延長された生体内半減期を有するＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体及びその製造方法
【課題】 延長された生体内半減期を有するＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体及びその製造方法の提供。
【解決手段】 ＰＥＧリンカーと二分子の生理活性ポリペプチドを含み、前記二分子の生理活性ポリペプチドがＰＥＧリンカーによって連結され、二分子の生理活性ポリペプチドの各々が一分子のＰＥＧで修飾された、ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体は延長された血中半減期を有するポリペプチド薬物の開発に有用に用いられ得る。
【解決手段】 ＰＥＧリンカーと二分子の生理活性ポリペプチドを含み、前記二分子の生理活性ポリペプチドがＰＥＧリンカーによって連結され、二分子の生理活性ポリペプチドの各々が一分子のＰＥＧで修飾された、ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体は延長された血中半減期を有するポリペプチド薬物の開発に有用に用いられ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、延長された生体内半減期（in vivo half-life）を有するポリエチレングリコール（polyethylene glycol, PEG）によって生理活性ポリペプチド二分子が結合されてなる同種二量体（homodimer）及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、血液、肝又は腎臓で変性又は酵素的分解（enzymatic degradation）に敏感である。ポリペプチドのこのような低い安定性のため、活性成分の效果的な血漿濃度を維持するためには患者にあらかじめ指定された頻度でポリペプチド薬物を投与することが要求される。また、ポリペプチド薬物は、通常注入（infusion）によって投与されるので、この頻繁な注入は患者に相当な不便を招く。従って、高い薬理学的効果は維持しつつ血液内でより長い血中半減期を有するポリペプチド薬物を開発するため、多くの研究が行われてきた。このようなポリペプチド薬物は、また患者に投与された際、向上された血清安定性（serum stability）、高活性、多様なポリペプチドに対する適用性（applicability）及び好ましくない免疫反応を誘発する可能性が低いという要件を満たさなければならない。
【０００３】
ポリペプチドの安定性を向上させるため、一番幅広く用いられている方法の一つは、ポリペプチドがタンパク質分解酵素（protease）と接触することを防止するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような高溶解性高分子（highly soluble macromolecule）を用いて得られるポリペプチドの化学的変形（chemical modification）である。ポリペプチド薬物に特異的に或いは非特異的に結合した際、ＰＥＧがポリペプチド薬物の溶解度（solubility）を増加させ、前記薬物の加水分解（hydrolysis）を防止し、その結果、低い抗原性（antigenicity）によっていかなる免疫反応も誘発せずにポリペプチド薬物の血清安定性を増加させ得るということは公知である（Sada et al., J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71: 137-139）。しかし、ＰＥＧは、ポリペプチドの自由リジン残基（free lysine residue）と無作為に共有結合（covalent bond）を形成するため、ペギレート化されたポリペプチド（pegylated polypeptide）はＰＥＧの分子量が増加するほど低い活性を有する傾向がある。
【０００４】
ポリペプチドの活性を維持するため、ポリペプチドの特定部位を選択的にペギレート化させる方法が米国特許第５，７６６，８９７号及び第５，９８５，２６５号に開示されている。しかし、これらの方法は、生体内ポリペプチドの活性増加維持の面では全く効果がなかった。
【０００５】
従って、満足できる水準の活性と延長された生体内半減期とを有するポリペプチド結合体を開発する必要性が依然として要求されている状況である。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，７６６，８９７号
【特許文献２】米国特許第５，９８５，２６５号
【非特許文献１】Sada et al., J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71: 137-139
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、二分子の生理活性ポリペプチドを小さい分子量を有するＰＥＧリンカーによって連結させて同種二量体を製造し、大きな分子量を有するＰＥＧで前記同種二量体を修飾（modifying）してポリペプチドの生物学的活性の低下を最少化すると共に、前記ポリペプチドの生体内活性を延長するために生理活性ポリペプチドの生体内安定性は増加させた、ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するため、本発明は一分子のＰＥＧリンカーと二分子の生理活性ポリペプチドを含み、前記二分子の生理活性ポリペプチドが前記ＰＥＧリンカーによって連結され、二分子の生理活性ポリペプチドの各々が一分子のＰＥＧによって修飾されたＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によるＰＥＧ−生理活性ポリペプチドの同種二量体結合体は、ＰＥＧリンカーを用いて血中半減期の短い生理活性ポリペプチドの同種二量体を製造した後、さらに生理活性ポリペプチドのリジン残基のアミノ基をＰＥＧで修飾したもので、生理活性ポリペプチドの血中半減期を増加させて、生理活性を改善しながら、免疫反応を誘発するおそれがないため、徐放出性剤形の製造に有用に適用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の好ましい実施例に用いられ得る生理活性ポリペプチドとしては、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、１７番システインがセリンで置換されたアミノ酸配列を有する顆粒球コロニー刺激因子誘導体（１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ）、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、インシュリン、インターロイキン、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）などを含む。本発明が適用され得る生理活性ポリペプチドは前記に言及されたものに限定されなく、生体内半減期を増加させるのに有用なすべての生理活性ポリペプチドが包含され得る。
【００１２】
本発明の生理活性ポリペプチドは、哺乳動物から分離された野生型であるか、或いは化学的に合成し得る。また、前記ポリペプチドは、遺伝工学（genetic engineering）によって形質転換された原核細胞又は真核細胞から製造し得る。
【００１３】
本発明の好ましい実施様態では、同種二量体が水性媒質中で沈殿しないようにＰＥＧリンカーが親水性を帯びなければならない。また、前記ＰＥＧリンカーは、二分子の生理活性ポリペプチドのアミノ末端の各々に特異的に結合できるように両末端に反応基を有するものが好ましい。このようなＰＥＧリンカーの反応基としてはアルデヒド基（aldehyde group）又はプロピオン（propionic）アルデヒド基が適当である。
【００１４】
本発明の好ましい実施様態では、ＰＥＧリンカーの分子量が１〜１００ｋＤａの範囲のものが望ましく、２〜２０ｋＤａの範囲のものがより好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい実施様態では、ＰＥＧ分子が通常の水溶性ＰＥＧ分子であって、ＰＥＧの活性基によってポリペプチドのリジン残基、システイン残基又はヒスチジン残基のε−アミノ基に結合し得る。
【００１６】
本発明の好ましい実施様態では、二分子の生理活性ポリペプチドを修飾するために用いられるＰＥＧの分子量は１〜１００ｋＤａの範囲のものが望ましく、２０〜４０ｋＤａの範囲のものがより好ましい。
【００１７】
この修飾用のＰＥＧ分子の反応基は、マレイミド基（maleimide）又はスクシンアミド基（succinamide）であることが望ましく、スクシンアミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオネート（succinimidyl propionate）、スクシンイミジルカルボキシメチル（succinimidyl carboxymethyl）及びスクシンイミジルカルボネート（succinimidyl carbonate）を含む。
【００１８】
また、本発明に用いられるＰＥＧ分子は線型や分枝型であってもよく、分枝型ＰＥＧがより好ましい。
【００１９】
本発明の他の目的によって、本発明はさらに下記段階を含む、ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体の製造方法を提供する：
ａ）ＰＥＧリンカーで二分子の生理活性ポリペプチドを連結させて同種二量体を製造する段階；及び
ｂ）一分子のＰＥＧで前記同種二量体の生理活性ポリペプチドの各々を修飾する（modifying）段階。
【００２０】
本発明の好ましい実施様態によれば、段階（ａ）で用いられたＰＥＧリンカーに対する生理活性ポリペプチドのモル比は１：０．２５〜１：１０の範囲のものが望ましく、１：０．５〜１：１がより好ましい。
【００２１】
本発明の好ましい実施例で、段階（ａ）はナトリウムシアノボロヒドリド（sodium cyanoborohydride, NaCNBH3）、水素化ホウ素ナトリウム（sodium borogydride）、ジメチルアミンホウ酸塩（dimethylamine borate）、トリメチルアミンホウ酸塩（trimethylamine borate）及びピリジンホウ酸塩（pyridine borate）からなる群から選択される還元剤の存在下で２〜１０℃範囲の温度で行われることが好ましい。
【００２２】
段階（ａ）が終決した後、これから形成されたポリペプチド同種二量体は、大きさ排除（size exclusion）クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーのようなタンパク質精製に有用な通常の方法のいずれかを用いて分離し得る。
【００２３】
段階（ｂ）で生理活性ポリペプチド同種二量体のＰＥＧ修飾（modification）が終決した後、これから形成された同種二量体結合体は大きさ排除クロマトグラフィーを用いて精製し得る。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を下記実施例によってより詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、これらに限定されない。
【００２５】
［実施例１］：ｈＧＨ同種二量体の製造及び精製
組替えｈＧＨは、韓国特許第３１６３４７号の方法によって製造され、本発明のｈＧＨは野生型（native form）である。前記で製造されたｈＧＨを１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液に溶解させてｈＧＨ溶液５ｍｇ／ｍｌを用意した。ｈＧＨとＰＥＧリンカーを連結するために両末端にアルデヒド基を有し、分子量が３．４ｋＤａであるＰＥＧリンカー（Shearwater Inc., 米国）をｈＧＨ：ＰＥＧリンカーのモル比が１：０．５、１：１、１：２．５、１：５、１：１０又は１：２０に相応する量で前記ｈＧＨ溶液に各々添加した。これに還元剤であるナトリウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３）を最終濃度が２０ｍＭになるように添加した。反応溶液を４℃で３時間攪拌し、二つのｈＧＨ分子のアミノ末端の各々にＰＥＧリンカーが選択的に連結されたｈＧＨ同種二量体（ｈＧＨ−ＰＥＧリンカー−ｈＧＨ）を分離するためにスーパーデックス２００（Superdex 200, Pharmacia）を用いた大きさ排除クロマトグラフィーを行った。５０ｍＭナトリウムリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ８．０）を用いてｈＧＨ同種二量体を溶出し、未反応のｈＧＨ及びＰＥＧリンカーを除去した。同種二量体を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧリンカーの最適モル比は１：０．５〜１：２の範囲であることを確認した。前記で得られたｈＧＨ同種二量体分画をアニオン交換樹脂カラムでさらに精製した。具体的に、ポリワックスＬＰカラム（PolyWAX LP, PolywaxInc., 米国）３ｍｌを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝溶液で平衡化させ、ｈＧＨ同種二量体分画を１ｍｌ／分の流速で前記カラムに点滴した後、前記カラムを５カラム体積（column volume）、即ちＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１５ｍｌで洗浄した。０〜１００％範囲の多様な濃度勾配で３０分以上１０カラム体積（３０ｍｌ）の１Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液を適用しつつ、塩濃度勾配方法によって一つのｈＧＨ分子が連結されたモノＰＥＧリンカーからｈＧＨ同種二量体を分離した。
【００２６】
［実施例２］：分枝型４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾されたｈＧＨ同種二量体の製造
分子量４０ｋＤａである分枝型Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル(N-hydroxysuccinimidyl)-PEG(NHS-PEG)(Shearwater Inc., 米国）を室温で２時間１００ｍＭナトリウムリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ８．０）上で、実施例１で精製されたｈＧＨ同種二量体のリジン残基と反応させた。同種二量体：ＮＨＳ−ＰＥＧのモル比は１：２、１：５、１：１０及び１：２０になるようにした。反応終了後、二つのｈＧＨ分子の各々が一分子のＮＨＳ−ＰＥＧで修飾されたジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体を精製するためにスーパーデックス大きさ排除クロマトグラフィーを行った。ＰＥＧが修飾されていないｈＧＨ同種二量体及びただ一分子のＮＨＳ−ＰＥＧが連結されたモノ−ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体を除去するためにリン酸塩緩衝食塩水を緩衝溶液として用いた。モノ−ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体産物の割合は、約６０％：４０％であった。これからジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体を得るためのＮＨＳ−ＰＥＧに対するｈＧＨ同種二量体の最適モル比は１：１０であることを確認した。
【００２７】
［実施例３］：分枝型４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾されたＩＦＮ同種二量体の製造
実施例１と同様な方法でＩＦＮ同種二量体（ＩＦＮ−ＰＥＧリンカー−ＩＦＮ）を製造し、実施例２と同様な方法でｈＧＨの代わりにＩＦＮを用いて前記ＩＦＮ同種二量体を分子量４０ｋＤａの分枝型ＮＨＳ−ＰＥＧ二分子で修飾した。モノ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体産物とジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体産物との割合は約６０％：４０％であった。
【００２８】
［実施例４］：分枝型４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾されたＧ−ＣＳＦ同種二量体の製造
実施例１と同様な方法でＧ−ＣＳＦ同種二量体（Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧリンカー−Ｇ−ＣＳＦ）を製造し、実施例２と同様な方法でｈＧＨの代わりにＧ−ＣＳＦを用いて前記Ｇ−ＣＳＦ同種二量体を分子量４０ｋＤａである分枝型ＮＨＳ−ＰＥＧ二分子で修飾した。モノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体産物とジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体産物との割合は約６０％：４０％であった。
【００２９】
［比較例１］：分枝型ＰＥＧで修飾されたｈＧＨモノマーの製造
ｈＧＨをリン酸塩緩衝溶液１００ｍＭに溶解させてｈＧＨ溶液１ｍｇ／ｍｌを三つ用意した後、分子量４０ｋＤａの分枝型メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（Shearwater Inc., 米国）をｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が１：４になるように前記溶液に添加した。前記反応溶液にナトリウムシアノボロヒドリド（NaCNBH3, Sigma）を最終濃度２０ｍＭになるように添加した後、４℃で１８時間徐々に攪拌させながら反応させた。ｈＧＨのアミノ末端に一つのＰＥＧ分子が修飾されたモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨを分離するためにアニオン交換クロマトグラフィーを行った。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝溶液で平衡化されたポリワックスＬＰ（PolyWAX LP、Polywax Inc., 米国）カラムにペギレート化された反応混合物を点滴した後、１ｍｌ／分の流速で溶出し、５カラム体積（１５ｍｌ）の同一な緩衝溶液で前記カラムを洗浄した。その後、０から１００％まで濃度勾配を自動的に変化させて３０分以上１０カラム体積（３０ｍｌ）の１Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液を適用させながら塩濃度勾配方法によってトリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ分画を反応物から分離した。
【００３０】
モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ分画を濃縮し、１０ｍＭリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．０）で平衡化させたスーパーデックス２００（Superdex 200、Pharmacia、米国）大きさ排除クロマトグラフィーに点滴した後、同一な緩衝溶液を用いて１ｍｌ／分の流速で溶出した。モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨより相対的に早く溶出されたトリ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨを除去してモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨのみを得た。
【００３１】
［比較例２及び３］：分枝型ＰＥＧで修飾されたＩＦＮ及びＧ−ＣＳＦモノマーの製造
ｈＧＨの代わりにＩＦＮ（比較例２）及びＧ−ＣＳＦ（比較例３）の各々を用いて前記比較例１と同様な方法で分枝型ＰＥＧが修飾されたＩＦＮと分枝型ＰＥＧが修飾されたＧ−ＣＳＦを製造して分離した。
【００３２】
［試験例１］：ＰＥＧ結合体の確認及び定量
前記実施例で製造されたポリペプチド結合体を各々の濃度及び純度をクマシー（Coomassie）染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び大きさ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し、この際、前記濃度はベール・ランバートの法則（Beer-Lambert law）によって２８０ｎｍで測定した（Bollag et al., Protein Methods Chapter 3, press in Wiley-Liss）。
【００３３】
ｈＧＨ同種二量体の見掛分子量は約４８ｋＤａであり、ＩＦＮ同種二量体及びＧ−ＣＳＦ同種二量体の見掛分子量もこれと同様であった。分子量４０ｋＤａのＰＥＧ分子一つが修飾された際、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体の見掛分子量は１５０ｋＤａであり；分子量４０ｋＤａのＰＥＧ分子二つで修飾された際、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の見掛分子量は２４０ｋＤａであった。なお、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨの分子量は約１２０ｋＤａであり、ＩＦＮ及びＧ−ＣＳＦの分子量も同様であった。
【００３４】
図１はｈＧＨ（レイン１）、ｈＧＨ同種二量体（レイン２）及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体（レイン４）の各々から得たＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レイン３は標準分子量タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ、下から４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０及び２２０ｋＤａを意味するベンチマーカー）を示す。図１に示すように、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の見掛分子量は約２４０ｋＤａであり、前記結合体は単一バンドとして現れて非常に高い純度を有していることが分かる。
【００３５】
［試験例２］：ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の試験管内（in vitro）活性測定
ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体（実施例２）及びモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ（比較例１）の試験管内活性度をｈＧＨ依存性有糸分裂を経るラットノードリンパ腫（Rat node lymphoma）細胞株であるＮｂ２（European Collection of Cell Cultures, ECCC#97041101）を用いて測定した。
【００３６】
Ｎｂ２細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．０７５％のＮａＣＯ３、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び２ｍＭグルタミンが調整されたフィッシャー培地（Fisher’s medium）で培養した。前記細胞を１０％牛胎児血清が添加されていない同一な培地で２４時間さらに培養した。ウェル当たり約２×１０４細胞を９６−ウェルプレートの各ウェルに添加した後、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体とモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ、野生型ｈＧＨ及び対照群（National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC）の多様な希釈液を各ウェルに添加し、前記プレートを４８時間３７℃、ＣＯ２培養器で培養した。細胞成長程度（各ウェルに存在する細胞数）を測定するため、細胞力価９６アクアスワン溶液（cell titer 96 Aqueous One Solution; Promega, 米国）２５μｌを各ウェルに添加して４時間培養した。４９０ｎｍで吸光度を測定して各試料の力価を計算し、その計算された力価を下記表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
前記表１から分かるように、ＰＥＧ修飾されたｈＧＨの試験管内活性は修飾されていないｈＧＨより低かった。
【００３９】
［試験例３］：ジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体結合体の試験管内活性測定
ジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体結合体（実施例３）及びモノ−ＰＥＧ−ＩＦＮ（比較例２）の試験管内活性を水胞性口炎ウイルス（vesicular stomatitis virus, VSV）で飽和させたマジン−ダービ牛腎臓細胞（Madin-Darby bovine kidney cells, MDBK cells;ATCC CCL-22）を用いた細胞培養生検方法（cell culture biopsy method）で測定した。ＰＥＧが修飾されていないＩＦＮ α ２ｂ（ＮＩＢＳＣ ＩＦＮ）を対照群として用いた。
【００４０】
ＭＤＢＫ細胞を１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加されたＭＥＭ（minimum essential medium, JBI）で３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。試料と対照群（ＮＩＢＳＣインターフェロン）を同一な細胞培養培地を用いて一定濃度に希釈し、各々の希釈液を１００μｌずつ９６−ウェルプレートに分注した。１００μｌの培養された細胞溶液を各ウェルに添加し、前記細胞を３７℃、５％ＣＯ２培養器で約１時間培養した。１時間後、５〜７×１０３ＰＦＵのウイルス濃度を有するＶＳＶ５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１６〜２０時間さらに培養した。試料又は対照群を添加せずに細胞とウイルスのみを含むウェルを陰性対照群として、ウイルスを添加せずに細胞のみを含むウェルを陽性対照群として用いた。
【００４１】
培養培地を除去して生きている細胞を染色するために、１００μｌのニュートラルレッド（neutral red）溶液を各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。吸込み（aspirating）によって上澄液を除去した後、抽出溶液（１００％エタノールと１％アセテートとの混合物１００μｌ（１：１））を各ウェルに添加した。染色された細胞をよく振って前記抽出溶液に溶解させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。最大細胞成長の５０％を表すＥＤ５０を陰性対照群の細胞成長に対して陽性対照群の細胞成長を１００％とみなして計算した。
【００４２】
【表２】
【００４３】
前記表２から分かるように、ＰＥＧ修飾されたＩＦＮの試験管内活性は修飾されていないＩＦＮに比べて低かった。
【００４４】
［試験例４］：ジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体の試験管内活性測定
ジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体（実施例４）及びモノ−ＰＥＧ−Ｃ−ＣＳＦ（比較例３）の試験管内活性を次のように測定した。
【００４５】
まず、ヒト骨髄（myelogenous）由来細胞、HL-60(ATCC CCL-240, Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female）細胞を１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養し、細胞数を約２．２×１０５細胞／ｍｌになるように調整した。これにＤＭＳＯ（dimethylsulfoxide, culture grade, SIGMA）を濃度が１．２５％（ｖ／ｖ）になるように添加した。ウェル当たり約２×１０４個の浮遊細胞を含むＤＭＳＯ処理された培養液９０μｌを９６−ウェルプレート（Corning/low evaporation 96 well plate）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で約４８時間培養した。
【００４６】
試料と対照群（ＮＩＢＳＣ Ｇ−ＣＳＦ）を最終濃度が５００ｎｇ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ １６４０培地を用いて適切な割合で希釈し、これから得た溶液を同一な培地で二倍ずつ連続的に１０回希釈した。
【００４７】
このように用意された各々の試料１０μｌを培養中のＨＬ−６０細胞株が含まれた各ウェルに添加し、濃度を５０ｎｇ／ｍｌから連続的に半減させた。試料が処理されたマイクロプレートを３７℃培養器で４８時間さらに培養した。
【００４８】
培養後、細胞成長程度を調査するため、細胞数をCellTiter96TM(Promega, USA)を用いて６７０ｎｍで吸光度を測定して決定した。
【００４９】
【表３】
【００５０】
前記表３から分かるように、ＰＥＧ修飾されたＧ−ＣＳＦの試験管内活性は修飾されていないＧ−ＣＳＦより低かった。しかし、ｈＧＨ及びＩＦＮの試験管内活性とは異なって、本発明のジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体の野生型Ｇ−ＣＳＦに対する相対的活性は、モノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦより約４倍高く表れた。このような結果は、本発明のジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体がＧ−ＣＳＦ同種二量体の形成に起因して高い生体内活性を発揮することを示す。
【００５１】
［試験例５］：薬物動態学分析
各群当り５匹のスプラグ−ダウリ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＳＤ）ラットを下記実験で用いた。前記マウスに１００μｇ／kgの野生型生理活性ポリペプチド（対照群）、及び前記実施例及び比較例で製造されたポリペプチド結合体（試験群）の各々を皮下注射した。対照群は０．５、１、２、４、６、１２、２４、３０及び４８時間後に血液試料を採取し、試験群は注射後１、６、１２、２４、３０、４８、７２、９６及び１２０時間後に血液試料を採取した。血液試料を、凝固防止のため、ヘパリンでコーティングされたチューブに集めた後、高速マイクロ遠心分離機で５分間遠心分離して細胞を除去した。血漿内タンパク質濃度は各々の生理活性ポリペプチドに特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００５２】
野生型タンパク質とポリペプチド結合体との薬物動態学グラフをの各々図２Ａ〜２Ｃに表し、Ｔ１／２（血液内薬物の半減期）は表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
表４に示したように、ジ−ＰＥＧ−ポリペプチド同種二量体結合体の各々の半減期は、野生型タンパク質より遥かに高く、比較例で製造された相応するモノ−ＰＥＧ−ポリペプチド結合体よりは約２倍ほど高かった。前記結果から分かるように、本発明のジ−ＰＥＧ−ポリペプチド同種二量体結合体が遥かに優れた生体内持続性（durability）を示すことが確認できた。
【００５５】
［試験例６］：ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の生体内活性測定
各群当り脳下垂体が除去された雄性スプラグ−ダウリラット（pituitary-removed Sprague Dawley rat、５週齢、ＳＬＣ、日本）５匹を用いた体重増加試験を通じてジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体及びモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨの生体内活性を測定した。溶媒対照群、野生型ｈＧＨ、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の各々を下記表５に記載された投与スケジュールと容量によって２６ケージ注射器（１ｍｌ、(株)韓国ワクチン）を用いてラットの肩背部に皮下注射した。ラットの体重を注射前及び注射してから１６時間後測定した。最終注射してから２４時間後、ラットをエーテル麻酔で致死させて肉眼で脳下垂体の残存有無を検査し、脳下垂体の残存物が観察されたラットは結果から除外させた。
【００５６】
【表５】
【００５７】
各試料の投与後、体重の変化を図３に示す。標準品（対照群）に用いられた野生型ｈＧＨは、その生体内活性を維持するために毎日投与が必要であるため、６日間毎日投与し、従ってグループ２のラットは投与期間の間体重が増加した。６日おきに一度モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨが投与されたグループ３のラットは、投与後３日目までは持続的に体重が増加したが、その以降は増加の趨勢が鈍化し、５日以後は減少した。一方、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体が６日おきに一度投与されたグループ４のラットはグループ３のラットより徐々に体重が増加したが、増加の趨勢はグループ２と同様であった。また、増加率は投与後５日が経過された後にも増加した。従って、本発明のジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体は、生理活性ポリペプチドの活性を維持しつつ延長された半減期を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明によって製造されたｈＧＨ同種二量体及びＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル写真である。
【図２Ａ】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の血中半減期をモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨと比較した薬物動態学グラフである。
【図２Ｂ】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体結合体の血中半減期をモノ−ＰＥＧ−ＩＦＮと比較した薬物動態学グラフである。
【図２Ｃ】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体の血中半減期をモノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦと比較した薬物動態学グラフである。
【図３】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の生体内活性をモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨと比較するために脳下垂体が除去されたラットを用いた体重増加試験結果を示す図表である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、延長された生体内半減期（in vivo half-life）を有するポリエチレングリコール（polyethylene glycol, PEG）によって生理活性ポリペプチド二分子が結合されてなる同種二量体（homodimer）及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、血液、肝又は腎臓で変性又は酵素的分解（enzymatic degradation）に敏感である。ポリペプチドのこのような低い安定性のため、活性成分の效果的な血漿濃度を維持するためには患者にあらかじめ指定された頻度でポリペプチド薬物を投与することが要求される。また、ポリペプチド薬物は、通常注入（infusion）によって投与されるので、この頻繁な注入は患者に相当な不便を招く。従って、高い薬理学的効果は維持しつつ血液内でより長い血中半減期を有するポリペプチド薬物を開発するため、多くの研究が行われてきた。このようなポリペプチド薬物は、また患者に投与された際、向上された血清安定性（serum stability）、高活性、多様なポリペプチドに対する適用性（applicability）及び好ましくない免疫反応を誘発する可能性が低いという要件を満たさなければならない。
【０００３】
ポリペプチドの安定性を向上させるため、一番幅広く用いられている方法の一つは、ポリペプチドがタンパク質分解酵素（protease）と接触することを防止するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような高溶解性高分子（highly soluble macromolecule）を用いて得られるポリペプチドの化学的変形（chemical modification）である。ポリペプチド薬物に特異的に或いは非特異的に結合した際、ＰＥＧがポリペプチド薬物の溶解度（solubility）を増加させ、前記薬物の加水分解（hydrolysis）を防止し、その結果、低い抗原性（antigenicity）によっていかなる免疫反応も誘発せずにポリペプチド薬物の血清安定性を増加させ得るということは公知である（Sada et al., J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71: 137-139）。しかし、ＰＥＧは、ポリペプチドの自由リジン残基（free lysine residue）と無作為に共有結合（covalent bond）を形成するため、ペギレート化されたポリペプチド（pegylated polypeptide）はＰＥＧの分子量が増加するほど低い活性を有する傾向がある。
【０００４】
ポリペプチドの活性を維持するため、ポリペプチドの特定部位を選択的にペギレート化させる方法が米国特許第５，７６６，８９７号及び第５，９８５，２６５号に開示されている。しかし、これらの方法は、生体内ポリペプチドの活性増加維持の面では全く効果がなかった。
【０００５】
従って、満足できる水準の活性と延長された生体内半減期とを有するポリペプチド結合体を開発する必要性が依然として要求されている状況である。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，７６６，８９７号
【特許文献２】米国特許第５，９８５，２６５号
【非特許文献１】Sada et al., J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71: 137-139
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、二分子の生理活性ポリペプチドを小さい分子量を有するＰＥＧリンカーによって連結させて同種二量体を製造し、大きな分子量を有するＰＥＧで前記同種二量体を修飾（modifying）してポリペプチドの生物学的活性の低下を最少化すると共に、前記ポリペプチドの生体内活性を延長するために生理活性ポリペプチドの生体内安定性は増加させた、ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するため、本発明は一分子のＰＥＧリンカーと二分子の生理活性ポリペプチドを含み、前記二分子の生理活性ポリペプチドが前記ＰＥＧリンカーによって連結され、二分子の生理活性ポリペプチドの各々が一分子のＰＥＧによって修飾されたＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によるＰＥＧ−生理活性ポリペプチドの同種二量体結合体は、ＰＥＧリンカーを用いて血中半減期の短い生理活性ポリペプチドの同種二量体を製造した後、さらに生理活性ポリペプチドのリジン残基のアミノ基をＰＥＧで修飾したもので、生理活性ポリペプチドの血中半減期を増加させて、生理活性を改善しながら、免疫反応を誘発するおそれがないため、徐放出性剤形の製造に有用に適用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の好ましい実施例に用いられ得る生理活性ポリペプチドとしては、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、１７番システインがセリンで置換されたアミノ酸配列を有する顆粒球コロニー刺激因子誘導体（１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ）、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、インシュリン、インターロイキン、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）などを含む。本発明が適用され得る生理活性ポリペプチドは前記に言及されたものに限定されなく、生体内半減期を増加させるのに有用なすべての生理活性ポリペプチドが包含され得る。
【００１２】
本発明の生理活性ポリペプチドは、哺乳動物から分離された野生型であるか、或いは化学的に合成し得る。また、前記ポリペプチドは、遺伝工学（genetic engineering）によって形質転換された原核細胞又は真核細胞から製造し得る。
【００１３】
本発明の好ましい実施様態では、同種二量体が水性媒質中で沈殿しないようにＰＥＧリンカーが親水性を帯びなければならない。また、前記ＰＥＧリンカーは、二分子の生理活性ポリペプチドのアミノ末端の各々に特異的に結合できるように両末端に反応基を有するものが好ましい。このようなＰＥＧリンカーの反応基としてはアルデヒド基（aldehyde group）又はプロピオン（propionic）アルデヒド基が適当である。
【００１４】
本発明の好ましい実施様態では、ＰＥＧリンカーの分子量が１〜１００ｋＤａの範囲のものが望ましく、２〜２０ｋＤａの範囲のものがより好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい実施様態では、ＰＥＧ分子が通常の水溶性ＰＥＧ分子であって、ＰＥＧの活性基によってポリペプチドのリジン残基、システイン残基又はヒスチジン残基のε−アミノ基に結合し得る。
【００１６】
本発明の好ましい実施様態では、二分子の生理活性ポリペプチドを修飾するために用いられるＰＥＧの分子量は１〜１００ｋＤａの範囲のものが望ましく、２０〜４０ｋＤａの範囲のものがより好ましい。
【００１７】
この修飾用のＰＥＧ分子の反応基は、マレイミド基（maleimide）又はスクシンアミド基（succinamide）であることが望ましく、スクシンアミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオネート（succinimidyl propionate）、スクシンイミジルカルボキシメチル（succinimidyl carboxymethyl）及びスクシンイミジルカルボネート（succinimidyl carbonate）を含む。
【００１８】
また、本発明に用いられるＰＥＧ分子は線型や分枝型であってもよく、分枝型ＰＥＧがより好ましい。
【００１９】
本発明の他の目的によって、本発明はさらに下記段階を含む、ＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体の製造方法を提供する：
ａ）ＰＥＧリンカーで二分子の生理活性ポリペプチドを連結させて同種二量体を製造する段階；及び
ｂ）一分子のＰＥＧで前記同種二量体の生理活性ポリペプチドの各々を修飾する（modifying）段階。
【００２０】
本発明の好ましい実施様態によれば、段階（ａ）で用いられたＰＥＧリンカーに対する生理活性ポリペプチドのモル比は１：０．２５〜１：１０の範囲のものが望ましく、１：０．５〜１：１がより好ましい。
【００２１】
本発明の好ましい実施例で、段階（ａ）はナトリウムシアノボロヒドリド（sodium cyanoborohydride, NaCNBH3）、水素化ホウ素ナトリウム（sodium borogydride）、ジメチルアミンホウ酸塩（dimethylamine borate）、トリメチルアミンホウ酸塩（trimethylamine borate）及びピリジンホウ酸塩（pyridine borate）からなる群から選択される還元剤の存在下で２〜１０℃範囲の温度で行われることが好ましい。
【００２２】
段階（ａ）が終決した後、これから形成されたポリペプチド同種二量体は、大きさ排除（size exclusion）クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーのようなタンパク質精製に有用な通常の方法のいずれかを用いて分離し得る。
【００２３】
段階（ｂ）で生理活性ポリペプチド同種二量体のＰＥＧ修飾（modification）が終決した後、これから形成された同種二量体結合体は大きさ排除クロマトグラフィーを用いて精製し得る。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を下記実施例によってより詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、これらに限定されない。
【００２５】
［実施例１］：ｈＧＨ同種二量体の製造及び精製
組替えｈＧＨは、韓国特許第３１６３４７号の方法によって製造され、本発明のｈＧＨは野生型（native form）である。前記で製造されたｈＧＨを１００ｍＭリン酸塩緩衝溶液に溶解させてｈＧＨ溶液５ｍｇ／ｍｌを用意した。ｈＧＨとＰＥＧリンカーを連結するために両末端にアルデヒド基を有し、分子量が３．４ｋＤａであるＰＥＧリンカー（Shearwater Inc., 米国）をｈＧＨ：ＰＥＧリンカーのモル比が１：０．５、１：１、１：２．５、１：５、１：１０又は１：２０に相応する量で前記ｈＧＨ溶液に各々添加した。これに還元剤であるナトリウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３）を最終濃度が２０ｍＭになるように添加した。反応溶液を４℃で３時間攪拌し、二つのｈＧＨ分子のアミノ末端の各々にＰＥＧリンカーが選択的に連結されたｈＧＨ同種二量体（ｈＧＨ−ＰＥＧリンカー−ｈＧＨ）を分離するためにスーパーデックス２００（Superdex 200, Pharmacia）を用いた大きさ排除クロマトグラフィーを行った。５０ｍＭナトリウムリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ８．０）を用いてｈＧＨ同種二量体を溶出し、未反応のｈＧＨ及びＰＥＧリンカーを除去した。同種二量体を得るためのｈＧＨ：ＰＥＧリンカーの最適モル比は１：０．５〜１：２の範囲であることを確認した。前記で得られたｈＧＨ同種二量体分画をアニオン交換樹脂カラムでさらに精製した。具体的に、ポリワックスＬＰカラム（PolyWAX LP, PolywaxInc., 米国）３ｍｌを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝溶液で平衡化させ、ｈＧＨ同種二量体分画を１ｍｌ／分の流速で前記カラムに点滴した後、前記カラムを５カラム体積（column volume）、即ちＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１５ｍｌで洗浄した。０〜１００％範囲の多様な濃度勾配で３０分以上１０カラム体積（３０ｍｌ）の１Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液を適用しつつ、塩濃度勾配方法によって一つのｈＧＨ分子が連結されたモノＰＥＧリンカーからｈＧＨ同種二量体を分離した。
【００２６】
［実施例２］：分枝型４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾されたｈＧＨ同種二量体の製造
分子量４０ｋＤａである分枝型Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル(N-hydroxysuccinimidyl)-PEG(NHS-PEG)(Shearwater Inc., 米国）を室温で２時間１００ｍＭナトリウムリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ８．０）上で、実施例１で精製されたｈＧＨ同種二量体のリジン残基と反応させた。同種二量体：ＮＨＳ−ＰＥＧのモル比は１：２、１：５、１：１０及び１：２０になるようにした。反応終了後、二つのｈＧＨ分子の各々が一分子のＮＨＳ−ＰＥＧで修飾されたジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体を精製するためにスーパーデックス大きさ排除クロマトグラフィーを行った。ＰＥＧが修飾されていないｈＧＨ同種二量体及びただ一分子のＮＨＳ−ＰＥＧが連結されたモノ−ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体を除去するためにリン酸塩緩衝食塩水を緩衝溶液として用いた。モノ−ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体産物の割合は、約６０％：４０％であった。これからジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体を得るためのＮＨＳ−ＰＥＧに対するｈＧＨ同種二量体の最適モル比は１：１０であることを確認した。
【００２７】
［実施例３］：分枝型４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾されたＩＦＮ同種二量体の製造
実施例１と同様な方法でＩＦＮ同種二量体（ＩＦＮ−ＰＥＧリンカー−ＩＦＮ）を製造し、実施例２と同様な方法でｈＧＨの代わりにＩＦＮを用いて前記ＩＦＮ同種二量体を分子量４０ｋＤａの分枝型ＮＨＳ−ＰＥＧ二分子で修飾した。モノ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体産物とジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体産物との割合は約６０％：４０％であった。
【００２８】
［実施例４］：分枝型４０ｋＤａ ＰＥＧで修飾されたＧ−ＣＳＦ同種二量体の製造
実施例１と同様な方法でＧ−ＣＳＦ同種二量体（Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧリンカー−Ｇ−ＣＳＦ）を製造し、実施例２と同様な方法でｈＧＨの代わりにＧ−ＣＳＦを用いて前記Ｇ−ＣＳＦ同種二量体を分子量４０ｋＤａである分枝型ＮＨＳ−ＰＥＧ二分子で修飾した。モノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体産物とジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体産物との割合は約６０％：４０％であった。
【００２９】
［比較例１］：分枝型ＰＥＧで修飾されたｈＧＨモノマーの製造
ｈＧＨをリン酸塩緩衝溶液１００ｍＭに溶解させてｈＧＨ溶液１ｍｇ／ｍｌを三つ用意した後、分子量４０ｋＤａの分枝型メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（Shearwater Inc., 米国）をｈＧＨ：ＰＥＧのモル比が１：４になるように前記溶液に添加した。前記反応溶液にナトリウムシアノボロヒドリド（NaCNBH3, Sigma）を最終濃度２０ｍＭになるように添加した後、４℃で１８時間徐々に攪拌させながら反応させた。ｈＧＨのアミノ末端に一つのＰＥＧ分子が修飾されたモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨを分離するためにアニオン交換クロマトグラフィーを行った。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝溶液で平衡化されたポリワックスＬＰ（PolyWAX LP、Polywax Inc., 米国）カラムにペギレート化された反応混合物を点滴した後、１ｍｌ／分の流速で溶出し、５カラム体積（１５ｍｌ）の同一な緩衝溶液で前記カラムを洗浄した。その後、０から１００％まで濃度勾配を自動的に変化させて３０分以上１０カラム体積（３０ｍｌ）の１Ｍ ＮａＣｌ緩衝溶液を適用させながら塩濃度勾配方法によってトリ−、ジ−及びモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ分画を反応物から分離した。
【００３０】
モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ分画を濃縮し、１０ｍＭリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．０）で平衡化させたスーパーデックス２００（Superdex 200、Pharmacia、米国）大きさ排除クロマトグラフィーに点滴した後、同一な緩衝溶液を用いて１ｍｌ／分の流速で溶出した。モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨより相対的に早く溶出されたトリ−及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨを除去してモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨのみを得た。
【００３１】
［比較例２及び３］：分枝型ＰＥＧで修飾されたＩＦＮ及びＧ−ＣＳＦモノマーの製造
ｈＧＨの代わりにＩＦＮ（比較例２）及びＧ−ＣＳＦ（比較例３）の各々を用いて前記比較例１と同様な方法で分枝型ＰＥＧが修飾されたＩＦＮと分枝型ＰＥＧが修飾されたＧ−ＣＳＦを製造して分離した。
【００３２】
［試験例１］：ＰＥＧ結合体の確認及び定量
前記実施例で製造されたポリペプチド結合体を各々の濃度及び純度をクマシー（Coomassie）染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び大きさ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し、この際、前記濃度はベール・ランバートの法則（Beer-Lambert law）によって２８０ｎｍで測定した（Bollag et al., Protein Methods Chapter 3, press in Wiley-Liss）。
【００３３】
ｈＧＨ同種二量体の見掛分子量は約４８ｋＤａであり、ＩＦＮ同種二量体及びＧ−ＣＳＦ同種二量体の見掛分子量もこれと同様であった。分子量４０ｋＤａのＰＥＧ分子一つが修飾された際、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体の見掛分子量は１５０ｋＤａであり；分子量４０ｋＤａのＰＥＧ分子二つで修飾された際、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の見掛分子量は２４０ｋＤａであった。なお、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨの分子量は約１２０ｋＤａであり、ＩＦＮ及びＧ−ＣＳＦの分子量も同様であった。
【００３４】
図１はｈＧＨ（レイン１）、ｈＧＨ同種二量体（レイン２）及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体（レイン４）の各々から得たＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レイン３は標準分子量タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ、下から４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１６０及び２２０ｋＤａを意味するベンチマーカー）を示す。図１に示すように、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の見掛分子量は約２４０ｋＤａであり、前記結合体は単一バンドとして現れて非常に高い純度を有していることが分かる。
【００３５】
［試験例２］：ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の試験管内（in vitro）活性測定
ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体（実施例２）及びモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ（比較例１）の試験管内活性度をｈＧＨ依存性有糸分裂を経るラットノードリンパ腫（Rat node lymphoma）細胞株であるＮｂ２（European Collection of Cell Cultures, ECCC#97041101）を用いて測定した。
【００３６】
Ｎｂ２細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．０７５％のＮａＣＯ３、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び２ｍＭグルタミンが調整されたフィッシャー培地（Fisher’s medium）で培養した。前記細胞を１０％牛胎児血清が添加されていない同一な培地で２４時間さらに培養した。ウェル当たり約２×１０４細胞を９６−ウェルプレートの各ウェルに添加した後、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体とモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ、野生型ｈＧＨ及び対照群（National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC）の多様な希釈液を各ウェルに添加し、前記プレートを４８時間３７℃、ＣＯ２培養器で培養した。細胞成長程度（各ウェルに存在する細胞数）を測定するため、細胞力価９６アクアスワン溶液（cell titer 96 Aqueous One Solution; Promega, 米国）２５μｌを各ウェルに添加して４時間培養した。４９０ｎｍで吸光度を測定して各試料の力価を計算し、その計算された力価を下記表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
前記表１から分かるように、ＰＥＧ修飾されたｈＧＨの試験管内活性は修飾されていないｈＧＨより低かった。
【００３９】
［試験例３］：ジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体結合体の試験管内活性測定
ジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体結合体（実施例３）及びモノ−ＰＥＧ−ＩＦＮ（比較例２）の試験管内活性を水胞性口炎ウイルス（vesicular stomatitis virus, VSV）で飽和させたマジン−ダービ牛腎臓細胞（Madin-Darby bovine kidney cells, MDBK cells;ATCC CCL-22）を用いた細胞培養生検方法（cell culture biopsy method）で測定した。ＰＥＧが修飾されていないＩＦＮ α ２ｂ（ＮＩＢＳＣ ＩＦＮ）を対照群として用いた。
【００４０】
ＭＤＢＫ細胞を１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加されたＭＥＭ（minimum essential medium, JBI）で３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。試料と対照群（ＮＩＢＳＣインターフェロン）を同一な細胞培養培地を用いて一定濃度に希釈し、各々の希釈液を１００μｌずつ９６−ウェルプレートに分注した。１００μｌの培養された細胞溶液を各ウェルに添加し、前記細胞を３７℃、５％ＣＯ２培養器で約１時間培養した。１時間後、５〜７×１０３ＰＦＵのウイルス濃度を有するＶＳＶ５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１６〜２０時間さらに培養した。試料又は対照群を添加せずに細胞とウイルスのみを含むウェルを陰性対照群として、ウイルスを添加せずに細胞のみを含むウェルを陽性対照群として用いた。
【００４１】
培養培地を除去して生きている細胞を染色するために、１００μｌのニュートラルレッド（neutral red）溶液を各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。吸込み（aspirating）によって上澄液を除去した後、抽出溶液（１００％エタノールと１％アセテートとの混合物１００μｌ（１：１））を各ウェルに添加した。染色された細胞をよく振って前記抽出溶液に溶解させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。最大細胞成長の５０％を表すＥＤ５０を陰性対照群の細胞成長に対して陽性対照群の細胞成長を１００％とみなして計算した。
【００４２】
【表２】
【００４３】
前記表２から分かるように、ＰＥＧ修飾されたＩＦＮの試験管内活性は修飾されていないＩＦＮに比べて低かった。
【００４４】
［試験例４］：ジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体の試験管内活性測定
ジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体（実施例４）及びモノ−ＰＥＧ−Ｃ−ＣＳＦ（比較例３）の試験管内活性を次のように測定した。
【００４５】
まず、ヒト骨髄（myelogenous）由来細胞、HL-60(ATCC CCL-240, Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female）細胞を１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養し、細胞数を約２．２×１０５細胞／ｍｌになるように調整した。これにＤＭＳＯ（dimethylsulfoxide, culture grade, SIGMA）を濃度が１．２５％（ｖ／ｖ）になるように添加した。ウェル当たり約２×１０４個の浮遊細胞を含むＤＭＳＯ処理された培養液９０μｌを９６−ウェルプレート（Corning/low evaporation 96 well plate）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で約４８時間培養した。
【００４６】
試料と対照群（ＮＩＢＳＣ Ｇ−ＣＳＦ）を最終濃度が５００ｎｇ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ １６４０培地を用いて適切な割合で希釈し、これから得た溶液を同一な培地で二倍ずつ連続的に１０回希釈した。
【００４７】
このように用意された各々の試料１０μｌを培養中のＨＬ−６０細胞株が含まれた各ウェルに添加し、濃度を５０ｎｇ／ｍｌから連続的に半減させた。試料が処理されたマイクロプレートを３７℃培養器で４８時間さらに培養した。
【００４８】
培養後、細胞成長程度を調査するため、細胞数をCellTiter96TM(Promega, USA)を用いて６７０ｎｍで吸光度を測定して決定した。
【００４９】
【表３】
【００５０】
前記表３から分かるように、ＰＥＧ修飾されたＧ−ＣＳＦの試験管内活性は修飾されていないＧ−ＣＳＦより低かった。しかし、ｈＧＨ及びＩＦＮの試験管内活性とは異なって、本発明のジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体の野生型Ｇ−ＣＳＦに対する相対的活性は、モノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦより約４倍高く表れた。このような結果は、本発明のジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体がＧ−ＣＳＦ同種二量体の形成に起因して高い生体内活性を発揮することを示す。
【００５１】
［試験例５］：薬物動態学分析
各群当り５匹のスプラグ−ダウリ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＳＤ）ラットを下記実験で用いた。前記マウスに１００μｇ／kgの野生型生理活性ポリペプチド（対照群）、及び前記実施例及び比較例で製造されたポリペプチド結合体（試験群）の各々を皮下注射した。対照群は０．５、１、２、４、６、１２、２４、３０及び４８時間後に血液試料を採取し、試験群は注射後１、６、１２、２４、３０、４８、７２、９６及び１２０時間後に血液試料を採取した。血液試料を、凝固防止のため、ヘパリンでコーティングされたチューブに集めた後、高速マイクロ遠心分離機で５分間遠心分離して細胞を除去した。血漿内タンパク質濃度は各々の生理活性ポリペプチドに特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００５２】
野生型タンパク質とポリペプチド結合体との薬物動態学グラフをの各々図２Ａ〜２Ｃに表し、Ｔ１／２（血液内薬物の半減期）は表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
表４に示したように、ジ−ＰＥＧ−ポリペプチド同種二量体結合体の各々の半減期は、野生型タンパク質より遥かに高く、比較例で製造された相応するモノ−ＰＥＧ−ポリペプチド結合体よりは約２倍ほど高かった。前記結果から分かるように、本発明のジ−ＰＥＧ−ポリペプチド同種二量体結合体が遥かに優れた生体内持続性（durability）を示すことが確認できた。
【００５５】
［試験例６］：ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の生体内活性測定
各群当り脳下垂体が除去された雄性スプラグ−ダウリラット（pituitary-removed Sprague Dawley rat、５週齢、ＳＬＣ、日本）５匹を用いた体重増加試験を通じてジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体及びモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨの生体内活性を測定した。溶媒対照群、野生型ｈＧＨ、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ及びジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の各々を下記表５に記載された投与スケジュールと容量によって２６ケージ注射器（１ｍｌ、(株)韓国ワクチン）を用いてラットの肩背部に皮下注射した。ラットの体重を注射前及び注射してから１６時間後測定した。最終注射してから２４時間後、ラットをエーテル麻酔で致死させて肉眼で脳下垂体の残存有無を検査し、脳下垂体の残存物が観察されたラットは結果から除外させた。
【００５６】
【表５】
【００５７】
各試料の投与後、体重の変化を図３に示す。標準品（対照群）に用いられた野生型ｈＧＨは、その生体内活性を維持するために毎日投与が必要であるため、６日間毎日投与し、従ってグループ２のラットは投与期間の間体重が増加した。６日おきに一度モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨが投与されたグループ３のラットは、投与後３日目までは持続的に体重が増加したが、その以降は増加の趨勢が鈍化し、５日以後は減少した。一方、ジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体が６日おきに一度投与されたグループ４のラットはグループ３のラットより徐々に体重が増加したが、増加の趨勢はグループ２と同様であった。また、増加率は投与後５日が経過された後にも増加した。従って、本発明のジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体は、生理活性ポリペプチドの活性を維持しつつ延長された半減期を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明によって製造されたｈＧＨ同種二量体及びＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル写真である。
【図２Ａ】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の血中半減期をモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨと比較した薬物動態学グラフである。
【図２Ｂ】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−ＩＦＮ同種二量体結合体の血中半減期をモノ−ＰＥＧ−ＩＦＮと比較した薬物動態学グラフである。
【図２Ｃ】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ同種二量体結合体の血中半減期をモノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦと比較した薬物動態学グラフである。
【図３】本発明によって製造されたジ−ＰＥＧ−ｈＧＨ同種二量体結合体の生体内活性をモノ−ＰＥＧ−ｈＧＨと比較するために脳下垂体が除去されたラットを用いた体重増加試験結果を示す図表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（polyethylene glycol, PEG）リンカーと二分子の生理活性ポリペプチドを含み、前記二分子の生理活性ポリペプチドが前記ＰＥＧリンカーによって連結され、前記二分子の生理活性ポリペプチドの各々が一分子のＰＥＧで修飾されたＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体。
【請求項２】
前記二分子の生理活性ポリペプチドのアミノ末端が、各々ＰＥＧリンカーによって連結されることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記生理活性ポリペプチドのリジン残基のアミノ基が、一分子のＰＥＧで修飾されることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、１７番システインがセリンで置換されたアミノ酸配列を有する顆粒球コロニー刺激因子誘導体、赤血球生成因子、インシュリン、インターロイキン、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子及び腫瘍壊死因子受容体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
前記ＰＥＧリンカーが、両末端にアルデヒド基又はプロピオンアルデヒド基を有することを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
前記ＰＥＧリンカーの分子量が、１〜１００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
前記ＰＥＧリンカーの分子量が、２〜２０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項６に記載の結合体。
【請求項８】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧが、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルカルボネート及びマレイミド（maleimide）からなる群から選択される反応基を一方の末端に有することを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項９】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧが、線形又は分枝型であることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項１０】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧの分子量が、１〜１００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項１１】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧの分子量が、２０〜４０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
下記段階を含む、ＰＥＧ−ポリペプチド同種二量体結合体の製造方法：
（ａ）ＰＥＧリンカーで二分子の生理活性ポリペプチドを連結させて同種二量体を形成する段階；及び
（ｂ）一分子のＰＥＧで前記同種二量体の生理活性ポリペプチドの各々を修飾する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）段階。
【請求項１】
ポリエチレングリコール（polyethylene glycol, PEG）リンカーと二分子の生理活性ポリペプチドを含み、前記二分子の生理活性ポリペプチドが前記ＰＥＧリンカーによって連結され、前記二分子の生理活性ポリペプチドの各々が一分子のＰＥＧで修飾されたＰＥＧ−生理活性ポリペプチド同種二量体結合体。
【請求項２】
前記二分子の生理活性ポリペプチドのアミノ末端が、各々ＰＥＧリンカーによって連結されることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記生理活性ポリペプチドのリジン残基のアミノ基が、一分子のＰＥＧで修飾されることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、１７番システインがセリンで置換されたアミノ酸配列を有する顆粒球コロニー刺激因子誘導体、赤血球生成因子、インシュリン、インターロイキン、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子及び腫瘍壊死因子受容体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
前記ＰＥＧリンカーが、両末端にアルデヒド基又はプロピオンアルデヒド基を有することを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
前記ＰＥＧリンカーの分子量が、１〜１００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
前記ＰＥＧリンカーの分子量が、２〜２０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項６に記載の結合体。
【請求項８】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧが、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルカルボネート及びマレイミド（maleimide）からなる群から選択される反応基を一方の末端に有することを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項９】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧが、線形又は分枝型であることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項１０】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧの分子量が、１〜１００ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の結合体。
【請求項１１】
前記生理活性ポリペプチドを修飾するためのＰＥＧの分子量が、２０〜４０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１０に記載の結合体。
【請求項１２】
下記段階を含む、ＰＥＧ−ポリペプチド同種二量体結合体の製造方法：
（ａ）ＰＥＧリンカーで二分子の生理活性ポリペプチドを連結させて同種二量体を形成する段階；及び
（ｂ）一分子のＰＥＧで前記同種二量体の生理活性ポリペプチドの各々を修飾する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）段階。
【図１】
【図３】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２８３４７（Ｐ２００７−５２８３４７Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００６６９（Ｐ２００６−５００６６９）
【出願日】平成１６年４月３日（２００４．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７７３９
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月３日（２００４．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００７８１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７７３９
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５９９１３９５３４）ハンミ ファーム． シーオー．， エルティーディー． (56)
【Ｆターム（参考）】
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