強化目的のフラックスに基づいたフラックス・スキャニングを用いた生物の改良方法
本発明は、代謝フラックスの分析を利用した有用物質の生成生物の改良方法に係り、さらに具体的には、有用物質の生産のための対象生物の代謝回路モデルにおいて、有用物質の理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求め、その最適値と最大値との間の範囲で、代謝フラックスの値の絶対値が増加する代謝フラックス、及びその代謝フラックスに関連する遺伝子を選別し、それを導入及び／または増幅することにより、有用物質の生成生物を改良する方法に関する。本発明によれば、ゲノムレベルの代謝回路モデルが構築された有用物質の生産のための対象生物において、生産関連の代謝フラックスの最適値と最大値との間の区間で、増幅対象代謝フラックス及びその代謝フラックスに関与する遺伝子を選別し、それを導入及び／または増幅することにより有用物質の生産性を効果的に向上させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝フラックスの分析を利用した有用物質の生成生物の改良方法に係り、さらに具体的には、有用物質の生産のための対象生物の代謝回路モデルにおいて、有用物質の理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値を求め、その最適値と最大値との間の範囲で、代謝フラックスの値の絶対値が大きくなる代謝フラックス、及びその代謝フラックスに関連する遺伝子を選別し、これを導入及び／または増幅することにより、有用物質の生成生物を改良する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、代謝工学的なアプローチを利用した生産菌株の改良及び目的代謝産物の増大のための多様な試みが行われてきた。しかし、分子生物学的な手法を利用した既存の代謝工学的な菌株の改良方法は、試行錯誤の戦略に基づいて多くの資本及び努力を必要とした。最近、蓄積されたゲノム情報及び多様なハイスループットスクリーニング手法の開発により、代謝工学的に改良された菌株で有用産物を極大化する方法が開発されている。特に、複数の有用微生物の全体のゲノム配列が明らかになることにより、代謝ネットワークモデルの構築が可能になり、さらに実質的な研究が可能になった。
【０００３】
したがって、既に構築された代謝ネットワークモデルを利用して、「微生物は、その成長を根本的な目的として代謝過程を経る」という前提下に代謝フラックスの分析が可能になった（Varma et al., J. Theor. Biol., 165:503, 1993）。その結果、（１）代謝経路の過程における分岐点の同定、（２）代替経路の同定、（３）測定していない外部代謝産物の計算、及び（４）最大理論収率の計算などを効果的に提供することができる（Stephanopoulos et al., Metabolic Engineering, Academic Press, NY, 309, 1998）。
【０００４】
最近提供されている多くの情報の理解に基づき、より効果的な生産菌株の開発のための新たな手法の開発が活発に行われている。ハイスループットスクリーニングの手法による有用微生物のゲノム情報の獲得によって、代謝ネットワークモデルが構築された（Edwards et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 13:244, 2000;Foster et al., Genome Res., 13:244, 2003）。また、代謝ネットワークモデルに基づいて集積された代謝機能を探求する代謝ネットワークの代謝フラックスの分析方法が開発された（Varma et al., J. Theor. Biol., 165:503, 2003;US 2002/0168654 A1）。これらの分析方法を根拠として、代謝ネットワークモデルに基づき生産菌株の有用産物の増大のための欠失対象遺伝子を選別できる手法が開発された。まず、生産目的の流れと成長目的の流れとの２つの軸についての最適化を通じて欠失対象遺伝子を選別し、相異なる目的関数を最適化するＯｐｔｋｎｏｃｋ方法（Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84:647, 2002, US 2004/0009466 A1）と、基本菌株から候補遺伝子欠失菌株の一次遺伝子の欠失による最適点の移動の最小化を通じて、部分的な最適点が得られる方法（Minimization of metabolic adjustment：MOMA）が開発された（Segre et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:15112, 2002）。これらの方法に基づいて、一次、二次及び三次の欠失対象遺伝子が選別できる順列的な遺伝子欠失の選別方法が開発され、実際のリコピンの生産に適用された（Alper et al., Metab. Eng., 7:155, 2004）。また、有用物質を生産する生物の代謝産物の活用度をフラックス合（Flux Sum）と定義し、これを摂動させることによる、有用物質の生産収率を増大させる重要な代謝産物のスクリーニング方法、及び前記スクリーニングされた重要な代謝産物に関連した遺伝子を欠失及び／または増幅させることによる有用物質を生産する生物の改良方法が開発されて出願された（韓国特許出願第１０−２００５−６２４０４号）。
【０００５】
一般に、代謝フラックスの分析において、生産目的のフラックスと細胞成長目的のフラックスとは反比例の関係になる（図１）。これは、一般的な微生物の場合、有用産物の生産が細胞成長を阻害するということを意味する。したがって、適切な代謝工学的な手法を通じて有用産物の生産を向上させる方法が必要である。代謝工学的な目的を達成するための代表的な分子生物学的なアプローチとして、対象遺伝子の過発現を誘導する遺伝子増幅法がある。このように、有用産物の生産性を向上させる生物の改良方法のために、体系的な遺伝子増幅の導入、及び生物に適用する手法の開発が、最近同技術分野における技術的課題となっている。
【０００６】
これにより、本発明者らは、有用物質の生産のための対象生物の代謝回路モデルにおいて、有用物質の理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求め、その最適値と最大値との間の範囲で、代謝フラックスの値の絶対値が増大する代謝フラックス、及びその代謝フラックスに関連する遺伝子を選別して、これを導入及び／または増幅することにより、有用物質の生成生物を改良できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、有用物質の生産性の向上のための増幅対象遺伝子をスクリーニングする方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記スクリーニングされた遺伝子を導入及び／または増幅させることによって有用物質を生産する対象生物の改良方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を解決するために、本発明は、（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦ（Flux Scanning based on Enforced Objective Flux）アルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値よりも大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；及び（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップを含む、有用物質の生産性の向上のための増幅対象遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【００１０】
本発明は、また、（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値より大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップ；及び（ｆ）前記ステップ（ｅ）で確定された増幅対象遺伝子を前記対象生物に導入及び／または対象生物で増幅させることによって前記対象生物の変異体を製作するステップを含む、有用物質を生産する生物の改良方法を提供する。
【００１１】
前記改良方法において、（ｇ）前記ステップ（ｆ）で製作された変異体を培養して、有用物質の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことが好ましい。
【００１２】
本発明において、前記対象生物は、微生物であることが好ましく、有用物質は、リコピン、シキミ酸及びインジゴなどを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された何れか一つであり、前記対象生物は、リコピン、シキミ酸及びインジゴなどを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された有用物質の生成能を有する微生物であることが好ましい。
【００１３】
本発明において、前記リコピンの生産のための増幅対象遺伝子は、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択され、前記シキミ酸の生産のための増幅対象遺伝子は、ｇｌｋ、ｐｇｉ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ及びａｒｏＧよりなる群から選択され、前記インジゴの生産のための増幅対象遺伝子は、ｐｇｉ、ｇｌｋ、ｆｂａＡ、ｐｐｓＡ、ｔｋｔＡ、ｒｐｉＡ及びａｃｅＢよりなる群から選択されることが好ましい。
【００１４】
本発明において、前記ステップ（ｂ）の発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることが好ましい。
【００１５】
【００１６】
また、前記ステップ（ｂ）の有用物質の生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とすることができる。
【００１７】
【００１８】
また、前記ステップ（ｃ）のＦＳＥＯＦアルゴリズムは、以下に表されることを特徴とすることができる。
【００１９】
であるとき、
値を選択する。
【００２０】
ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である。
【００２１】
本発明において、前記ステップ（ａ）の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の生産のための代謝回路を追加して代謝回路モデルを構築することができる。
【００２２】
また、本発明は、前記方法によって改良された生物を培養することを特徴とする有用物質の製造方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されており、リコピンの高生成能を有する変異菌株及びｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されている変異大腸菌を提供する。
【００２４】
また、本発明は、前記変異菌株及び変異大腸菌を好気条件下で培養することを特徴とするリコピンの製造方法を提供する。
【００２５】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】生産目的の代謝フラックスと細胞成長目的の代謝フラックスとの関係を示すグラフである。
【図２】本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムを概略的に示す図である。
【図３】リコピンの生産を向上させるために、本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【図４】シキミ酸の生産を向上させるために、本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【図５】インジゴの生産を向上させるために、本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【００２７】
本発明では、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、代謝フラックスの値の絶対値が大きくなる代謝フラックスを選別するＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて、増幅対象になる遺伝子を選別する。
【００２８】
選別された増幅対象の遺伝子は、発現ベクターを利用して有用物質の生産対象生物に導入させるか、及び／または対象生物で増幅させて、対象生物内で関連代謝フラックスを増加させ、これを通じて目的有用物質の生産性を極大化することができる。
【００２９】
増幅対象遺伝子を選別するアルゴリズムを実行するために、まず、代謝回路モデルを構築しなければならない。本発明では、代謝回路モデルを目的有用物質の生産にさらに適するようにするために、対象生物の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の代謝フラックスを追加して代謝回路モデルを構築した。
【００３０】
図２は、本発明で使用されるＦＳＥＯＦアルゴリズムを概略的に示す図であって、目的有用物質の生産関連の代謝フラックスの値を人為的に調節しつつ、全体の代謝フラックスを分析し、分析された代謝フラックスから増幅対象の代謝フラックス及び関連する遺伝子を選別する。その具体的な内容を説明すれば、以下の通りである。
【００３１】
まず、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用する前に、代謝フラックスの計算が優先されねばならない。予備実験から構築された代謝回路モデルの代謝フラックスの分析を行うことによって、代謝回路上の成長代謝フラックスの値が最大であるとき、全体の代謝フラックスの最適値を求める。これらの最適代謝フラックスの値を、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの開始点として記録する。また、ここで、生産関連の代謝フラックスの最適値を同時に記録して、その値を生産関連の代謝フラックスの値を強化させる出発点とする。代謝回路で代謝フラックスの最適値を計算するための代謝フラックスの分析の数学的な表現は、次のようになる。
【００３２】
【００３３】
ここで、Ｓは、代謝回路を構成する反応係数行列であり、反応物の反応係数は、負の数で表示され、生産物の反応係数は、正の数で表示されて、全ての反応係数は、原子単位で反応均衡をなす。線形方程式の計算において、既に取得した情報、すなわち、実際の基質の摂取速度及び熱力学的な制約条件のような条件を付加することにより、より正確な計算結果が得られる。
【００３４】
また、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの付加的な必要条件として、生産関連の代謝フラックスの理論的な最大収率値が必要である。多様な制約条件と共に、構築された代謝回路モデルの代謝フラックスの分析を通じて、代謝回路上の生産関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、生産関連の代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値を求める。この値を基に、強化目的の生産関連の代謝フラックスの値の最終値として決定する。前記の数式と類似の方式で、生産関連の代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値を、以下の数式により得ることができる。
【００３５】
【００３６】
前記数式による計算結果、生産関連の代謝フラックスの最適値及び最大値が得られ、これらの値を基準に、以下に表現されるＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用させることができる。ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて一次増幅対象の代謝フラックスを選別する。
【００３７】
であるとき、
値を選択する。
【００３８】
ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である。
【００３９】
生産関連の代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲を複数の区分に分けた後、同じ区分間隔で代謝フラックスの値を増大させつつ、その値に制約されるように線形方程式を構成する。このように構成されたモデルの細胞成長速度が最大であるとき、代謝フラックスの値を反復的に計算する。代謝フラックスを計算するために、次のようなソフトウェアが使用され得る。ＦｌｕｘＡｎａｌｙｚｅｒ（Klamt et al., Bioinformatics, 19:216, 2003）、Ｍｅｔａｂｏｌｏｇｉｃａ（Zhu et al., Metab. Eng., 5:74, 2003）のように、Ｍａｔｌａｂに基づくソフトウェア、Ｆｌｕｘｏｒ（http://arep.med.harvard.edu/moma/biospicefluxor.html）、Ｓｉｍｐｈｅｎｙ（Genomatica Inc., San Diago, CA）、ＩＮＳＩＬＩＣＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（INSILCO biotechnology Inc., Stuttgart, Germany）、ＦＢＡ（http://systemsbiology.ucsd.edu/downloads/fba.htm）、メタフラックスネット（Lee et al., Bioinformatics, 19:2144, 2003）のように、独立的に計算できるプログラム、Ｇａｍｓ（GAMS Development Corporation, NW Washington, DC）、Ｃ言語やフォートランのようなコンピュータ言語パッケージツールなどを利用して、ＦＳＥＯＦのアルゴリズムを適用して計算することができる。
【００４０】
前記反復的な計算の結果、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値より大きい場合、すなわち、必ず増加する区分が存在する代謝フラックスを一次的に増幅対象の代謝フラックスとして選別する。
【００４１】
次いで、前記一次的に選別された代謝フラックスの分析を通じて、最終的な増幅対象代謝フラックス及びその代謝フラックスに関与する増幅対象遺伝子を選別する。最終的な選別は、前記一次的に選別された代謝フラックスのうち、減少または増加する傾向を表すが、代謝フラックスの絶対値のうち、最大値が単にいくつかの区分でのみ最適値の絶対値より大きい場合は除外した。
【００４２】
前記のような方法で選別された代謝フラックスのパターンは、単調増加または単調減少の様態を表した。最適値が正の数である場合、正方向に継続的に増加し、最適値が負の数である場合、逆方向に増加する場合である。または、反応物と生成物との左右が逆になることにより、負の数で単調減少を表す。
【００４３】
しかし、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて一次的に選別された対象は、絶対値の変化に対する増加区分を選別する過程であるので、最適値の正の数または負の数の値とは関係がないと言える。したがって、振動するか、ゼロ値から出発しない場合も、増幅の対象として選別される。したがって、これらの代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しないか、代謝回路において、正方向と逆方向とが逆になる代謝フラックスについては、最終的な増幅対象から除外した。
【００４４】
すなわち、本発明の増幅対象遺伝子の選別過程は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて全体代謝関連の遺伝子のうち、増幅対象遺伝子を一次的に選別し、一次的に選別された遺伝子のうち、代謝フラックスのプロファイルを分析して、遺伝子増幅の対象を確定した。
【００４５】
本発明に係る増幅対象遺伝子の選別方法は、目的有用物質の過量生産に適用することができる。下記の実施例では、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの有用性を検証するために、大腸菌でリコピン、シキミ酸及びインジゴの生産を実際的に実施し、文献調査を行った。その結果、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを利用して選別された遺伝子の増幅が、目的代謝産物の生産性の向上に寄与するということが証明された。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳述する。これらの実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がそれらの実施例に限定されないということは、当業者にとっては明らかである。
【００４７】
特に、下記の実施例では、有用物質としてリコピン、シキミ酸及びインジゴのみを例示したが、その他に生物培養を利用して生産できる有用物質であれば、いかなるものでも適用できるということは、当業者ならば理解できる。
【００４８】
実施例１：リコピンの生産を向上させる増幅遺伝子の選別
リコピンは、二次代謝産物であって、活性酸素を防止する抗酸化剤の役割を行うことはもとより、癌の予防に役立ち、兔疫体系の向上に重要な役割を行う炭素４０個のカロテノイド系化合物である。主としてカロテノイド系化合物は、植物から抽出して得られるが、多様な誘導体を十分に生産することは、相当に困難である。バクテリアに外来の遺伝子を導入してリコピンを生産すれば、効率が高く、遺伝子の操作を通じて多様なリコピンの誘導体を得ることもできる。したがって、リコピンを過量生産は、多様な誘導体の過量生産を導くことができる（Misawa et al., J. Bacteriol., 172：6704, 1990；Barkcovich et al., Metab. Eng., 3：27, 200１；Wang et al., Biotechnol. Bioeng., 62, 235, 1999）。
【００４９】
リコピンは、代謝回路上でグリセロアルデヒド−３−リン酸（以下、‘Ｇ３Ｐ’：glycealdehyde-3-phoshpate）及びピルビン酸（以下、‘ＰＹＲ’：pyruvate）の重合反応から始まる非メバロン酸経路（Non-Mevalonate pathway）を利用して、中間体であるイソペンテニル二リン酸（以下、‘ＩＰＤＰ’：isopentenyl diphosphate）の合成、重合反応、そしてチェーンの変形ステップを経て生産される。
【００５０】
このとき、ＩＰＤＰを生産するために、遺伝子ｄｘｓ（1-deoxyl-d-xylose synthase）を含むイソペンテニルオペロン（ispABCEFGH operon）が関与する（Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 72：408, 200１）。したがって、大腸菌に存在していないｃｒｔオペロンを導入することにより、４０炭素化合物の端部の変形を可能にし、これにより、大腸菌でのリコピンの生産が可能になった（Misawa et al., J. Bacteriol., 172：6704, 1990）。
【００５１】
したがって、既存の大腸菌の代謝ネットワークモデルにリコピンの生産のためのｃｒｔオペロンの関連過程（Alper et al., Metab. Eng., 7：155, 2004）を追加して、既存の代謝ネットワークモデルを修正、再構築した。
【００５２】
リコピンを生産する代謝ネットワークモデルを構築して、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用し、これにより、新たな増幅遺伝子の候補群を発掘した。まず、代謝フラックスの分析を通じて、固定された基質（葡萄糖）の摂取速度を１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒに定義し、好気条件で代謝フラックスをシュミレーションした。
【００５３】
その結果、野生菌株で生産関連の代謝フラックスの値は０であり、リコピンを生産する遺伝子ｄｘｓが発現された基本菌株については、最適値が０．０００２ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒであった。前記値は、実験的に最小培地で得た値の制約条件を代入して計算したものである。また、リコピンの代謝フラックスの最大値は、０．６２ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒであった。前記得られた値を基にしてＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用することにより、一次増幅対象の代謝フラックスに関与する遺伝子が得られた。表１は、一次的に選別された増幅対象の代謝フラックスに関与する遺伝子を列挙したものである。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１から、解糖過程中のＧ３Ｐの合成に関連した遺伝子及びトリカルボン酸経路(tricarboxylic pathway)のあらゆる遺伝子が選別されたということが確認できる。また、Ｇ３ＰとＰＹＲとから始まる非メバロン酸経路のあらゆる遺伝子及び補酵素関連の遺伝子が選別された。
【００５６】
次いで、前記一次的に選別された遺伝子の代謝フラックスの分析を通じて、増幅対象遺伝子を最終的に選別した。代謝フラックスの間に減少または増加する傾向を表すが、代謝フラックスの絶対値のうち最大値が、単にいくつかの区分でのみ最適値の絶対値よりも大きい場合には除外した。この値を基にして生産目的の流れ及び増幅遺伝子の変化を比較・分析することができた。図３は、リコピン生産の向上のために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムにより一次的に選別された増幅対象遺伝子が関与する代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【００５７】
前記のような方法で選別された代謝フラックスのパターンは、単調増加または単調減少の様態を表した。最適値が正の数である場合、正方向に増加し、最適値が負の数である場合、逆方向に増加する。または、反応物と生成物との左右が逆になることにより、負の数で単調減少を表した。
【００５８】
しかし、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて一次的に選別された対象は、絶対値の変化についての増加区分を選別する過程であるので、最適値の正の数または負の数の値とは関係がないと言える。したがって、振動するか、ゼロ値から出発しない場合も、増幅の対象として選別された。したがって、これらの代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しないか、代謝回路において、正方向と逆方向とが逆になる代謝フラックスについては、最終増幅対象から除外した。
【００５９】
その結果、リコピンの生産を向上させるための生産菌株の改良に、解糖過程のｐｇｉ、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ及びｐｆｋＡを増幅対象遺伝子として選別し、リニアーな関係を有する非メバロン酸経路上の遺伝子のうち、ｉｄｉをさらに増幅対象として選別し、ＴＣＡ回路の遺伝子のうち、ｍｄｈ及びｉｃｄＡを増幅対象として選別した。
【００６０】
選別された対象遺伝子が、実際のリコピンの生産にどのような影響を及ぼすかを確認するために、発現ベクターを利用して対象遺伝子を大腸菌に導入した。
【００６１】
選別された遺伝子を発現するために、以下の方法で遺伝子ベクターを製作した。まず、あらゆる遺伝子は、大腸菌野生菌株（Ｗ３１１０）を鋳型とし、対象遺伝子についての下記表２のプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより得られたＰＣＲ切片を制限酵素で切断し、これを遺伝子ベクターに導入した。
【００６２】
まず、下記配列番号１及び配列番号２によってＰＣＲ切片を得た後、ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩとで切断し、それをｐＴｒｃ９９Ａ（Amersham Pharmacia, NJ, USA）に導入して、遺伝子ｄｘｓの増幅のためのベクターｐＴＤを製作した。
【００６３】
遺伝子ｐｇｉの場合、下記配列番号３及び配列番号４によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｐｇｉを製作した。
【００６４】
遺伝子ｐｆｋＡの場合、下記配列番号５及び配列番号６によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｐｆｋＡを製作した。
【００６５】
遺伝子ｆｂａＡの場合、下記配列番号７及び配列番号８によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断し、それををｐＴＤに導入してｐＴＤｆｂａＡを製作した。
【００６６】
遺伝子ｔｐｉＡの場合、下記配列番号９及び配列番号１０によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｔｐｉＡを製作した。
【００６７】
遺伝子ｉｃｄＡの場合、下記配列番号１１及び配列番号１２によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｉｃｄＡを製作した。
【００６８】
遺伝子ｍｄｈの場合、下記配列番号１３及び配列番号１４によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｍｄｈを製作した。
【００６９】
遺伝子ｉｄｉの場合、下記配列番号１５及び配列番号１６によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩとＫｐｎＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｉｄｉを製作した。
【００７０】
リコピンを生産するｃｒｔＥＸＹＩＢオペロンは、エルビニア・ウレドボラ（erwinia uredovora）菌株（ＡＴＣＣ １９３２１）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、表２の配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを使用してＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ切片をＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、それをｐＡＣＹＣ１８４（Chang et al., J. Bacteriol., 134:1141, 1978）に導入して、遺伝子ベクターｐＣａｒ１８４を製作した。
【００７１】
また、前記製作されたｐＣａｒ１８４を鋳型とし、表２の配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを使用してＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ切片をＤｎｐＩ制限酵素で切断し、自己融合を通じて遺伝子ｃｒｔＥＩＢを含んでいるｐＬｙｃ１８４を製作した。
【００７２】
リコピンの生産のために、大腸菌ＤＨ５α菌株（New England Lab., MA）に熱衝撃法で前記ｐＬｙｃ１８４を導入し、組み換え大腸菌を２５０ｍｌのフラスコに２ＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５０ｍｌを使用して４８時間、３０℃、２００ｒｐｍの振盪培養器で培養した。
【００７３】
【表２】
【００７４】
培養液を１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞を得た後、冷アセトンで懸濁し、５５℃の振盪槽でリコピンの抽出を１５分間行った。高性能の液体クロマトグラフィを通じて、前記抽出物からリコピンを分離し、４７０ｎｍ波長のＵＶ検出器でリコピンを同定した。周知の濃度のリコピンを利用した直線内挿法で試料の濃度を計算した。表３には、濃度、及び培養結果によって得たリコピンの含有量を表示した。
【００７５】
表３の発現ベクターのうち、ｐＡＣ−ＬＹＣ０４／ｐＴｄｘｓの製作及び発現ベクターの導入された大腸菌の培養（Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 72:408, 2001）と、ｐＣＷ２／ｐＡＫ３２の製作及び発現ベクターの導入された大腸菌の培養（Wang et al. Biotechnol. Prog., 16:922、1999）とは、それぞれ先行文献の記載に従って行った。
【００７６】
【表３】
【００７７】
実験の結果、対照群（ｐＴＤ／ｐＬｙｃ１８４）と比較したとき、ｆｂａＡの遺伝子が増幅された場合、リコピンの含有量が５０％増加し、ｔｐｉＡ及びｍｄｈ遺伝子が増幅された場合、６０％増加した。ｉｄｉ遺伝子が増幅された場合は、１１０％までに増加した。しかし、選別された他の遺伝子は、リコピンの生産に大きな影響を及ぼしていない。それは、代謝回路モデルに酵素活性度及び調節のメカニズムが含まれていないからであるとみなされる。
【００７８】
結論的に、選別された遺伝子のうち解糖過程の４個の候補遺伝子（ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉ）をリコピン生産の向上に肯定的な影響を及ぼす増幅対象遺伝子と決定した。
【００７９】
実施例２：シキミ酸(shikimate)
シキミ酸は、芳香族アミノ酸の一化合物であり、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン及びトリプトファンを大腸菌または植物で過量生産させる重要な前駆体の役割を行う。また、細菌感染の治療に用いられるノイラミニダーゼ阻害剤ＧＳ４１０４（Tamiflu）の合成に必要な初期物質でもある。
【００８０】
シキミ酸は、ホスホエノールピルビン酸（phosphoenolpyruvate：PEP）とエリトロース四リン酸（erythrose-4-phosphate：E4P）との重合反応によってヘプツロソン酸-7-リン酸（3-heptulosonate-7-phosphate：DAHP）が合成され、これからシキミ酸の合成経路が始まる。したがって、Ｅ４Ｐ及びＰＥＰの利用がシキミ酸の生産に大きく影響を及ぼす。
【００８１】
ＤＡＨＰは、ａｒｏＦＧＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ及びａｒｏＥによって一つの分子のＮＡＤＰＨを消費しつつシキミ酸を生産する。シキミ酸は、さらにａｒｏＫＬ及びａｒｏＡによって普通の芳香族化合物を合成する。蓄積される中間体の分析から、ａｒｏＢＬＡが反応律速因子であり、これにより、ａｒｏＫＬの変異株を用いてシキミ酸を生産できることが先行文献に記載されている（Draths et al., Ｊ. Am. Chem. Soc., 121：1603, 1999）。また、ａｒｏＡを欠失させることにより芳香族化合物の生産を阻害する菌株によってシキミ酸を生産することができた（米国特許第６４３６６６４号）。このような方法は、シキミ酸を生産するための遺伝子欠失法を採択したものであった。
【００８２】
本実施例では、シキミ酸を過量生産する菌株を改良するために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用して増幅対象遺伝子を選別した。
【００８３】
まず、実施例１のような初期入力基質の摂取速度及び好気条件でＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行し、初期アルゴリズムに入力されるべきシキミ酸の代謝フラックスの最適値及び最大値を計算した。その結果、基本菌株についての最適値及び最大値は、それぞれ０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒ、７.６９２８９ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒである。前記最適値及び最大値を基準としてＦＳＥＯＦアルゴリズムが計算された結果、表４のような結果が得られた。
【００８４】
【表４】
【００８５】
解糖過程では、ｐｇｉ、ｆｂａＡ及びｐｆｋＡが選別され、五炭糖リン酸経路では、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡＢ及びｒｐｉＡが選別された。ＴＣＡ回路では、何の遺伝子も選別されていない。また、直接的にシキミ酸を生産するａｒｏＦＧＨも共に選別された。したがって、それぞれ選別された遺伝子の代謝フラックスのパターンを分析した。選別されたあらゆる遺伝子のパターンは、単調増加するパターンを表した。図４は、シキミ酸の生産を向上させるために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【００８６】
前記のように、一次的に選別された遺伝子が関与する代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しない場合や、代謝回路において、正方向と逆方向とが逆になる代謝フラックスのパターンの場合を、遺伝子増幅の対象から除外した。このような方法で選別された遺伝子は、ｇｌｋ、ｐｇｉ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ及びａｒｏＧであった。
【００８７】
前記選別結果を確認するために、各種文献調査を行った。実際の大腸菌のｔｋｔＡを増幅し、葡萄糖を基質として大腸菌を培養すれば、シキミ酸を含むキナ酸（quinic acid）及びデヒドロシキミ酸（dehydroshikimate）の総量が、０．１５ｍｏｌ／ｍｏｌから０．２４ｍｏｌ／ｍｏｌに増加するということが先行文献に記載されている（Knop et al., J. Am. Chem. Soc., 123：10173, 2001）。このような結果は、シキミ酸の理論収率０．４３ｍｏｌ／ｍｏｌの５０％程度であった。前記文献におけるシキミ酸の収率は、０．１２ｍｏｌ／ｍｏｌから０．１８ｍｏｌ／ｍｏｌに向上した。したがって、ｔｋｔＡの増幅実験の結果は、中心代謝回路からＥ４Ｐの利用可能な量を増やす戦略として解釈されることができる。
【００８８】
また、ｔｋｔＡの増幅実験と共に、ＰＥＰの利用可能な量を増やす戦略としてリン酸リレー伝達系（phosphotransferase system：以下、PTSと称する）の非活性化及びグルコースキナーゼ（glucose kinase：glk）を増幅して、０．２７ｍｏｌ／ｍｏｌの収率が得られた（Gibson et al., Chem. Int. Ed., 40：1945, 2001；Chandran et al., Biotechnol. Prog., 19：808, 2003）。文献調査によってｔｋｔＡの増幅及びｇｌｋの増幅がシキミ酸の生産向上をもたらすということが確認された。
【００８９】
先行文献に記載されているように、増幅することによって実際の生産量の増加をもたらすｔｋｔＡ及びｇｌｋは、本発明のＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて選別された増幅対象遺伝子のうち一つであるので、シキミ酸の生産性の向上においても、本発明の増幅対象遺伝子の選別方法は有用であるということが確認された。
【００９０】
実施例３：インジゴ(indigo)
インジゴは、繊維材質の染色物質として使用される。伝統的にインジゴを得るためには、植物から抽出するか、化学的な方法で合成する方法を使用する。最近、生物産業の発達による技術が蓄積されることにより、芳香族分解バクテリアを利用してインジゴを生産する方法が開発された（Murdock et al., Bio/Technol., 11：381, 1993；O’Connor et al., Biotechnol. Lett., 20：219, 1998）。また、バシラス属でフェノールヒドロキシラーゼを暗号化する遺伝子を大腸菌に導入してインジゴを生産する方法が開発された（米国特許第５８３４２９７号）。Ｌ−トリプトファンのオペロンの変形及びシュードモナス病菌（Pseudomonas putida）から導入したナフタレンジオキシゲナーゼ（naphthalene dioxygenase：以下、NDOと称する）の酵素反応によって大腸菌の新たなインジゴ合成経路を開発し、大腸菌で主に生産しているＬ−トリプトファンをインジゴに転換することにより、生産性を向上させることもできた（＞４０ｇ／Ｌ）（Berry et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28：127, 2002）。
【００９１】
既存の大腸菌でＬ−トリプトファンの生産に当って重要な役割を行う中心代謝回路を対象とし、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを利用して増幅対象遺伝子を選別した。
【００９２】
まず、構築された大腸菌代謝回路モデルに新たなＮＤＯを導入してＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行した。実施例１のように、初期に入力されるべき基質摂取速度の条件及び好気条件下でＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行し、初期アルゴリズムに入力されるべきインジゴ代謝フラックスの最適値及び最大値を計算した。その結果、基本菌株については最適値及び最大値がそれぞれ０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒ及び９．９２８０９ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒであった。
【００９３】
解糖過程では、ｐｇｉ、ｐｆｋ、ｆｂａＡ及びｐｐｓＡが増幅対象遺伝子として選別され、五炭糖リン酸経路では、ｔｋｔＡＢ、ｔａｌＡＢ、ｒｐｉＡ及びｒｐｅ遺伝子がＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて選別された。一方、グリオキシル酸短絡回路（glyoxylateshunt）の遺伝子であるａｃｅＢとＴＣＡ経路では、ａｃｎＡＢ及びｓｕｃＡＢ遺伝子が選別された（表５）。
【００９４】
前記選別結果に基づいて選択された代謝フラックスのパターンを分析した。図５は、インジゴの生産を向上させるために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選別した増幅対象遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。これらの代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しない代謝フラックスについては、遺伝子増幅対象から除外した。インジゴの生産に関しては、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによるｓｕｃＡＢ、ｔｋｔＢ、ｐｆｋＡ及びｒｐｅを増幅対象から除外した。
【００９５】
前記のような選別方法を経た結果、解糖過程では、ｐｇｉ、ｇｌｋ、ｆｂａＡ及びｐｐｓＡを、五炭糖リン酸経路では、ｔｋｔＡ及びｒｐｉＡを、ＴＣＡ回路では、ａｃｅＢを増幅対象遺伝子として選別することができた。
【００９６】
次いで、インジゴ生産の代謝工学的なアプローチによって生産量の向上をもたらした文献を調べた。インジゴが生産される経路と同じ芳香族の生産において、炭素の流れの変化を増加させるために、次のような戦略を導入した。
【００９７】
ＰＴＳを持っている菌株について、遺伝子ｐｙｋＦＡの欠失及びｔｋｔＡの増幅を通じてそれぞれ３倍及び１．５倍の炭素代謝フラックスの増加をもたらし、ＰＴＳ欠失の変異菌株については、ｔｋｔＡの増幅によって５．８倍増加し、ｔｋｔＡの増幅にｇｌｋの遺伝子を共に導入すれば、約２０倍の炭素代謝フラックスを増加させることができるという報告があった（Gosset et al., J. Ind. Microbiol., 17：47, 1996）。
【００９８】
【表５】
【００９９】
これは、インジゴの生産経路の最初のステップであるＤＡＨＰシンターゼ（3-deoxy-D-arabiohetulosonate 7-phosphatesynthase）のＰＥＰ及びＥ４Ｐ（D-erythrose 4-phosphate）基質の有用性が向上した結果であると解釈することができる。したがって、インジゴ生産の代謝工学的な方法でＥ４Ｐの利用を向上させるために、ｔｋｔＡの増幅を、ＰＥＰの利用を向上させるためには、ｐｙｋＦＡ遺伝子の欠失を提案することができた。このとき、遺伝子ａｒｏＧのフィードバックの阻害を解消したａｒｏＧｆｂｒの導入と共に、炭素の流れを増加させた代謝工学的なアプローチを通じてインジゴの生産を３０％増加させることができた（Berry et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28：127, 2002）。
【０１００】
前記のような先行文献の結果は、本発明に係る遺伝子の選別方法を通じて選択された遺伝子を増幅させた結果と一致するものである。直接的に、ｔｋｔＡの遺伝子とｇｌｋの遺伝子とを増幅対象として選別し、遺伝子ａｒｏＧから始まる経路の増加を選別した。また、ＰＥＰの基質利用度を直接的に向上させうるｐｐｓＡの遺伝子も選別することができた。したがって、本発明の方法によって選別された遺伝子は、先行文献での結果と一致するので、その有用性が検証されたことを示している。
【０１０１】
以上、本発明の内容の特定の部分について詳細に記述したが、当業者にとっては、このような具体的な記述は単に望ましい実施形態に過ぎないものであり、これにより本発明の範囲が制限されないということは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
以上説明したように、本発明によれば、ゲノムレベルの代謝回路モデルが構築された有用物質の生産のための対象生物において、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値と、理論的な最大収率の最大値との間の区分で、増幅対象代謝フラックス及びその代謝フラックスに関与する遺伝子を選別し、これを導入及び／または増幅させることにより有用物質の生成生物を効果的に改良することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝フラックスの分析を利用した有用物質の生成生物の改良方法に係り、さらに具体的には、有用物質の生産のための対象生物の代謝回路モデルにおいて、有用物質の理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値を求め、その最適値と最大値との間の範囲で、代謝フラックスの値の絶対値が大きくなる代謝フラックス、及びその代謝フラックスに関連する遺伝子を選別し、これを導入及び／または増幅することにより、有用物質の生成生物を改良する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、代謝工学的なアプローチを利用した生産菌株の改良及び目的代謝産物の増大のための多様な試みが行われてきた。しかし、分子生物学的な手法を利用した既存の代謝工学的な菌株の改良方法は、試行錯誤の戦略に基づいて多くの資本及び努力を必要とした。最近、蓄積されたゲノム情報及び多様なハイスループットスクリーニング手法の開発により、代謝工学的に改良された菌株で有用産物を極大化する方法が開発されている。特に、複数の有用微生物の全体のゲノム配列が明らかになることにより、代謝ネットワークモデルの構築が可能になり、さらに実質的な研究が可能になった。
【０００３】
したがって、既に構築された代謝ネットワークモデルを利用して、「微生物は、その成長を根本的な目的として代謝過程を経る」という前提下に代謝フラックスの分析が可能になった（Varma et al., J. Theor. Biol., 165:503, 1993）。その結果、（１）代謝経路の過程における分岐点の同定、（２）代替経路の同定、（３）測定していない外部代謝産物の計算、及び（４）最大理論収率の計算などを効果的に提供することができる（Stephanopoulos et al., Metabolic Engineering, Academic Press, NY, 309, 1998）。
【０００４】
最近提供されている多くの情報の理解に基づき、より効果的な生産菌株の開発のための新たな手法の開発が活発に行われている。ハイスループットスクリーニングの手法による有用微生物のゲノム情報の獲得によって、代謝ネットワークモデルが構築された（Edwards et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 13:244, 2000;Foster et al., Genome Res., 13:244, 2003）。また、代謝ネットワークモデルに基づいて集積された代謝機能を探求する代謝ネットワークの代謝フラックスの分析方法が開発された（Varma et al., J. Theor. Biol., 165:503, 2003;US 2002/0168654 A1）。これらの分析方法を根拠として、代謝ネットワークモデルに基づき生産菌株の有用産物の増大のための欠失対象遺伝子を選別できる手法が開発された。まず、生産目的の流れと成長目的の流れとの２つの軸についての最適化を通じて欠失対象遺伝子を選別し、相異なる目的関数を最適化するＯｐｔｋｎｏｃｋ方法（Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84:647, 2002, US 2004/0009466 A1）と、基本菌株から候補遺伝子欠失菌株の一次遺伝子の欠失による最適点の移動の最小化を通じて、部分的な最適点が得られる方法（Minimization of metabolic adjustment：MOMA）が開発された（Segre et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:15112, 2002）。これらの方法に基づいて、一次、二次及び三次の欠失対象遺伝子が選別できる順列的な遺伝子欠失の選別方法が開発され、実際のリコピンの生産に適用された（Alper et al., Metab. Eng., 7:155, 2004）。また、有用物質を生産する生物の代謝産物の活用度をフラックス合（Flux Sum）と定義し、これを摂動させることによる、有用物質の生産収率を増大させる重要な代謝産物のスクリーニング方法、及び前記スクリーニングされた重要な代謝産物に関連した遺伝子を欠失及び／または増幅させることによる有用物質を生産する生物の改良方法が開発されて出願された（韓国特許出願第１０−２００５−６２４０４号）。
【０００５】
一般に、代謝フラックスの分析において、生産目的のフラックスと細胞成長目的のフラックスとは反比例の関係になる（図１）。これは、一般的な微生物の場合、有用産物の生産が細胞成長を阻害するということを意味する。したがって、適切な代謝工学的な手法を通じて有用産物の生産を向上させる方法が必要である。代謝工学的な目的を達成するための代表的な分子生物学的なアプローチとして、対象遺伝子の過発現を誘導する遺伝子増幅法がある。このように、有用産物の生産性を向上させる生物の改良方法のために、体系的な遺伝子増幅の導入、及び生物に適用する手法の開発が、最近同技術分野における技術的課題となっている。
【０００６】
これにより、本発明者らは、有用物質の生産のための対象生物の代謝回路モデルにおいて、有用物質の理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求め、その最適値と最大値との間の範囲で、代謝フラックスの値の絶対値が増大する代謝フラックス、及びその代謝フラックスに関連する遺伝子を選別して、これを導入及び／または増幅することにより、有用物質の生成生物を改良できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、有用物質の生産性の向上のための増幅対象遺伝子をスクリーニングする方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記スクリーニングされた遺伝子を導入及び／または増幅させることによって有用物質を生産する対象生物の改良方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を解決するために、本発明は、（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦ（Flux Scanning based on Enforced Objective Flux）アルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値よりも大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；及び（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップを含む、有用物質の生産性の向上のための増幅対象遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【００１０】
本発明は、また、（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値より大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップ；及び（ｆ）前記ステップ（ｅ）で確定された増幅対象遺伝子を前記対象生物に導入及び／または対象生物で増幅させることによって前記対象生物の変異体を製作するステップを含む、有用物質を生産する生物の改良方法を提供する。
【００１１】
前記改良方法において、（ｇ）前記ステップ（ｆ）で製作された変異体を培養して、有用物質の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことが好ましい。
【００１２】
本発明において、前記対象生物は、微生物であることが好ましく、有用物質は、リコピン、シキミ酸及びインジゴなどを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された何れか一つであり、前記対象生物は、リコピン、シキミ酸及びインジゴなどを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された有用物質の生成能を有する微生物であることが好ましい。
【００１３】
本発明において、前記リコピンの生産のための増幅対象遺伝子は、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択され、前記シキミ酸の生産のための増幅対象遺伝子は、ｇｌｋ、ｐｇｉ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ及びａｒｏＧよりなる群から選択され、前記インジゴの生産のための増幅対象遺伝子は、ｐｇｉ、ｇｌｋ、ｆｂａＡ、ｐｐｓＡ、ｔｋｔＡ、ｒｐｉＡ及びａｃｅＢよりなる群から選択されることが好ましい。
【００１４】
本発明において、前記ステップ（ｂ）の発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることが好ましい。
【００１５】
【００１６】
また、前記ステップ（ｂ）の有用物質の生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とすることができる。
【００１７】
【００１８】
また、前記ステップ（ｃ）のＦＳＥＯＦアルゴリズムは、以下に表されることを特徴とすることができる。
【００１９】
であるとき、
値を選択する。
【００２０】
ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である。
【００２１】
本発明において、前記ステップ（ａ）の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の生産のための代謝回路を追加して代謝回路モデルを構築することができる。
【００２２】
また、本発明は、前記方法によって改良された生物を培養することを特徴とする有用物質の製造方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されており、リコピンの高生成能を有する変異菌株及びｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されている変異大腸菌を提供する。
【００２４】
また、本発明は、前記変異菌株及び変異大腸菌を好気条件下で培養することを特徴とするリコピンの製造方法を提供する。
【００２５】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】生産目的の代謝フラックスと細胞成長目的の代謝フラックスとの関係を示すグラフである。
【図２】本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムを概略的に示す図である。
【図３】リコピンの生産を向上させるために、本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【図４】シキミ酸の生産を向上させるために、本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【図５】インジゴの生産を向上させるために、本発明に係るＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【００２７】
本発明では、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、代謝フラックスの値の絶対値が大きくなる代謝フラックスを選別するＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて、増幅対象になる遺伝子を選別する。
【００２８】
選別された増幅対象の遺伝子は、発現ベクターを利用して有用物質の生産対象生物に導入させるか、及び／または対象生物で増幅させて、対象生物内で関連代謝フラックスを増加させ、これを通じて目的有用物質の生産性を極大化することができる。
【００２９】
増幅対象遺伝子を選別するアルゴリズムを実行するために、まず、代謝回路モデルを構築しなければならない。本発明では、代謝回路モデルを目的有用物質の生産にさらに適するようにするために、対象生物の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の代謝フラックスを追加して代謝回路モデルを構築した。
【００３０】
図２は、本発明で使用されるＦＳＥＯＦアルゴリズムを概略的に示す図であって、目的有用物質の生産関連の代謝フラックスの値を人為的に調節しつつ、全体の代謝フラックスを分析し、分析された代謝フラックスから増幅対象の代謝フラックス及び関連する遺伝子を選別する。その具体的な内容を説明すれば、以下の通りである。
【００３１】
まず、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用する前に、代謝フラックスの計算が優先されねばならない。予備実験から構築された代謝回路モデルの代謝フラックスの分析を行うことによって、代謝回路上の成長代謝フラックスの値が最大であるとき、全体の代謝フラックスの最適値を求める。これらの最適代謝フラックスの値を、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの開始点として記録する。また、ここで、生産関連の代謝フラックスの最適値を同時に記録して、その値を生産関連の代謝フラックスの値を強化させる出発点とする。代謝回路で代謝フラックスの最適値を計算するための代謝フラックスの分析の数学的な表現は、次のようになる。
【００３２】
【００３３】
ここで、Ｓは、代謝回路を構成する反応係数行列であり、反応物の反応係数は、負の数で表示され、生産物の反応係数は、正の数で表示されて、全ての反応係数は、原子単位で反応均衡をなす。線形方程式の計算において、既に取得した情報、すなわち、実際の基質の摂取速度及び熱力学的な制約条件のような条件を付加することにより、より正確な計算結果が得られる。
【００３４】
また、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの付加的な必要条件として、生産関連の代謝フラックスの理論的な最大収率値が必要である。多様な制約条件と共に、構築された代謝回路モデルの代謝フラックスの分析を通じて、代謝回路上の生産関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、生産関連の代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値を求める。この値を基に、強化目的の生産関連の代謝フラックスの値の最終値として決定する。前記の数式と類似の方式で、生産関連の代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値を、以下の数式により得ることができる。
【００３５】
【００３６】
前記数式による計算結果、生産関連の代謝フラックスの最適値及び最大値が得られ、これらの値を基準に、以下に表現されるＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用させることができる。ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて一次増幅対象の代謝フラックスを選別する。
【００３７】
であるとき、
値を選択する。
【００３８】
ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である。
【００３９】
生産関連の代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲を複数の区分に分けた後、同じ区分間隔で代謝フラックスの値を増大させつつ、その値に制約されるように線形方程式を構成する。このように構成されたモデルの細胞成長速度が最大であるとき、代謝フラックスの値を反復的に計算する。代謝フラックスを計算するために、次のようなソフトウェアが使用され得る。ＦｌｕｘＡｎａｌｙｚｅｒ（Klamt et al., Bioinformatics, 19:216, 2003）、Ｍｅｔａｂｏｌｏｇｉｃａ（Zhu et al., Metab. Eng., 5:74, 2003）のように、Ｍａｔｌａｂに基づくソフトウェア、Ｆｌｕｘｏｒ（http://arep.med.harvard.edu/moma/biospicefluxor.html）、Ｓｉｍｐｈｅｎｙ（Genomatica Inc., San Diago, CA）、ＩＮＳＩＬＩＣＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（INSILCO biotechnology Inc., Stuttgart, Germany）、ＦＢＡ（http://systemsbiology.ucsd.edu/downloads/fba.htm）、メタフラックスネット（Lee et al., Bioinformatics, 19:2144, 2003）のように、独立的に計算できるプログラム、Ｇａｍｓ（GAMS Development Corporation, NW Washington, DC）、Ｃ言語やフォートランのようなコンピュータ言語パッケージツールなどを利用して、ＦＳＥＯＦのアルゴリズムを適用して計算することができる。
【００４０】
前記反復的な計算の結果、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値より大きい場合、すなわち、必ず増加する区分が存在する代謝フラックスを一次的に増幅対象の代謝フラックスとして選別する。
【００４１】
次いで、前記一次的に選別された代謝フラックスの分析を通じて、最終的な増幅対象代謝フラックス及びその代謝フラックスに関与する増幅対象遺伝子を選別する。最終的な選別は、前記一次的に選別された代謝フラックスのうち、減少または増加する傾向を表すが、代謝フラックスの絶対値のうち、最大値が単にいくつかの区分でのみ最適値の絶対値より大きい場合は除外した。
【００４２】
前記のような方法で選別された代謝フラックスのパターンは、単調増加または単調減少の様態を表した。最適値が正の数である場合、正方向に継続的に増加し、最適値が負の数である場合、逆方向に増加する場合である。または、反応物と生成物との左右が逆になることにより、負の数で単調減少を表す。
【００４３】
しかし、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて一次的に選別された対象は、絶対値の変化に対する増加区分を選別する過程であるので、最適値の正の数または負の数の値とは関係がないと言える。したがって、振動するか、ゼロ値から出発しない場合も、増幅の対象として選別される。したがって、これらの代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しないか、代謝回路において、正方向と逆方向とが逆になる代謝フラックスについては、最終的な増幅対象から除外した。
【００４４】
すなわち、本発明の増幅対象遺伝子の選別過程は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて全体代謝関連の遺伝子のうち、増幅対象遺伝子を一次的に選別し、一次的に選別された遺伝子のうち、代謝フラックスのプロファイルを分析して、遺伝子増幅の対象を確定した。
【００４５】
本発明に係る増幅対象遺伝子の選別方法は、目的有用物質の過量生産に適用することができる。下記の実施例では、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの有用性を検証するために、大腸菌でリコピン、シキミ酸及びインジゴの生産を実際的に実施し、文献調査を行った。その結果、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを利用して選別された遺伝子の増幅が、目的代謝産物の生産性の向上に寄与するということが証明された。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳述する。これらの実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がそれらの実施例に限定されないということは、当業者にとっては明らかである。
【００４７】
特に、下記の実施例では、有用物質としてリコピン、シキミ酸及びインジゴのみを例示したが、その他に生物培養を利用して生産できる有用物質であれば、いかなるものでも適用できるということは、当業者ならば理解できる。
【００４８】
実施例１：リコピンの生産を向上させる増幅遺伝子の選別
リコピンは、二次代謝産物であって、活性酸素を防止する抗酸化剤の役割を行うことはもとより、癌の予防に役立ち、兔疫体系の向上に重要な役割を行う炭素４０個のカロテノイド系化合物である。主としてカロテノイド系化合物は、植物から抽出して得られるが、多様な誘導体を十分に生産することは、相当に困難である。バクテリアに外来の遺伝子を導入してリコピンを生産すれば、効率が高く、遺伝子の操作を通じて多様なリコピンの誘導体を得ることもできる。したがって、リコピンを過量生産は、多様な誘導体の過量生産を導くことができる（Misawa et al., J. Bacteriol., 172：6704, 1990；Barkcovich et al., Metab. Eng., 3：27, 200１；Wang et al., Biotechnol. Bioeng., 62, 235, 1999）。
【００４９】
リコピンは、代謝回路上でグリセロアルデヒド−３−リン酸（以下、‘Ｇ３Ｐ’：glycealdehyde-3-phoshpate）及びピルビン酸（以下、‘ＰＹＲ’：pyruvate）の重合反応から始まる非メバロン酸経路（Non-Mevalonate pathway）を利用して、中間体であるイソペンテニル二リン酸（以下、‘ＩＰＤＰ’：isopentenyl diphosphate）の合成、重合反応、そしてチェーンの変形ステップを経て生産される。
【００５０】
このとき、ＩＰＤＰを生産するために、遺伝子ｄｘｓ（1-deoxyl-d-xylose synthase）を含むイソペンテニルオペロン（ispABCEFGH operon）が関与する（Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 72：408, 200１）。したがって、大腸菌に存在していないｃｒｔオペロンを導入することにより、４０炭素化合物の端部の変形を可能にし、これにより、大腸菌でのリコピンの生産が可能になった（Misawa et al., J. Bacteriol., 172：6704, 1990）。
【００５１】
したがって、既存の大腸菌の代謝ネットワークモデルにリコピンの生産のためのｃｒｔオペロンの関連過程（Alper et al., Metab. Eng., 7：155, 2004）を追加して、既存の代謝ネットワークモデルを修正、再構築した。
【００５２】
リコピンを生産する代謝ネットワークモデルを構築して、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用し、これにより、新たな増幅遺伝子の候補群を発掘した。まず、代謝フラックスの分析を通じて、固定された基質（葡萄糖）の摂取速度を１０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒに定義し、好気条件で代謝フラックスをシュミレーションした。
【００５３】
その結果、野生菌株で生産関連の代謝フラックスの値は０であり、リコピンを生産する遺伝子ｄｘｓが発現された基本菌株については、最適値が０．０００２ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒであった。前記値は、実験的に最小培地で得た値の制約条件を代入して計算したものである。また、リコピンの代謝フラックスの最大値は、０．６２ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒであった。前記得られた値を基にしてＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用することにより、一次増幅対象の代謝フラックスに関与する遺伝子が得られた。表１は、一次的に選別された増幅対象の代謝フラックスに関与する遺伝子を列挙したものである。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１から、解糖過程中のＧ３Ｐの合成に関連した遺伝子及びトリカルボン酸経路(tricarboxylic pathway)のあらゆる遺伝子が選別されたということが確認できる。また、Ｇ３ＰとＰＹＲとから始まる非メバロン酸経路のあらゆる遺伝子及び補酵素関連の遺伝子が選別された。
【００５６】
次いで、前記一次的に選別された遺伝子の代謝フラックスの分析を通じて、増幅対象遺伝子を最終的に選別した。代謝フラックスの間に減少または増加する傾向を表すが、代謝フラックスの絶対値のうち最大値が、単にいくつかの区分でのみ最適値の絶対値よりも大きい場合には除外した。この値を基にして生産目的の流れ及び増幅遺伝子の変化を比較・分析することができた。図３は、リコピン生産の向上のために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムにより一次的に選別された増幅対象遺伝子が関与する代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【００５７】
前記のような方法で選別された代謝フラックスのパターンは、単調増加または単調減少の様態を表した。最適値が正の数である場合、正方向に増加し、最適値が負の数である場合、逆方向に増加する。または、反応物と生成物との左右が逆になることにより、負の数で単調減少を表した。
【００５８】
しかし、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて一次的に選別された対象は、絶対値の変化についての増加区分を選別する過程であるので、最適値の正の数または負の数の値とは関係がないと言える。したがって、振動するか、ゼロ値から出発しない場合も、増幅の対象として選別された。したがって、これらの代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しないか、代謝回路において、正方向と逆方向とが逆になる代謝フラックスについては、最終増幅対象から除外した。
【００５９】
その結果、リコピンの生産を向上させるための生産菌株の改良に、解糖過程のｐｇｉ、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ及びｐｆｋＡを増幅対象遺伝子として選別し、リニアーな関係を有する非メバロン酸経路上の遺伝子のうち、ｉｄｉをさらに増幅対象として選別し、ＴＣＡ回路の遺伝子のうち、ｍｄｈ及びｉｃｄＡを増幅対象として選別した。
【００６０】
選別された対象遺伝子が、実際のリコピンの生産にどのような影響を及ぼすかを確認するために、発現ベクターを利用して対象遺伝子を大腸菌に導入した。
【００６１】
選別された遺伝子を発現するために、以下の方法で遺伝子ベクターを製作した。まず、あらゆる遺伝子は、大腸菌野生菌株（Ｗ３１１０）を鋳型とし、対象遺伝子についての下記表２のプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより得られたＰＣＲ切片を制限酵素で切断し、これを遺伝子ベクターに導入した。
【００６２】
まず、下記配列番号１及び配列番号２によってＰＣＲ切片を得た後、ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩとで切断し、それをｐＴｒｃ９９Ａ（Amersham Pharmacia, NJ, USA）に導入して、遺伝子ｄｘｓの増幅のためのベクターｐＴＤを製作した。
【００６３】
遺伝子ｐｇｉの場合、下記配列番号３及び配列番号４によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｐｇｉを製作した。
【００６４】
遺伝子ｐｆｋＡの場合、下記配列番号５及び配列番号６によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｐｆｋＡを製作した。
【００６５】
遺伝子ｆｂａＡの場合、下記配列番号７及び配列番号８によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断し、それををｐＴＤに導入してｐＴＤｆｂａＡを製作した。
【００６６】
遺伝子ｔｐｉＡの場合、下記配列番号９及び配列番号１０によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｔｐｉＡを製作した。
【００６７】
遺伝子ｉｃｄＡの場合、下記配列番号１１及び配列番号１２によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｉｃｄＡを製作した。
【００６８】
遺伝子ｍｄｈの場合、下記配列番号１３及び配列番号１４によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｍｄｈを製作した。
【００６９】
遺伝子ｉｄｉの場合、下記配列番号１５及び配列番号１６によってＰＣＲ切片を得た後、ＸｂａＩとＫｐｎＩで切断し、それをｐＴＤに導入してｐＴＤｉｄｉを製作した。
【００７０】
リコピンを生産するｃｒｔＥＸＹＩＢオペロンは、エルビニア・ウレドボラ（erwinia uredovora）菌株（ＡＴＣＣ １９３２１）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、表２の配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを使用してＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ切片をＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、それをｐＡＣＹＣ１８４（Chang et al., J. Bacteriol., 134:1141, 1978）に導入して、遺伝子ベクターｐＣａｒ１８４を製作した。
【００７１】
また、前記製作されたｐＣａｒ１８４を鋳型とし、表２の配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを使用してＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ切片をＤｎｐＩ制限酵素で切断し、自己融合を通じて遺伝子ｃｒｔＥＩＢを含んでいるｐＬｙｃ１８４を製作した。
【００７２】
リコピンの生産のために、大腸菌ＤＨ５α菌株（New England Lab., MA）に熱衝撃法で前記ｐＬｙｃ１８４を導入し、組み換え大腸菌を２５０ｍｌのフラスコに２ＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５０ｍｌを使用して４８時間、３０℃、２００ｒｐｍの振盪培養器で培養した。
【００７３】
【表２】
【００７４】
培養液を１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞を得た後、冷アセトンで懸濁し、５５℃の振盪槽でリコピンの抽出を１５分間行った。高性能の液体クロマトグラフィを通じて、前記抽出物からリコピンを分離し、４７０ｎｍ波長のＵＶ検出器でリコピンを同定した。周知の濃度のリコピンを利用した直線内挿法で試料の濃度を計算した。表３には、濃度、及び培養結果によって得たリコピンの含有量を表示した。
【００７５】
表３の発現ベクターのうち、ｐＡＣ−ＬＹＣ０４／ｐＴｄｘｓの製作及び発現ベクターの導入された大腸菌の培養（Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 72:408, 2001）と、ｐＣＷ２／ｐＡＫ３２の製作及び発現ベクターの導入された大腸菌の培養（Wang et al. Biotechnol. Prog., 16:922、1999）とは、それぞれ先行文献の記載に従って行った。
【００７６】
【表３】
【００７７】
実験の結果、対照群（ｐＴＤ／ｐＬｙｃ１８４）と比較したとき、ｆｂａＡの遺伝子が増幅された場合、リコピンの含有量が５０％増加し、ｔｐｉＡ及びｍｄｈ遺伝子が増幅された場合、６０％増加した。ｉｄｉ遺伝子が増幅された場合は、１１０％までに増加した。しかし、選別された他の遺伝子は、リコピンの生産に大きな影響を及ぼしていない。それは、代謝回路モデルに酵素活性度及び調節のメカニズムが含まれていないからであるとみなされる。
【００７８】
結論的に、選別された遺伝子のうち解糖過程の４個の候補遺伝子（ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉ）をリコピン生産の向上に肯定的な影響を及ぼす増幅対象遺伝子と決定した。
【００７９】
実施例２：シキミ酸(shikimate)
シキミ酸は、芳香族アミノ酸の一化合物であり、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン及びトリプトファンを大腸菌または植物で過量生産させる重要な前駆体の役割を行う。また、細菌感染の治療に用いられるノイラミニダーゼ阻害剤ＧＳ４１０４（Tamiflu）の合成に必要な初期物質でもある。
【００８０】
シキミ酸は、ホスホエノールピルビン酸（phosphoenolpyruvate：PEP）とエリトロース四リン酸（erythrose-4-phosphate：E4P）との重合反応によってヘプツロソン酸-7-リン酸（3-heptulosonate-7-phosphate：DAHP）が合成され、これからシキミ酸の合成経路が始まる。したがって、Ｅ４Ｐ及びＰＥＰの利用がシキミ酸の生産に大きく影響を及ぼす。
【００８１】
ＤＡＨＰは、ａｒｏＦＧＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ及びａｒｏＥによって一つの分子のＮＡＤＰＨを消費しつつシキミ酸を生産する。シキミ酸は、さらにａｒｏＫＬ及びａｒｏＡによって普通の芳香族化合物を合成する。蓄積される中間体の分析から、ａｒｏＢＬＡが反応律速因子であり、これにより、ａｒｏＫＬの変異株を用いてシキミ酸を生産できることが先行文献に記載されている（Draths et al., Ｊ. Am. Chem. Soc., 121：1603, 1999）。また、ａｒｏＡを欠失させることにより芳香族化合物の生産を阻害する菌株によってシキミ酸を生産することができた（米国特許第６４３６６６４号）。このような方法は、シキミ酸を生産するための遺伝子欠失法を採択したものであった。
【００８２】
本実施例では、シキミ酸を過量生産する菌株を改良するために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを適用して増幅対象遺伝子を選別した。
【００８３】
まず、実施例１のような初期入力基質の摂取速度及び好気条件でＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行し、初期アルゴリズムに入力されるべきシキミ酸の代謝フラックスの最適値及び最大値を計算した。その結果、基本菌株についての最適値及び最大値は、それぞれ０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒ、７.６９２８９ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒである。前記最適値及び最大値を基準としてＦＳＥＯＦアルゴリズムが計算された結果、表４のような結果が得られた。
【００８４】
【表４】
【００８５】
解糖過程では、ｐｇｉ、ｆｂａＡ及びｐｆｋＡが選別され、五炭糖リン酸経路では、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡＢ及びｒｐｉＡが選別された。ＴＣＡ回路では、何の遺伝子も選別されていない。また、直接的にシキミ酸を生産するａｒｏＦＧＨも共に選別された。したがって、それぞれ選別された遺伝子の代謝フラックスのパターンを分析した。選別されたあらゆる遺伝子のパターンは、単調増加するパターンを表した。図４は、シキミ酸の生産を向上させるために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選択された増幅遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。
【００８６】
前記のように、一次的に選別された遺伝子が関与する代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しない場合や、代謝回路において、正方向と逆方向とが逆になる代謝フラックスのパターンの場合を、遺伝子増幅の対象から除外した。このような方法で選別された遺伝子は、ｇｌｋ、ｐｇｉ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ及びａｒｏＧであった。
【００８７】
前記選別結果を確認するために、各種文献調査を行った。実際の大腸菌のｔｋｔＡを増幅し、葡萄糖を基質として大腸菌を培養すれば、シキミ酸を含むキナ酸（quinic acid）及びデヒドロシキミ酸（dehydroshikimate）の総量が、０．１５ｍｏｌ／ｍｏｌから０．２４ｍｏｌ／ｍｏｌに増加するということが先行文献に記載されている（Knop et al., J. Am. Chem. Soc., 123：10173, 2001）。このような結果は、シキミ酸の理論収率０．４３ｍｏｌ／ｍｏｌの５０％程度であった。前記文献におけるシキミ酸の収率は、０．１２ｍｏｌ／ｍｏｌから０．１８ｍｏｌ／ｍｏｌに向上した。したがって、ｔｋｔＡの増幅実験の結果は、中心代謝回路からＥ４Ｐの利用可能な量を増やす戦略として解釈されることができる。
【００８８】
また、ｔｋｔＡの増幅実験と共に、ＰＥＰの利用可能な量を増やす戦略としてリン酸リレー伝達系（phosphotransferase system：以下、PTSと称する）の非活性化及びグルコースキナーゼ（glucose kinase：glk）を増幅して、０．２７ｍｏｌ／ｍｏｌの収率が得られた（Gibson et al., Chem. Int. Ed., 40：1945, 2001；Chandran et al., Biotechnol. Prog., 19：808, 2003）。文献調査によってｔｋｔＡの増幅及びｇｌｋの増幅がシキミ酸の生産向上をもたらすということが確認された。
【００８９】
先行文献に記載されているように、増幅することによって実際の生産量の増加をもたらすｔｋｔＡ及びｇｌｋは、本発明のＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて選別された増幅対象遺伝子のうち一つであるので、シキミ酸の生産性の向上においても、本発明の増幅対象遺伝子の選別方法は有用であるということが確認された。
【００９０】
実施例３：インジゴ(indigo)
インジゴは、繊維材質の染色物質として使用される。伝統的にインジゴを得るためには、植物から抽出するか、化学的な方法で合成する方法を使用する。最近、生物産業の発達による技術が蓄積されることにより、芳香族分解バクテリアを利用してインジゴを生産する方法が開発された（Murdock et al., Bio/Technol., 11：381, 1993；O’Connor et al., Biotechnol. Lett., 20：219, 1998）。また、バシラス属でフェノールヒドロキシラーゼを暗号化する遺伝子を大腸菌に導入してインジゴを生産する方法が開発された（米国特許第５８３４２９７号）。Ｌ−トリプトファンのオペロンの変形及びシュードモナス病菌（Pseudomonas putida）から導入したナフタレンジオキシゲナーゼ（naphthalene dioxygenase：以下、NDOと称する）の酵素反応によって大腸菌の新たなインジゴ合成経路を開発し、大腸菌で主に生産しているＬ−トリプトファンをインジゴに転換することにより、生産性を向上させることもできた（＞４０ｇ／Ｌ）（Berry et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28：127, 2002）。
【００９１】
既存の大腸菌でＬ−トリプトファンの生産に当って重要な役割を行う中心代謝回路を対象とし、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを利用して増幅対象遺伝子を選別した。
【００９２】
まず、構築された大腸菌代謝回路モデルに新たなＮＤＯを導入してＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行した。実施例１のように、初期に入力されるべき基質摂取速度の条件及び好気条件下でＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行し、初期アルゴリズムに入力されるべきインジゴ代謝フラックスの最適値及び最大値を計算した。その結果、基本菌株については最適値及び最大値がそれぞれ０ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒ及び９．９２８０９ｍｍｏｌ／ｇＤＷ／ｈｒであった。
【００９３】
解糖過程では、ｐｇｉ、ｐｆｋ、ｆｂａＡ及びｐｐｓＡが増幅対象遺伝子として選別され、五炭糖リン酸経路では、ｔｋｔＡＢ、ｔａｌＡＢ、ｒｐｉＡ及びｒｐｅ遺伝子がＦＳＥＯＦアルゴリズムを通じて選別された。一方、グリオキシル酸短絡回路（glyoxylateshunt）の遺伝子であるａｃｅＢとＴＣＡ経路では、ａｃｎＡＢ及びｓｕｃＡＢ遺伝子が選別された（表５）。
【００９４】
前記選別結果に基づいて選択された代謝フラックスのパターンを分析した。図５は、インジゴの生産を向上させるために、ＦＳＥＯＦアルゴリズムにより選別した増幅対象遺伝子についての代謝フラックスの分布を示すグラフである。これらの代謝フラックスのパターンのうち、代謝フラックスの増加区分が一貫したパターンで増加しない代謝フラックスについては、遺伝子増幅対象から除外した。インジゴの生産に関しては、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによるｓｕｃＡＢ、ｔｋｔＢ、ｐｆｋＡ及びｒｐｅを増幅対象から除外した。
【００９５】
前記のような選別方法を経た結果、解糖過程では、ｐｇｉ、ｇｌｋ、ｆｂａＡ及びｐｐｓＡを、五炭糖リン酸経路では、ｔｋｔＡ及びｒｐｉＡを、ＴＣＡ回路では、ａｃｅＢを増幅対象遺伝子として選別することができた。
【００９６】
次いで、インジゴ生産の代謝工学的なアプローチによって生産量の向上をもたらした文献を調べた。インジゴが生産される経路と同じ芳香族の生産において、炭素の流れの変化を増加させるために、次のような戦略を導入した。
【００９７】
ＰＴＳを持っている菌株について、遺伝子ｐｙｋＦＡの欠失及びｔｋｔＡの増幅を通じてそれぞれ３倍及び１．５倍の炭素代謝フラックスの増加をもたらし、ＰＴＳ欠失の変異菌株については、ｔｋｔＡの増幅によって５．８倍増加し、ｔｋｔＡの増幅にｇｌｋの遺伝子を共に導入すれば、約２０倍の炭素代謝フラックスを増加させることができるという報告があった（Gosset et al., J. Ind. Microbiol., 17：47, 1996）。
【００９８】
【表５】
【００９９】
これは、インジゴの生産経路の最初のステップであるＤＡＨＰシンターゼ（3-deoxy-D-arabiohetulosonate 7-phosphatesynthase）のＰＥＰ及びＥ４Ｐ（D-erythrose 4-phosphate）基質の有用性が向上した結果であると解釈することができる。したがって、インジゴ生産の代謝工学的な方法でＥ４Ｐの利用を向上させるために、ｔｋｔＡの増幅を、ＰＥＰの利用を向上させるためには、ｐｙｋＦＡ遺伝子の欠失を提案することができた。このとき、遺伝子ａｒｏＧのフィードバックの阻害を解消したａｒｏＧｆｂｒの導入と共に、炭素の流れを増加させた代謝工学的なアプローチを通じてインジゴの生産を３０％増加させることができた（Berry et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28：127, 2002）。
【０１００】
前記のような先行文献の結果は、本発明に係る遺伝子の選別方法を通じて選択された遺伝子を増幅させた結果と一致するものである。直接的に、ｔｋｔＡの遺伝子とｇｌｋの遺伝子とを増幅対象として選別し、遺伝子ａｒｏＧから始まる経路の増加を選別した。また、ＰＥＰの基質利用度を直接的に向上させうるｐｐｓＡの遺伝子も選別することができた。したがって、本発明の方法によって選別された遺伝子は、先行文献での結果と一致するので、その有用性が検証されたことを示している。
【０１０１】
以上、本発明の内容の特定の部分について詳細に記述したが、当業者にとっては、このような具体的な記述は単に望ましい実施形態に過ぎないものであり、これにより本発明の範囲が制限されないということは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
以上説明したように、本発明によれば、ゲノムレベルの代謝回路モデルが構築された有用物質の生産のための対象生物において、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値と、理論的な最大収率の最大値との間の区分で、増幅対象代謝フラックス及びその代謝フラックスに関与する遺伝子を選別し、これを導入及び／または増幅させることにより有用物質の生成生物を効果的に改良することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用物質の生産性の向上のための増幅対象遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；
（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦ（Flux Scanning based on Enforced Objective Flux）アルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値よりも大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；及び
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップ、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）の発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項１に記載の方法：
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）の有用物質の生産に関する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項１に記載の方法：
【請求項４】
前記ステップ（ｃ）のＦＳＥＯＦアルゴリズムは、以下に表されることを特徴とする請求項１に記載の方法：
であるとき、
値を選択する
（ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である）。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の生産のための代謝回路を追加して代謝回路モデルを構築することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象生物は微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有用物質は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された何れか一つであり、前記対象生物は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された有用物質の生成能を有する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
有用物質を生産する生物の改良方法であって、
（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；
（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値より大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップ；及び
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で確定された増幅対象遺伝子を前記対象生物に導入及び／または対象生物で増幅させることによって前記対象生物の変異体を製作するステップ、
を含む前記方法。
【請求項９】
（ｇ）前記ステップ（ｆ）で製作された変異体を培養して、有用物質の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）の発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項８に記載の方法：
【請求項１１】
前記ステップ（ｂ）の有用物質の生産に関する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項８に記載の方法：
【請求項１２】
前記ステップ（ｃ）のＦＳＥＯＦアルゴリズムは、以下に表されることを特徴とする請求項８に記載の方法：
であるとき、
値を選択する
（ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である）。
【請求項１３】
前記ステップ（ａ）の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の生産のための代謝回路を追加して代謝回路モデルを構築することを特徴とする請求項８に記載の方法）。
【請求項１４】
前記対象生物は微生物であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
有用物質は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された何れか一つであり、前記対象生物は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された有用物質の生成能を有する微生物であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記リコピンの生産のための増幅対象遺伝子は、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記シキミ酸の生産のための増幅対象遺伝子は、ｇｌｋ、ｐｇｉ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ及びａｒｏＧよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記インジゴの生産のための増幅対象遺伝子は、ｐｇｉ、ｇｌｋ、ｆｂａＡ、ｐｐｓＡ、ｔｋｔＡ、ｒｐｉＡ及びａｃｅＢよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項８〜１８のいずれか１項の方法によって改良された生物を培養することを特徴とする有用物質の製造方法。
【請求項２０】
ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されており、リコピンの高生成能を有する変異菌株。
【請求項２１】
請求項２０の変異菌株を好気条件下で培養することを特徴とするリコピンの製造方法。
【請求項２２】
ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されている変異大腸菌。
【請求項２３】
請求項２２の変異大腸菌を好気条件下で培養することを特徴とするリコピンの製造方法。
【請求項１】
有用物質の生産性の向上のための増幅対象遺伝子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；
（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦ（Flux Scanning based on Enforced Objective Flux）アルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値よりも大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；及び
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップ、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）の発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項１に記載の方法：
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）の有用物質の生産に関する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項１に記載の方法：
【請求項４】
前記ステップ（ｃ）のＦＳＥＯＦアルゴリズムは、以下に表されることを特徴とする請求項１に記載の方法：
であるとき、
値を選択する
（ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である）。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の生産のための代謝回路を追加して代謝回路モデルを構築することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象生物は微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有用物質は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された何れか一つであり、前記対象生物は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された有用物質の生成能を有する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
有用物質を生産する生物の改良方法であって、
（ａ）目的有用物質を生産しようとする対象生物（但し、ヒトを除く）を選定し、選定された生物の代謝回路モデルを構築するステップ；
（ｂ）前記選定された生物の構築された代謝回路で、有用物質の生産に関連する理論的な最大収率である最大値と、発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値とを求めるステップ；
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で求められた代謝フラックスの最適値と最大値との間の範囲で、ＦＳＥＯＦアルゴリズムを実行して、代謝回路全体の代謝フラックスのプロファイルを作成するステップ；
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で作成されたプロファイルで、全体の代謝フラックスの値の絶対値のうち、最大値が最適値の絶対値より大きい場合、その代謝フラックスに関与する遺伝子を一次増幅対象遺伝子として選別するステップ；
（ｅ）前記ステップ（ｄ）で選別された一次増幅対象遺伝子のうち、単調増加または単調減少を表す代謝フラックスに関与する遺伝子を最終増幅対象遺伝子として確定するステップ；及び
（ｆ）前記ステップ（ｅ）で確定された増幅対象遺伝子を前記対象生物に導入及び／または対象生物で増幅させることによって前記対象生物の変異体を製作するステップ、
を含む前記方法。
【請求項９】
（ｇ）前記ステップ（ｆ）で製作された変異体を培養して、有用物質の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）の発酵データの適用または未適用の条件で、成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項８に記載の方法：
【請求項１１】
前記ステップ（ｂ）の有用物質の生産に関する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値は、以下のアルゴリズムを利用して求めることを特徴とする請求項８に記載の方法：
【請求項１２】
前記ステップ（ｃ）のＦＳＥＯＦアルゴリズムは、以下に表されることを特徴とする請求項８に記載の方法：
であるとき、
値を選択する
（ここで、Ｓは、代謝回路の反応係数行列であり、
は、代謝フラックスであり、
は、代謝フラックスの最適値であり、
は、ＦＳＥＯＦアルゴリズムによって計算された代謝フラックスの絶対値の最大値であり、
は、生産関連の代謝フラックスであり、
は、生産に関連する代謝フラックスの理論的な最大収率である最大値であり、
は、発酵データの適用または未適用の条件で成長関連の代謝フラックスの値が最大であるとき、有用物質の生産関連の代謝フラックスの最適値であり、Ｙは、ＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数を含む集合であり、ｙｋは、集合ＹでＦＳＥＯＦアルゴリズムの過程の指標因数である）。
【請求項１３】
前記ステップ（ａ）の代謝回路モデルが目的有用物質の生産に特異的ではない場合、目的有用物質の生産のための代謝回路を追加して代謝回路モデルを構築することを特徴とする請求項８に記載の方法）。
【請求項１４】
前記対象生物は微生物であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
有用物質は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された何れか一つであり、前記対象生物は、リコピン、シキミ酸及びインジゴを含む、産業的な有用性に優れた代謝産物よりなる群から選択された有用物質の生成能を有する微生物であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記リコピンの生産のための増幅対象遺伝子は、ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記シキミ酸の生産のための増幅対象遺伝子は、ｇｌｋ、ｐｇｉ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ及びａｒｏＧよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記インジゴの生産のための増幅対象遺伝子は、ｐｇｉ、ｇｌｋ、ｆｂａＡ、ｐｐｓＡ、ｔｋｔＡ、ｒｐｉＡ及びａｃｅＢよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項８〜１８のいずれか１項の方法によって改良された生物を培養することを特徴とする有用物質の製造方法。
【請求項２０】
ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されており、リコピンの高生成能を有する変異菌株。
【請求項２１】
請求項２０の変異菌株を好気条件下で培養することを特徴とするリコピンの製造方法。
【請求項２２】
ｆｂａＡ、ｔｐｉＡ、ｍｄｈ及びｉｄｉよりなる群から選択される遺伝子が導入及び／または増幅されている変異大腸菌。
【請求項２３】
請求項２２の変異大腸菌を好気条件下で培養することを特徴とするリコピンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５２７９９２（Ｐ２００８−５２７９９２Ａ）
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５２０４９（Ｐ２００７−５５２０４９）
【出願日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３０７４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３２５６８
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００３０７４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３２５６８
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０２３１８４７８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ (27)
【Ｆターム（参考）】
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