弱毒ＨＣＭＶ及びそのワクチンとしての使用
【課題】ワクチンとして有用な弱毒ヒトサイトメガロウイルスを提供すること。
【解決手段】ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７又は９５遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の１つ若しくは複数からの産生が低下又は消失している、弱毒ＨＣＭＶ。
【解決手段】ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７又は９５遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の１つ若しくは複数からの産生が低下又は消失している、弱毒ＨＣＭＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）及びそのワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ベータヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。そのウイルスゲノムは２４０，０００ｂｐを有し、少なくとも１５０個の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（９、５６）。ＨＣＭＶによる感染は多くの個体で生じるが、通常は無症候性である。このウイルスは免疫抑制条件下で再活性化し、肺炎、肝炎、腎炎、及び消化器疾患の病原となる。このウイルスは、線維芽細胞、上皮細胞及び内皮細胞などの最終的に分化した細胞、ならびに単球由来マクロファージにおいて、産生的に複製される（１１、１２、１８、２７、４０、４１、４７）。
【０００３】
産生的複製の間、ＨＣＭＶ遺伝子群は、前初期（ＩＥ）、初期及び後期と呼ばれる一時的カスケードで発現される。主要ＩＥ遺伝子群（ＭＩＥ）であるＵＬ１２３／１２２（ＩＥ１／ＩＥ２）は、その後のウイルス遺伝子発現及びウイルス複製の効率において決定的な役割を果たす（１９、２０、２３、３２−３４）。初期ウイルス遺伝子はウイルスＤＮＡ複製に必要なタンパク質をコードする（３５）。ウイルスＤＮＡ複製に続いて、遅延初期及び後期ウイルス遺伝子が発現され、これらはウイルス粒子のための構造タンパク質をコードする。これに関連して、ＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を有し、これによってウイルス複製が不能ではないが抑制されている弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルスが特許文献１に開示されている。
【０００４】
真性後期（true late）（γ−２クラス）ウイルス遺伝子の発現は、ウイルスＤＮＡ合成の阻害により妨げられる。ＵＬ７５（ｇＨ）及びＵＬ９９（ｐｐ２８）は、真性後期転写産物によりコードされるＨＣＭＶ遺伝子の２つの例である（２５、３１、５２）。ＨＣＭＶ前初期遺伝子及び初期遺伝子発現の制御は集中的に研究されてきているが、後期遺伝子発現を制御する特異的メカニズムについてはほとんど知られていない。
【０００５】
ＨＣＭＶでは、ＩＥ２タンパク質は感染後初期の微小フォーカス（microfoci）中に見出すことができ、直接的なＤＮＡ接触により親ウイルスゲノムと会合している。一部の微小フォーカスは拡大して、感染後の後期に複製コンパートメント（ＲＣ）を形成する（４２）。しかしながら、ＨＣＭＶのＩＥ遺伝子群単独では真性後期ウイルス遺伝子の活性化に十分ではない。どのＨＣＭＶ初期遺伝子が後期遺伝子発現に必要とされるのかは知られていない。
【０００６】
マウスガンマヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ−６８）のＯＲＦ１８、２４、３０及び３４は、後期遺伝子転写に必須である（３、５３、５４）。これらの不存在が初期ウイルス遺伝子発現又はＤＮＡ複製にほとんど影響を及ぼさないことから、これらの遺伝子産物は、後期遺伝子のプロモーターを刺激するために特異的に機能すると考えられる。したがって、後期遺伝子発現は、ウイルスＤＮＡ複製のみならず、それらのウイルスによりコードされるトランス作用性因子にも依存している。
【０００７】
ＤＮＡポリメラーゼ進行因子（DNA polymerase processivity factor）（ＵＬ４４）及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）（ＵＬ５７）をはじめとするＨＣＭＶウイルスＤＮＡ複製タンパク質群は、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ＲＣに似た大型の核構造中に局在する（３６、３８）。ＨＳＶ感染細胞では、ウイルスＤＮＡ合成を阻害剤ホスホノ酢酸（ＰＡＡ）で阻害した場合、ウイルスによりコードされるＳＳＢ（ＩＣＰ８）タンパク質を含有する小型のウイルス前複製部位又はフォーカスが観察される（６、２９、３７）。ＰＡＡの不存在下では、ＢｒｄＵがウイルスＤＮＡに取り込まれて、ＤＮＡは子ウイルスと共存して見出される（７、５７）。ＨＣＭＶでは、ＵＬ４４タンパク質は、感染後初期の段階では、ＳＳＢ（ＵＬ５７）タンパク質含有フォーカスと常に共存しているわけではない（３６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−０９２８５４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dunn, W., C. Chou, H. Li, R. Hai, D. Patterson, V. Stolc, H. Zhu, and F. Liu. 2003. Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:14223-14228. （文献９）
【非特許文献２】Yu, D., M. C. Silva, and T. Shenk. 2003. Functional map of human cytomegalovirus AD169 defined by global mutational analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:12396-12401. （文献５６）
【非特許文献３】Fish, K. N., W. Britt, and J. A. Nelson. 1996. A novel mechanism for persistence of human cytomegalovirus in macrophages. J. Virol. 70:1855-1862. （文献１１）
【非特許文献４】Fish, K. N., A. S. Depto, A. V. Moses, W. Britt, and J. A. Nelson. 1995. Growth kinetics of human cytomegalovirus are altered in monocyte-derived macrophages. J. Virol. 69:3737-3743. （文献１２）
【非特許文献５】Ibanez, C. E., R. Schrier, P. Ghazal, C. Wiley, and J. A. Nelson. 1991. Human cytomegalovirus productively infects primary differentiated macrophages. J. Virol. 65:6581-6588. （文献１８）
【非特許文献６】Lathey, J. L., and S. A. Spector. 1991. Unrestricted replication of human cytomegalovirus in hydrocortisone-treated macrophages. J. Virol. 65:6371-6375. （文献２７）
【非特許文献７】Sinzger, C., A. Grefte, B. Plachter, A. S. H. Gouw, T. Hauw The, and G. Jahn. 1995. Fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, and smooth muscle cells are the major targets of human cytomegalovirus infection in lung and gastrointestinal tissues. J. Gen. Virol. 76:741-750. （文献４０）
【非特許文献８】Sinzger, C., B. Plachter, A. Grefte, A. S. H. Gouw, T. H. The, and G. Jahn. 1996. Tissue macrophages are infected by human cytomegalovirus. J. Infect. Dis. 173:240-245. （文献４１）
【非特許文献９】Taylor-Wiedeman, J., J. G. Sissons, L. K. Borysiewicz, and J. H. Sinclair. 1991. Monocytes are a major site of persistence of human cytomegalovirus in peripheral blood mononuclear cells. J. Gen. Virol. 72:2059-2064. （文献４７）
【非特許文献１０】Isomura, H., and M. F. Stinski. 2003. The human cytomegalovirus major immediate-early enhancer determines the efficiency of immediate-early gene transcription and viral replication in permissive cells at low multiplicity of infection. J. Virol. 77:3602-3614. （文献１９）
【非特許文献１１】Isomura, H., M. F. Stinski, A. Kudoh, T. Daikoku, N. Shirata, and T. Tsurumi. 2005. Two Sp1/Sp3 binding sites in the major immediate-early proximal enhancer of human cytomegalovirus have a significant role in viral replication. J. Virol. 79:9597-9607. （文献２０）
【非特許文献１２】Isomura, H., T. Tsurumi, and M. F. Stinski. 2004. Role of the proximal enhancer of the major immediate-early promoter in human cytomegalovirus replication. J. Virol. 78:12788-12799. （文献２３）
【非特許文献１３】Meier, J. L., M. J. Keller, and J. J. McCoy. 2002. Requirement of multiple cis-acting elements in the human cytomegalovirus major immediate-early distal enhancer for viral gene expression and replication. J. Virol. 76:313-326. （文献３２）
【非特許文献１４】Meier, J. L., and J. A. Pruessner. 2000. The human cytomegalovirus major immediate-early distal enhancer region is required for efficient viral replication and immediate-early gene expression. J. Virol. 74:1602-1613. （文献３３）
【非特許文献１５】Meier, J. L., and M. F. Stinski. 1997. Effect of a modulator deletion on transcription of the human cytomegalovirus major immediate-early genes in infected undifferentiated and differentiated cells. J. Virol. 71:1246-1255. （文献３４）
【非特許文献１６】Pari, G. S., and D. G. Anders. 1993. Eleven loci encoding trans-acting factors are required for transient complementation of human cytomegalovirus oriLyt-dependent DNA replication. J. Virol. 67:6979-6988. （文献３５）
【非特許文献１７】Kohler, C. P., J. A. Kerry, M. Carter, V. P. Muzithras, T. R. Jones, and R. M. Stenberg. 1994. Use of recombinant virus to assess human cytomegalovirus early and late promoters in the context of the viral genome. J. Virol. 68:6589-6597. （文献２５）
【非特許文献１８】McWatters, B. J., R. M. Stenberg, and J. A. Kerry. 2002. Characterization of the human cytomegalovirus UL75 (glycoprotein H) late gene promoter. Virology. 303:309-316. （文献３１）
【非特許文献１９】Winkler, M., S. A. Rice, and T. Stamminger. 1994. UL69 of human cytomegalovirus, an open reading frame with homology to ICP27 of herpes simplex virus, encodes a transactivator of gene expression. J. Virol. 68:3943-3954. （文献５２）
【非特許文献２０】Sourvinos, G., N. Tavalai, A. Berndt, D. A. Spandidos, and T. Stamminger. 2007. Recruitment of human cytomegalovirus immediate-early 2 protein onto parental viral genomes in association with ND10 in live-infected cells. J. Virol. 81:10123-10136. （文献４２）
【非特許文献２１】Arumugaswami, V., T. T. Wu, D. Martinez-Guzman, Q. Jia, H. Deng, N. Reyes, and R. Sun. 2006. ORF18 is a transfactor that is essential for late gene transcription of a gammaherpesvirus. J. Virol. 80:9730-9740. （文献３）
【非特許文献２２】Wong, E., T. T. Wu, N. Reyes, H. Deng, and R. Sun. 2007. Murine gammaherpesvirus 68 open reading frame 24 is required for late gene expression after DNA replication. J. Virol. 81:6761-6764. （文献５３）
【非特許文献２３】Wu, T. T., T. Park, H. Kim, T. Tran, L. Tong, D. Martinez-Guzman, N. Reyes, H. Deng, and R. Sun. 2009. ORF30 and ORF34 are essential for expression of late genes in murine gammaherpesvirus 68. J. Virol. 83:2265-2273. （文献５４）
【非特許文献２４】Penfold, M. E., and E. S. Mocarski. 1997. Formation of cytomegalovirus DNA replication compartments defined by localization of viral proteins and DNA synthesis. Virology 239:46-61. （文献３６）
【非特許文献２５】Sarisky, R. T., and G. S. Hayward. 1996. Evidence that the UL84 gene product of human cytomegalvorus is essential for promoting oriLyt-dependent DNA replication and formation of replication compartments in cotransfection assays. J. Virol. 70:7398-7413. （文献３８）
【非特許文献２６】de Bruyn Kops, A., and D. M. Knipe. 1988. Formation of DNA replication structures in herpes virus-infected cells requires a viral DNA binding protein. Cell 55:857-868. （文献６）
【非特許文献２７】Lukonis, C. J., and S. K. Weller. 1996. Characterization of nuclear structures in cells infected with herpes simplex virus type 1 in the absence of viral DNA replication. J. Virol. 70:1751-1758. （文献２９）
【非特許文献２８】Quinlan, M. P., L. B. Chen, and D. M. Knipe. 1984. The intranuclear location of a herpes simplex virus DNA-binding protein is determined by the status of viral DNA replication. Cell 36:857-868. （文献３７）
【非特許文献２９】de Bruyn Kops, A., and D. M. Knipe. 1994. Preexisting nuclear architecture defines the intranuclear location of herpesvirus DNA replication structures. J. Virol. 68:3512-3526. （文献７）
【非特許文献３０】Zhong, L., and G. S. Hayward. 1997. Assembly of complete, functionally active herpes simplex virus DNA replication compartments and recruitment of associated viral and cellular proteins in transient cotransfection assays. J. Virol. 71:3146-3160. （文献５７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書において、本発明者らは、ＨＣＭＶのＯＲＦであるＵＬ７９、８７及び９５が、後期ウイルスｍＲＮＡ及び感染性ウイルス産生に必須であるが、ウイルスＤＮＡ複製には必須ではないことを示す。ＵＬ８７タンパク質とＵＬ９５タンパク質はウイルスＤＮＡ複製の前にウイルスゲノムと組み立てられて、ウイルスのＵＬ４４タンパク質及びＵＬ１２２（ＩＥ２）タンパク質ならびに細胞の転写因子ＴＢＰを含む微小フォーカスを形成することが明らかとなった。ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦに突然変異を導入することにより、ＨＣＭＶの弱毒ウイルスを作製することを本発明の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７及び９５タンパク質が、感染性ウイルス増殖には必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされないこと、真性後期ウイルスｍＲＮＡの産生に必須であることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５遺伝子ＯＲＦを突然変異させた弱毒ＨＣＭＶを作製し、本発明を完成させた。
【００１２】
具体的には、本発明は、以下の特徴を有する。
〔１〕ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７又は９５遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の１つ若しくは複数からの発現が低下又は消失している、弱毒ＨＣＭＶ。
〔２〕前記突然変異が、ＯＲＦ中への塩基の挿入によるものである、上記〔１〕に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
〔３〕前記弱毒ＨＣＭＶからの感染性ウイルス増殖は野生型ウイルスと比較して低下しているが、ウイルスＤＮＡ複製は野生型ウイルスと同等である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
〔４〕後期ウイルスｍＲＮＡの発現が野生型ウイルスと比較して低下している、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の弱毒ＨＣＭＶ。
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の弱毒ＨＣＭＶを有効成分として含む、ＨＣＭＶ感染の予防又は治療用ワクチン。
〔６〕アジュバントをさらに含む、上記〔５〕に記載のワクチン。
〔７〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の弱毒ＨＣＭＶ又は上記〔５〕若しくは〔６〕に記載のワクチンを非ヒト動物に免疫して抗体を作製するステップ、及び該抗体を回収するステップを含む、抗ＨＣＭＶ抗体の作製方法。
〔８〕前記抗体がヒト抗体である、上記〔７〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、ウイルス複製が抑制された弱毒化ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を提供することができ、該弱毒化ウイルスは、ワクチンとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡの構造を示す図である。（ａ）ｗｔ（野生型）、ＲｄｌＵＬ７９＋Ｆ、ＲｄｌＵＬ８７＋Ｆ及びＲｄｌＵＬ９５＋Ｆの組み換えＢＡＣ ＤＮＡを示す模式図である。ＯＲＦに突然変異を有する組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを構築する場合、ＦＲＴ配列をＯＲＦの中央部に挿入し、次いでＦＬＰ媒介組み換えによりＫａｎＲを切り出し、３４ｂｐのＦＲＴ配列のみを残した。（ｂ）ＵＬ９５及びＵＬ８７ＯＲＦに融合したエピトープを含む組み換えＢＡＣ ＤＮＡの模式図である。ＵＬ９５ＯＲＦと融合したＨＡエピトープを挿入する場合、逆選択を行なって薬剤耐性カセットを除去した。ＢＡＣＵＬ９５Ｎｎｅｏ＋Ｓｔ又はＢＡＣＵＬ９５Ｃｎｅｏ＋Ｓｔの構築のために、ＲｐｓＬ遺伝子（ストレプトマイシンに対する感受性を増大させる）及びネオマイシン耐性マーカー（カナマイシン耐性を付与するため）を含有するマーカーカセットをそれぞれＵＬ９５ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端に挿入した。中間体ＢＡＣクローンはカナマイシン耐性に基づいて単離した。相同組み換えの第２ラウンドでは、マーカーカセット全体をオリゴヌクレオチドを用いたカウンター選択によりＨＡエピトープを含む配列と置き換えた。ＵＬ８７ＯＲＦのＣ末端に融合したｍｙｃエピトープを含む組み換えＢＡＣを構築するために、ＢＡＣＨＡＵＬ９５及びＢＡＣＵＬ９５ＨＡの構築後に逆選択を繰り返した。（ｃ）ｗｔ（親ウイルス）及び組み換えＢＡＣのＰＣＲ分析を示す。ＰＣＲ産物は表２に示されるプライマーを用いて増幅し、３．０％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、配列決定した。レーン１、２、５、６及び９：ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ；レーン３、４、７、８及び１０：ＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ；レーン１１：ｗｔ。
【図２】ＵＬ７９、８７及び９５がウイルス増殖に必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされないことを示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩでウイルスを感染させた。ウイルス力価は５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより決定した。（ａ〜ｃ）ウイルス増殖曲線を示す。（ｄ〜ｆ）ウイルスＤＮＡ複製を示す。ウイルスＤＮＡはｇＢプライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲにより定量化した。１８Ｓプライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲも、内部対照として用いるために行なった。データは３回の独立した実験の平均である。（ａ）及び（ｄ）：ＲｄｌＵＬ７９；（ｂ）及び（ｅ）：ＲｄｌＩＬ８７；（ｃ）及び（ｆ）：ＲｄｌＵＬ９５。
【図３ａ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ａ〜ｃ）ＩＥ１（左パネル）、ＵＬ７５（ｇＨ）（中央パネル）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）（右パネル）についてのノザンブロットである。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡをＲＮＡロード量の等量の対照として用いた。（ａ）ＲｄｌＵＬ７９感染細胞。レーン１、３及び５：ＨＦＦ細胞；レーン２、４及び６：ＵＬ７９融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞；レーン１及び２：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン３及び４：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン５及び６：３ｄ．ｐ．ｉ．。
【図３ｂ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ａ〜ｃ）ＩＥ１（左パネル）、ＵＬ７５（ｇＨ）（中央パネル）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）（右パネル）についてのノザンブロットである。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡをＲＮＡロード量の等量の対照として用いた。（ｂ）ＲｄｌＵＬ８７感染細胞。ＵＬ８７融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞；レーン１及び２：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン３及び４：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン５及び６：３ｄ．ｐ．ｉ．；レーン７及び８：ＰＡＡの存在下での２ｄ．ｐ．ｉ．。
【図３ｃ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ａ〜ｃ）ＩＥ１（左パネル）、ＵＬ７５（ｇＨ）（中央パネル）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）（右パネル）についてのノザンブロットである。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡをＲＮＡロード量の等量の対照として用いた。（ｃ）ＲｄｌＵＬ９５感染細胞。ＵＬ９５融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞。レーン１及び２：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン３及び４：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン５及び６：ＰＡＡの存在下での２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン７及び８：３ｄ．ｐ．ｉ．。
【図３ｄ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ｄ）ＵＬ４４転写産物についてのＲＮａｓｅ保護アッセイ。３ＭＯＩでのＲｄｌＵＬ７９感染後１、２及び３日に細胞質ＲＮＡを回収した。２０μｇのＲＮＡを３２Ｐ標識アンチセンスＵＬ４４プロモータープローブと３７℃で一晩ハイブリダイズさせ、続いてＲＮａｓｅＴ１で消化した。アンチセンスＵＬ４４プローブはすべてのＵＬ４４転写産物の転写開始部位の上流配列を含んでいる。保護されたＲＮＡ断片を変性６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。レーン１：ＲＮａｓｅＴ１を含まないプローブ；レーン２、４及び６：ＨＦＦ細胞；レーン３、５及び７：ＵＬ７９融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞；レーン２及び３：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン４及び５：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン６及び７：３ｄ．ｐ．ｉ．。矢印１、２及び３はそれぞれ開始部位１、２又は３から開始する転写産物を示す。
【図４】ＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質及びＵＬ９５−ＨＡ融合タンパク質が感染後の初期に発現されることを示す図である。ウイルスＤＮＡ合成をＰＡＡ又はＧＣＶにより阻害した。前初期ｐＩＥ８６及びｐＩＥ７２（ＵＬ１２２及び１２３）、ＨＡ若しくはｍｙｃエピトープ、又はＧＡＰＤＨに対する抗体を用いて、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下でのＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃの感染後の示した時点でウエスタンブロット分析を行なった。ＧＡＰＤＨはロード量対照として用いた。（Ａ）抗ＨＡ抗体、（Ｂ）抗ｍｙｃ抗体、（Ｃ）抗ＩＥ７２／ＩＥ８６抗体、抗ＵＬ４４抗体、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体。
【図５】ＵＬ７９、８７及び９５タンパク質の複製コンパートメントへの動員を示す図である。（Ａ）対応するＯＲＦが突然変異した組み換えウイルス感染後のＵＬ７９、８７又は９５−ｍｃｈｅｒｒｙ融合タンパク質とＵＬ４４との局在を示す。ＲｄｌＵＬ７９（ａ）、ＲｄｌＵＬ８７（ｂ）又はＲｄｌＵＬ９５（ｃ）に感染させた細胞を固定し、処理した。（ａ）ＵＬ７９−ｍｃｈｅｒｒｙ及びＵＬ４４タンパク質；（ｂ）ＵＬ８７−ｍｃｈｅｒｒｙ及びＵＬ４４タンパク質；（ｃ）ＵＬ９５−ｍｃｈｅｒｒｙ及びＵＬ４４タンパク質。（Ｂ）ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ感染後のＵＬ９５−ＨＡ及びＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質、ＵＬ４４タンパク質、及びウイルスＤＮＡの局在を示す。ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた細胞を、示したｄ．ｐ．ｉ．で回収した。細胞を固定し、抗体を用いて顕微鏡観察のために又はＦＩＳＨ分析のために処理した。（ａ〜ｃ）ＵＬ９５−ＨＡタンパク質とＵＬ８７−ｍｙｃタンパク質との共局在；（ｄ）ＵＬ９５−ＨＡタンパク質とＵＬ４４タンパク質との共局在；（ｅ）ウイルスＤＮＡとＵＬ４４タンパク質との共局在；（ａ）１ｄ．ｐ．ｉ．；（ｂ、ｄ及びｅ）２ｄ．ｐ．ｉ．；（ｃ）３ｄ．ｐ．ｉ．。
【図６−１】ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下でのＵＬ９５−ＨＡ又はＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質の局在を示す図である。ＰＡＡ（ａ、ｃ、ｅ及びｇ）又はＧＣＶ（ｂ、ｄ及びｆ）の存在下でＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた細胞を２ｄ．ｐ．ｉ．で処理した。（ａ及びｂ）ＨＣＭＶ ＤＮＡとＵＬ４４タンパク質との共局在；（ｃ及びｄ）ＵＬ９５−ＨＡとＵＬ４４との共局在；（ｅ及びｆ）ＵＬ８７−ｍｙｃとＵＬ４４タンパク質との共局在。
【図６−２】ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下でのＵＬ９５−ＨＡ又はＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質の局在を示す図である。ＰＡＡ（ａ、ｃ、ｅ及びｇ）又はＧＣＶ（ｂ、ｄ及びｆ）の存在下でＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた細胞を２ｄ．ｐ．ｉ．で処理した。（ｇ）ＵＬ８７−ｍｙｃとＵＬ５７タンパク質との共局在。
【図７】ウイルスＤＮＡ複製前のＵＬ８７とＩＥ２タンパク質及びＵＬ４４とＴＢＰタンパク質の局在を示す図である。ＰＡＡの非存在下（ａ及びｄ）若しくはＰＡＡの存在下（ｂ及びｅ）又はＧＣＶの存在下（ｃ及びｆ）で細胞をＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させ、２ｄ．ｐ．ｉ．で回収し、抗体で処理した。（ａ〜ｃ）ＵＬ８７−ｍｙｃとＩＥ２タンパク質との共局在；（ｄ〜ｆ）ＵＬ４４タンパク質とＴＢＰとの共局在。
【図８】３ＭＯＩでのｗｔ、ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ及びＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃの増殖曲線を示す図である。ウイルス力価は５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前述したように、本発明は、ＨＣＭＶのＯＲＦであるＵＬ７９、８７及び９５が、後期ウイルスｍＲＮＡ及び感染性ウイルス産生に必須であるが、ウイルスＤＮＡ複製には必須ではないとの知見に基づく。具体的には、ＵＬ７９、８７若しくは９５ ＯＲＦに突然変異を導入することによりこれらのＯＲＦの発現を低下又は消失させることによって、ウイルス複製の抑制、ひいてはＨＣＭＶの弱毒化を可能にした。ホルマリンなどの化学物質での処理による弱毒化では、外被（エンベロープ）タンパク質の変性などの問題も生じかねないが、本発明の弱毒化ウイルスは天然ウイルスの構造を保持するという利点を有する。
【００１６】
＜ＨＣＭＶ＞
本発明の対象であるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、すべてのウイルス株を包含するものとする。ＨＣＭＶは、ヘルペスウイルス科βヘルペスウイルス亜科に属し、その直径が約１８０ｎｍで約２３０ｋｂｐの塩基数からなる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＣＭＶの株には公知の株が含まれ、例えば、ＡＤ１６９株、Ｔｏｗｎｅ株、Ｍａｊｏｒ株、ＢＴ１９４３株、Ｄａｖｉｓ株、Ｍｅｒｌｉｎ株、Ｔｏｌｅｄｏ株、３１５７株、６３９７株、３３０１株、Ｃ８７株などが知られている（Ｄｏｌａｎ，Ａ．ら，２００４，Ｊ．Ｇｅｎ。Ｖｉｒｏｌ．８５：１３０１−１３１２；Ｃｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１２５−１６９）。
【００１７】
上記のＨＣＭＶ株のゲノム配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ、米国）などに蓄積されたデータから入手可能である。例えば、一般によく知られているＡＤ１６９株及びＴｏｗｎｅ株のゲノム配列はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＦＪ５２７５６３、ＡＹ３１５１９７として登録されている。
【００１８】
ＨＣＭＶは、ヒト線維芽細胞、例えばヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣ２５０９）やヒト胎児線維芽細胞、ヒト内皮細胞、例えばヒト毛細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＣ−２５２７）やヒト網膜色素内皮細胞（ＲＰＥ）（ＡＴＣＣ Ｃ４０００−１）などのヒト細胞に感染することができる。したがって、これらの細胞に、ＨＣＭＶ又はそのウイルスベクター、例えばＨＣＭＶゲノム配列とＢＡＣ（細菌人工染色体）配列から作製されたＨＣＭＶＢＡＣ、を感染又は導入することによってウイルスＤＮＡを回収することができる（Ｄｕｎｎ，Ｗ．ら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００（２４）：１４２２３−１４２２８）。
【００１９】
ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７及び９５ＯＲＦは、後期転写のためのウイルストランス作用因子として知られるＭＨＶ−６８のＵＬ１８、２４及び３４と相同性を有するが、本願以前にはその機能は未知であった。本発明者らは、以下の実施例に示すように、これらのＯＲＦが、感染性ウイルス増殖には必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされないこと、真性後期ウイルスｍＲＮＡの産生に必須であることを見出した。
【００２０】
例えば、ＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ３１５１９７）のＵＬ７９、８７及び９５ＯＲＦ配列は、以下の通りである。他のＨＣＭＶ株のＵＬ７９、８７及び９５ＯＲＦ配列も、ＧｅｎＢａｎｋなどの公知の遺伝子バンク又は文献などから入手可能である。
ＵＬ７９ＯＲＦ塩基配列（配列番号１）：ａｔｇａｔｇｇｃｃｃｇｃｇａｃｇａａｇａｇａａｃｃｃｃｇｃｃｇｔｃｃｃｇｃｇｇｇｔｃｃｇｃａｃａｇｇｃａａａｔｔｃｔｃｃｔｔｔａｃｔｔｇｃｇｃｃａａｔｃａｔｃｔａａｔａｔｔａｃａｇａｔｔａｇｃｇａｇａａｇａｔｇｔｃｇｃｇｃｇｇａｃａｇｃｃｇｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｔｇｃｇｔｔｔｇｇａａｇａａｃｔｃａａａａｔｃｇｔａｃｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｃｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｔｃａｃｃｇｃｇｇｔｃｔｃｇａａａｃｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｇｃｇａａａｃｔａｔｇａａｃａａｃｃｔｇｇｇｔｇｔｃｔｃｇｇａｃｃａｃｇｃｃｇｔｇｃｔｔａｇｃｃｇｃａａｇａｃｇｃｃｇｃａａｃｃｃｔａｃｔｇｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｔａｃｃｇｃｇａａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｔｇａｇｇｃｇｇｃｃｇｔｇｔｔｃｇａｔｇａａａｃａｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｃｃａｇｃｇｃｃｔｇｔｇｔｃａｃｃｃｇｃｇｃｔｔｇａｇｃｇｇｃｇｇａｃｔｇｃｔｇａｃｇｃｇｃｔｔｔｇｔｇｃａｇｃｇｃｃａｃａｃｃｇｇｃｃｔｇｃｃｇｇｔｃｇｔｔｔｔｃｃｃｃｇａａｇａｃｃｔｇｇｃｇｃｇｃａａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｃｔｔｃｔｃｃｃｔａｇｇｃａｃｇｃｔｃｔａｃｇｇａｃａｃｃｇｃｃｔｇｔｔｔｃｇｔｃｔｇｇｃｇｇｃｃｔｔｃｔｔｃａｃａｃｇｃｃａｃｔｇｇｇｇｔｇｃｃｇａａｇｃｇｔａｃｇａａｃｃｃｔｔｇａｔｔｃｇｃａｔｃａｔｃｔｇｔｃａａａａａａｔｇｔｇｇｔａｃｔｔｔｔａｔｃｔｃａｔｃｇｇｃａｃｃｇｇｃａａｇａｔｇｃｇｃａｔｔａｃｃｃｃｃｇａｃｇｃｃｔｔｃｇａｇａｔｃｃａｇｃｇｇａｇｔｃｇａｃａｃｇａａａｃｇｇｇｃａｔｔｔｔｔａｃｃｔｔｔａｔｔａｔｇｇａａｇａｔｔａｃａｇａａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇｃａｃｇｃｔｇｔｃｃｃｇｇｃａｃｃｃｇｃａｃｃｇｔｃｃｇｃａｃｃｃａｃａａｃａｇｃａｇｃａｇｃａｃｃａｃｃａｃｃｃｃｇｇｔｃｃｃｃｃｃｃａｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｔｃｔｃａｃｃｃｔｇｃｃｔｃｇｔｃｃｔｇｔｃｔｃａａｃｃｃａｇａｇｇｃｃｇｔａｃｔｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｃｃｔｔｃａｔａｔｇｃｃｇａｃｇｃｔｇｇｃｔａａｃｇａｃｇｔｇｔｇａ
【００２１】
ＵＬ７９ＯＲＦアミノ酸配列（配列番号２）：ＭＭＡＲＤＥＥＮＰＡＶＰＲＶＲＴＧＫＦＳＦＴＣＡＮＨＬＩＬＱＩＳＥＫＭＳＲＧＱＰＬＳＳＬＲＬＥＥＬＫＩＶＲＬＩＣＶＬＬＦＨＲＧＬＥＴＬＬＬＲＥＴＭＮＮＬＧＶＳＤＨＡＶＬＳＲＫＴＰＱＰＹＷＰＨＬＹＲＥＬＲＱＡＦＰＧＬＤＦＥＡＡＶＦＤＥＴＲＡＡＲＬＳＱＲＬＣＨＰＲＬＳＧＧＬＬＴＲＦＶＱＲＨＴＧＬＰＶＶＦＰＥＤＬＡＲＮＧＮＩＬＦＳＬＧＴＬＹＧＨＲＬＦＲＬＡＡＦＦＴＲＨＷＧＡＥＡＹＥＰＬＩＲＩＩＣＱＫＭＷＹＦＹＬＩＧＴＧＫＭＲＩＴＰＤＡＦＥＩＱＲＳＲＨＥＴＧＩＦＴＦＩＭＥＤＹＲＴＦＡＧＴＬＳＲＨＰＨＲＰＨＰＱＱＱＱＨＨＨＰＧＰＰＨＰＰＬＳＨＰＡＳＳＣＬＮＰＥＡＶＬＡＡＲＡＬＨＭＰＴＬＡＮＤＶ
【００２２】
ＵＬ８７ＯＲＦ塩基配列（配列番号３）：ａｔｇｇｃｃｇｇｃｇｃｔｇｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｃｔａａｔａｇｔｃｇｔｃｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｃｔａｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇｇｇｔｔｔｔａｃａｃｇｔｃｃｃｃｇｔｇｃａｃｇｔｔｃｇｃｇｃｃｔｇｃａａｃｃｔｃａｃｃｃａａｇａｇｃｔａｔｃｇａｃｇｇｇｃｇａｇｇａｃｇｃｃｃｇｃｔｔｃｔｇｔｃｇｔｃｃｇｃｇａｃｃｃｇｔｔａａｃｇｔｃｇａａｃｇｇｇｔａｃｇｃｇｃｔｇｔｔｔｔｃｇｃｇｇｃｔｃｔｃｔａｃｃｇｔｇｃｃｔｇｔｃｃｃｇｔａｃａｃｇｃｇａｇｇａｃｃｇａｇｔｃｃｇａｇｃｇｔｇｔｃａａｇｃｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｔｃｇｔｃｔｇｔｔｇｃｔｇｇｇａｃｃｃｇｔｇｇｃｃｇｔａｃｃｃｔｇｔｔｔｔｔｇｃｇａｃｇｇｔｇａａｇｔｇｇａｇｇｇｃｃａｃｇｇｃｇａｇｃａｔｃｔｇｇｔａｃｃｃａｃｇａｃｇｃａｇｔｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｇｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔａｃｇｔｇｃａｃｃｇａｃｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｃｇｇａｔｃｃｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｔｇｔｃｃｔａｃｃａｃｇｔｔｃｔｃｇａａａａｃｃａｃｇｔｇｇｃｃａｃｇｃａｔｇｔｇｔｔａｃｇｃｇｇａｔｔｇｃｔｃｔｃｇｃｔｇａｃｇｇａａｔｇｇａａｔｃｇａｇａｇｔｔｇｃｃｇｇｇｃｃｔｔｔｔｔｔｇｃｇａｃｔｇｔｃｃｔｇｇｃａｇｃｇｇｔｇｇｃｇｃｃｔｔｇｇｇａａｃｃｇａｇｇａａｃｇｃｔａｃｇｃｃａｔｇｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｃｃｔｃａｇｃｃｔｇｃａｃｃｔｇｇａｃｇａｃｔａｔｃｃｔｔａｃｃｔｇａｔｇｇｔｇｇａａａｔｃｇｇａｃｇｃｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔｃａｇｃｇａｇｇｔａｇａｃｇａｃｔａｃｇｔａａｃｃｇｃｃｇｔｃｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｇｇｃｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃｇｃｃｇｃｇｃａｔｔｃａｇｇｔｔｃａｃｔａｃａａｇｃｔｇｃｔｃｔｔｔｇｇａｃｔｃａａｃｇｔｇｃｇｔｃｃｇｃａａｇｃｇｃｃｇｔｇｃｇｃｇｔｔｇｇａｃｇｃｔａｃａｃｇｃｇａｃｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃａａａａｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｔｔｇａａｔａｔｃａｃｃａｃｇａａｇｔｃａｃｇｔｃｇｇａｇｔｔｔｔｔｃｇｇｔｃｇｃｇｔａｃｔｇｇｃｔｃａｇｃｔｇｃａｔｃｇｃｇａｃｃｇｃｇｃｃｃｇｃｇｔｃａｔｇａｔｇｇｃａｃｔｔｃｇｃｔｔｇｃｃｃｇａｇｃａｇａｃｇｇｔｇｔｇｃｃａｃｃｔａａｇｃａｃｃｔｔｃｇｔｔｃｔｃａｇｔｃｇｃｔｔｃａａｇｃｇａｃａｇｇｔａｃｔｇｔａｃｔｔｃａａｇｔｔａｃａｇｇｔｇａｇｃｔａｃｇｇｃａａｇｔｇｃｃｇｇａｃｔｇｇｃｃａｃｇｃｔｇａｃａｇａａｇｔｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｇａａａｃｇｇｔｇｇａａｇｔｃａｇｇｇａｃａｃｃａｃａａｃｃｔａｃｔｇｔｇｔｔａｔｃｇａｃｇｔｃｔｔａｇｃｇｔｃａｃｇｔｔｔｇｃｃｇａｃａｃｇｇａｃａｃｇｇｔｇｔｇｇａｇａａａｃｃｔｔｔｔｃｔａｃｇｔｔｔａｔｔａｔｇａａｃｔａｇｃｔｃｇｇｇａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｇｇｇａｃａｇａｇｇａｃｃｇａｔｃｃｇｔａａｇｃｃｇｃｇｇｔｔａｃｇｇｔｇｔｔｔｃｔｔｇｃｇｃｔｃｃｇａｇｇａｃｇｔｃｇｃｇｇｃｔａｃｃａｃｃｇｔｃａｇａａｃｃｇａｃｇｇｔｇｇｔｔｔｃａｇｃｃａａｃｇｇａｃａｃｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｃｃａｃｃｇｃｇｃｔｃｃｃｇａｃｇａｃｇａｇｃｇｃｇｇｇｔｃａｃａａｇｃｔｇｔｃｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｃｃｃｇｇｃｃｇｃａｇａｔｃｇｃｇｔｔｃｇａｃｇｔｔａｃｇｔｇｔｇｃａｔｔａｔｃｔｃｇｃｇｔｃｔｃａｔｇｔｔｃｇｃｃｃｇｇｔａｔｇｇｇｇａｇａｇａｔｇｇｃｇｔａａａｃａｃｃｇｔｃｇａｃｇｇｃｇｇｔｃｇｇａｇａｃｇｇｇａｇａａｇａｇｇａｇｇａｇｇａａｇａｇａｃｇｇｔｇｇａａｔｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇａｃｇｃｃａｃｇｃｃｇｃｃａｔｔｔｇａｃｔｔｔａｃｇｇｇｇｃａｇｃａｇｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃｔａｔｃａｇｇａａｃａｃｃｇａｃｇｔｃｇｔａａａｃａｔｃｔａｇｃｃｇｔｇｃａｇｃｇｔｔａｃｇｃｇｃｃｇｔｇｃｃｇｔｃｇｔａａｇｃｔｃａｔｃｇｇｃｇｇｇａｔｇｇａｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｇｔｇａｃｇｇｇｃｇｔｔａｇｔｃｔｇｇａｃｃｇｃａｔｃｇｃｃｇｔｃａａｃｇｃｔｔｔｃａａｃａｃｃａａｃｃｇｃｇｔｔａｔｃａａｔａｔｇａａｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｔｃｇｔｃｃａｔｃｇｃｃｇｃｇｔｃｇｇｇｔｃｔｃｇｇｃｇｔｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇｃｇｇｃｔｔｃｃｃａａｇａａｃａｔｇａｃｃｃａｃａｇｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｔａｃａａｇｃａｃａｃｃｔｔｃａａｇｇａｇｃｃｃｇｃｔｔｇｃａｃｃｇｔｃａｇｃａｃｔｔｔｔｇｔｔｔｃｃａａｃｇａｃｇｃｃｇｔｃｔａｃａｔｃａａｃｔｃｇｃｔｃａａｃｇｔｃａａｔａｔｔｃｇｃｇｇｔｔｃｃｔａｔｃｃｃｇａｇｔｔｔｃｔｇｔａｃｔｃｇｃｔｇｇｇｃｇｔｇｔａｃｃｇｇｃｔｇｃａｃｇｔｔａａｔａｔｃｇａｔｃａｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｇｔｇｔｇｃａａｃａｇｃａａｃｔｃｃｔｃｇｃｔｇｇａｃｇｔｇｃａｔｇｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｃａｇｇｃｇｇｔｇａｔｃｃｇｃｔｃｇｇａｇｃｇｃａｇｃａａｇｇｔｇｔａｃｔｇｇａｃｃａｃｃａａｃｔｔｔｃｃｇｔｇｃａｔｇａｔｃｔｃｇｃａｔａｃｔａａｃａａｃｇｔｃａａｃｇｔｇｇｇｔｔｇｇｔｔｃａａａｇｃｇｇｃｔａｃｇｇｃｃａｔｔｇｔｇｃｃｇｃｇｃｇｔｃｔｃｇｇｇｃｇｃｔｇａｃｃｔｇｇａａｇｃｃａｔｔｃｔｇｃｔｃａａａｇａａｃｔｃｔｃｇｔｇｃａｔｃａａｇａａｃａｔｇｃｇｃｇａｃｇｔｇｔｇｃａｔｃｇａｔｔａｃｇｇｔｃｔｇｃａｔｃｇｃｇｔｔｔｔｃａｃｇｃａａｃｔａｇａｇｃｔｇｃｇｃａａｔｔｃｇｔａｃｃａｇａｔｃｃｃｃｔｔｃｃｔｇｇｃｃａａｇｃａｇｔｔｇｇｔｇｃｔｇｔｔｔｃｔｇｃｇｔｇｃｔｔｇｃｃｔｇｃｔｃａａｇｃｔｇｃａｃｇｇｔｃｇａｇａｇａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｇｔｔｇｇａｃｃｇｃｃｔａｇｔａｔｔｔｇａｇｇｃｇｇｃａｃａｇｃｇｇｇｇｔｃｔｃｔｔｔｇａｃｔａｃａｇｃａａｇａａｃｃｔｃａｃｇｇｃｇｃａｃａｃｃａａｇａｔｃａａｇｃａｃａｃｔｔｇｃｇｃｇｃｔｃａｔｃｇｇｃａｇｔｃｇｔｃｔａｇｃｃａａｃａａｃｇｔｇｃｃｃａａｇａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｇｇａａｃａａａａａａｇｔｃａａａｔｔｇｇａｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｇｇａａｃｇｃｃａａｃｇｔｇｃｔｇａｃｇｇｔｇｔｇｔｃｇｇｃａｃｇｔｇｇａａｇｃｃｃａｃａａｇａｔｃｃｃｔｃｇｃａｃｇｃｇｃｃｔｃａａａｇｔｇｔｔａｇｔｃｇａｇｇｔｇｃｔｇｇｇｃｇｃｇｔｔｇｃａｇａｇｔａｔｃａｇｃｇｇｔａｃｇｃｃｇｃａｃａｃｇｃｇｔｇａａｇｔｇａｔｃｃａｃｃａｇａｃｇｔｔｇｔｔｔｃｇａｔｔｇｔｇｃｔｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃａｇｃｃａｃｃｔｃｇｇｇｃｃｔｇｔｇｔｔｃａｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃａｔｔｇｔｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃａｔｃｔｔｃｃｔｃｃｇｃｃｃｃｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｃｔｃｃｇｔｃａｇｃｇｔｔｇａｃｇｇｃａｇｔｔｃｔｇａａｃｃｃａｃｇｔｃｇｃｃｇｃｇａｇｃｇｃｇｇｔｔｔｇｃａｔｃａｃｇａｔｇａ
【００２３】
ＵＬ８７ＯＲＦアミノ酸配列（配列番号４）：ＭＭＥＡＡＡＡＡＡＡＡＦＲＰＥＥＲＰＴＰＧＷＨＤＡＡＬＬＭＤＤＧＴＶＲＥＨＡＦＲＮＧＰＬＳＱＬＩＲＲＶＬＰＰＰＰＤＡＥＤＤＶＶＦＡＳＥＬＣＦＹＣＳＧＲＦＮＲＲＳＳＶＦＳＩＹＷＱＫＨＳＤＬＶＹＡＬＴＧＩＴＨＣＡＫＬＶＶＥＣＧＱＬＧＳＧＲＬＲＷＲＤＧＤＶＧＧＥＥＲＲＧＤＤＤＳＲＤＥＬＹＤＶＰＧＩＹＭＩＲＶＮＤＧＧＳＴＧＰＲＨＶＩＷＰＧＴＳＶＬＷＡＰＤＶＶＩＴＴＶＱＲＲＩＳＡＡＲＡＬＶＮＴＦＲＱＹＦＦＬＬＥＲＲＳＨＥＥＬＶＬＣＰＰＥＭＥＥＲＬＡＰＬＬＱＳＡＴＲＧＤＳＤＭＦＤＧＶＶＡＳＡＹＨＲＬＲＩＳＮＩＰＲＳＳＡＲＬＬＥＨＣＶＧＬＡＧＡＫＫＬＬＬＬＤＶＰＲＬＥＮＹＦＬＣＱＶＣＬＹＥＬＤＥＤＥＭＧＥＥＭＬＧＭＬＡＧＫＰＥＤＡＡＶＳＧＡＳＧＧＦＬＬＨＲＫＴＭＫＬＡＡＣＬＣＬＬＬＮＳＬＨＬＨＱＥＡＬＥＡＬＤＰＰＰＰＲＶＥＥＮＤＬＶＮＶＶＬＲＲＹＹＲＳＨＧＧＶＱＡＲＴＬＡＡＡＲＡＬＬＡＤＹＡＥＴＦＳＰＬＧＳＦＴＲＬＧＹＤＲＬＶＳＡＤＡＧＶＳＲＲＨＬＶＡＬＬＲＡ
【００２４】
ＵＬ９５ＯＲＦ塩基配列（配列番号５）：ｔｇａｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｃｇａｇｃｇｇａｇｇｔｔａｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇａｇａｇｇａｇａｇｇａａａａａｇａｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｇｇａｃｇａｃｇｇａｇｇａｔｃｃａｃｃｃｇａａａａｃｃａｃｇｔｔｇｔｔｇｃｇｇａｃｇｔｇｇｃｔｔｇｔｇｇｇａｃｇｇｇｃｇｃｃｇｔｃａｃｔｃｇｔｔｃｇｔｃｔｔｃｇｔｃｇｔｃｃｃｔａｇｔｇｇｔｇｔｃｇｔｃｔｔｃｃｔｃｇｇｃｇｔｃａｇｇｃｔｃｇｇａｃｇａａｃｃｔｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｃｔｃｃｔｃｔｃａｇｔｔｔｃｃｃｃｇｔｃｔｇｃｔｃｃｃｃｃｔｃａａｃｔｇｃｃｇｔｃａｇｇｔｃｔｃｃｇｇｇｇｔｃｃｇｃｃｇｇｇｇｔｔｔｃａａｃｇｔｃｃｃｔｇｔｇｃｔｃｇｇｔｇｇａａｃｇｇａｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｔｃｇｇｃｇｃａｇｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇａｔｔｔｃｔｃｇｇｔｃｔｃｃｇａｇｇｃｔｔｇｇｃｇｃｔｔｃｇａｇｇａｇｇｃｃｇｔａａａｔａｔｇｇｃｇｃｔｇｇｔｇｇｃｃｔｇｃｇａｇｇｃｃｇｔｇｔｃａｃｃｔｔａｃｇａｔｃｇｃｔｔｔｃｇｃｃｔａａｔｔｇａａａｃｇｃｃｃｇａｃｇａｇａａｔｔｔｃｔｔｇｔｔｇｇｔｃａｃｃａａｃｇｔａａｔｔｃｃｇｃｇｃｇａｇｔｃｇｇｃｃｇａｇｇｔｇｃｃｇｇｔｇｔｔｇｇａｔａｇｃａｇｔａｇｃａｇｃｇｇｔｇｇｃｇａｔａｇｃｇｇｇｃｃｇｇａｇｇａｃａａａａａｇａａａａａｃｇｔｃｇｇｇａａｔａａａａｃｃｇｃｇｇｇｇｇａａａａｇａａｃｇｇｃｇｇｔｇｇｇｔｃｔｃｇｇｇｃｃａａａｃｇｃｃｇｔｃｇｔａｇａｃｇａｃｇｃｇｃｔｃｃｇａａａａａｃｇａｃｇｃｃｇｃｃａｃｇｃｃｇｔｃｔｔｔｔｃｔａｃｇｔｃｇａｃａｃｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｇｃｇｔｔｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇａｇｃｃｔｔｔｇｃｃｇｔｃｇｃｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇａｔｔａｔｇｃｇｔｔａｃｇｃａａｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｔａｃｃｔａｃｇａｃｇｇｃｇａａｔｔａａｔｃｔａｃｇｇｃａｇｔｔａｃｃｔｇｔｔｇｔａｔｃｇｃａａｇｇｃｔｃａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇｔｃａｃｔｃｔｃｃａｇｃａａｃａａｇｇｔｇｃａａｃａｃｇｔｇｇａａｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃｇａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｇｃｃｇｇｇｃｔｔｇｔｔａｇａｔｃａｔｃａｃａａｃｇｔｇｔｇｃｇａｃｇｔｇｇａｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｔａｃｔｇｃｇｇａｃｃｇｃｇｔａｇｃｔｔｔｔｇｃｇｃｇｃｇｔｇａｃａｃｃｔｇｔｔｔｃｇｇｔｃｇｃｇａａａａａａａｃｇｇｔｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｃｃｇｃｇｔｔｇｔｔｇｃｃｃａａａｃｔｃｔｔｔｔａｃｇａａｃｃｃｇｔｇｃｇｇｇａｃｔａｔａｔｇａｃｃｔａｃａｔｇａａｔｃｔｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｔａｃｇｔｃｔｔｔｇｔｔｔｇｇｔａｔｃｇｃｇｇｃｔａｃｇａａｔｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｇａｃｇｃｃｇｃａｇｇｃｇａｃｇａｃｇｇｃｇｇｇｔａｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｇｃｇｃｔｔｇｔｇｃｇｇｔｃｇａｇａｃｇａｇｃｇｃｇｔｃａｇｃａｇｇｃｃｇｇｇｔｃｇａｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｇａｃｇａｇｇｔｇｃａｔｔｔｇｃｃｔｔｔａａａｇｃｃｃｇｔｃｔｃｇｃｔｇｇａｃｃｇｔｃｔｃａｇａｇａｇｇｔｇｔｔｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｃｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｃｔｃｇｇｇｇｃｇｃｇａｇｇｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｃｇｔｃｇｃｇｃａｃｃｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｇｃｇｃｇｃｔｃｔａｃａｇｔｃａｇａａｃｃｇｔｃｔｃｔｇｔｔｔａｇａｔｃｔｃｇｃｇｃｇｔｇａｃｇａｇｇｃｇｃｇｇａｃｃｇｔｇａｇｔｔａｔａｇｃｃｃｃａｔｃｇｔｔａｔｃｃａａｇａｃｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇｔｃａｃｃｇａｃｇｔｃａｃｔｔｔｇａｇｃｃａｃａｔｃｔｔｇｃｃｃｇｇｃｃａｇａｇｃａｃｃｇｔｃｔｃｇｃｔｔｔｔｃｃｃｃｇｔｃｔａｃｃａｃｇｔｃｇｇａａａｇｔｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｃｃｔｃｔｃｇｃｔｇａａｃｇａｃｇｃｇｇｇｔｃｔｃａｔｃａｃｇｔｔｇａａｔｃｔａｔｇａ
【００２５】
ＵＬ９５ＯＲＦアミノ酸配列（配列番号６）：ＭＭＡＡＡＶＶＲＡＥＶＲＲＱＲＲＥＥＲＫＫＭＡＡＡＲＴＴＥＤＰＰＥＮＨＶＶＡＤＶＡＣＧＴＧＡＶＴＲＳＳＳＳＳＬＶＶＳＳＳＳＡＳＧＳＤＥＰＳＳＡＳＰＬＳＦＰＶＣＳＰＳＴＡＶＲＳＰＧＳＡＧＶＳＴＳＬＣＳＶＥＲＭＶＥＬＳＡＱＳＰＡＡＤＦＳＶＳＥＡＷＲＦＥＥＡＶＮＭＡＬＶＡＣＥＡＶＳＰＹＤＲＦＲＬＩＥＴＰＤＥＮＦＬＬＶＴＮＶＩＰＲＥＳＡＥＶＰＶＬＤＳＳＳＳＧＧＤＳＧＰＥＤＫＫＫＮＶＧＮＫＴＡＧＥＫＮＧＧＧＳＲＡＫＲＲＲＲＲＲＡＰＫＮＤＡＡＴＰＳＦＬＲＲＨＤＶＬＥＲＦＡＡＡＡＥＰＬＰＳＬＣＶＲＤＹＡＬＲＮＡＤＲＶＴＹＤＧＥＬＩＹＧＳＹＬＬＹＲＫＡＨＶＥＬＳＬＳＳＮＫＶＱＨＶＥＡＶＬＲＱＶＹＴＰＧＬＬＤＨＨＮＶＣＤＶＥＡＬＬＷＬＬＹＣＧＰＲＳＦＣＡＲＤＴＣＦＧＲＥＫＮＧＣＰＦＰＡＬＬＰＫＬＦＹＥＰＶＲＤＹＭＴＹＭＮＬＡＥＬＹＶＦＶＷＹＲＧＹＥＦＰＡＰＴＰＱＡＴＴＡＧＳＧＧＧＧＧＡＧＡＣＡＶＥＴＳＡＳＡＧＲＶＤＤＡＧＤＥＶＨＬＰＬＫＰＶＳＬＤＲＬＲＥＶＬＱＡＶＲＧＲＦＳＧＲＥＶＰＡＷＰＡＳＳＲＴＣＬＬＣＡＬＹＳＱＮＲＬＣＬＤＬＡＲＤＥＡＲＴＶＳＹＳＰＩＶＩＱＤＣＡＡＡＶＴＤＶＴＬＳＨＩＬＰＧＱＳＴＶＳＬＦＰＶＹＨＶＧＫＬＬＤＡＬＳＬＮＤＡＧＬＩＴＬＮＬ
【００２６】
＜弱毒化＞
本発明では、ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦを突然変異させることにより不活性化して、ＨＣＭＶを弱毒化する。
【００２７】
本明細書中で使用される「弱毒化」との用語は、ウイルスの毒性（すなわち、感染性及び病原性）を減弱させることを意味する。
【００２８】
ＯＲＦの不活性化は、ＯＲＦから最終的に翻訳されるタンパク質の発現を阻害すること、又は機能が抑制されたタンパク質を発現させることを意味する。ＯＲＦを不活性化させるための突然変異は、例えばＯＲＦ配列の一部若しくは全部を別のヌクレオチド配列によって置換すること、又はＯＲＦの内部での配列の欠失、付加若しくは挿入によって行なうことができる。好ましくは、ＯＲＦの内部への別の配列の挿入により、ＯＲＦを不活性化する。しかし、ＯＲＦの機能を阻害することができれば、突然変異の程度（例えば配列同一性の程度）、突然変異の方法などは限定されないものとする。
【００２９】
ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦが不活性化されることにより、ＨＣＭＶの複製が抑制される。本発明により、ＯＲＦへの突然変異の導入によって、組み換えＨＣＭＶの複製能が約１／１０以下、１／５０以下、好ましくは１／１００以下に抑制される。
【００３０】
本発明の組み換えＨＣＭＶは、ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦの一部又は全部に突然変異を導入したゲノムＤＮＡを、適切なベクターを利用して作製し、これを適切な宿主細胞、例えば上記のヒト線維芽細胞やヒト内皮細胞に感染させ、組み換えウイルス粒子を回収することを含む手順によって作製することができる。突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発法、相同組み換え法などの公知の方法によって導入することができる。部位特異的突然変異誘発法は、例えば、野生型ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５配列の一部又は全部に突然変異を導入し、それに隣接する野生型配列と同一の十分な長さの配列を配置したヌクレオチド配列を合成し、クローニングベクターに導入して大腸菌などの細菌中にサブクローニングすること、野生型ＨＣＭＶゲノムＤＮＡを含む人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）を作製し、次いで、上記ヌクレオチド配列を人工染色体ベクターにアニーリングし、ＰＣＲを行い、目的ＤＮＡを増幅することなどを含む。
【００３１】
具体的な方法として、例えば大腸菌内でバクテリオファージλ組み換えタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔａ及びｇａｍを発現するための迅速相同組み換え系（Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：６７４２−６７４６）、ＨＣＭＶのＢＡＣ（細菌人工染色体）ＤＮＡ（Ｄｕｎｎ，Ｗ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１４２２３−１４２２８；Ｌｅｅ，Ｅ−Ｃ．ら（２００１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７３：５６−６５；Ｂｏｒｓｔ，Ｅ−Ｍ．ら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（１０）：８３２０−８３２９）などを使用して突然変異誘発を行なうことができる。
【００３２】
組み換えのためのＨＣＭＶの二本鎖ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子と７０ｂｐ程度の相同ウイルスＤＮＡ配列を含み、この耐性遺伝子には、３４ｂｐの最小ＦＲＴ部位を連結させることができる（後述の実施例１参照）。ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦの突然変異体を作製するために、適切なプライマーを使用してＰＣＲによる増幅を行なう。ＰＣＲ条件は、例えば、９４℃２分の変性を１サイクル、９４℃１５秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング及び７２℃１分の伸長を３０サイクル、並びに７２℃５分の伸長を１サイクルとするＰＣＲサイクルプログラムからなる。ＰＣＲ増幅産物をフェノール−クロロホルムで抽出し、９５％エタノールで沈殿する。
【００３３】
残存する鋳型ＤＮＡを除去するため、ＰＣＲ産物を制限酵素を用いて消化したのち、得られたＤＮＡ断片を、ＨＣＭＶ−ＢＡＣ ＤＮＡを含むコンピテント大腸菌へ、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム法などの手法、好ましくはエレクトロポレーションを用いて形質転換する。
【００３４】
カナマイシン耐性遺伝子を欠失させるために、組み換えＨＣＭＶ−ＢＡＣ ＤＮＡを大腸菌に形質転換する。また、リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＣＰ２０（Ｈａｈｎ，Ｗ．ら（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０７：１６４−１７７）を、組み換えＨＣＭＶ−ＢＡＣ ＤＮＡを含む大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換する。カナマイシン耐性遺伝子を含まないＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを、アンピシリン及びクロラムフェニコール含有ＬＢプレート上で選択する。
【００３５】
ＨＦＦ細胞などの細胞を、リン酸カルシウム沈殿法によって、プラスミドｐＳＶｐｐ７１の存在中、上記の各組み換えＢＡＣでトランスフェクションする。約１０日後にウイルスプラークが出現し、１００％細胞変性作用（ＣＰＥ）の７日後に、細胞外液を回収し、約１：１０に希釈したものと未希釈のものを調製し、ＨＦＦ細胞などの細胞に感染させ、組み換えウイルスを回収する。このとき、ウイルスの選択は、ＯＲＦに所望の突然変異が導入されていることを配列決定によって確認すること、及びＨＦＦ細胞などの細胞に導入又は感染させてウイルス複製が抑制されていることを確認し、また、野生型の表現型と同一又は本質的に同一であることを確認することによって行なうことができる。
【００３６】
＜ワクチン＞
本発明はさらに、弱毒化ＨＣＭＶを含むことを特徴とする、ＨＣＭＶ感染症を治療又は予防するためのワクチンを提供する。
【００３７】
ワクチンは、一般に生ワクチンと不活性化ワクチンに大別される。特に生ワクチンは安価に製造可能であることや接種回数が少なくても高い効果が期待できるなどの利点を有するが、同時に毒性復帰にリスクを有する。本発明の弱毒化ＨＣＭＶは、顕著にウイルス複製が抑制されたウイルスであるため、安全性の高い生ワクチンとして使用可能であると考えられる。
【００３８】
本発明のワクチンは、ＡＩＤＳ患者、臓器移植患者などの免疫抑制患者、胎児、乳幼児、高齢者、重症患者などの抵抗性が低下したヒトに対し、肺炎、肝炎、網膜炎、胃腸炎などを含む広範な疾患を引き起こす可能性のあるＨＣＭＶ感染の予防及び治療のために使用可能である。ＨＣＭＶは、血液、尿、唾液などを介して感染するウイルスであり、上記のヒトに感染すると重症化する場合がある。そのような感染を抑制するために、本発明のワクチンは有効である。
【００３９】
本発明のワクチンは、適切な賦形剤、特に希釈剤、例えば滅菌水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝液などとともに処方することができる。また、ブドウ糖、トレハロース、エタノール、グリセリンなどの添加剤を含有させることができる。さらにまた、免疫応答を増強させるためのアジュバント、例えば水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、ムラミルジペプチド、サポニン類、リポ多糖、リポゾーム、消化性ポリマー（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２６３−１２７６（１９９５））などをその有効量で含有させてもよい。さらにまた、安定化剤を添加することも可能であり、安定化剤としては、ゼラチン、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、ポリソルベートなどの界面活性剤、スクロース、トレハロースなどの糖類、メチオニン、リジンなどのアミノ酸類などが挙げられる。
【００４０】
投与方法は、例えば皮下、筋肉内又は皮内注射、鼻腔内などの粘膜投与を含む。鼻腔内投与の場合、噴霧器による投与が望ましい。投与量は、例えば１０３〜１０１１ＰＦＵウイルス／ｋｇ体重、又は１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇの用量であるが、この範囲に制限されない。ワクチンの投与量は、患者などの被験体の状態、年齢、体重、性別、重症度などを考慮に入れて、医師の裁量で判断されるべきである。被験体は、１回又は２回以上の投薬を受容でき、複数回投与の場合、１週間〜１ヵ月以上の間隔、例えば２、３、５、１２、１８又は２４ヵ月間隔で投与することができる。
【００４１】
＜抗体の作製＞
本発明はさらに、上記弱毒化ＨＣＭＶを非ヒト動物に免疫して抗体を生成させ、該抗体を回収することを含む、抗ＨＣＭＶ抗体の作製方法を提供する。
【００４２】
抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのいずれのクラスでもよいし、またＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などのいずれのサブクラスでもよい。さらにまた、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、組み換え抗体のいずれでもよい。組み換え抗体には、例えば単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）などが含まれる（浅野竜太郎、生化学、７７（１２）：１４９７−１５００（２００５））。抗体フラグメントには、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどがある。
【００４３】
また、抗体には、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体なども包含され、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
抗体の作製は、慣用の方法で行なうことができる。
【００４４】
ポリクローナル抗体は、弱毒化ＨＣＭＶ粒子を動物に免疫し、抗血清、さらにＩｇＧ画分を回収することによって作製できる。
【００４５】
モノクローナル抗体は、弱毒化ＨＣＭＶ粒子を免疫した動物（例えばマウス、ラットなど）から脾臓を取り出し、脾臓細胞又はリンパ球とミエローマ細胞とを融合させ、該ＨＣＭＶ粒子抗原と特異的に免疫反応する抗体をスクリーニングすることによって作製できる。
【００４６】
ヒト抗体は、ヒト抗体産生非ヒト動物（例えばＫＭマウス、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）を用いて作製することができる。あるいは、弱毒化ＨＣＭＶ粒子を免疫した動物のゲノムから抗体遺伝子を回収し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３コード配列を決定し、ヒト抗体遺伝子の本来のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３コード配列を前記ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３コード配列と置換することを含む遺伝子組み換え技術を用いてヒト化抗体を作製することができる。
上記の抗体は、ポリエチレングリコールなどの分子によって化学修飾することもできる。
【００４７】
上記のようにして得られた抗体は、ＨＣＭＶ感染症の治療及び予防のために使用することができ、或いはＨＣＭＶの検出のために使用することもできる。ここで、ＨＣＭＶの検出のために、抗原−抗体反応を利用する手法のいずれを使用することもできる。そのような手法には、例えば均質法、固相法（例えばサンドイッチ法）などが含まれる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、該実施例によって制限されないものとする。
【００４９】
実施例１
突然変異型若しくはエピトープタグ付けされたＵＬ７９、８７、又は９５ＯＲＦを有する組み換えウイルスの構築
ウイルスＤＮＡ複製及び後期ｍＲＮＡに対するＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７、又は９５の影響を調べるために、ＵＬ７９、８７又は９５のＯＲＦを中断する突然変異を有する組み換えウイルスを構築した。
【００５０】
＜材料と方法＞
細胞及びウイルス
初代ヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞を、以前に報告されているように（４３）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したイーグルの最小必須培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ウイルスＤＮＡ複製を阻害するために、ホスホノ酢酸（ＰＡＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（２００μｇ／ｍＬ）、又は９−［（１，３−ジヒドロキシ−２−プロピル）メチル］グアニン（ガンシクロビル［ＧＣＶ］，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（４５０μＭ）を、感染時及び感染して維持する間、培地に添加した。
【００５１】
ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦを発現するＨＦＦ細胞を作製するために、Ｎｏｌａｎ博士の研究室から入手したプロトコールに従いレトロウイルス系を使用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｎｏｌａｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｐｒｏ＿ｈｅｌｐｅｒ＿ｄｅｐ．ｈｔｍｌ）。ＵＬ７９及び９５ＯＲＦは、それぞれ、ＸｈｏＩＵＬ７９ＯＲＦＦ及びＨｉｎｄＩＩＩＵＬ７９ＯＲＦＲ、並びにＸｈｏＩＵＬ９５ＯＲＦＦ及びＨｉｎｄＩＩＩＵＬ９５ＯＲＦＲのプライマーペアを用いて、ＨＣＭＶ ＴｏｗｎｅのＢＡＣ ＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーの配列は表１に示してある。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＬＢＣ（２）（スタンフォード大学Ｎｏｌａｎ博士の許可を得て、Ｆｒｅｄ Ｈｕｎｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｅｎｔｅｒのＫｉｅｍ博士から供与された）にクローニングし、その結果、ＯＲＦのＣ末端にｍｃｈｅｒｒｙ（京都大学医学系研究科、松田博士より供与された）が融合された。ｐＬＢＣは、ＥＢＶゲノムのＥＢＮＡ１ ＯＲＦ及びＯｒｉＰ配列を有する、組み換えレトロウイルスの構築のためのシャトルベクターである。ＵＬ９７ＯＲＦ配列はＡＴＧ開始コドンから８１５ヌクレオチド（ｎ．ｔ．）に制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はｐＬＢＣへのＯＲＦのクローニングに必要である。ＵＬ８７の１〜８１４ｎ．ｔ．の領域をまずプライマーＸｈｏＩＵＬ８７ＯＲＦＦ及びＵＬ８７ＨｉｎｄＩＩＩ（８１５）Ｒを用いるＰＣＲにより増幅し、ｐＬＢＣの対応する制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列決定した（愛知県がんセンター中央研究所）。続いて、８１５〜２８２６ｎ．ｔ．の領域を、ＵＬ８７（８１５）ＨｉｎｄＩＩＩＦ及びＨｉｎｄＩＩＩＵＬ８７ＯＲＦＲのプライマーペアを用いるＰＣＲにより増幅し、ＵＬ８７の１〜８１４ｎ．ｔ．の領域を有するｐＬＢＣのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列決定した。各ＯＲＦを含有するシャトルベクターをパッケージング細胞株であるＰｈｏｅｎｉｘ−ＧＡＬＶ（１７）（Ｎｏｌａｎ博士の許可を得て、Ｋｉｅｍ博士から供与された）にトランスフェクションすることにより、レトロウイルスストックを調製した。ＨＦＦ細胞を組み換えレトロウイルスに感染させ、ピューロマイシン選択下でｐＵＬ７９−ｍｃｈｅｒｒｙ、ｐＵＬ８７−ｍｃｈｅｒｒｙ又はｐＵＬ９５−ｍｃｈｅｒｒｙ発現細胞集団を作製した。
【００５２】
野生型（ｗｔ）ＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ、ＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ、ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ、ＲｄｌＵＬ７９、ＲｄｌＵＬ８７、又はＲｄｌＵＬ９５のウイルス力価は、ＨＦＦ細胞又はｐＵＬ７９、８７若しくは９５−ｍｃｈｅｒｒｙ発現ＨＦＦ細胞に対する標準的なプラークアッセイにより、以前に記載されているように決定した（３４）。ウイルス力価は、段階希釈で感染させた単層ＨＦＦ細胞でのＧＦＰ蛍光フォーカスによっても決定した。感染後の種々の時点で細胞及び上清を回収し、３回の凍結融解サイクルに供した。ウイルス力価を、ＨＦＦ細胞又はｐＵＬ７９、８７若しくは９５−ｍｃｈｅｒｒｙ発現ＨＦＦ細胞での５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより決定した。ＴＣＩＤ５０を算出するために、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いた。野生型ウイルス及び組み換えウイルスは、置き換え可能な１０ｋｂ ＵＳ１−ＵＳ１２領域（ＵＳ：ユニークショート）をＧＦＰ遺伝子で置換されている。
【００５３】
ウイルスＤＮＡ複製
３ＭＯＩでの感染後、２、３及び４ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。３個の３５ｍｍプレート中の細胞を、５０μｇ／ｍＬプロテアーゼＫを含有する溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ及び２０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ）中に懸濁した。複製したウイルスＤＮＡをＨＣＭＶ ｇＢプライマー及び以前に記載されたプローブ（２０、２３）を用いるリアルタイムＰＣＲにより測定した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した１８Ｓプライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、入力ＤＮＡの内部対照としても機能した。データは３回の独立した実験の平均である。
【００５４】
ＨＣＭＡ ＢＡＣ ＤＮＡの突然変異誘発
バクテリオファージλ組み換えタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔａ及びｇａｍを発現する大腸菌（ＮＩＨのＣｏｕｒｔ博士から供与された）での迅速相同組み換えシステムを、以前に記載されているように用いた（１０）。ＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株のＢＡＣ ＤＮＡはＬｉｕ博士（カリフォルニア大学）から供与された（９）。ＯＲＦを欠損した組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡの構築に際して、ＯＲＦの中央にＦＲＴ配列を挿入し、隣接する遺伝子への３４ｂｐ配列の影響を最小限に抑えた。さらに、隣接遺伝子の調節領域が除去される可能性を除外するために、ヌクレオチドを欠失させることはしなかった。ＢＡＣｄｌＵＬ７９Ｋａｎ＋ＦＲＴ、ＢＡＣｄｌＵＬ８７Ｋａｎ＋ＦＲＴ及びＢＡＣｄｌＵＬ９５Ｋａｎ＋ＦＲＴ（図１ａ参照）の組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを作製するために、組み換えのための二本鎖ＤＮＡを、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（ＮＥＢ）を鋳型として、ＢＡＣｄｌＵＬ７９ＦＲＴＦＫａｎＦ及びＢＡＣｄｌＵＬ７９ＦＲＴＲＫａｎＲ、ＢＡＣｄｌＵＬ８７ＦＲＴＦＫａｎＦ及びＢＡＣｄｌＵＬ８７ＦＲＴＲＫａｎＲ、並びにＢＡＣｄｌＵＬ９５ＦＲＴＦＫａｎＦ及びＢＡＣｄｌＵＬ９５ＦＲＴＲＫａｎＲのプライマーペアをそれぞれ用いるＰＣＲにより増幅した。プライマー配列は表２に示してある。
【００５５】
ＢＡＣＵＬ９５Ｎ ｎｅｏ＋Ｓｔ及びＢＡＣＵＬ９５ ｎｅｏ＋Ｓｔを作製するために、プラスミドｐＲｐｓＬ−ｎｅｏ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を鋳型として、ＢＡＣＵＬ９５Ｎｎｅｏ＋ＳｔＦ及びＢＡＣＵＬ９５Ｎｎｅｏ＋ＳｔＲ、並びにＢＡＣＵＬ９５Ｃｎｅｏ＋ＳｔＦ及びＢＡＣＵＬ９５Ｃｎｅｏ＋ＳｔＲのプライマーペアをそれぞれ用いるＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを増幅した。プライマー配列は表２に示してある。プラスミドｐＡＣＹＣ１７７又はｐＲｐｓＬ−ｎｅｏ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）は、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）又はＫａｎＲ及びストレプトマイシン耐性遺伝子をそれぞれ含有する。組み換えのために増幅された二本鎖ＤＮＡは、最小ＦＲＴ部位（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’）（１５）、又はＲｐｓＬｎｅｏ遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）に連結されたＫａｎＲ遺伝子、及び７０ｂｐの相同ウイルスＤＮＡ配列を含有していた。ＤｐｎＩでの３７℃、１．５時間の消化の後に、ＰＣＲ産物をゲル精製し、親ＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを含有するＤＹ−３８０に形質転換した。相同組み換え後、ＫａｎＲ及びＦＲＴ配列、又はＲｐｓＬ−ｎｅｏ遺伝子を含有する突然変異型ＢＡＣ ＤＮＡはカナマイシンに対して耐性であった（図１を参照）。
【００５６】
ＦＲＴ配列を含む突然変異型ＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡからＫａｎＲ配列を切り出すために、ＦＲＴを介した組み換えを、以前に記載されているように用いた（２３）。プラスミドｐＣＰ２０（Ｍａｘ ｖｏｎ Ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，ＧｅｍａｎｙのＨｕｈｎ博士から供与された）を組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを含むＤＨ１０Ｂに形質転換した。カナマイシンを含まないＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦの欠失を有する組み換えＢＡＣ ＤＮＡを選択するために、ＵＬ７９ｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ７９ｄｅｔｅｃｔＲ、ＵＬ８７ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ８７ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＲ、並びにＵＬ９５ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ９５ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＲのプライマーペアをそれぞれ用いてＰＣＲ分析を行なった。プライマー配列は表１に示してある。ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決定し、組み換えを確認した（愛知県がんセンター中央研究所）。
【００５７】
逆選択を、以前に記載されているように行なった（２１、５０）。ＲｐｓＬはストレプトマイシン感受性遺伝子を付与するので、突然変異型ＢＡＣ ＤＮＡを、Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）を用いて増大したストレプトマイシン耐性に基づいて選択した。ＢＡＣＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡを構築するために、オリゴヌクレオチドＢＡＣｏｌｉｇｏＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５Ｃｏｌｉｇｏを用いてそれぞれ逆選択した（図１ｂ参照）。オリゴ配列は表２に示してある。
【００５８】
組み換えＢＡＣＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ（図１ｂ参照）を構築するために、ＢＡＣＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡの構築後に、逆の手順を繰り返した。ＢＡＣＵＬ８７Ｃｎｅｏ＋ＳｔＦ及びＢＡＣＵＬ８７Ｃｎｅｏ＋ＳｔＲのプライマーペアを用いるＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡを増幅し、ＢＡＣＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡを含有するＤＹ−３８０に形質転換した。プライマー配列は表２に示してある。ＢＡＣＨＡＵＬ９５ｎｅｏ＋Ｓｔ又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡｎｅｏ＋Ｓｔを、カナマイシン含有プレート上で選択した。ＢＡＣＵＬ８７ｏｌｉｇｏのオリゴヌクレオチドを用いる逆選択を行なった後、ＢＡＣＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃを上記のように増大したストレプトマイシン耐性に基づいて選択した（図１参照）。
【００５９】
ＨＡ−ＵＬ９５、ＵＬ９５−ＨＡ及びＵＬ８７−ｍｙｃを含む組み換えＢＡＣ ＤＮＡを選択するために、ＵＬ９５ＮｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ９５ＮｄｅｔｅｃｔＲ、ＵＬ９５ＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ９５ＣｄｅｔｅｃｔＲ、並びにＵＬ８７ＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ８７ＣｄｅｔｅｃｔＲのプライマーペアをそれぞれ用いてＰＣＲ分析を行なった。プライマー配列は表２に示してある。ＰＣＲ産物は、組み換え及び切り出しを確認するために配列決定した（愛知県がんセンター中央研究所）。
【００６０】
抗体
ＨＡ又はｍｃｈｅｒｒｙでタグ付けした融合タンパク質を検出するために、ラット又はウサギポリクローナル抗体（３Ｆ１０，Ｒｏｃｈｅ又はＰＭ００５，ＭＢＬ，名古屋）をそれぞれ用いた。ｍｙｃエピトープを含む融合タンパク質を検出するために、マウスモノクローナル抗体９Ｂ１１、又はウサギポリクローナル抗体７Ｄ１０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いた。ＩＥ１及びＩＥ２タンパク質、ＩＥ２、ＵＬ４４、ＵＬ５７、ＴＢＰ又は細胞内ＧＡＰＤＨを検出するための抗体は、ＮＥＡ−９２２１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、１２Ｅ２（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）、ＣＡ００６（ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ，Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｒｗｉｃｋ，ＭＥ）、ＣＨ１６７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ｓｃ−２７３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びＭＡＢ３７４（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｕｃｕｌａ，ＣＡ）をそれぞれ用いた。
【００６１】
ウエスタンブロット分析
細胞を感染後の示した時点で回収し、ＰＢＳで洗浄し、以前に記載されているように溶解バッファーで処理した（１９、２０）。２０μｇのタンパク質のアリコートを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために各レーンにロードし、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。増強化学発光検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及び二次西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス、ウサギ、又はラットＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を製造業者の取扱説明書に従って用いた。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
＜結果＞
Ｃ末端に蛍光タンパク質ｍｃｈｅｒｒｙをインフレームで融合させたＵＬ７９、８７又は９５を安定的に発現するＨＦＦ細胞を、組み換えレトロウイルスを用いて単離した。これらの細胞を、組み換えＨＣＭＶを増殖させるために用いた。組み換えＢＡＣ ＤＮＡを親ＢＡＣ ＤＮＡから選択するために薬剤耐性遺伝子が必要であったので、３４ｂｐの最小ＦＲＴ部位に連結されたＫａｎＲを有する組み換えＢＡＣ ＤＮＡをまず構築し、続いてＦＲＴ−ＦＬＰ組み換えによりＫａｎＲを切り出した。図１ａを参照されたい。隣接遺伝子への影響を最小限にするために、ＦＲＴはＯＲＦの中央に挿入した。
【００６５】
本発明者らはまた、ＵＬ８７又はＵＬ９５ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端に融合されたＨＡ又はｍｙｃエピトープを有する組み換えウイルスも構築した。以前に報告されているようにＵＬ９８遺伝子は必須であり（９、５６）、ＵＬ９５ＯＲＦはＵＬ８９と重複しているので、ＵＬ９５のＮ末端へのＨＡエピトープの挿入はＵＬ８９タンパク質の機能に障害を与える可能性がある。したがって、本発明者らは、ＵＬ９５ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端に融合されたＨＡエピトープを有する組み換えウイルスを構築した。
【００６６】
ＵＬ８６は必須であり（１０、５９）、ＵＬ８７とは逆方向に転写されるので、ｍｙｃエピトープをＵＬ８７ＯＲＦのＣ末端に挿入した。ＵＬ８７ＯＲＦのＴＧＡ停止コドンとＵＬ８８のＡＴＧ開始コドンは重複しているので、ｍｙｃエピトープはＵＬ８７ＯＲＦのＴＧＡ停止コドンの前に挿入した。ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端にエピトープを挿入するために、逆の手順を行なった。図１ｂに示されているように、マーカーカセットをＲｐｓＬ遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）で置き換え、ストレプトマイシンに対する感受性を増大させた。中間体ＢＡＣクローンは、カナマイシンに対する耐性に基づいて選択した。これらのクローンの完全性はＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりチェックし、正しい位置でのマーカーカセットの挿入はＰＣＲにより確認した。相同組み換えの第２ラウンドでは、マーカーカセット全体をカウンター選択によりエピトープを含む配列と置き換えた。組み換え構築物を、以前に記載されているように（５０）ストレプトマイシンに対する増大した耐性に基づいて単離し、エピトープが挿入された組み換えＢＡＣをＰＣＲにより選択した。ＰＣＲ分析により、組み換えＢＡＣ ＤＮＡ中へのエピトープの挿入が確認された（図１ｃ）。ＤＮＡ配列決定により組み換えを確認し（データは示していない）、突然変異型ＢＡＣの完全性をＨｉｎｄＩＩＩによる消化によってチェックした（データは示していない）。３の高ＭＯＩで、これら組み換えウイルスの増殖を親ウイルス（ｗｔ）と比較した。ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃは感染４及び５日後（ｄ．ｐ．ｉ．）で野生型と比較して１／２対数ほど遅く複製したが、７ｄ．ｐ．ｉ．までに感染力価は同等となった。ＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃは、４、５及び７ｄ．ｐ．ｉ．で野生型と同等に複製した（図８）。
【００６７】
実施例２
ＵＬ７９、８７及び９５はＨＣＭＶの増殖には必要であるが、ＤＮＡ複製には必要でない
ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７又は９５タンパク質がウイルス増殖又はＤＮＡ複製に必要であるかを決定するために、補充ウイルスタンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に組み換えウイルスを３ＭＯＩで感染させた。ウイルス力価を１、４、５、７及び９ｄ．ｐ．ｉ．でアッセイし、同数の感染細胞からのＤＮＡを２、３及び４ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。突然変異させたＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦを含む組み換えウイルスは、補充ウイルスタンパク質の発現なしではＨＦＦ細胞で感染ウイルスを産生しなかった（それぞれ、図２ａ、ｂ及びｃ）。対照的に、ウイルスＤＮＡは両方のＨＦＦ細胞で同等であった（図２ｄ、ｅ及びｆ）。これらの結果は、ＵＬ７９、８７及び９５がウイルス増殖に必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要でないことを示している。
【００６８】
実施例３
ＵＬ７９、８７及び９５タンパク質は真性後期（γ２）ウイルスｍＲＮＡに必要とされる
＜材料と方法＞
ノザンブロット分析
以前に記載されたように、感染後１、２及び３日で細胞質ＲＮＡを単離した（５、１６）。２０μｇの細胞質ＲＮＡを２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルでの電気泳動に供し、最大強度のＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）にトランスファーした。ＩＥ１、ＵＬ７５又はＵＬ９９ＤＮＡプローブを用いるノザンブロット分析を以前に記載されているように実施した（２０、２２、２３）。放射標識プローブは３２Ｐ−ｄＣＴＰでの標識により以前に記載されているように作製した（２３）。
【００６９】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ
３２Ｐ標識アンチセンスＵＬ４４ ＲＮＡプローブを以前に記載されているように構築した（２３）。以前に記載されているように（１９、２６）、２０μｇのＲＮＡを３２Ｐ標識アンチセンスＵＬ４４プロモータープローブに３７℃で一晩ハイブリダイズさせ、その後、ＲＮａｓｅＴ１（１００Ｕ）で消化した。保護されたＲＮＡ断片を変性６％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供し、続いてＨｙｐｅｒｆｉｌｍＭＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）でのオートラジオグラフィーに供した。
【００７０】
＜結果＞
ＵＬ７９、８７又は９５タンパク質が真性後期（γ２）ｍＲＮＡに必要とされるかを決定するために、補充ウイルスタンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞を、ＰＡＡの存在下又は非存在下で、組み換えウイルスに３ＭＯＩで感染させた。１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で細胞質ＲＮＡを回収し、ＩＥ１、ＵＬ７５（ｇＨ）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）ＤＮＡプローブのいずれかを用いてノザンブロット分析によって分析した。ＩＥ１ＲＮＡは、予想される通り、組み換えウイルスを感染させた両方の細胞タイプで１ｄ．ｐ．ｉ．に検出された（図３ａ〜ｃ、左パネル）。
【００７１】
ＵＬ７５プローブを用いると、ＵＬ７５、７６、７７及び７８ｍＲＮＡに対応する３種類のサイズのｍＲＮＡが検出された（図３ａ〜ｃ、中央パネル）。これらのウイルスｍＲＮＡは以前に報告されているように異なる開始部位を有する（４８）。ＵＬ７５の転写方向はＵＬ７６、７７及び７８とは逆方向である（５２）。初期／後期ＵＬ７６〜７８転写産物はＰＡＡの存在下では著明に減少した（図３ｂ及びｃ）。ＵＬ７５転写産物は後期転写産物であり、ＰＡＡの存在下又は補充タンパク質の発現なしにはＨＦＦ細胞で検出されなかった（図３ａ〜ｃ、中央パネル）。
【００７２】
ＵＬ９９ＯＲＦは一連の３’共同末端転写産物内のウイルスゲノムの複合領域に位置する（５１）。すべての転写産物はＵＬ９９ＯＲＦの共通のポリアデニル化部位下流配列を用いる（５１）。ｐｐ２８テグメントタンパク質は１．６ｋｂのｍＲＮＡから翻訳される（１）。以前に報告されているように（１）、ＵＬ９９プローブを用いるノザンブロット分析は、ＰＡＡの存在下で、ＵＬ９９プロモーターからの１．６ｋｂのｍＲＮＡが検出されないこと、したがってＵＬ９９は真性後期遺伝子であることを示した（図３ｂ及びｃ、右パネル）。以前の報告と合致して（５１）、ＰＡＡ処理ＲＮＡの分析から、この領域内の可能性があるＯＲＦのそれぞれの上流から開始されるｍＲＮＡが遅延初期転写産物を含むことが示された（図３ｂ及びＣ、右パネル）。ＰＡＡの存在下、又は補充タンパク質の発現なしには、１．６ｋｂ ｍＲＮＡはＨＦＦ細胞で検出されなかった（図３ａ〜ｃ、右パネル）。これらのことから、ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７及び９５は真性後期ウイルスｍＲＮＡのために必須であると結論づけられる。
【００７３】
ＨＣＭＶ ＵＬ４４転写ユニットは３つの異なる部位で開始され、それぞれは約５０塩基により隔てられ、生産性感染時に別々に調節される。これらの開始部位のうち２つ、遠位及び近位が初期に活性であり、中央開始部位は後期まで不活性である（２８）。後期開始部位からの発現はウイルスＤＮＡ複製に依存し、後期ウイルス遺伝子発現に影響を有する（２２）。本発明者らは、ＵＬ４４転写に対するＵＬ７９タンパク質の影響も調べた。異なる開始部位に由来するすべての転写産物を検出するために、ＲＮａｓｅ保護アッセイを行なった。以前の報告と合致して（２１、２２、２８）、離れた開始部位から開始される３種類の主要な転写産物が補充細胞では検出された（図３ｄ、レーン３、５及び７）。対照的に、中央の開始部位からの転写産物はＲｄｌＵＬ７９感染ＨＦＦ細胞では検出されず、他の２種類の初期転写産物は検出された（図３ｄ、レーン２、４及び６）。これらのことから、ＵＬ４４の中央の後期開始部位からの転写産物はＵＬ７９ウイルスタンパク質を必要とすることが結論づけられる。
【００７４】
実施例４
ＵＬ８７及び９５ＯＲＦは初期ウイルスタンパク質である
ＨＣＭＶ ＯＲＦ７９、８７及び９５はＭＨＶ−６８ ＯＲＦ１８、２４及び３４と機能の上で似通っているので、これらの発現時期及びＨＣＭＶ ＵＬ４４との共局在について調べた。図１ｂに示されるエピトープタグ付けされたＵＬ８７及びＵＬ９５ＯＲＦを含む組み換えウイルスを構築した。ＵＬ７９ＯＲＦに融合したエピトープを含む組み換えウイルスは構築しなかった。
【００７５】
ＵＬ８７及びＵＬ９５融合タンパク質の発現動態を調べるために、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下で、ＨＦＦ細胞をＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ又はＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃに３ＭＯＩで感染させた。感染細胞を１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収し、ＩＥ１若しくはＵＬ４４タンパク質に対する抗体、又はＨＡ若しくはｍｙｃエピトープに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によりアッセイした。タグ付けされた融合タンパク質は、１〜３ｄ．ｐ．ｉ．で、またＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下で２ｄ．ｐ．ｉ．で検出された（図４Ａ及びＢ）。ＵＬ８７及びＵＬ９５融合タンパク質の発現動態は、ＵＬ４４遺伝子の初期ウイルスタンパク質と似通っていた（図４Ｃ）。これらの結果は、ＵＬ８７及びＵＬ９５が感染の初期に発現されることを示している。
【００７６】
実施例５
ＵＬ７９、８７及び９５ウイルスタンパク質は複製コンパートメント（ＲＣ）に動員される
＜材料と方法＞
共焦点顕微鏡観察前のタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ抽出
２４ウェルプレート中のコンフルエントのＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで組み換えウイルスを感染させた。以前に記載されているように（５５）、感染後の種々の時点で、カバーガラス上で増殖した細胞を５０μｇ／ｍＬのジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ、Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（ホモ二官能性ＮＨＳエステル架橋剤）で４℃にて１０分間固定した。マトリックスに結合していないタンパク質を核又は細胞質から除去するために、細胞をＴＮＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１％ＮＰ４０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で処理し、２％パラホルムアルデヒドで４℃にて６０分間固定した。
【００７７】
顕微鏡観察
細胞を高塩濃度ＴＰＢＳ（０．００１Ｍリン酸ナトリウム［ｐＨ７．３］，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で３回洗浄し、示した一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。室温でのＴＰＢＳでの３回の洗浄後、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４若しくは６８０標識二次抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４若しくは６８０標識抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識ラットＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。感染細胞においてＨＡ又はｍｙｃ融合タンパク質を検出する場合には、Ｓｉｇｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ（ＴＯＹＯＢＯ，大阪）を用いて特異的シグナルの強度を増強した。スライドを、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄアンチフェード試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でマウントした。画像取得は、ＰｌａｉｎＡｐｏ６３又は１００×１．４ＮＡ油浸対物レンズを装着したＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｔａ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いて行なった。ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４及び６８０蛍光団を励起するためのＨｅＮｅレーザーを装着した。細胞をいずれかの抗原に関して染色した場合、まずタンパク質の局在を調べ、次に同じ条件で別のフィルターを用いて免疫蛍光が検出されないことを確認した。
【００７８】
＜結果＞
ＨＣＭＶ複製タンパク質ＵＬ４４は約２ｄ．ｐ．ｉ．でＲＣに局在化する。ＢｒｄＵをこれらのコンパートメント中のウイルスＤＮＡに取り込ませると、子孫ウイルスで検出される（３６、３８）。本発明者らは、ＲｄｌＵＬ７９、ＲｄｌＵＬ８７又はＲｄｌＵＬ９５での感染後の細胞内でその局在を調べるために、ＨＦＦ細胞で安定に発現させたｍｃｈｅｒｒｙ蛍光融合ウイルスタンパク質を用いた。３ＭＯＩでの感染２日後に細胞を固定し、ＵＬ４４に対する抗体とインキュベートした。組み換えウイルスはＧＦＰタンパク質を含有しているので、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識二次抗マウスＩｇＧを用いてＵＬ４４の細胞内局在を検出した。図５Ａ、ａ〜ｃに示されているように、ＵＬ７９、８７及び９５−ｍｃｈｅｒｒｙ融合ウイルスタンパク質はＵＬ４４タンパク質と核で共局在していた。これらの結果は、ｍｃｈｅｒｒｙと融合させた補充タンパク質ＵＬ７９、８７又は９５が、それぞれＲｄｌＵＬ７９、ＲｄｌＵＬ８７又はＲｄｌＵＬ９５での組み換えウイルス感染後にＲＣに動員されることを示している。
【００７９】
実施例６
組み換えウイルスから発現させたＵＬ８７及び９５タンパク質は複製コンパートメントに動員される
ウイルスから発現させたＵＬ８７及び９５タンパク質も互いに共局在することを示すために、ＨＦＦ細胞を３ＭＯＩでＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた。１〜３ｄ．ｐ．ｉ．において、細胞を固定し、ＨＡエピトープに対するラットポリクローナル抗体またはｍｙｃエピトープに対するマウスモノクローナル抗体と共にインキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識二次抗ラットＩｇＧ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗マウスＩｇＧをそれぞれ用いた。共焦点顕微鏡観察は、１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．でのＵＬ８７融合タンパク質とＵＬ９５融合タンパク質との共局在を証明した（図５Ｂ、ａ〜ｃ）。
【００８０】
共焦点顕微鏡観察はまた、２ｄ．ｐ．ｉ．でのＵＬ９５融合タンパク質とＵＬ４４タンパク質との共局在も実証した（図５ｄ）。さらに、ＵＬ４４タンパク質は新規に合成されたウイルスＤＮＡとも共局在していた（図５ｅ）。これらの結果は、ＵＬ８７及びＵＬ９５ウイルスタンパク質が共局在し、ＵＬ９５がＲＣに動員されたことを示している。
【００８１】
実施例７
ＵＬ８７及びＵＬ９５タンパク質はウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ４４の微小フォーカスに動員される
＜材料及び方法＞
ＦＩＳＨアッセイ
ＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを、ニックトランスレーションキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を製造業者の取扱説明書に従って用いてＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅで標識した。ＦＩＳＨ分析は多少の改変を加えて、基本的に以前に記載された方法に基づいて行なった（２４）。カバーガラス上で増殖させた細胞を、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞抽出後に２％パラホルムアルデヒドで４℃にて６０分間固定し、ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ）を含有するブロッキングバッファー（２．５％ＢＳＡ，０．２Ｍグリシン，及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で１時間透過化し、その後ハイブリダイゼーションに用いた。各カバーガラスを、５μＬのハイブリダイゼーションバッファー（２×ＳＳＣ，１０％硫酸デキストラン及び５０％ホルムアミド）及びＤＮＡプローブと共にスライドガラス上に逆にふせて置いた。ハイブリダイゼーションバッグ中に密封した後、スライドを８５℃の水浴中に５分間浸漬し、続いて３７℃で一晩インキュベートした。ＦＩＳＨ分析後、抗ＵＬ４４抗体を用いてＵＬ４４抗原を検出した。カバーガラスを、５０％ホルムアミドを含有する２×ＳＳＣで５０℃にて３分間ずつ３回洗浄し、２×ＳＳＣで５０℃にて３分間ずつ３回洗浄し、０．１×ＳＳＣで６０℃にて１０分間、１回洗浄した。ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ蛍光団は５６０ｎｍの吸収極大と５８８ｎｍの蛍光発光極大を有し、ＨｅＮｅレーザーで励起した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｅｉｓｓ．ｄｅ／Ｃ１２５６７ＢＥ００４５ＡＣＦ１／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ−Ｆｒａｍｅ／５ＣＤＤ６２Ｃ９２Ｂ１１２４１３Ｃ１２５６Ａ１４００４０Ｃ８３１）。
【００８２】
＜結果＞
ＵＬ８７及びＵＬ９５がウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ４４と共局在するかを調べるために、ＰＡＡ又はＧＣＶの存在下でＨＦＦ細胞を３ＭＯＩでＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた。細胞を固定し、ＨＡ又はｍｙｃエピトープに対するポリクローナル抗体、及びＵＬ４４タンパク質に対するモノクローナル抗体で処理した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識二次抗ラット又はウサギＩｇＧ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗マウスＩｇＧを用いた。ウイルスＤＮＡを検出するためのＦＩＳＨ分析後に、細胞をＵＬ４４タンパク質に対するモノクローナル抗体とインキュベートし、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識二次抗マウスＩｇＧとインキュベートした。予想された通り、ＵＬ４４はウイルスＤＮＡ合成阻害剤の存在下でウイルスＤＮＡと共局在した（図６ａ及びｂ）。ＵＬ８７及びＵＬ９５はＰＡＡ又はＧＣＶの存在下でＵＬ４４と共局在した（図６ｃ〜ｆ）。これらの結果は、ＵＬ８７及び９５タンパク質がウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ４４と共局在することを示している。
【００８３】
ＵＬ８７とＵＬ４４との共局在の特異性を調べるために、ＵＬ５７及びＵＬ４４の局在を調べた。ＨＣＭＶでは、ＵＬ４４タンパク質はウイルスＤＮＡ合成前にはＵＬ５７タンパク質含有小フォーカスには伴われないことが報告されている（３６）。細胞を固定し、ＵＬ８７と融合したｍｙｃエピトープに対する抗体及びＵＬ５７タンパク質に対する抗体で処理した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識二次抗ウサギＩｇＧ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗マウスＩｇＧをそれぞれ用いた。以前に報告されている通り（３８）、ＰＡＡの存在下では、ＵＬ８７融合タンパク質はＵＬ５７タンパク質と共局在しなかった（図６ｇ）。ＵＬ５７タンパク質はウイルスＤＮＡ複製開始後にはＵＬ４４タンパク質と共局在するようである。併せて考えると、ＨＣＭＶ ＵＬ８７及び９５タンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製前にはＵＬ４４と共局在する。
【００８４】
実施例８
ＩＥ２タンパク質はウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ８７と共局在する
Ｓｏｕｒｖｉｎｏｓらによるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析（４２）により、ＩＥ２タンパク質は１２時間ｐ．ｉ．で直接的なＤＮＡとの接触により親ウイルスゲノムに伴われていることが示されている。ＩＥタンパク質は点状構造を形成することができ、これがＲＣへと発達する。ＩＥ２はＰＡＡの存在下でウイルスＤＮＡ複製と関連するため、本発明者らは、ＨＣＭＶ後期トランス因子がウイルスＤＮＡ複製前にＩＥ２と共局在するかを調べた。細胞を３ＭＯＩでＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させ、固定し、ＩＥ２、ｍｙｃ、ＵＬ４４及びＴＢＰに対する抗体で処理した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識抗マウスＩｇＧ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗ウサギＩｇＧの二次抗体を用いた。ＵＬ８７タンパク質はＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下でＩＥ２フォーカスと共局在した（図７ａ〜ｃ）。ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）はＩＥ２タンパク質と直接的に相互作用するので（１４）、ＴＢＰに対するポリクローナル抗体及びＵＬ４４タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下でＴＢＰがＵＬ４４微小フォーカスに動員されるかを調べた。図７ｄ〜ｆに示される通り、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下で、ＴＢＰはＵＬ４４と共局在し、したがって、予想されたように、ＲＣ前駆体に動員された。これらの結果から、ＵＬ８７タンパク質は、ＩＥ２タンパク質及びＴＢＰと同様に、ウイルスＤＮＡ複製前にウイルスＲＣ前駆体に動員されると結論づけられる。
【００８５】
＜考察＞
ＭＨＶ−６８のＵＬ１８、２４及び３４は後期転写のためのウイルストランス作用因子である。これらのＭＨＶ−６８ＯＲＦは初期に発現されるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされない。これらのＭＨＶ−６８ウイルスタンパク質はインジケーター遺伝子の発現を駆動する後期ウイルスプロモーターを活性化させるので、後期ウイルストランス活性化因子であると考えられている。後期ウイルストランス活性化因子がどのようにして後期ウイルスプロモーターを特異的に活性化するのかは未だ明らかになっていない。
【００８６】
後期ウイルスプロモーターの活性化についての理解は、ユニークな抗ウイルス剤のための新規なアプローチに寄与するものと思われる。ＨＣＭＶは深刻な病原ウイルスであり、現在利用可能な抗ウイルス剤は限定された有効性及び副作用を有するので、ＨＣＭＶ後期転写因子の解析は新規な抗ウイルス剤の開発のために重要であろう。したがって、本発明者らは、ＭＨＶ−６８後期ウイルストランス活性化因子に相同なＨＣＭＶ遺伝子が真性後期（γ２）ＨＣＭＶ遺伝子の転写に影響を及ぼすかを調べた。
【００８７】
ＨＣＭＶでは、プロモーターは単純であり、それらは上流又は下流配列を必要としないコアエレメントを含む（８、２５、３１）。ＵＬ４４初期ウイルスプロモーターはカノニカルなＴＡＴＡ配列を有する。対照的に、ＵＬ４４後期ウイルスプロモーターはノンカノニカルなＴＡＴＡ配列を有する（図３ｄを参照されたい）。本発明者らは、このノンカノニカルなＴＡＴＡ配列が後期ウイルス遺伝子発現に重要であることを報告している（２１）。Ｓｅｒｉｏら（３９）もまた、ＥＢＶのＢｃＬＦ１後期プロモーターからの発現が変異型ＴＡＴＡエレメントのみに依存することを報告している。ノンカノニカルなＴＡＴＡ配列へのＴＢＰの弱い結合親和性は、感染後の初期での転写の欠如を部分的に説明するものかもしれない。ＴＢＰの後期プロモーターへの結合親和性が、後期遺伝子特異的トランス活性化因子の動員及びウイルスＤＮＡ複製中の二重らせんの開放後に強まる可能性はある。これらの後期遺伝子トランス活性化因子が、ＩＥ２トランス活性化因子と共に、ＴＢＰ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩの後期プロモーターへの結合を安定化させるということも考えられる。ＨＣＭＶでは、初期／後期ウイルス遺伝子発現に影響を与えるＩＥ２遺伝子にはいくつかのアイソマーがある。感染初期には、ウイルスＩＥ２−ｐ８６タンパク質が初期ウイルス遺伝子発現に必須である。感染後期には、ＩＥ２アイソマーであるＩＥ２−ｐ６０及びＩＥ２−ｐ４０が後期ウイルス遺伝子発現に多大な影響を及ぼす（４９、５０）。ウイルスＤＮＡとウイルスＩＥ２トランス活性化因子との複合体は、ウイルスＤＮＡが複製し始める時点で検出され、ＲＣの発達を引き起こす（４２）。本発明者らはＨＣＭＶ ＵＬ８７がウイルスＲＣでＩＥ２タンパク質と共局在することを示したが、現状ではこれら２つのウイルスタンパク質が相互作用するという証拠はない。
【００８８】
なぜ後期ウイルス遺伝子の転写がウイルスＤＮＡ複製を必要とするのかは分かっていない。本発明者らのデータは、ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７及び９５がＵＬ７５（ｇＨ）及びＵＬ９９（ｐｐ２８）後期ｍＲＮＡに必要であることを示している。これらのウイルスタンパク質はウイルスＤＮＡ複製の前に発現され、ウイルスＲＣに組み込まれる。ＲＣは、部分的にはウイルスＤＮＡ鋳型を濃縮することにより、ウイルス遺伝子発現のためのフォーカスとして機能する。ＵＬ４４タンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製前にＩＥ蓄積部位に組み込まれた。ＩＥ２タンパク質は後期遺伝子転写に十分ではないので、ＵＬ４４がＵＬ７９、８７及び９５と共にＩＥ２フォーカスに動員されることにより後期遺伝子転写に適した環境を提供したとは考えにくい。ＵＬ４４タンパク質がＵＬ７９、８７及び９５のタンパク質と直接的に相互作用するという証拠はない。ＵＬ４４は構造的に真核生物の増殖細胞細胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ；ＰＣＮＡ）と相同であり、ＰＣＮＡは複数のタンパク質と相互作用する（３０）。近年のプロテオーム解析により、ＵＬ４４タンパク質がウイルス複製関連タンパク質以外の転写因子を含む広範なタンパク質と相互作用することが実証された（１３、４４〜４６）。したがって、ＵＬ４４タンパク質が後期遺伝子転写のタイミングを最適化していると考えられる。ＨＣＭＶ ＲＣはまた、ヘルペスウイルス複製タンパク質（すなわち、ＨＳＶ ＩＣＰ８、ＵＬ９、及びヘテロ三量体ヘリカーゼ−プライマーゼ複合体ＵＬ５−ＵＬ８−ＵＬ５２）に相同な５種類のウイルスタンパク質も含有する。これらのヘルペスウイルス複製タンパク質がまずウイルスの複製前駆体微小フォーカスに組み込まれ、続いてこれらのフォーカスにポリメラーゼ及びポリメラーゼアクセサリータンパク質が動員される（４）。しかしながら、培地にＰＡＡを添加した場合、ＨＣＭＶ ＵＬ８７タンパク質はＳＳＢ ＵＬ５７タンパク質と共局在しなかった。ＨＣＭＶでは、ＨＣＭＶ ＵＬ５７の微小フォーカスは後期遺伝子転写を実現するための足場としては機能しないように思われるが、ウイルスＤＮＡ複製の開始後には重要な役割を果たすようである。
【００８９】
本願では、ＵＬ７９、８７及び９５タンパク質が後期ウイルスｍＲＮＡに必要であり、したがってウイルス増殖に必要とされることが示された。ＵＬ７９、８７若しくは９５ ＯＲＦに突然変異を導入することによりこれらのＯＲＦの発現を低下又は消失させることによって、ウイルス複製を抑制し、弱毒化したＨＣＭＶは、ワクチンとして使用する上で、天然ウイルスの構造を保持するという利点を有する。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、ＨＣＭＶを治療又は予防するためのワクチンが提供される。
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）及びそのワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ベータヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。そのウイルスゲノムは２４０，０００ｂｐを有し、少なくとも１５０個の予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（９、５６）。ＨＣＭＶによる感染は多くの個体で生じるが、通常は無症候性である。このウイルスは免疫抑制条件下で再活性化し、肺炎、肝炎、腎炎、及び消化器疾患の病原となる。このウイルスは、線維芽細胞、上皮細胞及び内皮細胞などの最終的に分化した細胞、ならびに単球由来マクロファージにおいて、産生的に複製される（１１、１２、１８、２７、４０、４１、４７）。
【０００３】
産生的複製の間、ＨＣＭＶ遺伝子群は、前初期（ＩＥ）、初期及び後期と呼ばれる一時的カスケードで発現される。主要ＩＥ遺伝子群（ＭＩＥ）であるＵＬ１２３／１２２（ＩＥ１／ＩＥ２）は、その後のウイルス遺伝子発現及びウイルス複製の効率において決定的な役割を果たす（１９、２０、２３、３２−３４）。初期ウイルス遺伝子はウイルスＤＮＡ複製に必要なタンパク質をコードする（３５）。ウイルスＤＮＡ複製に続いて、遅延初期及び後期ウイルス遺伝子が発現され、これらはウイルス粒子のための構造タンパク質をコードする。これに関連して、ＭＩＥ遺伝子プロモーターのシス作用性エレメント（ｃｒｓ）配列の一部に突然変異を有し、これによってウイルス複製が不能ではないが抑制されている弱毒化組換えヒトサイトメガロウイルスが特許文献１に開示されている。
【０００４】
真性後期（true late）（γ−２クラス）ウイルス遺伝子の発現は、ウイルスＤＮＡ合成の阻害により妨げられる。ＵＬ７５（ｇＨ）及びＵＬ９９（ｐｐ２８）は、真性後期転写産物によりコードされるＨＣＭＶ遺伝子の２つの例である（２５、３１、５２）。ＨＣＭＶ前初期遺伝子及び初期遺伝子発現の制御は集中的に研究されてきているが、後期遺伝子発現を制御する特異的メカニズムについてはほとんど知られていない。
【０００５】
ＨＣＭＶでは、ＩＥ２タンパク質は感染後初期の微小フォーカス（microfoci）中に見出すことができ、直接的なＤＮＡ接触により親ウイルスゲノムと会合している。一部の微小フォーカスは拡大して、感染後の後期に複製コンパートメント（ＲＣ）を形成する（４２）。しかしながら、ＨＣＭＶのＩＥ遺伝子群単独では真性後期ウイルス遺伝子の活性化に十分ではない。どのＨＣＭＶ初期遺伝子が後期遺伝子発現に必要とされるのかは知られていない。
【０００６】
マウスガンマヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ−６８）のＯＲＦ１８、２４、３０及び３４は、後期遺伝子転写に必須である（３、５３、５４）。これらの不存在が初期ウイルス遺伝子発現又はＤＮＡ複製にほとんど影響を及ぼさないことから、これらの遺伝子産物は、後期遺伝子のプロモーターを刺激するために特異的に機能すると考えられる。したがって、後期遺伝子発現は、ウイルスＤＮＡ複製のみならず、それらのウイルスによりコードされるトランス作用性因子にも依存している。
【０００７】
ＤＮＡポリメラーゼ進行因子（DNA polymerase processivity factor）（ＵＬ４４）及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）（ＵＬ５７）をはじめとするＨＣＭＶウイルスＤＮＡ複製タンパク質群は、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ＲＣに似た大型の核構造中に局在する（３６、３８）。ＨＳＶ感染細胞では、ウイルスＤＮＡ合成を阻害剤ホスホノ酢酸（ＰＡＡ）で阻害した場合、ウイルスによりコードされるＳＳＢ（ＩＣＰ８）タンパク質を含有する小型のウイルス前複製部位又はフォーカスが観察される（６、２９、３７）。ＰＡＡの不存在下では、ＢｒｄＵがウイルスＤＮＡに取り込まれて、ＤＮＡは子ウイルスと共存して見出される（７、５７）。ＨＣＭＶでは、ＵＬ４４タンパク質は、感染後初期の段階では、ＳＳＢ（ＵＬ５７）タンパク質含有フォーカスと常に共存しているわけではない（３６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−０９２８５４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dunn, W., C. Chou, H. Li, R. Hai, D. Patterson, V. Stolc, H. Zhu, and F. Liu. 2003. Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:14223-14228. （文献９）
【非特許文献２】Yu, D., M. C. Silva, and T. Shenk. 2003. Functional map of human cytomegalovirus AD169 defined by global mutational analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:12396-12401. （文献５６）
【非特許文献３】Fish, K. N., W. Britt, and J. A. Nelson. 1996. A novel mechanism for persistence of human cytomegalovirus in macrophages. J. Virol. 70:1855-1862. （文献１１）
【非特許文献４】Fish, K. N., A. S. Depto, A. V. Moses, W. Britt, and J. A. Nelson. 1995. Growth kinetics of human cytomegalovirus are altered in monocyte-derived macrophages. J. Virol. 69:3737-3743. （文献１２）
【非特許文献５】Ibanez, C. E., R. Schrier, P. Ghazal, C. Wiley, and J. A. Nelson. 1991. Human cytomegalovirus productively infects primary differentiated macrophages. J. Virol. 65:6581-6588. （文献１８）
【非特許文献６】Lathey, J. L., and S. A. Spector. 1991. Unrestricted replication of human cytomegalovirus in hydrocortisone-treated macrophages. J. Virol. 65:6371-6375. （文献２７）
【非特許文献７】Sinzger, C., A. Grefte, B. Plachter, A. S. H. Gouw, T. Hauw The, and G. Jahn. 1995. Fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, and smooth muscle cells are the major targets of human cytomegalovirus infection in lung and gastrointestinal tissues. J. Gen. Virol. 76:741-750. （文献４０）
【非特許文献８】Sinzger, C., B. Plachter, A. Grefte, A. S. H. Gouw, T. H. The, and G. Jahn. 1996. Tissue macrophages are infected by human cytomegalovirus. J. Infect. Dis. 173:240-245. （文献４１）
【非特許文献９】Taylor-Wiedeman, J., J. G. Sissons, L. K. Borysiewicz, and J. H. Sinclair. 1991. Monocytes are a major site of persistence of human cytomegalovirus in peripheral blood mononuclear cells. J. Gen. Virol. 72:2059-2064. （文献４７）
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【非特許文献２０】Sourvinos, G., N. Tavalai, A. Berndt, D. A. Spandidos, and T. Stamminger. 2007. Recruitment of human cytomegalovirus immediate-early 2 protein onto parental viral genomes in association with ND10 in live-infected cells. J. Virol. 81:10123-10136. （文献４２）
【非特許文献２１】Arumugaswami, V., T. T. Wu, D. Martinez-Guzman, Q. Jia, H. Deng, N. Reyes, and R. Sun. 2006. ORF18 is a transfactor that is essential for late gene transcription of a gammaherpesvirus. J. Virol. 80:9730-9740. （文献３）
【非特許文献２２】Wong, E., T. T. Wu, N. Reyes, H. Deng, and R. Sun. 2007. Murine gammaherpesvirus 68 open reading frame 24 is required for late gene expression after DNA replication. J. Virol. 81:6761-6764. （文献５３）
【非特許文献２３】Wu, T. T., T. Park, H. Kim, T. Tran, L. Tong, D. Martinez-Guzman, N. Reyes, H. Deng, and R. Sun. 2009. ORF30 and ORF34 are essential for expression of late genes in murine gammaherpesvirus 68. J. Virol. 83:2265-2273. （文献５４）
【非特許文献２４】Penfold, M. E., and E. S. Mocarski. 1997. Formation of cytomegalovirus DNA replication compartments defined by localization of viral proteins and DNA synthesis. Virology 239:46-61. （文献３６）
【非特許文献２５】Sarisky, R. T., and G. S. Hayward. 1996. Evidence that the UL84 gene product of human cytomegalvorus is essential for promoting oriLyt-dependent DNA replication and formation of replication compartments in cotransfection assays. J. Virol. 70:7398-7413. （文献３８）
【非特許文献２６】de Bruyn Kops, A., and D. M. Knipe. 1988. Formation of DNA replication structures in herpes virus-infected cells requires a viral DNA binding protein. Cell 55:857-868. （文献６）
【非特許文献２７】Lukonis, C. J., and S. K. Weller. 1996. Characterization of nuclear structures in cells infected with herpes simplex virus type 1 in the absence of viral DNA replication. J. Virol. 70:1751-1758. （文献２９）
【非特許文献２８】Quinlan, M. P., L. B. Chen, and D. M. Knipe. 1984. The intranuclear location of a herpes simplex virus DNA-binding protein is determined by the status of viral DNA replication. Cell 36:857-868. （文献３７）
【非特許文献２９】de Bruyn Kops, A., and D. M. Knipe. 1994. Preexisting nuclear architecture defines the intranuclear location of herpesvirus DNA replication structures. J. Virol. 68:3512-3526. （文献７）
【非特許文献３０】Zhong, L., and G. S. Hayward. 1997. Assembly of complete, functionally active herpes simplex virus DNA replication compartments and recruitment of associated viral and cellular proteins in transient cotransfection assays. J. Virol. 71:3146-3160. （文献５７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書において、本発明者らは、ＨＣＭＶのＯＲＦであるＵＬ７９、８７及び９５が、後期ウイルスｍＲＮＡ及び感染性ウイルス産生に必須であるが、ウイルスＤＮＡ複製には必須ではないことを示す。ＵＬ８７タンパク質とＵＬ９５タンパク質はウイルスＤＮＡ複製の前にウイルスゲノムと組み立てられて、ウイルスのＵＬ４４タンパク質及びＵＬ１２２（ＩＥ２）タンパク質ならびに細胞の転写因子ＴＢＰを含む微小フォーカスを形成することが明らかとなった。ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦに突然変異を導入することにより、ＨＣＭＶの弱毒ウイルスを作製することを本発明の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７及び９５タンパク質が、感染性ウイルス増殖には必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされないこと、真性後期ウイルスｍＲＮＡの産生に必須であることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５遺伝子ＯＲＦを突然変異させた弱毒ＨＣＭＶを作製し、本発明を完成させた。
【００１２】
具体的には、本発明は、以下の特徴を有する。
〔１〕ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７又は９５遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の１つ若しくは複数からの発現が低下又は消失している、弱毒ＨＣＭＶ。
〔２〕前記突然変異が、ＯＲＦ中への塩基の挿入によるものである、上記〔１〕に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
〔３〕前記弱毒ＨＣＭＶからの感染性ウイルス増殖は野生型ウイルスと比較して低下しているが、ウイルスＤＮＡ複製は野生型ウイルスと同等である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
〔４〕後期ウイルスｍＲＮＡの発現が野生型ウイルスと比較して低下している、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の弱毒ＨＣＭＶ。
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の弱毒ＨＣＭＶを有効成分として含む、ＨＣＭＶ感染の予防又は治療用ワクチン。
〔６〕アジュバントをさらに含む、上記〔５〕に記載のワクチン。
〔７〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の弱毒ＨＣＭＶ又は上記〔５〕若しくは〔６〕に記載のワクチンを非ヒト動物に免疫して抗体を作製するステップ、及び該抗体を回収するステップを含む、抗ＨＣＭＶ抗体の作製方法。
〔８〕前記抗体がヒト抗体である、上記〔７〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、ウイルス複製が抑制された弱毒化ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を提供することができ、該弱毒化ウイルスは、ワクチンとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡの構造を示す図である。（ａ）ｗｔ（野生型）、ＲｄｌＵＬ７９＋Ｆ、ＲｄｌＵＬ８７＋Ｆ及びＲｄｌＵＬ９５＋Ｆの組み換えＢＡＣ ＤＮＡを示す模式図である。ＯＲＦに突然変異を有する組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを構築する場合、ＦＲＴ配列をＯＲＦの中央部に挿入し、次いでＦＬＰ媒介組み換えによりＫａｎＲを切り出し、３４ｂｐのＦＲＴ配列のみを残した。（ｂ）ＵＬ９５及びＵＬ８７ＯＲＦに融合したエピトープを含む組み換えＢＡＣ ＤＮＡの模式図である。ＵＬ９５ＯＲＦと融合したＨＡエピトープを挿入する場合、逆選択を行なって薬剤耐性カセットを除去した。ＢＡＣＵＬ９５Ｎｎｅｏ＋Ｓｔ又はＢＡＣＵＬ９５Ｃｎｅｏ＋Ｓｔの構築のために、ＲｐｓＬ遺伝子（ストレプトマイシンに対する感受性を増大させる）及びネオマイシン耐性マーカー（カナマイシン耐性を付与するため）を含有するマーカーカセットをそれぞれＵＬ９５ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端に挿入した。中間体ＢＡＣクローンはカナマイシン耐性に基づいて単離した。相同組み換えの第２ラウンドでは、マーカーカセット全体をオリゴヌクレオチドを用いたカウンター選択によりＨＡエピトープを含む配列と置き換えた。ＵＬ８７ＯＲＦのＣ末端に融合したｍｙｃエピトープを含む組み換えＢＡＣを構築するために、ＢＡＣＨＡＵＬ９５及びＢＡＣＵＬ９５ＨＡの構築後に逆選択を繰り返した。（ｃ）ｗｔ（親ウイルス）及び組み換えＢＡＣのＰＣＲ分析を示す。ＰＣＲ産物は表２に示されるプライマーを用いて増幅し、３．０％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、配列決定した。レーン１、２、５、６及び９：ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ；レーン３、４、７、８及び１０：ＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ；レーン１１：ｗｔ。
【図２】ＵＬ７９、８７及び９５がウイルス増殖に必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされないことを示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩでウイルスを感染させた。ウイルス力価は５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより決定した。（ａ〜ｃ）ウイルス増殖曲線を示す。（ｄ〜ｆ）ウイルスＤＮＡ複製を示す。ウイルスＤＮＡはｇＢプライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲにより定量化した。１８Ｓプライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲも、内部対照として用いるために行なった。データは３回の独立した実験の平均である。（ａ）及び（ｄ）：ＲｄｌＵＬ７９；（ｂ）及び（ｅ）：ＲｄｌＩＬ８７；（ｃ）及び（ｆ）：ＲｄｌＵＬ９５。
【図３ａ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ａ〜ｃ）ＩＥ１（左パネル）、ＵＬ７５（ｇＨ）（中央パネル）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）（右パネル）についてのノザンブロットである。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡをＲＮＡロード量の等量の対照として用いた。（ａ）ＲｄｌＵＬ７９感染細胞。レーン１、３及び５：ＨＦＦ細胞；レーン２、４及び６：ＵＬ７９融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞；レーン１及び２：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン３及び４：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン５及び６：３ｄ．ｐ．ｉ．。
【図３ｂ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ａ〜ｃ）ＩＥ１（左パネル）、ＵＬ７５（ｇＨ）（中央パネル）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）（右パネル）についてのノザンブロットである。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡをＲＮＡロード量の等量の対照として用いた。（ｂ）ＲｄｌＵＬ８７感染細胞。ＵＬ８７融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞；レーン１及び２：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン３及び４：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン５及び６：３ｄ．ｐ．ｉ．；レーン７及び８：ＰＡＡの存在下での２ｄ．ｐ．ｉ．。
【図３ｃ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ａ〜ｃ）ＩＥ１（左パネル）、ＵＬ７５（ｇＨ）（中央パネル）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）（右パネル）についてのノザンブロットである。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡをＲＮＡロード量の等量の対照として用いた。（ｃ）ＲｄｌＵＬ９５感染細胞。ＵＬ９５融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞。レーン１及び２：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン３及び４：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン５及び６：ＰＡＡの存在下での２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン７及び８：３ｄ．ｐ．ｉ．。
【図３ｄ】組み換えウイルス感染後のＵＬ７５、９９及び４４後期ｍＲＮＡについて示す図である。補充タンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで突然変異型組み換えウイルスを感染させた。ＰＡＡの存在下又は非存在下で細胞質ＲＮＡを１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。（ｄ）ＵＬ４４転写産物についてのＲＮａｓｅ保護アッセイ。３ＭＯＩでのＲｄｌＵＬ７９感染後１、２及び３日に細胞質ＲＮＡを回収した。２０μｇのＲＮＡを３２Ｐ標識アンチセンスＵＬ４４プロモータープローブと３７℃で一晩ハイブリダイズさせ、続いてＲＮａｓｅＴ１で消化した。アンチセンスＵＬ４４プローブはすべてのＵＬ４４転写産物の転写開始部位の上流配列を含んでいる。保護されたＲＮＡ断片を変性６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。レーン１：ＲＮａｓｅＴ１を含まないプローブ；レーン２、４及び６：ＨＦＦ細胞；レーン３、５及び７：ＵＬ７９融合タンパク質を発現するＨＦＦ細胞；レーン２及び３：１ｄ．ｐ．ｉ．；レーン４及び５：２ｄ．ｐ．ｉ．；レーン６及び７：３ｄ．ｐ．ｉ．。矢印１、２及び３はそれぞれ開始部位１、２又は３から開始する転写産物を示す。
【図４】ＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質及びＵＬ９５−ＨＡ融合タンパク質が感染後の初期に発現されることを示す図である。ウイルスＤＮＡ合成をＰＡＡ又はＧＣＶにより阻害した。前初期ｐＩＥ８６及びｐＩＥ７２（ＵＬ１２２及び１２３）、ＨＡ若しくはｍｙｃエピトープ、又はＧＡＰＤＨに対する抗体を用いて、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下でのＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃの感染後の示した時点でウエスタンブロット分析を行なった。ＧＡＰＤＨはロード量対照として用いた。（Ａ）抗ＨＡ抗体、（Ｂ）抗ｍｙｃ抗体、（Ｃ）抗ＩＥ７２／ＩＥ８６抗体、抗ＵＬ４４抗体、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体。
【図５】ＵＬ７９、８７及び９５タンパク質の複製コンパートメントへの動員を示す図である。（Ａ）対応するＯＲＦが突然変異した組み換えウイルス感染後のＵＬ７９、８７又は９５−ｍｃｈｅｒｒｙ融合タンパク質とＵＬ４４との局在を示す。ＲｄｌＵＬ７９（ａ）、ＲｄｌＵＬ８７（ｂ）又はＲｄｌＵＬ９５（ｃ）に感染させた細胞を固定し、処理した。（ａ）ＵＬ７９−ｍｃｈｅｒｒｙ及びＵＬ４４タンパク質；（ｂ）ＵＬ８７−ｍｃｈｅｒｒｙ及びＵＬ４４タンパク質；（ｃ）ＵＬ９５−ｍｃｈｅｒｒｙ及びＵＬ４４タンパク質。（Ｂ）ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ感染後のＵＬ９５−ＨＡ及びＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質、ＵＬ４４タンパク質、及びウイルスＤＮＡの局在を示す。ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた細胞を、示したｄ．ｐ．ｉ．で回収した。細胞を固定し、抗体を用いて顕微鏡観察のために又はＦＩＳＨ分析のために処理した。（ａ〜ｃ）ＵＬ９５−ＨＡタンパク質とＵＬ８７−ｍｙｃタンパク質との共局在；（ｄ）ＵＬ９５−ＨＡタンパク質とＵＬ４４タンパク質との共局在；（ｅ）ウイルスＤＮＡとＵＬ４４タンパク質との共局在；（ａ）１ｄ．ｐ．ｉ．；（ｂ、ｄ及びｅ）２ｄ．ｐ．ｉ．；（ｃ）３ｄ．ｐ．ｉ．。
【図６−１】ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下でのＵＬ９５−ＨＡ又はＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質の局在を示す図である。ＰＡＡ（ａ、ｃ、ｅ及びｇ）又はＧＣＶ（ｂ、ｄ及びｆ）の存在下でＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた細胞を２ｄ．ｐ．ｉ．で処理した。（ａ及びｂ）ＨＣＭＶ ＤＮＡとＵＬ４４タンパク質との共局在；（ｃ及びｄ）ＵＬ９５−ＨＡとＵＬ４４との共局在；（ｅ及びｆ）ＵＬ８７−ｍｙｃとＵＬ４４タンパク質との共局在。
【図６−２】ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下でのＵＬ９５−ＨＡ又はＵＬ８７−ｍｙｃ融合タンパク質の局在を示す図である。ＰＡＡ（ａ、ｃ、ｅ及びｇ）又はＧＣＶ（ｂ、ｄ及びｆ）の存在下でＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた細胞を２ｄ．ｐ．ｉ．で処理した。（ｇ）ＵＬ８７−ｍｙｃとＵＬ５７タンパク質との共局在。
【図７】ウイルスＤＮＡ複製前のＵＬ８７とＩＥ２タンパク質及びＵＬ４４とＴＢＰタンパク質の局在を示す図である。ＰＡＡの非存在下（ａ及びｄ）若しくはＰＡＡの存在下（ｂ及びｅ）又はＧＣＶの存在下（ｃ及びｆ）で細胞をＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させ、２ｄ．ｐ．ｉ．で回収し、抗体で処理した。（ａ〜ｃ）ＵＬ８７−ｍｙｃとＩＥ２タンパク質との共局在；（ｄ〜ｆ）ＵＬ４４タンパク質とＴＢＰとの共局在。
【図８】３ＭＯＩでのｗｔ、ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ及びＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃの増殖曲線を示す図である。ウイルス力価は５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前述したように、本発明は、ＨＣＭＶのＯＲＦであるＵＬ７９、８７及び９５が、後期ウイルスｍＲＮＡ及び感染性ウイルス産生に必須であるが、ウイルスＤＮＡ複製には必須ではないとの知見に基づく。具体的には、ＵＬ７９、８７若しくは９５ ＯＲＦに突然変異を導入することによりこれらのＯＲＦの発現を低下又は消失させることによって、ウイルス複製の抑制、ひいてはＨＣＭＶの弱毒化を可能にした。ホルマリンなどの化学物質での処理による弱毒化では、外被（エンベロープ）タンパク質の変性などの問題も生じかねないが、本発明の弱毒化ウイルスは天然ウイルスの構造を保持するという利点を有する。
【００１６】
＜ＨＣＭＶ＞
本発明の対象であるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、すべてのウイルス株を包含するものとする。ＨＣＭＶは、ヘルペスウイルス科βヘルペスウイルス亜科に属し、その直径が約１８０ｎｍで約２３０ｋｂｐの塩基数からなる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＣＭＶの株には公知の株が含まれ、例えば、ＡＤ１６９株、Ｔｏｗｎｅ株、Ｍａｊｏｒ株、ＢＴ１９４３株、Ｄａｖｉｓ株、Ｍｅｒｌｉｎ株、Ｔｏｌｅｄｏ株、３１５７株、６３９７株、３３０１株、Ｃ８７株などが知られている（Ｄｏｌａｎ，Ａ．ら，２００４，Ｊ．Ｇｅｎ。Ｖｉｒｏｌ．８５：１３０１−１３１２；Ｃｈｅｅ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１２５−１６９）。
【００１７】
上記のＨＣＭＶ株のゲノム配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ、米国）などに蓄積されたデータから入手可能である。例えば、一般によく知られているＡＤ１６９株及びＴｏｗｎｅ株のゲノム配列はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＦＪ５２７５６３、ＡＹ３１５１９７として登録されている。
【００１８】
ＨＣＭＶは、ヒト線維芽細胞、例えばヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣ２５０９）やヒト胎児線維芽細胞、ヒト内皮細胞、例えばヒト毛細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＣ−２５２７）やヒト網膜色素内皮細胞（ＲＰＥ）（ＡＴＣＣ Ｃ４０００−１）などのヒト細胞に感染することができる。したがって、これらの細胞に、ＨＣＭＶ又はそのウイルスベクター、例えばＨＣＭＶゲノム配列とＢＡＣ（細菌人工染色体）配列から作製されたＨＣＭＶＢＡＣ、を感染又は導入することによってウイルスＤＮＡを回収することができる（Ｄｕｎｎ，Ｗ．ら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００（２４）：１４２２３−１４２２８）。
【００１９】
ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７及び９５ＯＲＦは、後期転写のためのウイルストランス作用因子として知られるＭＨＶ−６８のＵＬ１８、２４及び３４と相同性を有するが、本願以前にはその機能は未知であった。本発明者らは、以下の実施例に示すように、これらのＯＲＦが、感染性ウイルス増殖には必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされないこと、真性後期ウイルスｍＲＮＡの産生に必須であることを見出した。
【００２０】
例えば、ＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ３１５１９７）のＵＬ７９、８７及び９５ＯＲＦ配列は、以下の通りである。他のＨＣＭＶ株のＵＬ７９、８７及び９５ＯＲＦ配列も、ＧｅｎＢａｎｋなどの公知の遺伝子バンク又は文献などから入手可能である。
ＵＬ７９ＯＲＦ塩基配列（配列番号１）：ａｔｇａｔｇｇｃｃｃｇｃｇａｃｇａａｇａｇａａｃｃｃｃｇｃｃｇｔｃｃｃｇｃｇｇｇｔｃｃｇｃａｃａｇｇｃａａａｔｔｃｔｃｃｔｔｔａｃｔｔｇｃｇｃｃａａｔｃａｔｃｔａａｔａｔｔａｃａｇａｔｔａｇｃｇａｇａａｇａｔｇｔｃｇｃｇｃｇｇａｃａｇｃｃｇｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｔｇｃｇｔｔｔｇｇａａｇａａｃｔｃａａａａｔｃｇｔａｃｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｃｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｔｃａｃｃｇｃｇｇｔｃｔｃｇａａａｃｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｇｃｇａａａｃｔａｔｇａａｃａａｃｃｔｇｇｇｔｇｔｃｔｃｇｇａｃｃａｃｇｃｃｇｔｇｃｔｔａｇｃｃｇｃａａｇａｃｇｃｃｇｃａａｃｃｃｔａｃｔｇｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｔａｃｃｇｃｇａａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｔｇａｇｇｃｇｇｃｃｇｔｇｔｔｃｇａｔｇａａａｃａｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｔｃｔｃａｇｃｃａｇｃｇｃｃｔｇｔｇｔｃａｃｃｃｇｃｇｃｔｔｇａｇｃｇｇｃｇｇａｃｔｇｃｔｇａｃｇｃｇｃｔｔｔｇｔｇｃａｇｃｇｃｃａｃａｃｃｇｇｃｃｔｇｃｃｇｇｔｃｇｔｔｔｔｃｃｃｃｇａａｇａｃｃｔｇｇｃｇｃｇｃａａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｃｔｔｃｔｃｃｃｔａｇｇｃａｃｇｃｔｃｔａｃｇｇａｃａｃｃｇｃｃｔｇｔｔｔｃｇｔｃｔｇｇｃｇｇｃｃｔｔｃｔｔｃａｃａｃｇｃｃａｃｔｇｇｇｇｔｇｃｃｇａａｇｃｇｔａｃｇａａｃｃｃｔｔｇａｔｔｃｇｃａｔｃａｔｃｔｇｔｃａａａａａａｔｇｔｇｇｔａｃｔｔｔｔａｔｃｔｃａｔｃｇｇｃａｃｃｇｇｃａａｇａｔｇｃｇｃａｔｔａｃｃｃｃｃｇａｃｇｃｃｔｔｃｇａｇａｔｃｃａｇｃｇｇａｇｔｃｇａｃａｃｇａａａｃｇｇｇｃａｔｔｔｔｔａｃｃｔｔｔａｔｔａｔｇｇａａｇａｔｔａｃａｇａａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇｃａｃｇｃｔｇｔｃｃｃｇｇｃａｃｃｃｇｃａｃｃｇｔｃｃｇｃａｃｃｃａｃａａｃａｇｃａｇｃａｇｃａｃｃａｃｃａｃｃｃｃｇｇｔｃｃｃｃｃｃｃａｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｔｃｔｃａｃｃｃｔｇｃｃｔｃｇｔｃｃｔｇｔｃｔｃａａｃｃｃａｇａｇｇｃｃｇｔａｃｔｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｇｃｃｃｔｔｃａｔａｔｇｃｃｇａｃｇｃｔｇｇｃｔａａｃｇａｃｇｔｇｔｇａ
【００２１】
ＵＬ７９ＯＲＦアミノ酸配列（配列番号２）：ＭＭＡＲＤＥＥＮＰＡＶＰＲＶＲＴＧＫＦＳＦＴＣＡＮＨＬＩＬＱＩＳＥＫＭＳＲＧＱＰＬＳＳＬＲＬＥＥＬＫＩＶＲＬＩＣＶＬＬＦＨＲＧＬＥＴＬＬＬＲＥＴＭＮＮＬＧＶＳＤＨＡＶＬＳＲＫＴＰＱＰＹＷＰＨＬＹＲＥＬＲＱＡＦＰＧＬＤＦＥＡＡＶＦＤＥＴＲＡＡＲＬＳＱＲＬＣＨＰＲＬＳＧＧＬＬＴＲＦＶＱＲＨＴＧＬＰＶＶＦＰＥＤＬＡＲＮＧＮＩＬＦＳＬＧＴＬＹＧＨＲＬＦＲＬＡＡＦＦＴＲＨＷＧＡＥＡＹＥＰＬＩＲＩＩＣＱＫＭＷＹＦＹＬＩＧＴＧＫＭＲＩＴＰＤＡＦＥＩＱＲＳＲＨＥＴＧＩＦＴＦＩＭＥＤＹＲＴＦＡＧＴＬＳＲＨＰＨＲＰＨＰＱＱＱＱＨＨＨＰＧＰＰＨＰＰＬＳＨＰＡＳＳＣＬＮＰＥＡＶＬＡＡＲＡＬＨＭＰＴＬＡＮＤＶ
【００２２】
ＵＬ８７ＯＲＦ塩基配列（配列番号３）：ａｔｇｇｃｃｇｇｃｇｃｔｇｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｃｔａａｔａｇｔｃｇｔｃｇｇｃｇｇｃｔｃｃｇｃｔａｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇｇｇｔｔｔｔａｃａｃｇｔｃｃｃｃｇｔｇｃａｃｇｔｔｃｇｃｇｃｃｔｇｃａａｃｃｔｃａｃｃｃａａｇａｇｃｔａｔｃｇａｃｇｇｇｃｇａｇｇａｃｇｃｃｃｇｃｔｔｃｔｇｔｃｇｔｃｃｇｃｇａｃｃｃｇｔｔａａｃｇｔｃｇａａｃｇｇｇｔａｃｇｃｇｃｔｇｔｔｔｔｃｇｃｇｇｃｔｃｔｃｔａｃｃｇｔｇｃｃｔｇｔｃｃｃｇｔａｃａｃｇｃｇａｇｇａｃｃｇａｇｔｃｃｇａｇｃｇｔｇｔｃａａｇｃｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｔｃｇｔｃｔｇｔｔｇｃｔｇｇｇａｃｃｃｇｔｇｇｃｃｇｔａｃｃｃｔｇｔｔｔｔｔｇｃｇａｃｇｇｔｇａａｇｔｇｇａｇｇｇｃｃａｃｇｇｃｇａｇｃａｔｃｔｇｇｔａｃｃｃａｃｇａｃｇｃａｇｔｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｇｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔａｃｇｔｇｃａｃｃｇａｃｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｃｇｇａｔｃｃｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｔｇｔｃｃｔａｃｃａｃｇｔｔｃｔｃｇａａａａｃｃａｃｇｔｇｇｃｃａｃｇｃａｔｇｔｇｔｔａｃｇｃｇｇａｔｔｇｃｔｃｔｃｇｃｔｇａｃｇｇａａｔｇｇａａｔｃｇａｇａｇｔｔｇｃｃｇｇｇｃｃｔｔｔｔｔｔｇｃｇａｃｔｇｔｃｃｔｇｇｃａｇｃｇｇｔｇｇｃｇｃｃｔｔｇｇｇａａｃｃｇａｇｇａａｃｇｃｔａｃｇｃｃａｔｇｇｃｃｔｇｃｔｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｃｃｔｃａｇｃｃｔｇｃａｃｃｔｇｇａｃｇａｃｔａｔｃｃｔｔａｃｃｔｇａｔｇｇｔｇｇａａａｔｃｇｇａｃｇｃｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔｃａｇｃｇａｇｇｔａｇａｃｇａｃｔａｃｇｔａａｃｃｇｃｃｇｔｃｔｃｃｇｇｃｔａｃｃｔｇｇｇｃｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃｇｃｃｇｃｇｃａｔｔｃａｇｇｔｔｃａｃｔａｃａａｇｃｔｇｃｔｃｔｔｔｇｇａｃｔｃａａｃｇｔｇｃｇｔｃｃｇｃａａｇｃｇｃｃｇｔｇｃｇｃｇｔｔｇｇａｃｇｃｔａｃａｃｇｃｇａｃｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃａａａａｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｔｔｇａａｔａｔｃａｃｃａｃｇａａｇｔｃａｃｇｔｃｇｇａｇｔｔｔｔｔｃｇｇｔｃｇｃｇｔａｃｔｇｇｃｔｃａｇｃｔｇｃａｔｃｇｃｇａｃｃｇｃｇｃｃｃｇｃｇｔｃａｔｇａｔｇｇｃａｃｔｔｃｇｃｔｔｇｃｃｃｇａｇｃａｇａｃｇｇｔｇｔｇｃｃａｃｃｔａａｇｃａｃｃｔｔｃｇｔｔｃｔｃａｇｔｃｇｃｔｔｃａａｇｃｇａｃａｇｇｔａｃｔｇｔａｃｔｔｃａａｇｔｔａｃａｇｇｔｇａｇｃｔａｃｇｇｃａａｇｔｇｃｃｇｇａｃｔｇｇｃｃａｃｇｃｔｇａｃａｇａａｇｔｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｇａａａｃｇｇｔｇｇａａｇｔｃａｇｇｇａｃａｃｃａｃａａｃｃｔａｃｔｇｔｇｔｔａｔｃｇａｃｇｔｃｔｔａｇｃｇｔｃａｃｇｔｔｔｇｃｃｇａｃａｃｇｇａｃａｃｇｇｔｇｔｇｇａｇａａａｃｃｔｔｔｔｃｔａｃｇｔｔｔａｔｔａｔｇａａｃｔａｇｃｔｃｇｇｇａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｇｇｇａｃａｇａｇｇａｃｃｇａｔｃｃｇｔａａｇｃｃｇｃｇｇｔｔａｃｇｇｔｇｔｔｔｃｔｔｇｃｇｃｔｃｃｇａｇｇａｃｇｔｃｇｃｇｇｃｔａｃｃａｃｃｇｔｃａｇａａｃｃｇａｃｇｇｔｇｇｔｔｔｃａｇｃｃａａｃｇｇａｃａｃｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｃｃａｃｃｇｃｇｃｔｃｃｃｇａｃｇａｃｇａｇｃｇｃｇｇｇｔｃａｃａａｇｃｔｇｔｃｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｃｃｃｇｇｃｃｇｃａｇａｔｃｇｃｇｔｔｃｇａｃｇｔｔａｃｇｔｇｔｇｃａｔｔａｔｃｔｃｇｃｇｔｃｔｃａｔｇｔｔｃｇｃｃｃｇｇｔａｔｇｇｇｇａｇａｇａｔｇｇｃｇｔａａａｃａｃｃｇｔｃｇａｃｇｇｃｇｇｔｃｇｇａｇａｃｇｇｇａｇａａｇａｇｇａｇｇａｇｇａａｇａｇａｃｇｇｔｇｇａａｔｃｇｇｇｇｇａｇａｃｔｇａｃｇｃｃａｃｇｃｃｇｃｃａｔｔｔｇａｃｔｔｔａｃｇｇｇｇｃａｇｃａｇｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃｔａｔｃａｇｇａａｃａｃｃｇａｃｇｔｃｇｔａａａｃａｔｃｔａｇｃｃｇｔｇｃａｇｃｇｔｔａｃｇｃｇｃｃｇｔｇｃｃｇｔｃｇｔａａｇｃｔｃａｔｃｇｇｃｇｇｇａｔｇｇａｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｇｔｇａｃｇｇｇｃｇｔｔａｇｔｃｔｇｇａｃｃｇｃａｔｃｇｃｃｇｔｃａａｃｇｃｔｔｔｃａａｃａｃｃａａｃｃｇｃｇｔｔａｔｃａａｔａｔｇａａｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｔｃｇｔｃｃａｔｃｇｃｃｇｃｇｔｃｇｇｇｔｃｔｃｇｇｃｇｔｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇｃｇｇｃｔｔｃｃｃａａｇａａｃａｔｇａｃｃｃａｃａｇｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｔａｃａａｇｃａｃａｃｃｔｔｃａａｇｇａｇｃｃｃｇｃｔｔｇｃａｃｃｇｔｃａｇｃａｃｔｔｔｔｇｔｔｔｃｃａａｃｇａｃｇｃｃｇｔｃｔａｃａｔｃａａｃｔｃｇｃｔｃａａｃｇｔｃａａｔａｔｔｃｇｃｇｇｔｔｃｃｔａｔｃｃｃｇａｇｔｔｔｃｔｇｔａｃｔｃｇｃｔｇｇｇｃｇｔｇｔａｃｃｇｇｃｔｇｃａｃｇｔｔａａｔａｔｃｇａｔｃａｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｇｔｇｔｇｃａａｃａｇｃａａｃｔｃｃｔｃｇｃｔｇｇａｃｇｔｇｃａｔｇｇｇｃｔｇｇａｇｇａｃｃａｇｇｃｇｇｔｇａｔｃｃｇｃｔｃｇｇａｇｃｇｃａｇｃａａｇｇｔｇｔａｃｔｇｇａｃｃａｃｃａａｃｔｔｔｃｃｇｔｇｃａｔｇａｔｃｔｃｇｃａｔａｃｔａａｃａａｃｇｔｃａａｃｇｔｇｇｇｔｔｇｇｔｔｃａａａｇｃｇｇｃｔａｃｇｇｃｃａｔｔｇｔｇｃｃｇｃｇｃｇｔｃｔｃｇｇｇｃｇｃｔｇａｃｃｔｇｇａａｇｃｃａｔｔｃｔｇｃｔｃａａａｇａａｃｔｃｔｃｇｔｇｃａｔｃａａｇａａｃａｔｇｃｇｃｇａｃｇｔｇｔｇｃａｔｃｇａｔｔａｃｇｇｔｃｔｇｃａｔｃｇｃｇｔｔｔｔｃａｃｇｃａａｃｔａｇａｇｃｔｇｃｇｃａａｔｔｃｇｔａｃｃａｇａｔｃｃｃｃｔｔｃｃｔｇｇｃｃａａｇｃａｇｔｔｇｇｔｇｃｔｇｔｔｔｃｔｇｃｇｔｇｃｔｔｇｃｃｔｇｃｔｃａａｇｃｔｇｃａｃｇｇｔｃｇａｇａｇａａｇｃｇｇｃｔｇｃａｇｔｔｇｇａｃｃｇｃｃｔａｇｔａｔｔｔｇａｇｇｃｇｇｃａｃａｇｃｇｇｇｇｔｃｔｃｔｔｔｇａｃｔａｃａｇｃａａｇａａｃｃｔｃａｃｇｇｃｇｃａｃａｃｃａａｇａｔｃａａｇｃａｃａｃｔｔｇｃｇｃｇｃｔｃａｔｃｇｇｃａｇｔｃｇｔｃｔａｇｃｃａａｃａａｃｇｔｇｃｃｃａａｇａｔｃｃｔｇｇｃｃｃｇｇａａｃａａａａａａｇｔｃａａａｔｔｇｇａｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｇｇａａｃｇｃｃａａｃｇｔｇｃｔｇａｃｇｇｔｇｔｇｔｃｇｇｃａｃｇｔｇｇａａｇｃｃｃａｃａａｇａｔｃｃｃｔｃｇｃａｃｇｃｇｃｃｔｃａａａｇｔｇｔｔａｇｔｃｇａｇｇｔｇｃｔｇｇｇｃｇｃｇｔｔｇｃａｇａｇｔａｔｃａｇｃｇｇｔａｃｇｃｃｇｃａｃａｃｇｃｇｔｇａａｇｔｇａｔｃｃａｃｃａｇａｃｇｔｔｇｔｔｔｃｇａｔｔｇｔｇｃｔｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃａｇｃｃａｃｃｔｃｇｇｇｃｃｔｇｔｇｔｔｃａｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃａｔｔｇｔｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃａｔｃｔｔｃｃｔｃｃｇｃｃｃｃｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｃｔｃｃｇｔｃａｇｃｇｔｔｇａｃｇｇｃａｇｔｔｃｔｇａａｃｃｃａｃｇｔｃｇｃｃｇｃｇａｇｃｇｃｇｇｔｔｔｇｃａｔｃａｃｇａｔｇａ
【００２３】
ＵＬ８７ＯＲＦアミノ酸配列（配列番号４）：ＭＭＥＡＡＡＡＡＡＡＡＦＲＰＥＥＲＰＴＰＧＷＨＤＡＡＬＬＭＤＤＧＴＶＲＥＨＡＦＲＮＧＰＬＳＱＬＩＲＲＶＬＰＰＰＰＤＡＥＤＤＶＶＦＡＳＥＬＣＦＹＣＳＧＲＦＮＲＲＳＳＶＦＳＩＹＷＱＫＨＳＤＬＶＹＡＬＴＧＩＴＨＣＡＫＬＶＶＥＣＧＱＬＧＳＧＲＬＲＷＲＤＧＤＶＧＧＥＥＲＲＧＤＤＤＳＲＤＥＬＹＤＶＰＧＩＹＭＩＲＶＮＤＧＧＳＴＧＰＲＨＶＩＷＰＧＴＳＶＬＷＡＰＤＶＶＩＴＴＶＱＲＲＩＳＡＡＲＡＬＶＮＴＦＲＱＹＦＦＬＬＥＲＲＳＨＥＥＬＶＬＣＰＰＥＭＥＥＲＬＡＰＬＬＱＳＡＴＲＧＤＳＤＭＦＤＧＶＶＡＳＡＹＨＲＬＲＩＳＮＩＰＲＳＳＡＲＬＬＥＨＣＶＧＬＡＧＡＫＫＬＬＬＬＤＶＰＲＬＥＮＹＦＬＣＱＶＣＬＹＥＬＤＥＤＥＭＧＥＥＭＬＧＭＬＡＧＫＰＥＤＡＡＶＳＧＡＳＧＧＦＬＬＨＲＫＴＭＫＬＡＡＣＬＣＬＬＬＮＳＬＨＬＨＱＥＡＬＥＡＬＤＰＰＰＰＲＶＥＥＮＤＬＶＮＶＶＬＲＲＹＹＲＳＨＧＧＶＱＡＲＴＬＡＡＡＲＡＬＬＡＤＹＡＥＴＦＳＰＬＧＳＦＴＲＬＧＹＤＲＬＶＳＡＤＡＧＶＳＲＲＨＬＶＡＬＬＲＡ
【００２４】
ＵＬ９５ＯＲＦ塩基配列（配列番号５）：ｔｇａｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｃｇａｇｃｇｇａｇｇｔｔａｇｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇａｇａｇｇａｇａｇｇａａａａａｇａｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｇｇａｃｇａｃｇｇａｇｇａｔｃｃａｃｃｃｇａａａａｃｃａｃｇｔｔｇｔｔｇｃｇｇａｃｇｔｇｇｃｔｔｇｔｇｇｇａｃｇｇｇｃｇｃｃｇｔｃａｃｔｃｇｔｔｃｇｔｃｔｔｃｇｔｃｇｔｃｃｃｔａｇｔｇｇｔｇｔｃｇｔｃｔｔｃｃｔｃｇｇｃｇｔｃａｇｇｃｔｃｇｇａｃｇａａｃｃｔｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｃｔｃｃｔｃｔｃａｇｔｔｔｃｃｃｃｇｔｃｔｇｃｔｃｃｃｃｃｔｃａａｃｔｇｃｃｇｔｃａｇｇｔｃｔｃｃｇｇｇｇｔｃｃｇｃｃｇｇｇｇｔｔｔｃａａｃｇｔｃｃｃｔｇｔｇｃｔｃｇｇｔｇｇａａｃｇｇａｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｔｃｇｇｃｇｃａｇｔｃｔｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇａｔｔｔｃｔｃｇｇｔｃｔｃｃｇａｇｇｃｔｔｇｇｃｇｃｔｔｃｇａｇｇａｇｇｃｃｇｔａａａｔａｔｇｇｃｇｃｔｇｇｔｇｇｃｃｔｇｃｇａｇｇｃｃｇｔｇｔｃａｃｃｔｔａｃｇａｔｃｇｃｔｔｔｃｇｃｃｔａａｔｔｇａａａｃｇｃｃｃｇａｃｇａｇａａｔｔｔｃｔｔｇｔｔｇｇｔｃａｃｃａａｃｇｔａａｔｔｃｃｇｃｇｃｇａｇｔｃｇｇｃｃｇａｇｇｔｇｃｃｇｇｔｇｔｔｇｇａｔａｇｃａｇｔａｇｃａｇｃｇｇｔｇｇｃｇａｔａｇｃｇｇｇｃｃｇｇａｇｇａｃａａａａａｇａａａａａｃｇｔｃｇｇｇａａｔａａａａｃｃｇｃｇｇｇｇｇａａａａｇａａｃｇｇｃｇｇｔｇｇｇｔｃｔｃｇｇｇｃｃａａａｃｇｃｃｇｔｃｇｔａｇａｃｇａｃｇｃｇｃｔｃｃｇａａａａａｃｇａｃｇｃｃｇｃｃａｃｇｃｃｇｔｃｔｔｔｔｃｔａｃｇｔｃｇａｃａｃｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｇｃｇｔｔｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇａｇｃｃｔｔｔｇｃｃｇｔｃｇｃｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇａｔｔａｔｇｃｇｔｔａｃｇｃａａｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｔａｃｃｔａｃｇａｃｇｇｃｇａａｔｔａａｔｃｔａｃｇｇｃａｇｔｔａｃｃｔｇｔｔｇｔａｔｃｇｃａａｇｇｃｔｃａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇｔｃａｃｔｃｔｃｃａｇｃａａｃａａｇｇｔｇｃａａｃａｃｇｔｇｇａａｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃｇａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｇｃｃｇｇｇｃｔｔｇｔｔａｇａｔｃａｔｃａｃａａｃｇｔｇｔｇｃｇａｃｇｔｇｇａｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｔａｃｔｇｃｇｇａｃｃｇｃｇｔａｇｃｔｔｔｔｇｃｇｃｇｃｇｔｇａｃａｃｃｔｇｔｔｔｃｇｇｔｃｇｃｇａａａａａａａｃｇｇｔｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｃｃｇｃｇｔｔｇｔｔｇｃｃｃａａａｃｔｃｔｔｔｔａｃｇａａｃｃｃｇｔｇｃｇｇｇａｃｔａｔａｔｇａｃｃｔａｃａｔｇａａｔｃｔｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｔａｃｇｔｃｔｔｔｇｔｔｔｇｇｔａｔｃｇｃｇｇｃｔａｃｇａａｔｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｇａｃｇｃｃｇｃａｇｇｃｇａｃｇａｃｇｇｃｇｇｇｔａｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｇｃｇｃｔｔｇｔｇｃｇｇｔｃｇａｇａｃｇａｇｃｇｃｇｔｃａｇｃａｇｇｃｃｇｇｇｔｃｇａｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｇａｃｇａｇｇｔｇｃａｔｔｔｇｃｃｔｔｔａａａｇｃｃｃｇｔｃｔｃｇｃｔｇｇａｃｃｇｔｃｔｃａｇａｇａｇｇｔｇｔｔｇｃａｇｇｃｇｇｔｇｃｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｃｔｃｇｇｇｇｃｇｃｇａｇｇｔｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｃｇｔｃｇｃｇｃａｃｃｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｇｃｇｃｇｃｔｃｔａｃａｇｔｃａｇａａｃｃｇｔｃｔｃｔｇｔｔｔａｇａｔｃｔｃｇｃｇｃｇｔｇａｃｇａｇｇｃｇｃｇｇａｃｃｇｔｇａｇｔｔａｔａｇｃｃｃｃａｔｃｇｔｔａｔｃｃａａｇａｃｔｇｃｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇｔｃａｃｃｇａｃｇｔｃａｃｔｔｔｇａｇｃｃａｃａｔｃｔｔｇｃｃｃｇｇｃｃａｇａｇｃａｃｃｇｔｃｔｃｇｃｔｔｔｔｃｃｃｃｇｔｃｔａｃｃａｃｇｔｃｇｇａａａｇｔｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｃｃｔｃｔｃｇｃｔｇａａｃｇａｃｇｃｇｇｇｔｃｔｃａｔｃａｃｇｔｔｇａａｔｃｔａｔｇａ
【００２５】
ＵＬ９５ＯＲＦアミノ酸配列（配列番号６）：ＭＭＡＡＡＶＶＲＡＥＶＲＲＱＲＲＥＥＲＫＫＭＡＡＡＲＴＴＥＤＰＰＥＮＨＶＶＡＤＶＡＣＧＴＧＡＶＴＲＳＳＳＳＳＬＶＶＳＳＳＳＡＳＧＳＤＥＰＳＳＡＳＰＬＳＦＰＶＣＳＰＳＴＡＶＲＳＰＧＳＡＧＶＳＴＳＬＣＳＶＥＲＭＶＥＬＳＡＱＳＰＡＡＤＦＳＶＳＥＡＷＲＦＥＥＡＶＮＭＡＬＶＡＣＥＡＶＳＰＹＤＲＦＲＬＩＥＴＰＤＥＮＦＬＬＶＴＮＶＩＰＲＥＳＡＥＶＰＶＬＤＳＳＳＳＧＧＤＳＧＰＥＤＫＫＫＮＶＧＮＫＴＡＧＥＫＮＧＧＧＳＲＡＫＲＲＲＲＲＲＡＰＫＮＤＡＡＴＰＳＦＬＲＲＨＤＶＬＥＲＦＡＡＡＡＥＰＬＰＳＬＣＶＲＤＹＡＬＲＮＡＤＲＶＴＹＤＧＥＬＩＹＧＳＹＬＬＹＲＫＡＨＶＥＬＳＬＳＳＮＫＶＱＨＶＥＡＶＬＲＱＶＹＴＰＧＬＬＤＨＨＮＶＣＤＶＥＡＬＬＷＬＬＹＣＧＰＲＳＦＣＡＲＤＴＣＦＧＲＥＫＮＧＣＰＦＰＡＬＬＰＫＬＦＹＥＰＶＲＤＹＭＴＹＭＮＬＡＥＬＹＶＦＶＷＹＲＧＹＥＦＰＡＰＴＰＱＡＴＴＡＧＳＧＧＧＧＧＡＧＡＣＡＶＥＴＳＡＳＡＧＲＶＤＤＡＧＤＥＶＨＬＰＬＫＰＶＳＬＤＲＬＲＥＶＬＱＡＶＲＧＲＦＳＧＲＥＶＰＡＷＰＡＳＳＲＴＣＬＬＣＡＬＹＳＱＮＲＬＣＬＤＬＡＲＤＥＡＲＴＶＳＹＳＰＩＶＩＱＤＣＡＡＡＶＴＤＶＴＬＳＨＩＬＰＧＱＳＴＶＳＬＦＰＶＹＨＶＧＫＬＬＤＡＬＳＬＮＤＡＧＬＩＴＬＮＬ
【００２６】
＜弱毒化＞
本発明では、ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦを突然変異させることにより不活性化して、ＨＣＭＶを弱毒化する。
【００２７】
本明細書中で使用される「弱毒化」との用語は、ウイルスの毒性（すなわち、感染性及び病原性）を減弱させることを意味する。
【００２８】
ＯＲＦの不活性化は、ＯＲＦから最終的に翻訳されるタンパク質の発現を阻害すること、又は機能が抑制されたタンパク質を発現させることを意味する。ＯＲＦを不活性化させるための突然変異は、例えばＯＲＦ配列の一部若しくは全部を別のヌクレオチド配列によって置換すること、又はＯＲＦの内部での配列の欠失、付加若しくは挿入によって行なうことができる。好ましくは、ＯＲＦの内部への別の配列の挿入により、ＯＲＦを不活性化する。しかし、ＯＲＦの機能を阻害することができれば、突然変異の程度（例えば配列同一性の程度）、突然変異の方法などは限定されないものとする。
【００２９】
ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦが不活性化されることにより、ＨＣＭＶの複製が抑制される。本発明により、ＯＲＦへの突然変異の導入によって、組み換えＨＣＭＶの複製能が約１／１０以下、１／５０以下、好ましくは１／１００以下に抑制される。
【００３０】
本発明の組み換えＨＣＭＶは、ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦの一部又は全部に突然変異を導入したゲノムＤＮＡを、適切なベクターを利用して作製し、これを適切な宿主細胞、例えば上記のヒト線維芽細胞やヒト内皮細胞に感染させ、組み換えウイルス粒子を回収することを含む手順によって作製することができる。突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発法、相同組み換え法などの公知の方法によって導入することができる。部位特異的突然変異誘発法は、例えば、野生型ＨＣＭＶのＵＬ７９、８７又は９５配列の一部又は全部に突然変異を導入し、それに隣接する野生型配列と同一の十分な長さの配列を配置したヌクレオチド配列を合成し、クローニングベクターに導入して大腸菌などの細菌中にサブクローニングすること、野生型ＨＣＭＶゲノムＤＮＡを含む人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）を作製し、次いで、上記ヌクレオチド配列を人工染色体ベクターにアニーリングし、ＰＣＲを行い、目的ＤＮＡを増幅することなどを含む。
【００３１】
具体的な方法として、例えば大腸菌内でバクテリオファージλ組み換えタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔａ及びｇａｍを発現するための迅速相同組み換え系（Ｅｌｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：６７４２−６７４６）、ＨＣＭＶのＢＡＣ（細菌人工染色体）ＤＮＡ（Ｄｕｎｎ，Ｗ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１４２２３−１４２２８；Ｌｅｅ，Ｅ−Ｃ．ら（２００１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７３：５６−６５；Ｂｏｒｓｔ，Ｅ−Ｍ．ら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（１０）：８３２０−８３２９）などを使用して突然変異誘発を行なうことができる。
【００３２】
組み換えのためのＨＣＭＶの二本鎖ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子と７０ｂｐ程度の相同ウイルスＤＮＡ配列を含み、この耐性遺伝子には、３４ｂｐの最小ＦＲＴ部位を連結させることができる（後述の実施例１参照）。ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦの突然変異体を作製するために、適切なプライマーを使用してＰＣＲによる増幅を行なう。ＰＣＲ条件は、例えば、９４℃２分の変性を１サイクル、９４℃１５秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング及び７２℃１分の伸長を３０サイクル、並びに７２℃５分の伸長を１サイクルとするＰＣＲサイクルプログラムからなる。ＰＣＲ増幅産物をフェノール−クロロホルムで抽出し、９５％エタノールで沈殿する。
【００３３】
残存する鋳型ＤＮＡを除去するため、ＰＣＲ産物を制限酵素を用いて消化したのち、得られたＤＮＡ断片を、ＨＣＭＶ−ＢＡＣ ＤＮＡを含むコンピテント大腸菌へ、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム法などの手法、好ましくはエレクトロポレーションを用いて形質転換する。
【００３４】
カナマイシン耐性遺伝子を欠失させるために、組み換えＨＣＭＶ−ＢＡＣ ＤＮＡを大腸菌に形質転換する。また、リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＣＰ２０（Ｈａｈｎ，Ｗ．ら（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０７：１６４−１７７）を、組み換えＨＣＭＶ−ＢＡＣ ＤＮＡを含む大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）に形質転換する。カナマイシン耐性遺伝子を含まないＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを、アンピシリン及びクロラムフェニコール含有ＬＢプレート上で選択する。
【００３５】
ＨＦＦ細胞などの細胞を、リン酸カルシウム沈殿法によって、プラスミドｐＳＶｐｐ７１の存在中、上記の各組み換えＢＡＣでトランスフェクションする。約１０日後にウイルスプラークが出現し、１００％細胞変性作用（ＣＰＥ）の７日後に、細胞外液を回収し、約１：１０に希釈したものと未希釈のものを調製し、ＨＦＦ細胞などの細胞に感染させ、組み換えウイルスを回収する。このとき、ウイルスの選択は、ＯＲＦに所望の突然変異が導入されていることを配列決定によって確認すること、及びＨＦＦ細胞などの細胞に導入又は感染させてウイルス複製が抑制されていることを確認し、また、野生型の表現型と同一又は本質的に同一であることを確認することによって行なうことができる。
【００３６】
＜ワクチン＞
本発明はさらに、弱毒化ＨＣＭＶを含むことを特徴とする、ＨＣＭＶ感染症を治療又は予防するためのワクチンを提供する。
【００３７】
ワクチンは、一般に生ワクチンと不活性化ワクチンに大別される。特に生ワクチンは安価に製造可能であることや接種回数が少なくても高い効果が期待できるなどの利点を有するが、同時に毒性復帰にリスクを有する。本発明の弱毒化ＨＣＭＶは、顕著にウイルス複製が抑制されたウイルスであるため、安全性の高い生ワクチンとして使用可能であると考えられる。
【００３８】
本発明のワクチンは、ＡＩＤＳ患者、臓器移植患者などの免疫抑制患者、胎児、乳幼児、高齢者、重症患者などの抵抗性が低下したヒトに対し、肺炎、肝炎、網膜炎、胃腸炎などを含む広範な疾患を引き起こす可能性のあるＨＣＭＶ感染の予防及び治療のために使用可能である。ＨＣＭＶは、血液、尿、唾液などを介して感染するウイルスであり、上記のヒトに感染すると重症化する場合がある。そのような感染を抑制するために、本発明のワクチンは有効である。
【００３９】
本発明のワクチンは、適切な賦形剤、特に希釈剤、例えば滅菌水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝液などとともに処方することができる。また、ブドウ糖、トレハロース、エタノール、グリセリンなどの添加剤を含有させることができる。さらにまた、免疫応答を増強させるためのアジュバント、例えば水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、ムラミルジペプチド、サポニン類、リポ多糖、リポゾーム、消化性ポリマー（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２６３−１２７６（１９９５））などをその有効量で含有させてもよい。さらにまた、安定化剤を添加することも可能であり、安定化剤としては、ゼラチン、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、ポリソルベートなどの界面活性剤、スクロース、トレハロースなどの糖類、メチオニン、リジンなどのアミノ酸類などが挙げられる。
【００４０】
投与方法は、例えば皮下、筋肉内又は皮内注射、鼻腔内などの粘膜投与を含む。鼻腔内投与の場合、噴霧器による投与が望ましい。投与量は、例えば１０３〜１０１１ＰＦＵウイルス／ｋｇ体重、又は１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇの用量であるが、この範囲に制限されない。ワクチンの投与量は、患者などの被験体の状態、年齢、体重、性別、重症度などを考慮に入れて、医師の裁量で判断されるべきである。被験体は、１回又は２回以上の投薬を受容でき、複数回投与の場合、１週間〜１ヵ月以上の間隔、例えば２、３、５、１２、１８又は２４ヵ月間隔で投与することができる。
【００４１】
＜抗体の作製＞
本発明はさらに、上記弱毒化ＨＣＭＶを非ヒト動物に免疫して抗体を生成させ、該抗体を回収することを含む、抗ＨＣＭＶ抗体の作製方法を提供する。
【００４２】
抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのいずれのクラスでもよいし、またＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などのいずれのサブクラスでもよい。さらにまた、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、組み換え抗体のいずれでもよい。組み換え抗体には、例えば単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）などが含まれる（浅野竜太郎、生化学、７７（１２）：１４９７−１５００（２００５））。抗体フラグメントには、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどがある。
【００４３】
また、抗体には、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体なども包含され、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
抗体の作製は、慣用の方法で行なうことができる。
【００４４】
ポリクローナル抗体は、弱毒化ＨＣＭＶ粒子を動物に免疫し、抗血清、さらにＩｇＧ画分を回収することによって作製できる。
【００４５】
モノクローナル抗体は、弱毒化ＨＣＭＶ粒子を免疫した動物（例えばマウス、ラットなど）から脾臓を取り出し、脾臓細胞又はリンパ球とミエローマ細胞とを融合させ、該ＨＣＭＶ粒子抗原と特異的に免疫反応する抗体をスクリーニングすることによって作製できる。
【００４６】
ヒト抗体は、ヒト抗体産生非ヒト動物（例えばＫＭマウス、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）を用いて作製することができる。あるいは、弱毒化ＨＣＭＶ粒子を免疫した動物のゲノムから抗体遺伝子を回収し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３コード配列を決定し、ヒト抗体遺伝子の本来のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３コード配列を前記ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３コード配列と置換することを含む遺伝子組み換え技術を用いてヒト化抗体を作製することができる。
上記の抗体は、ポリエチレングリコールなどの分子によって化学修飾することもできる。
【００４７】
上記のようにして得られた抗体は、ＨＣＭＶ感染症の治療及び予防のために使用することができ、或いはＨＣＭＶの検出のために使用することもできる。ここで、ＨＣＭＶの検出のために、抗原−抗体反応を利用する手法のいずれを使用することもできる。そのような手法には、例えば均質法、固相法（例えばサンドイッチ法）などが含まれる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、該実施例によって制限されないものとする。
【００４９】
実施例１
突然変異型若しくはエピトープタグ付けされたＵＬ７９、８７、又は９５ＯＲＦを有する組み換えウイルスの構築
ウイルスＤＮＡ複製及び後期ｍＲＮＡに対するＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７、又は９５の影響を調べるために、ＵＬ７９、８７又は９５のＯＲＦを中断する突然変異を有する組み換えウイルスを構築した。
【００５０】
＜材料と方法＞
細胞及びウイルス
初代ヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞を、以前に報告されているように（４３）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したイーグルの最小必須培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ウイルスＤＮＡ複製を阻害するために、ホスホノ酢酸（ＰＡＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（２００μｇ／ｍＬ）、又は９−［（１，３−ジヒドロキシ−２−プロピル）メチル］グアニン（ガンシクロビル［ＧＣＶ］，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（４５０μＭ）を、感染時及び感染して維持する間、培地に添加した。
【００５１】
ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦを発現するＨＦＦ細胞を作製するために、Ｎｏｌａｎ博士の研究室から入手したプロトコールに従いレトロウイルス系を使用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｎｏｌａｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｐｒｏ＿ｈｅｌｐｅｒ＿ｄｅｐ．ｈｔｍｌ）。ＵＬ７９及び９５ＯＲＦは、それぞれ、ＸｈｏＩＵＬ７９ＯＲＦＦ及びＨｉｎｄＩＩＩＵＬ７９ＯＲＦＲ、並びにＸｈｏＩＵＬ９５ＯＲＦＦ及びＨｉｎｄＩＩＩＵＬ９５ＯＲＦＲのプライマーペアを用いて、ＨＣＭＶ ＴｏｗｎｅのＢＡＣ ＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーの配列は表１に示してある。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＬＢＣ（２）（スタンフォード大学Ｎｏｌａｎ博士の許可を得て、Ｆｒｅｄ Ｈｕｎｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｅｎｔｅｒのＫｉｅｍ博士から供与された）にクローニングし、その結果、ＯＲＦのＣ末端にｍｃｈｅｒｒｙ（京都大学医学系研究科、松田博士より供与された）が融合された。ｐＬＢＣは、ＥＢＶゲノムのＥＢＮＡ１ ＯＲＦ及びＯｒｉＰ配列を有する、組み換えレトロウイルスの構築のためのシャトルベクターである。ＵＬ９７ＯＲＦ配列はＡＴＧ開始コドンから８１５ヌクレオチド（ｎ．ｔ．）に制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はｐＬＢＣへのＯＲＦのクローニングに必要である。ＵＬ８７の１〜８１４ｎ．ｔ．の領域をまずプライマーＸｈｏＩＵＬ８７ＯＲＦＦ及びＵＬ８７ＨｉｎｄＩＩＩ（８１５）Ｒを用いるＰＣＲにより増幅し、ｐＬＢＣの対応する制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列決定した（愛知県がんセンター中央研究所）。続いて、８１５〜２８２６ｎ．ｔ．の領域を、ＵＬ８７（８１５）ＨｉｎｄＩＩＩＦ及びＨｉｎｄＩＩＩＵＬ８７ＯＲＦＲのプライマーペアを用いるＰＣＲにより増幅し、ＵＬ８７の１〜８１４ｎ．ｔ．の領域を有するｐＬＢＣのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列決定した。各ＯＲＦを含有するシャトルベクターをパッケージング細胞株であるＰｈｏｅｎｉｘ−ＧＡＬＶ（１７）（Ｎｏｌａｎ博士の許可を得て、Ｋｉｅｍ博士から供与された）にトランスフェクションすることにより、レトロウイルスストックを調製した。ＨＦＦ細胞を組み換えレトロウイルスに感染させ、ピューロマイシン選択下でｐＵＬ７９−ｍｃｈｅｒｒｙ、ｐＵＬ８７−ｍｃｈｅｒｒｙ又はｐＵＬ９５−ｍｃｈｅｒｒｙ発現細胞集団を作製した。
【００５２】
野生型（ｗｔ）ＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ、ＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ、ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ、ＲｄｌＵＬ７９、ＲｄｌＵＬ８７、又はＲｄｌＵＬ９５のウイルス力価は、ＨＦＦ細胞又はｐＵＬ７９、８７若しくは９５−ｍｃｈｅｒｒｙ発現ＨＦＦ細胞に対する標準的なプラークアッセイにより、以前に記載されているように決定した（３４）。ウイルス力価は、段階希釈で感染させた単層ＨＦＦ細胞でのＧＦＰ蛍光フォーカスによっても決定した。感染後の種々の時点で細胞及び上清を回収し、３回の凍結融解サイクルに供した。ウイルス力価を、ＨＦＦ細胞又はｐＵＬ７９、８７若しくは９５−ｍｃｈｅｒｒｙ発現ＨＦＦ細胞での５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより決定した。ＴＣＩＤ５０を算出するために、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いた。野生型ウイルス及び組み換えウイルスは、置き換え可能な１０ｋｂ ＵＳ１−ＵＳ１２領域（ＵＳ：ユニークショート）をＧＦＰ遺伝子で置換されている。
【００５３】
ウイルスＤＮＡ複製
３ＭＯＩでの感染後、２、３及び４ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。３個の３５ｍｍプレート中の細胞を、５０μｇ／ｍＬプロテアーゼＫを含有する溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ及び２０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ）中に懸濁した。複製したウイルスＤＮＡをＨＣＭＶ ｇＢプライマー及び以前に記載されたプローブ（２０、２３）を用いるリアルタイムＰＣＲにより測定した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した１８Ｓプライマー及びプローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、入力ＤＮＡの内部対照としても機能した。データは３回の独立した実験の平均である。
【００５４】
ＨＣＭＡ ＢＡＣ ＤＮＡの突然変異誘発
バクテリオファージλ組み換えタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔａ及びｇａｍを発現する大腸菌（ＮＩＨのＣｏｕｒｔ博士から供与された）での迅速相同組み換えシステムを、以前に記載されているように用いた（１０）。ＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株のＢＡＣ ＤＮＡはＬｉｕ博士（カリフォルニア大学）から供与された（９）。ＯＲＦを欠損した組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡの構築に際して、ＯＲＦの中央にＦＲＴ配列を挿入し、隣接する遺伝子への３４ｂｐ配列の影響を最小限に抑えた。さらに、隣接遺伝子の調節領域が除去される可能性を除外するために、ヌクレオチドを欠失させることはしなかった。ＢＡＣｄｌＵＬ７９Ｋａｎ＋ＦＲＴ、ＢＡＣｄｌＵＬ８７Ｋａｎ＋ＦＲＴ及びＢＡＣｄｌＵＬ９５Ｋａｎ＋ＦＲＴ（図１ａ参照）の組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを作製するために、組み換えのための二本鎖ＤＮＡを、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（ＮＥＢ）を鋳型として、ＢＡＣｄｌＵＬ７９ＦＲＴＦＫａｎＦ及びＢＡＣｄｌＵＬ７９ＦＲＴＲＫａｎＲ、ＢＡＣｄｌＵＬ８７ＦＲＴＦＫａｎＦ及びＢＡＣｄｌＵＬ８７ＦＲＴＲＫａｎＲ、並びにＢＡＣｄｌＵＬ９５ＦＲＴＦＫａｎＦ及びＢＡＣｄｌＵＬ９５ＦＲＴＲＫａｎＲのプライマーペアをそれぞれ用いるＰＣＲにより増幅した。プライマー配列は表２に示してある。
【００５５】
ＢＡＣＵＬ９５Ｎ ｎｅｏ＋Ｓｔ及びＢＡＣＵＬ９５ ｎｅｏ＋Ｓｔを作製するために、プラスミドｐＲｐｓＬ−ｎｅｏ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を鋳型として、ＢＡＣＵＬ９５Ｎｎｅｏ＋ＳｔＦ及びＢＡＣＵＬ９５Ｎｎｅｏ＋ＳｔＲ、並びにＢＡＣＵＬ９５Ｃｎｅｏ＋ＳｔＦ及びＢＡＣＵＬ９５Ｃｎｅｏ＋ＳｔＲのプライマーペアをそれぞれ用いるＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを増幅した。プライマー配列は表２に示してある。プラスミドｐＡＣＹＣ１７７又はｐＲｐｓＬ−ｎｅｏ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）は、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）又はＫａｎＲ及びストレプトマイシン耐性遺伝子をそれぞれ含有する。組み換えのために増幅された二本鎖ＤＮＡは、最小ＦＲＴ部位（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’）（１５）、又はＲｐｓＬｎｅｏ遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）に連結されたＫａｎＲ遺伝子、及び７０ｂｐの相同ウイルスＤＮＡ配列を含有していた。ＤｐｎＩでの３７℃、１．５時間の消化の後に、ＰＣＲ産物をゲル精製し、親ＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを含有するＤＹ−３８０に形質転換した。相同組み換え後、ＫａｎＲ及びＦＲＴ配列、又はＲｐｓＬ−ｎｅｏ遺伝子を含有する突然変異型ＢＡＣ ＤＮＡはカナマイシンに対して耐性であった（図１を参照）。
【００５６】
ＦＲＴ配列を含む突然変異型ＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡからＫａｎＲ配列を切り出すために、ＦＲＴを介した組み換えを、以前に記載されているように用いた（２３）。プラスミドｐＣＰ２０（Ｍａｘ ｖｏｎ Ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，ＧｅｍａｎｙのＨｕｈｎ博士から供与された）を組み換えＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを含むＤＨ１０Ｂに形質転換した。カナマイシンを含まないＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。ＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦの欠失を有する組み換えＢＡＣ ＤＮＡを選択するために、ＵＬ７９ｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ７９ｄｅｔｅｃｔＲ、ＵＬ８７ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ８７ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＲ、並びにＵＬ９５ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ９５ＢＡＣｄｅｔｅｃｔＲのプライマーペアをそれぞれ用いてＰＣＲ分析を行なった。プライマー配列は表１に示してある。ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決定し、組み換えを確認した（愛知県がんセンター中央研究所）。
【００５７】
逆選択を、以前に記載されているように行なった（２１、５０）。ＲｐｓＬはストレプトマイシン感受性遺伝子を付与するので、突然変異型ＢＡＣ ＤＮＡを、Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）を用いて増大したストレプトマイシン耐性に基づいて選択した。ＢＡＣＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡを構築するために、オリゴヌクレオチドＢＡＣｏｌｉｇｏＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５Ｃｏｌｉｇｏを用いてそれぞれ逆選択した（図１ｂ参照）。オリゴ配列は表２に示してある。
【００５８】
組み換えＢＡＣＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ（図１ｂ参照）を構築するために、ＢＡＣＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡの構築後に、逆の手順を繰り返した。ＢＡＣＵＬ８７Ｃｎｅｏ＋ＳｔＦ及びＢＡＣＵＬ８７Ｃｎｅｏ＋ＳｔＲのプライマーペアを用いるＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡを増幅し、ＢＡＣＨＡＵＬ９５又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡを含有するＤＹ−３８０に形質転換した。プライマー配列は表２に示してある。ＢＡＣＨＡＵＬ９５ｎｅｏ＋Ｓｔ又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡｎｅｏ＋Ｓｔを、カナマイシン含有プレート上で選択した。ＢＡＣＵＬ８７ｏｌｉｇｏのオリゴヌクレオチドを用いる逆選択を行なった後、ＢＡＣＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃ又はＢＡＣＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃを上記のように増大したストレプトマイシン耐性に基づいて選択した（図１参照）。
【００５９】
ＨＡ−ＵＬ９５、ＵＬ９５−ＨＡ及びＵＬ８７−ｍｙｃを含む組み換えＢＡＣ ＤＮＡを選択するために、ＵＬ９５ＮｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ９５ＮｄｅｔｅｃｔＲ、ＵＬ９５ＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ９５ＣｄｅｔｅｃｔＲ、並びにＵＬ８７ＣｄｅｔｅｃｔＦ及びＵＬ８７ＣｄｅｔｅｃｔＲのプライマーペアをそれぞれ用いてＰＣＲ分析を行なった。プライマー配列は表２に示してある。ＰＣＲ産物は、組み換え及び切り出しを確認するために配列決定した（愛知県がんセンター中央研究所）。
【００６０】
抗体
ＨＡ又はｍｃｈｅｒｒｙでタグ付けした融合タンパク質を検出するために、ラット又はウサギポリクローナル抗体（３Ｆ１０，Ｒｏｃｈｅ又はＰＭ００５，ＭＢＬ，名古屋）をそれぞれ用いた。ｍｙｃエピトープを含む融合タンパク質を検出するために、マウスモノクローナル抗体９Ｂ１１、又はウサギポリクローナル抗体７Ｄ１０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いた。ＩＥ１及びＩＥ２タンパク質、ＩＥ２、ＵＬ４４、ＵＬ５７、ＴＢＰ又は細胞内ＧＡＰＤＨを検出するための抗体は、ＮＥＡ−９２２１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、１２Ｅ２（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）、ＣＡ００６（ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ，Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｒｗｉｃｋ，ＭＥ）、ＣＨ１６７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ｓｃ−２７３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びＭＡＢ３７４（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｕｃｕｌａ，ＣＡ）をそれぞれ用いた。
【００６１】
ウエスタンブロット分析
細胞を感染後の示した時点で回収し、ＰＢＳで洗浄し、以前に記載されているように溶解バッファーで処理した（１９、２０）。２０μｇのタンパク質のアリコートを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために各レーンにロードし、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。増強化学発光検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及び二次西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス、ウサギ、又はラットＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を製造業者の取扱説明書に従って用いた。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
＜結果＞
Ｃ末端に蛍光タンパク質ｍｃｈｅｒｒｙをインフレームで融合させたＵＬ７９、８７又は９５を安定的に発現するＨＦＦ細胞を、組み換えレトロウイルスを用いて単離した。これらの細胞を、組み換えＨＣＭＶを増殖させるために用いた。組み換えＢＡＣ ＤＮＡを親ＢＡＣ ＤＮＡから選択するために薬剤耐性遺伝子が必要であったので、３４ｂｐの最小ＦＲＴ部位に連結されたＫａｎＲを有する組み換えＢＡＣ ＤＮＡをまず構築し、続いてＦＲＴ−ＦＬＰ組み換えによりＫａｎＲを切り出した。図１ａを参照されたい。隣接遺伝子への影響を最小限にするために、ＦＲＴはＯＲＦの中央に挿入した。
【００６５】
本発明者らはまた、ＵＬ８７又はＵＬ９５ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端に融合されたＨＡ又はｍｙｃエピトープを有する組み換えウイルスも構築した。以前に報告されているようにＵＬ９８遺伝子は必須であり（９、５６）、ＵＬ９５ＯＲＦはＵＬ８９と重複しているので、ＵＬ９５のＮ末端へのＨＡエピトープの挿入はＵＬ８９タンパク質の機能に障害を与える可能性がある。したがって、本発明者らは、ＵＬ９５ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端に融合されたＨＡエピトープを有する組み換えウイルスを構築した。
【００６６】
ＵＬ８６は必須であり（１０、５９）、ＵＬ８７とは逆方向に転写されるので、ｍｙｃエピトープをＵＬ８７ＯＲＦのＣ末端に挿入した。ＵＬ８７ＯＲＦのＴＧＡ停止コドンとＵＬ８８のＡＴＧ開始コドンは重複しているので、ｍｙｃエピトープはＵＬ８７ＯＲＦのＴＧＡ停止コドンの前に挿入した。ＯＲＦのＮ末端又はＣ末端にエピトープを挿入するために、逆の手順を行なった。図１ｂに示されているように、マーカーカセットをＲｐｓＬ遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）で置き換え、ストレプトマイシンに対する感受性を増大させた。中間体ＢＡＣクローンは、カナマイシンに対する耐性に基づいて選択した。これらのクローンの完全性はＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりチェックし、正しい位置でのマーカーカセットの挿入はＰＣＲにより確認した。相同組み換えの第２ラウンドでは、マーカーカセット全体をカウンター選択によりエピトープを含む配列と置き換えた。組み換え構築物を、以前に記載されているように（５０）ストレプトマイシンに対する増大した耐性に基づいて単離し、エピトープが挿入された組み換えＢＡＣをＰＣＲにより選択した。ＰＣＲ分析により、組み換えＢＡＣ ＤＮＡ中へのエピトープの挿入が確認された（図１ｃ）。ＤＮＡ配列決定により組み換えを確認し（データは示していない）、突然変異型ＢＡＣの完全性をＨｉｎｄＩＩＩによる消化によってチェックした（データは示していない）。３の高ＭＯＩで、これら組み換えウイルスの増殖を親ウイルス（ｗｔ）と比較した。ＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃは感染４及び５日後（ｄ．ｐ．ｉ．）で野生型と比較して１／２対数ほど遅く複製したが、７ｄ．ｐ．ｉ．までに感染力価は同等となった。ＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃは、４、５及び７ｄ．ｐ．ｉ．で野生型と同等に複製した（図８）。
【００６７】
実施例２
ＵＬ７９、８７及び９５はＨＣＭＶの増殖には必要であるが、ＤＮＡ複製には必要でない
ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７又は９５タンパク質がウイルス増殖又はＤＮＡ複製に必要であるかを決定するために、補充ウイルスタンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞に組み換えウイルスを３ＭＯＩで感染させた。ウイルス力価を１、４、５、７及び９ｄ．ｐ．ｉ．でアッセイし、同数の感染細胞からのＤＮＡを２、３及び４ｄ．ｐ．ｉ．で回収した。突然変異させたＵＬ７９、８７又は９５ＯＲＦを含む組み換えウイルスは、補充ウイルスタンパク質の発現なしではＨＦＦ細胞で感染ウイルスを産生しなかった（それぞれ、図２ａ、ｂ及びｃ）。対照的に、ウイルスＤＮＡは両方のＨＦＦ細胞で同等であった（図２ｄ、ｅ及びｆ）。これらの結果は、ＵＬ７９、８７及び９５がウイルス増殖に必要とされるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要でないことを示している。
【００６８】
実施例３
ＵＬ７９、８７及び９５タンパク質は真性後期（γ２）ウイルスｍＲＮＡに必要とされる
＜材料と方法＞
ノザンブロット分析
以前に記載されたように、感染後１、２及び３日で細胞質ＲＮＡを単離した（５、１６）。２０μｇの細胞質ＲＮＡを２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルでの電気泳動に供し、最大強度のＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）にトランスファーした。ＩＥ１、ＵＬ７５又はＵＬ９９ＤＮＡプローブを用いるノザンブロット分析を以前に記載されているように実施した（２０、２２、２３）。放射標識プローブは３２Ｐ−ｄＣＴＰでの標識により以前に記載されているように作製した（２３）。
【００６９】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ
３２Ｐ標識アンチセンスＵＬ４４ ＲＮＡプローブを以前に記載されているように構築した（２３）。以前に記載されているように（１９、２６）、２０μｇのＲＮＡを３２Ｐ標識アンチセンスＵＬ４４プロモータープローブに３７℃で一晩ハイブリダイズさせ、その後、ＲＮａｓｅＴ１（１００Ｕ）で消化した。保護されたＲＮＡ断片を変性６％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供し、続いてＨｙｐｅｒｆｉｌｍＭＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）でのオートラジオグラフィーに供した。
【００７０】
＜結果＞
ＵＬ７９、８７又は９５タンパク質が真性後期（γ２）ｍＲＮＡに必要とされるかを決定するために、補充ウイルスタンパク質を発現するか発現しないＨＦＦ細胞を、ＰＡＡの存在下又は非存在下で、組み換えウイルスに３ＭＯＩで感染させた。１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で細胞質ＲＮＡを回収し、ＩＥ１、ＵＬ７５（ｇＨ）又はＵＬ９９（ｐｐ２８）ＤＮＡプローブのいずれかを用いてノザンブロット分析によって分析した。ＩＥ１ＲＮＡは、予想される通り、組み換えウイルスを感染させた両方の細胞タイプで１ｄ．ｐ．ｉ．に検出された（図３ａ〜ｃ、左パネル）。
【００７１】
ＵＬ７５プローブを用いると、ＵＬ７５、７６、７７及び７８ｍＲＮＡに対応する３種類のサイズのｍＲＮＡが検出された（図３ａ〜ｃ、中央パネル）。これらのウイルスｍＲＮＡは以前に報告されているように異なる開始部位を有する（４８）。ＵＬ７５の転写方向はＵＬ７６、７７及び７８とは逆方向である（５２）。初期／後期ＵＬ７６〜７８転写産物はＰＡＡの存在下では著明に減少した（図３ｂ及びｃ）。ＵＬ７５転写産物は後期転写産物であり、ＰＡＡの存在下又は補充タンパク質の発現なしにはＨＦＦ細胞で検出されなかった（図３ａ〜ｃ、中央パネル）。
【００７２】
ＵＬ９９ＯＲＦは一連の３’共同末端転写産物内のウイルスゲノムの複合領域に位置する（５１）。すべての転写産物はＵＬ９９ＯＲＦの共通のポリアデニル化部位下流配列を用いる（５１）。ｐｐ２８テグメントタンパク質は１．６ｋｂのｍＲＮＡから翻訳される（１）。以前に報告されているように（１）、ＵＬ９９プローブを用いるノザンブロット分析は、ＰＡＡの存在下で、ＵＬ９９プロモーターからの１．６ｋｂのｍＲＮＡが検出されないこと、したがってＵＬ９９は真性後期遺伝子であることを示した（図３ｂ及びｃ、右パネル）。以前の報告と合致して（５１）、ＰＡＡ処理ＲＮＡの分析から、この領域内の可能性があるＯＲＦのそれぞれの上流から開始されるｍＲＮＡが遅延初期転写産物を含むことが示された（図３ｂ及びＣ、右パネル）。ＰＡＡの存在下、又は補充タンパク質の発現なしには、１．６ｋｂ ｍＲＮＡはＨＦＦ細胞で検出されなかった（図３ａ〜ｃ、右パネル）。これらのことから、ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７及び９５は真性後期ウイルスｍＲＮＡのために必須であると結論づけられる。
【００７３】
ＨＣＭＶ ＵＬ４４転写ユニットは３つの異なる部位で開始され、それぞれは約５０塩基により隔てられ、生産性感染時に別々に調節される。これらの開始部位のうち２つ、遠位及び近位が初期に活性であり、中央開始部位は後期まで不活性である（２８）。後期開始部位からの発現はウイルスＤＮＡ複製に依存し、後期ウイルス遺伝子発現に影響を有する（２２）。本発明者らは、ＵＬ４４転写に対するＵＬ７９タンパク質の影響も調べた。異なる開始部位に由来するすべての転写産物を検出するために、ＲＮａｓｅ保護アッセイを行なった。以前の報告と合致して（２１、２２、２８）、離れた開始部位から開始される３種類の主要な転写産物が補充細胞では検出された（図３ｄ、レーン３、５及び７）。対照的に、中央の開始部位からの転写産物はＲｄｌＵＬ７９感染ＨＦＦ細胞では検出されず、他の２種類の初期転写産物は検出された（図３ｄ、レーン２、４及び６）。これらのことから、ＵＬ４４の中央の後期開始部位からの転写産物はＵＬ７９ウイルスタンパク質を必要とすることが結論づけられる。
【００７４】
実施例４
ＵＬ８７及び９５ＯＲＦは初期ウイルスタンパク質である
ＨＣＭＶ ＯＲＦ７９、８７及び９５はＭＨＶ−６８ ＯＲＦ１８、２４及び３４と機能の上で似通っているので、これらの発現時期及びＨＣＭＶ ＵＬ４４との共局在について調べた。図１ｂに示されるエピトープタグ付けされたＵＬ８７及びＵＬ９５ＯＲＦを含む組み換えウイルスを構築した。ＵＬ７９ＯＲＦに融合したエピトープを含む組み換えウイルスは構築しなかった。
【００７５】
ＵＬ８７及びＵＬ９５融合タンパク質の発現動態を調べるために、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下で、ＨＦＦ細胞をＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃ又はＲＨＡＵＬ９５ＵＬ８７ｍｙｃに３ＭＯＩで感染させた。感染細胞を１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．で回収し、ＩＥ１若しくはＵＬ４４タンパク質に対する抗体、又はＨＡ若しくはｍｙｃエピトープに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によりアッセイした。タグ付けされた融合タンパク質は、１〜３ｄ．ｐ．ｉ．で、またＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下で２ｄ．ｐ．ｉ．で検出された（図４Ａ及びＢ）。ＵＬ８７及びＵＬ９５融合タンパク質の発現動態は、ＵＬ４４遺伝子の初期ウイルスタンパク質と似通っていた（図４Ｃ）。これらの結果は、ＵＬ８７及びＵＬ９５が感染の初期に発現されることを示している。
【００７６】
実施例５
ＵＬ７９、８７及び９５ウイルスタンパク質は複製コンパートメント（ＲＣ）に動員される
＜材料と方法＞
共焦点顕微鏡観察前のタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ抽出
２４ウェルプレート中のコンフルエントのＨＦＦ細胞に３ＭＯＩで組み換えウイルスを感染させた。以前に記載されているように（５５）、感染後の種々の時点で、カバーガラス上で増殖した細胞を５０μｇ／ｍＬのジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ、Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（ホモ二官能性ＮＨＳエステル架橋剤）で４℃にて１０分間固定した。マトリックスに結合していないタンパク質を核又は細胞質から除去するために、細胞をＴＮＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１％ＮＰ４０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で処理し、２％パラホルムアルデヒドで４℃にて６０分間固定した。
【００７７】
顕微鏡観察
細胞を高塩濃度ＴＰＢＳ（０．００１Ｍリン酸ナトリウム［ｐＨ７．３］，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で３回洗浄し、示した一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。室温でのＴＰＢＳでの３回の洗浄後、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４若しくは６８０標識二次抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４若しくは６８０標識抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識ラットＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。感染細胞においてＨＡ又はｍｙｃ融合タンパク質を検出する場合には、Ｓｉｇｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ（ＴＯＹＯＢＯ，大阪）を用いて特異的シグナルの強度を増強した。スライドを、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄアンチフェード試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でマウントした。画像取得は、ＰｌａｉｎＡｐｏ６３又は１００×１．４ＮＡ油浸対物レンズを装着したＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｔａ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いて行なった。ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４及び６８０蛍光団を励起するためのＨｅＮｅレーザーを装着した。細胞をいずれかの抗原に関して染色した場合、まずタンパク質の局在を調べ、次に同じ条件で別のフィルターを用いて免疫蛍光が検出されないことを確認した。
【００７８】
＜結果＞
ＨＣＭＶ複製タンパク質ＵＬ４４は約２ｄ．ｐ．ｉ．でＲＣに局在化する。ＢｒｄＵをこれらのコンパートメント中のウイルスＤＮＡに取り込ませると、子孫ウイルスで検出される（３６、３８）。本発明者らは、ＲｄｌＵＬ７９、ＲｄｌＵＬ８７又はＲｄｌＵＬ９５での感染後の細胞内でその局在を調べるために、ＨＦＦ細胞で安定に発現させたｍｃｈｅｒｒｙ蛍光融合ウイルスタンパク質を用いた。３ＭＯＩでの感染２日後に細胞を固定し、ＵＬ４４に対する抗体とインキュベートした。組み換えウイルスはＧＦＰタンパク質を含有しているので、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識二次抗マウスＩｇＧを用いてＵＬ４４の細胞内局在を検出した。図５Ａ、ａ〜ｃに示されているように、ＵＬ７９、８７及び９５−ｍｃｈｅｒｒｙ融合ウイルスタンパク質はＵＬ４４タンパク質と核で共局在していた。これらの結果は、ｍｃｈｅｒｒｙと融合させた補充タンパク質ＵＬ７９、８７又は９５が、それぞれＲｄｌＵＬ７９、ＲｄｌＵＬ８７又はＲｄｌＵＬ９５での組み換えウイルス感染後にＲＣに動員されることを示している。
【００７９】
実施例６
組み換えウイルスから発現させたＵＬ８７及び９５タンパク質は複製コンパートメントに動員される
ウイルスから発現させたＵＬ８７及び９５タンパク質も互いに共局在することを示すために、ＨＦＦ細胞を３ＭＯＩでＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた。１〜３ｄ．ｐ．ｉ．において、細胞を固定し、ＨＡエピトープに対するラットポリクローナル抗体またはｍｙｃエピトープに対するマウスモノクローナル抗体と共にインキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識二次抗ラットＩｇＧ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗マウスＩｇＧをそれぞれ用いた。共焦点顕微鏡観察は、１、２及び３ｄ．ｐ．ｉ．でのＵＬ８７融合タンパク質とＵＬ９５融合タンパク質との共局在を証明した（図５Ｂ、ａ〜ｃ）。
【００８０】
共焦点顕微鏡観察はまた、２ｄ．ｐ．ｉ．でのＵＬ９５融合タンパク質とＵＬ４４タンパク質との共局在も実証した（図５ｄ）。さらに、ＵＬ４４タンパク質は新規に合成されたウイルスＤＮＡとも共局在していた（図５ｅ）。これらの結果は、ＵＬ８７及びＵＬ９５ウイルスタンパク質が共局在し、ＵＬ９５がＲＣに動員されたことを示している。
【００８１】
実施例７
ＵＬ８７及びＵＬ９５タンパク質はウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ４４の微小フォーカスに動員される
＜材料及び方法＞
ＦＩＳＨアッセイ
ＨＣＭＶ ＢＡＣ ＤＮＡを、ニックトランスレーションキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を製造業者の取扱説明書に従って用いてＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅで標識した。ＦＩＳＨ分析は多少の改変を加えて、基本的に以前に記載された方法に基づいて行なった（２４）。カバーガラス上で増殖させた細胞を、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞抽出後に２％パラホルムアルデヒドで４℃にて６０分間固定し、ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ）を含有するブロッキングバッファー（２．５％ＢＳＡ，０．２Ｍグリシン，及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で１時間透過化し、その後ハイブリダイゼーションに用いた。各カバーガラスを、５μＬのハイブリダイゼーションバッファー（２×ＳＳＣ，１０％硫酸デキストラン及び５０％ホルムアミド）及びＤＮＡプローブと共にスライドガラス上に逆にふせて置いた。ハイブリダイゼーションバッグ中に密封した後、スライドを８５℃の水浴中に５分間浸漬し、続いて３７℃で一晩インキュベートした。ＦＩＳＨ分析後、抗ＵＬ４４抗体を用いてＵＬ４４抗原を検出した。カバーガラスを、５０％ホルムアミドを含有する２×ＳＳＣで５０℃にて３分間ずつ３回洗浄し、２×ＳＳＣで５０℃にて３分間ずつ３回洗浄し、０．１×ＳＳＣで６０℃にて１０分間、１回洗浄した。ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ蛍光団は５６０ｎｍの吸収極大と５８８ｎｍの蛍光発光極大を有し、ＨｅＮｅレーザーで励起した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｅｉｓｓ．ｄｅ／Ｃ１２５６７ＢＥ００４５ＡＣＦ１／Ｃｏｎｔｅｎｔｓ−Ｆｒａｍｅ／５ＣＤＤ６２Ｃ９２Ｂ１１２４１３Ｃ１２５６Ａ１４００４０Ｃ８３１）。
【００８２】
＜結果＞
ＵＬ８７及びＵＬ９５がウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ４４と共局在するかを調べるために、ＰＡＡ又はＧＣＶの存在下でＨＦＦ細胞を３ＭＯＩでＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させた。細胞を固定し、ＨＡ又はｍｙｃエピトープに対するポリクローナル抗体、及びＵＬ４４タンパク質に対するモノクローナル抗体で処理した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識二次抗ラット又はウサギＩｇＧ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗マウスＩｇＧを用いた。ウイルスＤＮＡを検出するためのＦＩＳＨ分析後に、細胞をＵＬ４４タンパク質に対するモノクローナル抗体とインキュベートし、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識二次抗マウスＩｇＧとインキュベートした。予想された通り、ＵＬ４４はウイルスＤＮＡ合成阻害剤の存在下でウイルスＤＮＡと共局在した（図６ａ及びｂ）。ＵＬ８７及びＵＬ９５はＰＡＡ又はＧＣＶの存在下でＵＬ４４と共局在した（図６ｃ〜ｆ）。これらの結果は、ＵＬ８７及び９５タンパク質がウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ４４と共局在することを示している。
【００８３】
ＵＬ８７とＵＬ４４との共局在の特異性を調べるために、ＵＬ５７及びＵＬ４４の局在を調べた。ＨＣＭＶでは、ＵＬ４４タンパク質はウイルスＤＮＡ合成前にはＵＬ５７タンパク質含有小フォーカスには伴われないことが報告されている（３６）。細胞を固定し、ＵＬ８７と融合したｍｙｃエピトープに対する抗体及びＵＬ５７タンパク質に対する抗体で処理した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識二次抗ウサギＩｇＧ又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗マウスＩｇＧをそれぞれ用いた。以前に報告されている通り（３８）、ＰＡＡの存在下では、ＵＬ８７融合タンパク質はＵＬ５７タンパク質と共局在しなかった（図６ｇ）。ＵＬ５７タンパク質はウイルスＤＮＡ複製開始後にはＵＬ４４タンパク質と共局在するようである。併せて考えると、ＨＣＭＶ ＵＬ８７及び９５タンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製前にはＵＬ４４と共局在する。
【００８４】
実施例８
ＩＥ２タンパク質はウイルスＤＮＡ複製前にＵＬ８７と共局在する
Ｓｏｕｒｖｉｎｏｓらによるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析（４２）により、ＩＥ２タンパク質は１２時間ｐ．ｉ．で直接的なＤＮＡとの接触により親ウイルスゲノムに伴われていることが示されている。ＩＥタンパク質は点状構造を形成することができ、これがＲＣへと発達する。ＩＥ２はＰＡＡの存在下でウイルスＤＮＡ複製と関連するため、本発明者らは、ＨＣＭＶ後期トランス因子がウイルスＤＮＡ複製前にＩＥ２と共局在するかを調べた。細胞を３ＭＯＩでＲＵＬ９５ＨＡＵＬ８７ｍｙｃに感染させ、固定し、ＩＥ２、ｍｙｃ、ＵＬ４４及びＴＢＰに対する抗体で処理した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識抗マウスＩｇＧ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０標識抗ウサギＩｇＧの二次抗体を用いた。ＵＬ８７タンパク質はＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下でＩＥ２フォーカスと共局在した（図７ａ〜ｃ）。ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）はＩＥ２タンパク質と直接的に相互作用するので（１４）、ＴＢＰに対するポリクローナル抗体及びＵＬ４４タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下でＴＢＰがＵＬ４４微小フォーカスに動員されるかを調べた。図７ｄ〜ｆに示される通り、ＰＡＡ若しくはＧＣＶの存在下又は非存在下で、ＴＢＰはＵＬ４４と共局在し、したがって、予想されたように、ＲＣ前駆体に動員された。これらの結果から、ＵＬ８７タンパク質は、ＩＥ２タンパク質及びＴＢＰと同様に、ウイルスＤＮＡ複製前にウイルスＲＣ前駆体に動員されると結論づけられる。
【００８５】
＜考察＞
ＭＨＶ−６８のＵＬ１８、２４及び３４は後期転写のためのウイルストランス作用因子である。これらのＭＨＶ−６８ＯＲＦは初期に発現されるが、ウイルスＤＮＡ複製には必要とされない。これらのＭＨＶ−６８ウイルスタンパク質はインジケーター遺伝子の発現を駆動する後期ウイルスプロモーターを活性化させるので、後期ウイルストランス活性化因子であると考えられている。後期ウイルストランス活性化因子がどのようにして後期ウイルスプロモーターを特異的に活性化するのかは未だ明らかになっていない。
【００８６】
後期ウイルスプロモーターの活性化についての理解は、ユニークな抗ウイルス剤のための新規なアプローチに寄与するものと思われる。ＨＣＭＶは深刻な病原ウイルスであり、現在利用可能な抗ウイルス剤は限定された有効性及び副作用を有するので、ＨＣＭＶ後期転写因子の解析は新規な抗ウイルス剤の開発のために重要であろう。したがって、本発明者らは、ＭＨＶ−６８後期ウイルストランス活性化因子に相同なＨＣＭＶ遺伝子が真性後期（γ２）ＨＣＭＶ遺伝子の転写に影響を及ぼすかを調べた。
【００８７】
ＨＣＭＶでは、プロモーターは単純であり、それらは上流又は下流配列を必要としないコアエレメントを含む（８、２５、３１）。ＵＬ４４初期ウイルスプロモーターはカノニカルなＴＡＴＡ配列を有する。対照的に、ＵＬ４４後期ウイルスプロモーターはノンカノニカルなＴＡＴＡ配列を有する（図３ｄを参照されたい）。本発明者らは、このノンカノニカルなＴＡＴＡ配列が後期ウイルス遺伝子発現に重要であることを報告している（２１）。Ｓｅｒｉｏら（３９）もまた、ＥＢＶのＢｃＬＦ１後期プロモーターからの発現が変異型ＴＡＴＡエレメントのみに依存することを報告している。ノンカノニカルなＴＡＴＡ配列へのＴＢＰの弱い結合親和性は、感染後の初期での転写の欠如を部分的に説明するものかもしれない。ＴＢＰの後期プロモーターへの結合親和性が、後期遺伝子特異的トランス活性化因子の動員及びウイルスＤＮＡ複製中の二重らせんの開放後に強まる可能性はある。これらの後期遺伝子トランス活性化因子が、ＩＥ２トランス活性化因子と共に、ＴＢＰ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩの後期プロモーターへの結合を安定化させるということも考えられる。ＨＣＭＶでは、初期／後期ウイルス遺伝子発現に影響を与えるＩＥ２遺伝子にはいくつかのアイソマーがある。感染初期には、ウイルスＩＥ２−ｐ８６タンパク質が初期ウイルス遺伝子発現に必須である。感染後期には、ＩＥ２アイソマーであるＩＥ２−ｐ６０及びＩＥ２−ｐ４０が後期ウイルス遺伝子発現に多大な影響を及ぼす（４９、５０）。ウイルスＤＮＡとウイルスＩＥ２トランス活性化因子との複合体は、ウイルスＤＮＡが複製し始める時点で検出され、ＲＣの発達を引き起こす（４２）。本発明者らはＨＣＭＶ ＵＬ８７がウイルスＲＣでＩＥ２タンパク質と共局在することを示したが、現状ではこれら２つのウイルスタンパク質が相互作用するという証拠はない。
【００８８】
なぜ後期ウイルス遺伝子の転写がウイルスＤＮＡ複製を必要とするのかは分かっていない。本発明者らのデータは、ＨＣＭＶ ＵＬ７９、８７及び９５がＵＬ７５（ｇＨ）及びＵＬ９９（ｐｐ２８）後期ｍＲＮＡに必要であることを示している。これらのウイルスタンパク質はウイルスＤＮＡ複製の前に発現され、ウイルスＲＣに組み込まれる。ＲＣは、部分的にはウイルスＤＮＡ鋳型を濃縮することにより、ウイルス遺伝子発現のためのフォーカスとして機能する。ＵＬ４４タンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製前にＩＥ蓄積部位に組み込まれた。ＩＥ２タンパク質は後期遺伝子転写に十分ではないので、ＵＬ４４がＵＬ７９、８７及び９５と共にＩＥ２フォーカスに動員されることにより後期遺伝子転写に適した環境を提供したとは考えにくい。ＵＬ４４タンパク質がＵＬ７９、８７及び９５のタンパク質と直接的に相互作用するという証拠はない。ＵＬ４４は構造的に真核生物の増殖細胞細胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ；ＰＣＮＡ）と相同であり、ＰＣＮＡは複数のタンパク質と相互作用する（３０）。近年のプロテオーム解析により、ＵＬ４４タンパク質がウイルス複製関連タンパク質以外の転写因子を含む広範なタンパク質と相互作用することが実証された（１３、４４〜４６）。したがって、ＵＬ４４タンパク質が後期遺伝子転写のタイミングを最適化していると考えられる。ＨＣＭＶ ＲＣはまた、ヘルペスウイルス複製タンパク質（すなわち、ＨＳＶ ＩＣＰ８、ＵＬ９、及びヘテロ三量体ヘリカーゼ−プライマーゼ複合体ＵＬ５−ＵＬ８−ＵＬ５２）に相同な５種類のウイルスタンパク質も含有する。これらのヘルペスウイルス複製タンパク質がまずウイルスの複製前駆体微小フォーカスに組み込まれ、続いてこれらのフォーカスにポリメラーゼ及びポリメラーゼアクセサリータンパク質が動員される（４）。しかしながら、培地にＰＡＡを添加した場合、ＨＣＭＶ ＵＬ８７タンパク質はＳＳＢ ＵＬ５７タンパク質と共局在しなかった。ＨＣＭＶでは、ＨＣＭＶ ＵＬ５７の微小フォーカスは後期遺伝子転写を実現するための足場としては機能しないように思われるが、ウイルスＤＮＡ複製の開始後には重要な役割を果たすようである。
【００８９】
本願では、ＵＬ７９、８７及び９５タンパク質が後期ウイルスｍＲＮＡに必要であり、したがってウイルス増殖に必要とされることが示された。ＵＬ７９、８７若しくは９５ ＯＲＦに突然変異を導入することによりこれらのＯＲＦの発現を低下又は消失させることによって、ウイルス複製を抑制し、弱毒化したＨＣＭＶは、ワクチンとして使用する上で、天然ウイルスの構造を保持するという利点を有する。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、ＨＣＭＶを治療又は予防するためのワクチンが提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７又は９５遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の１つ若しくは複数からの発現が低下又は消失している、弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項２】
前記突然変異が、ＯＲＦ中への塩基の挿入によるものである、請求項１に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項３】
前記弱毒ＨＣＭＶからの感染性ウイルス増殖は野生型ウイルスと比較して低下しているが、ウイルスＤＮＡ複製は野生型ウイルスと同等である、請求項１又は２に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項４】
後期ウイルスｍＲＮＡの発現が野生型ウイルスと比較して低下している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒ＨＣＭＶを有効成分として含む、ＨＣＭＶ感染の予防又は治療用ワクチン。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒ＨＣＭＶ又は請求項５若しくは６に記載のワクチンを非ヒト動物に免疫して抗体を作製するステップ、及び該抗体を回収するステップを含む、抗ＨＣＭＶ抗体の作製方法。
【請求項８】
前記抗体がヒト抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＬ７９、８７又は９５遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に突然変異を生じさせることにより、これらの遺伝子の１つ若しくは複数からの発現が低下又は消失している、弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項２】
前記突然変異が、ＯＲＦ中への塩基の挿入によるものである、請求項１に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項３】
前記弱毒ＨＣＭＶからの感染性ウイルス増殖は野生型ウイルスと比較して低下しているが、ウイルスＤＮＡ複製は野生型ウイルスと同等である、請求項１又は２に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項４】
後期ウイルスｍＲＮＡの発現が野生型ウイルスと比較して低下している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の弱毒ＨＣＭＶ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒ＨＣＭＶを有効成分として含む、ＨＣＭＶ感染の予防又は治療用ワクチン。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒ＨＣＭＶ又は請求項５若しくは６に記載のワクチンを非ヒト動物に免疫して抗体を作製するステップ、及び該抗体を回収するステップを含む、抗ＨＣＭＶ抗体の作製方法。
【請求項８】
前記抗体がヒト抗体である、請求項７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１５２１４７（Ｐ２０１２−１５２１４７Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４５４８（Ｐ２０１１−１４５４８）
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物名 ：第６９回 日本癌学会学術総会記事 発行日 ：平成２２年８月２３日 発行者 ：日本癌学会 講演番号 ：Ｐ−０３０７ 公開者 ：磯村 寛樹、鶴見 達也
【出願人】（３０４０３１４２７）愛知県 (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物名 ：第６９回 日本癌学会学術総会記事 発行日 ：平成２２年８月２３日 発行者 ：日本癌学会 講演番号 ：Ｐ−０３０７ 公開者 ：磯村 寛樹、鶴見 達也
【出願人】（３０４０３１４２７）愛知県 (36)
【Ｆターム（参考）】
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