強直性脊椎炎を有する患者における抗−ＴＮＦα抗体に対する臨床応答を予測する血清マーカー
本発明は、抗−ＴＮＦα剤による療法の開始前に、強直性脊椎炎と診断された患者を管理するためのツールを提供する。ツールは、血清マーカー濃度を使用した標準的な臨床一次及び二次エンドポイントに基づいて、治療法に対する応答を予測する特定のマーカー及びアルゴリズムである。一実施形態において、レプチン又はオステオカルシンのベースラインレベルを使用して、治療法の開始後の第１４週における応答を予測する。別の実施形態では、治療法の第４週後の補体成分３等の血清タンパク質バイオマーカーにおける変化を使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年１２月３０日出願の米国特許出願第６１／１４１，４２１号の優先権を主張するものであり、出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、血清バイオマーカーを使用して、強直性脊椎炎と診断された患者の抗−ＴＮＦα生物学的治療を用いた処置に対する応答を予測するための方法及び手順に関する。
【関連技術の記載】
【０００３】
現在入手可能な又は開発中のゴリムマブ又はアダリムマブ、ヒト抗−ＴＮＦα抗体又はインフリキシマブ、マウス−ヒトキメラ抗−ＴＮＦ抗体、又はエンテラセプト（enteracept）、ＴＮＦＲコンストラクト等の生物製剤を用いて強直性脊椎炎（ＡＳ）を処置する決定は、多数の困難を提示している。その困難のうちの１つは、どの対象が処置に応答し、どの対象が処置後に応答を失うかを予測することである。
【０００４】
バイオマーカーは、「正常な生物学的過程、発病過程、又は治療介入に対する薬理学的な応答性の指標として客観的に測定され評価される特徴として定義される」（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，２００１．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐ．６９：８９〜９５）。バイオマーカーの定義は、発現の変化が、疾病若しくは進行の危険性の増加に、又は所定の処置に対する応答性の予測に、関連付けられ得るタンパク質として最近更に定義された。
【０００５】
抗−ＴＮＦ抗体をインビトロ又はインビボシステムに添加することによるＴＮＦαの中和は、炎症性サイトカインの発現と、他の血清タンパク質及び非タンパク質の構成成分の数と、を変更し得る。培養した滑膜線維芽細胞に添加された抗−ＴＮＦ抗体は、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現を低減した（Ｆｅｌｄｍａｎｎ ＆ Ｍａｉｎｉ（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：１６３〜１９６）。インフリキシマブで処置されたＲＡ患者は、低下されたＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−６、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン及びフィブリノゲンの血清レベルを有した（Ｃｈａｒｌｅｓ １９９９ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：１５２１〜１５２８）。他の試験により、インフリキシマブで処置されたＲＡ患者が、低下された可溶性ＩＣＡＭ−３及びｓＰ−セレクチンの血清レベル（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇａｙ、２００６ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２４：３７３〜３７９）、並びにサイトカインＩＬ−１８のレベルの低下（Ｐｉｔｔｏｎｉ、２００２ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６１：７２３〜７２５；ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔ、２００５ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６４：５３７〜５４３）を有することが示された。
【０００６】
上昇したＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルは、様々な免疫介在性炎症性疾患を有する患者に観察されている。これらの観察は、ＣＲＰが抗−ＴＮＦα処置のマーカーとしての潜在的な価値を有し得ることを示している。（Ｓｔ Ｃｌａｉｒ、２００４ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５０：３４３２〜３４４３）は、インフリキシマブが、早期ＲＡを有する患者においてＣＲＰを正常レベルに戻すことを示した。難治性乾癬性関節炎においても（Ｆｅｌｅｔａｒ、２００４ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６３：１５６〜１６１）、インフリキシマブによる処置がＣＲＰを正常レベルに戻した。ＣＲＰレベルも、メトトレキサートのみで処置された早期ＲＡ患者における関節損傷進行に関連していることが示されている（Ｓｍｏｌｅｎ、２００６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４：７０２〜７１０）。インフリキシマブ処置がメトトレキサート処置に加えられた場合、ＣＲＰレベルは、もはや関節損傷進行に関与しなかった。
【０００７】
ＲＡを有する患者の処置において、Ｃｈａｒｌｅｓ（１９９９）及びＳｔｒｕｎｋ（２００６ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ．２６：２５２〜２５６）は、インフリキシマブがＩＬ−６等の炎症関連のサイトカインと、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）等の血管新生関連のサイトカインとの発現を低下させ得ることを示した。Ｕｌｆｇｒｅｎ（２０００ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４３：２３９１〜２３９６）は、インフリキシマブ処置が、処置から２週間以内に、滑膜内のＴＮＦ、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの合成を低下させることを示した。Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎｉ（２００５ Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １５３：５３１〜５３６）は、インフリキシマブによる処置後に、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＭＭＰ−２における低下が乾癬の領域内で有意に向上され、乾癬の重篤さを低減することを示した。Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ（Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ２００８；６７；５１１〜５１７；）は、インフリキシマブ処置がＡＳ患者の血清中のＩＬ−６、ＶＥＧＦ及びＣＲＰのレベルを低下させ、この低下は疾病活性尺度の改善を反映することを示した。
【０００８】
インフリキシマブによるＡＳ患者の処置はＩＬ−６の低下をもたらし、この低下は臨床的尺度の改善と関連していた（Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ，２００６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ７９２）。インフリキシマブ処置患者において、処置後のＩＬ−６及びＣＲＰの早期低下は、疾病活性スコアにおける改善に関連していた。
【０００９】
処置前の血清マーカー濃度も、抗−ＴＮＦα処置に対する応答に関与していた。ＩＬ−２Ｒの低いベースライン血清レベルは、難治性ＲＡを有する患者のインフリキシマブに対する臨床応答に関連することが見出された（Ｋｕｕｌｉａｌａ ２００６）。Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ（２００７ａ）は、インフリキシマブ及びＭＴＸを用いたＲＡ患者の処置が、ＭＭＰ−３を含む炎症関連マーカーの数の減少を誘導することを示した。この試験では、ＭＭＰ−３のベースラインレベルが、処置後１年の臨床的改善の尺度と有意に相関することが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、炎症及び全身性疾病の血清タンパク質及び非タンパク質マーカーの数は抗−ＴＮＦα処置中に変更されることが示されているが、マーカーと予測的アルゴリズムとの固有のセットは、今の所、見出されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、多数のバイオマーカーを使用して、抗−ＴＮＦαによる処置に対する患者の応答を予測することに関し、より詳細には患者が応答するか又はしないかを測定することに関する。加えて、本発明は、患者が処置に応答したか否かを測定し、また応答が持続するか否かを測定するのに使用され得る。一態様において、本発明は、患者血清サンプルを使用した多成分スクリーンを用いて、ＴＮＦα中和モノクローナル抗体による処置に対するＡＳを有する患者の応答及び非応答を予測することを包含する。
【００１２】
一実施形態において、実際の臨床応答評価と相関付けられている、抗−ＴＮＦα療法の開始前にＡＳ患者からのデータセット中に同定された特定のマーカーセットは、抗−ＴＮＦα療法による処置前の、ＡＳ患者の臨床応答の予測に使用される。特定の実施形態において、マーカーセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される２つ以上のマーカーである。
【００１３】
一実施形態において、実際の臨床応答評価と相関付けられている、抗−ＴＮＦα療法の開始の前後にＡＳ患者からのデータセット中に同定された特定のマーカーセットは、抗−ＴＮＦα療法による処置前の、ＡＳ患者の臨床応答の予測に使用される。特定の実施形態において、マーカーセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される２つ以上のマーカーである。
【００１４】
本発明は、抗−ＴＮＦα療法に対するＡＳ患者の応答を予測するためのコンピュータベースのシステムも提供し、コンピュータは患者のデータセットからの値を使用して決定木等の予測的アルゴリズムと比較し、データセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上のマーカーの血清濃度を含む。一実施形態において、コンピュータベースのシステムは、患者データセットを処理し、出力を生成する学習ずみニューラルネットワークであり、データセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、インスリン、補体成分３、ＶＥＧＦ及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上のマーカーの血清濃度を含む。
【００１５】
本発明は、ＡＳ患者から獲得した標本又はサンプル中の血清マーカーを処理及び検出可能な装置も提供し、血清マーカー濃度は、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される。
【００１６】
本発明は、ＡＳ患者から獲得した標本又はサンプル中の血清マーカーを処理及び検出可能な装置を含むキットも提供し、血清マーカー濃度は、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図１〜６は、血清バイオマーカーの使用に基づき、ＡＳＡＳ２０又はＢＡＳＤＡＩにより評価された患者臨床応答と相関付けられた決定木の形態で示されるＡＳ応答予測モデルである。非応答者又は「否」ノードは、ノード内の全対象がモデルにより非応答者と予測される一方、「肯」ノードは、ノード内の全対象がモデルにより応答者と予測されることを意味する。ノード内に、ノード内の実際の非応答者の数／実際の応答者の数が示されている。
【図１】第１４週にてＡＳＡＳ２０を用いて、ゴリムマブを受容している試験患者から多重化方法で分析したベースライン（第０週）マーカーデータから開発した予測値モデルであり、応答者に関する初期分類子はレプチン（カットオフ値＜３．８０４、対数目盛り）に基づき、応答者に関する二次分類子は、ＣＤ４０リガンド（カットオフ値＞＝１．０５、対数目盛り）に基づく。
【図２】第１４週にてＢＡＳＤＡＩにおける変化を用いて、ゴリムマブを受容している試験患者から多重化方法で分析したベースライン（第０週）マーカーデータから開発した予測値モデルであり、初期応答者基準はＴＩＭＰ−１（カットオフ値＞＝７．０３３）であり、応答者の二次分類子はＧ−ＣＳＦ（カットオフ値＜３．９５３）であり、ＴＩＭＰ−１がカットオフ値未満の場合、前立腺酸性ホスファターゼが応答者の分類子（カットオフ＞＝−１．２８７、ｌｏｇ値）であり、ＴＩＭＰ−１及びＰＡＰが両方ともそれらのそれぞれのカットオフ値未満の場合、ＭＣＰ−１が応答者に関する分類子（＜７．４１７、対数目盛り）。
【図３】第１４週にてＡＳＡＳ２０を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者及び応答から多重化方法及び個々のＥＩＡの両方により定量化した、ベースライン（第０週）における血清マーカー値から開発したＡＳ応答予測モデルであり、オステオカルシンが応答者の初期分類子（カットオフ値＞＝３．８７８、対数目盛り）であり、オステオカルシンがそのそれぞれのカットオフ値未満の場合、ＰＡＰが応答者の分類子（カットオフ値＞＝−１．３５９、対数目盛り）として使用される。
【図４】第１４週にてＢＡＳＤＡＩ変化を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者及び応答から多重化方法及び個々のＥＩＡの両方により定量化した、ベースライン（第０週）における血清マーカー値から開発したＡＳ応答予測モデルであり、オステオカルシンが応答者の初期分類子（カットオフ値＞＝３．９７７、対数目盛り）であり、オステオカルシンがカットオフ値未満の場合、ＰＡＰが応答者の分類子（カットオフ＞＝−１．４１５）であり、オステオカルシン及びＰＡＰの両方がそれらのそれぞれのカットオフ値未満の場合、インスリンが応答者の分類子（カットオフ値＜２．７１１、対数目盛り）として使用される。
【図５】応答を第１４週にてＡＳＡＳ２０を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者から多重化方法により定量化した、ベースラインと、抗−ＴＮＦ療法の開始後のベースライン（第０週）から第４週への血清マーカーの変化とから開発したＡＳ応答予測モデルであり、ベースラインレプチンが応答者の初期分類子（カットオフ値＜３．８０４、対数目盛り）であり、レプチンがカットオフ値未満の場合、ベースラインから第４週への補体３の変化が応答者の分類子（カットオフ＜−０．２２４）として使用され、レプチン及び補体３がそれらのそれぞれのカットオフ値以上の場合、ベースラインＶＥＧＦが応答者の分類子（カットオフ＞＝８．７２４）として使用される。
【図６】第１４週にてＢＡＳＤＡＩにおける変化を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者及び応答から多重化方法により定量化した、ベースラインと、抗−ＴＮＦ療法の開始後のベースライン（第０週）から第４週への血清マーカーの変化とから開発したＡＳ応答予測モデルであり、初期応答者基準は、ベースラインから第４週への補体成分３の変化（カットオフ値＜−０．２３３、対数目盛り）であり、補体３の変化がカットオフ値以上の場合、ベースラインフェリチンが分類子（カットオフ値＞＝７．７７４、対数目盛り）として使用され、補体３の変化がカットオフ値以上で、ベースラインフェリチンがそのそれぞれのカットオフ値未満の場合、ＩＣＡＭ−１の変化が応答者の分類子（カットオフ値＞＝−０．２２０４、対数目盛り）として使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
【表１】
【００１９】
定義
「バイオマーカー」は、Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（Ａｔｋｉｎｓｏｎら、２００１ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒａｐ ６９（３）：８９〜９５）による、正常な生物学的過程、発病過程、又は治療的介入に対する薬理応答の客観的指標として、客観的に測定及び評価される特徴として定義される。したがって、解剖学的又は生理学的過程は、タンパク質、遺伝子発現（ｍＲＮＡ）、小分子、代謝産物又は無機質のレベルが可能なように、例えば挙動の範囲のようなバイオマーカーとしての役割を果たすが、但しバイオマーカーと、関連する生理学的、毒物学的、薬理学的又は臨床成績との間に、検証された関係が存在することを条件とする。
【００２０】
マーカーの「血清レベル」は、血液等の標本から調製されたサンプル上で、典型的にはエクスビボで免疫測定法等の１つ以上の方法により測定されたマーカーの濃度を意味する。免疫測定法は、各マーカーに関する免疫特異的な試薬、典型的には抗体を使用し、酵素結合反応、例えばＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、又は他の直接的若しくは間接的プローブを含む多様なフォーマットにて実行され得る。サンプル中のマーカーを定量化する他の方法、例えば、電気化学的検出、蛍光プローブ結合検出も可能である。この測定法はまた「多重化」されてもよく、単一のサンプル調査中に多数のマーカーが検出及び定量化される。
【００２１】
観察的研究は、通常、それらの結果をオッズ比（ＯＲ）又は相対的危険性として報告する。これらの両方は、暴露（例えば喫煙、薬物療法の使用）と疾病又は死との間の関連性の大きさの尺度である。相対的危険性１．０は、暴露が疾病の危険性を変化させないことを示す。相対的危険性１．７５は、暴露を有する患者の疾病を発症する可能性が１．７５倍であり、又は疾病の危険性が７５％高いことを示す。相対的危険性１未満は、暴露が危険性を低下させることを示す。オッズ比は、相対的危険性が特に計算できない場合に、症例対照研究において相対的危険性を見積もる方法である。オッズ比は、疾病が希な場合、正確であるが、この近似は、疾病が通常のものである場合、同様に良好ではない。
【００２２】
予測値は、臨床現場において試験の結果を解釈する助けとなる。手順の診断値は、その感度、特異性、予測値及び有効性により規定される。いずれの試験方法も、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、偽陽性（ＦＰ）及び真陰性（ＴＮ）を生成するであろう。試験の「感度」は、陽性試験を有する、疾病が存在し又は応答する患者の百分率、即ち（ＴＰ／ＴＰ＋ＦＮ）×１００％である。試験の「特異性」は、陰性試験を有する、疾病を有さない又は応答しない全患者の百分率、即ち（ＴＮ／ＦＰ＋ＴＮ）×１００％である。試験の「予測値」又は「ＰＶ」は値（陽性又は陰性）が真の値である回数の尺度（％）であり、即ち、真陽性である全陽性試験の百分率が陽性予測値（ＰＶ＋）、即ち（ＴＰ／ＴＰ＋ＦＰ）×１００％である。「陰性予測値」（ＰＶ−）は、応答しない、陰性試験を有する患者の百分率、即ち（ＴＮ／ＦＮ＋ＴＮ）×１００％である。試験の「正確性」又は「有効性」は、全試験数と比較して正確な回答を与える試験の数の百分率、即ち（ＴＰ＋ＴＮ／ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％である。「誤り率」は、応答すると予測された患者が応答せず、また応答すると予測されなかった患者が応答する場合、即ち（ＦＰ＋ＦＮ／ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％である。全体的な試験の「特異性」は、感度の正確性の尺度であり、試験の特異性は、全体の疾病の可能性が集団内で変化する際に変化せず、予測値は変化する。ＰＶは、所定の患者における疾病の存在若しくは不在、又は臨床応答の存在若しくは不在への医師の臨床評価により変化する。
【００２３】
バイオマーカーの「低下したレベル」又は「より低いレベル」は、「カットオフ値」と称される所定の値と比較して定量化可能に低く、定量下限（ＬＯＱ）よりも高いレベルを指し、この「カットオフ値」は、患者サンプル採取及び処理条件に関連したアルゴリズム及びパラメータに特異的である。
【００２４】
バイオマーカーの「より高いレベル」又は「上昇したレベル」は、「カットオフ値」と称される所定の値と比較して定量化可能に高く、この「カットオフ値」は、患者サンプル採取及び処理条件に関連したアルゴリズム及びパラメータに特異的である。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒトＴＮＦα」（本明細書でｈＴＮＦα、ｈＴＮＦａ又は単にＴＮＦと略される）は、１７ｋＤ分泌形態及び２６ｋＤ膜結合形態として存在するヒトサイトカインを指すことを意図し、その生物学的に活性な形態は、非共有結合した１７ｋＤ分子の三量体から構成される。用語、ヒトＴＮＦαは、標準的な組み換え発現方法により調製され、又は商業的に購入することができる（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２１０−ＴＡ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）組み換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）を含むことを意図する。
【００２６】
「抗−ＴＮＦα」、「抗−ＴＮＦα」、抗−ＴＮＦα又は単に「抗−ＴＮＦ」療法又は処置は、受容体結合を遮断、阻害、中和、防止し、又はＴＮＦαによるＴＮＦＲ活性を防止することが可能な生物分子（生物製剤）を患者に投与することを意味する。そのような生物製剤の例は、インフリキシマブ及びアダリムマブの一般名で販売されている抗体、並びにゴリムマブ等の臨床開発中の抗体を含むがこれらに限定されない、ＴＮＦαに対する中和Ｍａｂであり、エンテラセプトとして公知のＴＮＦＲ−免疫グロブリンキメラ等の、ＴＮＦａに結合可能な非抗体構造も含む。この用語は、本明細書と、米国特許第６，０９０，３８２号、同第６，２５８，５６２号、同第６，５０９，０１５号、並びに米国特許出願第０９／８０１１８５号及び同第１０／３０２３５６号に記載されている抗−ＴＮＦαヒト抗体及び抗体部分のそれぞれを含む。一実施形態において、本発明で使用されるＴＮＦα阻害剤は、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＪｏｈｎｓｏｎ、参照により本明細書に組みこまれる米国特許第５，６５６，２７２号に記載）、ＣＤＰ５７１（ヒト化モノクローナル抗−ＴＮＦ−α ＩｇＧ４抗体）、ＣＤＰ ８７０（ヒト化モノクローナル抗−ＴＮＦ−α抗体断片）、抗−ＴＮＦ ｄＡｂ（Ｐｅｐｔｅｃｈ）、ＣＮＴＯ １４８（ゴリムマブ、及びＣｅｎｔｏｃｏｒ、ＷＯ ０２／１２５０２号参照）、及びアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ヒト抗−ＴＮＦ ｍＡｂ、米国特許第６，０９０，３８２号にＤ２Ｅ７として記載）を含む抗−ＴＮＦα抗体、又はその断片である。本発明で使用され得る更なるＴＮＦ抗体は、参照により本明細書に組みこまれる米国特許第６，５９３，４５８号、同第６，４９８，２３７号、同第６，４５１，９８３号、及び同第６，４４８，３８０号に記載されている。別の実施形態では、ＴＮＦα阻害剤は、ＴＮＦ融合タンパク質、例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ、参照により本明細書に組みこまれるＷＯ ９１／０３５５３号及びＷＯ ０９／４０６４７６号に記載）である。別の実施形態では、ＴＮＦα阻害剤は、組み換えＴＮＦ結合タンパク質（ｒ−ＴＢＰ−Ｉ）（Ｓｅｒｏｎｏ）である。
【００２７】
「サンプル」又は「患者のサンプル」は、ＴＮＦα関連の疾病に関連した症状を有することが疑われる又は表している患者から、抽出、生成、収集、又は別様に獲得した、細胞、組織若しくは流体又はそれらの一部である標本を意味する。
【００２８】
概観
プロテオミクス等の技術における近年の進歩は、ハイスループット方法により生成した新しい情報を、臨床病理学的相関に基づき、また多くの場合、病理組織学的発見を包含する現在の診断モデルと統合する挑戦を病理学者に提示している。医療情報学及び生物情報学の分野における平行した発展は、これらの問題に合理的に取り組むための技術的かつ数学的方法を提供し、開業医及び病理学者又は他の医療専門家に、多変量の及び集学的な診断及び予後モデルの形態の新しいツールを提供している。これらのツールは、より正確な、個々の患者ベースの情報を提供することが期待される。根拠に基づく医学（ＥＢＭ）及び医学判断学（ＭＤＡ）は、これらの比較的新しい学問分野に属し、定量的方法を使用して情報の値を評価し、個々の患者のケアに影響を与え得る予後の評価、治療法に対する応答、及び臨床試験の選択のためにいわゆる最良の証拠を多変量モデルと統合する。
【００２９】
本発明は、数個の態様を含む。
１．ＡＳを有する患者におけるゴリムマブ等の抗−ＴＮＦ処置に対する応答又は非応答に関連したバイオマーカーを同定するための血清の使用。
２．抗−ＴＮＦ療法を開始する前に、診断されたＡＳ患者からの血清中に存在するバイオマーカーを使用して、ゴリムマブ等の抗−ＴＮＦα Ｍａｂ処置に対する応答又は非応答を予測する能力。
３．抗−ＴＮＦ療法で処置されたＡＳを有する患者における成果を予測するためのアルゴリズム。
ａ．第１４週におけるＡＳ患者の抗−ＴＮＦαに対する臨床応答又は非応答は、抗−ＴＮＦ療法の開始前に、診断されたＡＳ患者の血清中に存在するバイオマーカーを使用して、評価時（第０週）に予測され得る。
ｂ．第１４週におけるＡＳ患者の抗−ＴＮＦα処置に対する臨床応答又は非応答は、治療法の開始前（第０週）に得られたベースライン値からのバイオマーカーと、治療法の開始後の第４週でのバイオマーカーとの変化を使用して予測され得る。
ｃ．第１４週におけるＡＳ患者の抗−ＴＮＦα処置に対する臨床応答又は非応答は、治療法の開始前（第０週）に得られたベースライン値からのバイオマーカーの変化を、治療法の開始後の第４週でのバイオマーカーの変化と組み合わせて使用して予測され得る。
４．本発明のマーカーを使用して、ＡＳ患者の抗−ＴＮＦα療法に対する応答又は非応答を予測する手段を含む装置、システム及びキット。
【００３０】
マーカーの濃度に基づく予測的アルゴリズムの開発に有用なマーカーを規定するために、ゴリムマブで処置された患者から血清を獲得した。血清は、処置のベースライン（第０週）、第４週及び第１４週、又は他の中間点若しくはより長い時間点にて獲得してもよい。血清サンプル中の多数のバイオマーカーを分析し、バイオマーカーのベースライン濃度と、処置後のバイオマーカーの濃度における変化と、を測定する。次いで、ベースラインとバイオマーカー発現の変化とを使用して、バイオマーカー発現が第１４週又は処置開始後の他の規定時間点における処置成果と相関するか否かを、ＡＳＡＳ２０又は臨床応答の他の尺度により評価して決定する。一実施形態では、ＡＳ患者の抗−ＴＮＦα療法に対する臨床応答に関連したマーカーを規定するプロセスと、それらのマーカーの血清濃度を含む、応答又は非応答を予測するためのアルゴリズムとの開発は、段階的な分析を使用し、初期相関は、患者の第１４週及び第２４週における臨床評価に対する各患者の第０週、第４週及び第１４週における各バイオマーカーの値に関するロジスティック回帰分析により行われ、多数の臨床エンドポイントにおいてマーカーの治療法に対する応答との有意な相関の能力が測定されたら、ＣＡＲＴ又は本明細書に記載した若しくは当技術分野にて公知の他の好適な分析方法を使用して、マーカー又はマーカーセットの規定された血清値に基づく固有のアルゴリズムを開発する。
【００３１】
本明細書に開示した他のマーカーに加えて、データセットマーカーは１つ以上の臨床的兆候から選択されてもよく、その例は、年齢、性別、血圧、身長及び体重、肥満度指数、ＣＲＰ濃度、煙草使用、心拍数、空腹時インスリン濃度、空腹時ブドウ糖濃度、糖尿病状態、他の薬物療法の使用、並びに特定の機能的評価又は挙動評価、並びに／又は放射線学的若しくは他の画像ベースの評価であり、個々の尺度に数値が適用され、又は全体的な数値スコアが生成される。臨床的変数が一般に評価され、得られたデータはアルゴリズムにおいて上記のマーカーと組み合わされる。
【００３２】
分析プロセスへ入力する前に、各マーカーに関する値を、通常三回、又は多数の三回にて測定することにより、各データセットにおけるデータを収集する。データを操作してもよく、例えば標準曲線を使用して生データを変換し、三回測定の平均を使用して、各患者に関する平均及び標準偏差を計算してもよい。これらの値は、モデルに使用される前に、例えばｌｏｇ−変換、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（Ｂｏｘ ａｎｄ Ｃｏｘ（１９６４）Ｊ．Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ，２６：２１１＆＃８２１２；２４６参照）変換等の変換をされてもよい。次いで、このデータを、規定パラメータを有する分析プロセスに入力してもよい。
【００３３】
このようにしてタンパク質マーカーに関連した定量的データが得られ、次いで他のデータセット成分を、学習アルゴリズムを使用して以前に決定されたパラメータを有する分析プロセスに供し、即ち、本明細書に提供する実施例（実施例１〜３）のように、予測的モデルに入力する。分析プロセスのパラメータは、本明細書に開示したもの、又は本明細書に記載したガイドラインを使用して誘導したものであってもよい。線形判別分析、再帰的特長削除（recursive feature elimination）、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰分析、ＣＡＲＴ、ＦｌｅｘＴｒｅｅ、ＬＡＲＴ、ランダムフォレスト、ＭＡＲＴ等の学習アルゴリズム、又は他の機械学習アルゴリズムが、適切な参照又は訓練データに適用されて、ＡＳ応答又は非応答分類に好適な分析プロセスのためのパラメータを決定する。
【００３４】
分析プロセスは、サンプルが所定のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定し得る。確率は、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又はそれ以上であることが好ましい。
【００３５】
別の実施形態では、分析プロセスは、得られたデータセットと参照データセットとの比較が、統計的に有意な差異を生じるか否かを決定する。統計的に有意な差異を生じる場合、データセットが由来するサンプルを、参照データセットクラスに属さないものとして分類する。逆に、そのような比較が参照データセットと統計的に有意に異ならない場合、データセットが由来するサンプルは、参照データセットクラスに属するものとして分類される。
【００３６】
一般に、分析プロセスは、線形アルゴリズム、二次アルゴリズム、多項式アルゴリズム、決定木アルゴリズム、投票アルゴリズム等の統計分析方法により生成されるモデルの形態を有するであろう。
【００３７】
分析プロセスのパラメータを決定するための参照／訓練データセットの使用
任意の好適な学習アルゴリズムを用いて、適切な参照又は訓練データセットを使用して、分類に使用されるべき分析プロセスのパラメータを決定し、即ち予測的モデルを開発する。
【００３８】
使用するべき参照又は訓練データセットは、決定されるべき所望のＡＳ分類、例えば応答者又は非応答者に依存するであろう。データセットは、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のクラスからのデータを含んでもよい。
【００３９】
例えば、抗−ＴＮＦα療法に対する応答の予測に使用される分析プロセスのためのパラメータを決定する、管理された学習アルゴリズムを使用するためには、対照サンプル及び疾病サンプルを含むデータセットを訓練セットとして使用する。代替的に、管理された学習アルゴリズムは、ＡＳ疾病療法に関する予測的モデルの開発に使用される。
【００４０】
統計分析
以下は、開示した方法の実践を補助するための、当業者が利用可能な統計分析方法の種類の例である。統計分析は、２つの課題の一方又は両方に適用され得る。まず、これら及び他の統計的方法は、好ましいデータセットを形成するであろう好ましいマーカー及び他の徴候のサブセットを同定するのに使用され得る。加えて、これら及び他の統計的方法は、データセットと共に使用されて結果を生成する分析プロセスの生成に使用され得る。本明細書に示し、又は当技術分野にて別様に入手可能な、数個の統計的方法は、これらの課題の両方を実行し、本明細書に開示した方法を実践するための分析プロセスとしての使用に好適なモデルを生じる。
【００４１】
特定の実施形態では、バイオマーカー及びそれらの対応する特徴（例えば発現レベル又は血清レベル）を使用して、患者のクラス、例えば抗−ＴＮＦα療法に対する応答者及び非応答者を区別する分析プロセス（１つ又は複数）を開発する。これらの例示的データ分析アルゴリズム又は当技術分野にて公知の他の技術を使用して分析プロセスを構築した後、分析プロセスを使用して、試験対象を２つ以上の表現型クラス（例えば抗−ＴＮＦα療法に応答すると予測される患者、又は応答しないと予測される患者）のうちの１つに分類し得る。これは分析プロセスを、試験対象から得られたマーカープロファイルに適用することにより達成される。したがって、そのような分析プロセスは、診断指標としての多大な価値を有する。
【００４２】
一態様において、開示された方法は、試験対象からのマーカープロファイルを、訓練集団から獲得したマーカープロファイルに対して評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、訓練集団内の対象、及び試験対象から得られた各マーカープロファイルは、複数の異なるマーカーのそれぞれに関する特徴を含む。いくつかの実施形態では、この比較は、（ｉ）訓練集団からのマーカープロファイルを使用して分析プロセスを開発し、（ｉｉ）この分析プロセスを試験対象からのマーカープロファイルに適用する、ことにより達成される。そのようなものとして、本明細書に開示した方法のいくつかの実施形態に適用される分析プロセスは、試験ＡＳ患者が抗−ＴＮＦα療法に応答するか否か、又は応答しない患者を決定するのに使用される。
【００４３】
したがって、いくつかの実施形態では、上述した二分決定状況における結果は、４つの可能な成績を有する。（ｉ）分析プロセスが、対象が抗−ＴＮＦα療法に対する応答者となることを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に実際に応答する、真の応答者（真陽性、ＴＰ）；（ｉｉ）分析プロセスが、対象が抗−ＴＮＦα療法に対する応答者となることを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に実際に応答しない、偽応答者（偽陽性、ＦＰ）；（ｉｉｉ）分析プロセスが、抗−ＴＮＦα療法に対する応答者とならないことを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に応答しない、真の非応答者（真陰性、ＴＮ）；又は（ｉｖ）分析プロセスが、患者が抗−ＴＮＦα療法に対する応答者とならないことを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に実際に応答する、偽の非応答者（偽陰性、ＦＮ）。
【００４４】
分析プロセスを開発するための関連したデータ分析アルゴリズムには、線形、ロジスティックを含む判別分析、及びより柔軟な判別技術（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＧｎａｎａｄｅｓｉｋａｎ、１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ １９７７参照）；分類木及び回帰木（ＣＡＲＴ）及び変形等の木ベースのアルゴリズム（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＢｒｅｉｍａｎ、１９８４，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．：Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ参照）；一般化加法モデル（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ、１９９０，Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ参照）；並びにニューラルネットワーク（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＮｅａｌ、１９９６，Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；及びＩｎｓｕａ、１９９８，Ｆｅｅｄｆｏｒｗａｒｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ Ｓｅｍｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，ｐｐ．１８１〜１９４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明のデータ分析アルゴリズムは、分類及び回帰木（ＣＡＲＴ）、多重相加的回帰木（Multiple Additive Regression Tree）（ＭＡＲＴ）、マイクロアレイに関する予測分析（ＰＡＭ）又はランダムフォレスト分析を含む。それらのアルゴリズムは、血液サンプル等の生物材料からの複雑なスペクトルを分類して、対象を正常か又は特定の疾病状態に特徴的なバイオマーカー発現レベルを所有するか区別する。別の実施形態では、本発明のデータ分析アルゴリズムは、ＡＮＯＶＡ及びノンパラメトリック等価物（nonparametric equivalent）、線形判別分析、ロジスティック回帰分析、最小近傍分類子分析（nearest neighbor classifier analysis）、ニューラルネットワーク、主成分分析、二次判別分析、回帰分類子及びサポートベクターマシンを含む。
【００４６】
それらのアルゴリズムは、分析プロセスを構成し、及び／又は分析プロセスの適用の速度及び効率を向上させ、研究者のバイアスを避けるために使用され得るが、当業者は本発明の予測的モデルの使用方法を実行するのにコンピュータベースの装置を必要としないことを認識するであろう。
【００４７】
ＣＡＲＴ分析の結果
本発明の一態様では、ＡＳと診断された患者における血清マーカーの分析は、バイオマーカーのベースライン値と抗−ＴＮＦα療法に対する応答との間の有意な関係に焦点を当てた。本発明の別の態様では、ＡＳと診断された患者における血清マーカーにおいて、ベースライン（抗−ＴＮＦα療法の前）から治療後の第４週への血清マーカーにおける変化の分析は、後の時間（第１４週）の患者の臨床応答又は非応答に関連していた。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、レプチンのベースライン濃度は、ゴリムマブで処置された患者に関するＡＳＡＳ２０として評価される第１４週の成果を予測するための、初期分類子であり得る。代替的な実施形態では、ベースラインオステオカルシン（osteocalin）は、ゴリムマブで処置された患者に関するＡＳＡＳ２０又はＢＡＳＤＡＩとして評価される第１４週の成果を予測するための、初期分類子であり得る。この情報は、医師により使用されて、ゴリムマブ処置から利益を得る者を決定することができ、また同様に重要なこととして、そのような処置から利益を得ない患者を同定することができる。
【００４９】
代替的に、ＢＡＳＤＡＩがモデルの臨床成績成分として使用された。またベースラインにおけるＴＩＭＰ−１、ベースラインにおけるオステオカルシン、又は補体成分３における変化は、分類用の初期マーカーであった。ＴＩＭＰ−１値が高い場合、Ｇ−ＣＳＦにおける変化と組み合わせ、ＴＩＭＰ−１値がカットオフ未満で、ＭＣＰ−１値がカットオフ値未満の場合、前立腺酸性ホスファターゼを組み合わせて、第１４週での成果を予測した。
【００５０】
抗−ＴＮＦα療法に対する応答のベースラインバイオマーカー予測
予測的アルゴリズムをベースラインバイオマーカー血清濃度値のみを含むデータセットから構築した際、抗−ＴＮＦα療法で処置したＡＳ患者の臨床応答を、臨床応答を評価するＡＳＡＳ２０及びＢＡＳＤＡＩ等の２つ以上の方法と相関付け、マーカーはレプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ，及びインスリンを含んでいた。
【００５１】
本明細書で示したように、ベースライン（第０週、処置前）にてＡＳ患者から獲得した血清中のバイオマーカーの分析は、多重化測定法で定量化され、最良のＣＡＲＴモデルは、初期分類子としてレプチンを含んだ。３．８（対数目盛り）を越えるレプチンを有する対象は非応答者と予測され、３．８未満のレプチンを有する対象は二次予測物のＣＤ４０リガンドに基づいて分類される（１．０５を越えるＣＤ４０リガンドはＡＳ応答者と予測され、１．０５未満のＣＤ４０リガンドは非応答者と予測される）（図１）。モデルの感度は８６％であり、モデル特異性は８８％であった。臨床的尺度が、ＢＡＳＤＡＩにおけるベースラインから第１４週への変化であった場合、多重の異なるバイオマーカーにより定量化されたベースラインバイオマーカーデータが分類子：ＴＩＭＰ−１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＧＣＳＦ及びＭＣＰ−１（図２）、となったが、ＢＡＳＤＡＩモデルの全体の正確性はＡＳＡＳ２０モデルと同様であった。
【００５２】
ベースライン（第０週、処置前）でＡＳ患者から獲得した血清中のバイオマーカーの分析は、多重化測定法及び個々のＥＩＡで定量化され、最良のＣＡＲＴモデルは初期分類子としてオステオカルシンを含んだ。３．８７８（対数目盛り）を越えるオステオカルシンを有する対象は応答者と予測され、３．８７８未満のオステオカルシンを有する対象は、前立腺酸性ホスファターゼに基づいて更に分類される（図３）。モデル感度は９０％であり、モデル特異性は８４％であった。したがって、多重化測定法と個々のＥＩＡ測定法とからのデータを使用し、結果をＢＡＳＤＡＩ及びＡＳＡＳ２０のいずれかと相関付けることにより、両方が分類子としてオステオカルシン及び前立腺酸性ホスファターゼを含むモデルを生成した。ＢＡＳＤＡＩベースのモデルは、追加の分類子の１つとしてインスリンを組み込んだ。モデル正確性は、ＢＡＳＤＡＩ臨床応答の予測に関して６１／７６（８０％）であった（図４）。
【００５３】
これらの結果は、バイオマーカーのベースラインレベルが医師によって処置前に測定されて、ゴリムマブで処置したどの患者が処置に応答し又は応答しないかを同定できることを示唆する。
【００５４】
成果の早期予測物としてのバイオマーカー変化
臨床応答を評価するＡＳＡＳ２０及びＢＡＳＤＡＩ等の２つ以上の方法において、臨床応答と相関することが見出された、ＡＳ患者における、ベースライン血清レベルから第４週へのバイオマーカー変化は、レプチン、ＶＥＧＦ、補体３、ＩＣＡＭ−１及びフェリチンを含む。
【００５５】
多重のみで定量化された、ベースライン及び第４週においてＡＳ患者から獲得した血清中のバイオマーカーの分析に関して、バイオマーカーモデルは、初期分類子としてレプチンを使用する。３．８（対数目盛り）を越えるレプチンを有する対象は非応答者と予測され、３．８未満のレプチンを有する対象は、２つの追加の分類子、ｉ）補体３における変化、及びｉｉ）ＶＥＧＦに基づいて分類される（図５）。モデルの感度は９２％であり、モデル特異性は８１％であった。臨床的尺度がＢＡＳＤＡＩにおけるベースラインから第１４週への変化であった場合、全体の正確性はＡＳＡＳ２０モデルと同様であり、補体成分３における変化が初期分類子であり、ベースラインフェリチンを使用した２つのサブ分類が続き、その後にＩＣＡＭ−１における変化が続く（図６）。
【００５６】
抗−ＴＮＦα療法に対するＡＳ患者の応答又は非応答を予測するのに有用なアルゴリズムの生成のための本発明に記載した特定の例は、多数のマーカーがＡＳプロセスと相関することを示し、治療法に対する応答の診断又は予測におけるそれぞれの特定のバイオマーカーの定量的解釈は、今までに確率されていない本出願人らは、規定した特定のマーカーに基づいた患者データのサンプリングを用いてアルゴリズムが生成できることを証明した。本発明のマーカーを使用する１つの方法では、コンピュータ支援装置を使用して患者データを捕捉し、必要な分析を実行する。別の態様では、コンピュータ支援装置又はシステムは、「訓練データセット」と表現されるデータを使用して、予測的分析の適用に必要な分類子情報を生成する。
【００５７】
分析を実行するための器具、試薬及びキット
診断されたＡＳ患者の抗−ＴＮＦ療法に対する応答を予測するための血清バイオマーカーの測定は、本発明に記載される標準的な免疫化学的及び生物物理学的方法を使用して、臨床検査室又は研究所、又は病院若しくは病院以外の場所の中心研究所で実行されてもよい。マーカー定量化は、ＷＢＣカウント、血小板及びＥＳＲ等の他の標準的な測定と同一の時間に実行されてもよい。分析は、市販のキットを使用して個別に若しくはバッチで、又は個々の患者サンプルに多重化分析を用いて実行されてもよい。
【００５８】
本発明の一態様では、個別の及びセットの試薬を使用して、１つ以上の工程において、患者のサンプル中のバイオマーカー、又はバイオマーカー若しくはパネルの相対的又は絶対的な量を測定する。試薬を使用して、抗体免疫特異的なバイオマーカー等のバイオマーカーを捕捉してもよく、バイオマーカーは酵素結合免疫特異的測定法等の間接的測定により検出可能な、リガンドバイオマーカー対を形成する。単一分析物ＥＩＡ又は多重化分析のいずれかを実行し得る。多重化分析は、単一の血清サンプルを使用して、多数の同時のＥＩＡベースの測定法を実行できる技術である。非常に少量のサンプル容積中の多数のバイオマーカーを定量化するのに有用な１つのプラットホームは、Ａｕｓｔｉｎ，ＴｅｘａｓのＲｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ所有）により使用されるｘＭＡＰ（登録商標）技術であり、光学的分類スキーム、生化学的測定法、フローサイトメトリー並びに高度なデジタル信号処理ハードウェア及びソフトウェアを組み合わせることにより、単一の反応容器内で１００に至る多重化ミクロスフェアベースの測定法を実行する。この技術では、多重化は、分析物特異的なそれぞれの測定法に、固有の蛍光サインで標識されたミクロスフェアセットを割り当てることにより達成される。多重化測定法は流通装置内で分析され、この装置は、ミクロスフェアが赤色及び緑色レーザーを通過する際に各ミクロスフェアを個々に調べる。代替的に、方法及び試薬を使用して、質量、電荷又は組み合わせ、例えばＳＥＬＤＩを用いる等の直接物理的測定を用いて、サンプルを検出及び可能な定量化のために加工する。ＮｅｘｔＧｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）により提供されるもの等、定量的質量分析による多数反応監視測定法が開発されている。
【００５９】
したがって、本発明の一態様によれば、ＡＳ状態の評価のためのバイオマーカーの検出は、対象からのサンプルを、バイオマーカーと試薬との結合を可能にする条件下で基質、例えば、上部に捕捉試薬を有するプローブと接触させた後、吸着剤に結合されたバイオマーカーを好適な方法により検出することを含む。マーカーを検出する１つの方法は、気相イオン分光法、例えば質量分析法である。この目的に使用し得る他の検出パラダイムには、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリー（voltametry）、電流測定又は電気化学蛍光法）、原子力顕微鏡及び高周波法、例えば多重共鳴分光法（multipolar resonance spectroscopy）が挙げられる。顕微鏡法に加えて、共焦点及び非共焦点の両方の光学的方法の例は、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率の検出（例えば表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、回折格子結合器導波管法（grating coupler waveguide method）又はインターフェロメトリー）、並びに酵素結合比色分析又は蛍光法である。
【００６０】
患者からの標本は、検出方法に適用する前に、非限定的に、マーカーを標本の他の成分から濃縮、精製又は分離する方法等の方法で、加工済み標本又はサンプルに加工する必要があり得る。例えば、分析物濃度の検出方法に供される前に、血液サンプルを典型的には抗凝固薬で処理し、細胞成分及び血小板を除去する。代替的に、検出は連続加工システムにより達成されてもよく、前記システムは、材料及び試薬を組みこんで、そのような濃縮、分離又は生成工程を達成し得る。一実施形態において、加工システムは、捕捉試薬の使用を含む。捕捉試薬の１つのタイプは、典型的にはクロマトグラフィーで使用される材料である「クロマトグラフィー吸着剤」である。クロマトグラフィー吸着剤には、例えばイオン交換材料、金属キレーター、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、染料、単純生体分子（例えばヌクレオチド、アミノ酸、単糖及び脂肪酸）、混合モード吸着剤（例えば疎水性誘引／静電反発吸着剤）が挙げられる。「生体分子特異的」捕捉試薬は、生体分子、例えばヌクレオチド、核酸分子、アミノ酸、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド又はこれらの抱合体（例えば糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質）である捕捉試薬である。所定の場合に、生体分子特異的吸着剤は、多タンパク質複合体、生体膜又はウイルス等の巨大分子構造であってもよい。具体的な生体分子特異的吸着剤は、抗体、受容体タンパク質及び核酸である。生体分子特異的吸着剤は、一般に、クロマトグラフィー吸着剤と比較して高い、標的分析物に対する特異性を有する。
【００６１】
したがって、本発明によるバイオマーカーの検出及び定量化は、所定の選択性状況、例えば吸着剤又は洗浄溶液を使用することにより向上される。洗浄溶液とは、吸着剤表面に対する分析物の吸着に影響を与え若しくは前記吸着を変更し、及び／又は表面から未結合材料を除去するのに使用される、典型的には溶液である薬剤を指す。洗浄溶液の溶出特性は、例えばｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピズムの程度、洗剤強度、及び温度に依存し得る。
【００６２】
本発明の一態様では、サンプルは多重化様式で分析され、これは患者サンプルからのマーカーの加工が実質的に同時に行われることを意味する。一態様において、サンプルは固有の特異性を示す多数の捕捉試薬を含む基質により接触される。捕捉試薬は、通常、免疫特異的な抗体、又はその断片である。基質は、捕捉試薬（１つ又は複数）が取り付けられる一般に平面状の表面を有する固体基質を示す用語である「バイオチップ」等の単一成分であってもよく、又は捕捉試薬は、多数の基質の間で分離され、例えば、個々の球状の基質（ビーズ）に結合していてもよい。度々、バイオチップの表面は、複数の指定可能な位置を含み、前記位置のそれぞれには捕捉試薬が結合されている。バイオチップは、プローブインターフェイスと係合するよう適合されてもよく、それにより、気相イオン分光法、好ましくは質量分析法においてプローブとして機能する。代替的に、本発明のバイオチップは別の基質上に装着されて、分光計内に挿入され得るプローブを形成してもよい。ビーズの場合、個々のビーズは、サンプルに暴露された後、検出のために分配又は選別されてもよい。
【００６３】
本発明によるバイオマーカーの捕捉及び検出のために、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ ＣＴ）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）及びＰｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｏｒｐ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）等の商業的供給源から多様なバイオチップが入手可能である。これらのバイオチップの例は、前述の米国特許第６，２２５，０４７号及び同第６，３２９，２０９号（Ｗａｇｎｅｒら）、並びにＷＯ ９９／５１７７３号（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ及びＷａｇｎｅｒ）、ＷＯ ００／５６９３４号（Ｅｎｇｌｅｒｔら）に記載されているものであり、特に、Ｗｏｈｌｓｔａｄｔｅｒら、ＷＯ９８／１２５３９及び米国特許第６０６６４４８号に教示されている多特異的、多アレイ等の、サンプル中の分析物マーカーの存在又は量の検出に電気化学的方法及び電気化学発光方法を使用するものである。
【００６４】
生体分子特異的な捕捉及び／又は検出試薬を有する基質を、例えば血清を含むサンプルと、存在し得るバイオマーカーが試薬に結合できるのに十分な期間接触させる。本発明の一実施形態では、上部に生体分子特異的な捕捉又は検出試薬を有する２つ以上のタイプの基質を、生物サンプルと接触させる。インキュベーション期間後、基質を洗浄して、未結合材料を除去する。任意の好適な洗浄溶液を使用することができ、好ましくは水性溶液が使用される。
【００６５】
基質に結合したバイオマーカーは、脱着後に直接、飛行時間型質量分析計等の気相イオン分光計を使用することにより検出される。バイオマーカーはレーザー等のイオン化源によりイオン化され、生成されたイオンはイオン光学アセンブリにより収集された後、質量分析器が、通過するイオンを分散及び分析する。次いで、検出器が、検出イオンの情報を質量対電荷比に翻訳する。バイオマーカーの検出は、一般に、信号強度の検出を含むであろう。したがって、バイオマーカーの量及び質量の両方が決定され得る。そのような方法はバイオマーカーの発見に使用することができ、ある場合には、バイオマーカーの定量化に使用することができる。
【００６６】
別の実施形態では、本発明の方法は、例えば米国特許第５５７１４１０号及びＵＳＲＥ３６３５０号に教示されているような、液相中の小分子及び／又は巨大分子溶質の検出及び分析に有用な、液体サンプル取り扱いを小型化できるミクロ流体装置、及び液相分析のための分析装置であり、場合により、クロマトグラフィー分離手段、電気泳動分離手段、通電クロマトグラフィー分離手段、又はそれらの組み合わせを使用する。ミクロ流体装置又は「ミクロ装置」は、分析物流体が分離され得るよう配置された多数のチャネルを含んでもよく、それによりバイオマーカーが捕捉され、場合により装置内の指定可能な位置で検出されることができる（米国特許第５６３７４６９号、同第６０４６０５６号及び同第６５７６４７８号）。
【００６７】
バイオマーカーの検出により生成したデータは、プログラム可能なデジタルコンピュータの使用により分析され得る。コンピュータプログラムはデータを分析して、検出されたマーカーの数と信号強度とを示す。データ分析は、バイオマーカーの信号強度を決定する工程と、所定の統計分布から逸脱したデータを除去する工程とを含んでもよい。例えば、データはある参照に対して正規化されてもよい。コンピュータは、得られたデータを表示のために、又は所望であれば更なる分析のために、様々なフォーマットに変換し得る。
【００６８】
人工ニューラルネットワーク
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークが使用される。ニューラルネットワークは、マーカーの選択されたセットのために構成され得る。ニューラルネットワークは、二段階回帰又は分類モデルである。ニューラルネットワークは層構造を有し、層構造は、重み層により出力ユニットの層に接続された入力ユニット（及びバイアス）の層を含む。回帰のために、出力ユニットの層は、典型的には１つのみの出力ユニットを含む。しかしながら、ニューラルネットワークは、途切れのない様式で、多数の定量的応答を取り扱うことができる。
【００６９】
多層ニューラルネットワークには、入力ユニット（入力層）、隠れユニット（hidden unit）（隠れ層（hidden layer））及び出力ユニット（出力層）が存在する。更に、入力ユニット以外の各ユニットに接続された単一のバイアスユニットが存在する。ニューラルネットワークは、Ｄｕｄａら、２００１，Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ａｍｐ；Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＨａｓｔｉｅら、２００１，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【００７０】
ニューラルネットワークを使用する基本的な手法は、未学習ネットワークから開始し、訓練パターン、例えば訓練データセット内の患者からのマーカープロファイルを入力層に提示し、ネットを介して信号をパスし、出力、例えば訓練データセット内の患者の予後を出力層にて決定する。次いで、これらの出力は標的値、例えば訓練データセット内の患者の実際の成果と比較され、差異は誤差に対応する。この誤差又は基準関数は、ある重みのスカラー関数であり、ネットワーク出力が所望の出力と一致した際に最小限となる。したがって、重みはこの誤差の測定値を低減するよう調整される。回帰では、この誤差は、誤差平方和であってもよい。分類では、この誤差は、平方誤差又はクロスエントロピー（偏差）のいずれかであってもよい。例えばＨａｓｔｉｅら、２００１，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００７１】
通常使用される３つの訓練プロトコルは、確率、バッチ及びオンラインである。確率訓練では、訓練セットからパターンがランダムに選択され、各パターン提示のためにネットワーク重みが更新される。確率的バックプロパゲーション等の勾配降下法により学習された多層非線形ネットワークは、ネットワークトポロジーにより規定されるモデルにて重み値の最尤法を実行する。バッチ訓練では、学習が行われる前に、全パターンがネットワークに提示される。典型的には、バッチ訓練では、訓練データにより数個のパスが形成される。オンライン訓練では、各パターンが１回提示され、ネットに１回のみ提示される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、重みのために出発値が考慮される。重みがほぼ０の場合、ニューラルネットワークの隠れ層に通常使用されるシグモイドの有効部分（例えばＨａｓｔｉｅら、２００１，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）は、大体線形であるため、ニューラルネットワークは、およそ線形モデルに崩壊する。いくつかの実施形態では、重みのための出発値は、ほぼ０であるランダム値であるよう選択される。したがって、モデルはほぼ線形から出発し、重みが増大するにつれて非線形となる。個々のユニットは方向に局在し、必要に応じて非線形性を導入する。正確な０の重みの使用は、０誘導体及び完全な対称性をもたらし、アルゴリズムは決して動かない。代替的に、大きい重みは度々乏しい解をもたらす。
【００７３】
入力のスケーリングは、ボトム層の重みの効果的なスケーリングを決定するため、最終的な解の品質に大きい影響を与え得る。したがって、いくつかの実施形態では、平均０及び標準偏差１を有するように最初に全発現値を標準化する。このことは全入力が正則化プロセスにて等しく処理されることを確実にし、ランダムな開始重みのための重要な範囲を選択することを可能にする。標準化入力と共に、範囲−０．７、＋０．７に亘りランダムな均一重み（random uniform weight）をとるのが典型的である。
【００７４】
隠れ層を有するネットワークを使用する際に頻発する問題は、ネットワーク内で使用する最適な数の隠れユニットである。ネットワークの入力及び出力数は、解決するべき問題によって決定される。本明細書に開示した方法では、所定のニューラルネットワークのための入力数は、選択されたマーカーのセットにおけるマーカーの数であってもよい。
【００７５】
ニューラルネットワークのための出力の数は、典型的には１つのみ、肯又は否であるが、いくつかの実施形態では２つ以上の出力が使用されて、２つのみを越える状態がネットワークによって定義される。
【００７６】
データの分析に使用されるソフトウェアは、信号の分析にアルゴリズムを適用するコードを含んで、信号が本発明によるバイオマーカーに対応する信号におけるピークを提示するか否かを決定することができる。ソフトウェアは観察されたバイオマーカー信号に関するデータを分類木又はＡＮＮ分析に供して、バイオマーカー、又は、患者の疾病診断又は状態を示すバイオマーカー信号の組み合わせが存在するか否かを決定することもできる。
【００７７】
したがって、プロセスは、学習段階と分類段階とに分割され得る。学習段階において、学習アルゴリズムは、分類が意図される異なるクラスのメンバーを含むデータセット、例えばＡＳと診断された及び抗−ＴＮＦα療法に応答した患者からの複数のサンプルからのデータ、及び陰性成績を有する患者、抗−ＴＮＦα療法に応答しなかったＡＳ患者からの複数のサンプルからのデータに適用される。データの分析に使用される方法には、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、遺伝子アルゴリズム及び自己組織化マップ並びに分類及び回帰木分析が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、例えばＷＯ０１／３１５７９号、２００１年５月３日（Ｂａｒｎｈｉｌｌら）；ＷＯ０２／０６８２９号、２００２年１月２４日（Ｈｉｔｔら）及びＷＯ０２／４２７３３号、２００２年５月３０日（Ｐａｕｌｓｅら）に記載されている。学習アルゴリズムは、通常、組み合わせで特定のマーカー及び特定のマーカーの濃度等のデータに適するよう調整された分類アルゴリズムを生成し、このアルゴリズムは、未知サンプルを２つのクラス、例えば非応答者に対する応答者に分類し得る。分類アルゴリズムは、最終的に予測的試験に使用される。
【００７８】
データ内のパターンを分析し、また成功のために任意の所定の基準を用いて追加のパターンを考案するためのフリーウェア及び専売ソフトウェアの両方のソフトウェアが容易に入手可能である。
【００７９】
キット
別の態様では、本発明は、ゴリムマブ等の抗−ＴＮＦα剤を用いた処置に応答するか又は応答しないかを決定するためのキットを提供し、キットは、本発明に従って血清マーカーを検出するのに使用される。キットは、ＡＳ患者内で異なるように存在する血清マーカー及びマーカーの組み合わせの存在に関してスクリーニングする。
【００８０】
一態様において、キットはサンプルを収集するためのランセット（lance）又は穿刺ツール等の、皮膚の「突き刺し」を生じる手段を含む。キットは、場合によりスティックから血液を収集するための、毛細管等のプローブを含んでもよい。
【００８１】
一実施形態において、キットは、本発明によるマーカーを結合する、生体特異性の１つ以上の捕捉試薬を有する基質を含む。キットは、それぞれ同一の又は異なる基質上に存在する、１つ（one）以上の生体特異性の捕捉試薬を含んでもよい。
【００８２】
更なる実施形態では、そのようなキットはラベル又は別個の挿入物の形態を有する、好適な操作パラメータに関する指示書を含んでもよい。例えば、指示書は、サンプルの収集法、又はプローブを空にし若しくは洗浄する方法を、消費者に知らせ得る。更なる別の実施形態では、キットは、検定（calibration）のための基準として使用されるバイオマーカーサンプルを有する１つ以上の容器を含んでもよい。
【００８３】
抗−ＴＮＦ療法に対するＡＳ患者の応答を予測するための本発明のアルゴリズムの使用方法では、抗−ＴＮＦ療法の前と、治療法の開始後の特定の期間とに、血液又は他の流体が患者から獲得される。血液は血清部分を抽出するために加工され、又は全体が使用されてもよい。血液又は血清サンプルは、例えば１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、又は１：１００に希釈され、又は未希釈で使用されてもよい。１つのフォーマットでは、血清又は血液サンプルは既成の試験ストリップ又はスティックに適用され、室温で、１分間、５分間、１０分間、１５分間、１時間又はそれ以上等の特定の時間中インキュベートされる。特定の測定法の時間後、サンプル及び結果は、ストリップから直接読み取り可能である。例えば、結果は、１つ以上のマーカーの濃度範囲を示す、着色帯又は灰色帯の様々な色合いとして出現する。試験ストリップキットは、１つ以上のマーカーの相対的な濃度に基づいて結果を解釈するための指示書を提供するであろう。代替的に、ストリップ上のマーカー検出システムの彩度を検出可能な装置を提供してもよく、この装置は、場合により、その一連のマーカーに関する適切な診断アルゴリズムに基づいて試験解釈の結果を提供してもよい。
【００８４】
本発明の使用方法
本発明は、ＡＳと診断された患者において検出されたバイオマーカーを分析することによる、ゴリムマブ等の抗−ＴＮＦα剤による治療法に対する応答性を予測する方法を提供する。本発明の方法では、患者は、主観的及び客観的基準を使用して、経験豊かな専門家によりＡＳと最初に診断される。
【００８５】
ＡＳの発病に関する継続した研究は、開始因子の識別、下流事象、炎症のメディエータ、及びプロセスの制御因子に焦点を当てている。ＡＳ発症危険性のおよそ９０％が遺伝性であると推定されている。最強の遺伝的危険性因子は、ＨＬＡ−Ｂ２７分子に関連している。危険性に果たすＨＬＡ−Ｂ２７の重要な役割を前提として、数個の可能な機構が提案されている。しかしながら、強い興味及び活発な研究にも関わらず、ＨＬＡ−Ｂ２７がどのように疾病の罹り易さに寄与しているかの一般的な見解は未だ存在しない。環境因子の役割は尚理解しづらく、ＡＳが靱帯及び腱の骨に対する結合（腱付着部）に関与し、又は仙腸関節に関与する傾向の理解も同様である。
【００８６】
ＡＳの主要な臨床的特徴には、仙腸関節炎により生じる炎症性背部痛、軸方向骨格内の他の位置の炎症、末梢関節炎、腱付着部炎及び前部ぶどう膜炎が挙げられる。構造的変化は、骨低下（osteodestruction）ではなく、主に骨増殖により生じる。靱帯骨棘及び関節強直は、この疾病の最も独特な特徴である。ＡＳの独特な症状は、腰痛、殿部痛、制限された脊椎可動性、股関節痛、肩部痛、末梢関節炎及び腱付着部炎である。神経症状は、疾病の数個の合併症による索又は脊髄神経の圧迫により生じ得る。強直した脊柱を有する患者に脊椎骨折が発生し、外傷は最小限又は存在しない。最も通常の骨折部位は、Ｃ５−６間隙である。ＡＳ患者の２１％に臨床的に有意な環軸椎亜脱臼が生じる場合があり、環軸椎亜脱臼は脊髄圧迫に繋がり得る。馬尾症候群は、長期にわたるＡＳの希な合併症であり、その原因の理解は乏しく、炎症、くも膜炎、機械的伸展（mechanical stretching）、神経根の圧迫、脱髄及び虚血を含む。
【００８７】
臨床的評価方法
ＡＳの診断は、１９８４ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ Ｓ，Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇ ＨＡ，Ｃａｔｓ Ａ：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ．Ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｃｒｉｔｅｒｉａ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２７：３６１〜３６８，１９８４）により規定されるいくつかの撮像技術による仙腸関節炎の臨床的特徴と証拠との組み合わせにより行われる。赤血球沈降速度（ＥＳＲ）及びＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル等の、疾病の研究室マーカーは、疾病活性の評価、又は処置に対する応答の監視には役立たないことが示されている（Ｓｐｏｏｏｒｅｎｂｅｒｇ Ａら、１９９９ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２６：９８０〜４）。
【００８８】
臨床的基準は、１）腰痛及び３ヶ月を越える持続時間における硬直、該硬直は、運動により改善するが安静により軽減されない、２）矢状及び前頭（冠状）面の両方における腰椎の動きの制限、３）年齢及び性別で補正された正常値と比較した胸郭拡張の制限である。放射線学的基準は、両側仙腸関節炎グレード２以上、又は片側グレード３以上である。仙腸関節炎の放射線学的等級付けは、５つのグレードからなる。グレード０は正常な脊椎であり、グレード１は疑わしい変化を示し、グレード２は幾分の侵食を有する硬化を示し、グレード３は重篤な侵食、関節腔の偽拡張、及び部分的な関節強直を示し、グレード４は完全な関節強直を示す。明確なＡＳは、１つの放射線学的基準が、少なくとも１つの臨床的基準と関連した際に存在する。ＡＳの高い可能性は、３つの臨床的基準が存在し、又は放射線学的な基準が存在し、かつ臨床的基準を満足する徴候若しくは症状が存在しない場合に考慮される。臨床的グレードをデータセットの一部として使用して、治療法に対する応答の予測的アルゴリズムを生成してもよい。
【００８９】
ＡＳの診断が確立されたら、医師は一般に、臨床成果を長軸方向に監視して、疾病の悪化の危険性にある患者を同定する。強直性脊椎炎の評価試験群（ＡＳＡＳ）は、管理のための疾病の多数のコアパラメータを規定している。ＡＳ患者の疼痛は、通常、背部に限定されるが、軸方向外の部位（extra-axial site）は、末梢疾病所見を有する患者における鎮痛療法の主な焦点であり得る。単一の１００ｍｍ水平視覚的アナログ目盛り（ＶＡＳ）を使用して、夜間及び通常の脊椎痛を測定する。抗−ＴＮＦ療法で処置されたＡＳ患者において、ＡＳＡＳは応答基準を開発している。これら基準のうちの数個は下記に概略され、又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ若しくはリウマチ学者との接触により得ることができる。
【００９０】
ＡＳＡＳ２０は「スコア」の生成に使用される数個の基準の２０％改善を反映している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＪら、２００１ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４４：１８７６〜１８８６）。ＡＳＡＳ改善基準は、処置に対する陽性応答を、第１に、２０％の相対的な改善、第２に、１０ユニットの３〜４のドメイン（炎症、機能、疼痛の患者知覚、及び患者の全体的な健康、第４のドメインの悪化がない）における明白な改善として規定する。
【００９１】
ＢＡＳＤＡＩ（Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾病活性インデックス）は、ＡＳ患者における炎症活性を規定する。炎症は、不快感の程度、及び患者が経験する朝硬直を評価することにより、臨床的に評価され得る。ＢＡＳＤＡＩは自己管理インデックスであり、各質問は、１００ｍｍ ＶＡＳ内に構成されている（範囲０〜１００、０＝硬直なし、１００＝非常に重篤な硬直）。スコアは処置による変化に敏感であることが示されている。
【００９２】
ＢＡＳＭＩ（Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測学インデックス）は、定量的な、医師が評価した、ＡＳ患者が経験する脊椎可動性の制限の尺度である。ＢＡＳＭＩは、５つの臨床的測定値からなる有効なインデックスであり、該測定値は、頸部回転、耳株から壁迄の距離、側棘屈曲（lateral spine flexion）、腰椎屈曲、及び軸方向分節関与を反映する果間距離である。ＢＡＳＭＩは良好な観察者間の信頼性を示すことが証明されているが、急性炎症の結果としての物理的制約を、慢性疾病損傷により生じるものと区別することができない。患者の寿命に亘るＢＡＳＭＩの進行を示す、発行されている長軸方向の研究は存在しないが、患者のＢＡＳＭＩスコアは、ＡＳ患者が進行性疾病を発症するにつれて時間の経過と共に徐々に増大することが仮定される。ある場合に、ＢＡＳＭＩを脊髄Ｘ線写真と相関付けることにより、Ｘ線像上の損傷の存在との有意な相関が示された。
【００９３】
ＢＡＳＦＩ（Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能性インデックス）は、物理的機能の尺度を使用して、連日の任務を実行する患者の能力の限界の程度を評価する。物理的機能は、ＢＡＳＦＩ及びＤｏｕｇａｄｏｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｄｅｘ（ＤＦＩ）を使用して測定される。しかしながら、ＢＡＳＦＩは、診療及び臨床試験の両方で最も広く使用されている尺度である。
【００９４】
本明細書に記載される臨床的インデックスは患者データセットの一部であり、数値スコアを割り当て得ることが認識されるであろう。
【００９５】
以前の治療法の失敗
ＡＳＡＳは、ＡＳにおける抗−ＴＮＦ療法の必要性に関する合意書を準備している（Ｂｒａｕｎら、２００３ Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６２：８１７〜８２４）。軸方向疾病、末梢関節及び腱付着部炎のＡＳの３つの全提示に関して、処置の失敗を少なくとも３ヶ月の標準的なＮＳＡＩＤ処置の試験として定義した。抗−ＴＮＦ療法を開始する前、患者は、最大推奨又は最大許容抗−炎症投与量の使用に基づいて、これらの薬物が矛盾しない限り、少なくとも２つのＮＳＡＩＤの十分な治療的試験を有している必要がある。
【００９６】
軸方向疾病、末梢関節及び腱付着部炎の３つ全部に関して、ＮＳＡＩＤ処置の失敗が必要である。
症候性軸方向疾病では、抗−ＴＮＦ療法の開始前に追加の処置を必要としない。
症候性末梢関節では、少関節炎において関節内コルチコステロイド処置（少なくとも２回の注射）の失敗が通常必要とされる。矛盾せず又は許容不可能でない限り、３ｇ／日迄のｍ最大許容投与量における、スルファサラジンを用いた標準的なＤＭＡＲＤ処置を４ヶ月間処方される必要がある。
症候性腱付着部炎では、少なくとも２回の局所ステロイド注射からなる十分な治療的試験が、これらの注射が矛盾しない限り、通常必要である。
【００９７】
ＴＮＦａ療法に対する適合性
インフリキシマブ等の抗−ＴＮＦα剤は市販されており、数年に亘りＡＳの処置に使用されている。抗−ＴＮＦα剤は、強直性脊椎炎の劇的な改善をもたらし、疾病の異なる症状を寛解させ、生活の質を向上させることが示されている。ＡＳ患者は、臨床評価を越える追加の基準、場合により、ＮＳＡＩＤｓ及び理学療法、スルファサルジン（sulfasalzine）又はメトトレキサート又はビスホスホネート等の等の代替療法に応答しないことに基づいて、抗−ＴＮＦα療法の候補者として考慮され得る。
【００９８】
患者管理
抗−ＴＮＦ療法に対する早期応答を予測又は評価するための本発明の方法では、抗−ＴＮＦ療法の開始前の「ベースライン訪問」時に、抗−ＴＮＦ療法で処置される患者からベースライン、即ち、「第０週」のサンプルを獲得する。サンプルは、本発明の方法に関連したバイオマーカーを評価し得る任意の組織であってもよい。一実施形態において、サンプルは、血液、血清、尿、精液及び便からなる群から選択される流体からなる群から選択される流体である。特定の実施形態では、サンプルは、直接静脈穿刺又は静脈カテーテルを介した標準的な方法により引かれた患者の血液から得られた血清サンプルである。
【００９９】
加えて、ベースライン訪問において、ＡＳを有する患者の個体群統計学及び病歴に関する情報が、標準化された書式又は症例記録表に記録されるであろう。患者の診断からの時間、以前の処置歴、併用薬物療法、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル、及び疾病活性の評価（即ち、ＢＡＳＤＡＩ、ＢＡＳＭＩ）等のデータが記録される。
【０１００】
患者は、ベースライン訪問の時、又は２４〜４８時間以内に抗−ＴＮＦ療法の第１の投与を受ける。ベースライン訪問時、患者は第４週の訪問について予定を決められる。
【０１０１】
第４週の訪問では、抗−ＴＮＦα療法の初期投与からおよそ２８日後、好ましくはベースラインサンプルと同一のプロトコル及び経路を使用して、第２の患者サンプルが獲得される。患者を検査し、医療専門家が禁止したような他のインデックス、撮像若しくは情報、又は指定された試験設計を実行又は監視してもよい。患者は、ＡＳＡＳ及びＢＡＳＤＡＩに示されたセット等の基準を用いた疾病の評価と、バイオマーカー評価のための患者サンプルの獲得とを行う目的で、第８週、第１２週、第１４週、第２８週等の次の訪問の予定が決められる。
【０１０２】
処置前、処置中又は処置後の任意の時間又は上記の時間において、患者のサンプル又は患者から獲得した他の流体若しくは組織サンプル中で、他のパラメータ及びマーカーを評価してもよい。それらにはヘモグロビン含有量、ヘマトクリット、赤血球容積、平均赤血球径、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）等の標準的な血液学的パラメータが含まれてもよい。ＡＳの存在の評価に有用であると測定されている他のマーカーは、患者のサンプルのいくつか又は全部にて定量化されてもよく、前記他のマーカーは、ＣＲＰ（Ｓｐｏｏｒｅｎｂｅｒｇ Ａら、１９９９．Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２６：９８０〜９８４）及びＩＬ−６、並びに血清１型Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、尿中ＩＩ型コラーゲンＣ−テロペプチド（尿中ＣＴＸ−ＩＩ）及び血清マトリクスメタロプロテアーゼ（metalloptrotesase）３（ＭＭＰ３、ストロメライシン１）（米国特許第２００７０１７２８９７号参照）等の軟骨分解のマーカーである。
【０１０３】
処置に対する応答の評価に有用であり得る追加の炎症関連のマーカーは、ＩＬ−８又はＩＬ−１等の炎症性サイトカイン、ＥＮＡ−７８／ＣＸＣＬ５、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１β等の炎症性ケモカイン；血管新生関連のタンパク質（ＥＧＦ、ＶＥＧＦ）；ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１等の追加のプロテアーゼ；ＩＦＮγ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０等の細胞性免疫システム（ＴＨ−１）上に作用する分子；並びにＩＬ−４及びＩＬ−１３を含む体液性免疫システム（ＴＨ−２）上に作用する分子；ＦＧＦ塩基性等の増殖因子；ミエロペルオキシダーゼを含む炎症の一般的マーカー；並びにＩＣＡＭ−１等の接着関連分子であってもよい。
【０１０４】
医療専門家による応答の臨床的判断は、試験結果により否定されるべきではない。しかしながら、試験はゴリムマブによる処置を中止する決定を行う補助となり得る。予測モデル（アルゴリズム）が９０％感度及び６０％特異性を有する試験では、５０％の患者が臨床応答を示し、５０％が評価スコア又は評価を示さない場合、臨床応答と一致する。これは、応答者のうち４５％が正確にＡＳ応答者と同定され（５人が非応答者の可能性があると報告される）、３０％又は非応答者が正確に非応答者として同定される（２０％が応答者の可能性があると区別される）ことを意味する。したがって、全体的な利益は、６０％の全員の真の非応答者が不必要な治療法を割愛し、又は早期の時間点（第４週）で治療法を中止することである。５％の偽陰性「応答者」（非応答者の可能性があると同定）は処置されており、全患者と同様、前記応答者の応答は、第１４週又はその後の処置を連続する又は中止する決定を行う前に、臨床的に判断されるであろう。２０％の偽陰性「非応答者」（可能な応答者と同定）は、臨床的に判断される必要があり、処置の中止の決定を行うのに通常の時間を要するであろう。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：試料採取及び解析
Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｃ０５２４Ｔ０９、多施設ランダム化、二重盲、プラセボ対照、３−アーム試験に登録した患者から血清サンプルを獲得し評価した。３つのグループは、プラセボと、抗−ＴＮＦα Ｍａｂ処置の２つの用量レベルとからなり、ゴリムマブ５０ｍｇ、又はゴリムマブ１００ｍｇが活動性強直性脊椎炎を有する患者内の４週間毎のＳＣ注射として投与される。一次有効性評価は、第１４週及び第２４週に行った。バイオマーカー試験用の血清サンプルを、１００人の患者からベースライン（第０週）、第４週及び第１４週にて収集した。
【０１０６】
Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、又は単一分析物ＥＬＩＳＡにより実行される多重分析を用いた、市販の測定法により血清のバイオマーカーを分析した。全サンプルを、試験迄、−８０℃で保管した。サンプルを室温で解凍し、ボルテックスし、清澄のために１３，０００×ｇで５分間高速回転させ、抗原分析のために１５０ｕＬをマスターマイクロタイタープレート内へと除去した。自動化ピぺッティングを用いて、各サンプルのアリコートを分析物の捕捉ミクロスフェア多重物（multiplex）の１つに導入した。サンプルと捕捉ミクロスフェアとのこれらの混合物を徹底的に混合し、室温で１時間インキュベートした。各多重物のためのビオチン化、レポーター抗体の多重化カクテルを使用し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンを使用して検出した。分析はＬｕｍｉｎｅｘ １００器具及内で実行され、得られたデータ流は、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより開発され、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓに使用許諾された専売のデータ分析ソフトウェアを使用して解釈した。各多重物のために、較正器及びコントロールの両方を作動させた。試験結果は、最初、各多重物に関して、高、中及び低コントロールについて決定して、適切な測定法の遂行を確実にした。特定の多重物中に局在するそれぞれの分析物の未知の値は、データ分析パッケージ内に含まれる４つ及び５つのパラメータ、重み付き及び非重み付き曲線適合アルゴリズムを使用して決定した。各時間点において、合計９２のタンパク質バイオマーカーを測定した（表１）。
【０１０７】
【表２−１】
【０１０８】
【表２−２】
【０１０９】
【表２−３】
【０１１０】
９２のバイオマーカーのそれぞれは、定量下限（ＬＯＱ）を有する。分析にバイオマーカーを使用する基準は、バイオマーカーが少なくとも２０％のサンプルにおいて定量限界を越えることを必要とした。３００のサンプルからの９２のバイオマーカのうち、６３（６８％）が、分析に含まれるためのその基準を満たした。各バイオマーカーの分布の評価を行って、そのバイオマーカーのｌｏｇ変換が保証されたか否かを決定した。この評価は、処置群に関わりなく行った。全体で、分析セット内の６３のバイオマーカーのうちの６０がｌｏｇ２変換された。表２は、最終分析に含まれたバイオマーカー、ＬＯＱ、及びｌｏｇ変換が可能であったか否かを同定する。
【０１１１】
追加のベースラインバイオマーカー分析
所定のマーカーが多重試験メニューに含まれなかったため、Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ多重分析に加えて単一のＥＩＡ方法を使用して、血清バイオマーカーデータの追加のセットを生成した。追加のマーカーを多重バイオマーカーデータセットと組み合わせて、単一及び多重マーカーの組み合わせに基づくモデル正確性を決定した。これらのデータは、予測的モデルの一部のみとして含まれた。
【０１１２】
【表３−１】
【０１１３】
【表３−２】
【０１１４】
サンプル相関マトリックスからの平均対相関も評価し、全サンプルは、他のサンプルと少なくとも平均８９％の相関を示し、バイオマーカーデータは対象サンプル全体で一貫していることを示した。
【０１１５】
バイオマーカーに関する要約統計量を、表３に示す。ベースラインバイオマーカーレベルの分布は、一般に、３つの処置群の全体で均衡していた。
【０１１６】
【表４−１】
【０１１７】
【表４−２】
【０１１８】
ゴリムマブ処置群では、多数のマーカーが、ベースラインレベルから第４週及び第１４週へと有意に変化した。プラセボ処置対象では、遙かに限定されたマーカーのセットが変化した。一般に、２つのゴリムマブ用量群の間の差異は、有意ではなかった。対象内でのベースラインからの変化を、ゴリムマブ群（組み合わせた用量群）とプラセボ群との間で比較した。測定されたマーカーのおよそ半分が、ゴリムマブとプラセボとの間で、ベースラインからの変化の有意な差異を示し（表４）、５）は、組み合わせたゴリムマブ群とプラセボ群との間で、ベースラインからの変化の有意な（ｐ＜０．０１）差異を有するマーカーを示す。
【０１１９】
【表５】
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
実施例２：マーカー及び関連性
予測的モデル又はアルゴリズムを構築するために、マーカーデータを試験の臨床エンドポイントに関連して評価した。この試験では、ＡＳＡＳ２０第１４週、ＡＳＡＳ２０第２４週、ＢＡＳＭＩにおける変化第１４週、ＢＡＳＦＩにおける変化第１４週、及びＢＡＳＤＡＩにおける変化第１４週と規定される６つの臨床エンドポイントが存在した。これらの試験エンドポイントは、患者の疾病状態を評価するための一般に受け入れられている臨床的方法である。タンパク質バイオマーカーのサブ試験における１００人の患者と、収集された試験エンドポイントとを下記に示す（表６）。
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
表７に、臨床応答の一次エンドポイントを示し、エントリーは群の応答者／全体を表す。これは、バイオマーカーサブ試験の主な焦点ではないが、このコホート内で臨床エンドポイントに対する処置効果を評価するために試験を解釈することに尚役立つ。表７に示すように、ゴリムマブ処置群の応答は、ＢＡＳＭＩを除いて、評価した臨床エンドポイントの範囲全体で、プラセボに対して有意に上位であった。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
タンパク質マーカー試験に参加している試験患者において、性別が６つの臨床エンドポイントのうちの３つに有意に関連していた（表８）。性別は多数のタンパク質バイオマーカーとも有意に関連していた。そのため、性別はバイオマーカー値と臨床エンドポイントとの間の関連性を試験されるモデルを調整するための共変数として使用された。この調整を有さない場合、性別と相関したマーカー（例えば、前立腺特異的抗原）は、臨床エンドポイントに関連しているように見えるが、性別／エンドポイントの相関のアーチファクトであろう。ＣＲＰは、通常ＡＳと関連したマーカーであるが、この試験では、ＣＲＰのベースライン値は臨床エンドポイントと統計的に相関しなかった。
【０１２６】
【表９】
【０１２７】
実施例３：予測モデル構築
ベースライン、第４週、及び第１４週においてバイオマーカーの関連性に関して評価した。これらの分析から、数個の知見が現れた。調べた９２個のマーカーのうち、臨床応答と有意に関連したものは殆ど存在しなかった。有意な効果を示したマーカーと、これらのマーカーに関するマーカーとエンドポイントとの関係は、数個の一次及び二次エンドポイントの全体で概ね一貫していた。臨床成課上に用量効果が存在しなかったため、使用したデータはゴリムマブ処置群（全患者はゴリムマブを受容）と組み合わせた。バイオマーカーをベースライン、第４週及び第１４週において、関連性に関して評価した。
【０１２８】
全ての分析は、Ｒ（Ｒ：Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２００８，Ａｕｔｈｏｒ：Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ，Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，ＩＳＢＮ ３−９０００５１−０７−０）を使用して実行した。ベースラインからの変化は、１−サンプルｔ−試験を用いて試験した。臨床因子とベースラインバイオマーカーとの関連は、ロバスト線形回帰モデルを使用して評価した。ロバストロジスティック回帰モデルを使用して、バイオマーカーと臨床エンドポイントとの関連を試験した。肯／否である臨床エンドポイント変数は、１／０コードを使用した。連続的な臨床エンドポイントは、全対象の中央値に閾値を適用することにより、この分析のために１／０変数に変換された。
【０１２９】
時間点及び臨床エンドポイントの全体で一貫して同定されたベースラインマーカーは、レプチン、ハプトグロビン、インスリン、ＥＮＡ７８及びアポリポタンパク質Ｃ３、オステオカルシン、Ｐ１ＮＰ、並びにＩＬ６であった（ＥＩＡによる）。これらのマーカーのそれぞれは、少なくとも３つの臨床エンドポイントにおいて有意であり、少なくとも１つのエンドポイントに関して１．５を越えるオッズ比を有した。これらのマーカーに関して、表９はそれらの臨床エンドポイントに関連したオッズ比及びｐ−値を示す。表９において、オッズ比（ＯＲ）は、ｌｏｇ２目盛り上の１単位変化、又は線形目盛りの二倍の、臨床応答の増大されたオッズを表す。
【０１３０】
この試験の結果の信頼性を増大させるために、多数のエンドポイントの全体において多数の時間点で有意な関連を示すマーカーの同定に焦点を当てた。ベースラインにおいて、臨床エンドポイント全体に一貫して同定された多重−決定マーカーは、レプチン、ハプトグロビン、インスリン、ＥＮＡ７８及びアポリポタンパク質Ｃ３であった。加えて、血清サンプルの単一ＥＬＩＳＡ試験は、オステオカルシン、Ｐ１ＮＰ及びＩＬ−６を同定した。これらの８つのマーカーのそれぞれは、少なくとも３つの臨床エンドポイントにおいて０．０５未満のｐ−値を有し、少なくとも１つのエンドポイントに関して１．５を越えるオッズ比（ＯＲ）を有した。これらのマーカーに関して、表９はそれらの臨床エンドポイントに関連したオッズ比及びｐ−値を示す。ＯＲは、ｌｏｇ２目盛り上の１単位変化、又は線形目盛りの二倍の、臨床応答の増大されたオッズを表す。
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】
ベースラインからの早期（第４週）変化が、時間点及び臨床エンドポイント全体において予測的に一貫したマーカーは、ハプトグロビン、血清アミロイド、ＣＲＰ、α−１アンチトリプシン、フォン・ヴィレブランド因子、補体因子３及び血清マーカーＩＬ−６であった（ＥＬＩＳＡ）。これらの７つのマーカーのそれぞれは、少なくとも３つの臨床エンドポイントにおいて有意であり、少なくとも１つのエンドポイントに関して３を越えるオッズ比を有した。これらのマーカーに関して、表１０はそれらの臨床エンドポイントに関連したオッズ比及びｐ−値を示す。
【０１３３】
【表１１】
【０１３４】
プラセボ
ゴリムマブ処置群において観察されたバイオマーカー／臨床エンドポイント関連性とは対称的に、プラセボ群ではバイオマーカー値と臨床エンドポイント応答との関連性が、あったとしても、殆ど存在しなかった（図示せず）。この結果は、ゴリムマブバイオマーカー分析で見られたより有意なバイオマーカーに対する内部標準又はベンチマークとしての役割を果たす。
【０１３５】
ベースラインバイオマーカーの予測方法
処置に対する患者の長期臨床応答の予測に使用できるバイオマーカーの決定に使用する分類及び回帰木（ＣＡＲＴ）予測的モデルを開発した。全予測モデルは、一つ抜き交差確認（leave-one-out cross-validation）を使用した。ＣＡＲＴモデルは、決定木（図１〜６）の形態で示されている。木のノードは、クラス予測（肯は、予測された臨床エンドポイント応答者、否は、予測された臨床的非応答者）及び２つの数字（ｘ／ｙ、ｘは、そのノードに属する、試験での非応答者の実際の数、ｙは、そのノードに属する、試験での答者の実際の数）で標識されている。モデルの全体的な正確性は、「否」エンドノード全体のｘの数、及び「肯」エンドノード全体のｙの数である。モデルは、一次臨床エンドポイント、第１４週におけるＡＣＲ２０、及び選択された二次臨床エンドポイントに関して開発された。一般に、二次エンドポイントモデルは、それらの感度及び特異性において、一次エンドポイントモデルと非常に類似していた。
【０１３６】
予測的モデルを使用して、どのバイオマーカーが、処置に対する患者の応答の予測に使用できるかを決定した。多重測定法により、及びＡＳＡＳ２０（一次）エンドポイントを使用して分析されたマーカーに関するベースラインで得た値に基づいて、１つのモデルを開発した（図１）。モデルを使用して得たサンプル結果の分析では、モデルがサンプルに適用された際に、モデルは試験患者の６１／７６（８０％）で正確であることが示された。これは、モデルで分析された患者サンプルにおいて、第１４週でのそれらの臨床応答（ＡＳＡＳ２０）を患者の８０％において結果が予測できたことを意味する。モデルの図を図１に示す。バイオマーカーモデルは、レプチンを初期分類子として使用する。即ち、３．８（対数目盛り）以上のレプチンを有する患者は、非応答者として予測される。次いで、３．８未満のレプチンレベルを有する患者は、二次マーカー、ＣＤ４０リガンドの使用に基づいて分類される。１．０５を越えるＣＤ４０リガンド結果を有する患者は、応答者として予測される一方、３．８未満のレプチンレベル及び１．０５未満のＣＤ４０リガンドを有する患者は、非応答者として予測される。モデルを使用した予測の感度は、８６％である。モデルを使用した結果の特異性は、８８％である。
【０１３７】
図２に、ＢＡＳＤＡＩエンドポイントに関する予測モデルを示す。このモデルのために異なるバイオマーカーが選択され、ＢＡＳＤＡＩモデルの全体的な正確性は、ＡＳＡＳ２０モデルと同様である。図２のアルゴリズムは、抗−ＴＮＦ療法に対する応答の初期分類子としての、７．０３３（対数目盛り）以上のＴＩＭＰ−１レベルに基づく。７．０３３以上のＴＩＭＰ−１レベルを有する患者は、更に、３．９５３未満のＧ−ＣＳＦを使用して予測応答者として分類され、３．９５３以上のＧ−ＣＳＦを使用して予測非応答者として分類される。７．０３３未満のＴＩＭＰ−１レベルを有する患者は、更にＰＡＰレベルを使用して分類され、−１．２８７未満のレベルは応答者を予測し、−１．２８７を越えるレベルの患者は更にＭＣＰ−１レベルに基づいて分類され、７．４１７未満のＭＣＰ−１は応答者を予測し、７．４１７以上のＭＣＰ−１は非応答者を予測する。
【０１３８】
個々のＥＩＡ測定法（非多重化測定法）及び３ｐｌｅｘ測定法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して分析したマーカーがＣＡＲＴ分析に含まれる場合、アルゴリズム（決定木）結果は、臨床エンドポイントがＡＳＡＳ２０又はＢＡＳＤＡＩ（それぞれ図３及び４）のいずれであっても初期分類子としてオステオカルシンに依存した。追加のマーカーは、マーカーのパネルの予測能力を向上させることが見出された。ベースラインバイオマーカー／血清バイオマーカーモデルの正確性は、第１４週にてＡＳＡＳ２０により評価して、臨床応答の予測に関して６７／７６（８８％）であった（図３）。このバイオマーカーモデルは、初期分類子としてオステオカルシン（個々のＥＩＡにより測定法）を使用する。３．８７８（対数目盛り）以上のオステオカルシンを有する患者は、応答者と予測される。３．８７８未満のオステオカルシンを有する患者は、ＰＡＰに基づいて分類される。モデルの正確性は８８％であり、感度は９０％であり、モデル特異性は８４％であった。
【０１３９】
同様の分析において、ＢＡＳＤＡＩエンドポイントに関する予測モデルを図４に示す。この場合、ＢＡＳＤＡＩとＡＳＡＳ２０モデルは非常に類似することが判明し（両方ともオステオカルシン及びＰＡＰを含んでいた）、ＢＡＳＤＡＩモデルは、１つの追加の分類子としてインスリンを加えた）。モデルの正確性は、ＢＡＳＤＡＩ臨床応答の予測に関して６１／７６（８０％）であった。
【０１４０】
ベースライン濃度、及び第４週におけるベースラインからの変化
多重データを使用する追加の予測モデルを開発して、処置の第４週におけるバイオマーカーの変化が、第１４週における臨床成果の予測を含み得るか否かを決定した。ＡＳＡＳ２０を予測するアルゴリズムを、図５に示す。ＡＳＡＳ２０を予測するベースラインのみのアルゴリズムと同様、ベースラインレプチンが初期分類子である。３．８（対数目盛り）以上のレプチンを有する患者は非応答者として予測され、３．８未満のレプチンを有する患者は、２つの追加の予測物、ｉ）補体３における変化、及びｉｉ）ベースラインＶＥＧＦ、に基づいて更に分類される。このモデルでは、正確性は第１４週での臨床応答（ＡＳＡＳ２０）に関して６４／７６（８４％）であった。モデルの感度は９２％、特異性は８１％であった。
【０１４１】
ＢＡＳＤＡＩエンドポイントに関する予測モデルを、図６に示す。ＢＡＳＤＡＩモデルの全体的な正確性はＡＳＡＳ２０モデルと類似しているが、異なるバイオマーカーを選択し、この分析で使用した。初期マーカーは補体成分３の第０週から第４週への変化であり、０．２３３（対数目盛り）未満の低下を有する患者は応答者として予測され、補体成分３において０．２３３３以上の低下を有する患者は、ベースラインフェリチンに基づいて更に分類され、フェリチン値がカットオフ値７．７７４を越える場合、患者は予測された応答者として分類され、フェリチンが７．７７４未満の場合、患者は予測された非応答者として分類され、フェリチンに基づいて非応答者と予測されたサブセットは、ＩＣＡＭ−１レベルにおける変化に基づいて更に分類され、第０週から第４週の間でＩＣＡＭ−１の低下が０．０２２０４以上の者は予測された応答者として分類され、第０週から第４週の間でＩＣＡＭ−１の低下が０．０２２０４未満の残りの患者は非応答者として分類される。
【０１４２】
タンパク質バイオマーカー試験の結果は、ゴリムマブ療法の結果として、多数のバイオマーカーが有意に変化したことを示した。対照的に、プラセボ対照アームではバイオマーカーの変化は殆ど観察されなかった。２つの種類の新規なバイオマーカーベースの臨床応答予測モデルが開発され、一方はベースラインバイオマーカー値を患者の臨床応答を予測するためのみ使用し、他方はバイオマーカー値の早期変化を使用して、より長期間（第１４週、第２４週）の臨床応答を予測する。モデルは、マーカーのサブセットが、単純な処置の非特異的な効果とは対照的に、ゴリムマブに対する臨床応答に関連した変化を有することを示唆する。このことは、多数の臨床エンドポイントの全体を見渡すロバストロジスティック回帰分析から結論付けることができる。
【０１４３】
重要なことには、マーカー値（ベースライン、又は第４週での変化のいずれか）は臨床成績に先行していた。このことは、ゴリムマブ処置に対するＡＳ患者の最終的な応答又は非応答を、良好な正確性を伴う予測に使用できるバイオマーカーのパネルが開発できることを示している。
【０１４４】
ゴリムマブに対する臨床応答（徴候及び症状）の最良のバイオマーカーモデル（特異性及び感度に基づいた）は、図３及び４に示したように、オステオカルシン及び前立腺酸性ホスファターゼのベースラインレベルを含んでいた。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年１２月３０日出願の米国特許出願第６１／１４１，４２１号の優先権を主張するものであり、出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、血清バイオマーカーを使用して、強直性脊椎炎と診断された患者の抗−ＴＮＦα生物学的治療を用いた処置に対する応答を予測するための方法及び手順に関する。
【関連技術の記載】
【０００３】
現在入手可能な又は開発中のゴリムマブ又はアダリムマブ、ヒト抗−ＴＮＦα抗体又はインフリキシマブ、マウス−ヒトキメラ抗−ＴＮＦ抗体、又はエンテラセプト（enteracept）、ＴＮＦＲコンストラクト等の生物製剤を用いて強直性脊椎炎（ＡＳ）を処置する決定は、多数の困難を提示している。その困難のうちの１つは、どの対象が処置に応答し、どの対象が処置後に応答を失うかを予測することである。
【０００４】
バイオマーカーは、「正常な生物学的過程、発病過程、又は治療介入に対する薬理学的な応答性の指標として客観的に測定され評価される特徴として定義される」（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，２００１．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐ．６９：８９〜９５）。バイオマーカーの定義は、発現の変化が、疾病若しくは進行の危険性の増加に、又は所定の処置に対する応答性の予測に、関連付けられ得るタンパク質として最近更に定義された。
【０００５】
抗−ＴＮＦ抗体をインビトロ又はインビボシステムに添加することによるＴＮＦαの中和は、炎症性サイトカインの発現と、他の血清タンパク質及び非タンパク質の構成成分の数と、を変更し得る。培養した滑膜線維芽細胞に添加された抗−ＴＮＦ抗体は、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの発現を低減した（Ｆｅｌｄｍａｎｎ ＆ Ｍａｉｎｉ（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：１６３〜１９６）。インフリキシマブで処置されたＲＡ患者は、低下されたＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−６、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン及びフィブリノゲンの血清レベルを有した（Ｃｈａｒｌｅｓ １９９９ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：１５２１〜１５２８）。他の試験により、インフリキシマブで処置されたＲＡ患者が、低下された可溶性ＩＣＡＭ−３及びｓＰ−セレクチンの血清レベル（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇａｙ、２００６ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２４：３７３〜３７９）、並びにサイトカインＩＬ−１８のレベルの低下（Ｐｉｔｔｏｎｉ、２００２ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６１：７２３〜７２５；ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔ、２００５ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６４：５３７〜５４３）を有することが示された。
【０００６】
上昇したＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルは、様々な免疫介在性炎症性疾患を有する患者に観察されている。これらの観察は、ＣＲＰが抗−ＴＮＦα処置のマーカーとしての潜在的な価値を有し得ることを示している。（Ｓｔ Ｃｌａｉｒ、２００４ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５０：３４３２〜３４４３）は、インフリキシマブが、早期ＲＡを有する患者においてＣＲＰを正常レベルに戻すことを示した。難治性乾癬性関節炎においても（Ｆｅｌｅｔａｒ、２００４ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ６３：１５６〜１６１）、インフリキシマブによる処置がＣＲＰを正常レベルに戻した。ＣＲＰレベルも、メトトレキサートのみで処置された早期ＲＡ患者における関節損傷進行に関連していることが示されている（Ｓｍｏｌｅｎ、２００６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４：７０２〜７１０）。インフリキシマブ処置がメトトレキサート処置に加えられた場合、ＣＲＰレベルは、もはや関節損傷進行に関与しなかった。
【０００７】
ＲＡを有する患者の処置において、Ｃｈａｒｌｅｓ（１９９９）及びＳｔｒｕｎｋ（２００６ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｉｎｔ．２６：２５２〜２５６）は、インフリキシマブがＩＬ−６等の炎症関連のサイトカインと、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）等の血管新生関連のサイトカインとの発現を低下させ得ることを示した。Ｕｌｆｇｒｅｎ（２０００ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４３：２３９１〜２３９６）は、インフリキシマブ処置が、処置から２週間以内に、滑膜内のＴＮＦ、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの合成を低下させることを示した。Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎｉ（２００５ Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １５３：５３１〜５３６）は、インフリキシマブによる処置後に、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＭＭＰ−２における低下が乾癬の領域内で有意に向上され、乾癬の重篤さを低減することを示した。Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ（Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ２００８；６７；５１１〜５１７；）は、インフリキシマブ処置がＡＳ患者の血清中のＩＬ−６、ＶＥＧＦ及びＣＲＰのレベルを低下させ、この低下は疾病活性尺度の改善を反映することを示した。
【０００８】
インフリキシマブによるＡＳ患者の処置はＩＬ−６の低下をもたらし、この低下は臨床的尺度の改善と関連していた（Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ，２００６ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ７９２）。インフリキシマブ処置患者において、処置後のＩＬ−６及びＣＲＰの早期低下は、疾病活性スコアにおける改善に関連していた。
【０００９】
処置前の血清マーカー濃度も、抗−ＴＮＦα処置に対する応答に関与していた。ＩＬ−２Ｒの低いベースライン血清レベルは、難治性ＲＡを有する患者のインフリキシマブに対する臨床応答に関連することが見出された（Ｋｕｕｌｉａｌａ ２００６）。Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ（２００７ａ）は、インフリキシマブ及びＭＴＸを用いたＲＡ患者の処置が、ＭＭＰ−３を含む炎症関連マーカーの数の減少を誘導することを示した。この試験では、ＭＭＰ−３のベースラインレベルが、処置後１年の臨床的改善の尺度と有意に相関することが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、炎症及び全身性疾病の血清タンパク質及び非タンパク質マーカーの数は抗−ＴＮＦα処置中に変更されることが示されているが、マーカーと予測的アルゴリズムとの固有のセットは、今の所、見出されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、多数のバイオマーカーを使用して、抗−ＴＮＦαによる処置に対する患者の応答を予測することに関し、より詳細には患者が応答するか又はしないかを測定することに関する。加えて、本発明は、患者が処置に応答したか否かを測定し、また応答が持続するか否かを測定するのに使用され得る。一態様において、本発明は、患者血清サンプルを使用した多成分スクリーンを用いて、ＴＮＦα中和モノクローナル抗体による処置に対するＡＳを有する患者の応答及び非応答を予測することを包含する。
【００１２】
一実施形態において、実際の臨床応答評価と相関付けられている、抗−ＴＮＦα療法の開始前にＡＳ患者からのデータセット中に同定された特定のマーカーセットは、抗−ＴＮＦα療法による処置前の、ＡＳ患者の臨床応答の予測に使用される。特定の実施形態において、マーカーセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される２つ以上のマーカーである。
【００１３】
一実施形態において、実際の臨床応答評価と相関付けられている、抗−ＴＮＦα療法の開始の前後にＡＳ患者からのデータセット中に同定された特定のマーカーセットは、抗−ＴＮＦα療法による処置前の、ＡＳ患者の臨床応答の予測に使用される。特定の実施形態において、マーカーセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される２つ以上のマーカーである。
【００１４】
本発明は、抗−ＴＮＦα療法に対するＡＳ患者の応答を予測するためのコンピュータベースのシステムも提供し、コンピュータは患者のデータセットからの値を使用して決定木等の予測的アルゴリズムと比較し、データセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上のマーカーの血清濃度を含む。一実施形態において、コンピュータベースのシステムは、患者データセットを処理し、出力を生成する学習ずみニューラルネットワークであり、データセットは、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、インスリン、補体成分３、ＶＥＧＦ及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上のマーカーの血清濃度を含む。
【００１５】
本発明は、ＡＳ患者から獲得した標本又はサンプル中の血清マーカーを処理及び検出可能な装置も提供し、血清マーカー濃度は、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される。
【００１６】
本発明は、ＡＳ患者から獲得した標本又はサンプル中の血清マーカーを処理及び検出可能な装置を含むキットも提供し、血清マーカー濃度は、レプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ、補体成分３、ＶＥＧＦ、インスリン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図１〜６は、血清バイオマーカーの使用に基づき、ＡＳＡＳ２０又はＢＡＳＤＡＩにより評価された患者臨床応答と相関付けられた決定木の形態で示されるＡＳ応答予測モデルである。非応答者又は「否」ノードは、ノード内の全対象がモデルにより非応答者と予測される一方、「肯」ノードは、ノード内の全対象がモデルにより応答者と予測されることを意味する。ノード内に、ノード内の実際の非応答者の数／実際の応答者の数が示されている。
【図１】第１４週にてＡＳＡＳ２０を用いて、ゴリムマブを受容している試験患者から多重化方法で分析したベースライン（第０週）マーカーデータから開発した予測値モデルであり、応答者に関する初期分類子はレプチン（カットオフ値＜３．８０４、対数目盛り）に基づき、応答者に関する二次分類子は、ＣＤ４０リガンド（カットオフ値＞＝１．０５、対数目盛り）に基づく。
【図２】第１４週にてＢＡＳＤＡＩにおける変化を用いて、ゴリムマブを受容している試験患者から多重化方法で分析したベースライン（第０週）マーカーデータから開発した予測値モデルであり、初期応答者基準はＴＩＭＰ−１（カットオフ値＞＝７．０３３）であり、応答者の二次分類子はＧ−ＣＳＦ（カットオフ値＜３．９５３）であり、ＴＩＭＰ−１がカットオフ値未満の場合、前立腺酸性ホスファターゼが応答者の分類子（カットオフ＞＝−１．２８７、ｌｏｇ値）であり、ＴＩＭＰ−１及びＰＡＰが両方ともそれらのそれぞれのカットオフ値未満の場合、ＭＣＰ−１が応答者に関する分類子（＜７．４１７、対数目盛り）。
【図３】第１４週にてＡＳＡＳ２０を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者及び応答から多重化方法及び個々のＥＩＡの両方により定量化した、ベースライン（第０週）における血清マーカー値から開発したＡＳ応答予測モデルであり、オステオカルシンが応答者の初期分類子（カットオフ値＞＝３．８７８、対数目盛り）であり、オステオカルシンがそのそれぞれのカットオフ値未満の場合、ＰＡＰが応答者の分類子（カットオフ値＞＝−１．３５９、対数目盛り）として使用される。
【図４】第１４週にてＢＡＳＤＡＩ変化を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者及び応答から多重化方法及び個々のＥＩＡの両方により定量化した、ベースライン（第０週）における血清マーカー値から開発したＡＳ応答予測モデルであり、オステオカルシンが応答者の初期分類子（カットオフ値＞＝３．９７７、対数目盛り）であり、オステオカルシンがカットオフ値未満の場合、ＰＡＰが応答者の分類子（カットオフ＞＝−１．４１５）であり、オステオカルシン及びＰＡＰの両方がそれらのそれぞれのカットオフ値未満の場合、インスリンが応答者の分類子（カットオフ値＜２．７１１、対数目盛り）として使用される。
【図５】応答を第１４週にてＡＳＡＳ２０を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者から多重化方法により定量化した、ベースラインと、抗−ＴＮＦ療法の開始後のベースライン（第０週）から第４週への血清マーカーの変化とから開発したＡＳ応答予測モデルであり、ベースラインレプチンが応答者の初期分類子（カットオフ値＜３．８０４、対数目盛り）であり、レプチンがカットオフ値未満の場合、ベースラインから第４週への補体３の変化が応答者の分類子（カットオフ＜−０．２２４）として使用され、レプチン及び補体３がそれらのそれぞれのカットオフ値以上の場合、ベースラインＶＥＧＦが応答者の分類子（カットオフ＞＝８．７２４）として使用される。
【図６】第１４週にてＢＡＳＤＡＩにおける変化を用いて評価した、ゴリムマブを受容している試験患者及び応答から多重化方法により定量化した、ベースラインと、抗−ＴＮＦ療法の開始後のベースライン（第０週）から第４週への血清マーカーの変化とから開発したＡＳ応答予測モデルであり、初期応答者基準は、ベースラインから第４週への補体成分３の変化（カットオフ値＜−０．２３３、対数目盛り）であり、補体３の変化がカットオフ値以上の場合、ベースラインフェリチンが分類子（カットオフ値＞＝７．７７４、対数目盛り）として使用され、補体３の変化がカットオフ値以上で、ベースラインフェリチンがそのそれぞれのカットオフ値未満の場合、ＩＣＡＭ−１の変化が応答者の分類子（カットオフ値＞＝−０．２２０４、対数目盛り）として使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
【表１】
【００１９】
定義
「バイオマーカー」は、Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（Ａｔｋｉｎｓｏｎら、２００１ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒａｐ ６９（３）：８９〜９５）による、正常な生物学的過程、発病過程、又は治療的介入に対する薬理応答の客観的指標として、客観的に測定及び評価される特徴として定義される。したがって、解剖学的又は生理学的過程は、タンパク質、遺伝子発現（ｍＲＮＡ）、小分子、代謝産物又は無機質のレベルが可能なように、例えば挙動の範囲のようなバイオマーカーとしての役割を果たすが、但しバイオマーカーと、関連する生理学的、毒物学的、薬理学的又は臨床成績との間に、検証された関係が存在することを条件とする。
【００２０】
マーカーの「血清レベル」は、血液等の標本から調製されたサンプル上で、典型的にはエクスビボで免疫測定法等の１つ以上の方法により測定されたマーカーの濃度を意味する。免疫測定法は、各マーカーに関する免疫特異的な試薬、典型的には抗体を使用し、酵素結合反応、例えばＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、又は他の直接的若しくは間接的プローブを含む多様なフォーマットにて実行され得る。サンプル中のマーカーを定量化する他の方法、例えば、電気化学的検出、蛍光プローブ結合検出も可能である。この測定法はまた「多重化」されてもよく、単一のサンプル調査中に多数のマーカーが検出及び定量化される。
【００２１】
観察的研究は、通常、それらの結果をオッズ比（ＯＲ）又は相対的危険性として報告する。これらの両方は、暴露（例えば喫煙、薬物療法の使用）と疾病又は死との間の関連性の大きさの尺度である。相対的危険性１．０は、暴露が疾病の危険性を変化させないことを示す。相対的危険性１．７５は、暴露を有する患者の疾病を発症する可能性が１．７５倍であり、又は疾病の危険性が７５％高いことを示す。相対的危険性１未満は、暴露が危険性を低下させることを示す。オッズ比は、相対的危険性が特に計算できない場合に、症例対照研究において相対的危険性を見積もる方法である。オッズ比は、疾病が希な場合、正確であるが、この近似は、疾病が通常のものである場合、同様に良好ではない。
【００２２】
予測値は、臨床現場において試験の結果を解釈する助けとなる。手順の診断値は、その感度、特異性、予測値及び有効性により規定される。いずれの試験方法も、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、偽陽性（ＦＰ）及び真陰性（ＴＮ）を生成するであろう。試験の「感度」は、陽性試験を有する、疾病が存在し又は応答する患者の百分率、即ち（ＴＰ／ＴＰ＋ＦＮ）×１００％である。試験の「特異性」は、陰性試験を有する、疾病を有さない又は応答しない全患者の百分率、即ち（ＴＮ／ＦＰ＋ＴＮ）×１００％である。試験の「予測値」又は「ＰＶ」は値（陽性又は陰性）が真の値である回数の尺度（％）であり、即ち、真陽性である全陽性試験の百分率が陽性予測値（ＰＶ＋）、即ち（ＴＰ／ＴＰ＋ＦＰ）×１００％である。「陰性予測値」（ＰＶ−）は、応答しない、陰性試験を有する患者の百分率、即ち（ＴＮ／ＦＮ＋ＴＮ）×１００％である。試験の「正確性」又は「有効性」は、全試験数と比較して正確な回答を与える試験の数の百分率、即ち（ＴＰ＋ＴＮ／ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％である。「誤り率」は、応答すると予測された患者が応答せず、また応答すると予測されなかった患者が応答する場合、即ち（ＦＰ＋ＦＮ／ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％である。全体的な試験の「特異性」は、感度の正確性の尺度であり、試験の特異性は、全体の疾病の可能性が集団内で変化する際に変化せず、予測値は変化する。ＰＶは、所定の患者における疾病の存在若しくは不在、又は臨床応答の存在若しくは不在への医師の臨床評価により変化する。
【００２３】
バイオマーカーの「低下したレベル」又は「より低いレベル」は、「カットオフ値」と称される所定の値と比較して定量化可能に低く、定量下限（ＬＯＱ）よりも高いレベルを指し、この「カットオフ値」は、患者サンプル採取及び処理条件に関連したアルゴリズム及びパラメータに特異的である。
【００２４】
バイオマーカーの「より高いレベル」又は「上昇したレベル」は、「カットオフ値」と称される所定の値と比較して定量化可能に高く、この「カットオフ値」は、患者サンプル採取及び処理条件に関連したアルゴリズム及びパラメータに特異的である。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒトＴＮＦα」（本明細書でｈＴＮＦα、ｈＴＮＦａ又は単にＴＮＦと略される）は、１７ｋＤ分泌形態及び２６ｋＤ膜結合形態として存在するヒトサイトカインを指すことを意図し、その生物学的に活性な形態は、非共有結合した１７ｋＤ分子の三量体から構成される。用語、ヒトＴＮＦαは、標準的な組み換え発現方法により調製され、又は商業的に購入することができる（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．２１０−ＴＡ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）組み換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）を含むことを意図する。
【００２６】
「抗−ＴＮＦα」、「抗−ＴＮＦα」、抗−ＴＮＦα又は単に「抗−ＴＮＦ」療法又は処置は、受容体結合を遮断、阻害、中和、防止し、又はＴＮＦαによるＴＮＦＲ活性を防止することが可能な生物分子（生物製剤）を患者に投与することを意味する。そのような生物製剤の例は、インフリキシマブ及びアダリムマブの一般名で販売されている抗体、並びにゴリムマブ等の臨床開発中の抗体を含むがこれらに限定されない、ＴＮＦαに対する中和Ｍａｂであり、エンテラセプトとして公知のＴＮＦＲ−免疫グロブリンキメラ等の、ＴＮＦａに結合可能な非抗体構造も含む。この用語は、本明細書と、米国特許第６，０９０，３８２号、同第６，２５８，５６２号、同第６，５０９，０１５号、並びに米国特許出願第０９／８０１１８５号及び同第１０／３０２３５６号に記載されている抗−ＴＮＦαヒト抗体及び抗体部分のそれぞれを含む。一実施形態において、本発明で使用されるＴＮＦα阻害剤は、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＪｏｈｎｓｏｎ、参照により本明細書に組みこまれる米国特許第５，６５６，２７２号に記載）、ＣＤＰ５７１（ヒト化モノクローナル抗−ＴＮＦ−α ＩｇＧ４抗体）、ＣＤＰ ８７０（ヒト化モノクローナル抗−ＴＮＦ−α抗体断片）、抗−ＴＮＦ ｄＡｂ（Ｐｅｐｔｅｃｈ）、ＣＮＴＯ １４８（ゴリムマブ、及びＣｅｎｔｏｃｏｒ、ＷＯ ０２／１２５０２号参照）、及びアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ヒト抗−ＴＮＦ ｍＡｂ、米国特許第６，０９０，３８２号にＤ２Ｅ７として記載）を含む抗−ＴＮＦα抗体、又はその断片である。本発明で使用され得る更なるＴＮＦ抗体は、参照により本明細書に組みこまれる米国特許第６，５９３，４５８号、同第６，４９８，２３７号、同第６，４５１，９８３号、及び同第６，４４８，３８０号に記載されている。別の実施形態では、ＴＮＦα阻害剤は、ＴＮＦ融合タンパク質、例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ、参照により本明細書に組みこまれるＷＯ ９１／０３５５３号及びＷＯ ０９／４０６４７６号に記載）である。別の実施形態では、ＴＮＦα阻害剤は、組み換えＴＮＦ結合タンパク質（ｒ−ＴＢＰ−Ｉ）（Ｓｅｒｏｎｏ）である。
【００２７】
「サンプル」又は「患者のサンプル」は、ＴＮＦα関連の疾病に関連した症状を有することが疑われる又は表している患者から、抽出、生成、収集、又は別様に獲得した、細胞、組織若しくは流体又はそれらの一部である標本を意味する。
【００２８】
概観
プロテオミクス等の技術における近年の進歩は、ハイスループット方法により生成した新しい情報を、臨床病理学的相関に基づき、また多くの場合、病理組織学的発見を包含する現在の診断モデルと統合する挑戦を病理学者に提示している。医療情報学及び生物情報学の分野における平行した発展は、これらの問題に合理的に取り組むための技術的かつ数学的方法を提供し、開業医及び病理学者又は他の医療専門家に、多変量の及び集学的な診断及び予後モデルの形態の新しいツールを提供している。これらのツールは、より正確な、個々の患者ベースの情報を提供することが期待される。根拠に基づく医学（ＥＢＭ）及び医学判断学（ＭＤＡ）は、これらの比較的新しい学問分野に属し、定量的方法を使用して情報の値を評価し、個々の患者のケアに影響を与え得る予後の評価、治療法に対する応答、及び臨床試験の選択のためにいわゆる最良の証拠を多変量モデルと統合する。
【００２９】
本発明は、数個の態様を含む。
１．ＡＳを有する患者におけるゴリムマブ等の抗−ＴＮＦ処置に対する応答又は非応答に関連したバイオマーカーを同定するための血清の使用。
２．抗−ＴＮＦ療法を開始する前に、診断されたＡＳ患者からの血清中に存在するバイオマーカーを使用して、ゴリムマブ等の抗−ＴＮＦα Ｍａｂ処置に対する応答又は非応答を予測する能力。
３．抗−ＴＮＦ療法で処置されたＡＳを有する患者における成果を予測するためのアルゴリズム。
ａ．第１４週におけるＡＳ患者の抗−ＴＮＦαに対する臨床応答又は非応答は、抗−ＴＮＦ療法の開始前に、診断されたＡＳ患者の血清中に存在するバイオマーカーを使用して、評価時（第０週）に予測され得る。
ｂ．第１４週におけるＡＳ患者の抗−ＴＮＦα処置に対する臨床応答又は非応答は、治療法の開始前（第０週）に得られたベースライン値からのバイオマーカーと、治療法の開始後の第４週でのバイオマーカーとの変化を使用して予測され得る。
ｃ．第１４週におけるＡＳ患者の抗−ＴＮＦα処置に対する臨床応答又は非応答は、治療法の開始前（第０週）に得られたベースライン値からのバイオマーカーの変化を、治療法の開始後の第４週でのバイオマーカーの変化と組み合わせて使用して予測され得る。
４．本発明のマーカーを使用して、ＡＳ患者の抗−ＴＮＦα療法に対する応答又は非応答を予測する手段を含む装置、システム及びキット。
【００３０】
マーカーの濃度に基づく予測的アルゴリズムの開発に有用なマーカーを規定するために、ゴリムマブで処置された患者から血清を獲得した。血清は、処置のベースライン（第０週）、第４週及び第１４週、又は他の中間点若しくはより長い時間点にて獲得してもよい。血清サンプル中の多数のバイオマーカーを分析し、バイオマーカーのベースライン濃度と、処置後のバイオマーカーの濃度における変化と、を測定する。次いで、ベースラインとバイオマーカー発現の変化とを使用して、バイオマーカー発現が第１４週又は処置開始後の他の規定時間点における処置成果と相関するか否かを、ＡＳＡＳ２０又は臨床応答の他の尺度により評価して決定する。一実施形態では、ＡＳ患者の抗−ＴＮＦα療法に対する臨床応答に関連したマーカーを規定するプロセスと、それらのマーカーの血清濃度を含む、応答又は非応答を予測するためのアルゴリズムとの開発は、段階的な分析を使用し、初期相関は、患者の第１４週及び第２４週における臨床評価に対する各患者の第０週、第４週及び第１４週における各バイオマーカーの値に関するロジスティック回帰分析により行われ、多数の臨床エンドポイントにおいてマーカーの治療法に対する応答との有意な相関の能力が測定されたら、ＣＡＲＴ又は本明細書に記載した若しくは当技術分野にて公知の他の好適な分析方法を使用して、マーカー又はマーカーセットの規定された血清値に基づく固有のアルゴリズムを開発する。
【００３１】
本明細書に開示した他のマーカーに加えて、データセットマーカーは１つ以上の臨床的兆候から選択されてもよく、その例は、年齢、性別、血圧、身長及び体重、肥満度指数、ＣＲＰ濃度、煙草使用、心拍数、空腹時インスリン濃度、空腹時ブドウ糖濃度、糖尿病状態、他の薬物療法の使用、並びに特定の機能的評価又は挙動評価、並びに／又は放射線学的若しくは他の画像ベースの評価であり、個々の尺度に数値が適用され、又は全体的な数値スコアが生成される。臨床的変数が一般に評価され、得られたデータはアルゴリズムにおいて上記のマーカーと組み合わされる。
【００３２】
分析プロセスへ入力する前に、各マーカーに関する値を、通常三回、又は多数の三回にて測定することにより、各データセットにおけるデータを収集する。データを操作してもよく、例えば標準曲線を使用して生データを変換し、三回測定の平均を使用して、各患者に関する平均及び標準偏差を計算してもよい。これらの値は、モデルに使用される前に、例えばｌｏｇ−変換、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（Ｂｏｘ ａｎｄ Ｃｏｘ（１９６４）Ｊ．Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ，２６：２１１＆＃８２１２；２４６参照）変換等の変換をされてもよい。次いで、このデータを、規定パラメータを有する分析プロセスに入力してもよい。
【００３３】
このようにしてタンパク質マーカーに関連した定量的データが得られ、次いで他のデータセット成分を、学習アルゴリズムを使用して以前に決定されたパラメータを有する分析プロセスに供し、即ち、本明細書に提供する実施例（実施例１〜３）のように、予測的モデルに入力する。分析プロセスのパラメータは、本明細書に開示したもの、又は本明細書に記載したガイドラインを使用して誘導したものであってもよい。線形判別分析、再帰的特長削除（recursive feature elimination）、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰分析、ＣＡＲＴ、ＦｌｅｘＴｒｅｅ、ＬＡＲＴ、ランダムフォレスト、ＭＡＲＴ等の学習アルゴリズム、又は他の機械学習アルゴリズムが、適切な参照又は訓練データに適用されて、ＡＳ応答又は非応答分類に好適な分析プロセスのためのパラメータを決定する。
【００３４】
分析プロセスは、サンプルが所定のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定し得る。確率は、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又はそれ以上であることが好ましい。
【００３５】
別の実施形態では、分析プロセスは、得られたデータセットと参照データセットとの比較が、統計的に有意な差異を生じるか否かを決定する。統計的に有意な差異を生じる場合、データセットが由来するサンプルを、参照データセットクラスに属さないものとして分類する。逆に、そのような比較が参照データセットと統計的に有意に異ならない場合、データセットが由来するサンプルは、参照データセットクラスに属するものとして分類される。
【００３６】
一般に、分析プロセスは、線形アルゴリズム、二次アルゴリズム、多項式アルゴリズム、決定木アルゴリズム、投票アルゴリズム等の統計分析方法により生成されるモデルの形態を有するであろう。
【００３７】
分析プロセスのパラメータを決定するための参照／訓練データセットの使用
任意の好適な学習アルゴリズムを用いて、適切な参照又は訓練データセットを使用して、分類に使用されるべき分析プロセスのパラメータを決定し、即ち予測的モデルを開発する。
【００３８】
使用するべき参照又は訓練データセットは、決定されるべき所望のＡＳ分類、例えば応答者又は非応答者に依存するであろう。データセットは、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のクラスからのデータを含んでもよい。
【００３９】
例えば、抗−ＴＮＦα療法に対する応答の予測に使用される分析プロセスのためのパラメータを決定する、管理された学習アルゴリズムを使用するためには、対照サンプル及び疾病サンプルを含むデータセットを訓練セットとして使用する。代替的に、管理された学習アルゴリズムは、ＡＳ疾病療法に関する予測的モデルの開発に使用される。
【００４０】
統計分析
以下は、開示した方法の実践を補助するための、当業者が利用可能な統計分析方法の種類の例である。統計分析は、２つの課題の一方又は両方に適用され得る。まず、これら及び他の統計的方法は、好ましいデータセットを形成するであろう好ましいマーカー及び他の徴候のサブセットを同定するのに使用され得る。加えて、これら及び他の統計的方法は、データセットと共に使用されて結果を生成する分析プロセスの生成に使用され得る。本明細書に示し、又は当技術分野にて別様に入手可能な、数個の統計的方法は、これらの課題の両方を実行し、本明細書に開示した方法を実践するための分析プロセスとしての使用に好適なモデルを生じる。
【００４１】
特定の実施形態では、バイオマーカー及びそれらの対応する特徴（例えば発現レベル又は血清レベル）を使用して、患者のクラス、例えば抗−ＴＮＦα療法に対する応答者及び非応答者を区別する分析プロセス（１つ又は複数）を開発する。これらの例示的データ分析アルゴリズム又は当技術分野にて公知の他の技術を使用して分析プロセスを構築した後、分析プロセスを使用して、試験対象を２つ以上の表現型クラス（例えば抗−ＴＮＦα療法に応答すると予測される患者、又は応答しないと予測される患者）のうちの１つに分類し得る。これは分析プロセスを、試験対象から得られたマーカープロファイルに適用することにより達成される。したがって、そのような分析プロセスは、診断指標としての多大な価値を有する。
【００４２】
一態様において、開示された方法は、試験対象からのマーカープロファイルを、訓練集団から獲得したマーカープロファイルに対して評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、訓練集団内の対象、及び試験対象から得られた各マーカープロファイルは、複数の異なるマーカーのそれぞれに関する特徴を含む。いくつかの実施形態では、この比較は、（ｉ）訓練集団からのマーカープロファイルを使用して分析プロセスを開発し、（ｉｉ）この分析プロセスを試験対象からのマーカープロファイルに適用する、ことにより達成される。そのようなものとして、本明細書に開示した方法のいくつかの実施形態に適用される分析プロセスは、試験ＡＳ患者が抗−ＴＮＦα療法に応答するか否か、又は応答しない患者を決定するのに使用される。
【００４３】
したがって、いくつかの実施形態では、上述した二分決定状況における結果は、４つの可能な成績を有する。（ｉ）分析プロセスが、対象が抗−ＴＮＦα療法に対する応答者となることを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に実際に応答する、真の応答者（真陽性、ＴＰ）；（ｉｉ）分析プロセスが、対象が抗−ＴＮＦα療法に対する応答者となることを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に実際に応答しない、偽応答者（偽陽性、ＦＰ）；（ｉｉｉ）分析プロセスが、抗−ＴＮＦα療法に対する応答者とならないことを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に応答しない、真の非応答者（真陰性、ＴＮ）；又は（ｉｖ）分析プロセスが、患者が抗−ＴＮＦα療法に対する応答者とならないことを示し、対象が規定期間中に抗−ＴＮＦα療法に実際に応答する、偽の非応答者（偽陰性、ＦＮ）。
【００４４】
分析プロセスを開発するための関連したデータ分析アルゴリズムには、線形、ロジスティックを含む判別分析、及びより柔軟な判別技術（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＧｎａｎａｄｅｓｉｋａｎ、１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ １９７７参照）；分類木及び回帰木（ＣＡＲＴ）及び変形等の木ベースのアルゴリズム（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＢｒｅｉｍａｎ、１９８４，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．：Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ参照）；一般化加法モデル（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ、１９９０，Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ参照）；並びにニューラルネットワーク（例えば全体が参照により本明細書に組みこまれるＮｅａｌ、１９９６，Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；及びＩｎｓｕａ、１９９８，Ｆｅｅｄｆｏｒｗａｒｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｆｏｒ ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ Ｓｅｍｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，ｐｐ．１８１〜１９４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明のデータ分析アルゴリズムは、分類及び回帰木（ＣＡＲＴ）、多重相加的回帰木（Multiple Additive Regression Tree）（ＭＡＲＴ）、マイクロアレイに関する予測分析（ＰＡＭ）又はランダムフォレスト分析を含む。それらのアルゴリズムは、血液サンプル等の生物材料からの複雑なスペクトルを分類して、対象を正常か又は特定の疾病状態に特徴的なバイオマーカー発現レベルを所有するか区別する。別の実施形態では、本発明のデータ分析アルゴリズムは、ＡＮＯＶＡ及びノンパラメトリック等価物（nonparametric equivalent）、線形判別分析、ロジスティック回帰分析、最小近傍分類子分析（nearest neighbor classifier analysis）、ニューラルネットワーク、主成分分析、二次判別分析、回帰分類子及びサポートベクターマシンを含む。
【００４６】
それらのアルゴリズムは、分析プロセスを構成し、及び／又は分析プロセスの適用の速度及び効率を向上させ、研究者のバイアスを避けるために使用され得るが、当業者は本発明の予測的モデルの使用方法を実行するのにコンピュータベースの装置を必要としないことを認識するであろう。
【００４７】
ＣＡＲＴ分析の結果
本発明の一態様では、ＡＳと診断された患者における血清マーカーの分析は、バイオマーカーのベースライン値と抗−ＴＮＦα療法に対する応答との間の有意な関係に焦点を当てた。本発明の別の態様では、ＡＳと診断された患者における血清マーカーにおいて、ベースライン（抗−ＴＮＦα療法の前）から治療後の第４週への血清マーカーにおける変化の分析は、後の時間（第１４週）の患者の臨床応答又は非応答に関連していた。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、レプチンのベースライン濃度は、ゴリムマブで処置された患者に関するＡＳＡＳ２０として評価される第１４週の成果を予測するための、初期分類子であり得る。代替的な実施形態では、ベースラインオステオカルシン（osteocalin）は、ゴリムマブで処置された患者に関するＡＳＡＳ２０又はＢＡＳＤＡＩとして評価される第１４週の成果を予測するための、初期分類子であり得る。この情報は、医師により使用されて、ゴリムマブ処置から利益を得る者を決定することができ、また同様に重要なこととして、そのような処置から利益を得ない患者を同定することができる。
【００４９】
代替的に、ＢＡＳＤＡＩがモデルの臨床成績成分として使用された。またベースラインにおけるＴＩＭＰ−１、ベースラインにおけるオステオカルシン、又は補体成分３における変化は、分類用の初期マーカーであった。ＴＩＭＰ−１値が高い場合、Ｇ−ＣＳＦにおける変化と組み合わせ、ＴＩＭＰ−１値がカットオフ未満で、ＭＣＰ−１値がカットオフ値未満の場合、前立腺酸性ホスファターゼを組み合わせて、第１４週での成果を予測した。
【００５０】
抗−ＴＮＦα療法に対する応答のベースラインバイオマーカー予測
予測的アルゴリズムをベースラインバイオマーカー血清濃度値のみを含むデータセットから構築した際、抗−ＴＮＦα療法で処置したＡＳ患者の臨床応答を、臨床応答を評価するＡＳＡＳ２０及びＢＡＳＤＡＩ等の２つ以上の方法と相関付け、マーカーはレプチン、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４０リガンド、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、オステオカルシン、ＰＡＰ，及びインスリンを含んでいた。
【００５１】
本明細書で示したように、ベースライン（第０週、処置前）にてＡＳ患者から獲得した血清中のバイオマーカーの分析は、多重化測定法で定量化され、最良のＣＡＲＴモデルは、初期分類子としてレプチンを含んだ。３．８（対数目盛り）を越えるレプチンを有する対象は非応答者と予測され、３．８未満のレプチンを有する対象は二次予測物のＣＤ４０リガンドに基づいて分類される（１．０５を越えるＣＤ４０リガンドはＡＳ応答者と予測され、１．０５未満のＣＤ４０リガンドは非応答者と予測される）（図１）。モデルの感度は８６％であり、モデル特異性は８８％であった。臨床的尺度が、ＢＡＳＤＡＩにおけるベースラインから第１４週への変化であった場合、多重の異なるバイオマーカーにより定量化されたベースラインバイオマーカーデータが分類子：ＴＩＭＰ−１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＧＣＳＦ及びＭＣＰ−１（図２）、となったが、ＢＡＳＤＡＩモデルの全体の正確性はＡＳＡＳ２０モデルと同様であった。
【００５２】
ベースライン（第０週、処置前）でＡＳ患者から獲得した血清中のバイオマーカーの分析は、多重化測定法及び個々のＥＩＡで定量化され、最良のＣＡＲＴモデルは初期分類子としてオステオカルシンを含んだ。３．８７８（対数目盛り）を越えるオステオカルシンを有する対象は応答者と予測され、３．８７８未満のオステオカルシンを有する対象は、前立腺酸性ホスファターゼに基づいて更に分類される（図３）。モデル感度は９０％であり、モデル特異性は８４％であった。したがって、多重化測定法と個々のＥＩＡ測定法とからのデータを使用し、結果をＢＡＳＤＡＩ及びＡＳＡＳ２０のいずれかと相関付けることにより、両方が分類子としてオステオカルシン及び前立腺酸性ホスファターゼを含むモデルを生成した。ＢＡＳＤＡＩベースのモデルは、追加の分類子の１つとしてインスリンを組み込んだ。モデル正確性は、ＢＡＳＤＡＩ臨床応答の予測に関して６１／７６（８０％）であった（図４）。
【００５３】
これらの結果は、バイオマーカーのベースラインレベルが医師によって処置前に測定されて、ゴリムマブで処置したどの患者が処置に応答し又は応答しないかを同定できることを示唆する。
【００５４】
成果の早期予測物としてのバイオマーカー変化
臨床応答を評価するＡＳＡＳ２０及びＢＡＳＤＡＩ等の２つ以上の方法において、臨床応答と相関することが見出された、ＡＳ患者における、ベースライン血清レベルから第４週へのバイオマーカー変化は、レプチン、ＶＥＧＦ、補体３、ＩＣＡＭ−１及びフェリチンを含む。
【００５５】
多重のみで定量化された、ベースライン及び第４週においてＡＳ患者から獲得した血清中のバイオマーカーの分析に関して、バイオマーカーモデルは、初期分類子としてレプチンを使用する。３．８（対数目盛り）を越えるレプチンを有する対象は非応答者と予測され、３．８未満のレプチンを有する対象は、２つの追加の分類子、ｉ）補体３における変化、及びｉｉ）ＶＥＧＦに基づいて分類される（図５）。モデルの感度は９２％であり、モデル特異性は８１％であった。臨床的尺度がＢＡＳＤＡＩにおけるベースラインから第１４週への変化であった場合、全体の正確性はＡＳＡＳ２０モデルと同様であり、補体成分３における変化が初期分類子であり、ベースラインフェリチンを使用した２つのサブ分類が続き、その後にＩＣＡＭ−１における変化が続く（図６）。
【００５６】
抗−ＴＮＦα療法に対するＡＳ患者の応答又は非応答を予測するのに有用なアルゴリズムの生成のための本発明に記載した特定の例は、多数のマーカーがＡＳプロセスと相関することを示し、治療法に対する応答の診断又は予測におけるそれぞれの特定のバイオマーカーの定量的解釈は、今までに確率されていない本出願人らは、規定した特定のマーカーに基づいた患者データのサンプリングを用いてアルゴリズムが生成できることを証明した。本発明のマーカーを使用する１つの方法では、コンピュータ支援装置を使用して患者データを捕捉し、必要な分析を実行する。別の態様では、コンピュータ支援装置又はシステムは、「訓練データセット」と表現されるデータを使用して、予測的分析の適用に必要な分類子情報を生成する。
【００５７】
分析を実行するための器具、試薬及びキット
診断されたＡＳ患者の抗−ＴＮＦ療法に対する応答を予測するための血清バイオマーカーの測定は、本発明に記載される標準的な免疫化学的及び生物物理学的方法を使用して、臨床検査室又は研究所、又は病院若しくは病院以外の場所の中心研究所で実行されてもよい。マーカー定量化は、ＷＢＣカウント、血小板及びＥＳＲ等の他の標準的な測定と同一の時間に実行されてもよい。分析は、市販のキットを使用して個別に若しくはバッチで、又は個々の患者サンプルに多重化分析を用いて実行されてもよい。
【００５８】
本発明の一態様では、個別の及びセットの試薬を使用して、１つ以上の工程において、患者のサンプル中のバイオマーカー、又はバイオマーカー若しくはパネルの相対的又は絶対的な量を測定する。試薬を使用して、抗体免疫特異的なバイオマーカー等のバイオマーカーを捕捉してもよく、バイオマーカーは酵素結合免疫特異的測定法等の間接的測定により検出可能な、リガンドバイオマーカー対を形成する。単一分析物ＥＩＡ又は多重化分析のいずれかを実行し得る。多重化分析は、単一の血清サンプルを使用して、多数の同時のＥＩＡベースの測定法を実行できる技術である。非常に少量のサンプル容積中の多数のバイオマーカーを定量化するのに有用な１つのプラットホームは、Ａｕｓｔｉｎ，ＴｅｘａｓのＲｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ所有）により使用されるｘＭＡＰ（登録商標）技術であり、光学的分類スキーム、生化学的測定法、フローサイトメトリー並びに高度なデジタル信号処理ハードウェア及びソフトウェアを組み合わせることにより、単一の反応容器内で１００に至る多重化ミクロスフェアベースの測定法を実行する。この技術では、多重化は、分析物特異的なそれぞれの測定法に、固有の蛍光サインで標識されたミクロスフェアセットを割り当てることにより達成される。多重化測定法は流通装置内で分析され、この装置は、ミクロスフェアが赤色及び緑色レーザーを通過する際に各ミクロスフェアを個々に調べる。代替的に、方法及び試薬を使用して、質量、電荷又は組み合わせ、例えばＳＥＬＤＩを用いる等の直接物理的測定を用いて、サンプルを検出及び可能な定量化のために加工する。ＮｅｘｔＧｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）により提供されるもの等、定量的質量分析による多数反応監視測定法が開発されている。
【００５９】
したがって、本発明の一態様によれば、ＡＳ状態の評価のためのバイオマーカーの検出は、対象からのサンプルを、バイオマーカーと試薬との結合を可能にする条件下で基質、例えば、上部に捕捉試薬を有するプローブと接触させた後、吸着剤に結合されたバイオマーカーを好適な方法により検出することを含む。マーカーを検出する１つの方法は、気相イオン分光法、例えば質量分析法である。この目的に使用し得る他の検出パラダイムには、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリー（voltametry）、電流測定又は電気化学蛍光法）、原子力顕微鏡及び高周波法、例えば多重共鳴分光法（multipolar resonance spectroscopy）が挙げられる。顕微鏡法に加えて、共焦点及び非共焦点の両方の光学的方法の例は、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、及び複屈折又は屈折率の検出（例えば表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、回折格子結合器導波管法（grating coupler waveguide method）又はインターフェロメトリー）、並びに酵素結合比色分析又は蛍光法である。
【００６０】
患者からの標本は、検出方法に適用する前に、非限定的に、マーカーを標本の他の成分から濃縮、精製又は分離する方法等の方法で、加工済み標本又はサンプルに加工する必要があり得る。例えば、分析物濃度の検出方法に供される前に、血液サンプルを典型的には抗凝固薬で処理し、細胞成分及び血小板を除去する。代替的に、検出は連続加工システムにより達成されてもよく、前記システムは、材料及び試薬を組みこんで、そのような濃縮、分離又は生成工程を達成し得る。一実施形態において、加工システムは、捕捉試薬の使用を含む。捕捉試薬の１つのタイプは、典型的にはクロマトグラフィーで使用される材料である「クロマトグラフィー吸着剤」である。クロマトグラフィー吸着剤には、例えばイオン交換材料、金属キレーター、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、染料、単純生体分子（例えばヌクレオチド、アミノ酸、単糖及び脂肪酸）、混合モード吸着剤（例えば疎水性誘引／静電反発吸着剤）が挙げられる。「生体分子特異的」捕捉試薬は、生体分子、例えばヌクレオチド、核酸分子、アミノ酸、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド又はこれらの抱合体（例えば糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質）である捕捉試薬である。所定の場合に、生体分子特異的吸着剤は、多タンパク質複合体、生体膜又はウイルス等の巨大分子構造であってもよい。具体的な生体分子特異的吸着剤は、抗体、受容体タンパク質及び核酸である。生体分子特異的吸着剤は、一般に、クロマトグラフィー吸着剤と比較して高い、標的分析物に対する特異性を有する。
【００６１】
したがって、本発明によるバイオマーカーの検出及び定量化は、所定の選択性状況、例えば吸着剤又は洗浄溶液を使用することにより向上される。洗浄溶液とは、吸着剤表面に対する分析物の吸着に影響を与え若しくは前記吸着を変更し、及び／又は表面から未結合材料を除去するのに使用される、典型的には溶液である薬剤を指す。洗浄溶液の溶出特性は、例えばｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピズムの程度、洗剤強度、及び温度に依存し得る。
【００６２】
本発明の一態様では、サンプルは多重化様式で分析され、これは患者サンプルからのマーカーの加工が実質的に同時に行われることを意味する。一態様において、サンプルは固有の特異性を示す多数の捕捉試薬を含む基質により接触される。捕捉試薬は、通常、免疫特異的な抗体、又はその断片である。基質は、捕捉試薬（１つ又は複数）が取り付けられる一般に平面状の表面を有する固体基質を示す用語である「バイオチップ」等の単一成分であってもよく、又は捕捉試薬は、多数の基質の間で分離され、例えば、個々の球状の基質（ビーズ）に結合していてもよい。度々、バイオチップの表面は、複数の指定可能な位置を含み、前記位置のそれぞれには捕捉試薬が結合されている。バイオチップは、プローブインターフェイスと係合するよう適合されてもよく、それにより、気相イオン分光法、好ましくは質量分析法においてプローブとして機能する。代替的に、本発明のバイオチップは別の基質上に装着されて、分光計内に挿入され得るプローブを形成してもよい。ビーズの場合、個々のビーズは、サンプルに暴露された後、検出のために分配又は選別されてもよい。
【００６３】
本発明によるバイオマーカーの捕捉及び検出のために、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ ＣＴ）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）及びＰｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｏｒｐ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）等の商業的供給源から多様なバイオチップが入手可能である。これらのバイオチップの例は、前述の米国特許第６，２２５，０４７号及び同第６，３２９，２０９号（Ｗａｇｎｅｒら）、並びにＷＯ ９９／５１７７３号（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ及びＷａｇｎｅｒ）、ＷＯ ００／５６９３４号（Ｅｎｇｌｅｒｔら）に記載されているものであり、特に、Ｗｏｈｌｓｔａｄｔｅｒら、ＷＯ９８／１２５３９及び米国特許第６０６６４４８号に教示されている多特異的、多アレイ等の、サンプル中の分析物マーカーの存在又は量の検出に電気化学的方法及び電気化学発光方法を使用するものである。
【００６４】
生体分子特異的な捕捉及び／又は検出試薬を有する基質を、例えば血清を含むサンプルと、存在し得るバイオマーカーが試薬に結合できるのに十分な期間接触させる。本発明の一実施形態では、上部に生体分子特異的な捕捉又は検出試薬を有する２つ以上のタイプの基質を、生物サンプルと接触させる。インキュベーション期間後、基質を洗浄して、未結合材料を除去する。任意の好適な洗浄溶液を使用することができ、好ましくは水性溶液が使用される。
【００６５】
基質に結合したバイオマーカーは、脱着後に直接、飛行時間型質量分析計等の気相イオン分光計を使用することにより検出される。バイオマーカーはレーザー等のイオン化源によりイオン化され、生成されたイオンはイオン光学アセンブリにより収集された後、質量分析器が、通過するイオンを分散及び分析する。次いで、検出器が、検出イオンの情報を質量対電荷比に翻訳する。バイオマーカーの検出は、一般に、信号強度の検出を含むであろう。したがって、バイオマーカーの量及び質量の両方が決定され得る。そのような方法はバイオマーカーの発見に使用することができ、ある場合には、バイオマーカーの定量化に使用することができる。
【００６６】
別の実施形態では、本発明の方法は、例えば米国特許第５５７１４１０号及びＵＳＲＥ３６３５０号に教示されているような、液相中の小分子及び／又は巨大分子溶質の検出及び分析に有用な、液体サンプル取り扱いを小型化できるミクロ流体装置、及び液相分析のための分析装置であり、場合により、クロマトグラフィー分離手段、電気泳動分離手段、通電クロマトグラフィー分離手段、又はそれらの組み合わせを使用する。ミクロ流体装置又は「ミクロ装置」は、分析物流体が分離され得るよう配置された多数のチャネルを含んでもよく、それによりバイオマーカーが捕捉され、場合により装置内の指定可能な位置で検出されることができる（米国特許第５６３７４６９号、同第６０４６０５６号及び同第６５７６４７８号）。
【００６７】
バイオマーカーの検出により生成したデータは、プログラム可能なデジタルコンピュータの使用により分析され得る。コンピュータプログラムはデータを分析して、検出されたマーカーの数と信号強度とを示す。データ分析は、バイオマーカーの信号強度を決定する工程と、所定の統計分布から逸脱したデータを除去する工程とを含んでもよい。例えば、データはある参照に対して正規化されてもよい。コンピュータは、得られたデータを表示のために、又は所望であれば更なる分析のために、様々なフォーマットに変換し得る。
【００６８】
人工ニューラルネットワーク
いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークが使用される。ニューラルネットワークは、マーカーの選択されたセットのために構成され得る。ニューラルネットワークは、二段階回帰又は分類モデルである。ニューラルネットワークは層構造を有し、層構造は、重み層により出力ユニットの層に接続された入力ユニット（及びバイアス）の層を含む。回帰のために、出力ユニットの層は、典型的には１つのみの出力ユニットを含む。しかしながら、ニューラルネットワークは、途切れのない様式で、多数の定量的応答を取り扱うことができる。
【００６９】
多層ニューラルネットワークには、入力ユニット（入力層）、隠れユニット（hidden unit）（隠れ層（hidden layer））及び出力ユニット（出力層）が存在する。更に、入力ユニット以外の各ユニットに接続された単一のバイアスユニットが存在する。ニューラルネットワークは、Ｄｕｄａら、２００１，Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ａｍｐ；Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；及びＨａｓｔｉｅら、２００１，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【００７０】
ニューラルネットワークを使用する基本的な手法は、未学習ネットワークから開始し、訓練パターン、例えば訓練データセット内の患者からのマーカープロファイルを入力層に提示し、ネットを介して信号をパスし、出力、例えば訓練データセット内の患者の予後を出力層にて決定する。次いで、これらの出力は標的値、例えば訓練データセット内の患者の実際の成果と比較され、差異は誤差に対応する。この誤差又は基準関数は、ある重みのスカラー関数であり、ネットワーク出力が所望の出力と一致した際に最小限となる。したがって、重みはこの誤差の測定値を低減するよう調整される。回帰では、この誤差は、誤差平方和であってもよい。分類では、この誤差は、平方誤差又はクロスエントロピー（偏差）のいずれかであってもよい。例えばＨａｓｔｉｅら、２００１，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００７１】
通常使用される３つの訓練プロトコルは、確率、バッチ及びオンラインである。確率訓練では、訓練セットからパターンがランダムに選択され、各パターン提示のためにネットワーク重みが更新される。確率的バックプロパゲーション等の勾配降下法により学習された多層非線形ネットワークは、ネットワークトポロジーにより規定されるモデルにて重み値の最尤法を実行する。バッチ訓練では、学習が行われる前に、全パターンがネットワークに提示される。典型的には、バッチ訓練では、訓練データにより数個のパスが形成される。オンライン訓練では、各パターンが１回提示され、ネットに１回のみ提示される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、重みのために出発値が考慮される。重みがほぼ０の場合、ニューラルネットワークの隠れ層に通常使用されるシグモイドの有効部分（例えばＨａｓｔｉｅら、２００１，Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）は、大体線形であるため、ニューラルネットワークは、およそ線形モデルに崩壊する。いくつかの実施形態では、重みのための出発値は、ほぼ０であるランダム値であるよう選択される。したがって、モデルはほぼ線形から出発し、重みが増大するにつれて非線形となる。個々のユニットは方向に局在し、必要に応じて非線形性を導入する。正確な０の重みの使用は、０誘導体及び完全な対称性をもたらし、アルゴリズムは決して動かない。代替的に、大きい重みは度々乏しい解をもたらす。
【００７３】
入力のスケーリングは、ボトム層の重みの効果的なスケーリングを決定するため、最終的な解の品質に大きい影響を与え得る。したがって、いくつかの実施形態では、平均０及び標準偏差１を有するように最初に全発現値を標準化する。このことは全入力が正則化プロセスにて等しく処理されることを確実にし、ランダムな開始重みのための重要な範囲を選択することを可能にする。標準化入力と共に、範囲−０．７、＋０．７に亘りランダムな均一重み（random uniform weight）をとるのが典型的である。
【００７４】
隠れ層を有するネットワークを使用する際に頻発する問題は、ネットワーク内で使用する最適な数の隠れユニットである。ネットワークの入力及び出力数は、解決するべき問題によって決定される。本明細書に開示した方法では、所定のニューラルネットワークのための入力数は、選択されたマーカーのセットにおけるマーカーの数であってもよい。
【００７５】
ニューラルネットワークのための出力の数は、典型的には１つのみ、肯又は否であるが、いくつかの実施形態では２つ以上の出力が使用されて、２つのみを越える状態がネットワークによって定義される。
【００７６】
データの分析に使用されるソフトウェアは、信号の分析にアルゴリズムを適用するコードを含んで、信号が本発明によるバイオマーカーに対応する信号におけるピークを提示するか否かを決定することができる。ソフトウェアは観察されたバイオマーカー信号に関するデータを分類木又はＡＮＮ分析に供して、バイオマーカー、又は、患者の疾病診断又は状態を示すバイオマーカー信号の組み合わせが存在するか否かを決定することもできる。
【００７７】
したがって、プロセスは、学習段階と分類段階とに分割され得る。学習段階において、学習アルゴリズムは、分類が意図される異なるクラスのメンバーを含むデータセット、例えばＡＳと診断された及び抗−ＴＮＦα療法に応答した患者からの複数のサンプルからのデータ、及び陰性成績を有する患者、抗−ＴＮＦα療法に応答しなかったＡＳ患者からの複数のサンプルからのデータに適用される。データの分析に使用される方法には、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、遺伝子アルゴリズム及び自己組織化マップ並びに分類及び回帰木分析が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、例えばＷＯ０１／３１５７９号、２００１年５月３日（Ｂａｒｎｈｉｌｌら）；ＷＯ０２／０６８２９号、２００２年１月２４日（Ｈｉｔｔら）及びＷＯ０２／４２７３３号、２００２年５月３０日（Ｐａｕｌｓｅら）に記載されている。学習アルゴリズムは、通常、組み合わせで特定のマーカー及び特定のマーカーの濃度等のデータに適するよう調整された分類アルゴリズムを生成し、このアルゴリズムは、未知サンプルを２つのクラス、例えば非応答者に対する応答者に分類し得る。分類アルゴリズムは、最終的に予測的試験に使用される。
【００７８】
データ内のパターンを分析し、また成功のために任意の所定の基準を用いて追加のパターンを考案するためのフリーウェア及び専売ソフトウェアの両方のソフトウェアが容易に入手可能である。
【００７９】
キット
別の態様では、本発明は、ゴリムマブ等の抗−ＴＮＦα剤を用いた処置に応答するか又は応答しないかを決定するためのキットを提供し、キットは、本発明に従って血清マーカーを検出するのに使用される。キットは、ＡＳ患者内で異なるように存在する血清マーカー及びマーカーの組み合わせの存在に関してスクリーニングする。
【００８０】
一態様において、キットはサンプルを収集するためのランセット（lance）又は穿刺ツール等の、皮膚の「突き刺し」を生じる手段を含む。キットは、場合によりスティックから血液を収集するための、毛細管等のプローブを含んでもよい。
【００８１】
一実施形態において、キットは、本発明によるマーカーを結合する、生体特異性の１つ以上の捕捉試薬を有する基質を含む。キットは、それぞれ同一の又は異なる基質上に存在する、１つ（one）以上の生体特異性の捕捉試薬を含んでもよい。
【００８２】
更なる実施形態では、そのようなキットはラベル又は別個の挿入物の形態を有する、好適な操作パラメータに関する指示書を含んでもよい。例えば、指示書は、サンプルの収集法、又はプローブを空にし若しくは洗浄する方法を、消費者に知らせ得る。更なる別の実施形態では、キットは、検定（calibration）のための基準として使用されるバイオマーカーサンプルを有する１つ以上の容器を含んでもよい。
【００８３】
抗−ＴＮＦ療法に対するＡＳ患者の応答を予測するための本発明のアルゴリズムの使用方法では、抗−ＴＮＦ療法の前と、治療法の開始後の特定の期間とに、血液又は他の流体が患者から獲得される。血液は血清部分を抽出するために加工され、又は全体が使用されてもよい。血液又は血清サンプルは、例えば１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、又は１：１００に希釈され、又は未希釈で使用されてもよい。１つのフォーマットでは、血清又は血液サンプルは既成の試験ストリップ又はスティックに適用され、室温で、１分間、５分間、１０分間、１５分間、１時間又はそれ以上等の特定の時間中インキュベートされる。特定の測定法の時間後、サンプル及び結果は、ストリップから直接読み取り可能である。例えば、結果は、１つ以上のマーカーの濃度範囲を示す、着色帯又は灰色帯の様々な色合いとして出現する。試験ストリップキットは、１つ以上のマーカーの相対的な濃度に基づいて結果を解釈するための指示書を提供するであろう。代替的に、ストリップ上のマーカー検出システムの彩度を検出可能な装置を提供してもよく、この装置は、場合により、その一連のマーカーに関する適切な診断アルゴリズムに基づいて試験解釈の結果を提供してもよい。
【００８４】
本発明の使用方法
本発明は、ＡＳと診断された患者において検出されたバイオマーカーを分析することによる、ゴリムマブ等の抗−ＴＮＦα剤による治療法に対する応答性を予測する方法を提供する。本発明の方法では、患者は、主観的及び客観的基準を使用して、経験豊かな専門家によりＡＳと最初に診断される。
【００８５】
ＡＳの発病に関する継続した研究は、開始因子の識別、下流事象、炎症のメディエータ、及びプロセスの制御因子に焦点を当てている。ＡＳ発症危険性のおよそ９０％が遺伝性であると推定されている。最強の遺伝的危険性因子は、ＨＬＡ−Ｂ２７分子に関連している。危険性に果たすＨＬＡ−Ｂ２７の重要な役割を前提として、数個の可能な機構が提案されている。しかしながら、強い興味及び活発な研究にも関わらず、ＨＬＡ−Ｂ２７がどのように疾病の罹り易さに寄与しているかの一般的な見解は未だ存在しない。環境因子の役割は尚理解しづらく、ＡＳが靱帯及び腱の骨に対する結合（腱付着部）に関与し、又は仙腸関節に関与する傾向の理解も同様である。
【００８６】
ＡＳの主要な臨床的特徴には、仙腸関節炎により生じる炎症性背部痛、軸方向骨格内の他の位置の炎症、末梢関節炎、腱付着部炎及び前部ぶどう膜炎が挙げられる。構造的変化は、骨低下（osteodestruction）ではなく、主に骨増殖により生じる。靱帯骨棘及び関節強直は、この疾病の最も独特な特徴である。ＡＳの独特な症状は、腰痛、殿部痛、制限された脊椎可動性、股関節痛、肩部痛、末梢関節炎及び腱付着部炎である。神経症状は、疾病の数個の合併症による索又は脊髄神経の圧迫により生じ得る。強直した脊柱を有する患者に脊椎骨折が発生し、外傷は最小限又は存在しない。最も通常の骨折部位は、Ｃ５−６間隙である。ＡＳ患者の２１％に臨床的に有意な環軸椎亜脱臼が生じる場合があり、環軸椎亜脱臼は脊髄圧迫に繋がり得る。馬尾症候群は、長期にわたるＡＳの希な合併症であり、その原因の理解は乏しく、炎症、くも膜炎、機械的伸展（mechanical stretching）、神経根の圧迫、脱髄及び虚血を含む。
【００８７】
臨床的評価方法
ＡＳの診断は、１９８４ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ Ｓ，Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇ ＨＡ，Ｃａｔｓ Ａ：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ．Ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｃｒｉｔｅｒｉａ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２７：３６１〜３６８，１９８４）により規定されるいくつかの撮像技術による仙腸関節炎の臨床的特徴と証拠との組み合わせにより行われる。赤血球沈降速度（ＥＳＲ）及びＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル等の、疾病の研究室マーカーは、疾病活性の評価、又は処置に対する応答の監視には役立たないことが示されている（Ｓｐｏｏｏｒｅｎｂｅｒｇ Ａら、１９９９ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２６：９８０〜４）。
【００８８】
臨床的基準は、１）腰痛及び３ヶ月を越える持続時間における硬直、該硬直は、運動により改善するが安静により軽減されない、２）矢状及び前頭（冠状）面の両方における腰椎の動きの制限、３）年齢及び性別で補正された正常値と比較した胸郭拡張の制限である。放射線学的基準は、両側仙腸関節炎グレード２以上、又は片側グレード３以上である。仙腸関節炎の放射線学的等級付けは、５つのグレードからなる。グレード０は正常な脊椎であり、グレード１は疑わしい変化を示し、グレード２は幾分の侵食を有する硬化を示し、グレード３は重篤な侵食、関節腔の偽拡張、及び部分的な関節強直を示し、グレード４は完全な関節強直を示す。明確なＡＳは、１つの放射線学的基準が、少なくとも１つの臨床的基準と関連した際に存在する。ＡＳの高い可能性は、３つの臨床的基準が存在し、又は放射線学的な基準が存在し、かつ臨床的基準を満足する徴候若しくは症状が存在しない場合に考慮される。臨床的グレードをデータセットの一部として使用して、治療法に対する応答の予測的アルゴリズムを生成してもよい。
【００８９】
ＡＳの診断が確立されたら、医師は一般に、臨床成果を長軸方向に監視して、疾病の悪化の危険性にある患者を同定する。強直性脊椎炎の評価試験群（ＡＳＡＳ）は、管理のための疾病の多数のコアパラメータを規定している。ＡＳ患者の疼痛は、通常、背部に限定されるが、軸方向外の部位（extra-axial site）は、末梢疾病所見を有する患者における鎮痛療法の主な焦点であり得る。単一の１００ｍｍ水平視覚的アナログ目盛り（ＶＡＳ）を使用して、夜間及び通常の脊椎痛を測定する。抗−ＴＮＦ療法で処置されたＡＳ患者において、ＡＳＡＳは応答基準を開発している。これら基準のうちの数個は下記に概略され、又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ若しくはリウマチ学者との接触により得ることができる。
【００９０】
ＡＳＡＳ２０は「スコア」の生成に使用される数個の基準の２０％改善を反映している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＪら、２００１ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４４：１８７６〜１８８６）。ＡＳＡＳ改善基準は、処置に対する陽性応答を、第１に、２０％の相対的な改善、第２に、１０ユニットの３〜４のドメイン（炎症、機能、疼痛の患者知覚、及び患者の全体的な健康、第４のドメインの悪化がない）における明白な改善として規定する。
【００９１】
ＢＡＳＤＡＩ（Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾病活性インデックス）は、ＡＳ患者における炎症活性を規定する。炎症は、不快感の程度、及び患者が経験する朝硬直を評価することにより、臨床的に評価され得る。ＢＡＳＤＡＩは自己管理インデックスであり、各質問は、１００ｍｍ ＶＡＳ内に構成されている（範囲０〜１００、０＝硬直なし、１００＝非常に重篤な硬直）。スコアは処置による変化に敏感であることが示されている。
【００９２】
ＢＡＳＭＩ（Ｂａｔｈ強直性脊椎炎計測学インデックス）は、定量的な、医師が評価した、ＡＳ患者が経験する脊椎可動性の制限の尺度である。ＢＡＳＭＩは、５つの臨床的測定値からなる有効なインデックスであり、該測定値は、頸部回転、耳株から壁迄の距離、側棘屈曲（lateral spine flexion）、腰椎屈曲、及び軸方向分節関与を反映する果間距離である。ＢＡＳＭＩは良好な観察者間の信頼性を示すことが証明されているが、急性炎症の結果としての物理的制約を、慢性疾病損傷により生じるものと区別することができない。患者の寿命に亘るＢＡＳＭＩの進行を示す、発行されている長軸方向の研究は存在しないが、患者のＢＡＳＭＩスコアは、ＡＳ患者が進行性疾病を発症するにつれて時間の経過と共に徐々に増大することが仮定される。ある場合に、ＢＡＳＭＩを脊髄Ｘ線写真と相関付けることにより、Ｘ線像上の損傷の存在との有意な相関が示された。
【００９３】
ＢＡＳＦＩ（Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能性インデックス）は、物理的機能の尺度を使用して、連日の任務を実行する患者の能力の限界の程度を評価する。物理的機能は、ＢＡＳＦＩ及びＤｏｕｇａｄｏｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｄｅｘ（ＤＦＩ）を使用して測定される。しかしながら、ＢＡＳＦＩは、診療及び臨床試験の両方で最も広く使用されている尺度である。
【００９４】
本明細書に記載される臨床的インデックスは患者データセットの一部であり、数値スコアを割り当て得ることが認識されるであろう。
【００９５】
以前の治療法の失敗
ＡＳＡＳは、ＡＳにおける抗−ＴＮＦ療法の必要性に関する合意書を準備している（Ｂｒａｕｎら、２００３ Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６２：８１７〜８２４）。軸方向疾病、末梢関節及び腱付着部炎のＡＳの３つの全提示に関して、処置の失敗を少なくとも３ヶ月の標準的なＮＳＡＩＤ処置の試験として定義した。抗−ＴＮＦ療法を開始する前、患者は、最大推奨又は最大許容抗−炎症投与量の使用に基づいて、これらの薬物が矛盾しない限り、少なくとも２つのＮＳＡＩＤの十分な治療的試験を有している必要がある。
【００９６】
軸方向疾病、末梢関節及び腱付着部炎の３つ全部に関して、ＮＳＡＩＤ処置の失敗が必要である。
症候性軸方向疾病では、抗−ＴＮＦ療法の開始前に追加の処置を必要としない。
症候性末梢関節では、少関節炎において関節内コルチコステロイド処置（少なくとも２回の注射）の失敗が通常必要とされる。矛盾せず又は許容不可能でない限り、３ｇ／日迄のｍ最大許容投与量における、スルファサラジンを用いた標準的なＤＭＡＲＤ処置を４ヶ月間処方される必要がある。
症候性腱付着部炎では、少なくとも２回の局所ステロイド注射からなる十分な治療的試験が、これらの注射が矛盾しない限り、通常必要である。
【００９７】
ＴＮＦａ療法に対する適合性
インフリキシマブ等の抗−ＴＮＦα剤は市販されており、数年に亘りＡＳの処置に使用されている。抗−ＴＮＦα剤は、強直性脊椎炎の劇的な改善をもたらし、疾病の異なる症状を寛解させ、生活の質を向上させることが示されている。ＡＳ患者は、臨床評価を越える追加の基準、場合により、ＮＳＡＩＤｓ及び理学療法、スルファサルジン（sulfasalzine）又はメトトレキサート又はビスホスホネート等の等の代替療法に応答しないことに基づいて、抗−ＴＮＦα療法の候補者として考慮され得る。
【００９８】
患者管理
抗−ＴＮＦ療法に対する早期応答を予測又は評価するための本発明の方法では、抗−ＴＮＦ療法の開始前の「ベースライン訪問」時に、抗−ＴＮＦ療法で処置される患者からベースライン、即ち、「第０週」のサンプルを獲得する。サンプルは、本発明の方法に関連したバイオマーカーを評価し得る任意の組織であってもよい。一実施形態において、サンプルは、血液、血清、尿、精液及び便からなる群から選択される流体からなる群から選択される流体である。特定の実施形態では、サンプルは、直接静脈穿刺又は静脈カテーテルを介した標準的な方法により引かれた患者の血液から得られた血清サンプルである。
【００９９】
加えて、ベースライン訪問において、ＡＳを有する患者の個体群統計学及び病歴に関する情報が、標準化された書式又は症例記録表に記録されるであろう。患者の診断からの時間、以前の処置歴、併用薬物療法、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル、及び疾病活性の評価（即ち、ＢＡＳＤＡＩ、ＢＡＳＭＩ）等のデータが記録される。
【０１００】
患者は、ベースライン訪問の時、又は２４〜４８時間以内に抗−ＴＮＦ療法の第１の投与を受ける。ベースライン訪問時、患者は第４週の訪問について予定を決められる。
【０１０１】
第４週の訪問では、抗−ＴＮＦα療法の初期投与からおよそ２８日後、好ましくはベースラインサンプルと同一のプロトコル及び経路を使用して、第２の患者サンプルが獲得される。患者を検査し、医療専門家が禁止したような他のインデックス、撮像若しくは情報、又は指定された試験設計を実行又は監視してもよい。患者は、ＡＳＡＳ及びＢＡＳＤＡＩに示されたセット等の基準を用いた疾病の評価と、バイオマーカー評価のための患者サンプルの獲得とを行う目的で、第８週、第１２週、第１４週、第２８週等の次の訪問の予定が決められる。
【０１０２】
処置前、処置中又は処置後の任意の時間又は上記の時間において、患者のサンプル又は患者から獲得した他の流体若しくは組織サンプル中で、他のパラメータ及びマーカーを評価してもよい。それらにはヘモグロビン含有量、ヘマトクリット、赤血球容積、平均赤血球径、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）等の標準的な血液学的パラメータが含まれてもよい。ＡＳの存在の評価に有用であると測定されている他のマーカーは、患者のサンプルのいくつか又は全部にて定量化されてもよく、前記他のマーカーは、ＣＲＰ（Ｓｐｏｏｒｅｎｂｅｒｇ Ａら、１９９９．Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２６：９８０〜９８４）及びＩＬ−６、並びに血清１型Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、尿中ＩＩ型コラーゲンＣ−テロペプチド（尿中ＣＴＸ−ＩＩ）及び血清マトリクスメタロプロテアーゼ（metalloptrotesase）３（ＭＭＰ３、ストロメライシン１）（米国特許第２００７０１７２８９７号参照）等の軟骨分解のマーカーである。
【０１０３】
処置に対する応答の評価に有用であり得る追加の炎症関連のマーカーは、ＩＬ−８又はＩＬ−１等の炎症性サイトカイン、ＥＮＡ−７８／ＣＸＣＬ５、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１β等の炎症性ケモカイン；血管新生関連のタンパク質（ＥＧＦ、ＶＥＧＦ）；ＭＭＰ−９、ＴＩＭＰ−１等の追加のプロテアーゼ；ＩＦＮγ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０等の細胞性免疫システム（ＴＨ−１）上に作用する分子；並びにＩＬ−４及びＩＬ−１３を含む体液性免疫システム（ＴＨ−２）上に作用する分子；ＦＧＦ塩基性等の増殖因子；ミエロペルオキシダーゼを含む炎症の一般的マーカー；並びにＩＣＡＭ−１等の接着関連分子であってもよい。
【０１０４】
医療専門家による応答の臨床的判断は、試験結果により否定されるべきではない。しかしながら、試験はゴリムマブによる処置を中止する決定を行う補助となり得る。予測モデル（アルゴリズム）が９０％感度及び６０％特異性を有する試験では、５０％の患者が臨床応答を示し、５０％が評価スコア又は評価を示さない場合、臨床応答と一致する。これは、応答者のうち４５％が正確にＡＳ応答者と同定され（５人が非応答者の可能性があると報告される）、３０％又は非応答者が正確に非応答者として同定される（２０％が応答者の可能性があると区別される）ことを意味する。したがって、全体的な利益は、６０％の全員の真の非応答者が不必要な治療法を割愛し、又は早期の時間点（第４週）で治療法を中止することである。５％の偽陰性「応答者」（非応答者の可能性があると同定）は処置されており、全患者と同様、前記応答者の応答は、第１４週又はその後の処置を連続する又は中止する決定を行う前に、臨床的に判断されるであろう。２０％の偽陰性「非応答者」（可能な応答者と同定）は、臨床的に判断される必要があり、処置の中止の決定を行うのに通常の時間を要するであろう。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：試料採取及び解析
Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｃ０５２４Ｔ０９、多施設ランダム化、二重盲、プラセボ対照、３−アーム試験に登録した患者から血清サンプルを獲得し評価した。３つのグループは、プラセボと、抗−ＴＮＦα Ｍａｂ処置の２つの用量レベルとからなり、ゴリムマブ５０ｍｇ、又はゴリムマブ１００ｍｇが活動性強直性脊椎炎を有する患者内の４週間毎のＳＣ注射として投与される。一次有効性評価は、第１４週及び第２４週に行った。バイオマーカー試験用の血清サンプルを、１００人の患者からベースライン（第０週）、第４週及び第１４週にて収集した。
【０１０６】
Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、又は単一分析物ＥＬＩＳＡにより実行される多重分析を用いた、市販の測定法により血清のバイオマーカーを分析した。全サンプルを、試験迄、−８０℃で保管した。サンプルを室温で解凍し、ボルテックスし、清澄のために１３，０００×ｇで５分間高速回転させ、抗原分析のために１５０ｕＬをマスターマイクロタイタープレート内へと除去した。自動化ピぺッティングを用いて、各サンプルのアリコートを分析物の捕捉ミクロスフェア多重物（multiplex）の１つに導入した。サンプルと捕捉ミクロスフェアとのこれらの混合物を徹底的に混合し、室温で１時間インキュベートした。各多重物のためのビオチン化、レポーター抗体の多重化カクテルを使用し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンを使用して検出した。分析はＬｕｍｉｎｅｘ １００器具及内で実行され、得られたデータ流は、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより開発され、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓに使用許諾された専売のデータ分析ソフトウェアを使用して解釈した。各多重物のために、較正器及びコントロールの両方を作動させた。試験結果は、最初、各多重物に関して、高、中及び低コントロールについて決定して、適切な測定法の遂行を確実にした。特定の多重物中に局在するそれぞれの分析物の未知の値は、データ分析パッケージ内に含まれる４つ及び５つのパラメータ、重み付き及び非重み付き曲線適合アルゴリズムを使用して決定した。各時間点において、合計９２のタンパク質バイオマーカーを測定した（表１）。
【０１０７】
【表２−１】
【０１０８】
【表２−２】
【０１０９】
【表２−３】
【０１１０】
９２のバイオマーカーのそれぞれは、定量下限（ＬＯＱ）を有する。分析にバイオマーカーを使用する基準は、バイオマーカーが少なくとも２０％のサンプルにおいて定量限界を越えることを必要とした。３００のサンプルからの９２のバイオマーカのうち、６３（６８％）が、分析に含まれるためのその基準を満たした。各バイオマーカーの分布の評価を行って、そのバイオマーカーのｌｏｇ変換が保証されたか否かを決定した。この評価は、処置群に関わりなく行った。全体で、分析セット内の６３のバイオマーカーのうちの６０がｌｏｇ２変換された。表２は、最終分析に含まれたバイオマーカー、ＬＯＱ、及びｌｏｇ変換が可能であったか否かを同定する。
【０１１１】
追加のベースラインバイオマーカー分析
所定のマーカーが多重試験メニューに含まれなかったため、Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ多重分析に加えて単一のＥＩＡ方法を使用して、血清バイオマーカーデータの追加のセットを生成した。追加のマーカーを多重バイオマーカーデータセットと組み合わせて、単一及び多重マーカーの組み合わせに基づくモデル正確性を決定した。これらのデータは、予測的モデルの一部のみとして含まれた。
【０１１２】
【表３−１】
【０１１３】
【表３−２】
【０１１４】
サンプル相関マトリックスからの平均対相関も評価し、全サンプルは、他のサンプルと少なくとも平均８９％の相関を示し、バイオマーカーデータは対象サンプル全体で一貫していることを示した。
【０１１５】
バイオマーカーに関する要約統計量を、表３に示す。ベースラインバイオマーカーレベルの分布は、一般に、３つの処置群の全体で均衡していた。
【０１１６】
【表４−１】
【０１１７】
【表４−２】
【０１１８】
ゴリムマブ処置群では、多数のマーカーが、ベースラインレベルから第４週及び第１４週へと有意に変化した。プラセボ処置対象では、遙かに限定されたマーカーのセットが変化した。一般に、２つのゴリムマブ用量群の間の差異は、有意ではなかった。対象内でのベースラインからの変化を、ゴリムマブ群（組み合わせた用量群）とプラセボ群との間で比較した。測定されたマーカーのおよそ半分が、ゴリムマブとプラセボとの間で、ベースラインからの変化の有意な差異を示し（表４）、５）は、組み合わせたゴリムマブ群とプラセボ群との間で、ベースラインからの変化の有意な（ｐ＜０．０１）差異を有するマーカーを示す。
【０１１９】
【表５】
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
実施例２：マーカー及び関連性
予測的モデル又はアルゴリズムを構築するために、マーカーデータを試験の臨床エンドポイントに関連して評価した。この試験では、ＡＳＡＳ２０第１４週、ＡＳＡＳ２０第２４週、ＢＡＳＭＩにおける変化第１４週、ＢＡＳＦＩにおける変化第１４週、及びＢＡＳＤＡＩにおける変化第１４週と規定される６つの臨床エンドポイントが存在した。これらの試験エンドポイントは、患者の疾病状態を評価するための一般に受け入れられている臨床的方法である。タンパク質バイオマーカーのサブ試験における１００人の患者と、収集された試験エンドポイントとを下記に示す（表６）。
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
表７に、臨床応答の一次エンドポイントを示し、エントリーは群の応答者／全体を表す。これは、バイオマーカーサブ試験の主な焦点ではないが、このコホート内で臨床エンドポイントに対する処置効果を評価するために試験を解釈することに尚役立つ。表７に示すように、ゴリムマブ処置群の応答は、ＢＡＳＭＩを除いて、評価した臨床エンドポイントの範囲全体で、プラセボに対して有意に上位であった。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
タンパク質マーカー試験に参加している試験患者において、性別が６つの臨床エンドポイントのうちの３つに有意に関連していた（表８）。性別は多数のタンパク質バイオマーカーとも有意に関連していた。そのため、性別はバイオマーカー値と臨床エンドポイントとの間の関連性を試験されるモデルを調整するための共変数として使用された。この調整を有さない場合、性別と相関したマーカー（例えば、前立腺特異的抗原）は、臨床エンドポイントに関連しているように見えるが、性別／エンドポイントの相関のアーチファクトであろう。ＣＲＰは、通常ＡＳと関連したマーカーであるが、この試験では、ＣＲＰのベースライン値は臨床エンドポイントと統計的に相関しなかった。
【０１２６】
【表９】
【０１２７】
実施例３：予測モデル構築
ベースライン、第４週、及び第１４週においてバイオマーカーの関連性に関して評価した。これらの分析から、数個の知見が現れた。調べた９２個のマーカーのうち、臨床応答と有意に関連したものは殆ど存在しなかった。有意な効果を示したマーカーと、これらのマーカーに関するマーカーとエンドポイントとの関係は、数個の一次及び二次エンドポイントの全体で概ね一貫していた。臨床成課上に用量効果が存在しなかったため、使用したデータはゴリムマブ処置群（全患者はゴリムマブを受容）と組み合わせた。バイオマーカーをベースライン、第４週及び第１４週において、関連性に関して評価した。
【０１２８】
全ての分析は、Ｒ（Ｒ：Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２００８，Ａｕｔｈｏｒ：Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ，Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，ＩＳＢＮ ３−９０００５１−０７−０）を使用して実行した。ベースラインからの変化は、１−サンプルｔ−試験を用いて試験した。臨床因子とベースラインバイオマーカーとの関連は、ロバスト線形回帰モデルを使用して評価した。ロバストロジスティック回帰モデルを使用して、バイオマーカーと臨床エンドポイントとの関連を試験した。肯／否である臨床エンドポイント変数は、１／０コードを使用した。連続的な臨床エンドポイントは、全対象の中央値に閾値を適用することにより、この分析のために１／０変数に変換された。
【０１２９】
時間点及び臨床エンドポイントの全体で一貫して同定されたベースラインマーカーは、レプチン、ハプトグロビン、インスリン、ＥＮＡ７８及びアポリポタンパク質Ｃ３、オステオカルシン、Ｐ１ＮＰ、並びにＩＬ６であった（ＥＩＡによる）。これらのマーカーのそれぞれは、少なくとも３つの臨床エンドポイントにおいて有意であり、少なくとも１つのエンドポイントに関して１．５を越えるオッズ比を有した。これらのマーカーに関して、表９はそれらの臨床エンドポイントに関連したオッズ比及びｐ−値を示す。表９において、オッズ比（ＯＲ）は、ｌｏｇ２目盛り上の１単位変化、又は線形目盛りの二倍の、臨床応答の増大されたオッズを表す。
【０１３０】
この試験の結果の信頼性を増大させるために、多数のエンドポイントの全体において多数の時間点で有意な関連を示すマーカーの同定に焦点を当てた。ベースラインにおいて、臨床エンドポイント全体に一貫して同定された多重−決定マーカーは、レプチン、ハプトグロビン、インスリン、ＥＮＡ７８及びアポリポタンパク質Ｃ３であった。加えて、血清サンプルの単一ＥＬＩＳＡ試験は、オステオカルシン、Ｐ１ＮＰ及びＩＬ−６を同定した。これらの８つのマーカーのそれぞれは、少なくとも３つの臨床エンドポイントにおいて０．０５未満のｐ−値を有し、少なくとも１つのエンドポイントに関して１．５を越えるオッズ比（ＯＲ）を有した。これらのマーカーに関して、表９はそれらの臨床エンドポイントに関連したオッズ比及びｐ−値を示す。ＯＲは、ｌｏｇ２目盛り上の１単位変化、又は線形目盛りの二倍の、臨床応答の増大されたオッズを表す。
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】
ベースラインからの早期（第４週）変化が、時間点及び臨床エンドポイント全体において予測的に一貫したマーカーは、ハプトグロビン、血清アミロイド、ＣＲＰ、α−１アンチトリプシン、フォン・ヴィレブランド因子、補体因子３及び血清マーカーＩＬ−６であった（ＥＬＩＳＡ）。これらの７つのマーカーのそれぞれは、少なくとも３つの臨床エンドポイントにおいて有意であり、少なくとも１つのエンドポイントに関して３を越えるオッズ比を有した。これらのマーカーに関して、表１０はそれらの臨床エンドポイントに関連したオッズ比及びｐ−値を示す。
【０１３３】
【表１１】
【０１３４】
プラセボ
ゴリムマブ処置群において観察されたバイオマーカー／臨床エンドポイント関連性とは対称的に、プラセボ群ではバイオマーカー値と臨床エンドポイント応答との関連性が、あったとしても、殆ど存在しなかった（図示せず）。この結果は、ゴリムマブバイオマーカー分析で見られたより有意なバイオマーカーに対する内部標準又はベンチマークとしての役割を果たす。
【０１３５】
ベースラインバイオマーカーの予測方法
処置に対する患者の長期臨床応答の予測に使用できるバイオマーカーの決定に使用する分類及び回帰木（ＣＡＲＴ）予測的モデルを開発した。全予測モデルは、一つ抜き交差確認（leave-one-out cross-validation）を使用した。ＣＡＲＴモデルは、決定木（図１〜６）の形態で示されている。木のノードは、クラス予測（肯は、予測された臨床エンドポイント応答者、否は、予測された臨床的非応答者）及び２つの数字（ｘ／ｙ、ｘは、そのノードに属する、試験での非応答者の実際の数、ｙは、そのノードに属する、試験での答者の実際の数）で標識されている。モデルの全体的な正確性は、「否」エンドノード全体のｘの数、及び「肯」エンドノード全体のｙの数である。モデルは、一次臨床エンドポイント、第１４週におけるＡＣＲ２０、及び選択された二次臨床エンドポイントに関して開発された。一般に、二次エンドポイントモデルは、それらの感度及び特異性において、一次エンドポイントモデルと非常に類似していた。
【０１３６】
予測的モデルを使用して、どのバイオマーカーが、処置に対する患者の応答の予測に使用できるかを決定した。多重測定法により、及びＡＳＡＳ２０（一次）エンドポイントを使用して分析されたマーカーに関するベースラインで得た値に基づいて、１つのモデルを開発した（図１）。モデルを使用して得たサンプル結果の分析では、モデルがサンプルに適用された際に、モデルは試験患者の６１／７６（８０％）で正確であることが示された。これは、モデルで分析された患者サンプルにおいて、第１４週でのそれらの臨床応答（ＡＳＡＳ２０）を患者の８０％において結果が予測できたことを意味する。モデルの図を図１に示す。バイオマーカーモデルは、レプチンを初期分類子として使用する。即ち、３．８（対数目盛り）以上のレプチンを有する患者は、非応答者として予測される。次いで、３．８未満のレプチンレベルを有する患者は、二次マーカー、ＣＤ４０リガンドの使用に基づいて分類される。１．０５を越えるＣＤ４０リガンド結果を有する患者は、応答者として予測される一方、３．８未満のレプチンレベル及び１．０５未満のＣＤ４０リガンドを有する患者は、非応答者として予測される。モデルを使用した予測の感度は、８６％である。モデルを使用した結果の特異性は、８８％である。
【０１３７】
図２に、ＢＡＳＤＡＩエンドポイントに関する予測モデルを示す。このモデルのために異なるバイオマーカーが選択され、ＢＡＳＤＡＩモデルの全体的な正確性は、ＡＳＡＳ２０モデルと同様である。図２のアルゴリズムは、抗−ＴＮＦ療法に対する応答の初期分類子としての、７．０３３（対数目盛り）以上のＴＩＭＰ−１レベルに基づく。７．０３３以上のＴＩＭＰ−１レベルを有する患者は、更に、３．９５３未満のＧ−ＣＳＦを使用して予測応答者として分類され、３．９５３以上のＧ−ＣＳＦを使用して予測非応答者として分類される。７．０３３未満のＴＩＭＰ−１レベルを有する患者は、更にＰＡＰレベルを使用して分類され、−１．２８７未満のレベルは応答者を予測し、−１．２８７を越えるレベルの患者は更にＭＣＰ−１レベルに基づいて分類され、７．４１７未満のＭＣＰ−１は応答者を予測し、７．４１７以上のＭＣＰ−１は非応答者を予測する。
【０１３８】
個々のＥＩＡ測定法（非多重化測定法）及び３ｐｌｅｘ測定法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して分析したマーカーがＣＡＲＴ分析に含まれる場合、アルゴリズム（決定木）結果は、臨床エンドポイントがＡＳＡＳ２０又はＢＡＳＤＡＩ（それぞれ図３及び４）のいずれであっても初期分類子としてオステオカルシンに依存した。追加のマーカーは、マーカーのパネルの予測能力を向上させることが見出された。ベースラインバイオマーカー／血清バイオマーカーモデルの正確性は、第１４週にてＡＳＡＳ２０により評価して、臨床応答の予測に関して６７／７６（８８％）であった（図３）。このバイオマーカーモデルは、初期分類子としてオステオカルシン（個々のＥＩＡにより測定法）を使用する。３．８７８（対数目盛り）以上のオステオカルシンを有する患者は、応答者と予測される。３．８７８未満のオステオカルシンを有する患者は、ＰＡＰに基づいて分類される。モデルの正確性は８８％であり、感度は９０％であり、モデル特異性は８４％であった。
【０１３９】
同様の分析において、ＢＡＳＤＡＩエンドポイントに関する予測モデルを図４に示す。この場合、ＢＡＳＤＡＩとＡＳＡＳ２０モデルは非常に類似することが判明し（両方ともオステオカルシン及びＰＡＰを含んでいた）、ＢＡＳＤＡＩモデルは、１つの追加の分類子としてインスリンを加えた）。モデルの正確性は、ＢＡＳＤＡＩ臨床応答の予測に関して６１／７６（８０％）であった。
【０１４０】
ベースライン濃度、及び第４週におけるベースラインからの変化
多重データを使用する追加の予測モデルを開発して、処置の第４週におけるバイオマーカーの変化が、第１４週における臨床成果の予測を含み得るか否かを決定した。ＡＳＡＳ２０を予測するアルゴリズムを、図５に示す。ＡＳＡＳ２０を予測するベースラインのみのアルゴリズムと同様、ベースラインレプチンが初期分類子である。３．８（対数目盛り）以上のレプチンを有する患者は非応答者として予測され、３．８未満のレプチンを有する患者は、２つの追加の予測物、ｉ）補体３における変化、及びｉｉ）ベースラインＶＥＧＦ、に基づいて更に分類される。このモデルでは、正確性は第１４週での臨床応答（ＡＳＡＳ２０）に関して６４／７６（８４％）であった。モデルの感度は９２％、特異性は８１％であった。
【０１４１】
ＢＡＳＤＡＩエンドポイントに関する予測モデルを、図６に示す。ＢＡＳＤＡＩモデルの全体的な正確性はＡＳＡＳ２０モデルと類似しているが、異なるバイオマーカーを選択し、この分析で使用した。初期マーカーは補体成分３の第０週から第４週への変化であり、０．２３３（対数目盛り）未満の低下を有する患者は応答者として予測され、補体成分３において０．２３３３以上の低下を有する患者は、ベースラインフェリチンに基づいて更に分類され、フェリチン値がカットオフ値７．７７４を越える場合、患者は予測された応答者として分類され、フェリチンが７．７７４未満の場合、患者は予測された非応答者として分類され、フェリチンに基づいて非応答者と予測されたサブセットは、ＩＣＡＭ−１レベルにおける変化に基づいて更に分類され、第０週から第４週の間でＩＣＡＭ−１の低下が０．０２２０４以上の者は予測された応答者として分類され、第０週から第４週の間でＩＣＡＭ−１の低下が０．０２２０４未満の残りの患者は非応答者として分類される。
【０１４２】
タンパク質バイオマーカー試験の結果は、ゴリムマブ療法の結果として、多数のバイオマーカーが有意に変化したことを示した。対照的に、プラセボ対照アームではバイオマーカーの変化は殆ど観察されなかった。２つの種類の新規なバイオマーカーベースの臨床応答予測モデルが開発され、一方はベースラインバイオマーカー値を患者の臨床応答を予測するためのみ使用し、他方はバイオマーカー値の早期変化を使用して、より長期間（第１４週、第２４週）の臨床応答を予測する。モデルは、マーカーのサブセットが、単純な処置の非特異的な効果とは対照的に、ゴリムマブに対する臨床応答に関連した変化を有することを示唆する。このことは、多数の臨床エンドポイントの全体を見渡すロバストロジスティック回帰分析から結論付けることができる。
【０１４３】
重要なことには、マーカー値（ベースライン、又は第４週での変化のいずれか）は臨床成績に先行していた。このことは、ゴリムマブ処置に対するＡＳ患者の最終的な応答又は非応答を、良好な正確性を伴う予測に使用できるバイオマーカーのパネルが開発できることを示している。
【０１４４】
ゴリムマブに対する臨床応答（徴候及び症状）の最良のバイオマーカーモデル（特異性及び感度に基づいた）は、図３及び４に示したように、オステオカルシン及び前立腺酸性ホスファターゼのベースラインレベルを含んでいた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、補体成分３、ＶＥＧＦ、オステオカルシン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される少なくとも１つの血清マーカーの濃度を測定し、
ｂ）前記測定された濃度を、抗−ＴＮＦα療法を受容し、１つ以上の臨床エンドポイントに基づいて応答者又は非応答者として分類された、ＡＳと診断された患者からのマーカーの血清濃度の値のセットを分析することにより決定されたカットオフ値と比較する、ことを含む、方法。
【請求項２】
前記患者からの血液又は血清サンプル中のハプトグロビン、血清アミロイド、ＣＲＰ、α−１アンチトリプシン、フォン・ヴィレブランド因子及びインスリンからなる群から選択される前記血清中の追加のマーカー濃度が測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のレプチン及びＣＤ４０リガンドの濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中のレプチンの前記濃度をレプチンカットオフ値と比較し、前記濃度が前記カットオフ値以上の場合、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する非応答者として予測され、レプチンの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中のＣＤ４０リガンドの前記濃度をＣＤ４０リガンドカットオフ値と比較し、前記ＣＤ４０リガンドカットオフ値以上のＣＤ４０の濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に応答することを示し、前記ＣＤ４０リガンド値未満の値及び前記レプチンカットオフ値未満のレプチンは、ＴＮＦα中和治療に対する非応答者を予測する、ことを含む、方法。
【請求項４】
前記サンプルが血清である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血清中のレプチンの濃度がｌｏｇ変換され、前記レプチンカットオフ値が３．８０４である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血清中のＣＤ４０の濃度がｌｏｇ変換され、前記ＣＤ４０カットオフ値が１．０５である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程が同時に実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記測定工程がコンピュータ支援装置により実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が非−ＴＮＦ中和治療により処置されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のオステオカルシン、前立腺酸性ホスファターゼ及びインスリンの濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中のオステオカルシンの前記濃度をオステオカルシンカットオフ値と比較し、前記濃度が前記カットオフ値以上の場合、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する非応答者として予測され、オステオカルシンの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼの濃度を前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値と比較し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値以上の前立腺酸性ホスファターゼの濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に対する応答者であると予測し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値未満の値と、場合により、
ｄ）ＡＳＡＳ２０により評価された臨床成績に基づいて、前記患者を非応答者と予測されたと分類し、又は更に、ＢＡＳＤＡＩにより評価して、前記患者血清中のインスリンの濃度をインスリンカットオフ値と比較することにより前記患者を分類し、前記インスリンカットオフ値未満のインスリン値は、前記患者を応答者と予測されたと分類し、カットオフ値以上のインスリン値は、前記患者をＴＮＦα中和治療に対する非応答者と予測されたと分類する、ことを含む、方法。
【請求項１１】
前記サンプルが血清である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血清中のオステオカルシンの前記濃度がｌｏｇ変換され、前記オステオカルシンカットオフ値が３．９である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血清中の前立腺酸性ホスファターゼの濃度がｌｏｇ変換され、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値が１．４である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
血清中のインスリンの濃度がｌｏｇ変換され、前記インスリンカットオフ値が２．７１１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定工程が同時に実行される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記測定工程がコンピュータ支援装置により実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のオステオカルシン及び前立腺酸性ホスファターゼの濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中の前記オステオカルシンの濃度をオステオカルシンカットオフ値と比較し、前記濃度が前記カットオフ値以上の場合、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する非応答者として予測され、オステオカルシンの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼの前記濃度を前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値と比較し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値以上の前立腺酸性ホスファターゼの濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に対する応答者であると予測し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値未満の値と、
ｄ）により評価された前記臨床成績に基づいて、前記患者を非応答者であると分類する、ことを含む、方法。
【請求項１８】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のＴＩＭＰ−１及び前立腺酸性ホスファターゼ、ＧＣＳＦ及びＭＣＰ−１の濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中のＴＩＭＰ−１の前記濃度をＴＩＭＰ−１カットオフ値と比較し、前記濃度が前記ＴＩＭＰ−１カットオフ値以上の場合、前記患者は更に分類され、ＴＩＭＰ−１の前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼの濃度を前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値と比較し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値未満の前立腺酸性ホスファターゼの濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に対する応答者であると予測し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値以上の値は、前記患者が更に分類されることを要し、
ｄ）ＢＡＳＤＡＩにより評価して、前記患者血清中のＭＣＰ−１の濃度をＭＣＰ−１カットオフ値と比較し、前記ＭＣＰ−１カットオフ値未満のＭＣＰ−１値は、前記患者が応答者であると予測し、カットオフ値以上のＭＣＰ−１値は、前記患者がＴＮＦα中和治療に対する非応答者であると予測する、ことを含む、方法。
【請求項１９】
前記患者の血清が前記ＴＩＭＰ−１カットオフ値以上のＴＩＭＰ−１のレベルを有する場合、前記患者の血清中のＧ−ＣＳＦのレベルをＧ−ＣＳＦカットオフ値と比較し、ＢＡＳＤＡＩにより評価されて、前記患者血清中の前記Ｇ−ＣＳＦレベルがＧ−ＣＳＦカットオフ値未満の場合、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に応答すると予測されたように分類され、前記Ｇ−ＣＳＦ値が前記Ｇ−ＣＳＦカットオフ値以上の場合、ＢＡＳＤＡＩにより評価されて、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に対する非応答者であると予測されたように分類される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＩＭＰ−１カットオフ値が７．０３である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）ベースラインサンプル及び第４週サンプルから補体成分３（Ｃ３）濃度における変化、ベースラインにおけるフェリチン、及び前記患者からの血液又は血清サンプル中のＣＡＭ−１のベースラインからの第４週のマーカー濃度の変化を測定し、
ｂ）抗−ＴＮＦ療法の開始前に採取した前記ＡＳ患者の血液サンプル中のＣ３の前記濃度の、抗−ＴＮＦ療法の開始後の第４週に採取した前記ＡＳ患者の血清サンプル中のＣ３の前記濃度に対する変化をＣ３カットオフ値と比較し、濃度における前記変化が前記Ｃ３カットオフ値未満と決定された場合、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に応答すると予測されたと分類され、前記Ｃ３カットオフ値以上のＣ３の血清濃度における変化を有する患者を、フェリチンカットオフ値と比較される前記患者のサンプル中のフェリチンのベースライン値を使用して分類し、前記カットオフ値以上の値により、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する応答者であると予測され、フェリチンレベルの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）抗−ＴＮＦ療法の開始前に採取された前記ＡＳ患者の血液サンプル中のＩＣＡＭ−１の前記濃度の、抗−ＴＮＦ療法の開始後の第４週に採取した前記ＡＳ患者の血清サンプル中のＩＣＡＭ−１の前記濃度に対する変化をＩＣＡＭ−１カットオフ値と比較し、ＩＣＡＭ−１濃度における前記変化が前記ＩＣＡＭ−１カットオフ値以上と決定された場合、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に応答すると予測されたと分類され、ＩＣＡＭ−１濃度における前記変化が前記ＩＣＡＭ−１カットオフ値未満であると決定された場合、前記患者は予測された非応答者と分類される、ことを含む、方法。
【請求項２２】
前記Ｃ３変化のカットオフ値が−０．２３３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗−ＴＮＦα治療により処置されるべき強直性脊椎炎と診断された患者から得た、処置後に１つ以上の臨床エンドポイントを使用して評価された、データのセットに予測アルゴリズムを適用するための、コンピュータベースのシステムであって、
コンピュータ読み取り可能なフォーマットにおける患者データセットを受信及び加工するためのコンピュータステーションであって、前記コンピュータステーションが前記患者データセットを加工し、出力分類を生成するための学習ずみニューラルネットワークを含み、前記学習ずみニューラルネットワークが患者データセットを前処理する方法により学習され、前記方法が、
ａ）ＡＳに関連した患者バイオマーカーを選択する工程と、
ｂ）統計的に及び／又はコンピュータ的に、前記選択された患者バイオマーカーの区別力（power）を、線形及び／又は非線形の組み合わせにおいて個別に試験して、臨床エンドポイントに基づいて患者の応答又は非応答を示す工程と、
ｃ）二次入力の誘導のための統計的方法を、元の又は変換されたバイオマーカーの線形及び／又は非線形の組み合わせである前記ニューラルネットワークに適用する工程と、
ｄ）区別力を示す患者バイオマーカーのみ又は誘導された二次入力を選択する工程と、
ｅ）前記前処理された患者バイオマーカー又は誘導された二次入力を使用して、前記コンピュータベースのニューラルネットワークを訓練する工程と、を含む、コンピュータベースのシステム。
【請求項２４】
前記出力分類が、前記患者が抗−ＴＮＦα療法に応答するか又は応答しないかであり、前記臨床エンドポイントがＡＳＡ２０又はＢＡＳＤＡＩであり、前記バイオマーカーが患者の性別、レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＡＰ、オステオカルシン、インスリン、ＶＥＧＦ、フェリチン、補体成分３、ＩＣＡＭ−１又は前記バイオマーカーの組み合わせである、請求項２３に記載のコンピュータベースのシステム。
【請求項２５】
抗−ＴＮＦα治療で処置されるべき強直性脊椎炎と診断された患者が、１つ以上の臨床エンドポイントにより評価されるように、療法に応答するか又は応答しないかを予測するための装置であって、
ａ）レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＡＰ、オステオカルシン、インスリン、ＶＥＧＦ、フェリチン、補体成分３又はＩＣＡＭ−１からなる群から選択される抗−ＴＮＦα療法に対するＡＳ患者の応答又は非応答に関連したマーカーに特異的な抗体と、検出可能なラベルで標識された二次抗体と、を含む試験ストリップと、
ｂ）前記ラベルにより生成された信号を、前記信号を加工可能なリーダーを使用して検出し、
ｃ）前記信号の前記加工から得られたデータを、前記サンプル中の前記マーカーの所定の濃度を示す結果に加工する、ことを含む、装置。
【請求項２６】
前記リーダーがヒトである、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記リーダーが反射率計である、請求項２５に記載の装置。
【請求項２８】
抗−ＴＮＦα治療で処置されるべき強直性脊椎炎と診断された患者が、１つ以上の臨床エンドポイントにより評価されるように、治療法に応答するか又は応答しないかの予測に使用するための予後試験キットであって、レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＡＰ、オステオカルシン、インスリン、ＶＥＧＦ、フェリチン、補体成分３、ＩＣＡＭ−１又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される患者サンプル中の１つ以上のマーカーの存在を定量化可能な前調製された基質を含む、キット。
【請求項１】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、補体成分３、ＶＥＧＦ、オステオカルシン、フェリチン及びＩＣＡＭ−１からなる群から選択される少なくとも１つの血清マーカーの濃度を測定し、
ｂ）前記測定された濃度を、抗−ＴＮＦα療法を受容し、１つ以上の臨床エンドポイントに基づいて応答者又は非応答者として分類された、ＡＳと診断された患者からのマーカーの血清濃度の値のセットを分析することにより決定されたカットオフ値と比較する、ことを含む、方法。
【請求項２】
前記患者からの血液又は血清サンプル中のハプトグロビン、血清アミロイド、ＣＲＰ、α−１アンチトリプシン、フォン・ヴィレブランド因子及びインスリンからなる群から選択される前記血清中の追加のマーカー濃度が測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のレプチン及びＣＤ４０リガンドの濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中のレプチンの前記濃度をレプチンカットオフ値と比較し、前記濃度が前記カットオフ値以上の場合、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する非応答者として予測され、レプチンの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中のＣＤ４０リガンドの前記濃度をＣＤ４０リガンドカットオフ値と比較し、前記ＣＤ４０リガンドカットオフ値以上のＣＤ４０の濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に応答することを示し、前記ＣＤ４０リガンド値未満の値及び前記レプチンカットオフ値未満のレプチンは、ＴＮＦα中和治療に対する非応答者を予測する、ことを含む、方法。
【請求項４】
前記サンプルが血清である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血清中のレプチンの濃度がｌｏｇ変換され、前記レプチンカットオフ値が３．８０４である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血清中のＣＤ４０の濃度がｌｏｇ変換され、前記ＣＤ４０カットオフ値が１．０５である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程が同時に実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記測定工程がコンピュータ支援装置により実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が非−ＴＮＦ中和治療により処置されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のオステオカルシン、前立腺酸性ホスファターゼ及びインスリンの濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中のオステオカルシンの前記濃度をオステオカルシンカットオフ値と比較し、前記濃度が前記カットオフ値以上の場合、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する非応答者として予測され、オステオカルシンの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼの濃度を前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値と比較し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値以上の前立腺酸性ホスファターゼの濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に対する応答者であると予測し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値未満の値と、場合により、
ｄ）ＡＳＡＳ２０により評価された臨床成績に基づいて、前記患者を非応答者と予測されたと分類し、又は更に、ＢＡＳＤＡＩにより評価して、前記患者血清中のインスリンの濃度をインスリンカットオフ値と比較することにより前記患者を分類し、前記インスリンカットオフ値未満のインスリン値は、前記患者を応答者と予測されたと分類し、カットオフ値以上のインスリン値は、前記患者をＴＮＦα中和治療に対する非応答者と予測されたと分類する、ことを含む、方法。
【請求項１１】
前記サンプルが血清である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血清中のオステオカルシンの前記濃度がｌｏｇ変換され、前記オステオカルシンカットオフ値が３．９である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血清中の前立腺酸性ホスファターゼの濃度がｌｏｇ変換され、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値が１．４である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
血清中のインスリンの濃度がｌｏｇ変換され、前記インスリンカットオフ値が２．７１１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定工程が同時に実行される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記測定工程がコンピュータ支援装置により実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のオステオカルシン及び前立腺酸性ホスファターゼの濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中の前記オステオカルシンの濃度をオステオカルシンカットオフ値と比較し、前記濃度が前記カットオフ値以上の場合、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する非応答者として予測され、オステオカルシンの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼの前記濃度を前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値と比較し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値以上の前立腺酸性ホスファターゼの濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に対する応答者であると予測し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値未満の値と、
ｄ）により評価された前記臨床成績に基づいて、前記患者を非応答者であると分類する、ことを含む、方法。
【請求項１８】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）前記患者からの血液又は血清サンプル中のＴＩＭＰ−１及び前立腺酸性ホスファターゼ、ＧＣＳＦ及びＭＣＰ−１の濃度を測定し、
ｂ）前記ＡＳサンプル中のＴＩＭＰ−１の前記濃度をＴＩＭＰ−１カットオフ値と比較し、前記濃度が前記ＴＩＭＰ−１カットオフ値以上の場合、前記患者は更に分類され、ＴＩＭＰ−１の前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）前記患者のサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼの濃度を前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値と比較し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値未満の前立腺酸性ホスファターゼの濃度は、前記患者がＴＮＦα治療に対する応答者であると予測し、前記前立腺酸性ホスファターゼカットオフ値以上の値は、前記患者が更に分類されることを要し、
ｄ）ＢＡＳＤＡＩにより評価して、前記患者血清中のＭＣＰ−１の濃度をＭＣＰ−１カットオフ値と比較し、前記ＭＣＰ−１カットオフ値未満のＭＣＰ−１値は、前記患者が応答者であると予測し、カットオフ値以上のＭＣＰ−１値は、前記患者がＴＮＦα中和治療に対する非応答者であると予測する、ことを含む、方法。
【請求項１９】
前記患者の血清が前記ＴＩＭＰ−１カットオフ値以上のＴＩＭＰ−１のレベルを有する場合、前記患者の血清中のＧ−ＣＳＦのレベルをＧ−ＣＳＦカットオフ値と比較し、ＢＡＳＤＡＩにより評価されて、前記患者血清中の前記Ｇ−ＣＳＦレベルがＧ−ＣＳＦカットオフ値未満の場合、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に応答すると予測されたように分類され、前記Ｇ−ＣＳＦ値が前記Ｇ−ＣＳＦカットオフ値以上の場合、ＢＡＳＤＡＩにより評価されて、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に対する非応答者であると予測されたように分類される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＩＭＰ−１カットオフ値が７．０３である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
強直性脊椎炎の診断を有する患者の、抗−ＴＮＦα療法に対する応答を予測するための方法であって、
ａ）ベースラインサンプル及び第４週サンプルから補体成分３（Ｃ３）濃度における変化、ベースラインにおけるフェリチン、及び前記患者からの血液又は血清サンプル中のＣＡＭ−１のベースラインからの第４週のマーカー濃度の変化を測定し、
ｂ）抗−ＴＮＦ療法の開始前に採取した前記ＡＳ患者の血液サンプル中のＣ３の前記濃度の、抗−ＴＮＦ療法の開始後の第４週に採取した前記ＡＳ患者の血清サンプル中のＣ３の前記濃度に対する変化をＣ３カットオフ値と比較し、濃度における前記変化が前記Ｃ３カットオフ値未満と決定された場合、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に応答すると予測されたと分類され、前記Ｃ３カットオフ値以上のＣ３の血清濃度における変化を有する患者を、フェリチンカットオフ値と比較される前記患者のサンプル中のフェリチンのベースライン値を使用して分類し、前記カットオフ値以上の値により、前記患者は抗−ＴＮＦα療法に対する応答者であると予測され、フェリチンレベルの前記血清値が前記カットオフ値未満の場合、
ｃ）抗−ＴＮＦ療法の開始前に採取された前記ＡＳ患者の血液サンプル中のＩＣＡＭ−１の前記濃度の、抗−ＴＮＦ療法の開始後の第４週に採取した前記ＡＳ患者の血清サンプル中のＩＣＡＭ−１の前記濃度に対する変化をＩＣＡＭ−１カットオフ値と比較し、ＩＣＡＭ−１濃度における前記変化が前記ＩＣＡＭ−１カットオフ値以上と決定された場合、前記患者は抗−ＴＮＦ療法に応答すると予測されたと分類され、ＩＣＡＭ−１濃度における前記変化が前記ＩＣＡＭ−１カットオフ値未満であると決定された場合、前記患者は予測された非応答者と分類される、ことを含む、方法。
【請求項２２】
前記Ｃ３変化のカットオフ値が−０．２３３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗−ＴＮＦα治療により処置されるべき強直性脊椎炎と診断された患者から得た、処置後に１つ以上の臨床エンドポイントを使用して評価された、データのセットに予測アルゴリズムを適用するための、コンピュータベースのシステムであって、
コンピュータ読み取り可能なフォーマットにおける患者データセットを受信及び加工するためのコンピュータステーションであって、前記コンピュータステーションが前記患者データセットを加工し、出力分類を生成するための学習ずみニューラルネットワークを含み、前記学習ずみニューラルネットワークが患者データセットを前処理する方法により学習され、前記方法が、
ａ）ＡＳに関連した患者バイオマーカーを選択する工程と、
ｂ）統計的に及び／又はコンピュータ的に、前記選択された患者バイオマーカーの区別力（power）を、線形及び／又は非線形の組み合わせにおいて個別に試験して、臨床エンドポイントに基づいて患者の応答又は非応答を示す工程と、
ｃ）二次入力の誘導のための統計的方法を、元の又は変換されたバイオマーカーの線形及び／又は非線形の組み合わせである前記ニューラルネットワークに適用する工程と、
ｄ）区別力を示す患者バイオマーカーのみ又は誘導された二次入力を選択する工程と、
ｅ）前記前処理された患者バイオマーカー又は誘導された二次入力を使用して、前記コンピュータベースのニューラルネットワークを訓練する工程と、を含む、コンピュータベースのシステム。
【請求項２４】
前記出力分類が、前記患者が抗−ＴＮＦα療法に応答するか又は応答しないかであり、前記臨床エンドポイントがＡＳＡ２０又はＢＡＳＤＡＩであり、前記バイオマーカーが患者の性別、レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＡＰ、オステオカルシン、インスリン、ＶＥＧＦ、フェリチン、補体成分３、ＩＣＡＭ−１又は前記バイオマーカーの組み合わせである、請求項２３に記載のコンピュータベースのシステム。
【請求項２５】
抗−ＴＮＦα治療で処置されるべき強直性脊椎炎と診断された患者が、１つ以上の臨床エンドポイントにより評価されるように、療法に応答するか又は応答しないかを予測するための装置であって、
ａ）レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＡＰ、オステオカルシン、インスリン、ＶＥＧＦ、フェリチン、補体成分３又はＩＣＡＭ−１からなる群から選択される抗−ＴＮＦα療法に対するＡＳ患者の応答又は非応答に関連したマーカーに特異的な抗体と、検出可能なラベルで標識された二次抗体と、を含む試験ストリップと、
ｂ）前記ラベルにより生成された信号を、前記信号を加工可能なリーダーを使用して検出し、
ｃ）前記信号の前記加工から得られたデータを、前記サンプル中の前記マーカーの所定の濃度を示す結果に加工する、ことを含む、装置。
【請求項２６】
前記リーダーがヒトである、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記リーダーが反射率計である、請求項２５に記載の装置。
【請求項２８】
抗−ＴＮＦα治療で処置されるべき強直性脊椎炎と診断された患者が、１つ以上の臨床エンドポイントにより評価されるように、治療法に応答するか又は応答しないかの予測に使用するための予後試験キットであって、レプチン、ＣＤ４０リガンド、ＴＩＭＰ−１、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＡＰ、オステオカルシン、インスリン、ＶＥＧＦ、フェリチン、補体成分３、ＩＣＡＭ−１又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される患者サンプル中の１つ以上のマーカーの存在を定量化可能な前調製された基質を含む、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５１４２０８（Ｐ２０１２−５１４２０８Ａ）
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４４５２（Ｐ２０１１−５４４４５２）
【出願日】平成２１年１２月９日（２００９．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７２８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７７７２２
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月９日（２００９．１２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７２８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７７７２２
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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