味し、％の数字は、２つの配列のうち長い方の残基数に対するものである。
【００２５】
（００３３）本発明の方法において用いる転写因子の機能的断片には、たとえば融合タンパク質の形で、追加の配列がさらに結合されてもよい。また、たとえば、いわゆるアフィニティタグまたはラベルなどの天然または人工の化学修飾を含んでいてもよい。アフィニティタグの例としては、限定はされないが、ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧのペプチド、Ｔ７エピトープ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄの配列Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐからなるＨＳＶエピトープ、配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａからなるヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープおよび転写因子ｃ−ｍｙｃの配列Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕからなる“ｍｙｃ”エピトープが挙げられる。ラベルはさらに、たとえば本発明の方法において望ましい場合には、検出を助ける部分であってもよい。一例としては、限定はされないが、放射活性アミノ酸、フルオレセインイソチオシアネート、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、アミノ−メチルクマリン、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標），Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン類、フィコエリスリン、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７酵素が挙げられる。さらに適した酵素としては、限定はされないが、アルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、またはサイヨウワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
【００２６】
（００３４）各アフィニティタグまたはラベルは、選択された転写因子の任意の部分内に配置されてもよいし、任意の部分に付加されてもよい。説明的な例として、任意のＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子またはＨＭＧドメイン含有転写因子のアミノ末端またはカルボキシ末端に機能可能なように融合させるとよい。
【００２７】
（００３５）本発明の方法は、少なくとも２つの転写因子（上記参照）またはその機能的断片が、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素との複合体を形成できるようにする
ことをさらに含む。
【００２８】
（００３６）本発明の方法のいくつかの実施形態において、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片は、ｎａｎｏｇプロモータ上にヘテロ三量体複合体を形成する。それぞれの複合体の形成は、当業者周知の様々な分析方法によって検出することができ、そのような方法としては、表面プラズモン共鳴（たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術）、核磁気共鳴または結晶化とそれに続くＸ線解析が挙げられる。本発明の方法のいくつかの実施形態において、上記で詳述したような転写因子またはその機能的断片は、ヘテロ二量体を形成する。このヘテロ二量体は、その後、ｎａｎｏｇプロモータの結合領域を含む核酸とのヘテロ三量体複合体を形成する。ヘテロ三量体複合体を形成するそれぞれの二量体の例は、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のｎａｎｏｇへの結合である。結晶学的データは、これらの２つの関係する転写因子がＤＮＡ上の結合要素と三重複合体を形成することを示している（レメニ（Ｒｅｍｅｎｙｉ）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 第１７巻、ｐ．２０４８〜２０５９）。Ｏｃｔｌ構造の上にＯｃｔ４を用いて作成した相同性モデルは、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２の間で形成された複合体が、Ｏｃｔ１とＳｏｘ２の間の複合体と類似していることを示す。Ｓｏｘ２は、Ｏｃｔ４との相互作用のための２つの表面パッチを有する。そのうちの一方は、ＤＮＡとも相互作用できることがわかっているＳｏｘ２のＨＭＧドメインのＣ末端である。様々なＳＯＸおよびＰＯＵ転写因子の間での複合体形成のキャラクタリゼーションが進んでいることに鑑みて（たとえばレメニ（Ｒｅｍｅｎｙｉ）ら、前掲を参照）、様々なＰＯＵドメインおよびホメオドメインを含む転写因子、ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子が、核酸、たとえばｎａｎｏｇ遺伝子上の結合領域とヘテロ三量体複合体を形成することが予想される。
【００２９】
（００３７）各結合要素は、当業者によって知られる様々な手段によって同定することができる。実施例４は、配列比較を用いたＮＡＮＯＧ上の結合要素の同定を示したものである。このような手法は典型的には、それぞれの転写因子に対する結合要素が存在するかどうかについての情報が全く得られない場合に行われる。本発明者らは少なくとも１つのそのような結合要素をすでに同定していたので、総じてこの手順を用いることは必要でないことになる。代替の手段は、たとえば米国特許第６，７３５，５３０号明細書に開示されるようなコンピュータによって実施する方法である。さらに別の結合要素同定手段としては、たとえば実施例３に記載するようなクロマチン免疫沈降アッセイがある。この方法はさらに、活性転写領域を判定したり、ヒストン結合によるゲノムの修飾を評価したりするために使用することもできる。さらに別の手段は、実施例２および図２に記載するような電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。ｎａｎｏｇプロモータ内の結合要素を同定するさらなる方法は、たとえば蛍光タンパク質などのマーカーの発現のために該プロモータを使用することである。この手法がどのように実施されるかの例を図４に示す。強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を駆動するｎａｎｏｇ遺伝子の−２８９から＋１１７（転写開始部位（ＴＳＳ）に対して）のマウス配列を含むプラスミドベクターで、マウスＥＳＣ株をトランスフェクトした。レチノイン酸による分化誘導によってｎａｎｏｇ遺伝子をダウンレギュレートし、これにより、処理３日後のＥＧＦＰ発現が劇的に減少した（図４Ｅ、Ｆを参照）。リアルタイムＰＣＲによる、ＮａｎｏｇＥＧＦＰと、内在性Ｎａｎｏｇとの比較（図４Ｇ）から、該構築物は、内在性Ｎａｎｏｇの発現を再現することができたことがわかる。当業者であれば、これらの方法は、さらに他の方法、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発と組み合わせて、特定の領域についての結合要素の一部としてのさらなる検証に用いることができることに気づくであろう。
【００３０】
（００３８）本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも２つの転写因子は、ｎｏｎｏｇプロモータ内の複合要素に結合する。このように、これらの実施形態において、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子は、複合要素の一方部分に結合し、ＨＭＧドメイン含有転写因子は、複合要素の他方部分に結合する。各結合要素は、それぞれ
の転写因子について任意の数の結合領域を有していてもよい。たとえば、２つの部分からなる結合部位であってもよい。そのような結合要素は、たとえば、２つの転写因子Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４に対して存在することが知られている。８量体とｓｏｘ結合部位を含み、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４の標的となる複合要素を含む遺伝子は、Ｆｇｆ４，Ｕｔｆｌ，Ｆｂｘ１５およびＳｏｘ２、ならびにＰｏｕ５ｆｌ（Ｏｃｔ４をコードする遺伝子）自体である（ユアン、エイチ．（Ｙｕａｎ，Ｈ．）ら、前掲；ニシモト、エム．（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、前掲；トクザワ、ワイ．（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．）ら、前掲；トミオカ、エム．（Ｔｏｍｉｏｋａ，Ｍ．）ら、前掲；チュー、ジェイ．エル．（Ｃｈｅｗ，Ｊ．−Ｌ．）ら、２００５年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第２５巻、第１４号、ｐ．６０３１〜６０４６；オクムラ‐ナカニシ、エス．（Ｏｋｕｍｕｒａ−Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．）ら、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２８０巻、ｐ．５３０７〜５３１７）である。本願発明者は、ｎａｎｏｇプロモータ内の各複合要素を同定した（たとえば、図５Ａを参照）。いくつかの実施形態において、複合結合要素はｏｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位である。ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位内では、ｏｃｔ４およびＳｏｘ２に対する結合領域は、Ｓｏｘ２およびｏｃｔ４の両者が同時に該複合結合部位に結合できさえすれば、任意の配向、かつ任意の相対位置に配置されていてよい。２つの領域は、たとえば、互いに直接隣接していてもよい（図５Ａを参照）。
【００３１】
（００３９）本発明のいくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域内の結合要素と、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片との間での複合体の形成も検出される。この目的のために、核酸へのタンパク質の結合を検出するのに十分な感度をもつ任意の方法を用いることができる。このような方法は、たとえば、分光学的、光化学的、光分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的もしくは熱力学的手段、または細胞効果を利用するものである。分光学的検出方法の例としては、蛍光相関分光法（トンプソン、エヌ．エル．（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．）ら、２００２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．第１２巻、第５号、ｐ．６３４〜６４１）が挙げられる。光化学的方法は、たとえば、光化学的架橋である（スティーン、エイチ．（Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．）、ジェンセン、オー．エヌ．（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｎ．）、２００２年、Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．第２１巻、第３号、ｐ．１６３〜１８２）。光活性、蛍光、放射活性、または酵素的ラベルの使用（総覧として、リッペ、アール．エイ．（Ｒｉｐｐｅ Ｒ．Ａ．）ら、２００１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第１６０巻、ｐ．４５９〜４７９を参照のこと）は、それぞれ光分析、蛍光分析、放射線学および酵素による検出法に対する例である。熱力学的検出方法の例は、等温滴定熱量分析（ＩＴＣ、総覧として、ベラツケツ‐カンポイ、エイ．（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｃａｍｐｏｙ，Ａ．）ら、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第２６１巻、ｐ．３５〜５４を参照のこと）である。任意の細胞効果、たとえば、表現型の変化などは、ｎａｎｏｇ遺伝子プロモータ領域制御下の組換え因子の発現によって引き起こされうる。細胞効果を用いた方法の例には、マーカータンパク質のパターンの判定を含む、細胞分化状態の測定が含まれていてもよい（たとえば、ノークソン、ケイ．（Ｎｏａｋｓｓｏｎ，Ｋ．）ら、２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−００９３を参照のこと）。これらの方法のいくつかは、電気泳動またはＨＰＬＣなどの追加の分離技術を含んでいてもよい。詳細には、ラベルの使用についての例としては、限定はされないが、プローブとしての化合物、または触媒する反応が検出可能なシグナルをもたらすような酵素を付加した免役グロブリンが挙げられる。放射活性ラベルおよび電気泳動による分離を用いた方法の例としては、電気泳動移動度シフトアッセイが挙げられる。
【００３２】
（００４０）したがって、ｎａｎｏｇ遺伝子の結合要素と、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片との間の複合体の形成を検出する例としては、限定はされないが、免役沈降（もしくはウェスタンブロットハイブリダイゼーション）またはクロマチン免疫
沈降アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、あるいは表面プラズモン共鳴などの結合要素の同定に適した例も挙げられる。
【００３３】
（００４１）いくつかの実施形態において、少なくとも２つの転写因子が結合するそれぞれのｎａｎｏｇ遺伝子の領域は、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２８９〜＋１１７を含むヒトｎａｎｏｇ遺伝子領域に相当する領域内に位置する。一実施形態において、この領域は、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２１２〜−１１９を含むヒトｎａｎｏｇ遺伝子領域に相当する。
【００３４】
（００４２）上記詳述したように、本発明の方法において、複合体は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域内の結合要素との間で形成される。この複合体の形成は、さらに、ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を調節する。この効果は、転写活性化を調節することによって達成される。このように、少なくとも２つの転写因子の結合が、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を増大させる。ｎａｎｏｇ遺伝子の転写の増大によって、ＥＳＣの多分化性細胞状態が維持されることがわかっている（前掲）。ｎａｎｏｇ遺伝子の転写の抑制により、ヒトＥＣおよびヒト胚性癌細胞における分化が誘導されることがわかっている（図１Ｅおよびヒスロップ、エル．（Ｈｙｓｌｏｐ，Ｌ．）ら、２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−００８０を参照のこと）。
【００３５】
（００４３）本発明のいくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写の増大は、ｎａｎｏｇ遺伝子発現に換算して測定される。これは、たとえば、ｎａｎｏｇプロモータの制御下にある遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の数を測定することによって行える。当分野で一般的に用いられる方法は、ＲＮＡ分子転写後の逆転写酵素を用いたＲＮＡからｃＤＮＡへのコピーと、該ｃＤＮＡ分子の蛍光染料とのカップリングである。分析は典型的には、ＤＮＡマイクロアレイの形で行われる。アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）製のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイといった数々のサービスやキットが市販されている。ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を判定するための他の手段としては、限定はされないが、オリゴヌクレオチドアレイ、および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【００３６】
（００４４）実施例５では、ｎａｎｏｇ遺伝子発現のさらなる判定手段であるルシフェラーゼレポーターベクターの使用について説明する。この方法において、発現レベルは、ｎａｎｏｇプロモータを含むベクターを発現している細胞のルシフェラーゼ活性に反映される。ルシフェラーゼ活性は、市販のキットを用いて照度計で検出することができる（たとえば、実施例５を参照）。
【００３７】
（００４５）いくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇ遺伝子発現データを較正するか、ランク付けすることが有益または望ましいかもしれない。このように、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、得られた結果を、１つまたはそれ以上の対照測定の結果と比較することをさらに含む。
【００３８】
（００４６）このような対照測定は、主要な測定自体とは異なる任意の条件を含んでいてもよい。たとえば、ｎａｎｏｇプロモータの制御下での全く発現が起こらない条件下、または転写因子とｎａｎｏｇプロモータとの間の複合体形成が生じ得ないか、複合体形成の調節ができないような条件下での方法の条件が含まれる。いくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇプロモータの活性を所定のレベルに調節する化合物を使用することを含んでいてもよい。他の実施形態において、各化合物は、ｎａｎｏｇプロモータと２つの転写因子のうちの一方との間での複合体形成を防止するものであってもよい。
【００３９】
（００４７）対照測定のさらなる手段は、上述の転写因子の一方または両方に結合することができないか、または周知レベルよりも低い親和性または高い親和性で結合する、変異ｎａｎｏｇプロモータを使用することである。図５Ｃは、変異に用いることのできる各部位の同定例である。３つの部位が、変異導入された場合に、多分化性プロモータの機能にルシフェラーゼ活性を野生型構築物の２０％以下に低下させるという劇的な影響を及ぼした（図５Ｃを参照）。これには、ｏｃｔ部位およびｓｏｘ部位に影響する変異が含まれていた。
【００４０】
（００４８）本発明の方法のいくつかの実施形態において、２つの転写因子は相乗的に作用して、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を活性化する。２つの転写因子のそれぞれの相乗作用は、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写に対する個々の転写因子の作用によって得られるデータを、転写に対する２つ（またはそれ以上）の転写因子の作用の組み合わせと比較することによって評定できる。たとえば上述したような、遺伝子発現を判定するのに適した任意の方法をこの目的のために使用することができる。説明的な例として、図５Ｃは、ルシフェラーゼ活性アッセイ（上記参照）によるｎａｎｏｇ遺伝子発現の検出を示している。同一の構築物中でｏｃｔ部位およびｓｏｘ部位の両方が変異していると、活性は、（野生型構築物の）約２０％の活性に対して、野生型の６％にまで低下する。
【００４１】
（００４９）多分化性または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持するための本発明の方法は、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素と複合体を形成することのできる、ＰＯＵドメインおよびＰＯＵホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子を発現できさえすれば、任意の幹細胞、前駆細胞、奇形腫細胞またはそれらに由来する任意の細胞に適している。説明的な例として、任意の多分化性ヒトＥＳＣまたはそれぞれの細胞株をそれぞれの方法において用いることができる。そのような細胞の集団を得る手段は、当該技術分野において十分に確立されている（たとえば、トンプソン、ジェイ．エイ．（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．）ら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８２巻、ｐ．１１４５〜１１４７またはカウアン、シー．エイ．（Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．）ら、２００４年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３５０巻、ｐ．１３５３〜１３５６を参照のこと）。さらに、たとえば７１の独立したヒトＥＳＣ株が存在することが知られており、そのうちＧＥ０１、ＧＥ０９、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＴＥ０６またはＷＡ０９などの１１の細胞株が研究目的で入手可能である（たとえば、ＮＩＨヒト胚幹細胞レジストリー（http://stemcells.nih.gov/research/registry/eligibilityCriteria.asp）を参照のこと）。成人幹細胞は、たとえば、分娩後に残った胎盤および臍帯由来の血液から、または成人幹細胞が「衛星細胞」として会合している筋原繊維から、単離することができる（コリンズ、シー．エイ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃ．Ａ．）ら、２００５年、Ｃｅｌｌ 第１２２巻、ｐ．２８９〜３０１、また、ランド、ティー．エイ．（Ｒａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．）、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 第１１巻、第８号、ｐ．８２９〜８３１も参照のこと）。
【００４２】
（００５０）本方法が前駆細胞、すなわち成熟体細胞を生じる細胞に対して使用されることが意図される場合、本発明の本方法においては任意の前駆細胞を用いることができる。適切な前駆細胞の例としては、限定はされないが、神経前駆細胞、内皮前駆細胞、赤血球前駆細胞、心臓前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、網膜前駆細胞、または造血前駆細胞が挙げられる。前駆細胞を得る方法は当該技術分野において周知である。２つの説明的な例として、巨核球前駆細胞を得る方法が米国特許出願第２００５／０１７６１４２号明細書に開示されており、マウス肝前駆細胞株を得る方法が、リ（Ｌｉ）ら（２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ，ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−０１０８）によって記載されている。いまのところ限られたデータしか入手できないが、前駆細胞は、幹細胞と同様に、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子ならびにＨＭＧドメイン含有転写因子を発現しているようである。たとえば末
梢血から得られる内皮前駆細胞などの前駆細胞は、ＮａｎｏｇやＯｃｔ−４の高い発現レベルを示すことが発見されている（ロマグナニ、ピー．（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，Ｐ．）ら、２００５年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．第９７巻、ｐ．３１４）。網膜前駆細胞などのＣＮＳ前駆細胞は、Ｓｏｘ２を高レベルで発現することが報告されている（グラハム、ブイ．（Ｇｒａｈａｍ，Ｖ．）ら、２００３年、Ｎｅｕｒｏｎ 第３９巻、第５号、ｐ．７４９〜７６５；クラッセン、エイチ．（Ｋｌａｓｓｅｎ，Ｈ．）ら、２００４年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．第７７巻、第３号、ｐ．３３４〜３４３）。
【００４３】
（００５１）上に示したように、本発明の１つの方法は、細胞内の遺伝子発現を調節するための方法である。上述の少なくとも２つの転写因子を発現し、かつ機能的ｎａｎｏｇ遺伝子を含む任意の細胞を用いることができる。いくつかの実施形態において、内在性ｎａｎｏｇ遺伝子は機能的に活性である。これらの実施形態の一部において、それぞれの細胞は幹細胞または前駆細胞である。本発明の方法において用いることのできる幹細胞の例としては、限定はされないが、胚幹細胞、トロホブラスト幹細胞および胚外幹細胞が挙げられる。本発明の方法のいくつかの実施形態において、ヒト由来のＥＳＣなどのＥＳＣ（胚幹細胞）、すなわちヒトＥＳＣを用いることができる。他の実施形態においては、細胞は前駆細胞である（上記参照）。さらに他の実施形態において、細胞はがん細胞である。がん細胞の例示的例としては、奇形腫がん細胞、たとえば、Ｆ９、ＮＴＥＲＡ２、Ｃ３Ｈ、ＴＥＳ−１、１２４６（１２４６−３Ａなど）、ＳｕＳａ（ＳｕＳａ／ＤＸＲ１０およびＳＫＯＶ−３／ＤＸＲ１０など）、ＡＴ８０５（ＡＴＤＣ５など）、ＨＴＳＴ、ＨＧＲＴ、ＰＣ（たとえば、ＰＣＣ３／Ａ／１）またはＧＣＴ２７などが挙げられる。がん細胞のさらなる２つの例示的な例としては、ＨｅＬａ細胞およびＭＣＦ−７細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞と体細胞のハイブリッド細胞である。ｎａｎｏｇ遺伝子は、このようなハイブリッド細胞内で機能的に活性であることが示されている（たとえば、ハタノ（Ｈａｔａｎｏ）ら、２００５年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．第１２２巻、ｐ．６７〜７９を参照）。他の実施形態において、内在性ｎａｎｏｇ遺伝子は機能的に不活性である。これらの実施形態のいくつかにおいて、確立された真核細胞株の任意の細胞、たとえばＨＥＫ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＣＲＥ、ＭＴ４、ＤＥ（アヒル胚）、ＱＦ（ウズラ線維肉腫）、ＮＳ０、ＢＨＫ、Ｓｆ９、ＰＣ１２、またはＨｉｇｈ５が選択される。説明的な例は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。さらなる実施形態において、外来性ｎａｎｏｇ遺伝子は、組換え技術によって、たとえばｎａｎｏｇ遺伝子を担持するベクターを用いて導入する（以下も参照されたい）。
【００４４】
（００５２）いくつかの実施形態において、選択された転写因子またはその機能的断片は、本発明の本方法を行うのに十分な量で内在的に発現される。他の実施形態において、選択された転写因子は、細胞のプロテオーム由来のものはほとんどまたは全く存在しない。いずれの場合も、各転写因子またはその機能的断片を、所望の転写因子をコードする遺伝子を含む１つ以上の組換えベクターを用いて細胞中に導入することができる。細胞が当該転写因子をすでに内在的に発現している場合には、いくつかの実施形態においては、例えばスクリーニングアッセイにおけるシグナル／ノイズ比を改善する目的で、細胞内でのそれぞれの転写ベクターの量を増加させることが望ましいかもしれない。例示的な例として、Ｏｃｔ４および他の転写因子（ｎａｎｏｇを含む）が、アデノウィルスベクターを用いてＥＳＣ中で発現されている（カワタバ、ケイ．（Ｋａｗａｔａｂａ，Ｋ．）ら、２００５年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ 第１２巻、第３号、ｐ．５４７〜５５３）。必然ではないが、典型的には、各遺伝子は活性プロモータまたは外部刺激によって都合良く活性化可能なプロモータの制御下におかれる。
【００４５】
（００５３）目的の細胞内に、各細胞の内在性遺伝子に加えて、ｎａｎｏｇプロモータまたは完全なｎａｎｏｇ遺伝子のさらなるコピーを含めることが望まれる場合には、これも同様に組換えベクターによって達成することができる（たとえば、カワタバ、ケイ．（
Ｋａｗａｔａｂａ，Ｋ）ら、前掲）。ｎａｎｏｇプロモータ（内在性または外来性のいずれの起源であっても）の活性化を容易にするために、ｎａｎｏｇプロモータを含むベクターを細胞内に導入することが有益であるかもしれない。さらに、たとえばタンパク質を得るために、ｎａｎｏｇプロモータを用いて外来性遺伝子を発現することが望ましい場合がある。この場合、典型的には、ｎａｎｏｇプロモータ制御下に所望の外来性遺伝子を含むベクターが選ばれる。この目的のために、任意の所望の遺伝子の配列を各ベクターに含めることができる。当業者であれば、それぞれ転写されたタンパク質が本発明の方法において用いられる細胞内で翻訳後修飾を受けることが望ましい場合には、さらに酵素を同時発現することが必要なこともあることに気づくであろう。
【００４６】
（００５４）本方法においてｎａｎｏｇプロモータの制御下で用いることのできる外来性遺伝子の例としては、限定はされないが、レポータ遺伝子、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス遺伝子（いわゆる「細胞死」遺伝子）または各細胞内で所望の発現をする任意の他の遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、各遺伝子は、目的のタンパク質をコードするものであってもよい。そのような場合、本発明の方法は、各タンパク質を発現して得るために用いてもよい。ｎａｎｏｇプロモータの制御下にある遺伝子がアポトーシス遺伝子の場合、本方法は、たとえば、組織から多分化性細胞を除外するために用いることができる。
【００４７】
（００５５）例示的な例としては、ｎａｎｏｇプロモータの制御下にあるアポトーシス遺伝子を含むベクターを組織の細胞内に導入してもよい。組織は、幹細胞／前駆細胞などの多分化性細胞の分化によって得られたものであってもよい。このように本発明の方法は、各組織から、残っている全ての未分化の細胞、たとえば多分化性細胞を除外するために用いることもできる。本実施形態において、本方法は、このような未分化の細胞が生物体に移植されるのを防止するために用いることもできる。したがって、本方法の本実施形態は、たとえば、移植または埋め込み後の奇形腫の発生を防ぐために用いることもできる。さらなる説明的な例として、ｎａｎｏｇプロモータによって駆動される薬剤耐性遺伝子（たとえば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターを、幹細胞／前駆細胞の選択のために用いてもよい。
【００４８】
（００５６）他の実施形態において、本方法は、上述の少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片の、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素との複合体形成を調節する化合物を各細胞内に導入することをさらに含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、本方法は、転写因子、そのヘテロ二量体複合体、またはｎａｎｏｇプロモータの結合要素を、上記のような化合物（すなわち、少なくとも２つの転写因子の、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素との複合体形成を調節する化合物）と接触させることをさらに含む。
【００４９】
（００５７）これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素との間の上述の複合体の形成を調節する適切な化合物を同定するためのｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法である。一実施形態において、本発明の方法は、そのような化合物を同定または選択することを目的としたスクリーニング方法として用いられる。そうしたスクリーニング方法は、自動作業ステーションを用いたマルチウェルミクロプレート（たとえば、従来の４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのプレート）上での化合物ライブラリの同時スクリーニングを含んでいてもよい。説明的な例として、上述のようなｎａｎｏｇプロモータ内の結合領域と少なくとも２つの転写因子との間の複合体形成を阻害する化合物を同定することが望ましい場合がある。そのような化合物は、たとえば胚細胞腫瘍を標的とするか、ある種の組織の細胞の均一集団を生じさせるために、たとえば細胞分化を開始または補助することが望まれるかもしれない。このような化合物を、細胞を除去または分化させるために用いることが望ましい場合もある。この特性は、たとえば、上述の少なくとも２
つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの各結合要素との複合体形成の阻害によるものかもしれない（上記参照）。
【００５０】
（００５８）他の実施形態において、本方法はｉｎ−ｖｉｖｏ方法であり、本方法において用いられる細胞は、哺乳類または無脊椎動物種、または微生物の一部であるか、これらに含まれる。使用しうる哺乳類の例は、限定はされないが、ラット、マウス、ディンゴ、ウシ、ブタ、ヤギ、チンパンジー、マカウ、およびヒトである。各ｉｎ−ｖｉｖｏ法は、少なくとも２つの転写因子とｎａｎｏｇ遺伝子プロモータ内の結合領域との間の上述の複合体の形成を調節する化合物を投与することを含みうる。
【００５１】
（００５９）さらなる実施形態において、本発明の方法は、哺乳類（たとえば上記）または無脊椎動物において、ｎａｎｏｇプロモータ内の結合要素と上述の転写因子またはその機能的断片との間の複合体形成を調節することが判っている化合物を使用することを含む。典型的な実施形態において、上記のような使用には、たとえばヒトなどの哺乳類に投与可能な医薬品または医薬組成物の製造が含まれる。
【００５２】
（００６０）上述の複合体形成を調節する化合物は、任意の適切な手段によって投与することができる。細胞が哺乳類に含まれるか、その一部である場合には、化合物は非経口投与でも経口（経腸）投与でもよい。哺乳類への投与に対する典型的な実施形態において、投与は、例えば化合物の調製物を経口投与、静脈内投与、または吸入によって、血液および肝臓へ確実に送達できるものとする。経口投与のための調製物の例としては、錠剤、丸剤または飲用液が挙げられ、静脈内投与に対する調製物の例としては、注射液または注入液が挙げられ、吸入による投与に対する調製物の例としては、エアロゾル混合物または噴霧剤が挙げられる。細胞が、微生物に含まれるかその一部である場合、または個々の細胞（たとえば、培養中の組換え細胞）として用いられる場合、投与の例は、化合物を該細胞の環境中に注入または添加することである。個々の細胞を用いる場合には、後者の投与形態が、場合によっては微生物を改変する技術と組み合わせて行われることもある。そのような技術としては、エレクトロポレーションまたは細胞膜の透過化が挙げられる。
【００５３】
（００６１）本発明のｉｎ−ｖｉｖｏ方法、またはｎａｎｏｇプロモータ内の結合要素と上述の転写因子との間の複合体形成を調節するための化合物の使用は、様々な目的のために用いることができる。そのような目的の例としては、治療、診断または検査の目的がある。検査目的においては、いくつかの方法は、上述の少なくとも２つの転写因子とｎａｎｏｇ遺伝子プロモータ内の結合領域との間の複合体形成を調節することができるとしてすでに同定されている化合物を投与することを含んでいてもよく、他の方法は、そのような化合物の同定を目的としたものであってもよい。治療目的の説明的な例は、奇形腫の治療である。
【００５４】
（００６２）すでに上に示したように、本発明の本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、たとえば幹細胞／前駆細胞の分化を開始または補助するためにさらに用いることができる。
【００５５】
（００６３）上述の複合体形成を調節するために用いられる化合物は、任意の性質を有するものであってよい。たとえば、生物供給源もしくは非生物供給源から単離されてもよいし、または化学的もしくは生物工学的に生産されてもよい。そのような化合物の例としては、限定はされないが、有機小分子またはポリペプチドなどの生物活性ポリマー、たとえば、免役グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有した結合タンパク質、またはオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
（００６４）各化合物の例示的実施形態は、核酸のメチル化状態を変化させる分子、ま
たは、ＰＯＵドメインおよびホメオドメインを含む転写因子および／またはＨＭＧドメインを含む転写因子のプロモータのメチル化状態を調節する化合物である。説明的な例として、脱メチル化分子５−アザシチジンが、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４の発現を増加させることが発見されている（ツジ‐タカヤマ（Ｔｓｕｊｉ−Ｔａｋａｙａｍａ）ら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第３２３巻、ｐ．８６〜９０）。
【００５７】
（００６５）上述の複合体形成を調節するために用いられる化合物の別の実施形態は、複合体に参加している転写因子の少なくとも一方の翻訳後修飾のパターンを変化させる分子である。転写因子の活性は、リン酸化、アセチル化またはユビキチン化を含むいくつかの翻訳後修飾によって調節されていることが知られている。
【００５８】
（００６６）このような化合物のさらなる実施形態は、核酸分子である。本明細書中で用いる「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖またはその組み合わせなど、任意の可能な立体構造にある任意の核酸のことをさす。核酸には、たとえば、ＤＮＡ分子（たとえばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（たとえばｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて、または核酸化学を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、およびＰＮＡ（タンパク質核酸）が含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノム由来でも合成されたものでもよいし、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。本発明の本方法において、必然ではないが、典型的にはＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子が用いられる。このような核酸は、たとえば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチドなどであってよい。各核酸は、非天然のヌクレオチドアナログをさらに含んでいてもよいし、かつ／またはアフィニティタグもしくはラベルが結合されていてもよい（上記参照）。
【００５９】
（００６７）多くのヌクレオチドアナログが知られており、本発明の本方法において用いられる核酸およびオリゴヌクオチドにおいて使用することができる。ヌクレオチドアナログは、たとえば塩基、糖、またはリン酸部分に修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分の修飾には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕの天然または合成の修飾体、別のプリンまたはピリミジン塩基（たとえばウラシル−５−イル、ヒポキサチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イル）、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基が含まれる。他のヌクレオチドアナログは、ユニバーサル塩基として機能する。ユニバーサル塩基には、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。ユニバーサル塩基は任意の他の塩基と塩基対を形成することができる。塩基修飾は、二本鎖の安定性を高めるなどの固有の特性を達成するために、たとえば糖修飾（２’−Ｏ−メトキシエチルなど）と組み合わせることができる場合が多い。
【００６０】
（００６８）本発明の本方法のいくつかの実施形態において、核酸分子は、アプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（国際公開公報第０１／９２６５５号パンフレットに記載）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、または短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、たとえば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉ−ＲＮＡ）分子もしくは反復関連短鎖干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）分子である。
【００６１】
（００６９）短鎖干渉ＲＮＡの使用は、特定の遺伝子を「ノックダウン」するためのツールとなっている。これは、転写後レベルで起こり、ｍＲＮＡの分解を伴うＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した、遺伝子のサイレンシングまたは遺伝子抑圧を利用する。ＲＮＡ干渉は、ゲノムを保護する細胞機構に相当する。ｓｉＲＮＡ分子は、該ｓｉＲＮＡが多酵素複合体と会合していわゆるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することにより、該ｓｉＲＮＡに相補的なＲＮＡの分解を媒介する。ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣの一部となって相補的ＲＮＡ種を標的とし、次いで相補的ＲＮＡが開裂される。これが、各遺伝
子の発現の損失をもたらす（簡単な概説として、ザモア、ピーディー（Ｚａｍｏｒｅ，ＰＤ）、ハーレイ、ビー（Ｈａｌｅｙ，Ｂ）、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第３０９巻、ｐ．１５１９〜１５２４を参照されたい）。この技術は、たとえば、米国特許出願第２００５／０１９１６１８号明細書に開示されるように、寄生ＤＮＡ配列のサイレンシング、たとえばＨＩＶ ＲＮＡの開裂に応用されてきた。
【００６２】
（００７０）本発明に対するこのようなｓｉＲＮＡの典型的な実施形態は、１０〜３５ヌクレオチド、一部の実施形態においては１５〜２５ヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで合成された分子を含む。転写によって（たとえば、生きた細胞の転写機構を用いて）ｓｉ−ＲＮＡ分子を生産するために用いることのできる核酸配列の説明的な２例が、配列番号３１および配列番号３２である（実施例６を参照）。各ｓｉ−ＲＮＡ分子を対象とする細胞（微生物および動物の一部である細胞を含む）内で直接合成してもよい。また、各細胞に導入してもよいし、かつ／または該細胞に送達してもよい。ｓｉＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｖｏで選択された細胞に送達する説明的例は、重鎖抗体断片（Ｆａｂ）と核酸結合タンパク質プロタミンとの融合タンパク質にｓｉＲＮＡ分子を非共有結合により結合させることである。（ソング、イー．（Ｓｏｎｇ，Ｅ．）ら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第２３巻、第６号、ｐ．７０９〜７１７）。本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を用いて、１つまたはそれ以上のＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子および／または１つまたはそれ以上のＨＭＧドメイン含有転写因子をコードするｍＲＮＡ分子の分解を誘導する（たとえば、実施例６参照）。
【００６３】
（００７１）本発明の方法は、ｎａｎｏｇ遺伝子上の領域に特異的に結合することのできるさらなる転写因子を使用することを含んでいてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも第３の転写因子をｎａｎｏｇ遺伝子と接触させることを含む。このような転写因子の例としては、限定はされないが、ＳＭＡＤタンパク質ファミリーのメンバー（たとえば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ７、およびＳＭＡＤ９、またはキツネの条虫である多包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）由来のＳｍａｄＡおよびＳｍａｄＢ）、ＡＰ１（アクチベータタンパク質１）ファミリーのメンバー、ｈａｎｄ１（心臓および神経冠誘導体発現タンパク質１）転写因子またはｈａｎｄ１関連転写因子が含まれる。
【００６４】
（００７２）本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００６５】
配列解析およびプロモータ構築物
（００７３）すべての配列は、www.ncbi.nlm.nih.govおよび／またはwww.ensembl.org.にある公的に利用可能なデータベースから得た。ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）およびアフィリカゾウ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ ａｆｒｉｃａｎａ）のＮａｎｏｇプロモータ領域は、ＮＣＢＩにおいて入手可能なトレースファイル配列から構築した。ウェブ上（www-gsd.lbl.gov/vista ）のＶｉｓｔａゲノム配列アラインメントツール（メイヤー（Ｍａｙｏｒ）ら、２０００年）を用いて、マウスとヒトのＮａｎｏｇゲノム配列を比較した。マウスｎａｎｏｇおよびヒトＮａｎｏｇおよびＮａｎｏｇＧＰ１に対するプロモータ領域を適当な生物種のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅のためのプライマーは、クローニング用の制限酵素切断部位（小文字で示す）を備えた下記の
ｎａｎｏｇ順方向 ５’−ＣＧＣｇｔｃｇａｃＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＧＴＡＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１）、
ｎａｎｏｇ逆方向 ５’−ＣＧＣｇｇａｔｃｃＧＧＡＡＡＧＡＴＣＡＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号２）、
Ｎａｎｏｇ順方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＴＴＧＣＴＣＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＣ
Ｃ−３’（配列番号３）、
Ｎａｎｏｇ逆方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号４）、
ＮａｎｏｇＧＰ１順方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＴＴＧＣＴＣＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号５）、
ＮａｎｏｇＧＰ１逆方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号６）
とした。マウスｎａｎｏｇプロモータ断片を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））およびｐＥＧＦＰ１ベクター（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））の両方にクローニングし、ヒトプロモータはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃだけにクローニングした。すべての構築物について配列確認を行った。
【００６６】
胚幹細胞培養およびレポータの系
（００７４）Ｅ１４マウスＥＳＣを、ダルベッコ改変イーグル培地、２０％ウシ胎仔血清、１×非必須アミノ酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、および組換えＬＩＦ調整培地のアリコート中で培養した。標準的なプロトコールを用いてＮａｎｏｇＥＧＦＰ構築物でＥＳＣを安定的にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性マウス胚線維芽細胞上で培養した細胞を用いて３００μｇ／ｍＬのＧ４１８で１０日間選択した後に、個々のコロニーを採取した。ＥＳＣを、ＬＩＦ調整培地の回収、胚様体への自発的分化、またはレチノイン酸の添加により分化させた。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ビーディーバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で行った。内在性Ｎａｎｏｇおよび強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポータの発現の定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いてリアルタイムの逆転写ＰＣＲ分析によって行った。この分析のためにＰｒｏｌｉｇｏ（登録商標）により合成されたプライマーとプローブのセットは以下の
Ｎａｎｏｇ順方向、５’−ＧＧＴＴＧＡＡＧＡＣＴＡＧＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡ−３’（配列番号７）
Ｎａｎｏｇ逆方向、５’−ＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴＡＣＴＣ−３’（配列番号８）
Ｎａｎｏｇプローブ、５’−ＴＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡ−３’（配列番号９）
ＥＧＦＰ順方向、５’−ＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１０）
ＥＧＦＰ逆方向、５’−ＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡＴ−３’（配列番号１１）
ＥＧＦＰプローブ、５’−ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１２）
である。発現はａ−アクチン対照（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））に対して正規化した。ヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ−６（ハーバード大学のダグ・メルトン氏（Ｄｏｕｇ Ｍｅｌｔｏｎ）より入手）は、カウアン（Ｃｏｗａｎ）ら（２００４年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３５０巻、ｐ．１３５３〜１３５６）に従って継代した。
【００６７】
実施例１：Ｎａｎｏｇのダウンレギュレーション効果の分析
（ａ）ＲＮＡｉ分析
（００７５）本実施例では、ｎａｎｏｇ遺伝子活性のダウンレギュレートによる細胞効果をどのようにして分析するかについて説明する。実施例６（下記参照）に示すのと同様の方法から、ＮａｎｏｇのダウンレギュレーションがＥＳＣの分化に繋がることが判った。
【００６８】
（００７６）ＲＮＡｉのための遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、レイノルド（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）らの文献（２００４年）およびウイ‐タイ（Ｕｉ−Ｔｅｉ）らの文献（２００４年）にしたがって設計した。９ヌクレオチドのループを有する１９ヌクレオチドのヘアピン型ｓｈＲＮＡｓを、ｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏ（ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位、オリゴエンジン（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ））中にクローニングした。使用したオリゴヌクレオチドは以下の通り、すなわち
ＧＦＰ ＲＮＡｉ（対照）用として、
５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号１３）および
５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＧＧＧ−３’（配列番号１４）
Ｎａｎｏｇ ＲＮＡｉ用として、
５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号１５）および
５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＧＧ−３’（配列番号１６）
とした。Ｅ１４ＥＳ細胞を、５０％コンフルエントの状態でｓｈＲＮＡプラスミドおよびＧＦＰプラスミドで同時にトランスフェクションした。
【００６９】
（ｂ）ウェスタンブロット分析
（００７７）ＮａｎｏｇＲＮＡｉが、Ｓｏｘ２またはＯｃｔ４などの他の転写因子に影響を与えることなくＮａｎｏｇ発現を特異的にダウンレギュレートするかどうかを調べるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くウェスタンブロットによってタンパク質レベルを分析した。この２つの方法は当業者に周知である。Ｎａｎｏｇ発現ベクターを、対照、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のｓｉＲＮＡを発現する構築物とともに、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、抗Ｎａｎｏｇ抗体または抗βアクチン抗体を用いて行い、βアクチンを装荷量の対照とした。
【００７０】
（００７８）タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、当該技術分野においてよく確立されている標準的な方法によってＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）Ｐブロッティング膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移した。膜をＰＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ２０および５％ミルクでブロッキングし、特異的抗体をプローブとして調べた。その後、膜をセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体とともにインキュベートした。このブロットをＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ（商標）ウェスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって現像した。
【００７１】
（００７９）図１Ａに示すように、Ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡだけが、Ｎａｎｏｇタンパク質レベルを低減することができた。対照ＲＮＡｉ、Ｏｃｔ４ ＲＮＡｉおよびＳｏｘ２
ＲＮＡｉ（実施例６参照）は、Ｎａｎｏｇの発現に影響を及ぼさなかった。このＮａｎｏｇ ｓｉＲＮＡは、同時発現させたＳｏｘ２またはＯｃｔ４のレベルに影響を及ぼさなかった（図１Ｂ、Ｃを参照）。これらのデータから、Ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡがＮａｎｏｇに対して特異的であり、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子ならびにＨＭＧドメイン含有転写因子に対するモデルタンパク質として選ばれた他の２つの転写因子には影響を及ぼさないことがわかった。
【００７２】
（００８０）ＥＳ細胞を、ＮａｎｏｇまたはＧＦＰのｓｉＲＮＡを発現する構築物でトランスフェクトした（下記も参照のこと）。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシンで選択し、ウェスタンブロットから、Ｎａｎｏｇのレベルが大きく減少、すなわち、検出限界のタンパク質レベルまで減少したことがわかった（図１Ｄ）。
【００７３】
（００８１）さらに、未分化ＥＳ細胞の典型的な形態が、Ｎａｎｏｇノックダウン後に失われていた（図１Ｅ）。各写真を撮るために従来の顕微鏡を用いた。アルカリホスファターゼ染色もＮａｎｏｇノックダウン細胞において劇的に減少していた。
【００７４】
実施例２：ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との間の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体形成についての検証
（００８２）当該技術分野において電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）として知られるアッセイを用いて、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２が、ｎａｎｏｇプロモータ内の要素と複合体を形成することができるかを判定した。
【００７５】
（００８３）この目的のために、核抽出物を、ディグナム（Ｄｉｇｎａｍ）ら（１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１巻、ｐ．１４７５〜１４８９）の方法を次のように改変したものを用いて、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で成長させたＥ１４マウス胚幹細胞から調製した。すなわち、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中で掻き取ることにより回収し、ペレットの５倍容のバッファＡ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）））中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ペレットの２倍容のバッファＡに再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（タイプＢペッスル）を２０ストロークとして細胞膜を溶解した。遠心分離によって核を回収し、核ペレットの０．６倍容のバッファＣ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、２５％グリセロール、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル）に再懸濁してから、回転させながら４℃で３０分間インキュベートした。次に核を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収して透析バッファ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、２０％グリセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．８３ｍＭ ＥＤＴＡ、１．６６ｍＭ ＤＴＴ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル）に対して４℃で２時間透析した。抽出物は−８０℃で保存した。
【００７６】
（００８４）ＥＭＳＡは、ＤＮＡプローブとして、ＮＯＳと呼ばれる推定上の要素と重複するｎａｎｏｇプロモータ由来の配列を含む３７塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子としてＳｏｘ２を選び、ＨＭＧドメインを含む転写因子としてＯｃｔ４を選んだ。陽性対照として、ＦＧＦ４エンハンサ由来の既知のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２複合結合部位（ＦＯＳ）を用いた。これはｎａｎｏｇ要素とは違って、８量体とＨＭＧモチーフとの間に３塩基対の間隔があいている。
【００７７】
（００８５）両鎖の５’末端がｃｙ５によって標識された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。一本鎖の５’標識オリゴヌクレオチドをプロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）より購入し、９５℃から室温に徐々に冷却することにより、相補的な５’標識オリゴヌクレオチドにアニールさせた。使用したオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおり、すなわち
ＦＯＳ、５’−ＴＴＴＡＡＧＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１７）；
ＮＯＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１８）；
ＮｍＯＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１９）；
ＮＯｍＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡＡＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号２０）；
ＮｍＯｍＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号２１）；
ＮＮＳ、５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡ−３’（配列番号２２）
である（図４Ａを参照）。ＤＮＡ結合反応のためには、２μｌ（約１６μｇ）の核抽出物を、５０ｎＭ二本鎖標識オリゴヌクレオチドと５μｇのポリｄＧｄＣ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とを含む反応物に添加して反応体積１０μｌ（最終）とした。最終的な結合バッファ組成は、６０％透析バッファとした。核抽出物を加える前に、所定の１μＭ非標識オリゴヌクレオチド競合物も含めた。結合反応は、室温（ＲＴ）で約２０分間行った。所定の２μｌ（抗Ｏｃｔ４および抗ＪｕｎＢ）または８μｌ（抗Ｓｏｘ２および抗Ｓｏｘ４）の抗体を最初の結合反応に続いて付加し、さらに２０分間インキュベートした。サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）より購入した抗体は以下の通りである。ウサギ抗Ｏｃｔ４ポリクローナル抗体（Ｈ−１３４）ｓｃ−９０８１ｘ；ヤギ抗Ｓｏｘ２ポリクローナル抗体（Ｙ−１７）ｓｃ−１７３２０；ウサギ抗ＪｕｎＢポリクローナル抗体（Ｎ−１７）ｓｃ−４６ｘ；ヤギ抗Ｓｏｘ４ポリクローナル抗体（Ｃ−２０）ｓｃ−１７３２６。結合反応物を、プレラン済みの６％非変性ポリアクリルアミドゲルで、０．５×ＴＢＥ中、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ｐｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＩＩ ｘｉ装置で３００Ｖにて２時間かけて分離した。ゲルは、モレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のＴｙｐｈｏｏｎ（商標）９１４０型画像解析装置を用いて、赤色レーザ（６３３ｎｍ）ならびに、設定を６００Ｖ、通常感度および焦点面＋３ｍｍとしたＰＭＴとともにｃｙ５エミッションフィルタを用いて、ガラス板中で直接撮影した。マウス胚線維芽細胞フィーダーのみについて行ったＥＭＳＡでは、有意な移動度シフトは生じなかったことから、それらが観察されるタンパク質ＤＮＡ複合体に寄与しないことが示された。
【００７８】
（００８６）最初に、Ｅ１４マウス胚幹細胞の核抽出物中のＤＮＡ結合タンパク質が、ＮＯＳ要素を認識することができるかどうかを調べた。図２に示すように、ＥＭＳＡにおいて、ＮＯＳ要素に結合する４つの主要タンパク質複合体が観察された。ＦＯＳ要素に結合する類似の移動度を示す４つの複合体が観察されたが、この配列に結合するもう１つの複合体も観察された（レーン１２）。さらに、複合体Ｃは、ＦＯＳ要素上よりもＮＯＳ要素上において僅かに速い移動度を有するようにみえた。
【００７９】
（００８７）これらのバンドのいずれがＯｃｔ４またはＳｏｘ２に相当するかを判定するために、これらのタンパク質に対する抗体を結合反応物に加えることによってスーパーシフトが起こるかどうかを調べた。実際には、抗Ｏｃｔ４抗体を添加した後、複合体のうちの２つ、ＡおよびＣが消失し、標識されたプローブがウェル中に蓄積した（標識Ｏｃｔ４のスーパーシフト）。これは、ＮＯＳおよびＦＯＳプローブの両方で観察され（レーン２および１３）、いずれの配列上の複合体ＡおよびＣもＯｃｔ４を含んでいたことがわかった。同様に、抗Ｓｏｘ２抗体の添加により、ＮＯＳプローブとの複合体Ｃ、およびＦＯＳプローブとの複合体ＣおよびＥが消失した（レーン３および１４）。いずれの場合も、より移動の遅い複合体（標識Ｓｏｘ２のスーパーシフト）が観察された。このことは、複合体ＣおよびＥがＳｏｘ２を含んでいたことを示す。重要なのは、ＪｕｎＢまたはＳｏｘ４のいずれかに対する抗体を加えてもバンドの移動度に全く影響がなく、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２抗体の影響が特異的であることが示されたことである。したがって、複合体ＣがＯｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体の両方によってスーパーシフトしたことから、このバンドは複合要素に結合したこれらのタンパク質のヘテロ二量体を示す。複合体Ａは該ヘテロ二量体よりもより迅速に移動し、Ｏｃｔ４抗体によってのみ認識されたことから、この複合体はＯｃｔ４単量体であることが強く示唆される。同様に、ＦＯＳ配列上の複合体Ｅは、ヘテロ二量体よりも速く移動し、Ｓｏｘ２抗体によってのみ認識されたことから、これはＳｏｘ２単量体に相当することが示された。これらのバンドの相対移動度は、以前に公
表されている、ＦＧＦ４要素に結合するＦ９テラトカルシノーマ細胞抽出物中のＯｃｔ４およびＳｏｘ２を同定した結果と矛盾するものではない。
【００８０】
（００８８）現在、複合体ＢおよびＤ中の結合因子は同定されていない。複合体Ｄの有力候補は転写因子Ｏｃｔ１であり、該転写因子Ｏｃｔ１は、ＦＧＦ４要素内の８量体モチーフを認識し、移動度が同様に遅いことが示されている。さらに、Ｏｃｔ１は、ＦＧＦ４複合要素上でＳｏｘ２とヘテロ二量体を形成することが示されている。しかしながら、さらに遅く移動する複合体が無いことから、Ｅ１４核抽出物においては、少なくともＥＭＳＡによって検出されるレベルではヘテロ二量体の形成が起こっていないことが示唆される。
【００８１】
（００８９）ＮＯＳに結合したＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体が、ＦＯＳに結合したものよりも移動がわずかに速い（レーン１と１２の複合体Ｃを比較）ことは、ＦＯＳ配列の場合のように８量体モチーフをＨＭＦモチーフから隔てるヌクレオチドが存在するわけではないために、ＮＯＳ配列上でより緊密なコンフォメーションが生じることもありうるという考えと矛盾しない。このようなコンフォメーションの違いが転写活性の差異や共調節因子の動員の差異をもたらすと考えると面白い。
【００８２】
（００９０）これらの因子のＤＮＡ結合特異性を確立するために、オリゴヌクレオチド競合を行った。いずれの因子によるＮＯＳへの結合も、２０倍過剰の同一の非標識ＮＯＳを加えることによって強く競合したが（レーン７）、ｎａｎｏｇプロモータのすぐ下流の配列を含む非特異的非標識オリゴヌクレオチド（ＮＮＳ）は、結合に対して有効な競合を示さなかった（レーン１１）。これらの結果は、これらの因子のＮＯＳに対する結合が特異的であることを示す。同様に、非標識ＦＯＳが標識ＦＯＳに対するすべての結合と競合可能であり（レーン１７）、ＮＳＳでは競合できなかった（レーン２２）ことから、ＦＯＳ配列に対する結合もまた特異的である。さらに、非標識のＦＯＳおよびＮＯＳのいずれも相互に競合可能である（レーン６および１８）ことから、０または３塩基対の間隔を有する競合物のいずれが２０倍過剰に加えられた場合にも、同等に有効であることがわかる。ＮＯＳおよびＦＯＳのいずれの場合も、８量体モチーフ内に３塩基対の置換を有する競合物の存在下で結合が行われる場合、Ｏｃｔ４単量体およびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体による結合に対する競合は起こらなくなるが（レーン８および１９）、Ｓｏｘ２単量体に対する競合は依然として起こる（レーン１９）。このことは、Ｏｃｔ４単量体およびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体のいずれの結合に対しても完全な８量体モチーフが必要であることを示している。同様に、競合物のＨＭＧモチーフ内を３塩基対置換することにより、ＮＯＳおよびＦＯＳに関するＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体との競合（レーン９および２０）およびＦＯＳに関するＳｏｘ２単量体との競合（レーン２０）が消失する。いずれの場合も、Ｏｃｔ４単量体は依然として競合を受けている。このことは、Ｓｏｘ２単量体およびＳｏｘ２／Ｏｃｔ４ヘテロ二量体の結合には完全なＨＭＧドメインが必要であることを示している。最後に、同じ競合物中の８量体およびＨＭＧモチーフの両方において２塩基対を置換することにより、Ｏｃｔ４単量体およびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体のＮＯＳおよびＦＯＳ両者への結合に対する競合が消失し（レーン１０および２１）、かつＳｏｘ２単量体のＦＯＳへの結合に対する競合が消失した（レーン２１）。図２からわかるように、ＥＭＳＡは転写因子とＮａｎｏｇとの間の形成を検証する便利な手段である。しかしながら、例えばＧＳＴプルダウンアッセイまたはＢｉａｃｏｒｅなどの他の手段を利用してもよい。
【００８３】
実施例３：ＮＡＮＯＧと（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との間のｉｎ ｖｉｖｏ複合体形成の検証
（００９１）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮａｎｏｇと転写因子との間の相互作用を分析する方法は、当業者には「クロマチン免役沈降アッセイ」または「ＣｈＩＰアッセイ」とし
て知られている。
【００８４】
（００９２）本実施例では、Ｏｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体ならびにマウスおよびヒトのＥＳＣからの核抽出物とともに、またはレチノイン酸で分化させたマウスＥＳＣにおいて、上記方法を使用することについて説明する。
【００８５】
（００９３）Ｅ１４マウスＥＳＣを用いたＣｈＩＰアッセイは、既述（ウェルズ、ジェイ．（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．）およびファーナム、ピー．ジェイ．（Ｆａｒｎｈａｍ，Ｐ．Ｊ．）、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｏｒｌａｎｄｏ）第２６巻、ｐ．４８〜５６）のようにして行った。簡潔に述べると、細胞を１％ホルムアルデヒドで１０分間室温にて架橋し、１２５ｍＭグリシンを添加することによってホルムアルデヒドを不活性化した。平均５００塩基対の大きさのＤＮＡ断片を含んだクロマチン抽出物を、Ｏｃｔ４ポリクローナル抗体（Ｎ１９）またはＳｏｘ２ポリクローナル抗体（Ｙ１７）（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））またはＳｏｘ２ポリクローナル抗体（ＡＢ５６０３）（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を用いて免役沈降させた。すべてのＣｈＩＰ実験に対して、定量的ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（アプライドバイオシステムズ）を用いて、既述（ン、エイチ．エイチ．（Ｎｇ，Ｈ．Ｈ．）ら、２００３年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ 第１１巻、ｐ．７０９〜７１９）のようにリアルタイムで行った。相対占有率は、見かけ上の免役沈降効率（入れた試料の量に対する免役沈降したＤＮＡ量の比）を測定し、対照の領域について観察されたレベルを１．０として正規化することによって算出した。プライマー対は以下のとおり、すなわち
１、５’−ＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＡＴＡ−３’（配列番号２３）、
５’−ＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＴＡＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’（配列番号２４）；
２、５’−ＧＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２５）、
５’−ＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＴＡＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＡＴＴＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２６）；
３、５’−ＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡ−３’（配列番号２７）、
５’−ＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２８）；
４、５’−ＧＧＴＧＡＴＡＣＧＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＡ−３’（配列番号２９）、
５’−ＧＧＧＣＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号３０）
とした。
【００８６】
（００９４）フィーダー無しの条件で増殖させた未分化のマウスＥＳＣからは、複合ｏｃｔ−ｓｏｘ要素を含むＤＮＡ断片が、それぞれＯｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体による免役沈降で４３倍および３７倍にまで富化された（図３Ａ、アンプリコン２）。ｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素を含まない２つの隣接領域には有意な富化はみられなかった（図３Ａ、アンプリコン１および３）。さらに、マウスＥＳＣをレチノイン酸によって分化誘導すると、このｏｃｔ−ｓｏｘ含有断片の富化は、その分化の程度に応じて低減された。分化の３日後、Ｏｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体を両方用いた場合にのみ富化は最大でバックグラウンドの１０倍にまで達したが、分化の６日後には、有意な富化は検出できなかった（図３Ａ）。Ｍｌｌに対する抗体を陰性対照として用いた場合、分析した３つのＥＳＣ状態の
いずれからもアンプリコンのいずれについても有意な富化は見られなかった（データ示さず）。ここで同定された富化のレベルは、ＥＧＦＰレポータ系を用いた上述の類似の分化プロトコールにおけるＮａｎｏｇプロモータの活性の場合とよく対応している。
【００８７】
（００９５）ＯＣＴ４およびＳＯＸ２がヒトＥＳＣのＮＡＮＯＧプロモータとも相互作用することを検証するために、類似のＣｈＩＰ分析を行ってもよい。本実施例においては、不活性化マウス胚線維芽細胞上で増殖させたヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ−６を用いた。ＯＣＴ４抗体およびＳＯＸ２抗体でクロマチン免役沈降したＤＮＡの富化を検出するために、いずれもＮＡＮＯＧのエキソン１に近接する６つの異なるアンプリコンを用いた（図３Ｂ）。複合ｓｏｘ−ｏｃｔ要素と近いほうの３つのアンプリコンだけが、両抗体による有意な富化を示した（図３Ｂ）。第２のＳｏｘ２抗体（Ｙ１７）から、類似の結果が得られた（データ示さず）。マウスＥＳＣにおいて見られるものと比較して３つすべての抗体について富化率が低い（６倍）のは、未分化なヒトＥＳＣを培養中に維持するのがより難しい傾向にあるので、ヒト培養物に分化した細胞がより多く存在することによるのかもしれない。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体を陰性対照として用いたところ、これらのヒトＥＳＣ中のアンプリコンのいずれに対しても有意な富化は見られなかった（データ示さず）。まとめると、これらのＣｈＩＰデータのすべてが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、未分化なマウスおよびヒトＥＳＣ中のＮａｎｏｇ／ＮＡＮＯＧプロモータ上をＯｃｔ４／ＯＣＴ４およびＳｏｘ２／ＳＯＸ２が占有することを明確に示している。
【００８８】
実施例４：ＮＡＮＯＧ上の結合要素の同定
（００９６）本実施例では、Ｎａｎｏｇ遺伝子上の結合領域を、その配列保存性に基づいてどのようにして同定できるかを説明する。
【００８９】
（ａ）シス調節情報を含む非コーディング領域の配列比較
（００９７）本発明者らは、ｎａｎｏｇの高度に保存された結合領域、ｓｏｘ−ｏｃｔ複合要素を同定済みである。マウスおよびヒト遺伝子配列のペアワイズなアラインメントを、エルビーエル・バークレー（ＬＢＬ Ｂｅｒｋｌｅｙ）のＶｉｓｔａオンラインツール（メイヤー、シー．（Ｍａｙｏｒ，Ｃ．）ら、２０００年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ 第１６巻、ｐ．１０４６〜１０４７）を用いて作成し、作成にあたっては、最適なアラインメントの作成時に種特異的な反復要素を考慮した。このアラインメントに対しては、マウスｎａｎｏｇＥＳＴの最も５’側の１０ｋｂ上流から、３’マウスｎａｎｏｇＥＳＴの最も３’側の１０ｋｂ下流までのゲノム領域を選択した。配列類似性のピークがｎａｎｏｇの４つのエキソンに対応して同定されたが、ホメオドメインをコードするエキソン２および３で最も顕著であり、エキソン１で最も顕著でなかった（データ示さず）。非コーディング領域のなかでは、ＥＳＴの最も５’側のすぐ上流に、近位プロモータと定義される、有意な配列保存性を有する唯一の領域がみつかった。
【００９０】
（００９８）非コーディング配列に有意な保存性が認められないことは、多分化性発現を指示するシス調節要素が、すべてこの近位プロモータ領域内にあることを示唆することに他ならない。このことを調べるために、レポータＥＧＦＰの発現を駆動するマウス近位プロモータ領域を含むプラスミドベクターで、安定にトランスフェクトされたマウスＥＳ細胞株を作成した。４０６塩基対のプロモータ断片は、優勢な転写開始部位として定義されてきたことから、最も遠い５’共通（ｐｕｂｌｉｃ）ＥＳＴの位置として同定されている位置に対して−２８９から＋１１７の配列で構成した（ハート、エイ．エイチ．（Ｈａｒｔ，Ａ．Ｈ．）ら、前掲）。選択後、これらのｎｅｏ耐性コロニーの大半が、緑色の蛍光を発し、ｎａｎｏｇプロモータのこの領域が多分化性細胞において実際に活性を有することを示した（図４Ｂを参照）。これらのｎａｎｏｇＥＧΕＶコロニーのいくつかをさらなる分析のために選択した。
【００９１】
（００９９）このプロモータ断片内の明らかに多分化性ポジティブなシス調節要素に加えて、発明者らは、内在性ＮａｎｏｇのｍＲＮＡレベルでは起こるような、ＥＳ細胞分化時の転写のダウンレギュレーションに十分なシス調節情報を該断片が含んでいるかを判定することに関心を持った。ＥＳ細胞分化の強力な誘発剤であるレチノイン酸を０．１μＭで使用して分化を誘発させた。この処理により、３日後にＥＧＦＰ発現が劇的に減少し（図４Ｅ−Ｆ参照）、分化から４日後までにはＦＡＣＳ分析による測定でＥＧＦＰポジティブのままの細胞はわずか９％にすぎなかった（図４Ｇを参照）。これは同じ分化プロトコールにおける内在性ｎａｎｏｇのｍＲＮＡレベルと非常に似ている（チャンバース、アイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．）ら、前掲）。
【００９２】
（０１００）より明敏な分化プロトコールにおいても、このプロモータ構築物の活性はやはり内在性Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡレベルと類似していた。ｎａｎｏｇＥＧＦＰ細胞をＬＩＦの非共存下で培養したところ、ＥＧＦＰ発現が培養の３日後に顕著に低下し（図４Ｃ〜Ｄを参照）、４日目までには、ＥＧＦＰポジティブであったのは、フィーダーを含まない未分化ｎａｎｏｇＥＧＦＰ細胞では７４％であるのに対して、４８％の細胞にすぎなかった（図４Ｇを参照）。胚様体形成もまた、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ビーディーバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））上でのＦＡＣＳ分析によって測定されるように、ＥＧＦＰ発現のダウンレギュレーションを誘発した。内在性ＮａｎｏｇおよびＥＧＦＰレポータの発現の定量化は、上述のようなＲＴ−ＰＣＲ分析によって行った（「胚幹細胞培養およびレポータの系」を参照）。分化の最初の２日の後、ＥＧＦＰ発現は次第に減少し、８日目までには、バックグラウンドレベルの発現しか認められず（図４Ｇを参照）、これは、内在性Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡの発現と類似している（ハート（Ｈａｒｔ）ら、２００４年）。よってこのｎａｎｏｇの４０６塩基対断片は、少なくともＥＳ細胞を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏの系において試験した場合には、内在性ｎａｎｏｇ発現を再現するのに十分なシス調節情報を含んでいる。
【００９３】
（ｂ）系統発生学的フットプリンティングによる結合要素の同定
（０１０１）広範囲の哺乳類から近位プロモータ領域のアラインメントを作成することにより、同定を強力な系統発生学的フットプリントにすることができる。このアラインメントの構築にあたって使用した５つの種の間の分岐年代は、控えめに見積もっても、マウスとラットの分岐については千２百万年前であり、マウス、ラット、ヒト、ウシおよびゾウの間では六千万年前であるが、この見積もりから、フットプリントを同定するための累積２億５千２百万年の浄化選択が提供される。最も大きい配列保存の長さは、ｎａｎｏｇ転写開始部位との相対位置−２１２から−１１９までに位置する９４塩基対領域にわたり、このうち６４位置が不変である（図５Ａを参照）。
【００９４】
（０１０２）最も長い連続不変配列は１６塩基対長であり、面白いことに、この配列の中に、ｆｇｆ４，ｕｔｆ１，ｓｏｘ２，およびｆｂｘ１５の多分化性発現において同定された要素もしくは前記発現に対して機能的であることが知られている要素と類似した、１５塩基対のｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素（図５Ａを参照）がある（ユアン、エイチ．（Ｙｕａｎ，Ｈ．）ら、前掲；ニシモト、エム．（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、前掲；トミオカ、エム．（Ｔｏｍｉｏｋａ，Ｍ．）ら、前掲；トクザワ、ワイ．（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．）ら、前掲）。ｓｏｘ要素とｏｃｔ要素の相対位置は、上記５つの遺伝子全部において同じであり、このことは、多分化性細胞においてこれらの要素と結合することが知られている対応する転写因子（Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）の間の特異的なタンパク質−タンパク質接触を示すものである（レメニ、エイ．（Ｒｅｍｅｎｙｉ，Ａ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．２０４８〜２０５９）。ｕｔｆｌ，ｓｏｘ２，およびｆｂｘ１５と同様に、ｎａｎｏｇ内のｓｏｘシス要素およびｏｃｔシス要素は互いに直接隣接しており、ｆｇｆ４においては該２つの要素は３つの塩基で隔てられている。
【００９５】
（０１０３）ｎａｎｏｇプロモータ内の多数の部位におけるこのような強力な浄化選択は、転写の調節におけるこれらの部位の機能的役割を示唆するものである。これらの部位のいくつか、たとえば、ｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素などは、多分化性発現において重要でありそうだし、他のものは、ｎａｎｏｇの移植後発現において機能するシス調節要素に相当するかもしれない。さらに、マウスＥＳＣにおける超並列シグニチャシーケンシング（ウェイ、シー．エル．（Ｗｅｉ，Ｃ．Ｌ．）ら、２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ 第２３巻、ｐ．１６６〜１８５）によって測定されたように、ｓｏｘ−ｏｃｔ複合要素の位置および向きと、対応する遺伝子の発現レベルとの間には、明確な関係はない（表１）。
【００９６】
実施例５：ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との複合体によるｎａｎｏｇ遺伝子発現の調節
（０１０４）本実施例では、ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との複合体形成の、多分化性細胞の転写活性化に対する影響の分析について説明する。
【００９７】
（０１０５）上記保存プロモータ内の特定の配列要素の役割を調べるために、一連のルシフェラーゼレポータ構築物を構築し、Ｆ９テラトカルシノーマ細胞内にトランスフェクトした。
【００９８】
（０１０６）ＤＮＡ断片（−２８９〜＋１１７）は、プライマーｐＮａｎｏｇＦおよびｐＮａｎｏｇＲを用いてＰＣＲによりマウスゲノムＤＮＡ（２Ｂ ｇＤＮＡ）から増幅した（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｐｆｕポリメラーゼ）。そのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化断片をｐＥＧＦＰ−１（ビーディーバイオサイエンシズ・クロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この完全な構築物に続いて、ｐＥＧＦＰ−１マルチクローニングサイト由来の２２塩基対を含むＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＧＬ３ Ｂａｓｉｃ（プロメガ）のＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをシーケンシングにより確認し、ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ ｐＮａｎｏｇと名付け、次の突然変異誘発実験に用いた。レポータプラスミドは、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて３塩基対の変異が組み込まれるように改変した。修飾プラスミドはシーケンシングにより確認した。Ｆ９細胞（ＡＴＣＣ）を、１５％標準ウシ胎仔血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））および１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン‐ストレプトマイシン）を含む高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。細胞は、５％ＣＯ２で３７℃に維持した。ＤＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、２４ウェル形式の細胞培養に対する同社のプロトコールを用いてＦ９細胞中にトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（プロメガより入手したｐＲＬ−ＴＫ）を内部対照として同時トランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解し、溶解物のルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポータアッセイシステム（プロメガ）により、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０型９６ウェル照度計（ベルトールドテクノロジーズ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて測定した。少なくとも、トランスフェクションは２回ずつ、２回の独立した状況で行った。レポータプラスミドは、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標）部位特異的変異誘発キット（クロンテック）を用いて、３塩基対の変異が組み込まれるように改変し、変異はシーケンシングによって確認した。
【００９９】
（０１０７）ｎａｎｏｇＥＧＦ ＥＳ細胞を作製するために用いた野生型４０６塩基対プロモータ断片は、予想どおり顕著な転写活性を有し、すべての比較において該活性を１００％と設定しポジティブコントロールとして使用した（図５Ｂ、２Ｃを参照）。図５Ａ
中の保存配列のすぐ５’側から始まるこの野生型プロモータのより短いもの（−２３０〜＋６３）は、元のプロモータ活性の約１３０％を維持していた。このことは、この短いプロモータから除外された配列内に潜在的な負の調節要素が含まれていることを示唆するだけでなく、多分化能エンハンサ要素が−２３０〜＋６３の領域内に含まれることを示している。
【０１００】
（０１０８）この保存されたモジュールの方向依存性を調べるために、この領域（−２８９〜−９４）が直近位プロモータ（−９３〜＋１１７）に対して順方向または逆方向のいずれかの方向の相同な構築物を構築した。野生型活性の７９％が順方向構築物において維持され、４８％が逆方向構築物において維持されていた。有意な転写活性は、この保存領域を逆向きにした場合にも該領域に維持されていたことから、わずかに低い活性が向きの微妙な影響を示すかもしれないものの、エンハンサ活性は向きに依存しないことが示唆された。
【０１０１】
（０１０９）保存領域の機能的重要性の別の尺度として、第２の種からの、すなわち、ヒトｎａｎｏｇを用いて、相同領域を調べた。マウスＦ９細胞にトランスフェクトされたこの構築物は、マウス転写活性の６０％を維持していた（Ｈｓ．１、図５Ｂを参照）ことから、実質的な機能保存が示された。本発明者らは、ＮａｎｏｇＧＰｌの、ヒトｎａｎｏｇのタンデム重複コピーからの相同領域についても調べた。おもしろいことに、ヒト多分化性細胞においてこの転写物のレベルは非常に低いにもかからわず、該領域は有意な転写活性を維持しており（Ｈｓ．２、図５Ｂを参照）、このことは、ＮａｎｏｇＧＰｌの不活性化変異がシス調節要素中ではなく、コーディング配列中にストップコドン８アミノ酸を生じることが判っているものでありそうなことを示唆している（ブース、エイチ．エイ．（Ｂｏｏｔｈ，Ｈ．Ａ．）およびホランド、ピー．ダブリュ．（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｗ）、前掲）。
【０１０２】
実施例６：Ｎａｎｏｇ活性ＲＮＡｉ分析の調節の分析
（０１１０）本実施例では、ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子とのあいだの複合体形成による、Ｎａｎｏｇプロモータの活性調節の分析について示す。本実施例においては、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２がＮａｎｏｇプロモータの多分化性活性に与える影響を分析した。
【０１０３】
（０１１１）この目的のために、ＲＮＡｉ実験を実施して、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のレベルを低下させた。この実験で用いたＰｏｕ５ｆｌおよびＳｏｘ２ ＲＮＡｉ構築物のいずれも、それぞれのｍＲＮＡを特異的にノックダウンすることがすでに知られているものである。Ｎａｎｏｇ−ルシフェラーゼレポータ構築物を、マウスＥＳＣにＰｏｕ５ｆｌ、Ｓｏｘ２、ＧＦＰ、または空のＲＮＡｉ構築物と同時トランスフェクトし（図６Ａ）、その後ルシフェラーゼ活性のアッセイを行った。
【０１０４】
（０１１２）オリゴヌクレオチドを、既述（ブルメルカンプ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ）ら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２９６巻、ｐ．５５０〜５５３）のようにして、９ヌクレオチドループを有する１９ヌクレオチドのヘアピン型短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏ（ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位；オリゴエンジン（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ））にクローニングした。すべての配列について、ＢＬＡＳＴ検索で解析し、他の遺伝子と有意な配列類似性を有していないことを確認した。Ｅ１４マウスＥＳＣは、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルプレートに細胞が２０，０００〜３０，０００個／ウェルの密度で（１０００個／ウェルの初代胚線維芽細胞とともに）播種した。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて行った。５０ｎｇのＮａｎｏｇ−ｐＧＬ３（ホタルルシフェラーゼ構築物），１５０ｎｇのｐＳｕｐｅｒまたはｐＳｕｐｅｒ＿ＲＮＡｉ，およびｐｈＲＬＳＶ４０（
ウミシイタケルシフェラーゼを発現する正規化対照）をトランスフェクトした。
【０１０５】
（０１１３）トランスフェクションから２４時間後に、ピューロマイシン耐性でさらに２日間細胞を選択してから、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＮＡｉに用いた配列は以下のとおり、すなわち
Ｓｏｘ２、５’−ＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＴＴＡ−３’（配列番号３１）；
Ｏｃｔ４、５’−ＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴ−３’（配列番号３２）
である。
【０１０６】
（０１１４）図６Ｂに見られるように、ルシフェラーゼ活性は、Ｐｏｕ５ｆｌおよびＳｏｘ２のＲＮＡｉによってほとんどバックグラウンドレベルにまで低減されたが、ＧＦＰおよび空のＲＮＡｉ対照では全く影響がなかった。
【０１０７】
（０１１５）本明細書で例示的に記載した発明は、本明細書に具体的に開示されていないような任意の要素または限定なしで適切に実施してもよい。したがって、たとえば、用語「〜を含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”，“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”，“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”，など）」という用語は、限定的ではなく開放的に読まれることになる。さらに、本明細書で用いる用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、開示および説明した特徴およびその一部の任意の均等物を除外するような用語および表現を使用する意図は全くなく、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内で様々な修正が可能であるものと理解される。したがって、本発明を説明的実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示してきたものの、本明細書に開示する具現された発明の修正および変更も、当業者によって行使されることができ、そのような修正や変更も本発明の範囲に含まれるとみなされると理解すべきである。
【０１０８】
（０１１６）本発明について、広範かつ一般的に本明細書において説明してきた。包括的開示の範囲内に入るより狭い種類のものおよび準包括的な群もまた、本発明の一部を構成する。これには、除外されたものが本明細書に具体的に列挙されているかどうかに関係なく、その分類から任意の特徴を除外する条件または負の限定を有する本発明の包括的説明も含まれる。
【０１０９】
（０１１７）他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の中にある。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、本発明が、そのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていることを理解できるであろう。
【０１１０】
【表１】
上記表中、
ａ参照文献：Ｆｇｆ４：ハート（Ｈａｒｔ）ら、前掲；
Ｕｔｆｌ：ニシモト（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ）ら、前掲；
Ｓｏｘ２：トミオカ（Ｔｏｍｉｏｋａ）ら、前掲；
Ｆｂｘｌ５：トクザワ（Ｔｏｋｕｚａｗａ）ら、前掲；
Ｎａｎｏｇ：本願発明者；
Ｐｏｕ５ｆｌ：本願発明者，オクムラ‐ナカニシ（Ｏｋｕｍｕｒａ−Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）ら、前掲
ｂ転写開始部位から
ｃＭＰＳＳ：超並列シグニチャシーケンシング（ウェイ（Ｗｅｉ）ら、前掲）
ｄｔｐｍ，マウスＥＳＣにおける１００万あたりのタグ数
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＮａｎｏｇＲＮＡｉを用いた胚幹細胞（ＥＳＣ）におけるＮａｎｏｇダウンレギュレーションの効果を示す図。（Ａ）使用したＮａｎｏｇＲＮＡｉの特異性について、Ｎａｎｏｇ発現ベクターを、対照、Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のｓｉＲＮＡを発現する構築物とともに２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトすることによって調べた。細胞溶解物を、抗Ｎａｎｏｇ抗体または抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。βアクチンは装荷量の対照とした。（Ｂ）ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡは、Ｓｏｘ２の発現に影響を及ぼさなかった。ｎａｎｏｇまたは対照のｓｉＲＮＡ構築物を、Ｓｏｘ２発現ベクターとともに２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトした。溶解物を、抗Ｓｏｘ２抗体または抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。（Ｃ）ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡは、Ｏｃｔ４の発現に影響を及ぼさなかった。ｎａｎｏｇまたは対照のｓｉＲＮＡ構築物を、Ｏｃｔ４発現ベクターとともに２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトした。溶解物を、抗Ｏｃｔ４抗体または抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。（Ｄ）ｎａｎｏｇのノックダウンにより、ＥＳ細胞中のＮａｎｏｇが減少した。ｎａｎｏｇまたは対照のｓｉＲＮＡ構築物を、ＥＳ細胞中にトランスフェクトした。溶解物を、抗Ｎａｎｏｇ抗体または抗βアクチン抗体を用いて調べた。（Ｅ）ｎａｎｏｇのノックダウンにより、ＥＳ細胞の分化が誘発された。ｎａｎｏｇおよび対照のノックダウン細胞をアルカリホスファターゼについて染色した。写真は、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＥＳＣ（Ｉ）およびｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＥＳＣ（ＩＩ）を同時に撮影したものである。ノックダウンした細胞の扁平な上皮様細胞の存在は、ベクター対照のＥＳ細胞においては全く認められないことに注目されたい。
【図２】ＰＯＵおよびホメオドメイン含有転写因子ならびにＨＭＧドメイン含有転写因子の、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素との複合体形成を分析するための例示的方法として、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す図。本実施例はＯｃｔ４およびＳｏｘ２の、Ｎａｎｏｇ８量体／ＨＭＧ複合要素への結合を説明する。ＥＭＳＡは、ｎａｎｏｇプロモータ由来の標識した推定Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２要素、または陽性対照としてのＦＧＦ４エンハンサ由来の既知のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位のいずれかを用いて実施した。因子の結合は、Ｅ１４胚幹細胞の粗製核抽出物中で調べた。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２を含むタンパク質−ＤＮＡ複合体は、示したバンドをスーパーシフトさせる抗体の添加によって同定した。結合特異性を、オリゴ競合物（ＰＡＧＥゲルの一番上に表示）を用いて調べたところ、Ｏｃｔ４の結合には完全な８量体モチーフを必要とし、Ｓｏｘ２の結合には完全なＨＭＧ要素を必要とすることが示された。ヘテロ二量化には、両方が完全であることが必要であった。競合物についての記号は次のとおりである。Ｎ＝Ｎａｎｏｇ，Ｆ＝ＦＧＦ４，Ｏ＝Ｏｃｔ４結合部位、Ｓ＝Ｓｏｘ２結合部位、ｍＯ＝変異型Ｏｃｔ４結合部位、ｍＳ＝変異型Ｓｏｘ２結合部位、Ｇｂｘ＝非特異的競合物。
【図３】Ｏｃｔ４／ＯＣＴ４およびＳｏｘ２／ＳＯＸ２の、Ｎａｎｏｇ／ＮＡＮＯＧプロモータとのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用を示す図。（Ａ）クロマチン免役沈降（ＣｈＩＰ）は、未分化のマウスＥＳＣ（第０日、レチノイン酸、ＲＡ）およびレチノイン酸（ＲＡ）の共存下で３日間および６日間培養したＥＳＣについて行った。Ｏｃｔ４（Ｎ１９）およびＳｏｘ２（Ｙ１７）に対する抗体による免疫沈降を示す。リアルタイムＰＣＲによって測定した富化の倍率を３つの異なるアンプリコンで比較した。このうち１つ（アンプリコン２）は、複合ｏｃｔ−ｓｏｘ要素（概略図では白抜きのボックスで示す）を含み、残りの２つ（アンプリコン１および３）は含まなかった。各アンプリコンの転写開始部位に対する位置が概略図に示されており、Ｎａｎｏｇのエキソン１が黒塗りのボックスで示されている。（Ｂ）ヒトＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧのＯＣＴ４およびＳＯＸ２ ＣｈＩＰ。未分化細胞からの特定のアンプリコンの富化の倍率が示されている。このデータから、複合ｓｏｘ−ｏｃｔ要素に最も近い３つのアンプリコンだけが、使用した両抗体によって富化を示したことがわかる。すべて標準偏差が示されている。
【図４】ｎａｎｏｇ近位プロモータが、未分化ＥＳ細胞においてはＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）発現を駆動するが、同細胞の分化誘導体においては駆動しないことを示す図。ＥＧＦＰ発現を駆動するｎａｎｏｇプロモータ（転写開始部位に対して−２８９〜＋１１７）を含むベクター構築物で安定的にトランスフェクトされたマウスＥＳＣ株（ＮａｎｏｇＥＧＦＰ）を、異なる培養条件において比較した。光学顕微鏡写真（Ａ，Ｃ，Ｅ）および蛍光顕微鏡写真（Ｂ，Ｄ，Ｆ）は、未分化のＥＳＣ（Ａ，Ｂ）、ＬＩＦなしで３日間培養したＥＳＣ（Ｃ，Ｄ）、および０．１μＭレチノイン酸（ＲＡ）で３日間処理したＥＳＣ（Ｅ，Ｆ）のものである。ＬＩＦを回収すると、ＲＡへの曝露よりも分化誘発の積極性は小さいが、ＥＧＦＰ発現は大きく減少した。ＥＳＣ分化の強力な誘発剤であるＲＡは、ＥＧＦＰ発現を劇的に減少させた。（Ｇ）リアルタイムＰＣＲでの検出により、内在性Ｎａｎｏｇ転写物のレベルを、未分化および分化条件下においてＮａｎｏｇプロモータによって誘導されるＥＧＦＰのレベルと比較して示すグラフ。グラフ中の数値は、ＦＡＣＳ分析によって測定したＥＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示す。ＥＢは胚様体であり、ＲＡはレチノイン酸である。
【図５】（Ａ）系統発生学的フットプリンティングによる結合要素の同定の例を示す図。ｎａｎｏｇ配列は、マウス、ラット、ヒト、ウシおよびゾウのゲノムシーケンシングプロジェクトから得た。２億５千万年以上の累積進化あいだ不変のままである、転写開始位置から−２１２〜−１１９の領域に影をつけてある。ｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素は、３塩基対の置換変異体として示してあり、該変異体の対応名は下に表示してある。 （Ｂ、Ｃ）Ｎａｎｏｇと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写遺伝子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との間の複合体形成の影響の分析を示す図。Ｆ９テラトカルシノーマ細胞に一時的にトランスフェクトされた様々なｎａｎｏｇプロモータ構築物のプロモータ−ルシフェラーゼレポータアッセイを示している。−２８９〜＋１１７のマウスｎａｎｏｇプロモータ断片（ｗｔ）のルシフェラーゼ活性を任意で１００％に設定する。（Ｂ）変更を加えたマウスプロモータ構築物の活性を、野生型（ｗｔ）、短縮型（ｓｈｏｒｔ）（短い野生型プロモータ、−２３０〜＋６３の領域）と比較したもの。ＦｏｒおよびＲｅｖは、互いに同じであるが、保存領域（−９３〜＋１１７）の転写開始位置に対する向きが逆である。Ｈｓ．１およびＨｓ．２は、それぞれヒトＮａｎｏｇおよびＮａｎｏｇＧＰｌ由来の、マウスｗｔ構築物に相同な領域である。（Ｃ）置換変異のマウスプロモータ活性への影響。変異は、ｏｃｔ／ｓｏｘ要素がいずれも変異を有するｏｃｔ／ｓｏｘ構築物に関して、（Ａ）に示したものに相当する。
【図６】Ｎａｎｏｇプロモータ活性に対する、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のＲＮＡｉノックダウンの結果を示す図。図２Ａは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびＥＧＦＰ（対照）を標的とするＲＮＡｉ構築物の、Ｎａｎｏｇプロモータ−ルシフェラーゼレポータ構築物とともにマウスＥＳＣ中への同時トランスフェクションの概略図である。図２Ａは、トランスフェクションから３日後に測定されたルシフェラーゼ活性を示す。（Ｂ）ルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケルシフェラーゼ内部対照と比較して測定した。阻害性ＲＮＡを含まない構築物を陰性対照（−）として用いた。示したとおり、Ｎａｎｏｇプロモータ活性は、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４の両者を標的としたＲＮＡｉ構築物によって低減される。標準偏差も示してある。
【技術分野】
【０００１】
（０００１）本発明は、幹細胞／前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法に関する。本発明は、細胞内の遺伝子発現を調節するための方法にも関する。本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させることを含む。少なくとも２つの転写因子のうちの一方は、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択される。少なくとも２つの転写因子のうちの他方は、ＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される。本方法は、少なくとも２つの転写因子が、ｎａｎｏｇのプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにすることをさらに含む。このようにして形成される複合体は、転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子の発現を調節する。
【背景技術】
【０００２】
（０００２）幹細胞は、再生医療に対する鍵を握っていることがわかってきている。というのも幹細胞は、疾患、感染または先天性異常によって損傷した対応組織の代わりとなる細胞源を供給できるためである。これは、幹細胞が、無制限に増殖できる能力を持つとともに、心臓、肝臓、脳細胞などの機能的な成熟細胞に分化しうる未分化細胞であるためである。ギュンター病、ハンター症候群、およびハーラー症候群は、たとえば、幹細胞を用いて治療されてきた。白血病やリンパ腫などの病状を有するがん患者の治療は、骨髄からの成人幹細胞を用いて行われてきた。化学療法投薬量の段階的増大による血球減少に苦しむがん患者の造血系は、幹細胞の静脈内注射によって回復させることができた。韓国の研究者は、臍帯血からの成人幹細胞をうまく用いて、脊髄損傷を煩う麻痺をもつ女性が、歩行器の助けを借りて歩行できるようになったことを報告している。パーキンソン病、心筋梗塞、若年発症糖尿病をはじめとするさらに多くの疾病が、現在のところ、幹細胞または幹細胞由来の細胞の治療的移植によって治療可能であると考えられている。
【０００３】
（０００３）この点に関する特に実現可能なツールは、哺乳類の多分化性幹細胞であるが、これは当該細胞が、任意の器官、細胞タイプまたは組織タイプへ分化可能であり、少なくとも潜在的には完全な生命体へと分化することができるためである。このような多分化性幹細胞は、着床前胚および多くの成人組織のいずれにおいても見られる。特に優れているのは、哺乳類の胚盤胞の段階にある胚の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来する胚幹細胞（ＥＳＣ）である。ＥＳＣは、特定の細胞培養条件下で、より長い時間、自己再生的に細胞分裂することにより、その多分化能を維持する（たとえば、非特許文献１または非特許文献２を参照のこと）。
【０００４】
（０００４）ＥＳＣは、たとえば、神経成長因子とレチノイン酸の共存下に、ニューロンへと制御的に分化させることができるが（非特許文献３）、そのように容易に分化できることが、実践上の大きな難問をつきつけるのである。ＥＳＣを多分化性状態に維持するためには、取扱時および培養増殖時の分化を防止しなければならない。こうした理由から、ＥＳＣは、伝統的にはフィーダー細胞層上でウシ胎仔血清の共存下で（たとえば、特許文献１および特許文献２を参照のこと）、または線維芽細胞調整培地（ＣＭ）中で培養されてきた。にもかかわらず、念入りに制御された条件下においてさえ、ＥＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖のあいだに自発的に分化することがある。マウスＥＳＣにおける自己再生を媒介する因子である白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、マウスＥＳＣの分化を阻害することがわかっているが、ヒトＥＳＣの分化を阻害する際のフィーダー細胞の役割に変わるものではない。したがって、ＥＣＳの多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する手段は、幹細胞治療の完全な商業的潜在性の実現に向けての多大な功績となるであろう。
【０００５】
（０００５）成人幹細胞は、ＥＳＣのような多分化性ではないものの、自己再生可能であり、その発生能を、より未成熟な多分化性ＥＳＣの発生能と同等にする可塑性を持つことがわかっている。一例として、成人幹細胞は、その元となる組織とは異なる細胞系統に分化することができる。
【０００６】
（０００６）幹細胞は、２以上の発生学上の層が混ざり合った組織を生み出す、様々な組織（精巣および卵巣のものであることが多い）の奇形腫と呼ばれる癌においても見つかっている。このような癌の悪性型は、奇形癌とも呼ばれている。マウス奇形癌における幹細胞の発達は、正常な胚における事象と平行したものである。これらの存在は、化学治療で大量の腫瘍塊を除去しても、腫瘍の再発を防止できない場合が多いことの説明となる（非特許文献４）。したがって、このような腫瘍において幹細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を無効にする手段は、典型的にはこのような癌の永久的除去のための前提条件となるであろう。
【０００７】
（０００７）いまのところ数種のタンパク質が、多分化性細胞の正常な発達のために、かつ／または多分化性の細胞状態を維持するために重要であることが確認されている。そうしたタンパク質としては、Ｏｃｔ４（非特許文献５）、Ｓｏｘ２（非特許文献６）、Ｎａｎｏｇ（非特許文献７、非特許文献８）、およびＦｏｘＤ３（非特許文献９）が挙げられる。他のタンパク質、たとえば、ＬＩＦ（上記参照）またはＲｅｘｌ（Ｚｆｐ４２）も、このような機能に関与することが示唆されている。しかしながら、それらのタンパク質の作用機構、ならびに多分化性細胞の発生または多分化性細胞状態の維持における、当該タンパク質の特異的役割については今のところ知られていない。
【特許文献１】米国特許第５，８４３，７８０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０９０，６２２号明細書
【非特許文献１】ロエベル、ディー．エイ．（Ｌｏｅｂｅｌ，Ｄ．Ａ．）ら、２００３年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第２６４巻、ｐ．１〜１４
【非特許文献２】スミス、エイ．ジー．（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｇ．）、２００１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１７巻、ｐ．４３５〜４６２
【非特許文献３】シュルディナー（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ）ら、２００１年、Ｂｒ．Ｒｅｓ．第９１３巻、ｐ．２０１〜２０５
【非特許文献４】チャンバース、アイ．、スミス、エイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ）、２００４年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第２３巻、ｐ．７１５０〜７１６０
【非特許文献５】ニコルス、ジェイ．（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．）ら、１９９８年、Ｃｅｌｌ 第９５巻、ｐ．３７９〜３９１
【非特許文献６】アビリオン、エイ．エイ．（Ａｖｉｌｉｏｎ，Ａ．Ａ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．１２６〜１４０
【非特許文献７】ミツイ（Ｍｉｔｓｕｉ）ら、２００３年、Ｃｅｌｌ 第１１３巻、ｐ．６３１〜６４２
【非特許文献８】チャンバース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ）ら、２００３年、Ｃｅｌｌ 第１１３巻、ｐ．６４３〜６５５
【非特許文献９】ハンナ（Ｈａｎｎａ）ら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１６巻、ｐ．２６５０〜２６５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（０００８）したがって、本発明の目的は、幹細胞／前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を制御的に維持する方法、ならびに、たとえば、奇形腫中の幹細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を無効にするために、細胞内の遺伝子発現を調節する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（０００９）一つの態様において、本発明は、幹細胞／前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法を提供する。本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させることを含む。少なくとも２つの転写因子のうちの一方は、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択される。少なくとも２つの転写因子のうちの他方は、ＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される。本方法は、少なくとも２つの転写因子が、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにすることをさらに含む。このように形成された複合体は、転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節する。
【００１０】
（００１０）別の態様において、本発明は、細胞内の遺伝子発現を調節する方法を提供する。本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片をｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させることを含む。少なくとも２つの転写因子のうちの一方は、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択される。少なくとも２つの転写因子のうちの他方は、ＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される。本方法は、少なくとも２つの転写因子が、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにすることをさらに含む。このように形成された複合体は、転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（００１１）本発明は、非限定的な実施例および図面と組み合わせて、以下の詳細な説明を参照してより良く理解されるであろう。
（００１９）本発明は、ＰＯＵ特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子、ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいてもｎａｎｏｇのプロモータと複合体を形成し、さらに、この複合体の形成がタンパク質Ｎａｎｏｇの発現を調節するという驚くべき発見に基づいている。さらに驚くべきことに、このような結合領域の少なくとも１つが累積して２億五千万年以上もの進化の間、不変のままであることが判った。
【００１２】
（００２０）本願発明者の知見は、特に実用的に関係がある。というのも、ＰＯＵ特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子がタンパク質Ｏｃｔ４であり、ＨＭＧドメインを含む転写因子がタンパク質Ｓｏｘ２（参考：上記および下記）であるためである。Ｏｃｔ３としても知られるＯｃｔ４は、細胞の未分化状態に関するマーカーとしてよく使用される。Ｏｃｔ４は、ヒトおよびマウスＥＳＣにおいて高度に発現され、その発現は、これらの細胞が分化して多分化能を失うときに減衰する（パルミエリ（Ｐａｌｍｉｅｒｉ）ら、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻、ｐ．２５９〜２６７）。また、Ｏｃｔ４は成人幹細胞、腫瘍細胞、および不死化非腫瘍原性細胞においても発現されるが、分化した組織の細胞においては発現されない（たとえば、モンク、エム．（Ｍｏｎｋ，Ｍ．）、ホールディング、シー．（Ｈｏｌｄｉｎｇ，Ｃ．）、２００１年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第２０巻、ｐ．８０８５〜８０９１を参照のこと）。
【００１３】
（００２１）Ｓｏｘ２は転写因子であり、Ｏｃｔ４と同様に、分化中のＥＳＣと比べて、未分化ヒトＥＳＣ内で強くアップレギュレートされる（ブランデンバーガー、アール（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ）ら、２００４年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第２２巻、ｐ．７０７〜７１６）。Ｓｏｘ２は、たとえば、胚発生の初期段階における全ＣＮＳの神経上皮の未熟な未分化細胞においても発現される。分化が起こると、Ｓｏｘ２がダウンレギュレートされる（ステバノヴィク、エム（Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｍ）、２００３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ 第３０巻
第２号、ｐ．１２７〜１３２）。Ｓｏｘ２とＯｃｔ４のいずれも、他の細胞タイプを決定する際に独立した役割を果たし（ニワ、エイチ．（Ｎｉｗａ，Ｈ．）ら、２０００年、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ 第２４巻、ｐ．３７２〜３７；非特許文献６）、多分化性細胞におけるそれらの機能の少なくとも一部は、標的遺伝子の転写を駆動するために２者の間の相乗作用を介する。
【００１４】
（００２２）転写因子という用語は、ＤＮＡからのＲＮＡの合成（転写）のレベルを変えるタンパク質の能力のことをいう。典型的には、このような因子は、エンハンサ要素またはプロモータ要素などのような、各ＤＮＡ上に見られる遺伝子の所定の領域に結合して、該ＤＮＡと複合体を形成する、細胞質タンパク質または核タンパク質である。
【００１５】
（００２３）Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の相乗作用の標的としては現在、ｆｇｆ４，ｕｔｆｌ，およびｆｂｘ１５の３種が知られており（ユアン、エイチ．（Ｙｕａｎ，Ｈ．）ら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第９巻、ｐ．２６３５〜２６４５；ニシモト、エム．（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、１９９９年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１９巻、ｐ．５４５３〜５４６５；トクザワ、ワイ．（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．）ら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第２３巻、ｐ．２６９９〜２７０８）、４つ目は、ｓｏｘ２自身であると思われる（トミオカ、エム．（Ｔｏｍｉｏｋａ，Ｍ．）ら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第３０巻、ｐ．３２０２〜３２１３）が、対応するシス要素は多分化性細胞発現に対しては省略可能であると思われる（ハヤシ、エス．（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．）ら、２００２年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．第１１９巻、追補１，Ｓ９７〜Ｓ１０１）。これらの標的遺伝子のそれぞれは、８量体およびｓｏｘ結合部位を含む複合要素を有する。
【００１６】
（００２４）本発明の方法において、上述のような転写因子（以下も参照）は、新しく同定されＮａｎｏｇと命名されたタンパク質をコードする遺伝子のプロモータとともに複合体を形成する。これは、細胞の多分化性状態の維持、ならびに初期胚盤葉上層／内細胞塊（ＩＣＭ）の多分化性細胞の正常な発達、およびこの細胞集団からのＥＳ細胞の派生にも必要なタンパク質である（ミツイ（Ｍｉｔｓｕｉ）ら、前掲）。またこのタンパク質は、たとえば分化中のＥＳＣ中よりも未分化のＥＳＣ中にはるかに多く存在することから、未分化状態の細胞、たとえば、幹細胞または胚性生殖細胞に対するマーカーとして使われることも多い（ブランデンバーガー、アール（Ｂｒａｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ）ら、前掲）。Ｎａｎｏｇは、成人骨髄中でも発現されており、腎細胞やある種のがんなどの様々な成人組織において、低レベルで発現されている。Ｏｃｔ−４と同様に、Ｎａｎｏｇは、成人の成熟細胞にいくらかの胚様の可塑性を回復させうることで知られている（たとえば、シース、エヌエックス．（Ｔｈｅｉｓｅ，ＮＸ．）、ウィルマット、アイ．（Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ）、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ 第４２５巻、ｐ．２１を参照）。
【００１７】
（００２５）Ｎａｎｏｇはホメオボックスを含み、転写因子として作用する場合もある。ｎａｎｏｇの過剰発現により、通常は分化を誘発する培養条件において、ＥＳＣの多分化能および自己再生特性を維持することができる（チャンバース、アイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．）ら、前掲）。標準増殖条件下でｎａｎｏｇ発現をダウンレギュレートすると、ＥＳＣにおける分化が誘導される（図１を参照）。多分化性細胞の維持においてこの必須機能に付随するのが、ｎａｎｏｇの限局的な発現パターンである。ｎａｎｏｇ転写物は、胚盤胞形成前に、まず桑実胚の内部細胞内に現れ（チャンバース、アイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．）ら、前掲；ミツイ、ケイ．（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．）ら、前掲）、胚盤胞内では発現は内細胞塊（ＩＣＭ）に限られ（ワン、エス．エイチ．（Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｈ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ 第３巻、ｐ．９９〜１０３）、着床時にはすでに検出不能である。
【００１８】
（００２６）本願発明者による知見を考慮すると、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２がマウスの着床前発生において類似の発現パターンを有するという最近発表された研究結果（アビロン、エイ．エイ．（Ａｖｉｌｌｏｎ，Ａ．Ａ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．１２６〜１４０）が容易に理解できるようになる。Ｎａｎｏｇは、幹細胞の多分化性細胞状態および自己再生特性の維持のための鍵となる要素であるという知識に基づいて、本発明者らは、幹細胞および前駆細胞の多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法を確立することができた。本発明者らは、さらに、それらの方法が細胞内の遺伝子発現を調節するのに適していることを発見した。
【００１９】
（００２７）ｎａｎｏｇ遺伝子は、凝縮後に現れ桑実胚の内部細胞に特異的な第１の既知の転写因子をコードし、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のいずれも、すべての割球において凝縮の前に発現される。本明細書中で用いる「ｎａｎｏｇ遺伝子」という用語は、あらゆる哺乳類のｎａｎｏｇ遺伝子、たとえば、ハート、エイ．エイチ．（Ｈａｒｔ，Ａ．Ｈ．）ら（２００４年、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ 第２３０巻、ｐ．１８７〜１９８）に記載されるようなマウスおよびヒトのｎａｎｏｇ遺伝子、ウシの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５３８９５１）、ブタの遺伝子（ＥＭＢＬアクセス番号Ｑ５ＧＭＱ０およびＱ６４ＨＸ３）、ディンゴの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４８６７０１）、チンパンジーの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４５２４３８）、マカクの遺伝子（ＥＭＢＬアクセス番号Ｑ５ＴＭ８４）、ラットの遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４１４０６５（Ｌｏｃｕｓタグ：ＲＧＤ：１３０３１７８））、ＮＣＢＩアクセス番号ＡＹ７８６４３７のＲＮＡを転写し、ＮＣＢＩアクセス番号ＡＡＷ５０７０９の転写因子をコードするヤギ遺伝子、ならびにこれらのオーソログを含む。また、まだ同定されてないｎａｎｏｇ遺伝子も含まれる。また、たとえばアンネ（Ａｎｎｅ）ら（２００４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 第８４巻、ｐ．２２９〜２３８）によって同定され、当技術分野で周知の標準的な方法（たとえば、部位特異的変異法）によって機能するように改変されたもののようなｎａｎｏｇの偽遺伝子も含まれる。さらに、既知のｎａｎｏｇ配列と比較すると核酸配列に逸脱が見られる形態の遺伝子も含まれる。その差異は、たとえば、多型、１つのヌクレオチドの変化または修飾、（連続する一続きの）置換、欠失または挿入、および対応する天然の核酸配列に導入されたＮ末端および／またはＣ末端への付加によるものであってよい。本発明の方法において用いるｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域は、任意の生物種のもの、または任意の生物種に由来するものであってよい。２つの例示的実施例は、ヒトおよびマウスのｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域である。
【００２０】
（００２８）Ｎａｎｏｇは、マウスおよびヒトの多分化性細胞のいずれにおいても発現されるので、この遺伝子の多分化性転写は、シス調節要素の機能保存を通して維持されており、同時に、これらの要素の位置および配列は、浄化選択を経ても保存されると思われる。したがって、マウスおよびヒトのｎａｎｏｇゲノム配列を、配列比較のために公開データベースから得た。驚いたことに、マウスｎａｎｏｇおよびｓｌｃ２ａ３のタンデム重複の結果として、２コピーのヒトｎａｎｏｇ遺伝子が同定された（ブース、エイチ．エイ．（Ｂｏｏｔｈ，Ｈ．Ａ．）およびホランド、ピー．ダブリュ．（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｗ．）、２００４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ 第８４巻、ｐ．２２９〜２３８；ハート、エイ．エイチ．（Ｈａｒｔ，Ａ．Ｈ．）ら、前掲）。ヒトＥＳＴデータ（Ｈｓ．３２９２９６）に基づけば、ＮＡＮＯＧ／ＮＡＮＯＧｌは活発に転写されるが、ＮＡＮＯＧＰ１／ＮＡＮＯＧ２は検出不能レベルを維持している。以下の実施例においては、活発に転写されるＮＡＮＯＧを用いて、マウスのホモログｎａｎｏｇと比較した。
【００２１】
（００２９）本発明の方法は、少なくとも２つの転写因子、またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域、すなわち、転写開始時にＲＮＡポリメラーゼによって認識され結合されるｎａｎｏｇ遺伝子の核酸配列と接触させることを含む。これらの転写因子のうちの一方は、Ｐｉｔ，Ｏｃｔ，Ｕｎｃ（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオ
ドメインを含む転写因子から選択される。多くの実施形態において、ホメオドメインはＰＯＵ−ホメオドメインである。ＰＯＵ特異的ドメインは一般には７５〜８２アミノ酸長であり、ＰＯＵ−ホメオドメインは約６０アミノ酸長である。天然の転写因子において、これらの２つのドメインは典型的には一緒になっていわゆるＰＯＵドメインを構成し、この場合、ＰＯＵ特異的ドメインはＮ末端領域を形成し、ＰＯＵ−ホメオドメインはＣ末端領域を形成する。ＰＯＵ特異的ドメインおよびＰＯＵホメオドメインのいずれも本発明において必要ではあるが、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータとの複合体形成が起こりさえすれば、該ドメインを任意の配置構成で選択することができる。多くの実施形態において、該ドメインは適切な長さのリンカー領域によって連結される。当業者であれば、ＰＯＵドメイン外の非保存配列が標的配列のトランス活性化に参加するとの報告を認識しているであろう。したがって、人工的に作成した転写因子、またはその機能的断片の、本発明の方法への適合性は、該転写因子または断片のｎａｎｏｇへの結合に関して調べる必要がある（下記およびたとえば、実施例２または３、図２または図３を参照）。適切な転写因子の例としては、限定はされないが、Ｐｉｔ−１，Ｏｃｔ−１，Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ−４、Ｏｃｔ−６、Ｏｃｔ−１１、Ｂｒｎ−３、Ｂｒｎ−３Ａ、ＢおよびＣ、肝細胞核因子ｌαおよびβ、網膜由来ＰＯＵドメイン因子−１、精子１ＰＯＵ−ドメイン転写因子、ラットタンパク質Ｒｏｖ−１、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の転写因子ＰＯＵｌ、ＰＯＵ２、ＧＢＸ−２およびＯｃｔ−１．５、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の転写因子Ｃｆｌａ、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の因子（ＮＣＢＩアクセス番号ＢＡＥ０６６５０）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）遺伝子ｕｎｃ−８６によってコードされるタンパク質、線虫の因子ｃｅｈ−６、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）タンパク質ｄＰＯＵ−１９／ｐｄｍ−１およびｄＰＯＵ−１９／ｐｄｍ−２、およびゼブラフィッシュの因子ｐｏｕ５ｆｌ／ｐｏｕ２が挙げられる。説明的な例としては、転写因子Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−４およびＯｃｔ−６が、ｎａｎｏｇプロモータ上の領域に結合することが示されている（ウー、ディー．（Ｗｕ，Ｄ）、ヤオ、ズィー．（Ｙａｏ，Ｚ）、２００５年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１５巻、第５号、ｐ．３１７〜３２４）。
【００２２】
（００３０）上記少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片の他方は、ＨＭＧ（高移動度群）ドメイン含有転写因子から選択される。ＨＭＧ ＤＮＡ結合ドメインは、４方向接合（４‐ｗａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）など湾曲ＤＮＡに対する著しい優先性を与える。このような転写因子の例としては、限定はされないが、Ｓｒｙ ＨＭＧボックス（Ｓｏｘ）転写因子、ＨｒＳｏｘＢ１、リンパ球エンハンサ結合因子１（ＬＥＦ−Ｉ，Ｔ細胞特異的転写因子１−α）、ＨＭＧＢ１ａタンパク質、ＨＭＧＢ１ｂタンパク質、上流結合因子（ＵＢＦ）、ＣＣＡＡＴ結合転写因子２（ＣＴＦ２）、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）、ＹＡＢＢＹファミリーのタンパク質、ミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）、顆粒膜細胞高移動度群ボックスタンパク質１（ＧＣＸ−１）、Ｔ細胞特異的転写因子７、黒穂菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓのＰｒｆｌ、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）のＳｔｅｌｌｐ因子および未命名の因子（ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ５９５６７２）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＴＣＦ／ＬＥＦ−１、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のＸＴｃｆ３、睾丸決定因子ＳＲＹ、ＸＳＯＸ３、ウニ遺伝子Ｕｎｉｃｈｒｏｍの転写産物、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来の交配型タンパク質Ａ２、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のタンパク質ＣＧ１７９６４−ＰＨアイソフォームＨ（ＮＣＢＩアクセス番号ＮＰ００１０１４６８５）、およびＮＣＢＩアクセス番号Ｔ１２１１３を有するソラマメの転写因子が挙げられる。
【００２３】
（００３１）いくつかの実施形態において、第２の転写因子は、ＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）タンパク質であり、例として、限定はされないが、Ｓｏｘ−１，Ｓｏｘ−２，Ｓｏｘ−３，Ｓｏｘ−４，Ｓｏｘ６，Ｓｏｘ７，Ｓｏｘ８，Ｓｏｘ９，Ｓｏｘ１０，
Ｓｏｘ１１，Ｓｏｘ−１３，Ｓｏｘ１４，Ｓｏｘ１５，Ｓｏｘ１８，Ｓｏｘ２０，Ｓｏｘ２１，Ｓｏｘ３０，Ｓｏｘ３２またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の因子Ｓｏｘ−１１−Ｄ、またはこれらの機能的断片が挙げられる。
【００２４】
（００３２）各転写因子のうち一方の機能的断片は、任意の長さのものであってよく、２つの基準によって定義することができる。第１に、機能的断片は、ｎａｎｏｇプロモータの結合領域と結合して複合体を形成することができ、前記複合体は、たとえばｎａｎｏｇ遺伝子などの当該プロモータによって駆動されるそれぞれの遺伝子の活性に影響するのに十分な安定性を有する。第２に、このような機能的断片は、ＰＯＵおよびホメオドメイン（たとえばＰＯＵ−ホメオドメイン）またはＨＭＧドメインをそれぞれ含む天然に存在する転写因子の対応するアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有しうる。いくつかの実施形態において、各断片は、既知の各転写因子の対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を、一部の実施形態においては少なくとも９５％の配列同一性を有する。「配列同一性」という用語は、既知のＰＯＵおよびホメオドメイン含有転写因子またはＨＭＧドメイン含有転写因子それぞれのアミノ酸配列と、問題とするアミノ酸配列との相同性アラインメント後に得られる、ペアワイズな同一残基の割合（％）を意味し、％の数字は、２つの配列のうち長い方の残基数に対するものである。
【００２５】
（００３３）本発明の方法において用いる転写因子の機能的断片には、たとえば融合タンパク質の形で、追加の配列がさらに結合されてもよい。また、たとえば、いわゆるアフィニティタグまたはラベルなどの天然または人工の化学修飾を含んでいてもよい。アフィニティタグの例としては、限定はされないが、ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧのペプチド、Ｔ７エピトープ（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄの配列Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐからなるＨＳＶエピトープ、配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａからなるヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープおよび転写因子ｃ−ｍｙｃの配列Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕからなる“ｍｙｃ”エピトープが挙げられる。ラベルはさらに、たとえば本発明の方法において望ましい場合には、検出を助ける部分であってもよい。一例としては、限定はされないが、放射活性アミノ酸、フルオレセインイソチオシアネート、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、アミノ−メチルクマリン、エオシン、エリスロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標），Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン類、フィコエリスリン、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７酵素が挙げられる。さらに適した酵素としては、限定はされないが、アルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、またはサイヨウワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
【００２６】
（００３４）各アフィニティタグまたはラベルは、選択された転写因子の任意の部分内に配置されてもよいし、任意の部分に付加されてもよい。説明的な例として、任意のＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子またはＨＭＧドメイン含有転写因子のアミノ末端またはカルボキシ末端に機能可能なように融合させるとよい。
【００２７】
（００３５）本発明の方法は、少なくとも２つの転写因子（上記参照）またはその機能的断片が、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素との複合体を形成できるようにする
ことをさらに含む。
【００２８】
（００３６）本発明の方法のいくつかの実施形態において、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片は、ｎａｎｏｇプロモータ上にヘテロ三量体複合体を形成する。それぞれの複合体の形成は、当業者周知の様々な分析方法によって検出することができ、そのような方法としては、表面プラズモン共鳴（たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術）、核磁気共鳴または結晶化とそれに続くＸ線解析が挙げられる。本発明の方法のいくつかの実施形態において、上記で詳述したような転写因子またはその機能的断片は、ヘテロ二量体を形成する。このヘテロ二量体は、その後、ｎａｎｏｇプロモータの結合領域を含む核酸とのヘテロ三量体複合体を形成する。ヘテロ三量体複合体を形成するそれぞれの二量体の例は、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のｎａｎｏｇへの結合である。結晶学的データは、これらの２つの関係する転写因子がＤＮＡ上の結合要素と三重複合体を形成することを示している（レメニ（Ｒｅｍｅｎｙｉ）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 第１７巻、ｐ．２０４８〜２０５９）。Ｏｃｔｌ構造の上にＯｃｔ４を用いて作成した相同性モデルは、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２の間で形成された複合体が、Ｏｃｔ１とＳｏｘ２の間の複合体と類似していることを示す。Ｓｏｘ２は、Ｏｃｔ４との相互作用のための２つの表面パッチを有する。そのうちの一方は、ＤＮＡとも相互作用できることがわかっているＳｏｘ２のＨＭＧドメインのＣ末端である。様々なＳＯＸおよびＰＯＵ転写因子の間での複合体形成のキャラクタリゼーションが進んでいることに鑑みて（たとえばレメニ（Ｒｅｍｅｎｙｉ）ら、前掲を参照）、様々なＰＯＵドメインおよびホメオドメインを含む転写因子、ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子が、核酸、たとえばｎａｎｏｇ遺伝子上の結合領域とヘテロ三量体複合体を形成することが予想される。
【００２９】
（００３７）各結合要素は、当業者によって知られる様々な手段によって同定することができる。実施例４は、配列比較を用いたＮＡＮＯＧ上の結合要素の同定を示したものである。このような手法は典型的には、それぞれの転写因子に対する結合要素が存在するかどうかについての情報が全く得られない場合に行われる。本発明者らは少なくとも１つのそのような結合要素をすでに同定していたので、総じてこの手順を用いることは必要でないことになる。代替の手段は、たとえば米国特許第６，７３５，５３０号明細書に開示されるようなコンピュータによって実施する方法である。さらに別の結合要素同定手段としては、たとえば実施例３に記載するようなクロマチン免疫沈降アッセイがある。この方法はさらに、活性転写領域を判定したり、ヒストン結合によるゲノムの修飾を評価したりするために使用することもできる。さらに別の手段は、実施例２および図２に記載するような電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。ｎａｎｏｇプロモータ内の結合要素を同定するさらなる方法は、たとえば蛍光タンパク質などのマーカーの発現のために該プロモータを使用することである。この手法がどのように実施されるかの例を図４に示す。強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を駆動するｎａｎｏｇ遺伝子の−２８９から＋１１７（転写開始部位（ＴＳＳ）に対して）のマウス配列を含むプラスミドベクターで、マウスＥＳＣ株をトランスフェクトした。レチノイン酸による分化誘導によってｎａｎｏｇ遺伝子をダウンレギュレートし、これにより、処理３日後のＥＧＦＰ発現が劇的に減少した（図４Ｅ、Ｆを参照）。リアルタイムＰＣＲによる、ＮａｎｏｇＥＧＦＰと、内在性Ｎａｎｏｇとの比較（図４Ｇ）から、該構築物は、内在性Ｎａｎｏｇの発現を再現することができたことがわかる。当業者であれば、これらの方法は、さらに他の方法、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発と組み合わせて、特定の領域についての結合要素の一部としてのさらなる検証に用いることができることに気づくであろう。
【００３０】
（００３８）本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも２つの転写因子は、ｎｏｎｏｇプロモータ内の複合要素に結合する。このように、これらの実施形態において、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子は、複合要素の一方部分に結合し、ＨＭＧドメイン含有転写因子は、複合要素の他方部分に結合する。各結合要素は、それぞれ
の転写因子について任意の数の結合領域を有していてもよい。たとえば、２つの部分からなる結合部位であってもよい。そのような結合要素は、たとえば、２つの転写因子Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４に対して存在することが知られている。８量体とｓｏｘ結合部位を含み、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４の標的となる複合要素を含む遺伝子は、Ｆｇｆ４，Ｕｔｆｌ，Ｆｂｘ１５およびＳｏｘ２、ならびにＰｏｕ５ｆｌ（Ｏｃｔ４をコードする遺伝子）自体である（ユアン、エイチ．（Ｙｕａｎ，Ｈ．）ら、前掲；ニシモト、エム．（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、前掲；トクザワ、ワイ．（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．）ら、前掲；トミオカ、エム．（Ｔｏｍｉｏｋａ，Ｍ．）ら、前掲；チュー、ジェイ．エル．（Ｃｈｅｗ，Ｊ．−Ｌ．）ら、２００５年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第２５巻、第１４号、ｐ．６０３１〜６０４６；オクムラ‐ナカニシ、エス．（Ｏｋｕｍｕｒａ−Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．）ら、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２８０巻、ｐ．５３０７〜５３１７）である。本願発明者は、ｎａｎｏｇプロモータ内の各複合要素を同定した（たとえば、図５Ａを参照）。いくつかの実施形態において、複合結合要素はｏｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位である。ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位内では、ｏｃｔ４およびＳｏｘ２に対する結合領域は、Ｓｏｘ２およびｏｃｔ４の両者が同時に該複合結合部位に結合できさえすれば、任意の配向、かつ任意の相対位置に配置されていてよい。２つの領域は、たとえば、互いに直接隣接していてもよい（図５Ａを参照）。
【００３１】
（００３９）本発明のいくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域内の結合要素と、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片との間での複合体の形成も検出される。この目的のために、核酸へのタンパク質の結合を検出するのに十分な感度をもつ任意の方法を用いることができる。このような方法は、たとえば、分光学的、光化学的、光分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的もしくは熱力学的手段、または細胞効果を利用するものである。分光学的検出方法の例としては、蛍光相関分光法（トンプソン、エヌ．エル．（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．）ら、２００２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．第１２巻、第５号、ｐ．６３４〜６４１）が挙げられる。光化学的方法は、たとえば、光化学的架橋である（スティーン、エイチ．（Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．）、ジェンセン、オー．エヌ．（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｎ．）、２００２年、Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．第２１巻、第３号、ｐ．１６３〜１８２）。光活性、蛍光、放射活性、または酵素的ラベルの使用（総覧として、リッペ、アール．エイ．（Ｒｉｐｐｅ Ｒ．Ａ．）ら、２００１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第１６０巻、ｐ．４５９〜４７９を参照のこと）は、それぞれ光分析、蛍光分析、放射線学および酵素による検出法に対する例である。熱力学的検出方法の例は、等温滴定熱量分析（ＩＴＣ、総覧として、ベラツケツ‐カンポイ、エイ．（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｃａｍｐｏｙ，Ａ．）ら、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．第２６１巻、ｐ．３５〜５４を参照のこと）である。任意の細胞効果、たとえば、表現型の変化などは、ｎａｎｏｇ遺伝子プロモータ領域制御下の組換え因子の発現によって引き起こされうる。細胞効果を用いた方法の例には、マーカータンパク質のパターンの判定を含む、細胞分化状態の測定が含まれていてもよい（たとえば、ノークソン、ケイ．（Ｎｏａｋｓｓｏｎ，Ｋ．）ら、２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−００９３を参照のこと）。これらの方法のいくつかは、電気泳動またはＨＰＬＣなどの追加の分離技術を含んでいてもよい。詳細には、ラベルの使用についての例としては、限定はされないが、プローブとしての化合物、または触媒する反応が検出可能なシグナルをもたらすような酵素を付加した免役グロブリンが挙げられる。放射活性ラベルおよび電気泳動による分離を用いた方法の例としては、電気泳動移動度シフトアッセイが挙げられる。
【００３２】
（００４０）したがって、ｎａｎｏｇ遺伝子の結合要素と、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片との間の複合体の形成を検出する例としては、限定はされないが、免役沈降（もしくはウェスタンブロットハイブリダイゼーション）またはクロマチン免疫
沈降アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、あるいは表面プラズモン共鳴などの結合要素の同定に適した例も挙げられる。
【００３３】
（００４１）いくつかの実施形態において、少なくとも２つの転写因子が結合するそれぞれのｎａｎｏｇ遺伝子の領域は、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２８９〜＋１１７を含むヒトｎａｎｏｇ遺伝子領域に相当する領域内に位置する。一実施形態において、この領域は、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２１２〜−１１９を含むヒトｎａｎｏｇ遺伝子領域に相当する。
【００３４】
（００４２）上記詳述したように、本発明の方法において、複合体は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域内の結合要素との間で形成される。この複合体の形成は、さらに、ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を調節する。この効果は、転写活性化を調節することによって達成される。このように、少なくとも２つの転写因子の結合が、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を増大させる。ｎａｎｏｇ遺伝子の転写の増大によって、ＥＳＣの多分化性細胞状態が維持されることがわかっている（前掲）。ｎａｎｏｇ遺伝子の転写の抑制により、ヒトＥＣおよびヒト胚性癌細胞における分化が誘導されることがわかっている（図１Ｅおよびヒスロップ、エル．（Ｈｙｓｌｏｐ，Ｌ．）ら、２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−００８０を参照のこと）。
【００３５】
（００４３）本発明のいくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写の増大は、ｎａｎｏｇ遺伝子発現に換算して測定される。これは、たとえば、ｎａｎｏｇプロモータの制御下にある遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の数を測定することによって行える。当分野で一般的に用いられる方法は、ＲＮＡ分子転写後の逆転写酵素を用いたＲＮＡからｃＤＮＡへのコピーと、該ｃＤＮＡ分子の蛍光染料とのカップリングである。分析は典型的には、ＤＮＡマイクロアレイの形で行われる。アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）製のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現アレイといった数々のサービスやキットが市販されている。ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を判定するための他の手段としては、限定はされないが、オリゴヌクレオチドアレイ、および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【００３６】
（００４４）実施例５では、ｎａｎｏｇ遺伝子発現のさらなる判定手段であるルシフェラーゼレポーターベクターの使用について説明する。この方法において、発現レベルは、ｎａｎｏｇプロモータを含むベクターを発現している細胞のルシフェラーゼ活性に反映される。ルシフェラーゼ活性は、市販のキットを用いて照度計で検出することができる（たとえば、実施例５を参照）。
【００３７】
（００４５）いくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇ遺伝子発現データを較正するか、ランク付けすることが有益または望ましいかもしれない。このように、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、得られた結果を、１つまたはそれ以上の対照測定の結果と比較することをさらに含む。
【００３８】
（００４６）このような対照測定は、主要な測定自体とは異なる任意の条件を含んでいてもよい。たとえば、ｎａｎｏｇプロモータの制御下での全く発現が起こらない条件下、または転写因子とｎａｎｏｇプロモータとの間の複合体形成が生じ得ないか、複合体形成の調節ができないような条件下での方法の条件が含まれる。いくつかの実施形態において、ｎａｎｏｇプロモータの活性を所定のレベルに調節する化合物を使用することを含んでいてもよい。他の実施形態において、各化合物は、ｎａｎｏｇプロモータと２つの転写因子のうちの一方との間での複合体形成を防止するものであってもよい。
【００３９】
（００４７）対照測定のさらなる手段は、上述の転写因子の一方または両方に結合することができないか、または周知レベルよりも低い親和性または高い親和性で結合する、変異ｎａｎｏｇプロモータを使用することである。図５Ｃは、変異に用いることのできる各部位の同定例である。３つの部位が、変異導入された場合に、多分化性プロモータの機能にルシフェラーゼ活性を野生型構築物の２０％以下に低下させるという劇的な影響を及ぼした（図５Ｃを参照）。これには、ｏｃｔ部位およびｓｏｘ部位に影響する変異が含まれていた。
【００４０】
（００４８）本発明の方法のいくつかの実施形態において、２つの転写因子は相乗的に作用して、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を活性化する。２つの転写因子のそれぞれの相乗作用は、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写に対する個々の転写因子の作用によって得られるデータを、転写に対する２つ（またはそれ以上）の転写因子の作用の組み合わせと比較することによって評定できる。たとえば上述したような、遺伝子発現を判定するのに適した任意の方法をこの目的のために使用することができる。説明的な例として、図５Ｃは、ルシフェラーゼ活性アッセイ（上記参照）によるｎａｎｏｇ遺伝子発現の検出を示している。同一の構築物中でｏｃｔ部位およびｓｏｘ部位の両方が変異していると、活性は、（野生型構築物の）約２０％の活性に対して、野生型の６％にまで低下する。
【００４１】
（００４９）多分化性または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持するための本発明の方法は、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素と複合体を形成することのできる、ＰＯＵドメインおよびＰＯＵホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子を発現できさえすれば、任意の幹細胞、前駆細胞、奇形腫細胞またはそれらに由来する任意の細胞に適している。説明的な例として、任意の多分化性ヒトＥＳＣまたはそれぞれの細胞株をそれぞれの方法において用いることができる。そのような細胞の集団を得る手段は、当該技術分野において十分に確立されている（たとえば、トンプソン、ジェイ．エイ．（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．）ら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８２巻、ｐ．１１４５〜１１４７またはカウアン、シー．エイ．（Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．）ら、２００４年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３５０巻、ｐ．１３５３〜１３５６を参照のこと）。さらに、たとえば７１の独立したヒトＥＳＣ株が存在することが知られており、そのうちＧＥ０１、ＧＥ０９、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＴＥ０６またはＷＡ０９などの１１の細胞株が研究目的で入手可能である（たとえば、ＮＩＨヒト胚幹細胞レジストリー（http://stemcells.nih.gov/research/registry/eligibilityCriteria.asp）を参照のこと）。成人幹細胞は、たとえば、分娩後に残った胎盤および臍帯由来の血液から、または成人幹細胞が「衛星細胞」として会合している筋原繊維から、単離することができる（コリンズ、シー．エイ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃ．Ａ．）ら、２００５年、Ｃｅｌｌ 第１２２巻、ｐ．２８９〜３０１、また、ランド、ティー．エイ．（Ｒａｎｄｏ，Ｔ．Ａ．）、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 第１１巻、第８号、ｐ．８２９〜８３１も参照のこと）。
【００４２】
（００５０）本方法が前駆細胞、すなわち成熟体細胞を生じる細胞に対して使用されることが意図される場合、本発明の本方法においては任意の前駆細胞を用いることができる。適切な前駆細胞の例としては、限定はされないが、神経前駆細胞、内皮前駆細胞、赤血球前駆細胞、心臓前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、網膜前駆細胞、または造血前駆細胞が挙げられる。前駆細胞を得る方法は当該技術分野において周知である。２つの説明的な例として、巨核球前駆細胞を得る方法が米国特許出願第２００５／０１７６１４２号明細書に開示されており、マウス肝前駆細胞株を得る方法が、リ（Ｌｉ）ら（２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ，ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−０１０８）によって記載されている。いまのところ限られたデータしか入手できないが、前駆細胞は、幹細胞と同様に、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子ならびにＨＭＧドメイン含有転写因子を発現しているようである。たとえば末
梢血から得られる内皮前駆細胞などの前駆細胞は、ＮａｎｏｇやＯｃｔ−４の高い発現レベルを示すことが発見されている（ロマグナニ、ピー．（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，Ｐ．）ら、２００５年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．第９７巻、ｐ．３１４）。網膜前駆細胞などのＣＮＳ前駆細胞は、Ｓｏｘ２を高レベルで発現することが報告されている（グラハム、ブイ．（Ｇｒａｈａｍ，Ｖ．）ら、２００３年、Ｎｅｕｒｏｎ 第３９巻、第５号、ｐ．７４９〜７６５；クラッセン、エイチ．（Ｋｌａｓｓｅｎ，Ｈ．）ら、２００４年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．第７７巻、第３号、ｐ．３３４〜３４３）。
【００４３】
（００５１）上に示したように、本発明の１つの方法は、細胞内の遺伝子発現を調節するための方法である。上述の少なくとも２つの転写因子を発現し、かつ機能的ｎａｎｏｇ遺伝子を含む任意の細胞を用いることができる。いくつかの実施形態において、内在性ｎａｎｏｇ遺伝子は機能的に活性である。これらの実施形態の一部において、それぞれの細胞は幹細胞または前駆細胞である。本発明の方法において用いることのできる幹細胞の例としては、限定はされないが、胚幹細胞、トロホブラスト幹細胞および胚外幹細胞が挙げられる。本発明の方法のいくつかの実施形態において、ヒト由来のＥＳＣなどのＥＳＣ（胚幹細胞）、すなわちヒトＥＳＣを用いることができる。他の実施形態においては、細胞は前駆細胞である（上記参照）。さらに他の実施形態において、細胞はがん細胞である。がん細胞の例示的例としては、奇形腫がん細胞、たとえば、Ｆ９、ＮＴＥＲＡ２、Ｃ３Ｈ、ＴＥＳ−１、１２４６（１２４６−３Ａなど）、ＳｕＳａ（ＳｕＳａ／ＤＸＲ１０およびＳＫＯＶ−３／ＤＸＲ１０など）、ＡＴ８０５（ＡＴＤＣ５など）、ＨＴＳＴ、ＨＧＲＴ、ＰＣ（たとえば、ＰＣＣ３／Ａ／１）またはＧＣＴ２７などが挙げられる。がん細胞のさらなる２つの例示的な例としては、ＨｅＬａ細胞およびＭＣＦ−７細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞と体細胞のハイブリッド細胞である。ｎａｎｏｇ遺伝子は、このようなハイブリッド細胞内で機能的に活性であることが示されている（たとえば、ハタノ（Ｈａｔａｎｏ）ら、２００５年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．第１２２巻、ｐ．６７〜７９を参照）。他の実施形態において、内在性ｎａｎｏｇ遺伝子は機能的に不活性である。これらの実施形態のいくつかにおいて、確立された真核細胞株の任意の細胞、たとえばＨＥＫ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＣＲＥ、ＭＴ４、ＤＥ（アヒル胚）、ＱＦ（ウズラ線維肉腫）、ＮＳ０、ＢＨＫ、Ｓｆ９、ＰＣ１２、またはＨｉｇｈ５が選択される。説明的な例は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。さらなる実施形態において、外来性ｎａｎｏｇ遺伝子は、組換え技術によって、たとえばｎａｎｏｇ遺伝子を担持するベクターを用いて導入する（以下も参照されたい）。
【００４４】
（００５２）いくつかの実施形態において、選択された転写因子またはその機能的断片は、本発明の本方法を行うのに十分な量で内在的に発現される。他の実施形態において、選択された転写因子は、細胞のプロテオーム由来のものはほとんどまたは全く存在しない。いずれの場合も、各転写因子またはその機能的断片を、所望の転写因子をコードする遺伝子を含む１つ以上の組換えベクターを用いて細胞中に導入することができる。細胞が当該転写因子をすでに内在的に発現している場合には、いくつかの実施形態においては、例えばスクリーニングアッセイにおけるシグナル／ノイズ比を改善する目的で、細胞内でのそれぞれの転写ベクターの量を増加させることが望ましいかもしれない。例示的な例として、Ｏｃｔ４および他の転写因子（ｎａｎｏｇを含む）が、アデノウィルスベクターを用いてＥＳＣ中で発現されている（カワタバ、ケイ．（Ｋａｗａｔａｂａ，Ｋ．）ら、２００５年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ 第１２巻、第３号、ｐ．５４７〜５５３）。必然ではないが、典型的には、各遺伝子は活性プロモータまたは外部刺激によって都合良く活性化可能なプロモータの制御下におかれる。
【００４５】
（００５３）目的の細胞内に、各細胞の内在性遺伝子に加えて、ｎａｎｏｇプロモータまたは完全なｎａｎｏｇ遺伝子のさらなるコピーを含めることが望まれる場合には、これも同様に組換えベクターによって達成することができる（たとえば、カワタバ、ケイ．（
Ｋａｗａｔａｂａ，Ｋ）ら、前掲）。ｎａｎｏｇプロモータ（内在性または外来性のいずれの起源であっても）の活性化を容易にするために、ｎａｎｏｇプロモータを含むベクターを細胞内に導入することが有益であるかもしれない。さらに、たとえばタンパク質を得るために、ｎａｎｏｇプロモータを用いて外来性遺伝子を発現することが望ましい場合がある。この場合、典型的には、ｎａｎｏｇプロモータ制御下に所望の外来性遺伝子を含むベクターが選ばれる。この目的のために、任意の所望の遺伝子の配列を各ベクターに含めることができる。当業者であれば、それぞれ転写されたタンパク質が本発明の方法において用いられる細胞内で翻訳後修飾を受けることが望ましい場合には、さらに酵素を同時発現することが必要なこともあることに気づくであろう。
【００４６】
（００５４）本方法においてｎａｎｏｇプロモータの制御下で用いることのできる外来性遺伝子の例としては、限定はされないが、レポータ遺伝子、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス遺伝子（いわゆる「細胞死」遺伝子）または各細胞内で所望の発現をする任意の他の遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、各遺伝子は、目的のタンパク質をコードするものであってもよい。そのような場合、本発明の方法は、各タンパク質を発現して得るために用いてもよい。ｎａｎｏｇプロモータの制御下にある遺伝子がアポトーシス遺伝子の場合、本方法は、たとえば、組織から多分化性細胞を除外するために用いることができる。
【００４７】
（００５５）例示的な例としては、ｎａｎｏｇプロモータの制御下にあるアポトーシス遺伝子を含むベクターを組織の細胞内に導入してもよい。組織は、幹細胞／前駆細胞などの多分化性細胞の分化によって得られたものであってもよい。このように本発明の方法は、各組織から、残っている全ての未分化の細胞、たとえば多分化性細胞を除外するために用いることもできる。本実施形態において、本方法は、このような未分化の細胞が生物体に移植されるのを防止するために用いることもできる。したがって、本方法の本実施形態は、たとえば、移植または埋め込み後の奇形腫の発生を防ぐために用いることもできる。さらなる説明的な例として、ｎａｎｏｇプロモータによって駆動される薬剤耐性遺伝子（たとえば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターを、幹細胞／前駆細胞の選択のために用いてもよい。
【００４８】
（００５６）他の実施形態において、本方法は、上述の少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片の、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素との複合体形成を調節する化合物を各細胞内に導入することをさらに含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、本方法は、転写因子、そのヘテロ二量体複合体、またはｎａｎｏｇプロモータの結合要素を、上記のような化合物（すなわち、少なくとも２つの転写因子の、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素との複合体形成を調節する化合物）と接触させることをさらに含む。
【００４９】
（００５７）これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、本方法は、少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの結合要素との間の上述の複合体の形成を調節する適切な化合物を同定するためのｉｎ−ｖｉｔｒｏ方法である。一実施形態において、本発明の方法は、そのような化合物を同定または選択することを目的としたスクリーニング方法として用いられる。そうしたスクリーニング方法は、自動作業ステーションを用いたマルチウェルミクロプレート（たとえば、従来の４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルのプレート）上での化合物ライブラリの同時スクリーニングを含んでいてもよい。説明的な例として、上述のようなｎａｎｏｇプロモータ内の結合領域と少なくとも２つの転写因子との間の複合体形成を阻害する化合物を同定することが望ましい場合がある。そのような化合物は、たとえば胚細胞腫瘍を標的とするか、ある種の組織の細胞の均一集団を生じさせるために、たとえば細胞分化を開始または補助することが望まれるかもしれない。このような化合物を、細胞を除去または分化させるために用いることが望ましい場合もある。この特性は、たとえば、上述の少なくとも２
つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの各結合要素との複合体形成の阻害によるものかもしれない（上記参照）。
【００５０】
（００５８）他の実施形態において、本方法はｉｎ−ｖｉｖｏ方法であり、本方法において用いられる細胞は、哺乳類または無脊椎動物種、または微生物の一部であるか、これらに含まれる。使用しうる哺乳類の例は、限定はされないが、ラット、マウス、ディンゴ、ウシ、ブタ、ヤギ、チンパンジー、マカウ、およびヒトである。各ｉｎ−ｖｉｖｏ法は、少なくとも２つの転写因子とｎａｎｏｇ遺伝子プロモータ内の結合領域との間の上述の複合体の形成を調節する化合物を投与することを含みうる。
【００５１】
（００５９）さらなる実施形態において、本発明の方法は、哺乳類（たとえば上記）または無脊椎動物において、ｎａｎｏｇプロモータ内の結合要素と上述の転写因子またはその機能的断片との間の複合体形成を調節することが判っている化合物を使用することを含む。典型的な実施形態において、上記のような使用には、たとえばヒトなどの哺乳類に投与可能な医薬品または医薬組成物の製造が含まれる。
【００５２】
（００６０）上述の複合体形成を調節する化合物は、任意の適切な手段によって投与することができる。細胞が哺乳類に含まれるか、その一部である場合には、化合物は非経口投与でも経口（経腸）投与でもよい。哺乳類への投与に対する典型的な実施形態において、投与は、例えば化合物の調製物を経口投与、静脈内投与、または吸入によって、血液および肝臓へ確実に送達できるものとする。経口投与のための調製物の例としては、錠剤、丸剤または飲用液が挙げられ、静脈内投与に対する調製物の例としては、注射液または注入液が挙げられ、吸入による投与に対する調製物の例としては、エアロゾル混合物または噴霧剤が挙げられる。細胞が、微生物に含まれるかその一部である場合、または個々の細胞（たとえば、培養中の組換え細胞）として用いられる場合、投与の例は、化合物を該細胞の環境中に注入または添加することである。個々の細胞を用いる場合には、後者の投与形態が、場合によっては微生物を改変する技術と組み合わせて行われることもある。そのような技術としては、エレクトロポレーションまたは細胞膜の透過化が挙げられる。
【００５３】
（００６１）本発明のｉｎ−ｖｉｖｏ方法、またはｎａｎｏｇプロモータ内の結合要素と上述の転写因子との間の複合体形成を調節するための化合物の使用は、様々な目的のために用いることができる。そのような目的の例としては、治療、診断または検査の目的がある。検査目的においては、いくつかの方法は、上述の少なくとも２つの転写因子とｎａｎｏｇ遺伝子プロモータ内の結合領域との間の複合体形成を調節することができるとしてすでに同定されている化合物を投与することを含んでいてもよく、他の方法は、そのような化合物の同定を目的としたものであってもよい。治療目的の説明的な例は、奇形腫の治療である。
【００５４】
（００６２）すでに上に示したように、本発明の本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、たとえば幹細胞／前駆細胞の分化を開始または補助するためにさらに用いることができる。
【００５５】
（００６３）上述の複合体形成を調節するために用いられる化合物は、任意の性質を有するものであってよい。たとえば、生物供給源もしくは非生物供給源から単離されてもよいし、または化学的もしくは生物工学的に生産されてもよい。そのような化合物の例としては、限定はされないが、有機小分子またはポリペプチドなどの生物活性ポリマー、たとえば、免役グロブリンまたは免疫グロブリン様の機能を有した結合タンパク質、またはオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
（００６４）各化合物の例示的実施形態は、核酸のメチル化状態を変化させる分子、ま
たは、ＰＯＵドメインおよびホメオドメインを含む転写因子および／またはＨＭＧドメインを含む転写因子のプロモータのメチル化状態を調節する化合物である。説明的な例として、脱メチル化分子５−アザシチジンが、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４の発現を増加させることが発見されている（ツジ‐タカヤマ（Ｔｓｕｊｉ−Ｔａｋａｙａｍａ）ら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第３２３巻、ｐ．８６〜９０）。
【００５７】
（００６５）上述の複合体形成を調節するために用いられる化合物の別の実施形態は、複合体に参加している転写因子の少なくとも一方の翻訳後修飾のパターンを変化させる分子である。転写因子の活性は、リン酸化、アセチル化またはユビキチン化を含むいくつかの翻訳後修飾によって調節されていることが知られている。
【００５８】
（００６６）このような化合物のさらなる実施形態は、核酸分子である。本明細書中で用いる「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖またはその組み合わせなど、任意の可能な立体構造にある任意の核酸のことをさす。核酸には、たとえば、ＤＮＡ分子（たとえばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（たとえばｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて、または核酸化学を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、およびＰＮＡ（タンパク質核酸）が含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノム由来でも合成されたものでもよいし、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。本発明の本方法において、必然ではないが、典型的にはＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子が用いられる。このような核酸は、たとえば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチドなどであってよい。各核酸は、非天然のヌクレオチドアナログをさらに含んでいてもよいし、かつ／またはアフィニティタグもしくはラベルが結合されていてもよい（上記参照）。
【００５９】
（００６７）多くのヌクレオチドアナログが知られており、本発明の本方法において用いられる核酸およびオリゴヌクオチドにおいて使用することができる。ヌクレオチドアナログは、たとえば塩基、糖、またはリン酸部分に修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分の修飾には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕの天然または合成の修飾体、別のプリンまたはピリミジン塩基（たとえばウラシル−５−イル、ヒポキサチン−９−イル、および２−アミノアデニン−９−イル）、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基が含まれる。他のヌクレオチドアナログは、ユニバーサル塩基として機能する。ユニバーサル塩基には、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。ユニバーサル塩基は任意の他の塩基と塩基対を形成することができる。塩基修飾は、二本鎖の安定性を高めるなどの固有の特性を達成するために、たとえば糖修飾（２’−Ｏ−メトキシエチルなど）と組み合わせることができる場合が多い。
【００６０】
（００６８）本発明の本方法のいくつかの実施形態において、核酸分子は、アプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（国際公開公報第０１／９２６５５号パンフレットに記載）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、または短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、たとえば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉ−ＲＮＡ）分子もしくは反復関連短鎖干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）分子である。
【００６１】
（００６９）短鎖干渉ＲＮＡの使用は、特定の遺伝子を「ノックダウン」するためのツールとなっている。これは、転写後レベルで起こり、ｍＲＮＡの分解を伴うＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した、遺伝子のサイレンシングまたは遺伝子抑圧を利用する。ＲＮＡ干渉は、ゲノムを保護する細胞機構に相当する。ｓｉＲＮＡ分子は、該ｓｉＲＮＡが多酵素複合体と会合していわゆるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することにより、該ｓｉＲＮＡに相補的なＲＮＡの分解を媒介する。ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣの一部となって相補的ＲＮＡ種を標的とし、次いで相補的ＲＮＡが開裂される。これが、各遺伝
子の発現の損失をもたらす（簡単な概説として、ザモア、ピーディー（Ｚａｍｏｒｅ，ＰＤ）、ハーレイ、ビー（Ｈａｌｅｙ，Ｂ）、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第３０９巻、ｐ．１５１９〜１５２４を参照されたい）。この技術は、たとえば、米国特許出願第２００５／０１９１６１８号明細書に開示されるように、寄生ＤＮＡ配列のサイレンシング、たとえばＨＩＶ ＲＮＡの開裂に応用されてきた。
【００６２】
（００７０）本発明に対するこのようなｓｉＲＮＡの典型的な実施形態は、１０〜３５ヌクレオチド、一部の実施形態においては１５〜２５ヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで合成された分子を含む。転写によって（たとえば、生きた細胞の転写機構を用いて）ｓｉ−ＲＮＡ分子を生産するために用いることのできる核酸配列の説明的な２例が、配列番号３１および配列番号３２である（実施例６を参照）。各ｓｉ−ＲＮＡ分子を対象とする細胞（微生物および動物の一部である細胞を含む）内で直接合成してもよい。また、各細胞に導入してもよいし、かつ／または該細胞に送達してもよい。ｓｉＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｖｏで選択された細胞に送達する説明的例は、重鎖抗体断片（Ｆａｂ）と核酸結合タンパク質プロタミンとの融合タンパク質にｓｉＲＮＡ分子を非共有結合により結合させることである。（ソング、イー．（Ｓｏｎｇ，Ｅ．）ら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第２３巻、第６号、ｐ．７０９〜７１７）。本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を用いて、１つまたはそれ以上のＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子および／または１つまたはそれ以上のＨＭＧドメイン含有転写因子をコードするｍＲＮＡ分子の分解を誘導する（たとえば、実施例６参照）。
【００６３】
（００７１）本発明の方法は、ｎａｎｏｇ遺伝子上の領域に特異的に結合することのできるさらなる転写因子を使用することを含んでいてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、該方法は、少なくとも第３の転写因子をｎａｎｏｇ遺伝子と接触させることを含む。このような転写因子の例としては、限定はされないが、ＳＭＡＤタンパク質ファミリーのメンバー（たとえば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ７、およびＳＭＡＤ９、またはキツネの条虫である多包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）由来のＳｍａｄＡおよびＳｍａｄＢ）、ＡＰ１（アクチベータタンパク質１）ファミリーのメンバー、ｈａｎｄ１（心臓および神経冠誘導体発現タンパク質１）転写因子またはｈａｎｄ１関連転写因子が含まれる。
【００６４】
（００７２）本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００６５】
配列解析およびプロモータ構築物
（００７３）すべての配列は、www.ncbi.nlm.nih.govおよび／またはwww.ensembl.org.にある公的に利用可能なデータベースから得た。ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）およびアフィリカゾウ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ ａｆｒｉｃａｎａ）のＮａｎｏｇプロモータ領域は、ＮＣＢＩにおいて入手可能なトレースファイル配列から構築した。ウェブ上（www-gsd.lbl.gov/vista ）のＶｉｓｔａゲノム配列アラインメントツール（メイヤー（Ｍａｙｏｒ）ら、２０００年）を用いて、マウスとヒトのＮａｎｏｇゲノム配列を比較した。マウスｎａｎｏｇおよびヒトＮａｎｏｇおよびＮａｎｏｇＧＰ１に対するプロモータ領域を適当な生物種のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅のためのプライマーは、クローニング用の制限酵素切断部位（小文字で示す）を備えた下記の
ｎａｎｏｇ順方向 ５’−ＣＧＣｇｔｃｇａｃＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＧＴＡＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１）、
ｎａｎｏｇ逆方向 ５’−ＣＧＣｇｇａｔｃｃＧＧＡＡＡＧＡＴＣＡＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号２）、
Ｎａｎｏｇ順方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＴＴＧＣＴＣＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＣ
Ｃ−３’（配列番号３）、
Ｎａｎｏｇ逆方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号４）、
ＮａｎｏｇＧＰ１順方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＴＴＧＣＴＣＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号５）、
ＮａｎｏｇＧＰ１逆方向 ５’−ＣＧＧｃｔｃｇａｇＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号６）
とした。マウスｎａｎｏｇプロモータ断片を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））およびｐＥＧＦＰ１ベクター（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））の両方にクローニングし、ヒトプロモータはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃだけにクローニングした。すべての構築物について配列確認を行った。
【００６６】
胚幹細胞培養およびレポータの系
（００７４）Ｅ１４マウスＥＳＣを、ダルベッコ改変イーグル培地、２０％ウシ胎仔血清、１×非必須アミノ酸、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、および組換えＬＩＦ調整培地のアリコート中で培養した。標準的なプロトコールを用いてＮａｎｏｇＥＧＦＰ構築物でＥＳＣを安定的にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性マウス胚線維芽細胞上で培養した細胞を用いて３００μｇ／ｍＬのＧ４１８で１０日間選択した後に、個々のコロニーを採取した。ＥＳＣを、ＬＩＦ調整培地の回収、胚様体への自発的分化、またはレチノイン酸の添加により分化させた。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ビーディーバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で行った。内在性Ｎａｎｏｇおよび強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポータの発現の定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いてリアルタイムの逆転写ＰＣＲ分析によって行った。この分析のためにＰｒｏｌｉｇｏ（登録商標）により合成されたプライマーとプローブのセットは以下の
Ｎａｎｏｇ順方向、５’−ＧＧＴＴＧＡＡＧＡＣＴＡＧＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡ−３’（配列番号７）
Ｎａｎｏｇ逆方向、５’−ＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴＡＣＴＣ−３’（配列番号８）
Ｎａｎｏｇプローブ、５’−ＴＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡ−３’（配列番号９）
ＥＧＦＰ順方向、５’−ＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１０）
ＥＧＦＰ逆方向、５’−ＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＡＴ−３’（配列番号１１）
ＥＧＦＰプローブ、５’−ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１２）
である。発現はａ−アクチン対照（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））に対して正規化した。ヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ−６（ハーバード大学のダグ・メルトン氏（Ｄｏｕｇ Ｍｅｌｔｏｎ）より入手）は、カウアン（Ｃｏｗａｎ）ら（２００４年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３５０巻、ｐ．１３５３〜１３５６）に従って継代した。
【００６７】
実施例１：Ｎａｎｏｇのダウンレギュレーション効果の分析
（ａ）ＲＮＡｉ分析
（００７５）本実施例では、ｎａｎｏｇ遺伝子活性のダウンレギュレートによる細胞効果をどのようにして分析するかについて説明する。実施例６（下記参照）に示すのと同様の方法から、ＮａｎｏｇのダウンレギュレーションがＥＳＣの分化に繋がることが判った。
【００６８】
（００７６）ＲＮＡｉのための遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、レイノルド（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）らの文献（２００４年）およびウイ‐タイ（Ｕｉ−Ｔｅｉ）らの文献（２００４年）にしたがって設計した。９ヌクレオチドのループを有する１９ヌクレオチドのヘアピン型ｓｈＲＮＡｓを、ｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏ（ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位、オリゴエンジン（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ））中にクローニングした。使用したオリゴヌクレオチドは以下の通り、すなわち
ＧＦＰ ＲＮＡｉ（対照）用として、
５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号１３）および
５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＧＧＧ−３’（配列番号１４）
Ｎａｎｏｇ ＲＮＡｉ用として、
５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号１５）および
５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＧＧ−３’（配列番号１６）
とした。Ｅ１４ＥＳ細胞を、５０％コンフルエントの状態でｓｈＲＮＡプラスミドおよびＧＦＰプラスミドで同時にトランスフェクションした。
【００６９】
（ｂ）ウェスタンブロット分析
（００７７）ＮａｎｏｇＲＮＡｉが、Ｓｏｘ２またはＯｃｔ４などの他の転写因子に影響を与えることなくＮａｎｏｇ発現を特異的にダウンレギュレートするかどうかを調べるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くウェスタンブロットによってタンパク質レベルを分析した。この２つの方法は当業者に周知である。Ｎａｎｏｇ発現ベクターを、対照、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のｓｉＲＮＡを発現する構築物とともに、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、抗Ｎａｎｏｇ抗体または抗βアクチン抗体を用いて行い、βアクチンを装荷量の対照とした。
【００７０】
（００７８）タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、当該技術分野においてよく確立されている標準的な方法によってＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）Ｐブロッティング膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移した。膜をＰＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ２０および５％ミルクでブロッキングし、特異的抗体をプローブとして調べた。その後、膜をセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体とともにインキュベートした。このブロットをＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ（商標）ウェスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって現像した。
【００７１】
（００７９）図１Ａに示すように、Ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡだけが、Ｎａｎｏｇタンパク質レベルを低減することができた。対照ＲＮＡｉ、Ｏｃｔ４ ＲＮＡｉおよびＳｏｘ２
ＲＮＡｉ（実施例６参照）は、Ｎａｎｏｇの発現に影響を及ぼさなかった。このＮａｎｏｇ ｓｉＲＮＡは、同時発現させたＳｏｘ２またはＯｃｔ４のレベルに影響を及ぼさなかった（図１Ｂ、Ｃを参照）。これらのデータから、Ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡがＮａｎｏｇに対して特異的であり、ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子ならびにＨＭＧドメイン含有転写因子に対するモデルタンパク質として選ばれた他の２つの転写因子には影響を及ぼさないことがわかった。
【００７２】
（００８０）ＥＳ細胞を、ＮａｎｏｇまたはＧＦＰのｓｉＲＮＡを発現する構築物でトランスフェクトした（下記も参照のこと）。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシンで選択し、ウェスタンブロットから、Ｎａｎｏｇのレベルが大きく減少、すなわち、検出限界のタンパク質レベルまで減少したことがわかった（図１Ｄ）。
【００７３】
（００８１）さらに、未分化ＥＳ細胞の典型的な形態が、Ｎａｎｏｇノックダウン後に失われていた（図１Ｅ）。各写真を撮るために従来の顕微鏡を用いた。アルカリホスファターゼ染色もＮａｎｏｇノックダウン細胞において劇的に減少していた。
【００７４】
実施例２：ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との間の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体形成についての検証
（００８２）当該技術分野において電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）として知られるアッセイを用いて、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２が、ｎａｎｏｇプロモータ内の要素と複合体を形成することができるかを判定した。
【００７５】
（００８３）この目的のために、核抽出物を、ディグナム（Ｄｉｇｎａｍ）ら（１９８３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１１巻、ｐ．１４７５〜１４８９）の方法を次のように改変したものを用いて、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で成長させたＥ１４マウス胚幹細胞から調製した。すなわち、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中で掻き取ることにより回収し、ペレットの５倍容のバッファＡ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）））中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ペレットの２倍容のバッファＡに再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（タイプＢペッスル）を２０ストロークとして細胞膜を溶解した。遠心分離によって核を回収し、核ペレットの０．６倍容のバッファＣ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、２５％グリセロール、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル）に再懸濁してから、回転させながら４℃で３０分間インキュベートした。次に核を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収して透析バッファ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、２０％グリセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．８３ｍＭ ＥＤＴＡ、１．６６ｍＭ ＤＴＴ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル）に対して４℃で２時間透析した。抽出物は−８０℃で保存した。
【００７６】
（００８４）ＥＭＳＡは、ＤＮＡプローブとして、ＮＯＳと呼ばれる推定上の要素と重複するｎａｎｏｇプロモータ由来の配列を含む３７塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて行った。（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子としてＳｏｘ２を選び、ＨＭＧドメインを含む転写因子としてＯｃｔ４を選んだ。陽性対照として、ＦＧＦ４エンハンサ由来の既知のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２複合結合部位（ＦＯＳ）を用いた。これはｎａｎｏｇ要素とは違って、８量体とＨＭＧモチーフとの間に３塩基対の間隔があいている。
【００７７】
（００８５）両鎖の５’末端がｃｙ５によって標識された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。一本鎖の５’標識オリゴヌクレオチドをプロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）より購入し、９５℃から室温に徐々に冷却することにより、相補的な５’標識オリゴヌクレオチドにアニールさせた。使用したオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおり、すなわち
ＦＯＳ、５’−ＴＴＴＡＡＧＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１７）；
ＮＯＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１８）；
ＮｍＯＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１９）；
ＮＯｍＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡＡＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号２０）；
ＮｍＯｍＳ、５’−ＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡ−３’（配列番号２１）；
ＮＮＳ、５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡ−３’（配列番号２２）
である（図４Ａを参照）。ＤＮＡ結合反応のためには、２μｌ（約１６μｇ）の核抽出物を、５０ｎＭ二本鎖標識オリゴヌクレオチドと５μｇのポリｄＧｄＣ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とを含む反応物に添加して反応体積１０μｌ（最終）とした。最終的な結合バッファ組成は、６０％透析バッファとした。核抽出物を加える前に、所定の１μＭ非標識オリゴヌクレオチド競合物も含めた。結合反応は、室温（ＲＴ）で約２０分間行った。所定の２μｌ（抗Ｏｃｔ４および抗ＪｕｎＢ）または８μｌ（抗Ｓｏｘ２および抗Ｓｏｘ４）の抗体を最初の結合反応に続いて付加し、さらに２０分間インキュベートした。サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）より購入した抗体は以下の通りである。ウサギ抗Ｏｃｔ４ポリクローナル抗体（Ｈ−１３４）ｓｃ−９０８１ｘ；ヤギ抗Ｓｏｘ２ポリクローナル抗体（Ｙ−１７）ｓｃ−１７３２０；ウサギ抗ＪｕｎＢポリクローナル抗体（Ｎ−１７）ｓｃ−４６ｘ；ヤギ抗Ｓｏｘ４ポリクローナル抗体（Ｃ−２０）ｓｃ−１７３２６。結合反応物を、プレラン済みの６％非変性ポリアクリルアミドゲルで、０．５×ＴＢＥ中、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ｐｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＩＩ ｘｉ装置で３００Ｖにて２時間かけて分離した。ゲルは、モレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のＴｙｐｈｏｏｎ（商標）９１４０型画像解析装置を用いて、赤色レーザ（６３３ｎｍ）ならびに、設定を６００Ｖ、通常感度および焦点面＋３ｍｍとしたＰＭＴとともにｃｙ５エミッションフィルタを用いて、ガラス板中で直接撮影した。マウス胚線維芽細胞フィーダーのみについて行ったＥＭＳＡでは、有意な移動度シフトは生じなかったことから、それらが観察されるタンパク質ＤＮＡ複合体に寄与しないことが示された。
【００７８】
（００８６）最初に、Ｅ１４マウス胚幹細胞の核抽出物中のＤＮＡ結合タンパク質が、ＮＯＳ要素を認識することができるかどうかを調べた。図２に示すように、ＥＭＳＡにおいて、ＮＯＳ要素に結合する４つの主要タンパク質複合体が観察された。ＦＯＳ要素に結合する類似の移動度を示す４つの複合体が観察されたが、この配列に結合するもう１つの複合体も観察された（レーン１２）。さらに、複合体Ｃは、ＦＯＳ要素上よりもＮＯＳ要素上において僅かに速い移動度を有するようにみえた。
【００７９】
（００８７）これらのバンドのいずれがＯｃｔ４またはＳｏｘ２に相当するかを判定するために、これらのタンパク質に対する抗体を結合反応物に加えることによってスーパーシフトが起こるかどうかを調べた。実際には、抗Ｏｃｔ４抗体を添加した後、複合体のうちの２つ、ＡおよびＣが消失し、標識されたプローブがウェル中に蓄積した（標識Ｏｃｔ４のスーパーシフト）。これは、ＮＯＳおよびＦＯＳプローブの両方で観察され（レーン２および１３）、いずれの配列上の複合体ＡおよびＣもＯｃｔ４を含んでいたことがわかった。同様に、抗Ｓｏｘ２抗体の添加により、ＮＯＳプローブとの複合体Ｃ、およびＦＯＳプローブとの複合体ＣおよびＥが消失した（レーン３および１４）。いずれの場合も、より移動の遅い複合体（標識Ｓｏｘ２のスーパーシフト）が観察された。このことは、複合体ＣおよびＥがＳｏｘ２を含んでいたことを示す。重要なのは、ＪｕｎＢまたはＳｏｘ４のいずれかに対する抗体を加えてもバンドの移動度に全く影響がなく、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２抗体の影響が特異的であることが示されたことである。したがって、複合体ＣがＯｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体の両方によってスーパーシフトしたことから、このバンドは複合要素に結合したこれらのタンパク質のヘテロ二量体を示す。複合体Ａは該ヘテロ二量体よりもより迅速に移動し、Ｏｃｔ４抗体によってのみ認識されたことから、この複合体はＯｃｔ４単量体であることが強く示唆される。同様に、ＦＯＳ配列上の複合体Ｅは、ヘテロ二量体よりも速く移動し、Ｓｏｘ２抗体によってのみ認識されたことから、これはＳｏｘ２単量体に相当することが示された。これらのバンドの相対移動度は、以前に公
表されている、ＦＧＦ４要素に結合するＦ９テラトカルシノーマ細胞抽出物中のＯｃｔ４およびＳｏｘ２を同定した結果と矛盾するものではない。
【００８０】
（００８８）現在、複合体ＢおよびＤ中の結合因子は同定されていない。複合体Ｄの有力候補は転写因子Ｏｃｔ１であり、該転写因子Ｏｃｔ１は、ＦＧＦ４要素内の８量体モチーフを認識し、移動度が同様に遅いことが示されている。さらに、Ｏｃｔ１は、ＦＧＦ４複合要素上でＳｏｘ２とヘテロ二量体を形成することが示されている。しかしながら、さらに遅く移動する複合体が無いことから、Ｅ１４核抽出物においては、少なくともＥＭＳＡによって検出されるレベルではヘテロ二量体の形成が起こっていないことが示唆される。
【００８１】
（００８９）ＮＯＳに結合したＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体が、ＦＯＳに結合したものよりも移動がわずかに速い（レーン１と１２の複合体Ｃを比較）ことは、ＦＯＳ配列の場合のように８量体モチーフをＨＭＦモチーフから隔てるヌクレオチドが存在するわけではないために、ＮＯＳ配列上でより緊密なコンフォメーションが生じることもありうるという考えと矛盾しない。このようなコンフォメーションの違いが転写活性の差異や共調節因子の動員の差異をもたらすと考えると面白い。
【００８２】
（００９０）これらの因子のＤＮＡ結合特異性を確立するために、オリゴヌクレオチド競合を行った。いずれの因子によるＮＯＳへの結合も、２０倍過剰の同一の非標識ＮＯＳを加えることによって強く競合したが（レーン７）、ｎａｎｏｇプロモータのすぐ下流の配列を含む非特異的非標識オリゴヌクレオチド（ＮＮＳ）は、結合に対して有効な競合を示さなかった（レーン１１）。これらの結果は、これらの因子のＮＯＳに対する結合が特異的であることを示す。同様に、非標識ＦＯＳが標識ＦＯＳに対するすべての結合と競合可能であり（レーン１７）、ＮＳＳでは競合できなかった（レーン２２）ことから、ＦＯＳ配列に対する結合もまた特異的である。さらに、非標識のＦＯＳおよびＮＯＳのいずれも相互に競合可能である（レーン６および１８）ことから、０または３塩基対の間隔を有する競合物のいずれが２０倍過剰に加えられた場合にも、同等に有効であることがわかる。ＮＯＳおよびＦＯＳのいずれの場合も、８量体モチーフ内に３塩基対の置換を有する競合物の存在下で結合が行われる場合、Ｏｃｔ４単量体およびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体による結合に対する競合は起こらなくなるが（レーン８および１９）、Ｓｏｘ２単量体に対する競合は依然として起こる（レーン１９）。このことは、Ｏｃｔ４単量体およびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体のいずれの結合に対しても完全な８量体モチーフが必要であることを示している。同様に、競合物のＨＭＧモチーフ内を３塩基対置換することにより、ＮＯＳおよびＦＯＳに関するＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体との競合（レーン９および２０）およびＦＯＳに関するＳｏｘ２単量体との競合（レーン２０）が消失する。いずれの場合も、Ｏｃｔ４単量体は依然として競合を受けている。このことは、Ｓｏｘ２単量体およびＳｏｘ２／Ｏｃｔ４ヘテロ二量体の結合には完全なＨＭＧドメインが必要であることを示している。最後に、同じ競合物中の８量体およびＨＭＧモチーフの両方において２塩基対を置換することにより、Ｏｃｔ４単量体およびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２ヘテロ二量体のＮＯＳおよびＦＯＳ両者への結合に対する競合が消失し（レーン１０および２１）、かつＳｏｘ２単量体のＦＯＳへの結合に対する競合が消失した（レーン２１）。図２からわかるように、ＥＭＳＡは転写因子とＮａｎｏｇとの間の形成を検証する便利な手段である。しかしながら、例えばＧＳＴプルダウンアッセイまたはＢｉａｃｏｒｅなどの他の手段を利用してもよい。
【００８３】
実施例３：ＮＡＮＯＧと（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との間のｉｎ ｖｉｖｏ複合体形成の検証
（００９１）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮａｎｏｇと転写因子との間の相互作用を分析する方法は、当業者には「クロマチン免役沈降アッセイ」または「ＣｈＩＰアッセイ」とし
て知られている。
【００８４】
（００９２）本実施例では、Ｏｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体ならびにマウスおよびヒトのＥＳＣからの核抽出物とともに、またはレチノイン酸で分化させたマウスＥＳＣにおいて、上記方法を使用することについて説明する。
【００８５】
（００９３）Ｅ１４マウスＥＳＣを用いたＣｈＩＰアッセイは、既述（ウェルズ、ジェイ．（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．）およびファーナム、ピー．ジェイ．（Ｆａｒｎｈａｍ，Ｐ．Ｊ．）、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｏｒｌａｎｄｏ）第２６巻、ｐ．４８〜５６）のようにして行った。簡潔に述べると、細胞を１％ホルムアルデヒドで１０分間室温にて架橋し、１２５ｍＭグリシンを添加することによってホルムアルデヒドを不活性化した。平均５００塩基対の大きさのＤＮＡ断片を含んだクロマチン抽出物を、Ｏｃｔ４ポリクローナル抗体（Ｎ１９）またはＳｏｘ２ポリクローナル抗体（Ｙ１７）（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））またはＳｏｘ２ポリクローナル抗体（ＡＢ５６０３）（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を用いて免役沈降させた。すべてのＣｈＩＰ実験に対して、定量的ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（アプライドバイオシステムズ）を用いて、既述（ン、エイチ．エイチ．（Ｎｇ，Ｈ．Ｈ．）ら、２００３年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ 第１１巻、ｐ．７０９〜７１９）のようにリアルタイムで行った。相対占有率は、見かけ上の免役沈降効率（入れた試料の量に対する免役沈降したＤＮＡ量の比）を測定し、対照の領域について観察されたレベルを１．０として正規化することによって算出した。プライマー対は以下のとおり、すなわち
１、５’−ＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＡＴＡ−３’（配列番号２３）、
５’−ＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＴＡＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴ−３’（配列番号２４）；
２、５’−ＧＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２５）、
５’−ＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＴＡＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＡＴＴＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２６）；
３、５’−ＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡ−３’（配列番号２７）、
５’−ＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２８）；
４、５’−ＧＧＴＧＡＴＡＣＧＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＡ−３’（配列番号２９）、
５’−ＧＧＧＣＡＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号３０）
とした。
【００８６】
（００９４）フィーダー無しの条件で増殖させた未分化のマウスＥＳＣからは、複合ｏｃｔ−ｓｏｘ要素を含むＤＮＡ断片が、それぞれＯｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体による免役沈降で４３倍および３７倍にまで富化された（図３Ａ、アンプリコン２）。ｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素を含まない２つの隣接領域には有意な富化はみられなかった（図３Ａ、アンプリコン１および３）。さらに、マウスＥＳＣをレチノイン酸によって分化誘導すると、このｏｃｔ−ｓｏｘ含有断片の富化は、その分化の程度に応じて低減された。分化の３日後、Ｏｃｔ４抗体およびＳｏｘ２抗体を両方用いた場合にのみ富化は最大でバックグラウンドの１０倍にまで達したが、分化の６日後には、有意な富化は検出できなかった（図３Ａ）。Ｍｌｌに対する抗体を陰性対照として用いた場合、分析した３つのＥＳＣ状態の
いずれからもアンプリコンのいずれについても有意な富化は見られなかった（データ示さず）。ここで同定された富化のレベルは、ＥＧＦＰレポータ系を用いた上述の類似の分化プロトコールにおけるＮａｎｏｇプロモータの活性の場合とよく対応している。
【００８７】
（００９５）ＯＣＴ４およびＳＯＸ２がヒトＥＳＣのＮＡＮＯＧプロモータとも相互作用することを検証するために、類似のＣｈＩＰ分析を行ってもよい。本実施例においては、不活性化マウス胚線維芽細胞上で増殖させたヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ−６を用いた。ＯＣＴ４抗体およびＳＯＸ２抗体でクロマチン免役沈降したＤＮＡの富化を検出するために、いずれもＮＡＮＯＧのエキソン１に近接する６つの異なるアンプリコンを用いた（図３Ｂ）。複合ｓｏｘ−ｏｃｔ要素と近いほうの３つのアンプリコンだけが、両抗体による有意な富化を示した（図３Ｂ）。第２のＳｏｘ２抗体（Ｙ１７）から、類似の結果が得られた（データ示さず）。マウスＥＳＣにおいて見られるものと比較して３つすべての抗体について富化率が低い（６倍）のは、未分化なヒトＥＳＣを培養中に維持するのがより難しい傾向にあるので、ヒト培養物に分化した細胞がより多く存在することによるのかもしれない。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体を陰性対照として用いたところ、これらのヒトＥＳＣ中のアンプリコンのいずれに対しても有意な富化は見られなかった（データ示さず）。まとめると、これらのＣｈＩＰデータのすべてが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、未分化なマウスおよびヒトＥＳＣ中のＮａｎｏｇ／ＮＡＮＯＧプロモータ上をＯｃｔ４／ＯＣＴ４およびＳｏｘ２／ＳＯＸ２が占有することを明確に示している。
【００８８】
実施例４：ＮＡＮＯＧ上の結合要素の同定
（００９６）本実施例では、Ｎａｎｏｇ遺伝子上の結合領域を、その配列保存性に基づいてどのようにして同定できるかを説明する。
【００８９】
（ａ）シス調節情報を含む非コーディング領域の配列比較
（００９７）本発明者らは、ｎａｎｏｇの高度に保存された結合領域、ｓｏｘ−ｏｃｔ複合要素を同定済みである。マウスおよびヒト遺伝子配列のペアワイズなアラインメントを、エルビーエル・バークレー（ＬＢＬ Ｂｅｒｋｌｅｙ）のＶｉｓｔａオンラインツール（メイヤー、シー．（Ｍａｙｏｒ，Ｃ．）ら、２０００年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ 第１６巻、ｐ．１０４６〜１０４７）を用いて作成し、作成にあたっては、最適なアラインメントの作成時に種特異的な反復要素を考慮した。このアラインメントに対しては、マウスｎａｎｏｇＥＳＴの最も５’側の１０ｋｂ上流から、３’マウスｎａｎｏｇＥＳＴの最も３’側の１０ｋｂ下流までのゲノム領域を選択した。配列類似性のピークがｎａｎｏｇの４つのエキソンに対応して同定されたが、ホメオドメインをコードするエキソン２および３で最も顕著であり、エキソン１で最も顕著でなかった（データ示さず）。非コーディング領域のなかでは、ＥＳＴの最も５’側のすぐ上流に、近位プロモータと定義される、有意な配列保存性を有する唯一の領域がみつかった。
【００９０】
（００９８）非コーディング配列に有意な保存性が認められないことは、多分化性発現を指示するシス調節要素が、すべてこの近位プロモータ領域内にあることを示唆することに他ならない。このことを調べるために、レポータＥＧＦＰの発現を駆動するマウス近位プロモータ領域を含むプラスミドベクターで、安定にトランスフェクトされたマウスＥＳ細胞株を作成した。４０６塩基対のプロモータ断片は、優勢な転写開始部位として定義されてきたことから、最も遠い５’共通（ｐｕｂｌｉｃ）ＥＳＴの位置として同定されている位置に対して−２８９から＋１１７の配列で構成した（ハート、エイ．エイチ．（Ｈａｒｔ，Ａ．Ｈ．）ら、前掲）。選択後、これらのｎｅｏ耐性コロニーの大半が、緑色の蛍光を発し、ｎａｎｏｇプロモータのこの領域が多分化性細胞において実際に活性を有することを示した（図４Ｂを参照）。これらのｎａｎｏｇＥＧΕＶコロニーのいくつかをさらなる分析のために選択した。
【００９１】
（００９９）このプロモータ断片内の明らかに多分化性ポジティブなシス調節要素に加えて、発明者らは、内在性ＮａｎｏｇのｍＲＮＡレベルでは起こるような、ＥＳ細胞分化時の転写のダウンレギュレーションに十分なシス調節情報を該断片が含んでいるかを判定することに関心を持った。ＥＳ細胞分化の強力な誘発剤であるレチノイン酸を０．１μＭで使用して分化を誘発させた。この処理により、３日後にＥＧＦＰ発現が劇的に減少し（図４Ｅ−Ｆ参照）、分化から４日後までにはＦＡＣＳ分析による測定でＥＧＦＰポジティブのままの細胞はわずか９％にすぎなかった（図４Ｇを参照）。これは同じ分化プロトコールにおける内在性ｎａｎｏｇのｍＲＮＡレベルと非常に似ている（チャンバース、アイ．（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．）ら、前掲）。
【００９２】
（０１００）より明敏な分化プロトコールにおいても、このプロモータ構築物の活性はやはり内在性Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡレベルと類似していた。ｎａｎｏｇＥＧＦＰ細胞をＬＩＦの非共存下で培養したところ、ＥＧＦＰ発現が培養の３日後に顕著に低下し（図４Ｃ〜Ｄを参照）、４日目までには、ＥＧＦＰポジティブであったのは、フィーダーを含まない未分化ｎａｎｏｇＥＧＦＰ細胞では７４％であるのに対して、４８％の細胞にすぎなかった（図４Ｇを参照）。胚様体形成もまた、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ビーディーバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））上でのＦＡＣＳ分析によって測定されるように、ＥＧＦＰ発現のダウンレギュレーションを誘発した。内在性ＮａｎｏｇおよびＥＧＦＰレポータの発現の定量化は、上述のようなＲＴ−ＰＣＲ分析によって行った（「胚幹細胞培養およびレポータの系」を参照）。分化の最初の２日の後、ＥＧＦＰ発現は次第に減少し、８日目までには、バックグラウンドレベルの発現しか認められず（図４Ｇを参照）、これは、内在性Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡの発現と類似している（ハート（Ｈａｒｔ）ら、２００４年）。よってこのｎａｎｏｇの４０６塩基対断片は、少なくともＥＳ細胞を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏの系において試験した場合には、内在性ｎａｎｏｇ発現を再現するのに十分なシス調節情報を含んでいる。
【００９３】
（ｂ）系統発生学的フットプリンティングによる結合要素の同定
（０１０１）広範囲の哺乳類から近位プロモータ領域のアラインメントを作成することにより、同定を強力な系統発生学的フットプリントにすることができる。このアラインメントの構築にあたって使用した５つの種の間の分岐年代は、控えめに見積もっても、マウスとラットの分岐については千２百万年前であり、マウス、ラット、ヒト、ウシおよびゾウの間では六千万年前であるが、この見積もりから、フットプリントを同定するための累積２億５千２百万年の浄化選択が提供される。最も大きい配列保存の長さは、ｎａｎｏｇ転写開始部位との相対位置−２１２から−１１９までに位置する９４塩基対領域にわたり、このうち６４位置が不変である（図５Ａを参照）。
【００９４】
（０１０２）最も長い連続不変配列は１６塩基対長であり、面白いことに、この配列の中に、ｆｇｆ４，ｕｔｆ１，ｓｏｘ２，およびｆｂｘ１５の多分化性発現において同定された要素もしくは前記発現に対して機能的であることが知られている要素と類似した、１５塩基対のｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素（図５Ａを参照）がある（ユアン、エイチ．（Ｙｕａｎ，Ｈ．）ら、前掲；ニシモト、エム．（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、前掲；トミオカ、エム．（Ｔｏｍｉｏｋａ，Ｍ．）ら、前掲；トクザワ、ワイ．（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．）ら、前掲）。ｓｏｘ要素とｏｃｔ要素の相対位置は、上記５つの遺伝子全部において同じであり、このことは、多分化性細胞においてこれらの要素と結合することが知られている対応する転写因子（Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）の間の特異的なタンパク質−タンパク質接触を示すものである（レメニ、エイ．（Ｒｅｍｅｎｙｉ，Ａ．）ら、２００３年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．２０４８〜２０５９）。ｕｔｆｌ，ｓｏｘ２，およびｆｂｘ１５と同様に、ｎａｎｏｇ内のｓｏｘシス要素およびｏｃｔシス要素は互いに直接隣接しており、ｆｇｆ４においては該２つの要素は３つの塩基で隔てられている。
【００９５】
（０１０３）ｎａｎｏｇプロモータ内の多数の部位におけるこのような強力な浄化選択は、転写の調節におけるこれらの部位の機能的役割を示唆するものである。これらの部位のいくつか、たとえば、ｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素などは、多分化性発現において重要でありそうだし、他のものは、ｎａｎｏｇの移植後発現において機能するシス調節要素に相当するかもしれない。さらに、マウスＥＳＣにおける超並列シグニチャシーケンシング（ウェイ、シー．エル．（Ｗｅｉ，Ｃ．Ｌ．）ら、２００５年、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ 第２３巻、ｐ．１６６〜１８５）によって測定されたように、ｓｏｘ−ｏｃｔ複合要素の位置および向きと、対応する遺伝子の発現レベルとの間には、明確な関係はない（表１）。
【００９６】
実施例５：ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との複合体によるｎａｎｏｇ遺伝子発現の調節
（０１０４）本実施例では、ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との複合体形成の、多分化性細胞の転写活性化に対する影響の分析について説明する。
【００９７】
（０１０５）上記保存プロモータ内の特定の配列要素の役割を調べるために、一連のルシフェラーゼレポータ構築物を構築し、Ｆ９テラトカルシノーマ細胞内にトランスフェクトした。
【００９８】
（０１０６）ＤＮＡ断片（−２８９〜＋１１７）は、プライマーｐＮａｎｏｇＦおよびｐＮａｎｏｇＲを用いてＰＣＲによりマウスゲノムＤＮＡ（２Ｂ ｇＤＮＡ）から増幅した（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｐｆｕポリメラーゼ）。そのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化断片をｐＥＧＦＰ−１（ビーディーバイオサイエンシズ・クロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この完全な構築物に続いて、ｐＥＧＦＰ−１マルチクローニングサイト由来の２２塩基対を含むＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＧＬ３ Ｂａｓｉｃ（プロメガ）のＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをシーケンシングにより確認し、ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ ｐＮａｎｏｇと名付け、次の突然変異誘発実験に用いた。レポータプラスミドは、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて３塩基対の変異が組み込まれるように改変した。修飾プラスミドはシーケンシングにより確認した。Ｆ９細胞（ＡＴＣＣ）を、１５％標準ウシ胎仔血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））および１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン‐ストレプトマイシン）を含む高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。細胞は、５％ＣＯ２で３７℃に維持した。ＤＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用し、２４ウェル形式の細胞培養に対する同社のプロトコールを用いてＦ９細胞中にトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（プロメガより入手したｐＲＬ−ＴＫ）を内部対照として同時トランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解し、溶解物のルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポータアッセイシステム（プロメガ）により、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０型９６ウェル照度計（ベルトールドテクノロジーズ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて測定した。少なくとも、トランスフェクションは２回ずつ、２回の独立した状況で行った。レポータプラスミドは、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標）部位特異的変異誘発キット（クロンテック）を用いて、３塩基対の変異が組み込まれるように改変し、変異はシーケンシングによって確認した。
【００９９】
（０１０７）ｎａｎｏｇＥＧＦ ＥＳ細胞を作製するために用いた野生型４０６塩基対プロモータ断片は、予想どおり顕著な転写活性を有し、すべての比較において該活性を１００％と設定しポジティブコントロールとして使用した（図５Ｂ、２Ｃを参照）。図５Ａ
中の保存配列のすぐ５’側から始まるこの野生型プロモータのより短いもの（−２３０〜＋６３）は、元のプロモータ活性の約１３０％を維持していた。このことは、この短いプロモータから除外された配列内に潜在的な負の調節要素が含まれていることを示唆するだけでなく、多分化能エンハンサ要素が−２３０〜＋６３の領域内に含まれることを示している。
【０１００】
（０１０８）この保存されたモジュールの方向依存性を調べるために、この領域（−２８９〜−９４）が直近位プロモータ（−９３〜＋１１７）に対して順方向または逆方向のいずれかの方向の相同な構築物を構築した。野生型活性の７９％が順方向構築物において維持され、４８％が逆方向構築物において維持されていた。有意な転写活性は、この保存領域を逆向きにした場合にも該領域に維持されていたことから、わずかに低い活性が向きの微妙な影響を示すかもしれないものの、エンハンサ活性は向きに依存しないことが示唆された。
【０１０１】
（０１０９）保存領域の機能的重要性の別の尺度として、第２の種からの、すなわち、ヒトｎａｎｏｇを用いて、相同領域を調べた。マウスＦ９細胞にトランスフェクトされたこの構築物は、マウス転写活性の６０％を維持していた（Ｈｓ．１、図５Ｂを参照）ことから、実質的な機能保存が示された。本発明者らは、ＮａｎｏｇＧＰｌの、ヒトｎａｎｏｇのタンデム重複コピーからの相同領域についても調べた。おもしろいことに、ヒト多分化性細胞においてこの転写物のレベルは非常に低いにもかからわず、該領域は有意な転写活性を維持しており（Ｈｓ．２、図５Ｂを参照）、このことは、ＮａｎｏｇＧＰｌの不活性化変異がシス調節要素中ではなく、コーディング配列中にストップコドン８アミノ酸を生じることが判っているものでありそうなことを示唆している（ブース、エイチ．エイ．（Ｂｏｏｔｈ，Ｈ．Ａ．）およびホランド、ピー．ダブリュ．（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｗ）、前掲）。
【０１０２】
実施例６：Ｎａｎｏｇ活性ＲＮＡｉ分析の調節の分析
（０１１０）本実施例では、ＮＡＮＯＧと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子とのあいだの複合体形成による、Ｎａｎｏｇプロモータの活性調節の分析について示す。本実施例においては、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２がＮａｎｏｇプロモータの多分化性活性に与える影響を分析した。
【０１０３】
（０１１１）この目的のために、ＲＮＡｉ実験を実施して、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のレベルを低下させた。この実験で用いたＰｏｕ５ｆｌおよびＳｏｘ２ ＲＮＡｉ構築物のいずれも、それぞれのｍＲＮＡを特異的にノックダウンすることがすでに知られているものである。Ｎａｎｏｇ−ルシフェラーゼレポータ構築物を、マウスＥＳＣにＰｏｕ５ｆｌ、Ｓｏｘ２、ＧＦＰ、または空のＲＮＡｉ構築物と同時トランスフェクトし（図６Ａ）、その後ルシフェラーゼ活性のアッセイを行った。
【０１０４】
（０１１２）オリゴヌクレオチドを、既述（ブルメルカンプ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ）ら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２９６巻、ｐ．５５０〜５５３）のようにして、９ヌクレオチドループを有する１９ヌクレオチドのヘアピン型短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏ（ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位；オリゴエンジン（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ））にクローニングした。すべての配列について、ＢＬＡＳＴ検索で解析し、他の遺伝子と有意な配列類似性を有していないことを確認した。Ｅ１４マウスＥＳＣは、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルプレートに細胞が２０，０００〜３０，０００個／ウェルの密度で（１０００個／ウェルの初代胚線維芽細胞とともに）播種した。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて行った。５０ｎｇのＮａｎｏｇ−ｐＧＬ３（ホタルルシフェラーゼ構築物），１５０ｎｇのｐＳｕｐｅｒまたはｐＳｕｐｅｒ＿ＲＮＡｉ，およびｐｈＲＬＳＶ４０（
ウミシイタケルシフェラーゼを発現する正規化対照）をトランスフェクトした。
【０１０５】
（０１１３）トランスフェクションから２４時間後に、ピューロマイシン耐性でさらに２日間細胞を選択してから、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＮＡｉに用いた配列は以下のとおり、すなわち
Ｓｏｘ２、５’−ＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＧＧＡＴＴＡ−３’（配列番号３１）；
Ｏｃｔ４、５’−ＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴ−３’（配列番号３２）
である。
【０１０６】
（０１１４）図６Ｂに見られるように、ルシフェラーゼ活性は、Ｐｏｕ５ｆｌおよびＳｏｘ２のＲＮＡｉによってほとんどバックグラウンドレベルにまで低減されたが、ＧＦＰおよび空のＲＮＡｉ対照では全く影響がなかった。
【０１０７】
（０１１５）本明細書で例示的に記載した発明は、本明細書に具体的に開示されていないような任意の要素または限定なしで適切に実施してもよい。したがって、たとえば、用語「〜を含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”，“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”，“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”，など）」という用語は、限定的ではなく開放的に読まれることになる。さらに、本明細書で用いる用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、開示および説明した特徴およびその一部の任意の均等物を除外するような用語および表現を使用する意図は全くなく、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内で様々な修正が可能であるものと理解される。したがって、本発明を説明的実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示してきたものの、本明細書に開示する具現された発明の修正および変更も、当業者によって行使されることができ、そのような修正や変更も本発明の範囲に含まれるとみなされると理解すべきである。
【０１０８】
（０１１６）本発明について、広範かつ一般的に本明細書において説明してきた。包括的開示の範囲内に入るより狭い種類のものおよび準包括的な群もまた、本発明の一部を構成する。これには、除外されたものが本明細書に具体的に列挙されているかどうかに関係なく、その分類から任意の特徴を除外する条件または負の限定を有する本発明の包括的説明も含まれる。
【０１０９】
（０１１７）他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の中にある。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、本発明が、そのマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていることを理解できるであろう。
【０１１０】
【表１】
上記表中、
ａ参照文献：Ｆｇｆ４：ハート（Ｈａｒｔ）ら、前掲；
Ｕｔｆｌ：ニシモト（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ）ら、前掲；
Ｓｏｘ２：トミオカ（Ｔｏｍｉｏｋａ）ら、前掲；
Ｆｂｘｌ５：トクザワ（Ｔｏｋｕｚａｗａ）ら、前掲；
Ｎａｎｏｇ：本願発明者；
Ｐｏｕ５ｆｌ：本願発明者，オクムラ‐ナカニシ（Ｏｋｕｍｕｒａ−Ｎａｋａｎｉｓｈｉ）ら、前掲
ｂ転写開始部位から
ｃＭＰＳＳ：超並列シグニチャシーケンシング（ウェイ（Ｗｅｉ）ら、前掲）
ｄｔｐｍ，マウスＥＳＣにおける１００万あたりのタグ数
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＮａｎｏｇＲＮＡｉを用いた胚幹細胞（ＥＳＣ）におけるＮａｎｏｇダウンレギュレーションの効果を示す図。（Ａ）使用したＮａｎｏｇＲＮＡｉの特異性について、Ｎａｎｏｇ発現ベクターを、対照、Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のｓｉＲＮＡを発現する構築物とともに２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトすることによって調べた。細胞溶解物を、抗Ｎａｎｏｇ抗体または抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。βアクチンは装荷量の対照とした。（Ｂ）ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡは、Ｓｏｘ２の発現に影響を及ぼさなかった。ｎａｎｏｇまたは対照のｓｉＲＮＡ構築物を、Ｓｏｘ２発現ベクターとともに２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトした。溶解物を、抗Ｓｏｘ２抗体または抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。（Ｃ）ｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡは、Ｏｃｔ４の発現に影響を及ぼさなかった。ｎａｎｏｇまたは対照のｓｉＲＮＡ構築物を、Ｏｃｔ４発現ベクターとともに２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトした。溶解物を、抗Ｏｃｔ４抗体または抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。（Ｄ）ｎａｎｏｇのノックダウンにより、ＥＳ細胞中のＮａｎｏｇが減少した。ｎａｎｏｇまたは対照のｓｉＲＮＡ構築物を、ＥＳ細胞中にトランスフェクトした。溶解物を、抗Ｎａｎｏｇ抗体または抗βアクチン抗体を用いて調べた。（Ｅ）ｎａｎｏｇのノックダウンにより、ＥＳ細胞の分化が誘発された。ｎａｎｏｇおよび対照のノックダウン細胞をアルカリホスファターゼについて染色した。写真は、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＥＳＣ（Ｉ）およびｎａｎｏｇ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＥＳＣ（ＩＩ）を同時に撮影したものである。ノックダウンした細胞の扁平な上皮様細胞の存在は、ベクター対照のＥＳ細胞においては全く認められないことに注目されたい。
【図２】ＰＯＵおよびホメオドメイン含有転写因子ならびにＨＭＧドメイン含有転写因子の、ｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素との複合体形成を分析するための例示的方法として、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す図。本実施例はＯｃｔ４およびＳｏｘ２の、Ｎａｎｏｇ８量体／ＨＭＧ複合要素への結合を説明する。ＥＭＳＡは、ｎａｎｏｇプロモータ由来の標識した推定Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２要素、または陽性対照としてのＦＧＦ４エンハンサ由来の既知のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位のいずれかを用いて実施した。因子の結合は、Ｅ１４胚幹細胞の粗製核抽出物中で調べた。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２を含むタンパク質−ＤＮＡ複合体は、示したバンドをスーパーシフトさせる抗体の添加によって同定した。結合特異性を、オリゴ競合物（ＰＡＧＥゲルの一番上に表示）を用いて調べたところ、Ｏｃｔ４の結合には完全な８量体モチーフを必要とし、Ｓｏｘ２の結合には完全なＨＭＧ要素を必要とすることが示された。ヘテロ二量化には、両方が完全であることが必要であった。競合物についての記号は次のとおりである。Ｎ＝Ｎａｎｏｇ，Ｆ＝ＦＧＦ４，Ｏ＝Ｏｃｔ４結合部位、Ｓ＝Ｓｏｘ２結合部位、ｍＯ＝変異型Ｏｃｔ４結合部位、ｍＳ＝変異型Ｓｏｘ２結合部位、Ｇｂｘ＝非特異的競合物。
【図３】Ｏｃｔ４／ＯＣＴ４およびＳｏｘ２／ＳＯＸ２の、Ｎａｎｏｇ／ＮＡＮＯＧプロモータとのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用を示す図。（Ａ）クロマチン免役沈降（ＣｈＩＰ）は、未分化のマウスＥＳＣ（第０日、レチノイン酸、ＲＡ）およびレチノイン酸（ＲＡ）の共存下で３日間および６日間培養したＥＳＣについて行った。Ｏｃｔ４（Ｎ１９）およびＳｏｘ２（Ｙ１７）に対する抗体による免疫沈降を示す。リアルタイムＰＣＲによって測定した富化の倍率を３つの異なるアンプリコンで比較した。このうち１つ（アンプリコン２）は、複合ｏｃｔ−ｓｏｘ要素（概略図では白抜きのボックスで示す）を含み、残りの２つ（アンプリコン１および３）は含まなかった。各アンプリコンの転写開始部位に対する位置が概略図に示されており、Ｎａｎｏｇのエキソン１が黒塗りのボックスで示されている。（Ｂ）ヒトＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧのＯＣＴ４およびＳＯＸ２ ＣｈＩＰ。未分化細胞からの特定のアンプリコンの富化の倍率が示されている。このデータから、複合ｓｏｘ−ｏｃｔ要素に最も近い３つのアンプリコンだけが、使用した両抗体によって富化を示したことがわかる。すべて標準偏差が示されている。
【図４】ｎａｎｏｇ近位プロモータが、未分化ＥＳ細胞においてはＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）発現を駆動するが、同細胞の分化誘導体においては駆動しないことを示す図。ＥＧＦＰ発現を駆動するｎａｎｏｇプロモータ（転写開始部位に対して−２８９〜＋１１７）を含むベクター構築物で安定的にトランスフェクトされたマウスＥＳＣ株（ＮａｎｏｇＥＧＦＰ）を、異なる培養条件において比較した。光学顕微鏡写真（Ａ，Ｃ，Ｅ）および蛍光顕微鏡写真（Ｂ，Ｄ，Ｆ）は、未分化のＥＳＣ（Ａ，Ｂ）、ＬＩＦなしで３日間培養したＥＳＣ（Ｃ，Ｄ）、および０．１μＭレチノイン酸（ＲＡ）で３日間処理したＥＳＣ（Ｅ，Ｆ）のものである。ＬＩＦを回収すると、ＲＡへの曝露よりも分化誘発の積極性は小さいが、ＥＧＦＰ発現は大きく減少した。ＥＳＣ分化の強力な誘発剤であるＲＡは、ＥＧＦＰ発現を劇的に減少させた。（Ｇ）リアルタイムＰＣＲでの検出により、内在性Ｎａｎｏｇ転写物のレベルを、未分化および分化条件下においてＮａｎｏｇプロモータによって誘導されるＥＧＦＰのレベルと比較して示すグラフ。グラフ中の数値は、ＦＡＣＳ分析によって測定したＥＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示す。ＥＢは胚様体であり、ＲＡはレチノイン酸である。
【図５】（Ａ）系統発生学的フットプリンティングによる結合要素の同定の例を示す図。ｎａｎｏｇ配列は、マウス、ラット、ヒト、ウシおよびゾウのゲノムシーケンシングプロジェクトから得た。２億５千万年以上の累積進化あいだ不変のままである、転写開始位置から−２１２〜−１１９の領域に影をつけてある。ｏｃｔ−ｓｏｘ複合要素は、３塩基対の置換変異体として示してあり、該変異体の対応名は下に表示してある。 （Ｂ、Ｃ）Ｎａｎｏｇと、（ＰＯＵ）特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写遺伝子ならびにＨＭＧドメインを含む転写因子との間の複合体形成の影響の分析を示す図。Ｆ９テラトカルシノーマ細胞に一時的にトランスフェクトされた様々なｎａｎｏｇプロモータ構築物のプロモータ−ルシフェラーゼレポータアッセイを示している。−２８９〜＋１１７のマウスｎａｎｏｇプロモータ断片（ｗｔ）のルシフェラーゼ活性を任意で１００％に設定する。（Ｂ）変更を加えたマウスプロモータ構築物の活性を、野生型（ｗｔ）、短縮型（ｓｈｏｒｔ）（短い野生型プロモータ、−２３０〜＋６３の領域）と比較したもの。ＦｏｒおよびＲｅｖは、互いに同じであるが、保存領域（−９３〜＋１１７）の転写開始位置に対する向きが逆である。Ｈｓ．１およびＨｓ．２は、それぞれヒトＮａｎｏｇおよびＮａｎｏｇＧＰｌ由来の、マウスｗｔ構築物に相同な領域である。（Ｃ）置換変異のマウスプロモータ活性への影響。変異は、ｏｃｔ／ｓｏｘ要素がいずれも変異を有するｏｃｔ／ｓｏｘ構築物に関して、（Ａ）に示したものに相当する。
【図６】Ｎａｎｏｇプロモータ活性に対する、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のＲＮＡｉノックダウンの結果を示す図。図２Ａは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびＥＧＦＰ（対照）を標的とするＲＮＡｉ構築物の、Ｎａｎｏｇプロモータ−ルシフェラーゼレポータ構築物とともにマウスＥＳＣ中への同時トランスフェクションの概略図である。図２Ａは、トランスフェクションから３日後に測定されたルシフェラーゼ活性を示す。（Ｂ）ルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケルシフェラーゼ内部対照と比較して測定した。阻害性ＲＮＡを含まない構築物を陰性対照（−）として用いた。示したとおり、Ｎａｎｏｇプロモータ活性は、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４の両者を標的としたＲＮＡｉ構築物によって低減される。標準偏差も示してある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方の、多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させる工程であり、前記少なくとも２つの転写因子の一方はＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択され、前記少なくとも２つの転写因子の他方はＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される接触工程と、
（ｂ）前記少なくとも２つの転写因子がｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにする工程であり、前記複合体は転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節することを特徴とする工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子のホメオドメインは、ＰＯＵ−ホメオドメインであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体形成を検出する工程をさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方におけるｎａｎｏｇ遺伝子発現を測定する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ｄ）工程（ｃ）において得られた測定結果を、対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの転写因子は、ｎａｎｏｇプロモータ上でヘテロ複合体を形成することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヘテロ複合体は、２つの転写因子からなるヘテロ二量体であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つの転写因子は相乗的に作用して、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を活性化することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子はＯｃｔ４であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＭＧドメイン含有転写因子はＳｏｘ２であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２つの転写因子は、ｎａｎｏｇプロモータ内の複合結合要素に結合し、前記ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子は複合結合要素の一方部分に結合し、前記ＨＭＧドメイン含有転写因子は複合結合要素の他方部分に結合することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
複合結合要素は２つの部分からなる結合部位であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複合結合要素は、Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｏｃｔ４結合部位およびＳｏｘ２結合部位は互いに直接隣接していることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞／前駆細胞は、胚幹細胞であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
胚幹細胞はヒト由来であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも第３の転写因子をｎａｎｏｇ遺伝子と接触させる工程をさらに含み、前記第３の転写因子は、ＳＭＡＤタンパク質ファミリーのメンバー、ＡＰ１ファミリーのメンバー、ｈａｎｄ１転写因子およびｈａｎｄ１関連転写因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２つの転写因子のそれぞれが、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２８９〜＋１１７からなるヒトｎａｎｏｇ遺伝子の領域に対応するそれぞれのｎａｎｏｇ遺伝子の領域内に位置する結合部位に結合することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
３つの転写因子のそれぞれに対する結合部位が、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２１２〜−１１９からなるヒトｎａｎｏｇ遺伝子の領域に対応するｎａｎｏ遺伝子の領域内に位置することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞内の遺伝子発現を調節する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させる工程であり、前記少なくとも２つの転写因子の一方はＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択され、前記少なくとも２つの転写因子の他方はＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される接触工程と、
（ｂ）前記少なくとも２つの転写因子がｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにする工程であり、前記複合体は転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節することを特徴とする工程と
を含む方法。
【請求項２１】
前記ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子のホメオドメインは、ＰＯＵ−ホメオドメインであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞は、幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞は、胚幹細胞であることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞は、がん細胞であることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
がんは、奇形腫であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞は、ｎａｎｏｇプロモータを含み少なくとも２つの転写因子を発現する組換え細胞であり、少なくとも２つの転写因子の一方はＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子またはその機能的断片から選択され、少なくとも２つの転写因子の他方はＨＭＧドメイン含有転写因子またはその機能的断片から選択されることを特徴とする請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
発現が調節される遺伝子は、レポータ遺伝子、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス遺伝子（いわゆる「細胞死」遺伝子）、または各細胞における所望の発現を有する任意の他の遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写因子を、前記少なくとも２つの転写因子とｎａｎｏｇプロモータの前記要素との複合体形成を調節する化合物と接触させる工程をさらに含む請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの前記要素との複合体形成が、核酸分子によって低減されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸分子はアプタマー、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉ−ＲＮＡ）分子、または反復関連短鎖干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）分子であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
核酸分子は、配列番号３１の配列から転写されたｓｉ−ＲＮＡ分子、または配列番号３２の配列から転写されたｓｉ−ＲＮＡ分子のうち少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
方法は、前記複合体形成を調節する適切な化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であることを特徴とする請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの前記要素との間の複合体形成の阻害により細胞を除去するかまたは分化させるのに有用である潜在的化合物を、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでスクリーニングするための請求項３３に記載の方法であり、自動化作業ステーションを用いたマルチウェルマイクロプレート上での化合物ライブラリの同時スクリーニングを含む方法。
【請求項３５】
前記細胞は哺乳類に含まれており、方法はｉｎ−ｖｉｖｏ方法であることを特徴とする請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳類は、ラット、マウス、ディンゴ、ウシ、ヤギ、ブタ、チンパンジー、マカウおよびヒトからなる群より選択されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの転写因子と、ｎａｎｏｇプロモータの結合領域との間の前記複合体の形成を調節する化合物を投与することを含む、請求項３５または３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
奇形腫の治療のための方法であるか、または奇形腫の治療の一部である請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
複合体形成を検出することをさらに含む請求項２０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｃ）細胞内でのｎａｎｏｇ遺伝子の発現を測定する工程をさらに含む請求項２０〜３
９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
（ｄ）工程（ｃ）において得られる測定結果を、対照測定の結果と比較することをさらに含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
検出は、適切な分光学的、光化学的、光分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的または熱力学的方法によって行うか、または細胞効果に基づいて行うことを特徴とする請求項３または３９に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも２つの転写因子が相乗的に作用して、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を活性化することを特徴とする請求項２０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子はＯｃｔ４であることを特徴とする請求項２０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方の、多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させる工程であり、前記少なくとも２つの転写因子の一方はＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択され、前記少なくとも２つの転写因子の他方はＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される接触工程と、
（ｂ）前記少なくとも２つの転写因子がｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにする工程であり、前記複合体は転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節することを特徴とする工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子のホメオドメインは、ＰＯＵ−ホメオドメインであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体形成を検出する工程をさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方におけるｎａｎｏｇ遺伝子発現を測定する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ｄ）工程（ｃ）において得られた測定結果を、対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２つの転写因子は、ｎａｎｏｇプロモータ上でヘテロ複合体を形成することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヘテロ複合体は、２つの転写因子からなるヘテロ二量体であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つの転写因子は相乗的に作用して、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を活性化することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子はＯｃｔ４であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＭＧドメイン含有転写因子はＳｏｘ２であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２つの転写因子は、ｎａｎｏｇプロモータ内の複合結合要素に結合し、前記ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子は複合結合要素の一方部分に結合し、前記ＨＭＧドメイン含有転写因子は複合結合要素の他方部分に結合することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
複合結合要素は２つの部分からなる結合部位であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複合結合要素は、Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２結合部位であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｏｃｔ４結合部位およびＳｏｘ２結合部位は互いに直接隣接していることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞／前駆細胞は、胚幹細胞であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
胚幹細胞はヒト由来であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも第３の転写因子をｎａｎｏｇ遺伝子と接触させる工程をさらに含み、前記第３の転写因子は、ＳＭＡＤタンパク質ファミリーのメンバー、ＡＰ１ファミリーのメンバー、ｈａｎｄ１転写因子およびｈａｎｄ１関連転写因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２つの転写因子のそれぞれが、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２８９〜＋１１７からなるヒトｎａｎｏｇ遺伝子の領域に対応するそれぞれのｎａｎｏｇ遺伝子の領域内に位置する結合部位に結合することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
３つの転写因子のそれぞれに対する結合部位が、ヒトｎａｎｏｇ遺伝子配列の位置−２１２〜−１１９からなるヒトｎａｎｏｇ遺伝子の領域に対応するｎａｎｏ遺伝子の領域内に位置することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞内の遺伝子発現を調節する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片を、ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域と接触させる工程であり、前記少なくとも２つの転写因子の一方はＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択され、前記少なくとも２つの転写因子の他方はＨＭＧドメイン含有転写因子から選択される接触工程と、
（ｂ）前記少なくとも２つの転写因子がｎａｎｏｇプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにする工程であり、前記複合体は転写活性化を介してｎａｎｏｇ遺伝子発現を調節することを特徴とする工程と
を含む方法。
【請求項２１】
前記ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子のホメオドメインは、ＰＯＵ−ホメオドメインであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞は、幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞は、胚幹細胞であることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞は、がん細胞であることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
がんは、奇形腫であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞は、ｎａｎｏｇプロモータを含み少なくとも２つの転写因子を発現する組換え細胞であり、少なくとも２つの転写因子の一方はＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子またはその機能的断片から選択され、少なくとも２つの転写因子の他方はＨＭＧドメイン含有転写因子またはその機能的断片から選択されることを特徴とする請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
発現が調節される遺伝子は、レポータ遺伝子、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス遺伝子（いわゆる「細胞死」遺伝子）、または各細胞における所望の発現を有する任意の他の遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写因子を、前記少なくとも２つの転写因子とｎａｎｏｇプロモータの前記要素との複合体形成を調節する化合物と接触させる工程をさらに含む請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの前記要素との複合体形成が、核酸分子によって低減されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸分子はアプタマー、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉ−ＲＮＡ）分子、または反復関連短鎖干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）分子であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
核酸分子は、配列番号３１の配列から転写されたｓｉ−ＲＮＡ分子、または配列番号３２の配列から転写されたｓｉ−ＲＮＡ分子のうち少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
方法は、前記複合体形成を調節する適切な化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であることを特徴とする請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも２つの転写因子またはその機能的断片と、ｎａｎｏｇプロモータの前記要素との間の複合体形成の阻害により細胞を除去するかまたは分化させるのに有用である潜在的化合物を、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでスクリーニングするための請求項３３に記載の方法であり、自動化作業ステーションを用いたマルチウェルマイクロプレート上での化合物ライブラリの同時スクリーニングを含む方法。
【請求項３５】
前記細胞は哺乳類に含まれており、方法はｉｎ−ｖｉｖｏ方法であることを特徴とする請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳類は、ラット、マウス、ディンゴ、ウシ、ヤギ、ブタ、チンパンジー、マカウおよびヒトからなる群より選択されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの転写因子と、ｎａｎｏｇプロモータの結合領域との間の前記複合体の形成を調節する化合物を投与することを含む、請求項３５または３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
奇形腫の治療のための方法であるか、または奇形腫の治療の一部である請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
複合体形成を検出することをさらに含む請求項２０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｃ）細胞内でのｎａｎｏｇ遺伝子の発現を測定する工程をさらに含む請求項２０〜３
９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
（ｄ）工程（ｃ）において得られる測定結果を、対照測定の結果と比較することをさらに含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
検出は、適切な分光学的、光化学的、光分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的または熱力学的方法によって行うか、または細胞効果に基づいて行うことを特徴とする請求項３または３９に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも２つの転写因子が相乗的に作用して、ｎａｎｏｇ遺伝子の転写を活性化することを特徴とする請求項２０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ＰＯＵドメインおよびホメオドメイン含有転写因子はＯｃｔ４であることを特徴とする請求項２０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５１１３２１（Ｐ２００８−５１１３２１Ａ）
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２９７８７（Ｐ２００７−５２９７８７）
【出願日】平成１７年９月２日（２００５．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００３０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２５８０２
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０６２０５１０３）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (26)
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２日（２００５．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００３０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２５８０２
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０６２０５１０３）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (26)
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
【Ｆターム（参考）】
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