強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体
本発明は、抗癌活性を有する強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体に関する。更に詳細には、本発明は、ヒト肺癌細胞、ヒト繊維肉腫細胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト白血病細胞、ヒト胃癌細胞、ヒト鼻咽頭癌細胞及び／又はヒト乳癌細胞に対する優れた抗癌活性を有する強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体に関する。更に詳細には、本発明は、ヒト肺癌細胞、ヒト繊維肉腫細胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト白血病細胞、ヒト胃癌細胞、ヒト鼻咽頭癌細胞及び／又はヒト乳癌細胞に対する優れた抗癌活性を有する強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の進行、ニューロン機能、分化及びアポトーシスの調節に関与するセリン／スレオニンキナーゼのグループに属する。これらの活性は対応するサイクリンとの結合を含む複数の機構によって厳重に制御されており、その発現レベルは細胞周期の各期にわたって変動する。種々の異なるＣＤＫ／サイクリン複合体が、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期を通した細胞周期の各段階において活性化される。初期Ｇ１期におけるＣＤＫ４／サイクリンＤ及びＣＤＫ６／サイクリンＤ並びに後期Ｇ１期におけるＣＤＫ２／サイクリンＥによる網膜芽細胞腫蛋白（ｐＲｂ）の連続的なリン酸化によって、Ｅ２Ｆ（転写因子タンパク質）の放出が生ずる。次に、Ｅ２Ｆタンパク質は、細胞周期のＳ期へ入るために必要な一連の遺伝子の転写活性化を引き起こす。続いて、ＣＤＫ２がＤＮＡ複製の後期（Ｓ期）にサイクリンＡよって活性化され、残存するＥ２Ｆ活性によって誘発されるアポトーシスを防止するよう適切な時期にＥ２Ｆの非活性化を促進する。最終的には、サイクリンＡ又はＢと複合体を形成したＣＤＫ１が、Ｇ２／Ｍチェックポイントを制御し細胞の有糸分裂を促進する機能を担っていると考えられている。
【０００３】
細胞周期の調節に加え、ＣＤＫ２、７、８及び９について他の役割が分かっている。例えば、ＣＤＫ２／サイクリンＥはｐ５３に媒介されるＤＮＡ損傷の反応経路にとって重要であり、ＣＤＫ７、８、及び９はＲＮＡポリメラーゼのリン酸化を通して転写の開始と伸長の調節に関与している。従って、ＣＤＫは種々の異なる機構を通して細胞の成長及び生存に影響を及ぼし、ＣＤＫ活性の適切な制御はいろいろな細胞プロセスにとって重要である。現在、多くのヒト腫瘍において、サイクリンＤ及びサイクリンＥのようなサイクリンの異常な高発現や変異によるＣＤＫの制御不良が起こることが分かっている。例えば、ＣＤＫ２／サイクリンＥ複合体の発現及び触媒活性は大腸癌、卵巣癌、乳癌及び前立腺癌において増加し、原発癌におけるサイクリンＥの高発現は乳癌患者の低い生存率と相関関係がある。ＣＤＫ１／サイクリンＢ複合体の異常な発現も、いくつかの場合（前立腺腺癌及び肺癌）に観察されている。
【０００４】
ＣＤＫ２は細胞周期の進行及び増殖に必要ないかも知れないという報告があるが、最近の報告は、メラニン形成細胞及び肝細胞が、増殖及び生存に関し、ＣＤＫ２に依存している可能性を示唆している。また、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２を同時に欠乏させた調査では、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２のいずれか一つを対象とする場合に比べて、腫瘍セルラインの抗細胞増殖に高い効果があると報告された。更に、新たに得られた証拠により、ある種の腫瘍細胞は増殖のために特定の間期のＣＤＫを必要とする可能性が示唆されている。このように、ＣＤＫを阻害することは、癌治療の興味ある標的として、腫瘍の成長を制御する有効な戦略を提供する可能性がある。
【０００５】
現在までに、多くの低分子ＣＤＫ阻害剤が臨床試験中である。これらの阻害剤は、キナーゼのＡＴＰ結合部位においてＡＴＰと競合して作用する平面状の小さい複素環である。これらの中でフラボピリドールは臨床評価に入った最初のＣＤＫ阻害剤だった。Ｒ−ロスコビチン（１分子中に３個の置換基を有するプリン類縁体）及びＢＭＳ−３８７０３２（アミノチアゾール）はＣＤＫ２／サイクリンＥに対して選択性を有し、ＰＤ−０３３２９９１（ピリドピリミジン）はＣＤＫ４／サイクリンＤ及びＣＤＫ６／サイクリンＤに対して高い選択性を有している。インディルビン、ビス−インドール・スキャフォールド及びその誘導体は、ＣＤＫ、ＧＳＫ−３β及びオーロラキナーゼのような重要なプロテインキナーゼを標的とする強力な阻害剤として、大変な興味を持って調査されてきた。
【０００６】
国際公開公報ＷＯ２００５／０７０４１６ Ａ１において、本出願の発明者は、ヒト癌セルラインに対する抗癌特性を有するインディルビン誘導体を開示した。この開示においては、ヒト癌セルラインに関して細胞増殖を阻害することによる抗癌特性を有するインディルビン誘導体が開示されている。開示されたインディルビン誘導体の中で、５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシムは種々の癌セルラインに対して最も強力な抗増殖効果（ＩＣ５０＝０．７９〜２．９μＭ）を示した。しかし、インディルビン骨格の５’位のラジカルを更に置換することは行われなかったし、また、そのような化合物について抗癌活性も測定されなかった。更に、インディルビン骨格の５’位で種々の置換を行った場合の効果を調べる合成や生物学的評価についての報告もない。
【０００７】
一方で、本出願の発明者は、５’位を更に置換することは５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム類縁体と比較して明らかに有利であることを発見した。そして、本出願の発明者は、新規な５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム類縁体の設計、合成並びにＣＤＫ阻害活性、抗増殖活性及びインビトロ抗癌活性を含む生物学的評価による調査を行って、本発明を完成した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、式（Ｉ）で表される抗癌活性を有するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物を提供することである。
式（Ｉ）
【０００９】
【化１】
【００１０】
ここで、
Ｒ1はＦ、Ｃｌ、ＣＨ又はＣＨ3から選択され、
Ｒ2はＦ、Ｃｌ又はＮＯ2から選択される。
【００１１】
また、本発明は、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物；Ｒ1がＦであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、
i）Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＣｌである化合物、
ii）Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＦである化合物、
iii）Ｒ1がＣｌであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物、及び
iv）Ｒ1がＣＨ3であり、Ｒ2がＮＯ2である化合物
を提供する。
【００１３】
更に、本発明は、ヒト肺癌セルライン、ヒト繊維肉腫セルライン、ヒト大腸癌セルライン、ヒト白血病セルライン、ヒト胃癌セルライン、ヒト鼻咽頭癌セルライン及び／又はヒト乳癌セルラインに対する優れた抗癌活性を有する式（Ｉ）で表されるインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物を提供する。
【００１４】
更に、本発明の目的は、前記インディルビン−３’−オキシム誘導体化合物及び医薬として許容可能な担体を有する抗癌組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明に関連したインディルビン誘導体の構造を示す。
【図２】図２は、ＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位への２及び１１ｂの結合状態を示す。図２（ａ）は、２とキナーゼ主鎖との間の水素結合ネットワーク（緑色の破線）を示す。２のＣＤＫ２との結合状態は、ＣＤＫ２のヒンジ領域との３個の水素結合、オキシム部分とＧｌｎ１３１のカルボニルの酸素との間の更なる水素結合を表している。また、ニトロ基は、Ｌｙｓ３３、Ａｓｐ１４５の側鎖と塩橋を形成している。図２（ｂ）は、ＣＤＫ２の２とのファンデルワールス表面をＣＰＫ表示で示している。５’−ブロモ基は、正に帯電したアミノ酸残基のＬｓｙ８９を提示するＡＴＰ結合ポケットの外側の水性の空間に向かって投影されている。図２（ｃ）は、１１ｂとキナーゼ主鎖との間の水素結合ネットワーク（緑色の破線）を示す。１１ｂは、５’−ヒドロキシ基とＡｓｐ８６のカルボン酸との間に更なる水素結合を形成している。これにより、ＣＤＫ２阻害活性が更に向上している可能性がある。図２（ｄ）は、ＣＤＫ２の、ＡＴＰ結合部位で結合した１１ｂとの分子表面の表示を示す。結合面内に存在するいくつかの重要なアミノ酸が表示されている。５’−ヒドロキシ基はポケットから溶媒の方に向かっている。
【図３】図３は、５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体が１μＭの時のＣＤＫ1、ＣＤＫ２活性のパーセントを示す。一連のインディルビン誘導体が、明細書に記載したように、１μＭで、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＢについての効果が試験されている。実験は、比較対象として、５−ニトロインディルビン−３’−オキシム（１）についても実施された。
【図４】図４は、１０μＭでの１１ｂ、１２ｂのキナーゼパネルによるスクリーニングを示す。化合物１１ｂ、１２ｂが、明細書に記載したように、１０μＭの濃度で、受容体型チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼからなる種々のキナーゼパネルに対して試験されている。１μＭの１１ｂはＴｒｋＡに対する９％の阻害活性を示し、また、ＡｕｒｏｒａＡ（１μＭ）とＩＫＫβ（１０μＭ）の２種のセリン／スレオニンキナーゼ及び受容体型チロシンキナーゼＴｒｋＡ（４μＭ）に対する１１ｂのＩＣ50値が用量反応曲線から算出されている。
【図５】図５は、１１ｂによる異種移植された腫瘍の成長の抑制を示す。図５は、ＳＤ−ラットがＲＫ３Ｅ−ｒａｓ−Ｌｕｃ細胞（５×１０6／１００μl）を注射されたこと示している。腫瘍が５ｍｍの大きさに達した時、ラットは非麻酔状態で１日おきに合計5回、静脈内に１１ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）が注射された。腫瘍の大きさは、明細書に記載したようにノギスで測定した。図５（ｂ）は、対照及び１１ｂで処置されたラットから切除された皮下腫瘍の代表例を示す。図５（ｃ）は、対照及び１１ｂで処置されたラットのインビボ生物発光イメージングアッセイを示す。
【図６】図６は、腫瘍組織の組織学的検査及び免疫組織化学的検査を示す。ＲＫ３Ｅ−ｒａｓ−Ｌｕｃ細胞がラットの左側腹部に皮下接種された。5日目から1日おきに、１１ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）が担腫瘍ラットの静脈内に注射された。１１日目にラットを屠殺した。図６（ａ）は、腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色（左側）、固形腫瘍のパラフィン切片のＴＵＮＥＬアッセイ（中央）、及び、ＰＣＮＡの免疫組織化学染色（右側）を示す。図６（ｂ）はＴＵＮＥＬアッセイの陽性細胞を示し、図６（ｃ）はＰＣＮＡ免疫染色の陽性細胞を示す。細胞は3回計数した（柱は平均値、棒線はＳＤ）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
インディルビン誘導体を含む抗癌剤のターゲットであるＣＤＫ２／サイクリンＥに対する阻害活性を向上させるために、５’位及び５位の両方を置換した新規な一連のインディルビン−３’−オキシム誘導体を設計し、合成した。５’−置換類縁体の、ＯＨ又はハロゲンとの結合状態はＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位における分子ドッキングの研究により予測され、更に、ＣＤＫ２阻害活性の向上を説明する可能性のある重要な相互作用も示された。
【００１７】
構造活性相関解析は、５’位では、ＣＨ３やＯＣＨ3のような電子供与性基よりもＯＨ基やハロゲン基の方が好ましいことを示している。合成した誘導体の中では、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）及び５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）が、ＣＤＫ２に対してＩＣ５０値がそれぞれ１．９ｎＭ、１．７ｎＭの強力な阻害活性を示し、また、種々のヒト癌セルラインに対してＩＣ５０値が０．２〜３．３μＭの範囲の抗増殖効果を示した。１０種の異なる受容体型チロシンキナーゼ及びセリン／チロシンキナーゼのパネルでの１１ｂのキナーゼ選択性プロファイルの研究の結果、ＣＤＫに対する阻害活性の選択性は５００倍以上であった。１１ｂの抗癌活性が更に確認され、５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されたインビボ異種移植動物モデルは体重の減少もなく対照動物に比べて８４％の腫瘍容積の減少を示した。組織学的解析を通した抗腫瘍活性の機序がアポトーシス及び増殖のマーカーによって示され、それぞれアポトーシスは増加し、増殖は減少した。
【００１８】
更に、他の類縁体、例えば５’−ヒドロキシ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ａ）、５’−ヒドロキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｃ）、５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）及び５’−メチル−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）が効果的な抗癌剤と考えられた。
【００１９】
本発明は、以下の通り、更に具体的に説明することができる。
【００２０】
設計戦略のための分子ドッキング
化合物２の増強された抗増殖効果に取り組むために、ＣＨＡＲＭｍ−ベース・分子動力学・ドッキング・プログラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２．０）のＣＤｏｃｋｅｒを用いて、ＣＤＫ２（図２）のＡＴＰ結合部位における分子ドッキングの研究を行った。図２（ａ）は、化合物２の１’位の窒素、２位のカルボニルの酸素及び１位の窒素がＡＴＰ結合部位のヒンジ部分（Ｇｌｎ８１、Ｌｅｕ８３）と３個の水素結合の相互作用を維持していることを示している。更に、オキシム部分の３’−ヒドロキシル基はＧｌｎ３１の主鎖カルボニルと水素結合を形成し、５−ニトロ基はＬｙｓ３３、Ａｓｐ１４５の側鎖との塩橋に寄与している。図２（ｂ）は、リガンド、２及び５’−Ｂｒ基の周囲４Å以内の静電ポテンシャルを有する結合面が、実質的な結合相手である正に帯電したアミノ酸残基のＬｓｙ８９が存在するＡＴＰ結合ポケットの外側の水性の空間に向かって投影されているようであることを示している。５’−Ｂｒ基の孤立電子対の電子と正に帯電したＬｙｓ８９残基との別の静電的な相互作用がＣＤＫ２との高い結合親和性を与えているようであり、その結果、５’−非置換−インディルビン−３’ −オキシム類縁体の１に比べて２がより強力な抗増殖活性を有することに貢献しているという仮説を立てることができる。ドッキングの研究によって得られたデータによれば、５−置換基（Ｃｌ、ＮＯ2、Ｆ及びＯＣＦ3）に加えて更に５’−位の誘導体化を行うことは、ＣＤＫ２の結合親和性を最適化するためのインディルビン・スキャフォールドの修飾の戦略に理想的であろう。
【００２１】
ＣＤＫ阻害活性及び抗増殖活性に関してインディルビン骨格の５’位での構造活性相関を調査するために、次のグループを誘導体化に選定した。１）５’−Ｆ，５’−Ｃｌ（５’−ブロモ類縁体の２の場合と同様な静電相互作用をＬｙｓ８９と形成することができる）、２）５’−ＯＨ（ＣＤＫ２に更なる水素結合を提供して親水性の性質を導入する）、３）５’−ＯＣＨ3、５’−ＣＨ3（ハロゲン置換類縁体と比較した対比効果を期待する）。
【００２２】
事実、設計した分子の代表例、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム誘導体（１１ｂ）のＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位におけるドッキングモデルは、新しい水素結合の相互作用が溶媒露出領域において１１ｂの５’−ＯＨ基とＡｓｐ８６の間で形成されているようであり、また、１１ｂのオキシム部がＧｌｎ１３１ではなくＩｌｅ１０と相互作用しているようであることを示した。図２（ｄ）は、１１ｂの周囲４Å以内の静電ポテンシャルを有する結合面を提示し、５’−ＯＨがどのように外側の水性の表面、溶媒露出領域の中へ向って突き出ているかを示した。
【００２３】
化学
５’，５−置換−３’−インディルビン・オキシム誘導体を合成するために、５−置換インドキシルＮ，Ｏ−ジアセテート（５ａ〜ｄ）を対応する５−置換アントラニル酸（３ａ〜ｄ）から調整した（スキーム１）。
【００２４】
【化２】
【００２５】
簡潔に言えば、化合物３ａ〜ｄをグリオキシル酸エチルの存在下で還元的アルキル化条件に置き、続いて、加水分解してジカルボン酸（４ａ〜ｄ）を得、最終的にこれを無水酢酸中で環化して５ａ〜ｄを得た。５’−ヒドロキシ誘導体の場合、フェノール性ヒドロキシル基も環化条件下でアセチル化されるので、環化化合物５ａはトリアセテートの形で得た。
【００２６】
“Ｍｏｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，１４，２３７−２４６”では、５−置換インドキシルＮ，Ｏ−ジアセテート（５ａ〜ｄ）を種々の５−置換イサチン類縁体（６ａ〜ｄ）と共役反応させて塩基性条件下で５’，５−置換インディルビン誘導体（７〜１０）を得、続いて、ケトンを３’−オキシム基に変換するためにそれぞれのインディルビン（７〜１０）をヒドロキシルアミンと反応させて、５’，５−置換−３’−インディルビンオキシム誘導体（１１〜１４）が合成された（スキーム２）。
【００２７】
【化３】
【００２８】
５’−メトキシ−５−置換−３’−オキシム化合物（１６ａ〜ｃ）は、対応する５’−ヒドロキシ−５−置換―インディルビン誘導体（１５ａ〜ｃ）から、フェノール性ヒドロキシル基をメチル化し、続いて、ヒドロキシルアミンと反応させることによって合成した（スキーム３）。
【００２９】
【化４】
【００３０】
ＣＤＫ阻害活性及びキナーゼ選択制プロファイル
５’，５−置換−インディルビン−３’−オキシム誘導体は、最初に、１μＭでＣＤＫ1／サイクリンＢ、ＣＤＫ2／サイクリンＥに対する阻害活性を評価した（図３）。５’−位の置換体の効果の比較のために、５−ニトロインディルビン−３’−オキシム（１）も併せて試験した。ＣＤＫ１と比べた場合のＣＤＫ２に対するこれらの化合物の阻害活性及び選択性は、Ｒ１−位の５’−置換基に依存することが分かった。一般に、５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体は、１２ｄ及び１６ａ〜ｃを除いて、ＣＤＫ２に対して１μＭで９０％以上の阻害効力を有する強力な阻害活性を示した。特に、５’−ＯＨ類縁体の１１ａ〜ｄは、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の両方に対して最も高い阻害効力示した。Ｒ1位の５’−ＯＨは、ＣＤＫ１と比べたＣＤＫ２の選択性を減少させる結果となったが、しかしながら、文献によれば、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対する同時阻害剤が抗癌活性の点で更なる利点を有する可能性があるという観点から、この結果は重要と言える。更に、５’−ヒドロキシル基の置換は、インディルビン類縁体の物理化学的性質の中で大きな欠点であった水溶性を改善させた。５’−ＯＨ−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体とは対照的に、５’−クロロ及び５’−フルオロ置換インディルビン−３’−オキシム誘導体（１２ａ〜ｄ及び１３ａ〜ｄ）は、ＣＤＫ１と比べて６〜１０倍の選択性で強力なＣＤＫ２阻害活性を保持した。例えば、５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）は、ＣＤＫ２に対しては、ＣＤＫ１よりも約８倍強力であった（表１）。
【００３１】
表１．５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体のＣＤＫ２／サイクリンＥ阻害活性
【００３２】
【表１】
【００３３】
実験の項に記載したように、一連のインディルビン誘導体を１０種の濃度でＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼアッセイの試験をした。用量反応曲線からＩＣ50を計算した。ＣＤＫ１／サイクリンＢキナーゼアッセイにおける１１ｂ及び１２ｂのＩＣ50値は、それぞれ１３ｎＭ及び１９５ｎＭである。
【００３４】
５’−ハロゲン化によってＣＤＫ１阻害効力が低下することは、５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１）に比べて低いＣＤＫ１阻害活性（ＩＣ50＝１９０ｎＭ）を示した５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（２）についての報告によって更に裏付けることができる。５’位に電子供与性基を有する一連の化合物の中で、５’−ＣＨ3を有する１４ｂは、ＣＤＫ１と比べて７倍の選択性で強力なＣＤＫ２阻害活性を保持した。しかしながら、５’−ＯＣＨ3置換誘導体（１６ａ〜ｃ）は、１ｎＭでＣＤＫ１及びＣＤＫ2に対して弱い阻害活性を示したか又は阻害活性は示さなかった。
【００３５】
ＣＤＫ２阻害活性に関して、５’，５−インディルビン−３’−オキシム誘導体の構造活性相関をＩＣ50値により分析した（表１）。５’−ＯＣＨ3誘導体（１６ａ〜ｃ）を除いて、ほとんどの誘導体は１〜７０ｎＭのＩＣ50値で強力な阻害活性を示した。Ｒ１位の５’−置換基の効果に関しては、−ＯＣＨ3＜−Ｃｌ＜−Ｈ、−ＣＨ3＜−ＯＨ、Ｆの順に従ってＣＤＫ２阻害活性は増加した。例えば、５’−クロロ−置換−インディルビン−３’−オキシム誘導体（１２ａ〜ｄ）は、５’−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム誘導体（１３ａ〜ｃ）（ＩＣ50＝１〜８ｎＭ）よりも１０倍弱いＣＤＫ２阻害活性（ＩＣ50＝１０〜７６ｎＭ）を示した。他の電子供与性基である５’−ＣＨ3−が置換されたインディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）は１６ｂに比べて２７０倍の増強された阻害効果を示したが、電子供与性基の５’−ＯＣＨ３置換基（１６ａ〜ｃ）は２−８μＭのＩＣ50値で極めて低いＣＤＫ２阻害活性を示した。特に、最も強力なＣＤＫ２阻害剤である１１ｂ、１３ｂ及び１３ｃは、ＣＤＫ２に対するＩＣ50値が約２ｎＭで、５’−非置換−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１）（ＩＣ50＝７ｎＭ）よりも約４倍高い効力を示した。インディルビン−３’−オキシム誘導体のＲ2位の５−置換の効果の分析では、ニトロ基及びフルオロ基は、クロロ基又はトリフルオロメトキシ基のような他の５−置換基よりも、概してＣＤＫ２阻害により有利であった。総合すれば、５’−位のＯＨ及びＦ並びに５−位のＮＯ2及びＦのような電子的効果を与える置換基の組み合わせを有するインディルビン−３’−オキシム誘導体は、ＣＤＫ２に対して強力な阻害活性を示した。
【００３６】
代表的な強力で選択的なＣＤＫ２阻害剤１１ｂ及び１２ｂは、受容体型チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼを含むキナーゼのより多様なパネルに対して、更に評価を行った（図４）。１１ｂは、試験したキナーゼの中でＡｕｒｏｒａ Ａ、ＩＫＫβ及びＴｒｋＡに対してのみ弱い阻害活性を示し、ＩＣ50値は１〜１０μＭの範囲であった。１２ｂは、試験した全てのキナーゼパネルに対して、無視できる程度の阻害活性しか示さなかった。１１ｂ及び１２ｂのＣＤＫ１及び２に対するＩＣ50値が低いナノモルの範囲にあることから、この研究で試験したセリン／スレオニンキナーゼ及び受容体型チロシンキナーゼにおけるキナーゼ選択性プロファイルはＣＤＫ１及びＣＤＫ２に非常に有利と言える。
【００３７】
抗増殖活性
種々の癌セルライン、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、ＨＣＴ１１６、Ｋ５６２、ＳＮＵ６３８、ＫＢ、ＭＣＦ−７に対する５’，５−置換−インディルビン−３’−オキシム誘導体の抗増殖活性をＳＲＢアッセイにより評価し、癌細胞増殖阻害のＩＣ50値を表２にまとめた。５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（２）及びロスコビチンは、このアッセイにおいて、ポジティブコントロールとして一緒に試験した。
【００３８】
表２．異なるヒト癌セルラインについての５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体の抗増殖活性
【００３９】
【表２】
【００４０】
実験の項で説明したように、ＳＲＢアッセイを用いて、a一連のインディルビン誘導体の種々のヒト癌セルラインに対する効果を５つの濃度で試験した。ＩＣ50（μＭ）値は、用量反応曲線から計算した。bヒト肺癌細胞。cヒト繊維肉腫細胞。dヒト大腸癌細胞。eヒト白血病細胞。fヒト胃癌細胞、gヒト鼻咽頭癌細胞。hヒト乳癌細胞。i実験は、ポジティブコントロールとして、２及びロスコビチンについても実施した。
【００４１】
５’−ヒドロキシ誘導体（１１ａ〜ｄ）の抗増殖活性は、ＮＯ2＞Ｆ＞Ｃｌ、ＯＣＦ3の順で、５位の置換基に応じてＣＤＫ２に対するこれらの阻害活性の効力と良く相関した。特に、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）は、ＨＴ１０８０及びＨＣＴ１１６セルラインに対して〜０．４μＭのＩＣ50値を有し、２と比較して、癌細胞に応じて同程度の又は改善された阻害活性を示した。２の５’−ブロモ基をＦ及びＣｌのような他のハロゲン基に置き換えた化合物の中で、５−ニトロ誘導体（１２ｂ及び１３ｂ）は、５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム化合物（２）よりも、特にサイクリンＤ１の調節を解除しているヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６に対して、約０．３μＭのＩＣ50値で、より効果的であった。
【００４２】
特に、５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）は、その強力なＣＤＫ２阻害活性と相関して、全ての癌細胞に対して最も広い阻害効力スぺクトル（ＩＣ50＝０．２８〜０．９４μＭ）を示した。化合物１３ｂは、他の誘導体の多くが弱い活性であるのとは対照的に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対して、他にはないナノモルのＩＣ50値の抗増殖活性を有する。しかしながら、５’−ＣＨ3、５’−ＯＣＨ3のような電子供与性基と置換されたインディルビン−３’−オキシム誘導体（１４及び１６）は、抗増殖活性がＩＣ50値０．８〜１μＭの範囲である５’−メチル−５−ニトロ−３’−オキシム（１４ｂ）を除いて、多くの癌細胞に対して非常に弱い阻害剤であった。５−位（Ｒ２）の置換の効果に関しては、５−ＮＯ3基は、５’−ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＨ3と組み合わせたときに、一連の５’，５−二置換誘導体の中で最も強力な抗増殖効果を示した。この結果は、我々の以前に発表した結果23とよく一致し、また、２及び１１ｂの仮定した結合状態、すなわちＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位において５−ニトロ基とＡｓｐ１４５、Ｌｙｓ３３との間で塩橋を有する更なる結合が形成されているようであるということによって指示されている。５’−ＯＣＨ3誘導体の場合、５−Ｆ置換類縁体（１６ｂ）のみが中程度の抗増殖活性を示し、これにより異なる作用機序がこの類縁体に関連している可能性が示唆された。この研究の結果を組み合わせると、５’−ヒドロキシル基又はハロゲン基は、おそらくＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位で更なる水素結合の相互作用を形成することによって、ＣＤＫや癌細胞増殖の阻害に有利だろうという重要な考察が示唆される。
【００４３】
１１ｂのインビボ抗癌活性
５’−ＯＨ−５−ニトロ類縁体（１１ｂ）のインビボの効果を探索するために、我々のグループが発表したように、ｋ−ｒａｓ遺伝子及びＧＦＰ／Ｌｕｃ遺伝子を有しているＲＫ３Ｅラット腎臓細胞が皮下移植されたＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットの腫瘍異種移植動物モデルを利用した。移植の５日後に、１１ｂを５ｍｇ／ｋｇで１日おきに、合計５回、日々モニタリングしながら動物にｉ．ｖ．投与した。腫瘍の容積は、コントロール群（図５（ａ）及び図５（ｂ））と比較して約８４．３％で、有意に減少した。１１ｂの投与期間中は、コントロール群と比較して体重に有意な差はなかった（データは示さず）。１１ｂの処置の後１０日目に得られたバイオルミネセンスイメージは、腫瘍成長の指標であるルミネセンス強度が有意に減少していることを示した（図５（ｃ））。
【００４４】
組織学的分析により、未処置のコントロールの固形腫瘍は、多くの有糸分裂像、多病巣性壊死及び出血を示している未分化の癌腫に属していることが明らかになった。しかし、１１ｂで処置した腫瘍は、広範な細胞死を引き起こした（図６（ａ）左側）。ＴＵＮＥＬ−陽性のアポトーシス細胞は、１１ｂで処置した動物の組織の場合はコントロールの組織と比べて約６倍増加した（図６（ａ）中央及び図６（ｂ））。一方、細胞増殖マーカーであるＰＣＮＡの発現レベルは、１１ｂで処置した動物においてはコントロールと比べて低下した（図６（ａ）右側及び図６（ｃ））。これらの結果は、インビボにおける細胞増殖阻害及びアポトーシス活性化を通して、１１ｂが腫瘍の成長を抑制することを示している。
【００４５】
要約すると、種々の癌セルラインに抗増殖活性を有する、ＣＤＫ１及び２に対する強力な阻害剤として、いくつかの新規な５’，５−置換−インディルビン−３’−オキシム化合物を開発した。５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体の増強された阻害活性は、ＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位における分子ドッキングの研究によって、５’−非置換インディルビン−３’−オキシム（１）と比較して解釈できた。その結果、溶媒露出領域に向かった分子の更なる投影図及び５’−ヒドロキシ類縁体（１１ｂ）で例示されるようなＡＴＰ結合ポケットの提示されたアミノ酸残基との相互作用が決定された。特に、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）及び５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）は、それぞれ１．７１ｎＭ及び１．９１ｎＭのＩＣ50値を有する強力なＣＤＫ２阻害剤であり、更に、０．２〜３．３μＭの範囲のＩＣ50値を有する種々のヒト癌セルラインへの強力な抗増殖剤でもあった。構造活性相関分析により、５’位は、５’−ＣＨ3、５’−ＯＣＨ3のような電子供与性基よりＯＨ基及びハロゲン基の方が好ましいことが示された。代表的な類縁体である５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）は、選択したキナーゼパネルについてＣＤＫに対する阻害活性の選択性は５００倍以上を示し、また、重要なインビボ抗癌活性も示した。この研究から得られた情報は、ＣＤＫ阻害剤に基づくドラッグデザインの開発及び臨床応用に貢献することが期待された。
【００４６】
更に、５’−ヒドロキシ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ａ）、５’−ヒドロキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｃ）、５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）及び５’−メチル−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）のような他の類縁体も有効な抗癌剤と考えられた。
【００４７】
本発明は、次の実施例によって、より具体的に説明することができる。しかし、本発明の範囲は、次の実施例に限定して解釈してはならい。
【実施例】
【００４８】
化学
３００ＭＨｚのＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＬＡ ３００ＷＢ分光計又は４００ＭＨｚのＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＣＸ ４００Ｐ分光計を用いて、1Ｈ ＮＭＲスペクトルを決定した。スペクトルは、ＣＤＣｌ3、ＤＭＳＯ−ｄ6又はアセトン−ｄ6において取得した。特に明記しない限り、化学シフトは、内部テトラメチルシランからの低磁場側のｐｐｍ又はＤＭＳＯ（２．５ｐｐｍ）、アセトン（２．０４ｐｐｍ）からの相対的なｐｐｍとして表示する。質量分析法は、エレクトロスプレーで実施し、ＦＡＢ、ＥＩ[ＪＥＯＬ：マスレンジ２６００ａｍｕ、１０ｋＶ加速]及びＥＳＩで高分解能質量スペクトル（ｍ／ｚ）を記録した。高分解能質量分析はＫｏｒｅａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｄａｅｇｕ）で実施した。
【００４９】
全ての最終生成物の純度はＨＰＬＣで決定した（特に明記しない限り、少なくとも９５％の純度）。純度の決定は、島津 Ｓｈｉm−ｐａｃｋ Ｃ１８ 分析カラム（２５０ｍｍ ４．６ｍｍ，５ｍ，１００Å リニアグラジエント溶媒システム）を用いて、島津 ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ ＨＰＬＣシステムにより行った。溶媒システムは、流速＝１ｍＬ／ｍｉｎでＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ＝６５：３５から５：９５へ３０ｍｉｎとした。ピークはダイオードアレイ検出器を用いたＵＶ吸収により検出した。
【実施例１】
【００５０】
５−置換インドキシＮ，Ｏ−ジアセテート（５ａ〜ｄ）の調製
５−置換アントラニル酸（１．０ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのメタノールに溶解した溶液に０．５ｍｌの酢酸を加え、次いでグリオキシル酸エチル（１ｍｌ，９．７ｍｍｏｌ）及びＮａＣＮＢＨ3（６０９．５ｍｇ，９．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で３時間撹拌した。その後、エバポレーションによってメタノールを除去した。残渣を飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液に溶解し、酢酸エチルで抽出した。抽出物を合せ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレーションを行った。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ3Ｃｌ：メタノール＝３０：１）で精製し、更に、この生成物（１．４ｇ，５．８ｍｍｏｌ）を２５ｍｌの１規定のＮａＯＨ（ａｑ）と１０ｍｌのメタノールの中で加水分解した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、得られた溶液を１規定のＨＣｌで酸性化した。形成された沈殿物をろ過によって集め、水で洗浄した。得られた二酸化合物（４ａ〜ｄ）（１．２ｇ，４．９７ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１５ｍｌ）とＮａ2ＣＯ3（１．３ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）の中へ加えた。反応混合物を４時間還流した。生成物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄した。抽出物を合せ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレーションを行った。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製した。
【００５１】
１−アセチル−１Ｈ−インドール−３，５−ジイルジアセテート（５ａ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm, J in Hz) 8.46 (1H, d, J = 9.3 Hz), 7.76 (1H, s), 7.30 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.11 (1H, dd, J = 9.3, 2.4 Hz), 2.67 (3H, s), 2.36 (3H, s), 2.31 (3H, s). ESI [M-H] - : 273.83.
１−アセチル−５−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（５ｂ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, ppm, J in Hz) 8.40 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.75 (1H, s), 7.53 (1H, d, J = 2 Hz), 7.34 (1H, dd, J = 8.8, 2 Hz), 2.61 (3H, s), 2.39 (3H, s). ESI [M-H] - : 249.83.
１−アセチル−５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（５ｃ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, ppm, J in Hz) 8.42 (1H, m), 7.75 (1H, s), 7.19 (1H, dd, J = 8.2, 2.4 Hz), 7.10 (1H, td, J = 8.8, 2.4 Hz), 2.59 (3H, s), 2.37 (3H, s). ESI [M-H] - : 233.88.
１−アセチル−５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（５ｄ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, ppm, J in Hz) 8.31 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.65 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.19 (1H, d, J = 7.6 Hz), 2.57 (3H, s), 2.44 (3H, s), 2.36 (3H, s). ESI [M-H] - : 229.80.
【実施例２】
【００５２】
５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体（１１〜１４）の調製
イサチン類縁体（７７ｍｇ，０．４２５ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍｌ）に溶解した溶液に５−置換インドキシＮ，Ｏ−ジアセテート（１００ｍｇ，０．４２５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５分間撹拌した。無水Ｎａ2ＣＯ3（１１２．５ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌を継続した。黒色の沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、減圧下で乾燥して、５，５−置換インディルビンの誘導体（７〜１０）を得た。適当なインディルビン誘導体（１０ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）をピリジン（０．３ｍｌ）に溶解し、塩酸ヒドロキシルアミン（６．６ｍｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を還流下で１２０℃、２時間加熱した。冷却後、生成物を１規定ＨＣｌで酸性化した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、対応する３’−オキシムを定量的に、（２’Ｚ，３’Ｅ）の形態で選択的に得た。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製した。
【００５３】
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.71 (1H, s, N-H), 10.78 (1H, s, N'-H), 9.27 (1H, s, O-H), 8.59 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 7.74 (1H, d, J = 2 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.11 (1H, dd, J = 8, 2 Hz, H-6'), 6.87 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.85 (1H, d, J = 8 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H10ClN3O3): calcd 327.0411 found 327.0408. Purity 92%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 300 MHz, ppm, J in Hz) 13.87 (1H, s, NOH), 11.78 (1H, s, N-H), 11.35 (1H, s, N'-H), 9.41 (1H, d, J = 2.8 Hz, H-4), 9.32 (1H, s, O-H), 8.05 (1H, dd, J = 11.6, 2.8 Hz, H-6), 7.76 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4'), 7.29 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-7), 7.04 (1H, d, J = 11.2 Hz, H-7'), 6.86 (1H, dd, J = 11.2, 3.2 Hz, H-6'). HRMS (EI) [M]+ (C16H10N4O5): calcd 338.0651 found 338.0648.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｃ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.69 (1H, s, N-H), 10.66 (1H, s, N'-H), 9.25 (1H, s, O-H), 8.42 (1H, dd, J = 11.4, 2.8 Hz, H-6), 7.73 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.81-6.99 ( 3H, m, H-7', H-4, H-7). HRMS (EI) [M]+ (C16H10FN3O3): calcd 311.0706 found 311.0707. Purity 93%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｄ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.70 (1H, s, N-H), 10.78 (1H, s, N'-H), 9.22 (1H, s, O-H), 8.50 (1H, s, H-4), 7.70 (1H, d, J = 2 Hz, H-4'), 7.21 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-7'), 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.80 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6'). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H9F3N3O4): calcd 376.0545 found 376.0546.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ａ）のデータ
1H NMR (acetone, 300 MHz, ppm, J in Hz) 13.05 (1H, s, NOH), 11.82 (1H, s, N-H), 9.81 (1H, s, N'-H), 8.67 (1H, s, H-4), 8.35 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-4'), 7.45 (2H, m, H-6, H-7), 7.16 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.97 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H9Cl2N3O2): calcd 345.0072 found 345.0075.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.98 (1H, s, N-H), 11.39 (1H, s, N'-H), 9.45 (1H, s, H-4), 8.25 (1H, s, H-4'), 8.08 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 7.50 (2H, m, H-6', H-7), 7.05 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C16H8ClN4O4): calcd 355.0234 found 355.0242.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｃ）のデータ
1H NMR (acetone, 300 MHz, ppm, J in Hz) 12.96 (1H, s, NOH), 11.78 (1H, s, N-H), 9.71 (1H, s, N'-H), 8.41 (1H, d, J = 11.4 Hz, H-7), 8.32 (1H, s, H-4), 7.40-7.50 (2H, m, H-4', H-6'), 6.88-6.91 (2H, m, H-6, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C16H8ClFN3O2): calcd 328.0289 found 328.0291.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｄ）のデータ
1H NMR (acetone, 300 MHz, ppm, J in Hz) 13.02 (1H, s, NOH), 11.82 (1H, s, N-H), 9.88 (1H, s, N'-H), 8.63 (1H, s, H-4) , 8.34 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-4'), 7.47 (2H, m, H-6, H-7), 7.11 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H8ClF3N3O3): calcd 394.0206 found 394.0215.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.81 (1H, s, N-H), 10.85 (1H, s, N'-H), 8.62 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 7.97 (1H, dd, J = 8.2, 2.4 Hz, H-6), 7.47 (1H, m, H-4'), 7.31 (1H, m, H-7), 7.15 (1H, dd, J = 8.4, 2 Hz, H-6'), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C16H8ClFN3O2): calcd 328.0289 found 328.0295.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.89 (1H, s, N-H), 11.40 (1H, s, N'-H), 9.43 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 8.08 (1H, dd, J = 8.6, 2 Hz, H-6), 8.00 (1H, dd, J = 8.6, 2 Hz, H-7), 7.51 (1H, m, H-4'), 7.33 (1H, td, J = 9, 2.8 Hz, H-6'), 7.06 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H9FN4O4): calcd 340.0608 found 340.0610.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｃ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.76 (1H, s, N-H), 10.68 (1H, s, N'-H), 8.41 (1H, dd, J = 11.2, 2.4 Hz, H-4), 7.93 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-4'), 7.39 (1H, m, H-7), 7.30 (1H, td, J = 8.8, 2 Hz, H-6), 6.93 (1H, td, J = 9, 2.4 Hz, H-6'), 6.84 (1H, m, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H9F2N3O2): calcd 313.0663 found 313.0666. Purity 93%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｄ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 12.02 (1H, s, N-H), 10.72 (1H, s, N'-H), 8.59 (1H, s, H-4), 8.02 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6), 7.41 (1H, m, H-4'), 7.18 (1H, td, J = 9.2, 2 Hz, H-6), 7.00 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.9 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (FAB) (C17H9O3N3F4): calcd 379.0579 found 379.0580.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.85 (1H, s, N-H), 10.76 (1H, s, N'-H), 8.64 (1H, s, H-4), 8.10 (1H,s, H-4'), 7.29 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.20 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.10 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'), 6.86 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'), 2.31 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]+ (C17H12ClN3O2): calcd 325.0618 found 325.0623.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.87 (1H, s, N-H), 11.38 (1H, s, N'-H), 9.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 8.11 (1H,s, H-4'), 8.07 (1H, dd, J = 8, 2.4 Hz, H-6), 7.37 (1H, d, J = 8 Hz, H-7), 7.26 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6'), 7.05 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-7'), 2.32 (3H, s, CH3). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H11N4O4): calcd 335.0780 found 335.0787. Purity 93%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｃ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.78 (1H, s, N-H), 10.61 (1H, s, N'-H), 8.43 (1H, dd, J = 11.2, 2.4 Hz, H-4), 8.06 (1H,s, H-4'), 7.26 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.17 (1H, d, J = 8 Hz, H-7'), 6.86 (1H, td, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 6.80 (1H, d, J = 8 Hz, H-6'), 2.28 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]+ (C17H12FN3O2): calcd 309.0914 found 309.0912.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｄ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.80 (1H, s, N-H), 10.87 (1H, s, N'-H), 8.59 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 8.09 (1H,s, H-4'), 7.34 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.25 (1H, d, J = 8 Hz, H-7), 7.10 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-6'), 6.94 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'), 2.33 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]+ (C18H12F3N3O3): calcd 375.0831 found 375.0833.
【実施例３】
【００５４】
５’−メトキシ−５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体（１６ａ〜ｃ）の調製
５’−ヒドロキシ−インディルビン類縁体（７ｄ）（１０ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）をアセトン（１ｍｌ）に溶解した溶液にヨウ化メチル（１７Ｌ，０．２７６ｍｍｏｌ）を滴下し、Ｋ２ＣＯ３（１９ｍｇ，０．１３８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌を続けた。黒色の沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、減圧下で乾燥して、５’−メトキシ−５−置換インディルビン（１５ｃ）を得た。適当なインディルビン誘導体（６ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）をピリジン（０．３ｍｌ）に溶解し、塩酸ヒドロキシルアミン（３．４ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を還流下で１２０℃、１時間加熱した。冷却後、生成物を１規定ＨＣｌで酸性化した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、対応する３’−オキシムを定量的に、（２’Ｚ，３’Ｅ）の形態で選択的に得た。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製した。
【００５５】
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メトキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１６ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.82(1H, s, N-H), 9.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 9.33 (1H, s, N'-H), 8.12 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 7.77 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.30 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.24 (1H, d, J = 9.2 Hz, H-7'), 6.85 (1H, dd, J = 7.8, 2.4 Hz, H-6'), 3.39 (3H, s, OCH3). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H11N4O5): calcd 351.0729 found 351.0724. Purity 94%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メトキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１６ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.68 (1H, s, N-H), 9.22 (1H, s, N'-H), 8.44 (1H, m, H-4), 7.70 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.21 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6), 6.96 (2H, m, H-7, H-7'), 6.79 (1H, dd, J = 8.6, 2.4 Hz, H-6'), 3.26 (3H, s, OCH3). HRMS (EI) [M]+ (C17H12FN3O3): calcd 325.0863 found 325.0859.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メトキシ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１６ｃ）のデータ
1H NMR (acetone, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.70 (1H, s, N-H), 8.62 (1H, s, H-4), 8.28 (1H, s, N'-H), 7.90 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.12 (1H, m, H-7'), 7.04 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.99 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6'), 3.33 (3H, s, OCH3). HRMS (EI) [M]+ (C18H12F3N3O4): calcd 391.0780 found 391.0782.
【実施例４】
【００５６】
分子ドッキング
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）のＣＨＡＲＭｍ−ベース分子動力学ドッキングアルゴリズムのＣＤｏｃｋｅｒを用いて、分子ドッキングを行った。５−ブロモ−インディルビンと共結晶化したＣＤＫ２の構造は、ＰＤＢデータバンク（ＰＤＢコード：２ＢＨＥ）から得た。続いて、プロテインクリーンプロセス及びＣＨＡＲＭｍ−力場を適用した。半径８Åの５−ブロモ−インディルビンの周囲の領域を活性部位として選択した。複合体の構造からリガンドを除去した後、活性部位の周囲に３軸方向において結合球面を構成した。全てのデフォルトパラメータは、ドッキングプロセスに使用した。ＣＨＡＲＭｍ−ベース分子動力学（１，０００ステップ）を使用してランダムなリガンド１１ｂのコンフォメーションを作成し、剛体回転（リジッドボディローテーション）続いて７００Ｋでのシミュレーティドアニーリングを行って、結合部位におけるリガンド１１ｂの位置を最適化した。最終的なエネルギー最小化は、フルポテンシャルモードとして設定した。１１ｂの最終的な結合コンフォメーションは、エネルギーに基づいて決定した。リガンド２、１３ｂのドッキング研究を上記の通り実施した。
【実施例５】
【００５７】
生物学的方法
酵素アッセイ
ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＥは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から購入した。キナーゼ活性は、０．１ｍｇ／ｍＬのヒストンＨ１を含むバッファー（８ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）中で、ＣＤＫ１については４５Ｍ[−33Ｐ]ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）の存在下で、又は、ＣＤＫ２については１２０μＭ[γ−33Ｐ]ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）の存在下で、最終反応量２５μＭで試験した。ＭｇＡＴＰ混合物を添加することによって反応を開始した。３０℃で４０分間インキュベーションした後、３％リン酸溶液を５μＬ添加することによって反応を停止した。上清の１０μＬ分量をＷｈａｔｍａｎ Ｐ３０ ホスホセルロース紙の２．５ｃｍ×３ｃｍ小片上にスポットし、２０秒後にそのフィルタを７５ｍＭリン酸中で５分間３回洗浄し、乾燥前にメタノール中で１回洗浄した。１ｍＬのＡＣＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）シンチレーション液の存在下で、湿ったフィルタを計数した。活性は、通常、最大活性、すなわち阻害剤の非存在下のパーセンテージとして表される。コントロールには適当に希釈したＤＭＳＯを用いた。
【００５８】
種々の組換えキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ，Ｍｅｔ Ｍ１２５０Ｔ，Ｒｏｎ，ＶＥＧＦ２，ＥＧＦＲ，ＴｒｋＡ，ＰＩ３Ｋγ，ＩＫＫβインスリン受容体，Ａｕｒｏｒａ Ａ）に対するキナーゼ活性の阻害を、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いて測定した。簡潔に言えば、アッセイはＡＴＰの存在下でペプチド基質のリン酸化に基づいている。結果として生じたリン酸化された基質は、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー転移）シグナルによって検出する。キナーゼドメインを含む組換えタンパク質は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から購入した。酵素、ＡＴＰ及び基質の最適濃度は、ＨＴＲＦ ＫｉｎＥＡＳＥキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて、製造業者の指示に従って、それぞれの酵素について設定した。アッセイは、キナーゼ反応バッファー（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ オルトナバジウム酸塩，０．０５％ ＢＳＡ，０．１％ ＮａＮ3）中で、連続的に希釈した化合物及びペプチド基質に酵素を混合して構成する。検出用試薬の添加の後、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ−ラベルリーダー（Ｐｅｒｋａｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを測定した。
【００５９】
細胞増殖アッセイ
細胞（Ａ５４９，ＨＴ１０８０，ＨＣＴ１１６，Ｋ５６２，ＳＮＵ６３８，ＫＢ，ＭＣＦ−７）を計数し、新鮮な培地（１０％ＦＢＳを含むＭＥＭＥ，ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ）で５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈し、１９０μＬの細胞懸濁液を種々の濃度の試験化合物（１０％ＤＭＳＯ水溶液中に１０μＬ）を含む９６穴プレートに加えた。試験プレートをＣＯ2インキュベーターで３７℃３日間インキュベートした。０日目のコントロールとして、細胞をＣＯ2インキュベーターで３７℃３０分間インキュベートした。全ての処理は、３連で行った。インキュベーション期間経過後、細胞を、冷却した５０％ＴＣＡ５０μＬで４℃で３０分間固定し、水道水で５回洗浄し、風乾した。固定した細胞を、０．４％ＳＲＢ溶液含有１％酢酸水溶液で室温で１時間染色した。次いで、１％酢酸で５回洗浄することによって遊離のＳＲＢ溶液除去し、風乾した。結合した色素を２００Ｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ（ｐＨ１０．０）で溶解し、吸光度をＥＬＩＳＡ用マイクロプレートリーダーを用いて５１５ｎｍで測定した。最終的に、各々の処理手順で得られた吸光度の値を平均して、０日目のコントロールで得られた平均値を引き算した。これらの結果は、溶媒で処理したコントロールのインキュベーションに対してのパーセンテージとして表し、ＩＣ50値は非線形回帰分析（生存パーセント対濃度）を用いて計算した。
【００６０】
腫瘍異種移植動物モデル
ｋ−ｒａｓ−形質転換ラットの腎臓上皮細胞セルライン（ＲＫ３Ｅ−ｒａｓ）は、１０％ＦＣＳ、１００ユニット／ｍＬペニシリン及び１００Ａｇ／ｍＬストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ中で保持した。ＲＫ３Ｅ−ｒａｓ細胞は、Ｅｒｉc Ｆｅａｒｏｎ博士（ミシガン大学医学部、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から快く提供を受け、以前の報告に記載されている。インビボでの腫瘍成長の抑制を調べるために、雄のＳＤラット（生後６週）を用いた。０日目のラットの側腹部にＲＫ３Ｅ−ｒａｓ−Ｌｕｃ細胞（５×１０6）を皮下移植し、以前に記載したように５日目にラットをランダムにグループ化した（５匹／グループ）。１１ｂを含有するＰＥＧ４００、ＥｔＯＨ及びＤＷの混合物の溶液（３０：３３：３７，３ｍｇ／ｍＬ，５ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに、合計５回、無麻酔状態で静脈内に投与した。最終投与の４８時間後に動物を屠殺し、ラットの体重及び腫瘍の容積を測定した。腫瘍成長の容積は、次の通り計算した：Ｖ＝（ａｂ2）／２、ここで、ａは腫瘍の最も長い直径、ｂは腫瘍の最も短い直径である。全て実験は、Ｃｈｏｓｕｎ大学歯学部（Ｇｗａｎｇｊｕ，韓国）の動物実験委員会により承認されたプロトコルの下で実施した。
【００６１】
生物発光イメージングアッセイ
生物発光イメージングのために、ラットにランパン／ケタミン（１：１）麻酔でルシフェリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をｉ．ｐ．投与した。ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓイメージングシステム（富士フィルム，東京，日本）を用いて、ラットをイメージングし、腫瘍から放出されたバイオルミネセンスシグナルを記録した。放出された光を取り込むためにＣＣＤカメラを備えているＬＡＳ−１０００システムを用い、データ解析のためにＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウエア（Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ｖ３．０）を用いた。
【００６２】
組織学、免疫組織化学及びＴＵＮＥＬアッセイ
切除した固形腫瘍を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包理した。光学顕微鏡検査のために、４−μｍの切片とした組織をＨ＆Ｅで染色した。免疫組織化学的染色は、抗−ＰＣＮＡ抗体を用いてアビジン−ビオチン複合体法で行った。免疫反応は、３，３’−ジアミノベンジジンで可視化し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｌｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）を用いて、製造業者の指示に従って、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。簡潔に言えば、スライドを脱パラフィンし、２０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫで３７℃で１５分間処理し、染色を増強した。内因性のペルオキシダーゼをブロックするために３％過酸化水素中に漬けた後、スライドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む反応バッファーで３７℃で１時間インキュベートした。次いで、スライドをペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体とともに３０分間インキュベートし、反応生成物を２ｍＭの過酸化水素を含む０．０３％の３，３’−ジアミノベンジジン溶液で可視化した。スライドは、０．５％のメチルグリーンで対比染色した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体に関する。更に詳細には、本発明は、ヒト肺癌細胞、ヒト繊維肉腫細胞、ヒト大腸癌細胞、ヒト白血病細胞、ヒト胃癌細胞、ヒト鼻咽頭癌細胞及び／又はヒト乳癌細胞に対する優れた抗癌活性を有する強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の進行、ニューロン機能、分化及びアポトーシスの調節に関与するセリン／スレオニンキナーゼのグループに属する。これらの活性は対応するサイクリンとの結合を含む複数の機構によって厳重に制御されており、その発現レベルは細胞周期の各期にわたって変動する。種々の異なるＣＤＫ／サイクリン複合体が、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期を通した細胞周期の各段階において活性化される。初期Ｇ１期におけるＣＤＫ４／サイクリンＤ及びＣＤＫ６／サイクリンＤ並びに後期Ｇ１期におけるＣＤＫ２／サイクリンＥによる網膜芽細胞腫蛋白（ｐＲｂ）の連続的なリン酸化によって、Ｅ２Ｆ（転写因子タンパク質）の放出が生ずる。次に、Ｅ２Ｆタンパク質は、細胞周期のＳ期へ入るために必要な一連の遺伝子の転写活性化を引き起こす。続いて、ＣＤＫ２がＤＮＡ複製の後期（Ｓ期）にサイクリンＡよって活性化され、残存するＥ２Ｆ活性によって誘発されるアポトーシスを防止するよう適切な時期にＥ２Ｆの非活性化を促進する。最終的には、サイクリンＡ又はＢと複合体を形成したＣＤＫ１が、Ｇ２／Ｍチェックポイントを制御し細胞の有糸分裂を促進する機能を担っていると考えられている。
【０００３】
細胞周期の調節に加え、ＣＤＫ２、７、８及び９について他の役割が分かっている。例えば、ＣＤＫ２／サイクリンＥはｐ５３に媒介されるＤＮＡ損傷の反応経路にとって重要であり、ＣＤＫ７、８、及び９はＲＮＡポリメラーゼのリン酸化を通して転写の開始と伸長の調節に関与している。従って、ＣＤＫは種々の異なる機構を通して細胞の成長及び生存に影響を及ぼし、ＣＤＫ活性の適切な制御はいろいろな細胞プロセスにとって重要である。現在、多くのヒト腫瘍において、サイクリンＤ及びサイクリンＥのようなサイクリンの異常な高発現や変異によるＣＤＫの制御不良が起こることが分かっている。例えば、ＣＤＫ２／サイクリンＥ複合体の発現及び触媒活性は大腸癌、卵巣癌、乳癌及び前立腺癌において増加し、原発癌におけるサイクリンＥの高発現は乳癌患者の低い生存率と相関関係がある。ＣＤＫ１／サイクリンＢ複合体の異常な発現も、いくつかの場合（前立腺腺癌及び肺癌）に観察されている。
【０００４】
ＣＤＫ２は細胞周期の進行及び増殖に必要ないかも知れないという報告があるが、最近の報告は、メラニン形成細胞及び肝細胞が、増殖及び生存に関し、ＣＤＫ２に依存している可能性を示唆している。また、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２を同時に欠乏させた調査では、ＣＤＫ１又はＣＤＫ２のいずれか一つを対象とする場合に比べて、腫瘍セルラインの抗細胞増殖に高い効果があると報告された。更に、新たに得られた証拠により、ある種の腫瘍細胞は増殖のために特定の間期のＣＤＫを必要とする可能性が示唆されている。このように、ＣＤＫを阻害することは、癌治療の興味ある標的として、腫瘍の成長を制御する有効な戦略を提供する可能性がある。
【０００５】
現在までに、多くの低分子ＣＤＫ阻害剤が臨床試験中である。これらの阻害剤は、キナーゼのＡＴＰ結合部位においてＡＴＰと競合して作用する平面状の小さい複素環である。これらの中でフラボピリドールは臨床評価に入った最初のＣＤＫ阻害剤だった。Ｒ−ロスコビチン（１分子中に３個の置換基を有するプリン類縁体）及びＢＭＳ−３８７０３２（アミノチアゾール）はＣＤＫ２／サイクリンＥに対して選択性を有し、ＰＤ−０３３２９９１（ピリドピリミジン）はＣＤＫ４／サイクリンＤ及びＣＤＫ６／サイクリンＤに対して高い選択性を有している。インディルビン、ビス−インドール・スキャフォールド及びその誘導体は、ＣＤＫ、ＧＳＫ−３β及びオーロラキナーゼのような重要なプロテインキナーゼを標的とする強力な阻害剤として、大変な興味を持って調査されてきた。
【０００６】
国際公開公報ＷＯ２００５／０７０４１６ Ａ１において、本出願の発明者は、ヒト癌セルラインに対する抗癌特性を有するインディルビン誘導体を開示した。この開示においては、ヒト癌セルラインに関して細胞増殖を阻害することによる抗癌特性を有するインディルビン誘導体が開示されている。開示されたインディルビン誘導体の中で、５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシムは種々の癌セルラインに対して最も強力な抗増殖効果（ＩＣ５０＝０．７９〜２．９μＭ）を示した。しかし、インディルビン骨格の５’位のラジカルを更に置換することは行われなかったし、また、そのような化合物について抗癌活性も測定されなかった。更に、インディルビン骨格の５’位で種々の置換を行った場合の効果を調べる合成や生物学的評価についての報告もない。
【０００７】
一方で、本出願の発明者は、５’位を更に置換することは５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム類縁体と比較して明らかに有利であることを発見した。そして、本出願の発明者は、新規な５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム類縁体の設計、合成並びにＣＤＫ阻害活性、抗増殖活性及びインビトロ抗癌活性を含む生物学的評価による調査を行って、本発明を完成した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、式（Ｉ）で表される抗癌活性を有するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物を提供することである。
式（Ｉ）
【０００９】
【化１】
【００１０】
ここで、
Ｒ1はＦ、Ｃｌ、ＣＨ又はＣＨ3から選択され、
Ｒ2はＦ、Ｃｌ又はＮＯ2から選択される。
【００１１】
また、本発明は、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物；Ｒ1がＦであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、
i）Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＣｌである化合物、
ii）Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＦである化合物、
iii）Ｒ1がＣｌであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物、及び
iv）Ｒ1がＣＨ3であり、Ｒ2がＮＯ2である化合物
を提供する。
【００１３】
更に、本発明は、ヒト肺癌セルライン、ヒト繊維肉腫セルライン、ヒト大腸癌セルライン、ヒト白血病セルライン、ヒト胃癌セルライン、ヒト鼻咽頭癌セルライン及び／又はヒト乳癌セルラインに対する優れた抗癌活性を有する式（Ｉ）で表されるインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物を提供する。
【００１４】
更に、本発明の目的は、前記インディルビン−３’−オキシム誘導体化合物及び医薬として許容可能な担体を有する抗癌組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明に関連したインディルビン誘導体の構造を示す。
【図２】図２は、ＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位への２及び１１ｂの結合状態を示す。図２（ａ）は、２とキナーゼ主鎖との間の水素結合ネットワーク（緑色の破線）を示す。２のＣＤＫ２との結合状態は、ＣＤＫ２のヒンジ領域との３個の水素結合、オキシム部分とＧｌｎ１３１のカルボニルの酸素との間の更なる水素結合を表している。また、ニトロ基は、Ｌｙｓ３３、Ａｓｐ１４５の側鎖と塩橋を形成している。図２（ｂ）は、ＣＤＫ２の２とのファンデルワールス表面をＣＰＫ表示で示している。５’−ブロモ基は、正に帯電したアミノ酸残基のＬｓｙ８９を提示するＡＴＰ結合ポケットの外側の水性の空間に向かって投影されている。図２（ｃ）は、１１ｂとキナーゼ主鎖との間の水素結合ネットワーク（緑色の破線）を示す。１１ｂは、５’−ヒドロキシ基とＡｓｐ８６のカルボン酸との間に更なる水素結合を形成している。これにより、ＣＤＫ２阻害活性が更に向上している可能性がある。図２（ｄ）は、ＣＤＫ２の、ＡＴＰ結合部位で結合した１１ｂとの分子表面の表示を示す。結合面内に存在するいくつかの重要なアミノ酸が表示されている。５’−ヒドロキシ基はポケットから溶媒の方に向かっている。
【図３】図３は、５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体が１μＭの時のＣＤＫ1、ＣＤＫ２活性のパーセントを示す。一連のインディルビン誘導体が、明細書に記載したように、１μＭで、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＢについての効果が試験されている。実験は、比較対象として、５−ニトロインディルビン−３’−オキシム（１）についても実施された。
【図４】図４は、１０μＭでの１１ｂ、１２ｂのキナーゼパネルによるスクリーニングを示す。化合物１１ｂ、１２ｂが、明細書に記載したように、１０μＭの濃度で、受容体型チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼからなる種々のキナーゼパネルに対して試験されている。１μＭの１１ｂはＴｒｋＡに対する９％の阻害活性を示し、また、ＡｕｒｏｒａＡ（１μＭ）とＩＫＫβ（１０μＭ）の２種のセリン／スレオニンキナーゼ及び受容体型チロシンキナーゼＴｒｋＡ（４μＭ）に対する１１ｂのＩＣ50値が用量反応曲線から算出されている。
【図５】図５は、１１ｂによる異種移植された腫瘍の成長の抑制を示す。図５は、ＳＤ−ラットがＲＫ３Ｅ−ｒａｓ−Ｌｕｃ細胞（５×１０6／１００μl）を注射されたこと示している。腫瘍が５ｍｍの大きさに達した時、ラットは非麻酔状態で１日おきに合計5回、静脈内に１１ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）が注射された。腫瘍の大きさは、明細書に記載したようにノギスで測定した。図５（ｂ）は、対照及び１１ｂで処置されたラットから切除された皮下腫瘍の代表例を示す。図５（ｃ）は、対照及び１１ｂで処置されたラットのインビボ生物発光イメージングアッセイを示す。
【図６】図６は、腫瘍組織の組織学的検査及び免疫組織化学的検査を示す。ＲＫ３Ｅ−ｒａｓ−Ｌｕｃ細胞がラットの左側腹部に皮下接種された。5日目から1日おきに、１１ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）が担腫瘍ラットの静脈内に注射された。１１日目にラットを屠殺した。図６（ａ）は、腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色（左側）、固形腫瘍のパラフィン切片のＴＵＮＥＬアッセイ（中央）、及び、ＰＣＮＡの免疫組織化学染色（右側）を示す。図６（ｂ）はＴＵＮＥＬアッセイの陽性細胞を示し、図６（ｃ）はＰＣＮＡ免疫染色の陽性細胞を示す。細胞は3回計数した（柱は平均値、棒線はＳＤ）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
インディルビン誘導体を含む抗癌剤のターゲットであるＣＤＫ２／サイクリンＥに対する阻害活性を向上させるために、５’位及び５位の両方を置換した新規な一連のインディルビン−３’−オキシム誘導体を設計し、合成した。５’−置換類縁体の、ＯＨ又はハロゲンとの結合状態はＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位における分子ドッキングの研究により予測され、更に、ＣＤＫ２阻害活性の向上を説明する可能性のある重要な相互作用も示された。
【００１７】
構造活性相関解析は、５’位では、ＣＨ３やＯＣＨ3のような電子供与性基よりもＯＨ基やハロゲン基の方が好ましいことを示している。合成した誘導体の中では、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）及び５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）が、ＣＤＫ２に対してＩＣ５０値がそれぞれ１．９ｎＭ、１．７ｎＭの強力な阻害活性を示し、また、種々のヒト癌セルラインに対してＩＣ５０値が０．２〜３．３μＭの範囲の抗増殖効果を示した。１０種の異なる受容体型チロシンキナーゼ及びセリン／チロシンキナーゼのパネルでの１１ｂのキナーゼ選択性プロファイルの研究の結果、ＣＤＫに対する阻害活性の選択性は５００倍以上であった。１１ｂの抗癌活性が更に確認され、５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されたインビボ異種移植動物モデルは体重の減少もなく対照動物に比べて８４％の腫瘍容積の減少を示した。組織学的解析を通した抗腫瘍活性の機序がアポトーシス及び増殖のマーカーによって示され、それぞれアポトーシスは増加し、増殖は減少した。
【００１８】
更に、他の類縁体、例えば５’−ヒドロキシ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ａ）、５’−ヒドロキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｃ）、５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）及び５’−メチル−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）が効果的な抗癌剤と考えられた。
【００１９】
本発明は、以下の通り、更に具体的に説明することができる。
【００２０】
設計戦略のための分子ドッキング
化合物２の増強された抗増殖効果に取り組むために、ＣＨＡＲＭｍ−ベース・分子動力学・ドッキング・プログラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２．０）のＣＤｏｃｋｅｒを用いて、ＣＤＫ２（図２）のＡＴＰ結合部位における分子ドッキングの研究を行った。図２（ａ）は、化合物２の１’位の窒素、２位のカルボニルの酸素及び１位の窒素がＡＴＰ結合部位のヒンジ部分（Ｇｌｎ８１、Ｌｅｕ８３）と３個の水素結合の相互作用を維持していることを示している。更に、オキシム部分の３’−ヒドロキシル基はＧｌｎ３１の主鎖カルボニルと水素結合を形成し、５−ニトロ基はＬｙｓ３３、Ａｓｐ１４５の側鎖との塩橋に寄与している。図２（ｂ）は、リガンド、２及び５’−Ｂｒ基の周囲４Å以内の静電ポテンシャルを有する結合面が、実質的な結合相手である正に帯電したアミノ酸残基のＬｓｙ８９が存在するＡＴＰ結合ポケットの外側の水性の空間に向かって投影されているようであることを示している。５’−Ｂｒ基の孤立電子対の電子と正に帯電したＬｙｓ８９残基との別の静電的な相互作用がＣＤＫ２との高い結合親和性を与えているようであり、その結果、５’−非置換−インディルビン−３’ −オキシム類縁体の１に比べて２がより強力な抗増殖活性を有することに貢献しているという仮説を立てることができる。ドッキングの研究によって得られたデータによれば、５−置換基（Ｃｌ、ＮＯ2、Ｆ及びＯＣＦ3）に加えて更に５’−位の誘導体化を行うことは、ＣＤＫ２の結合親和性を最適化するためのインディルビン・スキャフォールドの修飾の戦略に理想的であろう。
【００２１】
ＣＤＫ阻害活性及び抗増殖活性に関してインディルビン骨格の５’位での構造活性相関を調査するために、次のグループを誘導体化に選定した。１）５’−Ｆ，５’−Ｃｌ（５’−ブロモ類縁体の２の場合と同様な静電相互作用をＬｙｓ８９と形成することができる）、２）５’−ＯＨ（ＣＤＫ２に更なる水素結合を提供して親水性の性質を導入する）、３）５’−ＯＣＨ3、５’−ＣＨ3（ハロゲン置換類縁体と比較した対比効果を期待する）。
【００２２】
事実、設計した分子の代表例、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム誘導体（１１ｂ）のＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位におけるドッキングモデルは、新しい水素結合の相互作用が溶媒露出領域において１１ｂの５’−ＯＨ基とＡｓｐ８６の間で形成されているようであり、また、１１ｂのオキシム部がＧｌｎ１３１ではなくＩｌｅ１０と相互作用しているようであることを示した。図２（ｄ）は、１１ｂの周囲４Å以内の静電ポテンシャルを有する結合面を提示し、５’−ＯＨがどのように外側の水性の表面、溶媒露出領域の中へ向って突き出ているかを示した。
【００２３】
化学
５’，５−置換−３’−インディルビン・オキシム誘導体を合成するために、５−置換インドキシルＮ，Ｏ−ジアセテート（５ａ〜ｄ）を対応する５−置換アントラニル酸（３ａ〜ｄ）から調整した（スキーム１）。
【００２４】
【化２】
【００２５】
簡潔に言えば、化合物３ａ〜ｄをグリオキシル酸エチルの存在下で還元的アルキル化条件に置き、続いて、加水分解してジカルボン酸（４ａ〜ｄ）を得、最終的にこれを無水酢酸中で環化して５ａ〜ｄを得た。５’−ヒドロキシ誘導体の場合、フェノール性ヒドロキシル基も環化条件下でアセチル化されるので、環化化合物５ａはトリアセテートの形で得た。
【００２６】
“Ｍｏｏｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，１４，２３７−２４６”では、５−置換インドキシルＮ，Ｏ−ジアセテート（５ａ〜ｄ）を種々の５−置換イサチン類縁体（６ａ〜ｄ）と共役反応させて塩基性条件下で５’，５−置換インディルビン誘導体（７〜１０）を得、続いて、ケトンを３’−オキシム基に変換するためにそれぞれのインディルビン（７〜１０）をヒドロキシルアミンと反応させて、５’，５−置換−３’−インディルビンオキシム誘導体（１１〜１４）が合成された（スキーム２）。
【００２７】
【化３】
【００２８】
５’−メトキシ−５−置換−３’−オキシム化合物（１６ａ〜ｃ）は、対応する５’−ヒドロキシ−５−置換―インディルビン誘導体（１５ａ〜ｃ）から、フェノール性ヒドロキシル基をメチル化し、続いて、ヒドロキシルアミンと反応させることによって合成した（スキーム３）。
【００２９】
【化４】
【００３０】
ＣＤＫ阻害活性及びキナーゼ選択制プロファイル
５’，５−置換−インディルビン−３’−オキシム誘導体は、最初に、１μＭでＣＤＫ1／サイクリンＢ、ＣＤＫ2／サイクリンＥに対する阻害活性を評価した（図３）。５’−位の置換体の効果の比較のために、５−ニトロインディルビン−３’−オキシム（１）も併せて試験した。ＣＤＫ１と比べた場合のＣＤＫ２に対するこれらの化合物の阻害活性及び選択性は、Ｒ１−位の５’−置換基に依存することが分かった。一般に、５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体は、１２ｄ及び１６ａ〜ｃを除いて、ＣＤＫ２に対して１μＭで９０％以上の阻害効力を有する強力な阻害活性を示した。特に、５’−ＯＨ類縁体の１１ａ〜ｄは、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の両方に対して最も高い阻害効力示した。Ｒ1位の５’−ＯＨは、ＣＤＫ１と比べたＣＤＫ２の選択性を減少させる結果となったが、しかしながら、文献によれば、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対する同時阻害剤が抗癌活性の点で更なる利点を有する可能性があるという観点から、この結果は重要と言える。更に、５’−ヒドロキシル基の置換は、インディルビン類縁体の物理化学的性質の中で大きな欠点であった水溶性を改善させた。５’−ＯＨ−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体とは対照的に、５’−クロロ及び５’−フルオロ置換インディルビン−３’−オキシム誘導体（１２ａ〜ｄ及び１３ａ〜ｄ）は、ＣＤＫ１と比べて６〜１０倍の選択性で強力なＣＤＫ２阻害活性を保持した。例えば、５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）は、ＣＤＫ２に対しては、ＣＤＫ１よりも約８倍強力であった（表１）。
【００３１】
表１．５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体のＣＤＫ２／サイクリンＥ阻害活性
【００３２】
【表１】
【００３３】
実験の項に記載したように、一連のインディルビン誘導体を１０種の濃度でＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼアッセイの試験をした。用量反応曲線からＩＣ50を計算した。ＣＤＫ１／サイクリンＢキナーゼアッセイにおける１１ｂ及び１２ｂのＩＣ50値は、それぞれ１３ｎＭ及び１９５ｎＭである。
【００３４】
５’−ハロゲン化によってＣＤＫ１阻害効力が低下することは、５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１）に比べて低いＣＤＫ１阻害活性（ＩＣ50＝１９０ｎＭ）を示した５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（２）についての報告によって更に裏付けることができる。５’位に電子供与性基を有する一連の化合物の中で、５’−ＣＨ3を有する１４ｂは、ＣＤＫ１と比べて７倍の選択性で強力なＣＤＫ２阻害活性を保持した。しかしながら、５’−ＯＣＨ3置換誘導体（１６ａ〜ｃ）は、１ｎＭでＣＤＫ１及びＣＤＫ2に対して弱い阻害活性を示したか又は阻害活性は示さなかった。
【００３５】
ＣＤＫ２阻害活性に関して、５’，５−インディルビン−３’−オキシム誘導体の構造活性相関をＩＣ50値により分析した（表１）。５’−ＯＣＨ3誘導体（１６ａ〜ｃ）を除いて、ほとんどの誘導体は１〜７０ｎＭのＩＣ50値で強力な阻害活性を示した。Ｒ１位の５’−置換基の効果に関しては、−ＯＣＨ3＜−Ｃｌ＜−Ｈ、−ＣＨ3＜−ＯＨ、Ｆの順に従ってＣＤＫ２阻害活性は増加した。例えば、５’−クロロ−置換−インディルビン−３’−オキシム誘導体（１２ａ〜ｄ）は、５’−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム誘導体（１３ａ〜ｃ）（ＩＣ50＝１〜８ｎＭ）よりも１０倍弱いＣＤＫ２阻害活性（ＩＣ50＝１０〜７６ｎＭ）を示した。他の電子供与性基である５’−ＣＨ3−が置換されたインディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）は１６ｂに比べて２７０倍の増強された阻害効果を示したが、電子供与性基の５’−ＯＣＨ３置換基（１６ａ〜ｃ）は２−８μＭのＩＣ50値で極めて低いＣＤＫ２阻害活性を示した。特に、最も強力なＣＤＫ２阻害剤である１１ｂ、１３ｂ及び１３ｃは、ＣＤＫ２に対するＩＣ50値が約２ｎＭで、５’−非置換−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１）（ＩＣ50＝７ｎＭ）よりも約４倍高い効力を示した。インディルビン−３’−オキシム誘導体のＲ2位の５−置換の効果の分析では、ニトロ基及びフルオロ基は、クロロ基又はトリフルオロメトキシ基のような他の５−置換基よりも、概してＣＤＫ２阻害により有利であった。総合すれば、５’−位のＯＨ及びＦ並びに５−位のＮＯ2及びＦのような電子的効果を与える置換基の組み合わせを有するインディルビン−３’−オキシム誘導体は、ＣＤＫ２に対して強力な阻害活性を示した。
【００３６】
代表的な強力で選択的なＣＤＫ２阻害剤１１ｂ及び１２ｂは、受容体型チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼを含むキナーゼのより多様なパネルに対して、更に評価を行った（図４）。１１ｂは、試験したキナーゼの中でＡｕｒｏｒａ Ａ、ＩＫＫβ及びＴｒｋＡに対してのみ弱い阻害活性を示し、ＩＣ50値は１〜１０μＭの範囲であった。１２ｂは、試験した全てのキナーゼパネルに対して、無視できる程度の阻害活性しか示さなかった。１１ｂ及び１２ｂのＣＤＫ１及び２に対するＩＣ50値が低いナノモルの範囲にあることから、この研究で試験したセリン／スレオニンキナーゼ及び受容体型チロシンキナーゼにおけるキナーゼ選択性プロファイルはＣＤＫ１及びＣＤＫ２に非常に有利と言える。
【００３７】
抗増殖活性
種々の癌セルライン、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、ＨＣＴ１１６、Ｋ５６２、ＳＮＵ６３８、ＫＢ、ＭＣＦ−７に対する５’，５−置換−インディルビン−３’−オキシム誘導体の抗増殖活性をＳＲＢアッセイにより評価し、癌細胞増殖阻害のＩＣ50値を表２にまとめた。５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（２）及びロスコビチンは、このアッセイにおいて、ポジティブコントロールとして一緒に試験した。
【００３８】
表２．異なるヒト癌セルラインについての５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体の抗増殖活性
【００３９】
【表２】
【００４０】
実験の項で説明したように、ＳＲＢアッセイを用いて、a一連のインディルビン誘導体の種々のヒト癌セルラインに対する効果を５つの濃度で試験した。ＩＣ50（μＭ）値は、用量反応曲線から計算した。bヒト肺癌細胞。cヒト繊維肉腫細胞。dヒト大腸癌細胞。eヒト白血病細胞。fヒト胃癌細胞、gヒト鼻咽頭癌細胞。hヒト乳癌細胞。i実験は、ポジティブコントロールとして、２及びロスコビチンについても実施した。
【００４１】
５’−ヒドロキシ誘導体（１１ａ〜ｄ）の抗増殖活性は、ＮＯ2＞Ｆ＞Ｃｌ、ＯＣＦ3の順で、５位の置換基に応じてＣＤＫ２に対するこれらの阻害活性の効力と良く相関した。特に、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）は、ＨＴ１０８０及びＨＣＴ１１６セルラインに対して〜０．４μＭのＩＣ50値を有し、２と比較して、癌細胞に応じて同程度の又は改善された阻害活性を示した。２の５’−ブロモ基をＦ及びＣｌのような他のハロゲン基に置き換えた化合物の中で、５−ニトロ誘導体（１２ｂ及び１３ｂ）は、５’−ブロモ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム化合物（２）よりも、特にサイクリンＤ１の調節を解除しているヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６に対して、約０．３μＭのＩＣ50値で、より効果的であった。
【００４２】
特に、５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）は、その強力なＣＤＫ２阻害活性と相関して、全ての癌細胞に対して最も広い阻害効力スぺクトル（ＩＣ50＝０．２８〜０．９４μＭ）を示した。化合物１３ｂは、他の誘導体の多くが弱い活性であるのとは対照的に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対して、他にはないナノモルのＩＣ50値の抗増殖活性を有する。しかしながら、５’−ＣＨ3、５’−ＯＣＨ3のような電子供与性基と置換されたインディルビン−３’−オキシム誘導体（１４及び１６）は、抗増殖活性がＩＣ50値０．８〜１μＭの範囲である５’−メチル−５−ニトロ−３’−オキシム（１４ｂ）を除いて、多くの癌細胞に対して非常に弱い阻害剤であった。５−位（Ｒ２）の置換の効果に関しては、５−ＮＯ3基は、５’−ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＨ3と組み合わせたときに、一連の５’，５−二置換誘導体の中で最も強力な抗増殖効果を示した。この結果は、我々の以前に発表した結果23とよく一致し、また、２及び１１ｂの仮定した結合状態、すなわちＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位において５−ニトロ基とＡｓｐ１４５、Ｌｙｓ３３との間で塩橋を有する更なる結合が形成されているようであるということによって指示されている。５’−ＯＣＨ3誘導体の場合、５−Ｆ置換類縁体（１６ｂ）のみが中程度の抗増殖活性を示し、これにより異なる作用機序がこの類縁体に関連している可能性が示唆された。この研究の結果を組み合わせると、５’−ヒドロキシル基又はハロゲン基は、おそらくＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位で更なる水素結合の相互作用を形成することによって、ＣＤＫや癌細胞増殖の阻害に有利だろうという重要な考察が示唆される。
【００４３】
１１ｂのインビボ抗癌活性
５’−ＯＨ−５−ニトロ類縁体（１１ｂ）のインビボの効果を探索するために、我々のグループが発表したように、ｋ−ｒａｓ遺伝子及びＧＦＰ／Ｌｕｃ遺伝子を有しているＲＫ３Ｅラット腎臓細胞が皮下移植されたＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットの腫瘍異種移植動物モデルを利用した。移植の５日後に、１１ｂを５ｍｇ／ｋｇで１日おきに、合計５回、日々モニタリングしながら動物にｉ．ｖ．投与した。腫瘍の容積は、コントロール群（図５（ａ）及び図５（ｂ））と比較して約８４．３％で、有意に減少した。１１ｂの投与期間中は、コントロール群と比較して体重に有意な差はなかった（データは示さず）。１１ｂの処置の後１０日目に得られたバイオルミネセンスイメージは、腫瘍成長の指標であるルミネセンス強度が有意に減少していることを示した（図５（ｃ））。
【００４４】
組織学的分析により、未処置のコントロールの固形腫瘍は、多くの有糸分裂像、多病巣性壊死及び出血を示している未分化の癌腫に属していることが明らかになった。しかし、１１ｂで処置した腫瘍は、広範な細胞死を引き起こした（図６（ａ）左側）。ＴＵＮＥＬ−陽性のアポトーシス細胞は、１１ｂで処置した動物の組織の場合はコントロールの組織と比べて約６倍増加した（図６（ａ）中央及び図６（ｂ））。一方、細胞増殖マーカーであるＰＣＮＡの発現レベルは、１１ｂで処置した動物においてはコントロールと比べて低下した（図６（ａ）右側及び図６（ｃ））。これらの結果は、インビボにおける細胞増殖阻害及びアポトーシス活性化を通して、１１ｂが腫瘍の成長を抑制することを示している。
【００４５】
要約すると、種々の癌セルラインに抗増殖活性を有する、ＣＤＫ１及び２に対する強力な阻害剤として、いくつかの新規な５’，５−置換−インディルビン−３’−オキシム化合物を開発した。５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体の増強された阻害活性は、ＣＤＫ２のＡＴＰ結合部位における分子ドッキングの研究によって、５’−非置換インディルビン−３’−オキシム（１）と比較して解釈できた。その結果、溶媒露出領域に向かった分子の更なる投影図及び５’−ヒドロキシ類縁体（１１ｂ）で例示されるようなＡＴＰ結合ポケットの提示されたアミノ酸残基との相互作用が決定された。特に、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）及び５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）は、それぞれ１．７１ｎＭ及び１．９１ｎＭのＩＣ50値を有する強力なＣＤＫ２阻害剤であり、更に、０．２〜３．３μＭの範囲のＩＣ50値を有する種々のヒト癌セルラインへの強力な抗増殖剤でもあった。構造活性相関分析により、５’位は、５’−ＣＨ3、５’−ＯＣＨ3のような電子供与性基よりＯＨ基及びハロゲン基の方が好ましいことが示された。代表的な類縁体である５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）は、選択したキナーゼパネルについてＣＤＫに対する阻害活性の選択性は５００倍以上を示し、また、重要なインビボ抗癌活性も示した。この研究から得られた情報は、ＣＤＫ阻害剤に基づくドラッグデザインの開発及び臨床応用に貢献することが期待された。
【００４６】
更に、５’−ヒドロキシ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ａ）、５’−ヒドロキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｃ）、５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）及び５’−メチル−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）のような他の類縁体も有効な抗癌剤と考えられた。
【００４７】
本発明は、次の実施例によって、より具体的に説明することができる。しかし、本発明の範囲は、次の実施例に限定して解釈してはならい。
【実施例】
【００４８】
化学
３００ＭＨｚのＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＬＡ ３００ＷＢ分光計又は４００ＭＨｚのＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＣＸ ４００Ｐ分光計を用いて、1Ｈ ＮＭＲスペクトルを決定した。スペクトルは、ＣＤＣｌ3、ＤＭＳＯ−ｄ6又はアセトン−ｄ6において取得した。特に明記しない限り、化学シフトは、内部テトラメチルシランからの低磁場側のｐｐｍ又はＤＭＳＯ（２．５ｐｐｍ）、アセトン（２．０４ｐｐｍ）からの相対的なｐｐｍとして表示する。質量分析法は、エレクトロスプレーで実施し、ＦＡＢ、ＥＩ[ＪＥＯＬ：マスレンジ２６００ａｍｕ、１０ｋＶ加速]及びＥＳＩで高分解能質量スペクトル（ｍ／ｚ）を記録した。高分解能質量分析はＫｏｒｅａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｄａｅｇｕ）で実施した。
【００４９】
全ての最終生成物の純度はＨＰＬＣで決定した（特に明記しない限り、少なくとも９５％の純度）。純度の決定は、島津 Ｓｈｉm−ｐａｃｋ Ｃ１８ 分析カラム（２５０ｍｍ ４．６ｍｍ，５ｍ，１００Å リニアグラジエント溶媒システム）を用いて、島津 ＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ ＨＰＬＣシステムにより行った。溶媒システムは、流速＝１ｍＬ／ｍｉｎでＨ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮ＝６５：３５から５：９５へ３０ｍｉｎとした。ピークはダイオードアレイ検出器を用いたＵＶ吸収により検出した。
【実施例１】
【００５０】
５−置換インドキシＮ，Ｏ−ジアセテート（５ａ〜ｄ）の調製
５−置換アントラニル酸（１．０ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのメタノールに溶解した溶液に０．５ｍｌの酢酸を加え、次いでグリオキシル酸エチル（１ｍｌ，９．７ｍｍｏｌ）及びＮａＣＮＢＨ3（６０９．５ｍｇ，９．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で３時間撹拌した。その後、エバポレーションによってメタノールを除去した。残渣を飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液に溶解し、酢酸エチルで抽出した。抽出物を合せ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレーションを行った。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ3Ｃｌ：メタノール＝３０：１）で精製し、更に、この生成物（１．４ｇ，５．８ｍｍｏｌ）を２５ｍｌの１規定のＮａＯＨ（ａｑ）と１０ｍｌのメタノールの中で加水分解した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、得られた溶液を１規定のＨＣｌで酸性化した。形成された沈殿物をろ過によって集め、水で洗浄した。得られた二酸化合物（４ａ〜ｄ）（１．２ｇ，４．９７ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１５ｍｌ）とＮａ2ＣＯ3（１．３ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）の中へ加えた。反応混合物を４時間還流した。生成物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄した。抽出物を合せ、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレーションを行った。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製した。
【００５１】
１−アセチル−１Ｈ−インドール−３，５−ジイルジアセテート（５ａ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm, J in Hz) 8.46 (1H, d, J = 9.3 Hz), 7.76 (1H, s), 7.30 (1H, d, J = 2.4 Hz), 7.11 (1H, dd, J = 9.3, 2.4 Hz), 2.67 (3H, s), 2.36 (3H, s), 2.31 (3H, s). ESI [M-H] - : 273.83.
１−アセチル−５−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（５ｂ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, ppm, J in Hz) 8.40 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.75 (1H, s), 7.53 (1H, d, J = 2 Hz), 7.34 (1H, dd, J = 8.8, 2 Hz), 2.61 (3H, s), 2.39 (3H, s). ESI [M-H] - : 249.83.
１−アセチル−５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（５ｃ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, ppm, J in Hz) 8.42 (1H, m), 7.75 (1H, s), 7.19 (1H, dd, J = 8.2, 2.4 Hz), 7.10 (1H, td, J = 8.8, 2.4 Hz), 2.59 (3H, s), 2.37 (3H, s). ESI [M-H] - : 233.88.
１−アセチル−５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イルアセテート（５ｄ）のデータ
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, ppm, J in Hz) 8.31 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.65 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.19 (1H, d, J = 7.6 Hz), 2.57 (3H, s), 2.44 (3H, s), 2.36 (3H, s). ESI [M-H] - : 229.80.
【実施例２】
【００５２】
５’，５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体（１１〜１４）の調製
イサチン類縁体（７７ｍｇ，０．４２５ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍｌ）に溶解した溶液に５−置換インドキシＮ，Ｏ−ジアセテート（１００ｍｇ，０．４２５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５分間撹拌した。無水Ｎａ2ＣＯ3（１１２．５ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌を継続した。黒色の沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、減圧下で乾燥して、５，５−置換インディルビンの誘導体（７〜１０）を得た。適当なインディルビン誘導体（１０ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）をピリジン（０．３ｍｌ）に溶解し、塩酸ヒドロキシルアミン（６．６ｍｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を還流下で１２０℃、２時間加熱した。冷却後、生成物を１規定ＨＣｌで酸性化した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、対応する３’−オキシムを定量的に、（２’Ｚ，３’Ｅ）の形態で選択的に得た。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製した。
【００５３】
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.71 (1H, s, N-H), 10.78 (1H, s, N'-H), 9.27 (1H, s, O-H), 8.59 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 7.74 (1H, d, J = 2 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.11 (1H, dd, J = 8, 2 Hz, H-6'), 6.87 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.85 (1H, d, J = 8 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H10ClN3O3): calcd 327.0411 found 327.0408. Purity 92%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 300 MHz, ppm, J in Hz) 13.87 (1H, s, NOH), 11.78 (1H, s, N-H), 11.35 (1H, s, N'-H), 9.41 (1H, d, J = 2.8 Hz, H-4), 9.32 (1H, s, O-H), 8.05 (1H, dd, J = 11.6, 2.8 Hz, H-6), 7.76 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-4'), 7.29 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-7), 7.04 (1H, d, J = 11.2 Hz, H-7'), 6.86 (1H, dd, J = 11.2, 3.2 Hz, H-6'). HRMS (EI) [M]+ (C16H10N4O5): calcd 338.0651 found 338.0648.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｃ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.69 (1H, s, N-H), 10.66 (1H, s, N'-H), 9.25 (1H, s, O-H), 8.42 (1H, dd, J = 11.4, 2.8 Hz, H-6), 7.73 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.81-6.99 ( 3H, m, H-7', H-4, H-7). HRMS (EI) [M]+ (C16H10FN3O3): calcd 311.0706 found 311.0707. Purity 93%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−ヒドロキシ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１１ｄ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.70 (1H, s, N-H), 10.78 (1H, s, N'-H), 9.22 (1H, s, O-H), 8.50 (1H, s, H-4), 7.70 (1H, d, J = 2 Hz, H-4'), 7.21 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-7'), 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.80 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6'). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H9F3N3O4): calcd 376.0545 found 376.0546.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ａ）のデータ
1H NMR (acetone, 300 MHz, ppm, J in Hz) 13.05 (1H, s, NOH), 11.82 (1H, s, N-H), 9.81 (1H, s, N'-H), 8.67 (1H, s, H-4), 8.35 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-4'), 7.45 (2H, m, H-6, H-7), 7.16 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.97 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H9Cl2N3O2): calcd 345.0072 found 345.0075.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.98 (1H, s, N-H), 11.39 (1H, s, N'-H), 9.45 (1H, s, H-4), 8.25 (1H, s, H-4'), 8.08 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 7.50 (2H, m, H-6', H-7), 7.05 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C16H8ClN4O4): calcd 355.0234 found 355.0242.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｃ）のデータ
1H NMR (acetone, 300 MHz, ppm, J in Hz) 12.96 (1H, s, NOH), 11.78 (1H, s, N-H), 9.71 (1H, s, N'-H), 8.41 (1H, d, J = 11.4 Hz, H-7), 8.32 (1H, s, H-4), 7.40-7.50 (2H, m, H-4', H-6'), 6.88-6.91 (2H, m, H-6, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C16H8ClFN3O2): calcd 328.0289 found 328.0291.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−クロロ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１２ｄ）のデータ
1H NMR (acetone, 300 MHz, ppm, J in Hz) 13.02 (1H, s, NOH), 11.82 (1H, s, N-H), 9.88 (1H, s, N'-H), 8.63 (1H, s, H-4) , 8.34 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-4'), 7.47 (2H, m, H-6, H-7), 7.11 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 7.03 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H8ClF3N3O3): calcd 394.0206 found 394.0215.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.81 (1H, s, N-H), 10.85 (1H, s, N'-H), 8.62 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 7.97 (1H, dd, J = 8.2, 2.4 Hz, H-6), 7.47 (1H, m, H-4'), 7.31 (1H, m, H-7), 7.15 (1H, dd, J = 8.4, 2 Hz, H-6'), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (ESI) [M-H] - (C16H8ClFN3O2): calcd 328.0289 found 328.0295.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.89 (1H, s, N-H), 11.40 (1H, s, N'-H), 9.43 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 8.08 (1H, dd, J = 8.6, 2 Hz, H-6), 8.00 (1H, dd, J = 8.6, 2 Hz, H-7), 7.51 (1H, m, H-4'), 7.33 (1H, td, J = 9, 2.8 Hz, H-6'), 7.06 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H9FN4O4): calcd 340.0608 found 340.0610.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｃ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.76 (1H, s, N-H), 10.68 (1H, s, N'-H), 8.41 (1H, dd, J = 11.2, 2.4 Hz, H-4), 7.93 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-4'), 7.39 (1H, m, H-7), 7.30 (1H, td, J = 8.8, 2 Hz, H-6), 6.93 (1H, td, J = 9, 2.4 Hz, H-6'), 6.84 (1H, m, H-7'). HRMS (EI) [M]+ (C16H9F2N3O2): calcd 313.0663 found 313.0666. Purity 93%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−フルオロ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１３ｄ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 12.02 (1H, s, N-H), 10.72 (1H, s, N'-H), 8.59 (1H, s, H-4), 8.02 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, H-6), 7.41 (1H, m, H-4'), 7.18 (1H, td, J = 9.2, 2 Hz, H-6), 7.00 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.9 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'). HRMS (FAB) (C17H9O3N3F4): calcd 379.0579 found 379.0580.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−クロロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.85 (1H, s, N-H), 10.76 (1H, s, N'-H), 8.64 (1H, s, H-4), 8.10 (1H,s, H-4'), 7.29 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.20 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.10 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'), 6.86 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'), 2.31 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]+ (C17H12ClN3O2): calcd 325.0618 found 325.0623.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.87 (1H, s, N-H), 11.38 (1H, s, N'-H), 9.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 8.11 (1H,s, H-4'), 8.07 (1H, dd, J = 8, 2.4 Hz, H-6), 7.37 (1H, d, J = 8 Hz, H-7), 7.26 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6'), 7.05 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-7'), 2.32 (3H, s, CH3). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H11N4O4): calcd 335.0780 found 335.0787. Purity 93%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｃ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.78 (1H, s, N-H), 10.61 (1H, s, N'-H), 8.43 (1H, dd, J = 11.2, 2.4 Hz, H-4), 8.06 (1H,s, H-4'), 7.26 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.17 (1H, d, J = 8 Hz, H-7'), 6.86 (1H, td, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 6.80 (1H, d, J = 8 Hz, H-6'), 2.28 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]+ (C17H12FN3O2): calcd 309.0914 found 309.0912.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メチル−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１４ｄ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.80 (1H, s, N-H), 10.87 (1H, s, N'-H), 8.59 (1H, d, J = 2 Hz, H-4), 8.09 (1H,s, H-4'), 7.34 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.25 (1H, d, J = 8 Hz, H-7), 7.10 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-6'), 6.94 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7'), 2.33 (3H, s, CH3). HRMS (EI) [M]+ (C18H12F3N3O3): calcd 375.0831 found 375.0833.
【実施例３】
【００５４】
５’−メトキシ−５−置換インディルビン−３’−オキシム誘導体（１６ａ〜ｃ）の調製
５’−ヒドロキシ−インディルビン類縁体（７ｄ）（１０ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ）をアセトン（１ｍｌ）に溶解した溶液にヨウ化メチル（１７Ｌ，０．２７６ｍｍｏｌ）を滴下し、Ｋ２ＣＯ３（１９ｍｇ，０．１３８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌を続けた。黒色の沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、減圧下で乾燥して、５’−メトキシ−５−置換インディルビン（１５ｃ）を得た。適当なインディルビン誘導体（６ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ）をピリジン（０．３ｍｌ）に溶解し、塩酸ヒドロキシルアミン（３．４ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を還流下で１２０℃、１時間加熱した。冷却後、生成物を１規定ＨＣｌで酸性化した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、対応する３’−オキシムを定量的に、（２’Ｚ，３’Ｅ）の形態で選択的に得た。生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製した。
【００５５】
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メトキシ−５−ニトロ−インディルビン−３’−オキシム（１６ａ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.82(1H, s, N-H), 9.46 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 9.33 (1H, s, N'-H), 8.12 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6), 7.77 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.30 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 7.24 (1H, d, J = 9.2 Hz, H-7'), 6.85 (1H, dd, J = 7.8, 2.4 Hz, H-6'), 3.39 (3H, s, OCH3). HRMS (ESI) [M-H] - (C17H11N4O5): calcd 351.0729 found 351.0724. Purity 94%.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メトキシ−５−フルオロ−インディルビン−３’−オキシム（１６ｂ）のデータ
1H NMR (DMSO, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.68 (1H, s, N-H), 9.22 (1H, s, N'-H), 8.44 (1H, m, H-4), 7.70 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.21 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6), 6.96 (2H, m, H-7, H-7'), 6.79 (1H, dd, J = 8.6, 2.4 Hz, H-6'), 3.26 (3H, s, OCH3). HRMS (EI) [M]+ (C17H12FN3O3): calcd 325.0863 found 325.0859.
（２’Ｚ，３’Ｅ）−５’−メトキシ−５−トリフルオロメトキシ−インディルビン−３’−オキシム（１６ｃ）のデータ
1H NMR (acetone, 400 MHz, ppm, J in Hz) 11.70 (1H, s, N-H), 8.62 (1H, s, H-4), 8.28 (1H, s, N'-H), 7.90 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4'), 7.24 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 7.12 (1H, m, H-7'), 7.04 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-7), 6.99 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-6'), 3.33 (3H, s, OCH3). HRMS (EI) [M]+ (C18H12F3N3O4): calcd 391.0780 found 391.0782.
【実施例４】
【００５６】
分子ドッキング
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）のＣＨＡＲＭｍ−ベース分子動力学ドッキングアルゴリズムのＣＤｏｃｋｅｒを用いて、分子ドッキングを行った。５−ブロモ−インディルビンと共結晶化したＣＤＫ２の構造は、ＰＤＢデータバンク（ＰＤＢコード：２ＢＨＥ）から得た。続いて、プロテインクリーンプロセス及びＣＨＡＲＭｍ−力場を適用した。半径８Åの５−ブロモ−インディルビンの周囲の領域を活性部位として選択した。複合体の構造からリガンドを除去した後、活性部位の周囲に３軸方向において結合球面を構成した。全てのデフォルトパラメータは、ドッキングプロセスに使用した。ＣＨＡＲＭｍ−ベース分子動力学（１，０００ステップ）を使用してランダムなリガンド１１ｂのコンフォメーションを作成し、剛体回転（リジッドボディローテーション）続いて７００Ｋでのシミュレーティドアニーリングを行って、結合部位におけるリガンド１１ｂの位置を最適化した。最終的なエネルギー最小化は、フルポテンシャルモードとして設定した。１１ｂの最終的な結合コンフォメーションは、エネルギーに基づいて決定した。リガンド２、１３ｂのドッキング研究を上記の通り実施した。
【実施例５】
【００５７】
生物学的方法
酵素アッセイ
ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＥは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から購入した。キナーゼ活性は、０．１ｍｇ／ｍＬのヒストンＨ１を含むバッファー（８ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）中で、ＣＤＫ１については４５Ｍ[−33Ｐ]ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）の存在下で、又は、ＣＤＫ２については１２０μＭ[γ−33Ｐ]ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）の存在下で、最終反応量２５μＭで試験した。ＭｇＡＴＰ混合物を添加することによって反応を開始した。３０℃で４０分間インキュベーションした後、３％リン酸溶液を５μＬ添加することによって反応を停止した。上清の１０μＬ分量をＷｈａｔｍａｎ Ｐ３０ ホスホセルロース紙の２．５ｃｍ×３ｃｍ小片上にスポットし、２０秒後にそのフィルタを７５ｍＭリン酸中で５分間３回洗浄し、乾燥前にメタノール中で１回洗浄した。１ｍＬのＡＣＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）シンチレーション液の存在下で、湿ったフィルタを計数した。活性は、通常、最大活性、すなわち阻害剤の非存在下のパーセンテージとして表される。コントロールには適当に希釈したＤＭＳＯを用いた。
【００５８】
種々の組換えキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ，Ｍｅｔ Ｍ１２５０Ｔ，Ｒｏｎ，ＶＥＧＦ２，ＥＧＦＲ，ＴｒｋＡ，ＰＩ３Ｋγ，ＩＫＫβインスリン受容体，Ａｕｒｏｒａ Ａ）に対するキナーゼ活性の阻害を、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを用いて測定した。簡潔に言えば、アッセイはＡＴＰの存在下でペプチド基質のリン酸化に基づいている。結果として生じたリン酸化された基質は、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー転移）シグナルによって検出する。キナーゼドメインを含む組換えタンパク質は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から購入した。酵素、ＡＴＰ及び基質の最適濃度は、ＨＴＲＦ ＫｉｎＥＡＳＥキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて、製造業者の指示に従って、それぞれの酵素について設定した。アッセイは、キナーゼ反応バッファー（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ オルトナバジウム酸塩，０．０５％ ＢＳＡ，０．１％ ＮａＮ3）中で、連続的に希釈した化合物及びペプチド基質に酵素を混合して構成する。検出用試薬の添加の後、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチ−ラベルリーダー（Ｐｅｒｋａｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを測定した。
【００５９】
細胞増殖アッセイ
細胞（Ａ５４９，ＨＴ１０８０，ＨＣＴ１１６，Ｋ５６２，ＳＮＵ６３８，ＫＢ，ＭＣＦ−７）を計数し、新鮮な培地（１０％ＦＢＳを含むＭＥＭＥ，ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ）で５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈し、１９０μＬの細胞懸濁液を種々の濃度の試験化合物（１０％ＤＭＳＯ水溶液中に１０μＬ）を含む９６穴プレートに加えた。試験プレートをＣＯ2インキュベーターで３７℃３日間インキュベートした。０日目のコントロールとして、細胞をＣＯ2インキュベーターで３７℃３０分間インキュベートした。全ての処理は、３連で行った。インキュベーション期間経過後、細胞を、冷却した５０％ＴＣＡ５０μＬで４℃で３０分間固定し、水道水で５回洗浄し、風乾した。固定した細胞を、０．４％ＳＲＢ溶液含有１％酢酸水溶液で室温で１時間染色した。次いで、１％酢酸で５回洗浄することによって遊離のＳＲＢ溶液除去し、風乾した。結合した色素を２００Ｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ（ｐＨ１０．０）で溶解し、吸光度をＥＬＩＳＡ用マイクロプレートリーダーを用いて５１５ｎｍで測定した。最終的に、各々の処理手順で得られた吸光度の値を平均して、０日目のコントロールで得られた平均値を引き算した。これらの結果は、溶媒で処理したコントロールのインキュベーションに対してのパーセンテージとして表し、ＩＣ50値は非線形回帰分析（生存パーセント対濃度）を用いて計算した。
【００６０】
腫瘍異種移植動物モデル
ｋ−ｒａｓ−形質転換ラットの腎臓上皮細胞セルライン（ＲＫ３Ｅ−ｒａｓ）は、１０％ＦＣＳ、１００ユニット／ｍＬペニシリン及び１００Ａｇ／ｍＬストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ中で保持した。ＲＫ３Ｅ−ｒａｓ細胞は、Ｅｒｉc Ｆｅａｒｏｎ博士（ミシガン大学医学部、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から快く提供を受け、以前の報告に記載されている。インビボでの腫瘍成長の抑制を調べるために、雄のＳＤラット（生後６週）を用いた。０日目のラットの側腹部にＲＫ３Ｅ−ｒａｓ−Ｌｕｃ細胞（５×１０6）を皮下移植し、以前に記載したように５日目にラットをランダムにグループ化した（５匹／グループ）。１１ｂを含有するＰＥＧ４００、ＥｔＯＨ及びＤＷの混合物の溶液（３０：３３：３７，３ｍｇ／ｍＬ，５ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに、合計５回、無麻酔状態で静脈内に投与した。最終投与の４８時間後に動物を屠殺し、ラットの体重及び腫瘍の容積を測定した。腫瘍成長の容積は、次の通り計算した：Ｖ＝（ａｂ2）／２、ここで、ａは腫瘍の最も長い直径、ｂは腫瘍の最も短い直径である。全て実験は、Ｃｈｏｓｕｎ大学歯学部（Ｇｗａｎｇｊｕ，韓国）の動物実験委員会により承認されたプロトコルの下で実施した。
【００６１】
生物発光イメージングアッセイ
生物発光イメージングのために、ラットにランパン／ケタミン（１：１）麻酔でルシフェリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をｉ．ｐ．投与した。ＬＡＳ−１０００ ｐｌｕｓイメージングシステム（富士フィルム，東京，日本）を用いて、ラットをイメージングし、腫瘍から放出されたバイオルミネセンスシグナルを記録した。放出された光を取り込むためにＣＣＤカメラを備えているＬＡＳ−１０００システムを用い、データ解析のためにＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウエア（Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ｖ３．０）を用いた。
【００６２】
組織学、免疫組織化学及びＴＵＮＥＬアッセイ
切除した固形腫瘍を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包理した。光学顕微鏡検査のために、４−μｍの切片とした組織をＨ＆Ｅで染色した。免疫組織化学的染色は、抗−ＰＣＮＡ抗体を用いてアビジン−ビオチン複合体法で行った。免疫反応は、３，３’−ジアミノベンジジンで可視化し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｌｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）を用いて、製造業者の指示に従って、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。簡潔に言えば、スライドを脱パラフィンし、２０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫで３７℃で１５分間処理し、染色を増強した。内因性のペルオキシダーゼをブロックするために３％過酸化水素中に漬けた後、スライドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む反応バッファーで３７℃で１時間インキュベートした。次いで、スライドをペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体とともに３０分間インキュベートし、反応生成物を２ｍＭの過酸化水素を含む０．０３％の３，３’−ジアミノベンジジン溶液で可視化した。スライドは、０．５％のメチルグリーンで対比染色した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される抗癌活性を有するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
式（Ｉ）
【化５】
（ここで、
Ｒ1はＦ、Ｃｌ、ＯＨ又はＣＨ3から選択され、
Ｒ2はＦ、Ｃｌ又はＮＯ2から選択される。）
【請求項２】
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＮＯ2である、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項３】
Ｒ1がＦであり、Ｒ2がＮＯ2である、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項４】
i）Ｒ１がＯＨであり、Ｒ2がＣｌである化合物、
ii）Ｒ１がＯＨであり、Ｒ2がＦである化合物、
iii）Ｒ１がＣｌであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物、及び
iv）Ｒ１がＣＨ3であり、Ｒ2がＮＯ2である化合物
である、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項５】
ヒト肺癌セルライン、ヒト繊維肉腫セルライン、ヒト大腸癌セルライン、ヒト白血病セルライン、ヒト胃癌セルライン、ヒト鼻咽頭癌セルライン及び／又はヒト乳癌セルラインに対する優れた抗癌活性を有する、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項６】
前記インディルビン−３’−オキシム誘導体化合物及び医薬として許容可能な担体を有する抗癌組成物。
【請求項１】
式（Ｉ）で表される抗癌活性を有するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
式（Ｉ）
【化５】
（ここで、
Ｒ1はＦ、Ｃｌ、ＯＨ又はＣＨ3から選択され、
Ｒ2はＦ、Ｃｌ又はＮＯ2から選択される。）
【請求項２】
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＮＯ2である、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項３】
Ｒ1がＦであり、Ｒ2がＮＯ2である、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項４】
i）Ｒ１がＯＨであり、Ｒ2がＣｌである化合物、
ii）Ｒ１がＯＨであり、Ｒ2がＦである化合物、
iii）Ｒ１がＣｌであり、Ｒ2がＮＯ2である化合物、及び
iv）Ｒ１がＣＨ3であり、Ｒ2がＮＯ2である化合物
である、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項５】
ヒト肺癌セルライン、ヒト繊維肉腫セルライン、ヒト大腸癌セルライン、ヒト白血病セルライン、ヒト胃癌セルライン、ヒト鼻咽頭癌セルライン及び／又はヒト乳癌セルラインに対する優れた抗癌活性を有する、請求項１に記載のインディルビン−３’−オキシム誘導体化合物。
【請求項６】
前記インディルビン−３’−オキシム誘導体化合物及び医薬として許容可能な担体を有する抗癌組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５１８８７４（Ｐ２０１３−５１８８７４Ａ）
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５１９０９（Ｐ２０１２−５５１９０９）
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／０００６１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９６６７６
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５１２２０５６７０）エニジェン カンパニー．，リミテッド． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／０００６１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９６６７６
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（５１２２０５６７０）エニジェン カンパニー．，リミテッド． (1)
【Ｆターム（参考）】
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