延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質、前記物質の検定用コンストラクト、並びにそれらの用途
【課題】延命・抗老化効果を有する物質や感染防御効果・ワクチン効果を有する物質、およびこれらの物質を効率的に検定するための手段を提供すること。
【解決手段】サーチュイン遺伝子の活性を増強することを特徴とする延命効果物質、ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することを特徴とする感染防御効果・ワクチン効果促進物質、前記のいずれかの物質を含有する食品、医薬品、化粧品または試薬；サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、延命効果物質検定用コンストラクト、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト、およびこれらのコンストラクトを利用する前記各物質の検定方法。
【解決手段】サーチュイン遺伝子の活性を増強することを特徴とする延命効果物質、ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することを特徴とする感染防御効果・ワクチン効果促進物質、前記のいずれかの物質を含有する食品、医薬品、化粧品または試薬；サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、延命効果物質検定用コンストラクト、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト、およびこれらのコンストラクトを利用する前記各物質の検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質、前記物質の検定用コンストラクト、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化・寿命制御に関するこれまでの研究で、酵母、線虫、ショウジョウバエ等においてはカロリー制限が延命・抗老化を実現するための有効な処理であること、更には、熱や有毒化学薬品などのストレスに対する抵抗性も増強すること、そして、それらのカロリー制限による延命の実現には、ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性を有するサーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）であるＳｉｒ２が関与していることが明らかになっている。酵母Ｓｉｒ２の哺乳類ホモログとしてはＳＩＲＴ１〜７が知られており、なかでもＳＩＲＴ１は脂肪動員の増強、神経軸索変性の抑制、β細胞からのインスリン分泌、肝臓での糖新生等の制御に係わり（非特許文献１参照）、その制御を通じて延命を実現しているものと考えられている。
サーチュインを増強あるいは活性化する因子としては、赤ワイン中のポリフェノールであるレスベラトロールをはじめとした植物性ポリフェノール類が知られているに過ぎない（非特許文献２参照）。従って、サーチュイン遺伝子を増強する物質や、該物質を探索するための手段が望まれていた。
【０００３】
一方、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ＣＳＲ）に必須の遺伝子であるＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子は、老化に伴いその発現が低下し、同時に抗体レパトアも減少することが報告されている（非特許文献３および４参照）。すなわち、ＡＩＤの減少により高齢者は感染症にかかりやすくなる可能性が示唆され、感染防御におけるＡＩＤ発現が重要なファクターである可能性がある。また、感染防御において最も重要な免疫器官の１つである腸管においてＩｇＡ濃度が上昇すると病原菌などを体外に排除する力が強くなるが、ＩｇＡへの産生にはＡＩＤ活性化による抗体のクラススイッチが必須である。
【０００４】
ＡＩＤはこのように種々の免疫系疾患治療の為のターゲット因子になりうるものと認識されながら、その制御機構、さらにはその発現・活性を制御するような食品成分に関しては報告されていない。また、タンパク質−核酸複合体がＢ細胞レセプター（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＣＲ）とＴｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）の両方に結合すると、ＢＣＲのみに結合するときよりもＢ細胞の活性化や抗体産生が促進されることが知られている（非特許文献５および６参照）。しかし、特に非タンパク質性抗原に対しては親和性と持続性に優れた中和抗体を誘導することは難しく、そのため有効なワクチンが未開発な例も多かった。そこで、抗体産生応答だけでなくＢ細胞の親和性成熟過程をも活性化することのできる物質、および該物質を探索するための手段が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２０：２９１３−２９２１（２００６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，４２５：１９１−１９６（２００３）
【非特許文献３】Ｅｘｐ. Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，３７：４２７−４３９（２００２）
【非特許文献４】Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：３７８−３８４（２００５）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ，４１６：６０３−６０７（２００２）
【非特許文献６】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：１１７１−１１７７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、延命・抗老化効果を有する物質や感染防御効果・ワクチン効果を有する物質を選抜することは、機能性食品、医薬品、化粧品の開発につながるものである。しかし、このような因子は従来知られていなかった上に、これらの因子を正確に、短時間で効率よく検定する方法は、従来知られていなかった。
【０００７】
本発明の目的は、延命・抗老化効果を有する物質や感染防御効果・ワクチン効果を有する物質、およびこれらの物質を効率的に検定するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはヒトＳＩＲＴ１（ｈＳＩＲＴ１）のプロモーター領域を取得し、その転写活性化をＧＦＰ蛍光強度で追跡することのできるシステムを構築した。本システムを動物培養細胞に導入し、ｈＳＩＲＴ１プロモーターを活性化しうる乳酸菌群を探索した結果、各種乳酸菌及びビフィズス菌が、ｈＳＩＲＴ１プロモーターを活性化することが明らかとなった。
【０００９】
また、本発明者らはヒトＡＩＤのプロモーター領域を取得し、その転写活性化をＧＦＰ蛍光強度で追跡することのできるシステムを構築した。本システムを動物培養細胞に導入し、ＡＩＤプロモーターを活性化しうる乳酸菌群を探索した結果、各種乳酸菌が、ＡＩＤプロモーターを活性化することが明らかとなった。本システムを用いることで、感染防御能を有する乳酸菌やワクチン生産への応用が可能な乳酸菌の育種も可能になるものと考えられる。
【００１０】
本発明は、以下の各発明を提供するものである。
〔１〕 サーチュイン遺伝子の活性を増強することを特徴とする延命効果物質。
〔２〕 サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、〔１〕記載の延命効果物質。
〔３〕 乳酸菌または乳酸菌由来成分である、〔１〕または〔２〕に記載の延命効果物質。
〔４〕 乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔３〕に記載の延命効果物質。
〔５〕 〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の延命効果物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
〔６〕 サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、延命効果物質検定用コンストラクト。
〔７〕 サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、〔６〕記載のコンストラクト。
〔８〕 〔６〕または〔７〕に記載のコンストラクトを含む細胞。
〔９〕 〔６〕または〔７〕に記載のコンストラクトまたは〔８〕に記載の細胞を含む、延命効果物質の検定用キット。
〔１０〕 〔８〕に記載の細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、延命効果物質の検定方法。
〔１１〕 前記延命効果物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である〔１０〕に記載の検定方法。
〔１２〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔１１〕に記載の検定方法。
〔１３〕 ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することを特徴とする感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１４〕 乳酸菌または乳酸菌由来成分である、〔１３〕に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１５〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔１４〕に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１６〕 〔１３〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
〔１７〕 ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト。
〔１８〕 〔１７〕に記載のコンストラクトを含む細胞。
〔１９〕 〔１７〕に記載のコンストラクトまたは〔１８〕に記載の細胞を含む、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キット。
〔２０〕 〔１８〕に記載の細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法。
〔２１〕 前記感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である〔２０〕に記載の検定方法。
〔２２〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔２１〕に記載の検定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、延命・抗老化という新たな機能性を有する物質が提供されると共に、該物質を検定し、選抜することができるので、延命を実現する新たな機能性食品の開発に繋げることができる。
また、本発明は、ｈＳＩＲＴ１プロモーターの活性化を通じて延命を実現しうる相互作用の解明、つまり乳酸菌菌体の有する糖鎖・ＤＮＡ等のリガンドとサーチュイン遺伝子を発現する動物細胞上のＴｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒとの間の相互作用の解明に応用することができ、延命を実現しうるスーパーアンチエイジング乳酸菌の探索・創製への応用が期待できる。
【００１２】
更に、本系は、乳酸菌の刺激で活性化されていることから、本系で検索される物質は、中でも、乳酸菌由来物質は、Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒを刺激しうる物質であり、Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒによる抗原提示細胞の活性化を通じた、抗癌作用に働く免疫系の増強が期待されることより、間接的ではあるが、免疫の抗癌作用を高める物質としても期待しうる物質である。
【００１３】
更に、本発明により、感染防御効果やワクチン効果を促進する物質といった機能性物質が提供されると共に、該物質を検定し、選抜することができるので、感染防御を実現する新規機能性食品の開発や、新規ワクチンの開発に繋げることができる。
また、本発明によれば、ＡＩＤプロモーターの活性化を通じてＡＩＤ活性化メカニズムの解明も可能であり、抗体産生応答の異常とそれに伴う疾病の改善を目的とした創薬の検索への応用も期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質
本発明は、延命効果物質と、感染防御効果・ワクチン効果促進物質との両者を提供するものである。以下、両発明のそれぞれに特徴的な部分について先に説明し、続いて共通する部分について説明する。
【００１５】
（延命効果物質）
本発明の延命効果物質は、延命効果、すなわち抗癌作用をはじめとして生物の寿命を延長する効果を発揮する物質であり、サーチュイン遺伝子の活性を増強（活性化）することを特徴とする。サーチュインとは、酵母、線虫、ショウジョウバエの延命に寄与するとされるＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性を有するＳｉｒ２のホモログを指し、哺乳類ではＳＩＲＴ１〜７を挙げることができる。サーチュイン遺伝子の活性を増強することの確認は、下記の延命効果物質検定用コンストラクトによりそのサーチュイン遺伝子のプロモーター活性を分析して行うことができる。
【００１６】
（感染防御効果・ワクチン効果促進物質）
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、感染防御効果およびワクチン効果のうちいずれかの効果、または両方の効果を発揮する物質であり、ＡＩＤ遺伝子の活性を増強（活性化）することを特徴とする。ＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子とは、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ＣＳＲ）に必須の遺伝子である。ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することの確認は、下記の感染防御効果・ワクチン効果促進物質検定用コンストラクトによりそのＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を分析して行うことができる。
【００１７】
本発明の延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質としては、乳酸菌や他の菌類・酵母類、他の動植物由来の成分である蛋白質、糖類、核酸、脂質、ポリフェノール、食物繊維、ミネラル、ビタミン等を挙げることができ、特に菌類やその成分が好ましい。菌類としては、乳酸菌を挙げることができる。
【００１８】
乳酸菌は、腸内細菌にも分類されるものが好ましく、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィドバクテリウム属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、スタフィロコッカス属乳酸菌などを挙げることができる。
【００１９】
ラクトバチルス属乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラクティスなどがある。
ビフィドバクテリウム属乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムなどがある。
ラクトコッカス属乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクティスなどがある。
スタフィロコッカス属乳酸菌としては、スタフィロコッカス・サーモフィルスなどがある。
【００２０】
これらの乳酸菌のうち、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）,ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）,ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、特にラクトバチルス・アシドフィルスは、サーチュイン遺伝子の活性を増強することが確認されている。
【００２１】
また、これらの実施例のうち、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ），ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、特にラクトバチルス・アシドフィルスは、ＡＩＤ遺伝子を活性化するものであり、感染防御効果・ワクチン効果促進物質として有用である。
【００２２】
本発明の延命効果物質は、各種の食品、化粧品、医薬品等の成分として利用することができ、特に、延命を実現しうる新たな機能性食品として有用である。
また、本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質も、各種の食品、化粧品、医薬品等の成分として利用することができ、特に、感染防御を実現する新規機能性食品や新規ワクチンの開発に繋げることができる。
【００２３】
２．延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定
本発明においては、延命効果物質の検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトの２つを提供する。以下、両発明のそれぞれに特徴的な部分について先に説明し、続いて共通する部分について説明する。
【００２４】
（延命効果物質検定用コンストラクト）
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトは、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備える。サーチュイン遺伝子については既に延命効果物質の欄において述べたとおりである。
【００２５】
ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するとは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性の９０％以上、好ましくは９５％以上の活性を有することを意味し、好ましくは実質的に同等以上の活性を有することを意味する。ｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性の確認は、ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現が増強または活性化されるかどうかの確認により行うことができる。
【００２６】
ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列表の配列番号１記載の塩基配列は、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製されるｈＳＩＲＴ１遺伝子の上流−１５９３〜−１塩基部分（＋１がｈＳＩＲＴ１遺伝子の翻訳開始点とする。）の領域である。
【００２７】
また、ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであれば、配列表の配列番号１記載の塩基配列に改変を加えた塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号１に記載の塩基配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２８】
本発明において、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ等により得ることができる。例えば、ｈＳＩＲＴ１遺伝子の場合、配列番号１に記載の塩基配列を増幅するプライマーセットを用いて、ヒト由来の鋳型ゲノムＤＮＡをＰＣＲ等により増幅することにより、配列表の配列番号１記載の塩基配列を得ることができる。一方、配列番号１に記載の塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても、配列表の配列番号１記載の塩基配列を得ることができる。
【００２９】
（感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト）
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトは、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備える。ＡＩＤ遺伝子については既に延命効果物質の欄において述べたとおりである。
【００３０】
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するとは、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の９０％以上の活性を有することを意味し、好ましくは実質的に同等以上の活性を有することを意味する。ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の確認は、ＡＩＤ遺伝子の発現が増強または活性化されるかどうかの確認により行うことができる。
【００３１】
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号２記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列表の配列番号２記載の塩基配列は、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１から得られるヒトＡＩＤ遺伝子の上流−５２０〜−１塩基部分（＋１がＡＩＤ遺伝子の翻訳開始点とする。）の領域である。
【００３２】
また、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであれば、配列表の配列番号２記載の塩基配列に改変を加えた塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号２に記載の塩基配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３３】
本発明において、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ等により得ることができる。例えば、配列番号２に記載の塩基配列を増幅するプライマーセットを用いて、ヒト由来の鋳型ゲノムＤＮＡをＰＣＲ等により増幅することにより、配列表の配列番号２記載の塩基配列を得ることができる。一方、配列番号２に記載の塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても、配列表の配列番号２記載の塩基配列を得ることができる。
【００３４】
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトとは、更にリポーター活性を有するポリヌクレオチドなどを含むものであってもよい。リポーター活性を有するポリヌクレオチドを含むことにより、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性やＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の確認を容易に行うことができる。
【００３５】
リポーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる公知のリポータータンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。リポータータンパク質としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）をはじめとする各種蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等を挙げることができる。このうち、本発明においてはＧＦＰが好ましい。
【００３６】
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトの調製は、例えば、ｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを、レポーター活性を有するポリヌクレオチドを含むベクターのレポーターの発現を制御するプロモーターと置換することで行うことができる。このようなベクターとしては、リポータータンパク質がＧＦＰの場合には、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）を挙げることができる。
【００３７】
（各コンストラクトを含む細胞）
上記本発明の延命効果物質検定用コンストラクトか、或いは感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトは、細胞に導入して各物質の検索システムとして機能させることができる。
【００３８】
各コンストラクトの導入先となる宿主細胞としては、ヒトをはじめとする各種生物の細胞を挙げることができ、動物細胞が好ましい。また、細胞の種類には特に限定はない。代表的なものとしては、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン由来細胞株Ａ５４９、ヒト大腸ガン由来細胞株ＣａＣｏ−２、ヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−１、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、ヒトＢ骨髄腫細胞株Ｕ−２６６、エプスタインバールウイルスにより不死化したヒトＢ細胞株(ＥＢＶ−Ｂ)を挙げることができる。
【００３９】
宿主細胞に上記本発明のコンストラクトを取り込ませる方法は、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法などによることができ、市販のトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）など）やＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）等を利用してもよい。
【００４０】
本発明の細胞は、宿主細胞の種類に応じて培地を選択して（例えば、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＣａＣｏ−２及びＴＩＧ−１の場合にはＭＥＭ培地、ＢＡＬＬ−１及びＵ−２６６の場合にはＲＰＭＩ６４０培地、ＥＢＶ−Ｂの場合にはＥＲＤＦ培地など）、常法により培養することができる。
【００４１】
（本発明の検定用キット）
上述の本発明のコンストラクトおよび細胞は、それぞれ、有用物質の検定用キットとして利用することができる。
すなわち、本発明の第１のキットは、延命効果物質の検定用キットであって、上述の延命効果物質検定用コンストラクトまたは該コンストラクトを含む細胞を含むものである。本発明の第２のキットは、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キットであって、上述の感染防御効果・ワクチン効果促進物質検定用コンストラクトまたは該コンストラクトを含む細胞を含むものである。
各コンストラクト、細胞については、既に述べたとおりである。
【００４２】
本発明のキットにおいて、それぞれのコンストラクトを含む場合は、コンストラクトの導入先である宿主細胞や、細胞を導入するための培地、細胞へコンストラクトを取り込ませるための試薬、検体と細胞とを接触させるための培地等を一緒に含めることができる。宿主細胞や培地については既に述べたとおりであり、試薬についても既に述べた細胞の取り込み方法のいずれかの方法において用いる試薬を適宜選択することができる。検体と細胞とを接触させるための培地については、後述する本発明の検出方法の欄において説明するとおりである。
一方、本発明のキットにおいて細胞を含む場合には、検体と細胞とを接触させるための培地を含めることができる。
【００４３】
（本発明の検定方法）
上述の本発明の細胞は、それぞれ、有用物質の検定に用いることができる。
すなわち、本発明の第一の検定方法は、延命効果物質の検定方法であって、延命効果物質検定用コンストラクトを含有する細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする。
本発明の第二の検定方法は、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法であって、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトを含む細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする。
【００４４】
本発明の２つの検定方法は、細胞と試料とを接触させ、プロモーター活性を測定する点においては共通である。
試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、食品成分・生薬成分・医薬品成分・化粧品成分等の天然及び化学合成成分等であれば良く、より具体的には、乳酸菌や他の菌類・酵母類、他の動植物由来の成分である蛋白質、糖類、核酸、脂質、ポリフェノール、食物繊維、ミネラル、ビタミン等を挙げることができ、特に菌類やその成分が好ましい。菌類としては、乳酸菌を挙げることができる。乳酸菌は、腸内細菌にも分類されるものが好ましく、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィドバクテリウム属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、スタフィロコッカス属乳酸菌などを挙げることができる。各属の乳酸菌の具体例については、上述の延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質の説明の欄で列挙したとおりである。
【００４５】
試料としての菌類の形態は、生菌体、死菌体、培養上清などが挙げられ、中でも死菌体が好ましい。死菌体は、生菌体を加熱（例えば、６０〜１２０℃で２０分〜１時間程度）、凍結乾燥、アルコール処理等、更には食品用途以外であればホルマリン処理することにより調製され得る。
【００４６】
本発明の分析方法においては、まず試料と細胞とを接触させる。試料と細胞との接触は、細胞に対し試料を添加して一定時間静置することにより行うことができる。試料が上記乳酸菌の場合の例を示すと、乳酸菌の加熱死菌体を細胞に対し終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、１２時間〜３日間程度処理を行う。
【００４７】
本発明の各検定方法においては、続いてプロモーター活性を測定する。プロモーター活性の測定は、細胞にリポーター活性を有するポリヌクレオチドが含まれている場合には、その発現強度の変化を追跡することにより行うことができる。追跡は、蛍光強度の観察によることができる。蛍光強度は、フローサイトメーターにより測定することができる。
【００４８】
本発明の第一の検定方法、すなわち、延命効果物質の検定方法により、試料の延命効果を検定することができる。すなわち、試料が延命効果を有するか否かの確認、延命効果の程度の確認などを行うことができるほか、複数ある試料の中から、延命効果を有する物質を選抜することができる。
【００４９】
例えば、延命効果物質としての各種乳酸菌または乳酸菌由来成分の探索に用いることができる。具体的には、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）,ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）,ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を延命効果物質として選抜することができ、特にラクトバチルス・アシドフィルスを優れた延命効果物質として選抜することができる。
【００５０】
本発明の延命効果物質の検定方法によれば、乳酸菌が直接接触をする可能性のある腸管系の細胞株を宿主細胞として用いることで、腸管細胞でのＳＩＲＴ１発現増強と延命実現に対するＳＩＲＴ１の新たな関連が明らかになるとともに、乳酸菌による腸管細胞の機能修飾を通じた延命実現の可能性についても解析を行うことが可能である。
【００５１】
本発明の第二の検定方法、すなわち、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法により、試料の感染防御効果・ワクチン効果（いずれかの効果、または両方の効果）を検定することができる。すなわち、試料が感染防御効果・ワクチン効果を有するか否かの確認、感染防御効果・ワクチン効果の程度の確認などを行うことができるほか、複数ある試料の中から、感染防御効果・ワクチン効果を有する物質を選抜することができる。
【００５２】
例えば、感染防御効果・ワクチン効果促進物質としての各種乳酸菌または乳酸菌由来成分の探索に用いることができる。具体的には、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ），ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を感染防御効果・ワクチン効果促進物質として選抜することができ、特にラクトバチルス・アシドフィルスを優れた感染防御効果・ワクチン効果促進物質として選抜することができる。
【００５３】
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法によれば、試料の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を検定することができる。すなわち、抗体産生応答だけでなくＢ細胞のＣＳＲ過程の活性化及びＢ細胞の親和性成熟過程の活性化が可能であり、非タンパク質性抗原に対しては親和性と持続性に優れた中和抗体を誘導することができる物質、特に乳酸菌を選抜することが可能であり、ワクチンへの応用が可能である。
【実施例】
【００５４】
実施例１〔ｈＳＩＲＴ１プロモーター転写活性化乳酸菌の同定〕
（１）ｈＳＩＲＴ１プロモーター（ｈＳＩＲＴ１ｐ）の取得
ｈＳＩＲＴ１ｐとして、ＡＴＧ翻訳開始点より−１５９３ｂｐ〜−１ｂｐ（＋１は翻訳開始点を示すものとする。）を、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応には、宝酒造のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用い、指定のプロトコールに従って反応を進めた。ＰＣＲの反応液組成は、以下に示すとおりである。ＰＣＲ反応条件は９４℃にて２分間変性を行ったあと、９８℃；２０秒、６８℃；１分を３５サイクルとした。なお、非特異的反応を抑えるために、全ての操作は氷上にて速やかに行った。
【００５５】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌水 ２５．９μｌ
１０ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（５'） １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（３'） １μｌ
ＴＩＧ−１ゲノムＤＮＡ ３．６μｌ
ＬＡ−Ｔａｑ １μｌ
合 計 ５０μｌ
【００５６】
ＰＣＲに使用したプライマーｈＳＩＲＴｐ−ＡｓｅＩ（Ｆ）およびｈＳＩＲＴｐ−ＮｈｅＩ（Ｒ）のそれぞれの配列は、配列表の配列番号３および４、並びに表１に示した。尚、表１に示す配列中、大文字はｈＳＩＲＴ１プロモーター内の配列を示し、小文字はＰＣＲにより付加するそれぞれの制限酵素認識配列を示し、表２以降に示すプライマー配列においても同じである。ＧＦＰ発現ベクターの構築にはｈＳＩＲＴｐ−ＡｓｅＩ（Ｆ）およびｈＳＩＲＴｐ−ＮｈｅＩ（Ｒ）をそれぞれ用いた。また、すべてのオリゴ合成はニッポンＥＧＴ社（Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）に依頼した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
それぞれ反応終了後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、目的のバンドを切り出した後、ゲル抽出を行った。ゲル抽出はプロメガ社のＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、製品のプロトコールに従って行った。
次に、これらのＰＣＲ産物をＴＡクローニング用のベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローニングした（ｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐ）。
【００５９】
（２）点変異の導入
得られたヒトＳＩＲＴ１プロモーター（ｈＳＩＲＴ１ｐ）全長のシークエンスを確認した。その結果３カ所に点変異が確認されたため、部位特異的変異導入法により点変異の修正を行った。
すなわち、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、製品付属のプロトコールに従いＰＣＲ法にて修正を行った。ＰＣＲの反応条件は９５℃；３０秒のあと、９５℃；３０秒、５５℃；１分を１２サイクルとした。修正に使用したプライマーｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１４３６、ｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１４０１、ｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１６０のそれぞれの配列は、配列表の配列番号５、６および７、並びに表２に示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
このＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間処理し、鋳型ＤＮＡの消化を行った。上記サンプル１μｌにつきＳｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ＸＬ−１−ｂｌｕｅを１００μｌ加えて、氷上にて３０分静置し、４２℃で４５秒間熱処理を行った後、さらに氷上にて２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地を４００μｌ加え、２００〜２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、遠心して得られた菌体ペレットをＬＢ（Ａｍｐ+）プレートに播種し、３７℃にて一晩培養した。翌日、適当なコロニーをピックアップし、それぞれシークエンスを確認した。
【００６２】
（３）ｐＥＧＦＰ−Ｃ３への組換え
上記により点変異を修正したｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐから、ＡｓｅＩ／ＮｈｅＩ消化にてプロモーター断片を切り出し、ＡｓｅＩ／ＮｈｅＩ消化によりＣＭＶプロモーターを除去したｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）に挿入し、ＧＦＰ発現コンストラクトを構築した（ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ）。ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのベクターマップを、図１に示した。
【００６３】
（４）ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞の樹立
ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の作製には、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン由来細胞株Ａ５４９、ヒト大腸ガン由来細胞株ＣａＣｏ−２を用いた。
また、生体の正常組織におけるＳＩＲＴ１制御に対する乳酸菌の効果を検証可能とするために、ヒト正常線維芽細胞（ＴＩＧ−１）を用いた。
各細胞の培養には、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＣａＣｏ−２及びＴＩＧ−１の場合にはＭＥＭ培地を用いた。
【００６４】
（５）遺伝子導入
上記ｈＳＩＲＴ１ｐ駆動のＧＦＰリポーターベクター（ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ）を、ヒト子宮頸ガン細胞株（ＨｅＬａ）、ヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）及びヒト大腸がん細胞株（Ｃａｃｏ−２）にリポフェクション法により導入した。
すなわち、上記接着系動物細胞へのｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ導入に当たっては、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた。トランスフェクションの前日に細胞を１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ ｄｉｓｈの細胞密度で準備した。翌日、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ遺伝子を１０μｇ分(液量８５μｌ)とＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬１５μｌをＯｐｉｔ−ＭＥＭ培地１．４ｍｌで希釈し、室温にて１５分間インキュベートした。この間に、細胞の培養培地を、血清を含まない新鮮なＥＲＤＦ培地（５ｍｌ／１０ｍｌ ｄｉｓｈ）と交換し、混合液を添加した。その後、遺伝子導入から３時間後に血清を含む新鮮な通常培地に培地交換を行い、また同時にＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）による遺伝子導入細胞の薬剤選択を開始した。
このようにして、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ，Ａ５４９及びＣａｃｏ−２細胞株を樹立した。
【００６５】
一方、ＴＩＧ−１細胞に対して、他の細胞と同様ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを導入することを試みたが、従来のリポフェクション法では遺伝子導入効率が低く、安定株を作ることは困難であった。そこで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍａｘａ社）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）を用いたエレクトロポレーション法による遺伝子導入を試みた。ところがＴＩＧ−１用として特化された遺伝子導入条件及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎはなかったので、様々な条件でエレクトロポレーションを行い、ＴＩＧ−１細胞に対する遺伝子導入の最適条件を決定し、実際にはＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を用い、Ｕ−２３プログラムを用いて遺伝子導入を行った。詳細はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットに付属のプロトコールに従い行った。
【００６６】
（６）乳酸菌
乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ１，３，４），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）（Ｌ５．６），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（Ｌ７），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（Ｌ８），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（Ｌ１０），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）（Ｌ２２），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｌ３４），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）（Ｂ１，２），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）（Ｂ５），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）（Ｂ８），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）（Ｂ１１），ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＳＫ３０３），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（Ｌ２５）を用いた。
【００６７】
（７）乳酸菌処理
１００℃で３０分間処理後凍結乾燥した乳酸菌の凍結乾燥加熱死菌体をサンプルとして用いた。凍結乾燥死菌体は、上記遺伝子導入動物細胞に終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２日間培養を行った。
ポジティブコントロールは、カロリー制限をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系で模倣し、ＳＩＲＴ１発現増強効果があるとされている血清及び糖抜き培地での１６時間培養処理（ＣＲ処理）とした。
【００６８】
（８）フローサイトメーター解析
フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いてＧＦＰの発現強度の変化を追跡した。この蛍光強度の変化がｈＳＩＲＴ１プロモーター活性の変化として捉えることができる。蛍光強度をヒストグラムとして展開し、未処理区においてピークの頻度値を示す蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞数の割合を数値化し、グラフに示した。ＨｅＬａ、Ａ５４９及びＣａｃｏ−２の各細胞株における結果を、それぞれ図２、図３、図４に示した。また、ＴＩＧ−１細胞における結果を、図５に示した。
【００６９】
図２〜４から明らかなように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１，３，４）は、全ての細胞株で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ５．６）はＡ５４９及びＣａｃｏ−２細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）は全ての細胞株で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ（Ｌ８）はＡ５４９及びＣａｃｏ−２細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１０）はＨｅＬａ及びＡ５４９細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｌ２２）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂ１，２）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ（Ｂ５）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１１）はＡ５４９細胞で、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（ＳＫ３０３）はＡ５４９細胞でそれぞれ再現性良く強い活性が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４）はＨｅＬａ及びＡ５４９で再現性良く弱めの活性が観察された。
【００７０】
また図５から明らかなように、ＴＩＧ−１細胞では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ６）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）で高い活性が観察された。
【００７１】
（９）ルシフェラーゼアッセイ
先に構築したｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐよりＮｏｔＩ消化によりｈＳＩＲＴ１ｐを切り出し、ＮｏｔＩ消化したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入した。さらにＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ消化によりｈＳＩＲＴ１ｐを切り出し、ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入し、ルシフェラーゼ活性を指標としてｈＳＩＲＴ１ｐ活性を測定するレポーターベクターを作製した（ｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１ｐ）。ＨｅＬａ，Ａ５４９，Ｃａｃｏ−２，ＴＩＧ−１細胞に対しｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１ｐ及び遺伝子導入効率を推定するためのコントロールプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）をＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ試薬により導入し、３時間後に培地交換を行った。
【００７２】
通常はここからｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのときと同様４８時間に渡り１０μｇ／ｍｌの濃度で乳酸菌の加熱死菌体を添加・培養し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙキットのプロトコールに則って、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性の測定を行う。ところがこの条件では、サンプル間のデータのばらつきが大きかった。そこで細胞毎に、乳酸菌加熱死菌体処理及び培養時間の至適化を行った。その結果、ＨｅＬａでは遺伝子導入後３時間後に培地交換、さらに２１時間後に培地交換とともに乳酸菌添加（１０μｇ／ｍｌ）し、２４時間後にプロモーターアッセイを行うことにより、再現性良く、サンプル間のデータのばらつきの少ないデータを得ることができた。また、Ａ５４９では遺伝子導入後３時間後に培地交換とともに乳酸菌を添加して、さらに３日間培養後プロモーターアッセイを行うことにより、再現性良く、サンプル間のデータのばらつきの少ないデータを得ることができた。この為、以後、この条件で乳酸菌加熱死菌体のｈＳＩＲＴ１ｐ活性に与える影響を検証した。ＨｅＬａおよびＡ５４９の各細胞株における結果を、それぞれ図６および図７に示す。
【００７３】
その結果、図６からわかるように、ＨｅＬａ細胞では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）以外の乳酸菌で高いＳＩＲＴ１ｐの転写活性化を観察することができた。また、図７からわかるように、Ａ５４９細胞では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ４）以外の乳酸菌で高いＳＩＲＴ１ｐの転写活性化を観察することができた。
【００７４】
（１０）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる遺伝子発現の解析
ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰ及びｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１を用いた解析から再現性良く、ｈＳＩＲＴ１ｐを活性化しうる乳酸菌を選抜し、それら乳酸菌存在下で培養したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＴＩＧ−１，Ｃａｃｏ−２における内在性ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現量の変化をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により追跡した。この際、各細胞における乳酸菌の処理条件は、前記実験と同様に至適化を行ってから決定するものとした。内在性ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現を測定するためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ用のプライマーは、以下のものを用いた。
ＨＡ０４４２６３−Ｆ：ＧＣＣＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＴＧＡＣ（配列番号１０）
ＨＡ０４４２６３−Ｒ：ＴＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＡ（配列番号１１）
【００７５】
また内部コントロールとしてはヒトβアクチンあるいはヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。その際のプライマーは、以下のものを用いた。
【００７６】
βアクチンの場合：
ＨＡ０６７８０３−Ｆ：ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡ（配列番号１２）
ＨＡ０６７８０３−Ｒ：ＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ（配列番号１３）
【００７７】
ＧＡＰＤＨの場合：
ＨＡ０３１５７８−Ｆ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ（配列番号１４）
ＨＡ０３１５７８−Ｒ：ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴ（配列番号１５）
【００７８】
ｃＤＮＡ合成は、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅ Ｈ Ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い常法に基づき行った。ＰＣＲ反応はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。
【００７９】
実施例２〔ヒトＡＩＤプロモーター転写活性化乳酸菌の同定〕
（１）ヒトＡＩＤプロモーター（ｈＡＩＤｐ）の取得
ｈＡＩＤプロモーターとして、ＡＴＧ翻訳開始点より−５２０ｂｐ〜−１ｂｐ（＋１は翻訳開始点を示すものとする。）を、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ法により取得した。ＰＣＲ反応には、宝酒造のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用い、指定のプロトコールに従って反応を進めた。ＰＣＲの反応液組成は、以下に示すとおりである。ＰＣＲ反応条件は９４℃にて２分間変性を行ったあと、９８℃；２０秒、６８℃；１分を３５サイクルとした。なお、非特異的反応を抑えるために、全ての操作は氷上にて速やかに行った。
【００８０】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌水 ２５．９μｌ
１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（５'） １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（３'） １μｌ
ＴＩＧ−１ ゲノムＤＮＡ ３．６μｌ
ＬＡ−Ｔａｑ １μl
合 計 ５０μｌ
【００８１】
ＰＣＲに使用したプライマーの配列は表３に示した。ＧＦＰ発現ベクターの構築にはｈＡＩＤｐ−ＮｄｅＩ（Ｆ）およびｈＡＩＤｐ−ＸｂａＩ（Ｒ）をそれぞれ用いた。また、すべての合成はニッポンＥＧＴ社（Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）に依頼した。
【００８２】
【表３】
【００８３】
それぞれ反応終了後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、目的のバンドを切り出した後、ゲル抽出を行った。ゲル抽出はプロメガ社のＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、製品のプロトコールに従って行った。
次に、このＰＣＲ産物はＴＡクローニング用のベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローニングした（ｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐ）。
【００８４】
（２）ｐＥＧＦＰ−Ｃ３への組換え
シークエンスを確認したあとのｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐから、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ消化にてプロモーター断片を切り出し、ＡｓｅＩ及びＮｈｅＩ消化によりＣＭＶプロモーターを除去したｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）に挿入し、ＧＦＰ発現コンストラクトを構築した（ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ）。ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰのベクターマップを、図８に示した。
【００８５】
（３）ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の樹立及び遺伝子導入
ｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の作製には、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、ヒトＢ骨髄腫細胞株Ｕ−２６６、エプスタインバールウイルスにより不死化したヒトＢ細胞株(ＥＢＶ−Ｂ)を用いた。
各細胞の培養には、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＢＡＬＬ−１及びＵ−２６６の場合にはＲＰＭＩ６４０培地、ＥＢＶ−Ｂの場合にはＥＲＤＦ培地を用いた。
【００８６】
上記ｈＡＩＤｐ駆動のＧＦＰリポーターベクター（ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ）を、リポフェクション法により、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてヒト子宮頸ガン細胞株（ＨｅＬａ）及びヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）に導入した。
【００８７】
トランスフェクションの前日に細胞を１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ ｄｉｓｈの細胞密度で準備しておいた。翌日、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ遺伝子を１０μｇ分(液量８５μｌ)とＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬１５μｌをＯｐｉｔ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地１．４ｍｌで希釈し、室温にて１５分間インキュベートした。この間に、細胞の培養培地を、血清を含まない新鮮なＥＲＤＦ培地（５ｍｌ／１０ｍｌ ｄｉｓｈ)と交換し、混合液を添加した。遺伝子導入から３時間後に血清を含む新鮮な通常培地に培地交換を行い、また同時にＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）によるセレクションを開始した。
このようにして、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ及びＡ５４９細胞株を樹立した。
【００８８】
一方、ＢＡＬＬ−１，Ｕ−２６６，ＥＢＶ−Ｂはいずれも浮遊細胞で、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ遺伝子導入が困難な細胞であった。そのため様々な遺伝子導入方法及び条件を検討し、接着系細胞で高い遺伝子導入効率が観察されていたＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ社）を試したが、満足できるものではなかった。そこでさらにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍａｘａ社）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）を用いたエレクトロポレーション法による遺伝子導入を試みた。その際、至適試薬及びプログラムは、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ社）を用い決定した。ＢＡＬＬ−１，Ｕ−２６６，ＥＢＶ−ＢともにＶ ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を用い、Ｔ−１６プログラムにより遺伝子導入を行った。詳細はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットに付属のプロトコールに従い行った。
【００８９】
（４）乳酸菌
乳酸菌としては、以下の菌株を用いた。
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（Ｌ２５）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ１〜４），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）（Ｌ５，６），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（Ｌ７，８），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（Ｌ９〜１２，１５，３３），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（Ｌ１６，１７），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（Ｌ２８），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｌ３４），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ２６），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）（Ｂ２），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）（Ｂ８），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）（Ｂ１２），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）（Ｂ１３）を用いた。
【００９０】
（５）乳酸菌処理
１００℃で３０分処理後凍結乾燥した乳酸菌の凍結乾燥加熱死菌体をサンプルとして用いた。凍結乾燥加熱死菌体は、上記ｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現細胞株に終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２日間処理を行った。
【００９１】
（６）フローサイトメーター解析
フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いてＧＦＰの発光強度の変化を追跡した。この蛍光強度の変化がｈＡＩＤプロモーター活性の変化として捉えることができる。無処理のものをコントロール（ｃｔｒｌ）とした。蛍光強度をヒストグラムとして展開し、未処理区においてピークの頻度値を示す蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞数の割合を数値化し、グラフに示した。ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＢＡＬＬ、Ｕ２６６の各細胞株の結果を、それぞれ図９、図１０、図１１、図１２にそれぞれ示した。
【００９２】
その結果、図９から明らかなように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１〜４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ５，６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂ２）で強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１１，１２，１５，３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌ１６，１７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｌ２８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１３）は中程度のＡＩＤｐ転写活性化能が、それ以外の菌には弱いＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９３】
図１０の結果から、Ａ５４９細胞においては、いずれの乳酸菌においても強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９４】
図１１の結果から、ＢＡＬＬ−１細胞においては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ３３），Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４），Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６），Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８），Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１３）以外の乳酸菌に強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９５】
図１２の結果から、Ｕ−２６６細胞においては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６）で弱いｈＡＩＤｐ転写活性化能が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（Ｌ２５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１〜４）で中程度のｈＡＩＤｐ転写活性化能が、それ以外の乳酸菌で強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９６】
（７）ルシフェラーゼアッセイ
先に構築したｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐよりＥｃｏＲＩ処理によりｈＡＩＤｐを切り出し、ＥｃｏＲＩ処理をしたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入した。さらにＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりｈＡＩＤｐを切り出し、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃに挿入し、ルシフェラーゼ活性を指標としてｈＡＩＤｐ活性を測定するレポーターベクターを作製した（ｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐ）。ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂ各細胞に対しｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐ及び遺伝子導入効率を推定するためのコントロールプラスミド（ｐＲＫ−ＴＫ）をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ試薬により導入し、３時間後に培地交換を行った。ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのときと同様４８時間に渡り１０μｇ／ｍｌの濃度で乳酸菌の加熱死菌体を添加・培養し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙキットのプロトコールに則って、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性の測定を行った。
【００９７】
（８）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる遺伝子発現の解析
ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ及びｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐを用いた解析から再現性良く、ｈＡＩＤｐを活性化しうる乳酸菌を選抜し、それら乳酸菌存在下で培養したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂにおける内在性ｈＡＩＤ遺伝子の発現量の変化をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により追跡した。
【００９８】
内在性ｈＡＩＤ遺伝子の発現を測定するためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ用のプライマーは、以下のものを用いた。
ＨＡ０５０７９７−Ｆ：ＣＡＣＣＣＴＡＡＴＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧ（配列番号１６）
ＨＡ０５０７９７−Ｒ：ＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧ（配列番号１７）
【００９９】
また内部コントロールは上記実施例１と同様ヒトβアクチンあるいはヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応も上記と同様に行った。
【０１００】
実施例３（遺伝子発現を誘導するＴＬＲの同定）
微生物を認識するレセプターとして機能しうる各種ＴＬＲの発現を、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰおよびｐｈＡＩＤ−ＧＦＰのそれぞれを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＴＩＧ−１，Ｃａｃｏ−２，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂにおいて検証した。
【０１０１】
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ法用のプライマーとしては、以下の組み合わせを用い、方法は上記実施例１および実施例２の方法にならって行った。
【０１０２】
ＴＬＲ１：
ＨＡ０３７８４１−Ｆ：ＣＡＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＴＴＡＴＧＡＡＣ（配列番号１８）
ＨＡ０３７８４１−Ｒ：ＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＴＡＡＧＴＣ（配列番号１９）
【０１０３】
ＴＬＲ２：
ＨＡ０３７８４２−Ｆ：ＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号２０）
ＨＡ０３７８４２−Ｒ：ＡＧＴＡＧＧＣＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＴＡＡ（配列番号２１）
【０１０４】
ＴＬＲ３：
ＣＨ０００２５５−Ｆ：ＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号２２）
ＣＨ０００２５５−Ｒ：ＧＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号２３）
【０１０５】
ＴＬＲ４：
ＣＨ０００２５６−Ｆ：ＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡ（配列番号２４）
ＣＨ０００２５６−Ｒ：ＣＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号２５）
【０１０６】
ＴＬＲ５：
ＨＡ０３７８４９−Ｆ：ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡ（配列番号２６）
ＨＡ０３７８４９−Ｒ：ＧＴＴＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴＧ（配列番号２７）
【０１０７】
ＴＬＲ９：
ＨＡ０４８１３８−Ｆ：ＡＧＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡ（配列番号２８）
ＨＡ０４８１３８−Ｒ：ＧＣＧＴＴＧＧＣＧＣＴＡＡＧＧＴＴＧＡ（配列番号２９）
【０１０８】
各種ＴＬＲリガンド（Ｈｕｍａｎ ＴＬＲ１−９ Ａｇｏｎｉｓｔ Ｋｉｔ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を購入し、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，Ｃａｃｏ−２，ＴＩＧ−１細胞及びｐｈＡＩＤ−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６と共培養することで、それぞれの細胞内でのＧＦＰ強度が増強するＴＬＲを同定した。ＧＦＰ発現強度は、フローサイトメーターにより追跡した。
【０１０９】
ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞における結果を図１３−１〜図１３−１２に示す。また、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞における結果を図１４−１〜図１４−１２に示す。図１３−１及び図１４−１３のｃｏｎは、ネガティブコントロールを示す。図１３−１１および図１４−１１のＬ１、図１４−１２のＬ５、および図１３−１２のＬ７は、ポジティブコントロールを示す。点線が反応時のデータを示し、このデータが動いているものが反応を示したＴＬＲとなる、具体的には、ＨｅＬａでは、ＴＬＲ１（図１３−２）、ＴＬＲ２（図１３−３）、ＴＬＲ３（図１３−４）、ＴＬＲ９（図１３−１０）が反応を示し、Ａ５４９では、ほぼ全てのＴＬＲに反応性を示していた（図１４−２〜図１４−１０）。これらのことより、乳酸菌のＳＩＲＴ１への反応の少なくとも一部は、ＴＬＲを介して生じていることが示された。
【０１１０】
実施例４（ＧＦＰｍｕｔを用いたＳＨＭ増強乳酸菌のスクリーニング）
ＡＩＤ遺伝子は抗体のクラススイッチに加え、体細胞高頻度突然変異（Ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ：ＳＨＭ）誘導能を有していることが知られている。そこでＧＦＰ遺伝子のコード領域内のＡＩＤによるＳＨＭのターゲットとなるような領域に停止コドンを人為的に導入したＧＦＰｍｕｔというコンストラクトを作製した。ＧＦＰｍｕｔはｈＡＩＤ非存在下では無蛍光、ｈＡＩＤ活性に応じて緑色蛍光を発する。このコンストラクトを安定に発現する細胞株を樹立することができれば、ＡＩＤのＳＨＭ活性を増強しうる乳酸菌の探索に応用できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのベクターマップである。
【図２】図２は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＨｅＬａ細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＡ５４９細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＣａｃｏ−２細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＴＩＧ−１細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＨｅＬａ細胞による、各乳酸菌の検定結果（ルシフェラーゼアッセイ）を示すグラフである。
【図７】図７は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＡ５４９細胞による、各乳酸菌の検定結果（ルシフェラーゼアッセイ）を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰのベクターマップである。
【図９】図９は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＨｅＬａ細胞による、各乳酸菌の検定結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＡ５４９細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＢＡＬＬ−１細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＵ−２６６細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図１３−１】図１３−１は、実施例３のＨｅＬａ細胞におけるネガティブコントロールの結果を示す図である。
【図１３−２】図１３−２は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−１発現の結果を示す図である。
【図１３−３】図１３−３は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−２発現の結果を示す図である。
【図１３−４】図１３−４は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−３発現の結果を示す図である。
【図１３−５】図１３−５は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−４発現の結果を示す図である。
【図１３−６】図１３−６は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−５発現の結果を示す図である。
【図１３−７】図１３−７は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−６発現の結果を示す図である。
【図１３−８】図１３−８は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−７発現の結果を示す図である。
【図１３−９】図１３−９は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−８発現の結果を示す図である。
【図１３−１０】図１３−１０は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−９発現の結果を示す図である。
【図１３−１１】図１３−１１は、実施例３のＨｅＬａ細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【図１３−１２】図１３−１２は、実施例３のＨｅＬａ細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【図１４−１】図１４−１は、実施例３のＡ５４９細胞におけるネガティブコントロールの結果を示す図である。
【図１４−２】図１４−２は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−１発現の結果を示す図である。
【図１４−３】図１４−３は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−２発現の結果を示す図である。
【図１４−４】図１４−４は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−３発現の結果を示す図である。
【図１４−５】図１４−５は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−４発現の結果を示す図である。
【図１４−６】図１４−６は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−５発現の結果を示す図である。
【図１４−７】図１４−７は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−６発現の結果を示す図である。
【図１４−８】図１４−８は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−７発現の結果を示す図である。
【図１４−９】図１４−９は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−８発現の結果を示す図である。
【図１４−１０】図１４−１０は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−９発現の結果を示す図である。
【図１４−１１】図１４−１１は、実施例３のＡ５４９細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【図１４−１２】図１４−１２は、実施例３のＡ５４９細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質、前記物質の検定用コンストラクト、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化・寿命制御に関するこれまでの研究で、酵母、線虫、ショウジョウバエ等においてはカロリー制限が延命・抗老化を実現するための有効な処理であること、更には、熱や有毒化学薬品などのストレスに対する抵抗性も増強すること、そして、それらのカロリー制限による延命の実現には、ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性を有するサーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）であるＳｉｒ２が関与していることが明らかになっている。酵母Ｓｉｒ２の哺乳類ホモログとしてはＳＩＲＴ１〜７が知られており、なかでもＳＩＲＴ１は脂肪動員の増強、神経軸索変性の抑制、β細胞からのインスリン分泌、肝臓での糖新生等の制御に係わり（非特許文献１参照）、その制御を通じて延命を実現しているものと考えられている。
サーチュインを増強あるいは活性化する因子としては、赤ワイン中のポリフェノールであるレスベラトロールをはじめとした植物性ポリフェノール類が知られているに過ぎない（非特許文献２参照）。従って、サーチュイン遺伝子を増強する物質や、該物質を探索するための手段が望まれていた。
【０００３】
一方、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ＣＳＲ）に必須の遺伝子であるＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子は、老化に伴いその発現が低下し、同時に抗体レパトアも減少することが報告されている（非特許文献３および４参照）。すなわち、ＡＩＤの減少により高齢者は感染症にかかりやすくなる可能性が示唆され、感染防御におけるＡＩＤ発現が重要なファクターである可能性がある。また、感染防御において最も重要な免疫器官の１つである腸管においてＩｇＡ濃度が上昇すると病原菌などを体外に排除する力が強くなるが、ＩｇＡへの産生にはＡＩＤ活性化による抗体のクラススイッチが必須である。
【０００４】
ＡＩＤはこのように種々の免疫系疾患治療の為のターゲット因子になりうるものと認識されながら、その制御機構、さらにはその発現・活性を制御するような食品成分に関しては報告されていない。また、タンパク質−核酸複合体がＢ細胞レセプター（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＣＲ）とＴｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）の両方に結合すると、ＢＣＲのみに結合するときよりもＢ細胞の活性化や抗体産生が促進されることが知られている（非特許文献５および６参照）。しかし、特に非タンパク質性抗原に対しては親和性と持続性に優れた中和抗体を誘導することは難しく、そのため有効なワクチンが未開発な例も多かった。そこで、抗体産生応答だけでなくＢ細胞の親和性成熟過程をも活性化することのできる物質、および該物質を探索するための手段が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２０：２９１３−２９２１（２００６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，４２５：１９１−１９６（２００３）
【非特許文献３】Ｅｘｐ. Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，３７：４２７−４３９（２００２）
【非特許文献４】Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：３７８−３８４（２００５）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ，４１６：６０３−６０７（２００２）
【非特許文献６】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：１１７１−１１７７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、延命・抗老化効果を有する物質や感染防御効果・ワクチン効果を有する物質を選抜することは、機能性食品、医薬品、化粧品の開発につながるものである。しかし、このような因子は従来知られていなかった上に、これらの因子を正確に、短時間で効率よく検定する方法は、従来知られていなかった。
【０００７】
本発明の目的は、延命・抗老化効果を有する物質や感染防御効果・ワクチン効果を有する物質、およびこれらの物質を効率的に検定するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはヒトＳＩＲＴ１（ｈＳＩＲＴ１）のプロモーター領域を取得し、その転写活性化をＧＦＰ蛍光強度で追跡することのできるシステムを構築した。本システムを動物培養細胞に導入し、ｈＳＩＲＴ１プロモーターを活性化しうる乳酸菌群を探索した結果、各種乳酸菌及びビフィズス菌が、ｈＳＩＲＴ１プロモーターを活性化することが明らかとなった。
【０００９】
また、本発明者らはヒトＡＩＤのプロモーター領域を取得し、その転写活性化をＧＦＰ蛍光強度で追跡することのできるシステムを構築した。本システムを動物培養細胞に導入し、ＡＩＤプロモーターを活性化しうる乳酸菌群を探索した結果、各種乳酸菌が、ＡＩＤプロモーターを活性化することが明らかとなった。本システムを用いることで、感染防御能を有する乳酸菌やワクチン生産への応用が可能な乳酸菌の育種も可能になるものと考えられる。
【００１０】
本発明は、以下の各発明を提供するものである。
〔１〕 サーチュイン遺伝子の活性を増強することを特徴とする延命効果物質。
〔２〕 サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、〔１〕記載の延命効果物質。
〔３〕 乳酸菌または乳酸菌由来成分である、〔１〕または〔２〕に記載の延命効果物質。
〔４〕 乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔３〕に記載の延命効果物質。
〔５〕 〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の延命効果物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
〔６〕 サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、延命効果物質検定用コンストラクト。
〔７〕 サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、〔６〕記載のコンストラクト。
〔８〕 〔６〕または〔７〕に記載のコンストラクトを含む細胞。
〔９〕 〔６〕または〔７〕に記載のコンストラクトまたは〔８〕に記載の細胞を含む、延命効果物質の検定用キット。
〔１０〕 〔８〕に記載の細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、延命効果物質の検定方法。
〔１１〕 前記延命効果物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である〔１０〕に記載の検定方法。
〔１２〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔１１〕に記載の検定方法。
〔１３〕 ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することを特徴とする感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１４〕 乳酸菌または乳酸菌由来成分である、〔１３〕に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１５〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔１４〕に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１６〕 〔１３〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
〔１７〕 ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト。
〔１８〕 〔１７〕に記載のコンストラクトを含む細胞。
〔１９〕 〔１７〕に記載のコンストラクトまたは〔１８〕に記載の細胞を含む、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キット。
〔２０〕 〔１８〕に記載の細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法。
〔２１〕 前記感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である〔２０〕に記載の検定方法。
〔２２〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔２１〕に記載の検定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、延命・抗老化という新たな機能性を有する物質が提供されると共に、該物質を検定し、選抜することができるので、延命を実現する新たな機能性食品の開発に繋げることができる。
また、本発明は、ｈＳＩＲＴ１プロモーターの活性化を通じて延命を実現しうる相互作用の解明、つまり乳酸菌菌体の有する糖鎖・ＤＮＡ等のリガンドとサーチュイン遺伝子を発現する動物細胞上のＴｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒとの間の相互作用の解明に応用することができ、延命を実現しうるスーパーアンチエイジング乳酸菌の探索・創製への応用が期待できる。
【００１２】
更に、本系は、乳酸菌の刺激で活性化されていることから、本系で検索される物質は、中でも、乳酸菌由来物質は、Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒを刺激しうる物質であり、Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒによる抗原提示細胞の活性化を通じた、抗癌作用に働く免疫系の増強が期待されることより、間接的ではあるが、免疫の抗癌作用を高める物質としても期待しうる物質である。
【００１３】
更に、本発明により、感染防御効果やワクチン効果を促進する物質といった機能性物質が提供されると共に、該物質を検定し、選抜することができるので、感染防御を実現する新規機能性食品の開発や、新規ワクチンの開発に繋げることができる。
また、本発明によれば、ＡＩＤプロモーターの活性化を通じてＡＩＤ活性化メカニズムの解明も可能であり、抗体産生応答の異常とそれに伴う疾病の改善を目的とした創薬の検索への応用も期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質
本発明は、延命効果物質と、感染防御効果・ワクチン効果促進物質との両者を提供するものである。以下、両発明のそれぞれに特徴的な部分について先に説明し、続いて共通する部分について説明する。
【００１５】
（延命効果物質）
本発明の延命効果物質は、延命効果、すなわち抗癌作用をはじめとして生物の寿命を延長する効果を発揮する物質であり、サーチュイン遺伝子の活性を増強（活性化）することを特徴とする。サーチュインとは、酵母、線虫、ショウジョウバエの延命に寄与するとされるＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性を有するＳｉｒ２のホモログを指し、哺乳類ではＳＩＲＴ１〜７を挙げることができる。サーチュイン遺伝子の活性を増強することの確認は、下記の延命効果物質検定用コンストラクトによりそのサーチュイン遺伝子のプロモーター活性を分析して行うことができる。
【００１６】
（感染防御効果・ワクチン効果促進物質）
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、感染防御効果およびワクチン効果のうちいずれかの効果、または両方の効果を発揮する物質であり、ＡＩＤ遺伝子の活性を増強（活性化）することを特徴とする。ＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子とは、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ＣＳＲ）に必須の遺伝子である。ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することの確認は、下記の感染防御効果・ワクチン効果促進物質検定用コンストラクトによりそのＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を分析して行うことができる。
【００１７】
本発明の延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質としては、乳酸菌や他の菌類・酵母類、他の動植物由来の成分である蛋白質、糖類、核酸、脂質、ポリフェノール、食物繊維、ミネラル、ビタミン等を挙げることができ、特に菌類やその成分が好ましい。菌類としては、乳酸菌を挙げることができる。
【００１８】
乳酸菌は、腸内細菌にも分類されるものが好ましく、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィドバクテリウム属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、スタフィロコッカス属乳酸菌などを挙げることができる。
【００１９】
ラクトバチルス属乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラクティスなどがある。
ビフィドバクテリウム属乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムなどがある。
ラクトコッカス属乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクティスなどがある。
スタフィロコッカス属乳酸菌としては、スタフィロコッカス・サーモフィルスなどがある。
【００２０】
これらの乳酸菌のうち、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）,ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）,ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、特にラクトバチルス・アシドフィルスは、サーチュイン遺伝子の活性を増強することが確認されている。
【００２１】
また、これらの実施例のうち、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ），ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、特にラクトバチルス・アシドフィルスは、ＡＩＤ遺伝子を活性化するものであり、感染防御効果・ワクチン効果促進物質として有用である。
【００２２】
本発明の延命効果物質は、各種の食品、化粧品、医薬品等の成分として利用することができ、特に、延命を実現しうる新たな機能性食品として有用である。
また、本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質も、各種の食品、化粧品、医薬品等の成分として利用することができ、特に、感染防御を実現する新規機能性食品や新規ワクチンの開発に繋げることができる。
【００２３】
２．延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定
本発明においては、延命効果物質の検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトの２つを提供する。以下、両発明のそれぞれに特徴的な部分について先に説明し、続いて共通する部分について説明する。
【００２４】
（延命効果物質検定用コンストラクト）
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトは、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備える。サーチュイン遺伝子については既に延命効果物質の欄において述べたとおりである。
【００２５】
ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するとは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性の９０％以上、好ましくは９５％以上の活性を有することを意味し、好ましくは実質的に同等以上の活性を有することを意味する。ｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性の確認は、ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現が増強または活性化されるかどうかの確認により行うことができる。
【００２６】
ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列表の配列番号１記載の塩基配列は、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製されるｈＳＩＲＴ１遺伝子の上流−１５９３〜−１塩基部分（＋１がｈＳＩＲＴ１遺伝子の翻訳開始点とする。）の領域である。
【００２７】
また、ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであれば、配列表の配列番号１記載の塩基配列に改変を加えた塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号１に記載の塩基配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２８】
本発明において、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ等により得ることができる。例えば、ｈＳＩＲＴ１遺伝子の場合、配列番号１に記載の塩基配列を増幅するプライマーセットを用いて、ヒト由来の鋳型ゲノムＤＮＡをＰＣＲ等により増幅することにより、配列表の配列番号１記載の塩基配列を得ることができる。一方、配列番号１に記載の塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても、配列表の配列番号１記載の塩基配列を得ることができる。
【００２９】
（感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト）
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトは、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備える。ＡＩＤ遺伝子については既に延命効果物質の欄において述べたとおりである。
【００３０】
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するとは、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の９０％以上の活性を有することを意味し、好ましくは実質的に同等以上の活性を有することを意味する。ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の確認は、ＡＩＤ遺伝子の発現が増強または活性化されるかどうかの確認により行うことができる。
【００３１】
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号２記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列表の配列番号２記載の塩基配列は、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１から得られるヒトＡＩＤ遺伝子の上流−５２０〜−１塩基部分（＋１がＡＩＤ遺伝子の翻訳開始点とする。）の領域である。
【００３２】
また、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであれば、配列表の配列番号２記載の塩基配列に改変を加えた塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号２に記載の塩基配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であるポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３３】
本発明において、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ等により得ることができる。例えば、配列番号２に記載の塩基配列を増幅するプライマーセットを用いて、ヒト由来の鋳型ゲノムＤＮＡをＰＣＲ等により増幅することにより、配列表の配列番号２記載の塩基配列を得ることができる。一方、配列番号２に記載の塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても、配列表の配列番号２記載の塩基配列を得ることができる。
【００３４】
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトとは、更にリポーター活性を有するポリヌクレオチドなどを含むものであってもよい。リポーター活性を有するポリヌクレオチドを含むことにより、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性やＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の確認を容易に行うことができる。
【００３５】
リポーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる公知のリポータータンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。リポータータンパク質としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）をはじめとする各種蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等を挙げることができる。このうち、本発明においてはＧＦＰが好ましい。
【００３６】
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトの調製は、例えば、ｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを、レポーター活性を有するポリヌクレオチドを含むベクターのレポーターの発現を制御するプロモーターと置換することで行うことができる。このようなベクターとしては、リポータータンパク質がＧＦＰの場合には、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）を挙げることができる。
【００３７】
（各コンストラクトを含む細胞）
上記本発明の延命効果物質検定用コンストラクトか、或いは感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトは、細胞に導入して各物質の検索システムとして機能させることができる。
【００３８】
各コンストラクトの導入先となる宿主細胞としては、ヒトをはじめとする各種生物の細胞を挙げることができ、動物細胞が好ましい。また、細胞の種類には特に限定はない。代表的なものとしては、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン由来細胞株Ａ５４９、ヒト大腸ガン由来細胞株ＣａＣｏ−２、ヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−１、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、ヒトＢ骨髄腫細胞株Ｕ−２６６、エプスタインバールウイルスにより不死化したヒトＢ細胞株(ＥＢＶ−Ｂ)を挙げることができる。
【００３９】
宿主細胞に上記本発明のコンストラクトを取り込ませる方法は、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法などによることができ、市販のトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）など）やＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）等を利用してもよい。
【００４０】
本発明の細胞は、宿主細胞の種類に応じて培地を選択して（例えば、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＣａＣｏ−２及びＴＩＧ−１の場合にはＭＥＭ培地、ＢＡＬＬ−１及びＵ−２６６の場合にはＲＰＭＩ６４０培地、ＥＢＶ−Ｂの場合にはＥＲＤＦ培地など）、常法により培養することができる。
【００４１】
（本発明の検定用キット）
上述の本発明のコンストラクトおよび細胞は、それぞれ、有用物質の検定用キットとして利用することができる。
すなわち、本発明の第１のキットは、延命効果物質の検定用キットであって、上述の延命効果物質検定用コンストラクトまたは該コンストラクトを含む細胞を含むものである。本発明の第２のキットは、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キットであって、上述の感染防御効果・ワクチン効果促進物質検定用コンストラクトまたは該コンストラクトを含む細胞を含むものである。
各コンストラクト、細胞については、既に述べたとおりである。
【００４２】
本発明のキットにおいて、それぞれのコンストラクトを含む場合は、コンストラクトの導入先である宿主細胞や、細胞を導入するための培地、細胞へコンストラクトを取り込ませるための試薬、検体と細胞とを接触させるための培地等を一緒に含めることができる。宿主細胞や培地については既に述べたとおりであり、試薬についても既に述べた細胞の取り込み方法のいずれかの方法において用いる試薬を適宜選択することができる。検体と細胞とを接触させるための培地については、後述する本発明の検出方法の欄において説明するとおりである。
一方、本発明のキットにおいて細胞を含む場合には、検体と細胞とを接触させるための培地を含めることができる。
【００４３】
（本発明の検定方法）
上述の本発明の細胞は、それぞれ、有用物質の検定に用いることができる。
すなわち、本発明の第一の検定方法は、延命効果物質の検定方法であって、延命効果物質検定用コンストラクトを含有する細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする。
本発明の第二の検定方法は、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法であって、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトを含む細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする。
【００４４】
本発明の２つの検定方法は、細胞と試料とを接触させ、プロモーター活性を測定する点においては共通である。
試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、食品成分・生薬成分・医薬品成分・化粧品成分等の天然及び化学合成成分等であれば良く、より具体的には、乳酸菌や他の菌類・酵母類、他の動植物由来の成分である蛋白質、糖類、核酸、脂質、ポリフェノール、食物繊維、ミネラル、ビタミン等を挙げることができ、特に菌類やその成分が好ましい。菌類としては、乳酸菌を挙げることができる。乳酸菌は、腸内細菌にも分類されるものが好ましく、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィドバクテリウム属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、スタフィロコッカス属乳酸菌などを挙げることができる。各属の乳酸菌の具体例については、上述の延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質の説明の欄で列挙したとおりである。
【００４５】
試料としての菌類の形態は、生菌体、死菌体、培養上清などが挙げられ、中でも死菌体が好ましい。死菌体は、生菌体を加熱（例えば、６０〜１２０℃で２０分〜１時間程度）、凍結乾燥、アルコール処理等、更には食品用途以外であればホルマリン処理することにより調製され得る。
【００４６】
本発明の分析方法においては、まず試料と細胞とを接触させる。試料と細胞との接触は、細胞に対し試料を添加して一定時間静置することにより行うことができる。試料が上記乳酸菌の場合の例を示すと、乳酸菌の加熱死菌体を細胞に対し終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、１２時間〜３日間程度処理を行う。
【００４７】
本発明の各検定方法においては、続いてプロモーター活性を測定する。プロモーター活性の測定は、細胞にリポーター活性を有するポリヌクレオチドが含まれている場合には、その発現強度の変化を追跡することにより行うことができる。追跡は、蛍光強度の観察によることができる。蛍光強度は、フローサイトメーターにより測定することができる。
【００４８】
本発明の第一の検定方法、すなわち、延命効果物質の検定方法により、試料の延命効果を検定することができる。すなわち、試料が延命効果を有するか否かの確認、延命効果の程度の確認などを行うことができるほか、複数ある試料の中から、延命効果を有する物質を選抜することができる。
【００４９】
例えば、延命効果物質としての各種乳酸菌または乳酸菌由来成分の探索に用いることができる。具体的には、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）,ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）,ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を延命効果物質として選抜することができ、特にラクトバチルス・アシドフィルスを優れた延命効果物質として選抜することができる。
【００５０】
本発明の延命効果物質の検定方法によれば、乳酸菌が直接接触をする可能性のある腸管系の細胞株を宿主細胞として用いることで、腸管細胞でのＳＩＲＴ１発現増強と延命実現に対するＳＩＲＴ１の新たな関連が明らかになるとともに、乳酸菌による腸管細胞の機能修飾を通じた延命実現の可能性についても解析を行うことが可能である。
【００５１】
本発明の第二の検定方法、すなわち、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法により、試料の感染防御効果・ワクチン効果（いずれかの効果、または両方の効果）を検定することができる。すなわち、試料が感染防御効果・ワクチン効果を有するか否かの確認、感染防御効果・ワクチン効果の程度の確認などを行うことができるほか、複数ある試料の中から、感染防御効果・ワクチン効果を有する物質を選抜することができる。
【００５２】
例えば、感染防御効果・ワクチン効果促進物質としての各種乳酸菌または乳酸菌由来成分の探索に用いることができる。具体的には、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ），ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を感染防御効果・ワクチン効果促進物質として選抜することができ、特にラクトバチルス・アシドフィルスを優れた感染防御効果・ワクチン効果促進物質として選抜することができる。
【００５３】
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法によれば、試料の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を検定することができる。すなわち、抗体産生応答だけでなくＢ細胞のＣＳＲ過程の活性化及びＢ細胞の親和性成熟過程の活性化が可能であり、非タンパク質性抗原に対しては親和性と持続性に優れた中和抗体を誘導することができる物質、特に乳酸菌を選抜することが可能であり、ワクチンへの応用が可能である。
【実施例】
【００５４】
実施例１〔ｈＳＩＲＴ１プロモーター転写活性化乳酸菌の同定〕
（１）ｈＳＩＲＴ１プロモーター（ｈＳＩＲＴ１ｐ）の取得
ｈＳＩＲＴ１ｐとして、ＡＴＧ翻訳開始点より−１５９３ｂｐ〜−１ｂｐ（＋１は翻訳開始点を示すものとする。）を、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応には、宝酒造のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用い、指定のプロトコールに従って反応を進めた。ＰＣＲの反応液組成は、以下に示すとおりである。ＰＣＲ反応条件は９４℃にて２分間変性を行ったあと、９８℃；２０秒、６８℃；１分を３５サイクルとした。なお、非特異的反応を抑えるために、全ての操作は氷上にて速やかに行った。
【００５５】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌水 ２５．９μｌ
１０ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（５'） １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（３'） １μｌ
ＴＩＧ−１ゲノムＤＮＡ ３．６μｌ
ＬＡ−Ｔａｑ １μｌ
合 計 ５０μｌ
【００５６】
ＰＣＲに使用したプライマーｈＳＩＲＴｐ−ＡｓｅＩ（Ｆ）およびｈＳＩＲＴｐ−ＮｈｅＩ（Ｒ）のそれぞれの配列は、配列表の配列番号３および４、並びに表１に示した。尚、表１に示す配列中、大文字はｈＳＩＲＴ１プロモーター内の配列を示し、小文字はＰＣＲにより付加するそれぞれの制限酵素認識配列を示し、表２以降に示すプライマー配列においても同じである。ＧＦＰ発現ベクターの構築にはｈＳＩＲＴｐ−ＡｓｅＩ（Ｆ）およびｈＳＩＲＴｐ−ＮｈｅＩ（Ｒ）をそれぞれ用いた。また、すべてのオリゴ合成はニッポンＥＧＴ社（Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）に依頼した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
それぞれ反応終了後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、目的のバンドを切り出した後、ゲル抽出を行った。ゲル抽出はプロメガ社のＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、製品のプロトコールに従って行った。
次に、これらのＰＣＲ産物をＴＡクローニング用のベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローニングした（ｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐ）。
【００５９】
（２）点変異の導入
得られたヒトＳＩＲＴ１プロモーター（ｈＳＩＲＴ１ｐ）全長のシークエンスを確認した。その結果３カ所に点変異が確認されたため、部位特異的変異導入法により点変異の修正を行った。
すなわち、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、製品付属のプロトコールに従いＰＣＲ法にて修正を行った。ＰＣＲの反応条件は９５℃；３０秒のあと、９５℃；３０秒、５５℃；１分を１２サイクルとした。修正に使用したプライマーｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１４３６、ｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１４０１、ｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１６０のそれぞれの配列は、配列表の配列番号５、６および７、並びに表２に示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
このＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間処理し、鋳型ＤＮＡの消化を行った。上記サンプル１μｌにつきＳｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ＸＬ−１−ｂｌｕｅを１００μｌ加えて、氷上にて３０分静置し、４２℃で４５秒間熱処理を行った後、さらに氷上にて２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地を４００μｌ加え、２００〜２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、遠心して得られた菌体ペレットをＬＢ（Ａｍｐ+）プレートに播種し、３７℃にて一晩培養した。翌日、適当なコロニーをピックアップし、それぞれシークエンスを確認した。
【００６２】
（３）ｐＥＧＦＰ−Ｃ３への組換え
上記により点変異を修正したｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐから、ＡｓｅＩ／ＮｈｅＩ消化にてプロモーター断片を切り出し、ＡｓｅＩ／ＮｈｅＩ消化によりＣＭＶプロモーターを除去したｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）に挿入し、ＧＦＰ発現コンストラクトを構築した（ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ）。ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのベクターマップを、図１に示した。
【００６３】
（４）ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞の樹立
ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の作製には、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン由来細胞株Ａ５４９、ヒト大腸ガン由来細胞株ＣａＣｏ−２を用いた。
また、生体の正常組織におけるＳＩＲＴ１制御に対する乳酸菌の効果を検証可能とするために、ヒト正常線維芽細胞（ＴＩＧ−１）を用いた。
各細胞の培養には、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＣａＣｏ−２及びＴＩＧ−１の場合にはＭＥＭ培地を用いた。
【００６４】
（５）遺伝子導入
上記ｈＳＩＲＴ１ｐ駆動のＧＦＰリポーターベクター（ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ）を、ヒト子宮頸ガン細胞株（ＨｅＬａ）、ヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）及びヒト大腸がん細胞株（Ｃａｃｏ−２）にリポフェクション法により導入した。
すなわち、上記接着系動物細胞へのｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ導入に当たっては、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた。トランスフェクションの前日に細胞を１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ ｄｉｓｈの細胞密度で準備した。翌日、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ遺伝子を１０μｇ分(液量８５μｌ)とＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬１５μｌをＯｐｉｔ−ＭＥＭ培地１．４ｍｌで希釈し、室温にて１５分間インキュベートした。この間に、細胞の培養培地を、血清を含まない新鮮なＥＲＤＦ培地（５ｍｌ／１０ｍｌ ｄｉｓｈ）と交換し、混合液を添加した。その後、遺伝子導入から３時間後に血清を含む新鮮な通常培地に培地交換を行い、また同時にＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）による遺伝子導入細胞の薬剤選択を開始した。
このようにして、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ，Ａ５４９及びＣａｃｏ−２細胞株を樹立した。
【００６５】
一方、ＴＩＧ−１細胞に対して、他の細胞と同様ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを導入することを試みたが、従来のリポフェクション法では遺伝子導入効率が低く、安定株を作ることは困難であった。そこで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍａｘａ社）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）を用いたエレクトロポレーション法による遺伝子導入を試みた。ところがＴＩＧ−１用として特化された遺伝子導入条件及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎはなかったので、様々な条件でエレクトロポレーションを行い、ＴＩＧ−１細胞に対する遺伝子導入の最適条件を決定し、実際にはＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を用い、Ｕ−２３プログラムを用いて遺伝子導入を行った。詳細はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットに付属のプロトコールに従い行った。
【００６６】
（６）乳酸菌
乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ１，３，４），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）（Ｌ５．６），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（Ｌ７），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（Ｌ８），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（Ｌ１０），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）（Ｌ２２），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｌ３４），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）（Ｂ１，２），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）（Ｂ５），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）（Ｂ８），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）（Ｂ１１），ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＳＫ３０３），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（Ｌ２５）を用いた。
【００６７】
（７）乳酸菌処理
１００℃で３０分間処理後凍結乾燥した乳酸菌の凍結乾燥加熱死菌体をサンプルとして用いた。凍結乾燥死菌体は、上記遺伝子導入動物細胞に終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２日間培養を行った。
ポジティブコントロールは、カロリー制限をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系で模倣し、ＳＩＲＴ１発現増強効果があるとされている血清及び糖抜き培地での１６時間培養処理（ＣＲ処理）とした。
【００６８】
（８）フローサイトメーター解析
フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いてＧＦＰの発現強度の変化を追跡した。この蛍光強度の変化がｈＳＩＲＴ１プロモーター活性の変化として捉えることができる。蛍光強度をヒストグラムとして展開し、未処理区においてピークの頻度値を示す蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞数の割合を数値化し、グラフに示した。ＨｅＬａ、Ａ５４９及びＣａｃｏ−２の各細胞株における結果を、それぞれ図２、図３、図４に示した。また、ＴＩＧ−１細胞における結果を、図５に示した。
【００６９】
図２〜４から明らかなように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１，３，４）は、全ての細胞株で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ５．６）はＡ５４９及びＣａｃｏ−２細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）は全ての細胞株で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ（Ｌ８）はＡ５４９及びＣａｃｏ−２細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１０）はＨｅＬａ及びＡ５４９細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｌ２２）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂ１，２）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ（Ｂ５）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１１）はＡ５４９細胞で、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（ＳＫ３０３）はＡ５４９細胞でそれぞれ再現性良く強い活性が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４）はＨｅＬａ及びＡ５４９で再現性良く弱めの活性が観察された。
【００７０】
また図５から明らかなように、ＴＩＧ−１細胞では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ６）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）で高い活性が観察された。
【００７１】
（９）ルシフェラーゼアッセイ
先に構築したｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐよりＮｏｔＩ消化によりｈＳＩＲＴ１ｐを切り出し、ＮｏｔＩ消化したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入した。さらにＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ消化によりｈＳＩＲＴ１ｐを切り出し、ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入し、ルシフェラーゼ活性を指標としてｈＳＩＲＴ１ｐ活性を測定するレポーターベクターを作製した（ｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１ｐ）。ＨｅＬａ，Ａ５４９，Ｃａｃｏ−２，ＴＩＧ−１細胞に対しｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１ｐ及び遺伝子導入効率を推定するためのコントロールプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）をＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ試薬により導入し、３時間後に培地交換を行った。
【００７２】
通常はここからｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのときと同様４８時間に渡り１０μｇ／ｍｌの濃度で乳酸菌の加熱死菌体を添加・培養し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙキットのプロトコールに則って、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性の測定を行う。ところがこの条件では、サンプル間のデータのばらつきが大きかった。そこで細胞毎に、乳酸菌加熱死菌体処理及び培養時間の至適化を行った。その結果、ＨｅＬａでは遺伝子導入後３時間後に培地交換、さらに２１時間後に培地交換とともに乳酸菌添加（１０μｇ／ｍｌ）し、２４時間後にプロモーターアッセイを行うことにより、再現性良く、サンプル間のデータのばらつきの少ないデータを得ることができた。また、Ａ５４９では遺伝子導入後３時間後に培地交換とともに乳酸菌を添加して、さらに３日間培養後プロモーターアッセイを行うことにより、再現性良く、サンプル間のデータのばらつきの少ないデータを得ることができた。この為、以後、この条件で乳酸菌加熱死菌体のｈＳＩＲＴ１ｐ活性に与える影響を検証した。ＨｅＬａおよびＡ５４９の各細胞株における結果を、それぞれ図６および図７に示す。
【００７３】
その結果、図６からわかるように、ＨｅＬａ細胞では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）以外の乳酸菌で高いＳＩＲＴ１ｐの転写活性化を観察することができた。また、図７からわかるように、Ａ５４９細胞では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ４）以外の乳酸菌で高いＳＩＲＴ１ｐの転写活性化を観察することができた。
【００７４】
（１０）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる遺伝子発現の解析
ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰ及びｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１を用いた解析から再現性良く、ｈＳＩＲＴ１ｐを活性化しうる乳酸菌を選抜し、それら乳酸菌存在下で培養したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＴＩＧ−１，Ｃａｃｏ−２における内在性ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現量の変化をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により追跡した。この際、各細胞における乳酸菌の処理条件は、前記実験と同様に至適化を行ってから決定するものとした。内在性ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現を測定するためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ用のプライマーは、以下のものを用いた。
ＨＡ０４４２６３−Ｆ：ＧＣＣＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＴＧＡＣ（配列番号１０）
ＨＡ０４４２６３−Ｒ：ＴＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＡ（配列番号１１）
【００７５】
また内部コントロールとしてはヒトβアクチンあるいはヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。その際のプライマーは、以下のものを用いた。
【００７６】
βアクチンの場合：
ＨＡ０６７８０３−Ｆ：ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡ（配列番号１２）
ＨＡ０６７８０３−Ｒ：ＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ（配列番号１３）
【００７７】
ＧＡＰＤＨの場合：
ＨＡ０３１５７８−Ｆ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ（配列番号１４）
ＨＡ０３１５７８−Ｒ：ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴ（配列番号１５）
【００７８】
ｃＤＮＡ合成は、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅ Ｈ Ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い常法に基づき行った。ＰＣＲ反応はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。
【００７９】
実施例２〔ヒトＡＩＤプロモーター転写活性化乳酸菌の同定〕
（１）ヒトＡＩＤプロモーター（ｈＡＩＤｐ）の取得
ｈＡＩＤプロモーターとして、ＡＴＧ翻訳開始点より−５２０ｂｐ〜−１ｂｐ（＋１は翻訳開始点を示すものとする。）を、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ法により取得した。ＰＣＲ反応には、宝酒造のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用い、指定のプロトコールに従って反応を進めた。ＰＣＲの反応液組成は、以下に示すとおりである。ＰＣＲ反応条件は９４℃にて２分間変性を行ったあと、９８℃；２０秒、６８℃；１分を３５サイクルとした。なお、非特異的反応を抑えるために、全ての操作は氷上にて速やかに行った。
【００８０】
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌水 ２５．９μｌ
１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（５'） １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（３'） １μｌ
ＴＩＧ−１ ゲノムＤＮＡ ３．６μｌ
ＬＡ−Ｔａｑ １μl
合 計 ５０μｌ
【００８１】
ＰＣＲに使用したプライマーの配列は表３に示した。ＧＦＰ発現ベクターの構築にはｈＡＩＤｐ−ＮｄｅＩ（Ｆ）およびｈＡＩＤｐ−ＸｂａＩ（Ｒ）をそれぞれ用いた。また、すべての合成はニッポンＥＧＴ社（Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）に依頼した。
【００８２】
【表３】
【００８３】
それぞれ反応終了後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、目的のバンドを切り出した後、ゲル抽出を行った。ゲル抽出はプロメガ社のＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、製品のプロトコールに従って行った。
次に、このＰＣＲ産物はＴＡクローニング用のベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローニングした（ｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐ）。
【００８４】
（２）ｐＥＧＦＰ−Ｃ３への組換え
シークエンスを確認したあとのｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐから、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ消化にてプロモーター断片を切り出し、ＡｓｅＩ及びＮｈｅＩ消化によりＣＭＶプロモーターを除去したｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）に挿入し、ＧＦＰ発現コンストラクトを構築した（ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ）。ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰのベクターマップを、図８に示した。
【００８５】
（３）ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の樹立及び遺伝子導入
ｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の作製には、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、ヒトＢ骨髄腫細胞株Ｕ−２６６、エプスタインバールウイルスにより不死化したヒトＢ細胞株(ＥＢＶ−Ｂ)を用いた。
各細胞の培養には、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＢＡＬＬ−１及びＵ−２６６の場合にはＲＰＭＩ６４０培地、ＥＢＶ−Ｂの場合にはＥＲＤＦ培地を用いた。
【００８６】
上記ｈＡＩＤｐ駆動のＧＦＰリポーターベクター（ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ）を、リポフェクション法により、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてヒト子宮頸ガン細胞株（ＨｅＬａ）及びヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）に導入した。
【００８７】
トランスフェクションの前日に細胞を１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ ｄｉｓｈの細胞密度で準備しておいた。翌日、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ遺伝子を１０μｇ分(液量８５μｌ)とＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬１５μｌをＯｐｉｔ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地１．４ｍｌで希釈し、室温にて１５分間インキュベートした。この間に、細胞の培養培地を、血清を含まない新鮮なＥＲＤＦ培地（５ｍｌ／１０ｍｌ ｄｉｓｈ)と交換し、混合液を添加した。遺伝子導入から３時間後に血清を含む新鮮な通常培地に培地交換を行い、また同時にＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）によるセレクションを開始した。
このようにして、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ及びＡ５４９細胞株を樹立した。
【００８８】
一方、ＢＡＬＬ−１，Ｕ−２６６，ＥＢＶ−Ｂはいずれも浮遊細胞で、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ遺伝子導入が困難な細胞であった。そのため様々な遺伝子導入方法及び条件を検討し、接着系細胞で高い遺伝子導入効率が観察されていたＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ社）を試したが、満足できるものではなかった。そこでさらにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍａｘａ社）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）を用いたエレクトロポレーション法による遺伝子導入を試みた。その際、至適試薬及びプログラムは、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ社）を用い決定した。ＢＡＬＬ−１，Ｕ−２６６，ＥＢＶ−ＢともにＶ ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を用い、Ｔ−１６プログラムにより遺伝子導入を行った。詳細はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットに付属のプロトコールに従い行った。
【００８９】
（４）乳酸菌
乳酸菌としては、以下の菌株を用いた。
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（Ｌ２５）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ１〜４），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）（Ｌ５，６），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（Ｌ７，８），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（Ｌ９〜１２，１５，３３），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（Ｌ１６，１７），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（Ｌ２８），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｌ３４），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ２６），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）（Ｂ２），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）（Ｂ８），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）（Ｂ１２），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）（Ｂ１３）を用いた。
【００９０】
（５）乳酸菌処理
１００℃で３０分処理後凍結乾燥した乳酸菌の凍結乾燥加熱死菌体をサンプルとして用いた。凍結乾燥加熱死菌体は、上記ｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現細胞株に終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２日間処理を行った。
【００９１】
（６）フローサイトメーター解析
フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いてＧＦＰの発光強度の変化を追跡した。この蛍光強度の変化がｈＡＩＤプロモーター活性の変化として捉えることができる。無処理のものをコントロール（ｃｔｒｌ）とした。蛍光強度をヒストグラムとして展開し、未処理区においてピークの頻度値を示す蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞数の割合を数値化し、グラフに示した。ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＢＡＬＬ、Ｕ２６６の各細胞株の結果を、それぞれ図９、図１０、図１１、図１２にそれぞれ示した。
【００９２】
その結果、図９から明らかなように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１〜４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ５，６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂ２）で強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１１，１２，１５，３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌ１６，１７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｌ２８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１３）は中程度のＡＩＤｐ転写活性化能が、それ以外の菌には弱いＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９３】
図１０の結果から、Ａ５４９細胞においては、いずれの乳酸菌においても強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９４】
図１１の結果から、ＢＡＬＬ−１細胞においては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ３３），Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４），Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６），Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８），Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１３）以外の乳酸菌に強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９５】
図１２の結果から、Ｕ−２６６細胞においては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６）で弱いｈＡＩＤｐ転写活性化能が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（Ｌ２５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１〜４）で中程度のｈＡＩＤｐ転写活性化能が、それ以外の乳酸菌で強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。
【００９６】
（７）ルシフェラーゼアッセイ
先に構築したｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐよりＥｃｏＲＩ処理によりｈＡＩＤｐを切り出し、ＥｃｏＲＩ処理をしたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入した。さらにＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりｈＡＩＤｐを切り出し、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃに挿入し、ルシフェラーゼ活性を指標としてｈＡＩＤｐ活性を測定するレポーターベクターを作製した（ｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐ）。ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂ各細胞に対しｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐ及び遺伝子導入効率を推定するためのコントロールプラスミド（ｐＲＫ−ＴＫ）をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ試薬により導入し、３時間後に培地交換を行った。ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのときと同様４８時間に渡り１０μｇ／ｍｌの濃度で乳酸菌の加熱死菌体を添加・培養し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙキットのプロトコールに則って、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性の測定を行った。
【００９７】
（８）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる遺伝子発現の解析
ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ及びｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐを用いた解析から再現性良く、ｈＡＩＤｐを活性化しうる乳酸菌を選抜し、それら乳酸菌存在下で培養したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂにおける内在性ｈＡＩＤ遺伝子の発現量の変化をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により追跡した。
【００９８】
内在性ｈＡＩＤ遺伝子の発現を測定するためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ用のプライマーは、以下のものを用いた。
ＨＡ０５０７９７−Ｆ：ＣＡＣＣＣＴＡＡＴＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧ（配列番号１６）
ＨＡ０５０７９７−Ｒ：ＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧ（配列番号１７）
【００９９】
また内部コントロールは上記実施例１と同様ヒトβアクチンあるいはヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応も上記と同様に行った。
【０１００】
実施例３（遺伝子発現を誘導するＴＬＲの同定）
微生物を認識するレセプターとして機能しうる各種ＴＬＲの発現を、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰおよびｐｈＡＩＤ−ＧＦＰのそれぞれを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＴＩＧ−１，Ｃａｃｏ−２，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂにおいて検証した。
【０１０１】
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ法用のプライマーとしては、以下の組み合わせを用い、方法は上記実施例１および実施例２の方法にならって行った。
【０１０２】
ＴＬＲ１：
ＨＡ０３７８４１−Ｆ：ＣＡＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＴＴＡＴＧＡＡＣ（配列番号１８）
ＨＡ０３７８４１−Ｒ：ＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＴＡＡＧＴＣ（配列番号１９）
【０１０３】
ＴＬＲ２：
ＨＡ０３７８４２−Ｆ：ＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号２０）
ＨＡ０３７８４２−Ｒ：ＡＧＴＡＧＧＣＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＴＡＡ（配列番号２１）
【０１０４】
ＴＬＲ３：
ＣＨ０００２５５−Ｆ：ＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号２２）
ＣＨ０００２５５−Ｒ：ＧＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号２３）
【０１０５】
ＴＬＲ４：
ＣＨ０００２５６−Ｆ：ＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡ（配列番号２４）
ＣＨ０００２５６−Ｒ：ＣＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号２５）
【０１０６】
ＴＬＲ５：
ＨＡ０３７８４９−Ｆ：ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡ（配列番号２６）
ＨＡ０３７８４９−Ｒ：ＧＴＴＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴＧ（配列番号２７）
【０１０７】
ＴＬＲ９：
ＨＡ０４８１３８−Ｆ：ＡＧＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡ（配列番号２８）
ＨＡ０４８１３８−Ｒ：ＧＣＧＴＴＧＧＣＧＣＴＡＡＧＧＴＴＧＡ（配列番号２９）
【０１０８】
各種ＴＬＲリガンド（Ｈｕｍａｎ ＴＬＲ１−９ Ａｇｏｎｉｓｔ Ｋｉｔ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を購入し、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，Ｃａｃｏ−２，ＴＩＧ−１細胞及びｐｈＡＩＤ−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６と共培養することで、それぞれの細胞内でのＧＦＰ強度が増強するＴＬＲを同定した。ＧＦＰ発現強度は、フローサイトメーターにより追跡した。
【０１０９】
ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞における結果を図１３−１〜図１３−１２に示す。また、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞における結果を図１４−１〜図１４−１２に示す。図１３−１及び図１４−１３のｃｏｎは、ネガティブコントロールを示す。図１３−１１および図１４−１１のＬ１、図１４−１２のＬ５、および図１３−１２のＬ７は、ポジティブコントロールを示す。点線が反応時のデータを示し、このデータが動いているものが反応を示したＴＬＲとなる、具体的には、ＨｅＬａでは、ＴＬＲ１（図１３−２）、ＴＬＲ２（図１３−３）、ＴＬＲ３（図１３−４）、ＴＬＲ９（図１３−１０）が反応を示し、Ａ５４９では、ほぼ全てのＴＬＲに反応性を示していた（図１４−２〜図１４−１０）。これらのことより、乳酸菌のＳＩＲＴ１への反応の少なくとも一部は、ＴＬＲを介して生じていることが示された。
【０１１０】
実施例４（ＧＦＰｍｕｔを用いたＳＨＭ増強乳酸菌のスクリーニング）
ＡＩＤ遺伝子は抗体のクラススイッチに加え、体細胞高頻度突然変異（Ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ：ＳＨＭ）誘導能を有していることが知られている。そこでＧＦＰ遺伝子のコード領域内のＡＩＤによるＳＨＭのターゲットとなるような領域に停止コドンを人為的に導入したＧＦＰｍｕｔというコンストラクトを作製した。ＧＦＰｍｕｔはｈＡＩＤ非存在下では無蛍光、ｈＡＩＤ活性に応じて緑色蛍光を発する。このコンストラクトを安定に発現する細胞株を樹立することができれば、ＡＩＤのＳＨＭ活性を増強しうる乳酸菌の探索に応用できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのベクターマップである。
【図２】図２は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＨｅＬａ細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＡ５４９細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＣａｃｏ−２細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＴＩＧ−１細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＨｅＬａ細胞による、各乳酸菌の検定結果（ルシフェラーゼアッセイ）を示すグラフである。
【図７】図７は、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを含むＡ５４９細胞による、各乳酸菌の検定結果（ルシフェラーゼアッセイ）を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰのベクターマップである。
【図９】図９は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＨｅＬａ細胞による、各乳酸菌の検定結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＡ５４９細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＢＡＬＬ−１細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを含むＵ−２６６細胞による、各乳酸菌の検定結果（フローサイトメーター解析）を示すグラフである。
【図１３−１】図１３−１は、実施例３のＨｅＬａ細胞におけるネガティブコントロールの結果を示す図である。
【図１３−２】図１３−２は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−１発現の結果を示す図である。
【図１３−３】図１３−３は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−２発現の結果を示す図である。
【図１３−４】図１３−４は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−３発現の結果を示す図である。
【図１３−５】図１３−５は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−４発現の結果を示す図である。
【図１３−６】図１３−６は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−５発現の結果を示す図である。
【図１３−７】図１３−７は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−６発現の結果を示す図である。
【図１３−８】図１３−８は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−７発現の結果を示す図である。
【図１３−９】図１３−９は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−８発現の結果を示す図である。
【図１３−１０】図１３−１０は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＴＬＲ−９発現の結果を示す図である。
【図１３−１１】図１３−１１は、実施例３のＨｅＬａ細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【図１３−１２】図１３−１２は、実施例３のＨｅＬａ細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【図１４−１】図１４−１は、実施例３のＡ５４９細胞におけるネガティブコントロールの結果を示す図である。
【図１４−２】図１４−２は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−１発現の結果を示す図である。
【図１４−３】図１４−３は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−２発現の結果を示す図である。
【図１４−４】図１４−４は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−３発現の結果を示す図である。
【図１４−５】図１４−５は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−４発現の結果を示す図である。
【図１４−６】図１４−６は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−５発現の結果を示す図である。
【図１４−７】図１４−７は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−６発現の結果を示す図である。
【図１４−８】図１４−８は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−７発現の結果を示す図である。
【図１４−９】図１４−９は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−８発現の結果を示す図である。
【図１４−１０】図１４−１０は、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞におけるＴＬＲ−９発現の結果を示す図である。
【図１４−１１】図１４−１１は、実施例３のＡ５４９細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【図１４−１２】図１４−１２は、実施例３のＡ５４９細胞におけるポジティブコントロールの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーチュイン遺伝子の活性を増強することを特徴とする延命効果物質。
【請求項２】
サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、請求項１記載の延命効果物質。
【請求項３】
乳酸菌または乳酸菌由来成分である、請求項１または２に記載の延命効果物質。
【請求項４】
乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項３に記載の延命効果物質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の延命効果物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
【請求項６】
サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、延命効果物質検定用コンストラクト。
【請求項７】
サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、請求項６記載のコンストラクト。
【請求項８】
請求項６または７に記載のコンストラクトを含む細胞。
【請求項９】
請求項６または７に記載のコンストラクトまたは請求項８に記載の細胞を含む、延命効果物質の検定用キット。
【請求項１０】
請求項８に記載の細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、延命効果物質の検定方法。
【請求項１１】
前記延命効果物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である請求項１０に記載の検定方法。
【請求項１２】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項１１に記載の検定方法。
【請求項１３】
ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することを特徴とする感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
【請求項１４】
乳酸菌または乳酸菌由来成分である、請求項１３に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
【請求項１５】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項１４に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
【請求項１７】
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト。
【請求項１８】
請求項１７に記載のコンストラクトを含む細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載のコンストラクトまたは請求項１８に記載の細胞を含む、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キット。
【請求項２０】
請求項１８に記載の細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法。
【請求項２１】
前記感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である請求項２０に記載の検定方法。
【請求項２２】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項２１に記載の検定方法。
【請求項１】
サーチュイン遺伝子の活性を増強することを特徴とする延命効果物質。
【請求項２】
サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、請求項１記載の延命効果物質。
【請求項３】
乳酸菌または乳酸菌由来成分である、請求項１または２に記載の延命効果物質。
【請求項４】
乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項３に記載の延命効果物質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の延命効果物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
【請求項６】
サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、延命効果物質検定用コンストラクト。
【請求項７】
サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、請求項６記載のコンストラクト。
【請求項８】
請求項６または７に記載のコンストラクトを含む細胞。
【請求項９】
請求項６または７に記載のコンストラクトまたは請求項８に記載の細胞を含む、延命効果物質の検定用キット。
【請求項１０】
請求項８に記載の細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、延命効果物質の検定方法。
【請求項１１】
前記延命効果物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である請求項１０に記載の検定方法。
【請求項１２】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項１１に記載の検定方法。
【請求項１３】
ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することを特徴とする感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
【請求項１４】
乳酸菌または乳酸菌由来成分である、請求項１３に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
【請求項１５】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項１４に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
【請求項１７】
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト。
【請求項１８】
請求項１７に記載のコンストラクトを含む細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載のコンストラクトまたは請求項１８に記載の細胞を含む、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キット。
【請求項２０】
請求項１８に記載の細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法。
【請求項２１】
前記感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である請求項２０に記載の検定方法。
【請求項２２】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである請求項２１に記載の検定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１３−３】
【図１３−４】
【図１３−５】
【図１３−６】
【図１３−７】
【図１３−８】
【図１３−９】
【図１３−１０】
【図１３−１１】
【図１３−１２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１４−４】
【図１４−５】
【図１４−６】
【図１４−７】
【図１４−８】
【図１４−９】
【図１４−１０】
【図１４−１１】
【図１４−１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１３−３】
【図１３−４】
【図１３−５】
【図１３−６】
【図１３−７】
【図１３−８】
【図１３−９】
【図１３−１０】
【図１３−１１】
【図１３−１２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１４−４】
【図１４−５】
【図１４−６】
【図１４−７】
【図１４−８】
【図１４−９】
【図１４−１０】
【図１４−１１】
【図１４−１２】
【公開番号】特開２００８−１９５６７３（Ｐ２００８−１９５６７３Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３４１１５（Ｐ２００７−３４１１５）
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
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