弾性線維形成促進剤
【課題】フコイダンの生理活性を見出し、新たな用途に供すること。
【解決手段】低分子フコイダンを有効成分として含有する弾性線維形成促進剤を調製する。このようなフコイダンは、好適には、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、イシゲ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種に由来する。さらに、このような低分子フコイダンを含有する弾性線維形成促進用組成物を調製する。
【解決手段】低分子フコイダンを有効成分として含有する弾性線維形成促進剤を調製する。このようなフコイダンは、好適には、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、イシゲ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種に由来する。さらに、このような低分子フコイダンを含有する弾性線維形成促進用組成物を調製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類であるフコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤に関する。より詳細には、本発明は、低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコイダンは、硫酸多糖の一種であり、藻類や棘皮動物由来の粘質物に多く含まれる。主に L-フコース（６−デオキシ−ガラクトース）が α1-2、α1-4結合で数十から数十万個も繋がった化合物を含み、平均分子量は約２０万程度である。
【０００３】
フコイダンの構造は、由来とする藻類やその生育環境などにより多様性があることが知られており、グルクロン酸を含むU-フコイダン、硫酸化フコースだけからなるF-フコイダン、ガラクトースを含むG-フコイダンなどに分けられる。
【０００４】
一方、フコイダンを加水分解して低分子化する方法が報告されている。例えば、フコイダンを酸加水分解する方法（特許文献１）、酸を外部から添加することなくフコイダンを加水分解してオリゴ糖を得る方法（特許文献２）、酵素によりフコイダンを加水分解する方法（特許文献３）などである。
【０００５】
また、フコイダンの生理作用については、抗炎症作用、血液凝固作用、コレステロール沈着防止作用、抗腫瘍作用、抗ガン作用などの他、アレルギーに対する生理学的、生化学的な作用（特許文献４）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２１５９９０号公報
【特許文献２】特開２００２−２２６４９６号公報
【特許文献３】特開２０００−２３６８８９号公報
【特許文献４】特開平１１−２１２４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで解明されていない低分子フコイダンの新たな生理活性を見出し、適合する用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、低分子フコイダンに弾性線維形成促進能があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
上記弾性線維形成促進剤について、上記低分子フコイダンの重量平均分子量は、７００〜３００００であり得る。
【００１０】
上記低分子フコイダンは、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、イシゲ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種に由来することが好ましい。
【００１１】
本発明はまた、上記いずれかの弾性線維形成促進剤を含有する、弾性線維形成促進用組成物、に関する。
【００１２】
上記弾性線維形成促進用組成物は、低分子フコイダンを、全量に対して、０．０００００１〜９９重量％含み得る。
【００１３】
上記弾性線維形成促進用組成物は、化粧料であり得る。
【００１４】
上記弾性線維形成促進用組成物は、食品であり得る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤が提供される。さらには、このような弾性線維形成促進剤を含有する弾性線維形成用組成物であって、化粧料あるいは食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】培養細胞を用いたインビトロでの評価において、フコイダン無添加（コントロール：写真上）、低分子フコイダン添加（写真中）および高分子フコイダン添加（下写真）の場合における弾性線維形成を蛍光発色によって示した写真である。
【図２】図１の写真におけるそれぞれのサンプルの蛍光量を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
肌、血管、肺などの特定の臓器、靱帯などにおける弾力向上又は維持は、細胞だけでなく、細胞外マトリクスを合わせた組織構成によって保たれている。細胞は、伸縮など外部強度に弱いため、細胞の回りに細胞外マトリックスを形成して、組織の形状を保っている。細胞外マトリクスとしては、コラーゲン線維、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、へパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸など）、弾性線維（エラスチン線維）などがある。コラーゲン線維やグリコサミノグリカンは外部強度に対して伸び縮みができないが、弾性線維は引き延ばしても元に戻る特性、すなわち弾性を有しており、伸び縮みの機能が必須である動脈，肺、皮膚の組織には弾性線維は重要な因子である。弾性線維は、ミクロフィブリルという線維の周りにエラスチンが沈着・架橋してできると考えられている。
【００１８】
弾性線維のターンオーバーは非常に遅いため、加齢等によって弾性線維が劣化・断裂した結果、または炎症細胞から分泌されるプロテアーゼ等の外的要因によって弾性線維が劣化・断裂した結果、皮膚のたるみ、動脈硬化、肺が無理に引き延ばされたことに起因する肺気腫などが生じる。動脈においては、弾性線維は太い動脈の質量の半分程度を占めており、脈圧（収縮期圧−拡張期圧）を吸収している。弾性線維の機能が低下すると、動脈は硬い管となって脈圧が上昇する。脈圧の上昇は心疾患の予後を悪化させることがわかっている。
【００１９】
弾性線維の再生が所望される状態又は疾患は、肺気腫、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの、皮膚のたるみ）、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニア、脳底動脈瘤、消化管運動障害、褥瘡などがあり、本願発明の弾性線維形成促進剤によって、弾性線維の伸び縮みの機能が必須である疾患または状態の改善や予防が可能となる。
【００２０】
本発明でいう弾性線維形成促進能とは、ミクロフィブリルの周りにエラスチンが沈着・架橋する工程が促進される能力をいい、その程度は問わず、処置を施さない場合と比較して、エラスチンの沈着がある程度でも促進されている状況であればよい。
【００２１】
本発明においては、このような弾性線維を形成することを促進する作用が低分子フコイダンに見出され、低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤が提供される。
【００２２】
本発明でいうフコイダンは、褐藻類や有棘動物から抽出される粘着質に含まれる硫酸多糖の一種であり、基本的には、Ｌ−フコース−４−硫酸の１，２−結合を主体とする。しかしながら、Ｌ−フコース−４−硫酸の１，３−結合、１，４−結合なども存在するほか、構成糖としては、グルクロン酸などのウロン酸やガラクトース、キシロース、ラムノース、マンノースなどの中性糖を含む場合も多く、その組成は、海藻種によって多様性がある。本発明において「低分子フコイダン」または「フコイダンの低分子量画分」という用語は、同意義で用いられる。そして、これらの用語は、硫酸化フコースを構成成分として含む硫酸化フコース含有多糖のうち、典型的には、重量平均分子量７００〜３００００のフコイダンを意味する。好ましくは、１０万以上の分子量の画分を除いたものがよいが、特に限定はされない。このような重量平均分子量が７００〜３００００の範囲のフコイダンは、優れた弾性線維形成促進能を有する。低分子フコイダンとして、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品その他市販で通常用いられているものをそのまま用いることもできる。
【００２３】
本発明でいう分子量、平均分子量は、重量平均分子量のことであり、ＧＰＣ（ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー）により測定し、ポリスチレン換算により算出された値をいう。すなわち、試料を２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ含有、ｐＨ７．５）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの被験溶液を調製し、これを一晩静置した後、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した濾液を用いて、カラムで溶出する。カラムは、Superdex peptide 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流量：0.4ml／min、カラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製）およびSuperdex 200 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流速：0.4ml/minカラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製)を利用し、上記緩衝液で平衡化後、被験溶液を注入して試料を溶出し、溶出時間から重量平均分子量を決定し、本願発明の効果を発揮する弾性線維形成促進剤を調製する。検出は、示差屈折計（ＲＩ）で行う。
【００２４】
本願発明の低分子フコイダンは、より詳細には、フコイダンのピーク重量平均分子量は、約７００以上が好ましく、約１０００以上がより好ましく、約１５００以上がさらにより好ましい。また、重量平均分子量が約３００００以下が好ましく、約２００００以下がより好ましく、約１５０００以下がさらにより好ましい。上記範囲内であれば、本願発明の十分な効果を得ることができる。
【００２５】
このような低分子フコイダンは、動物、植物、真菌、単細胞生物、原生生物及び原核生物からなる群より選択される一種又は二種以上より抽出されたものや、合成によって得られるものであってもよい。典型的には、海藻類または有棘動物類から得られ得るが、限定はされない。低分子フコイダンは、例えば、天然の海藻類等から抽出されたフコイダン成分を分子量で分画し、低分子フコイダンのみを選択する方法で得られ得る。あるいは、天然の材料から抽出方法を工夫することで、抽出されたフコイダン成分が低分子量化している場合、そのような成分をそのまま使用することもできる。
【００２６】
以下に、本発明の内容を詳細に説明する。本発明に用いられる低分子フコイダンを抽出する原料の由来としては、例えば海藻類または有棘動物類が挙げられるが、これらのうち、特に褐藻類が好ましく用いられる。
【００２７】
ここで、褐藻類とは、褐藻綱に属する海藻をいい、イソガワラ目 （マツモ、キンイロハンモン）、アミジグサ目（エゾヤハズ、ヤハズグサ、ヘラヤハズ、シワヤハズ、アミジグサ、イトアミジ、フクリンアミジ、フタエオオギ、サナダグサ、ウミウチワ、コナウミウチワ、アツバコモングサ、コモングサ、シマオオギ）、ナガマツモ目（クロモ、フトモズク、ネバリモ、シワノカワ、ナガマツモ、モズク）、カヤモノリ目（ワタモ、ホソクビワタモ、フクロノリ、カゴメノリ、イワヒゲ、ハバノリ、セイヨウハバノリ、カヤモドキ、カヤモノリ）、ムチモ目（ムチモ）、ケヤリモ目（イチメガサ）、ウルシグサ目（ウルシグサ、タバコグサ）、コンブ目（ワカメ、ツルモ、スジメ、カジメ、クロメ、アラメ、マコンブ、ホソメコンブ、チガイソ）、イシゲ目（イシゲ、イロロ）、ヒバマタ目（ウガノモク、ヤバネモク、ジョロモク、スナビキモク、フシスジモク、ホンダワラ、ヒジキ、オオバノコギリモク、イソモク、アカモク、ノコギリモク、タマハハキモク、ナラサモ、ヒラネジモク、ヤツマタモク、マメタワラ、オオバモク、ウミトラノオ、アズマネジモク、ヨレモクモドキ、エンドウモク、ラッパモク）、シオミドロ目（特にシオミドロ科に属するもの）、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種または２種以上の組み合わせに由来することが好ましい。
【００２８】
より具体的には、低分子フコイダンを得る為の褐藻類として、例えば、ガゴメコンブ、マコンブ、ホソメコンブ、ミツイシコンブ、チジミコンブ、ヒメコンブ、トロロコンブ、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、レッソニア ニグレセンス、アスコフィラム ノドッサム、ジャイアントケルプ等のコンブ目、オキナワモズク、ナガマツモ、クロモ、イシモズク、フトモズク等のナガマツモ目、ヒバマタ、エゾイシゲ、オオバモク、アカモク、ウガノモク、フジスジモク、ウミトラノオ等のヒバマタ目、アミジグサ、エゾハヤズ等のアミジグサ目等に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種または２種以上の組み合わせが例示される。好ましくは、ガゴメコンブ、マコンブ、ホソメコンブ、ミツイシコンブ、チジミコンブ、ヒメコンブ、トロロコンブ、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、レッソニア ニグレセンス、アスコフィラム ノドッサム、ジャイアントケルプ等のコンブ目、特に好ましくは、ガゴメコンブが用いられる。
【００２９】
上記低分子フコイダンは、天然物からの抽出液として、粗生成物をそのままで用いても、また、粗生成物から低分子フコイダンのみを分離精製したものを用いてもよい。
【００３０】
低分子フコイダンを得る方法としては、特に限定されず、通常の抽出法が採用される。
例えば海藻であれば、限定はされないが、典型的には、ガゴメコンブを粉砕機などで細断したものを、水、あるいは有機溶媒を単独あるいは組み合わせて得られる溶媒を用いて抽出、溶解または懸濁することにより得ることができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等のアルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。
【００３１】
さらに、酸、アルカリの条件下で抽出する事ができる。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、又は、酢酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸などの有機酸が挙げられる。アルカリとしては、アルカリ無機塩が好ましく用いられ、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等を例示できる。
【００３２】
また、粉砕後に、洗浄、脱脂および／または脱色を目的に、有機溶媒および／または水を単独あるいは組み合わせて得られる溶媒を用いて処理してもよい。
【００３３】
低分子フコイダンの抽出物の抽出条件としては、室温又は常温の溶媒を用いることもできるが、「加熱した溶媒」や「加温した熱溶媒」を用いることもできる。具体的には、抽出溶媒が水の場合、抽出時の温度は、溶媒の沸点以下であればよく、特に限定されないが、加圧熱水による抽出方法を利用する場合もあるため、約０〜２００℃が好ましく、約２０〜１３０℃がより好ましい。また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒間〜数日間に設定すれば良く、更に好ましくはい３０分〜６時間に設定すれば良い。溶媒の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明の分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。上記範囲であれば、弾性線維形成能を有する成分を十分に抽出することができる。
【００３４】
限定はされないが、詳細な一例を挙げると、例えば、低分子フコイダンの分解物の製造に際しては、ガゴメコンブをカッターミルで粉砕後、脱色及び/又は脱脂するために７５％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌した後、ろ紙でろ過し、残渣を得る。残渣に水を加えて、９５℃以上で１０時間処理後に、処理液を室温まで冷却し、最終濃度が３０％になるようにエタノールを添加する。この処理液を室温で約２４時間静置し、遠心分離によって固液分離を行う。得られた上清に０．５Ｎ塩酸を添加して低温に２４時間静置し、生じた沈殿を遠心分離で除去し、得られた上清に０．５Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥して低分子フコイダンを得ることができる。
【００３５】
さらに、別の調製例では、例えば、ガゴメコンブ５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて内径４０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分間当り１２０回転の速度で攪拌し、フコイダンを抽出し、抽出物を網目３２μｍのステンレス金網でろ過し、低分子フコイダン溶液を調製する。これを凍結乾燥し、低分子フコイダン粉末を得る。
【００３６】
本発明では、このように抽出した抽出液を低分子フコイダンとして、そのままの状態で用いることもできるが、有機溶媒が含まれている場合には減圧蒸留等により有機溶媒を除去することが好ましい。また、本発明において、低分子フコイダンを含む抽出液は、液状のものを使用してもよいが、必要に応じて、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理を行って液体分を低減又は除去することにより、濃縮液状、半固形状、固形状、又は粉末状にしたものを使用してもよい。
【００３７】
あるいはまた、本発明においては、抽出液に含まれるフコイダンまたは低分子フコイダンを精製することも可能である。フコイダンを精製する場合、精製後に、高分子量画分を含むフコイダンを酸処理したり、酵素処理を施すことで、低分子化し使用することもできる。精製されたＦ−、Ｕ−又はＧ−フコイダンからその低分子量画分を分画することにより得ることもできる。
【００３８】
例えば、ガゴメコンブからフコイダンを調製し、該フコイダンから、グルクロン酸含有フコイダンとグルクロン酸非含有フコイダンを分離できる。また、硫酸化フコガラクタンを調製できる。これらの精製されたフコイダンから低分子量画分を分離して本発明に使用できる。
【００３９】
粗生成物からフコイダンあるいは低分子フコイダンを分離精製する方法としては、特に限定されないが、例えば、塩化セチルピリジニウムなどの４級アンモニウム塩を添加し、フコイダンまたは低分子フコイダンを沈殿させ、アルコール溶液で洗浄する方法やＤＥＡＥセルロースなどの陰イオン交換樹脂などを用いたクロマトグラフィーを用いる方法がある。
【００４０】
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる方法では、得られた抽出液を、濾過などによりさらに処理して陰イオン交換クロマトグラフィーに供することも好ましい。用いられる陰イオン交換樹脂は特に限定されるものではない。陰イオン交換樹脂の活性基としては、例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル基）、ＱＡＥ〔ジエチル（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル基〕、Ｑ（又はＴＥＡＥ）（トリエチルアミノエチル基）、ジメチル（２−ヒドロキシエチル）アミノメチル基、ＰＡＢ（パラアミノベンジル基）、ＡＥ（アミノエチル基）、ＧＥ（グアニドエチル基）などが好適であり、これらを有する陰イオン交換樹脂を用いることができる。陰イオン交換樹脂の担体としては、例えばセルロース系の物質、デキストラン系の物質、アガロース系の物質、スチレンジビニルベンゼン重合体や、親水性ビニルポリマーなどの合成ポリマー系の物質などが用いられており、いかなる担体を用いた陰イオン交換樹脂でも用いることができる。これらの活性基と担体とを組合せた市販の陰イオン交換樹脂として、例えばＤＥＡＥ−セファロース系、ＤＥＡＥ−セファセル系、ＤＥＡＥ−セファデックス系、ＱＡＥ−セファデックス系、Ｑ−セファロースファストフロー（以上ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−バイオゲル系、ＡＧ系（以上バイオラッド社製）、ＤＥＡＥ−トヨパール系、ＴＳＫゲルトヨパール系（以上東ソー社製）、ＤＥＡＥ−セルロファイン系（生化学工業社製）、ダウエックス系（ダウケミカル社製）、ＴＥＡＥ−セルロース（セルバ社製）、アンバーライト系（ロームアンド ハース社製）などがある。
【００４１】
低分子フコイダンを得る方法としては、さらに、抽出物として得られたフコイダンや精製フコイダンをサイズ排除クロマトグラフィーなどに供することも例示される。
【００４２】
限定はされないが、本発明において、分子量１０万以上の画分が排除された低分子フコイダンを調製することも好ましい。この場合には、例えば、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて分子量分画することによって、排除できる。
【００４３】
また、本発明においては、フコイダンには、フコイダンの塩も包含され得る。フコイダンの塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基等との塩が例示され、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、またはジエタノールアミン、エチレンジアミン等との塩が挙げられる。これらの塩は、たとえば、フコイダン等に存在する硫酸基やカルボキシル基を公知の方法により塩に変換することで得られる。さらには、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩などが挙げられる。また、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩なども挙げられる。
【００４４】
使用の目的によっては、薬理学的に許容され得る塩が好ましいが、弾性線維形成のインビトロの実験に供する場合等はこれに限定はされない。
【００４５】
あるいは、本発明の低分子フコイダンは、塩の溶媒和物または水和物を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤は、弾性線維の再生が所望される状態又は疾患、例えば、肺気腫、肺線維症、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの）、皮膚硬化症、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニア、脳底動脈瘤、消化管運動障害、褥瘡などの予防、治療又は改善に有用である他、皮膚のたるみやしわの予防や改善といった美容目的のためにも有用である。また、本発明の弾性線維形成促進剤は、弾性線維の再生能を有する細胞の培養用試薬などとしても有用である。さらに、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に役立つ。さらに、十分解明されているとはいえない弾性線維自体の研究への応用も考えられ、非常に広い範囲で有用である。
【００４７】
本発明の弾性線維形成剤は、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品などとして幅広く利用可能な任意の製剤または組成物の形態で提供され得るが、好ましくは、機能性食品または化粧品として利用可能な製剤または組成物である。
【００４８】
本発明の弾性線維活性促進剤を含む組成物が、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品のいずれの形態を取る場合でも、低分子フコイダンの含有量は、０．０００００１〜９９重量％が好ましく、より好ましくは０．００００１〜３０重量％、さらに好ましくは０．０００１〜１０重量％、特に好ましくは０．００１〜５重量％である。
【００４９】
本発明を医薬品または健康食品などの食品の用途に用いる場合の低分子フコイダンの投与量は、乾燥重量にして、成人1日当たり、０．０００１〜１０ｇ／ｋｇ程度、より好ましくは、成人１日当り０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇとすることができる。上記範囲であれば、弾性線維の伸び縮みの機能を必須とする疾患または状態の改善や予防が可能となる。
【００５０】
内服用形態
【００５１】
本発明の有効成分である低分子フコイダンは、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの固形製剤;またはシロップ剤、注射剤などの液状製剤として経口または非経口的に投与することもできる。さらに、坐剤、貼付剤、吸入剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤が挙げられる。これらの製剤は、常法の添加剤を含んでいても良い。薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００５２】
賦形剤の好適な例としては、例えばＤ−ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどの糖アルコール、ブドウ糖、白糖、乳糖、果糖などの糖類、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、リン酸水素カルシウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、β−シクロデキストリン、軽質無水ケイ酸、酸化チタン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、タルク、カオリンなどが挙げられる。
【００５３】
結合剤の好適な例としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アクリル酸系高分子、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、アルファー化デンプン、カンテン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどが挙げられる。
【００５４】
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルスターチ、部分アルファー化デンプンなどが挙げられる。溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
【００５５】
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ポリオキシル、セタノール、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ジメチルポリシロキサン、ミツロウ、サラシミツロウなどが挙げられる。
【００５６】
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤;例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
【００５７】
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００５８】
本発明の低分子フコイダンを含む弾性線維形成促進剤を固形製剤とする場合、このような製剤を製造する方法としては、低分子フコイダンを製剤原料と混合して固形製剤を製造する工程を含むものであれば特に限定はなく、公知の方法を使用することができる。
【００５９】
例えば、低分子フコイダンと製剤原料を含む製剤組成物を練合し、スクリーンを通過させることで成型する押出造粒物を、粉砕し、整粒する方法、前記製剤組成物に練合水を加えバーチカルグラニュレーターによって成型する攪拌造粒の後に、コーミルを用いて粉砕・篩過する方法、及び前記製剤組成物をローラーコンパクターで圧縮した後、ロールグラニュレーターで粉砕し篩過する方法、撹拌造粒の後に、流動層乾燥する方法が例示される。
【００６０】
また、例えば、直打により製造する場合には、低分子フコイダンと製剤原料を含む製剤組成物を混合した後、直接、打錠機に投入して打錠すればよい。
【００６１】
皮膚外用剤形態
【００６２】
本発明の低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤は、医薬品、医薬部外品として、皮膚外用剤として、あるいは化粧品の形態で使用され得る。これらの外用剤形態においては、低分子フコイダンに加えて、本発明の効果を損なわない範囲で、外皮用剤(化粧料、医薬部外品、医薬品）に添加される公知の基剤又は担体と共に混合して組成物とすることができる。その他に、このような外皮用剤には、例えば、界面活性剤、油分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、分散剤、香料、着色剤、色素、パール光沢付与剤、血行促進成分、保湿成分、紫外線吸収成分、紫外線散乱成分、洗浄成分、抗菌成分、収斂成分、ビタミン類、アミノ酸類、老化防止成分、抗炎症成分、美白成分、角質柔軟成分、細胞賦活化成分、水等を配合することができる。添加剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００６３】
本発明の低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤は、医薬品、化粧料又は医薬部外品の公知の形態として、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、パウダー剤、パップ剤、不織布等のシートに薬液を含浸させたシート剤、リップスティックのようなスティック剤などが挙げられる。中でも、好ましくは、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、ゲル剤の形態で用いられる。かかる形態とすることにより、弾性線維形成効果を十分に発揮することができる。
【００６４】
また、化粧料組成物のより詳細で具体的な形態としては、化粧水、乳液、クリーム、美容液、日焼け止め用化粧料、パック、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリームのような基礎化粧料；洗顔料、メイク落とし、ボディーシャンプー、シャンプー、リンスのような洗浄用化粧料；ファンデーション、化粧下地、リップクリーム、口紅、チークカラーのようなメークアップ化粧料；入浴剤などが挙げられる。
【００６５】
＜基剤又は担体＞
基剤又は担体としては、流動パラフィン、スクワラン、ゲル化炭化水素（プラスチベースなど）、オゾケライト、α−オレフィンオリゴマー、軽質流動パラフィンのような炭化水素；メチルポリシロキサン、架橋型メチルポリシロキサン、高重合メチルポリシロキサン、環状シリコーン、アルキル変性シリコーン、架橋型アルキル変性シリコーン、アミノ変性シリコーン、ポリエーテル変性シリコーン、ポリグリセリン変性シリコーン、架橋型ポリエーテル変性シリコーン、架橋型アルキルポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリグリセリン変性シリコーン、ポリエーテル変性分岐シリコーン、ポリグリセリン変性分岐シリコーン、アクリルシリコン、フェニル変性シリコーン、シリコーンレジンのようなシリコーン油；エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン；カラギーナン；ポリビニルブチラート；ポリエチレングリコール；ジオキサン；ブチレングリコールアジピン酸ポリエステル；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリットのようなエステル類；デキストリン、マルトデキストリンのような多糖類；エタノール、イソプロパノールのような低級アルコール；エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ジプロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールモノプロピルエーテルのようなグリコールエーテル；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、グリセリン、イソプレングリコールなどの多価アルコール；水などの水系基剤などが挙げられる。
【００６６】
基剤又は担体は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００６７】
酸化防止剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ソルビン酸、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、エリソルビン酸、Ｌ−システイン塩酸塩などが挙げられる。
【００６８】
界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタンのようなソルビタン脂肪酸エステル類；モノステアリン酸プロピレングリコールのようなプロピレングリコール脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０（ＨＣＯ−４０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油８０などの硬化ヒマシ油誘導体；モノラウリル酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート２０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート６０）、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート８０）、イソステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレンモノヤシ油脂肪酸グリセリル；グリセリンアルキルエーテル；アルキルグルコシド；ポリオキシエチレンセチルエーテルのようなポリオキシアルキレンアルキルエーテル；ステアリルアミン、オレイルアミンのようなアミン類；ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体、ラウリルＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン、ＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコンのようなシリコーン系界面活性剤などが挙げられる。
【００６９】
増粘剤としては、例えば、グアーガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸メタクリル酸アルキル共重合体、ポリエチレングリコール、ベントナイト、（アクリル酸ヒドロキシエチル／アクリロイルジメチルタウリンＮａ）コポリマー、（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリドン）コポリマーなどが挙げられる。
【００７０】
保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、フェノキシエタノールなどが挙げられる。
【００７１】
ｐＨ調整剤としては、無機酸（塩酸、硫酸など）、有機酸（乳酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなど）、有機塩基（トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミンなど）などが挙げられる。
キレート剤としては、ＥＤＴＡ・２ナトリウム塩、ＥＤＴＡ・カルシウム・２ナトリウム塩などが挙げられる。
【００７２】
安定化剤としては、ポリアクリル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられる。
【００７３】
添加剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００７４】
＜その他の有効成分＞
本発明の外用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の有効成分を含むことができる。有効成分の具体例としては、例えば、保湿成分、抗炎症成分、抗菌成分、ビタミン類、ペプチド又はその誘導体、アミノ酸又はその誘導体、細胞賦活化成分、老化防止成分、血行促進成分などが挙げられる。
【００７５】
保湿成分としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジグリセリントレハロースのような多価アルコール；ヒアルロン酸ナトリウム、ヘパリン類似物質、コンドロイチン硫酸ナトリウム、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、キチン、キトサンのような高分子化合物；グリシン、アスパラギン酸、アルギニンのようなアミノ酸；乳酸ナトリウム、尿素、ピロリドンカルボン酸ナトリウムのような天然保湿因子；セラミド、コレステロール、リン脂質のような脂質；カミツレエキス、ハマメリスエキス、チャエキス、シソエキスのような植物抽出エキスなどが挙げられる。
【００７６】
ビタミン類としては、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロールカルシウム等のビタミンＥ類；リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、リボフラビン酪酸エステル、リボフラビンテトラ酪酸エステル、リボフラビン５’−リン酸エステルナトリウム、リボフラビンテトラニコチン酸エステル等のビタミンＢ２類；ニコチン酸ｄｌ−α−トコフェロール、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸メチル、ニコチン酸β−ブトキシエチル、ニコチン酸１−（４−メチルフェニル）エチル等のニコチン酸類；アスコルビゲン−Ａ、アスコルビン酸ステアリン酸エステル、アスコルビン酸パルミチン酸エステル、ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビルなどのビタミンＣ類；メチルヘスペリジン、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロールなどのビタミンＤ類；フィロキノン、ファルノキノン等のビタミンＫ類、γ−オリザノール、ジベンゾイルチアミン、ジベンゾイルチアミン塩酸塩；チアミン塩酸塩、チアミンセチル塩酸塩、チアミンチオシアン酸塩、チアミンラウリル塩酸塩、チアミン硝酸塩、チアミンモノリン酸塩、チアミンリジン塩、チアミントリリン酸塩、チアミンモノリン酸エステルリン酸塩、チアミンモノリン酸エステル、チアミンジリン酸エステル、チアミンジリン酸エステル塩酸塩、チアミントリリン酸エステル、チアミントリリン酸エステルモノリン酸塩等のビタミンＢ１類；塩酸ピリドキシン、酢酸ピリドキシン、塩酸ピリドキサール、５’−リン酸ピリドキサール、塩酸ピリドキサミン等のビタミンＢ６類；シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、デオキシアデノシルコバラミン等のビタミンＢ１２類；葉酸、プテロイルグルタミン酸等の葉酸類；ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどのニコチン酸類；パントテン酸、パントテン酸カルシウム、パントテニルアルコール（パンテノール）、Ｄ−パンテサイン、Ｄ−パンテチン、補酵素Ａ、パントテニルエチルエーテル等のパントテン酸類；ビオチン、ビオチシン等のビオチン類；アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム等のアスコルビン酸誘導体であるビタミンＣ類；カルニチン、フェルラ酸、α−リポ酸、オロット酸等のビタミン様作用因子などが挙げられる。
【００７７】
ペプチド又はその誘導体としては、ケラチン分解ペプチド、加水分解ケラチン、コラーゲン、魚由来コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン分解ペプチド、コラーゲン分解ペプチド、加水分解コラーゲン、塩化ヒドロキシプロピルアンモニウム加水分解コラーゲン、エラスチン分解ペプチド、コンキオリン分解ペプチド、加水分解コンキオリン、シルク蛋白分解ペプチド、加水分解シルク、ラウロイル加水分解シルクナトリウム、大豆蛋白分解ペプチド、加水分解大豆蛋白、小麦蛋白、小麦蛋白分解ペプチド、加水分解小麦蛋白、カゼイン分解ペプチド、アシル化ペプチド（パルミトイルオリゴペプチド、パルミトイルペンタペプチド、パルミトイルテトラペプチド等）などが挙げられる。
【００７８】
アミノ酸又はその誘導体としては、ベタイン（トリメチルグリシン）、プロリン、ヒドロキシプロリン、アルギニン、リジン、セリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、β−アラニン、スレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ヒスチジン、タウリン、γ−アミノ酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、カルニチン、カルノシン、クレアチン等が挙げられる。
【００７９】
食品
【００８０】
本発明の低分子フコイダンを含む弾性線維形成促進剤は、食品または機能性食品に含有させて提供され得る。このような食品または機能性食品としては、米飯；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺、カップ麺を含む各種の麺類；清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等の飲料；カレールー、シチュー、各種スープ類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；飴、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、その他の焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、ドレッシング、味噌、醤油、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品などが例示される。
【００８１】
さらには、本発明の弾性線維形成剤を含有するサプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）を調製してもよい。
【００８２】
また、ペットなどの動物用の餌に対して本発明の弾性線維形成剤を含有させることもできる。
【００８３】
食品には、必要に応じて、添加物が加えられる。このような添加物としては、例えばブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、マンニット、デキストリン、クエン酸、クエン酸ソーダ、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ類、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存剤などが挙げられる。
【００８４】
本発明の低分子フコイダンを弾性線維形成促進剤として、弾性線維の再生能を有する細胞の培養用試薬、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に用いる場合、弾性線維自体の研究への応用に用いる場合、そのままの形で用いることも好ましい。
【００８５】
本発明の弾性線維形成促進剤を用いて、人工弾性線維をインビトロで作成すること、弾性線維の研究への応用に用いることも可能である。本発明の弾性線維形成促進剤を用いて、インビトロで弾性線維を形成させ、人工弾性線維の培養用試薬、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に用いることもできる。このようなインビトロでの研究や実施への応用に用いる場合、低分子フコイダンをそのままの形で用いることも好ましい。
【００８６】
本発明の弾性線維形成促進剤は、さらに、ＤＡＮＣＥ発現増強因子（ＤＡＮＣＥ誘導因子）を含んでいてもよい。ＤＡＮＣＥ発現増強因子を用いることができ、例えば、ナンテンカズラエキス、シカクマメエキス、フィチン酸及びその生理学的に許容される塩、並びにＬ−ヒドロキシプロリン及びその生理学的に許容される塩等のＤＡＮＣＥ発現増強因子；ＤＡＮＣＥ発現ベクター、またはＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターなどが挙げられる。
【００８７】
なお、本発明の弾性線維形成促進剤を医薬用途に用いる場合、キットの形態で用いても良い。具体的には、医薬組成物を構成する異種の構成成分を、予め、別々の容器またはパック中に包装しておき、使用直前に混合して使用する態様が挙げられる。容器としては、例えば、封着されたアンプル、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはこれらの類似物が挙げられる。
【実施例】
【００８８】
次に、試験例、実施例等により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８９】
〔製造例１〕（フコイダンの低分子量画分の製造）
ガゴメコンブ５００ｇをカッターミルで細断し、洗浄及び／又は脱色するために１０リットルの８０％エタノール中に懸濁して、３時間攪拌した後、ろ紙でろ過し、残渣を得た。残渣に５０リットルの精製水を添加し、９５℃で１０時間処理後に、処理液を室温まで冷却し、最終濃度が３０％になるようにエタノールを添加した。この処理液を室温で約２４時間静置し、遠心分離によって固液分離を行った。得られた上清に０．５Ｎ塩酸を添加して低温に２４時間静置し、生じた沈殿を遠心分離で除去し、得られた上清に０．５Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを中性付近に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥して低分子フコイダンを得た。
分子量の測定方法としては、ＧＰＣ法により、フコイダン抽出液を２５ｍＭ Tris-HCl緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．５）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの被験溶液を調製し、ＨＰＬＣカラム Superdex peptide 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流量：0.4ml／min、カラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製）およびSuperdex 200 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流速：0.4ml/minカラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製)を同じ緩衝液で平衡化し、このカラムに被験溶液を１００μL注入する。そして、溶出時間から重量平均分子量１８００〜１２０００の範囲内であることを確認した。
【００９０】
〔比較製造例〕（フコイダンの高分子量画分の製造）
市販のフコイダン（タカラバイオ社製、商品名：TaKaRa海藻エキス、エタノール抽出）をそのまま利用した。
【００９１】
〔試験例１〕
無血清下での実験
２４ウエルプレートの底にMicroscope Cover Glass（Fisherbrandから購入）を置き、その上にヒト皮膚線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０4個播種し、継代用培地（DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium,Invitrogenから購入）、１０％ウシ胎仔血清（FBS、JRH Bioscienceから購入）、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシン）にて３７℃、５％ＣＯ2で培養した。さらに、血清を含まない弾性線維形成培地、すなわち、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用い、ヒト線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０4個播種し、この無血清培地に、製造例１または比較製造例で得た低分子フコイダンまたは高分子フコイダンを０．０００１％加えて、あるいは加えないで、３７℃、５％ＣＯ2で4週間培養した。4週間の培養後、弾性線維の蛍光免疫染色を行なった。詳細には、１ｍＬのＰＢＳを用いて３回洗浄した後、１００％メタノールを用い、−２０℃で20分間固定した。更にＰＢＳを用いて洗浄した後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳを用い、室温で1時間ブロッキングした後、１次抗体として抗エラスチンポリクローナル抗体（Elastin Products Companyから購入）を用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８−抗ウサギＩｇＧ抗体（Invitrogenから購入）を用いた。１次抗体と室温で１時間以上インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、上記の２次抗体と室温で１時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定し、再びPBSで洗浄した後、Hoechst33258(Dojindoから購入)を用いて室温で5分間反応させ、再びPBSで洗浄した後、Aqua Poly/Mount(Poluscienceから購入)にてスライドガラス上にサンプルをマウントした。観察は蛍光顕微鏡DMIRE２（LEICA）IX71（Olympus）を用いて行った。その結果を図１に示す。
【００９２】
すなわち、図1は、弾性線維であるエラスチンを蛍光染色したものである。本蛍光染色法ではエラスチンに加えて細胞質も同時に染色されるためコントロールでは斑点状の蛍光発色が認められるが、これは細胞質を染色したものでありエラスチンを染色したものではない。一方、低分子フコイダンでは、コントロール同様に細胞質は斑点状に染色されるが、写真全面に著明な線維状の蛍光染色が確認された。このことから低分子フコイダンには、著明な弾性線維（エラスチン線維）形成促進効果が確認された。低分子フコイダンおよびコントロールの細胞数に変化がないことは確認済みである。
【００９３】
さらに、蛍光量を数値化する為に、Image J(数値化に用いた画像ソフト)を用いて蛍光量を数値化した。た。その結果を図２に示す。
【００９４】
製造例１で得た低分子フコイダンおよび比較製造例の高分子フコイダンを利用して弾性線維形成促進作用を比較検討した結果製造例１で得られる低分子フコイダンは、比較製造例の高分子フコイダンと比較して優れた効果を示すことがわかった。
【００９５】
(組成物調製例１)
化粧料組成物
以下の化粧品組成物を調製する。処方例中の数値の単位は「重量％」である。
以下の低分子フコイダンとは、ガゴメ由来の重量平均分子量７００〜３００００のものである。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
(組成物調製例２)
内服組成物
以下の食品組成物の処方例において、フコイダンの重量は乾燥重量である。
食品組成物の全処方において、フコイダンとしては、エタノール抽出物を行う。
【００９９】
【表３】
【０１００】
この錠剤は、１日３回の食事毎に３錠摂取される。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
この粉末飲料は、１パックを水に溶かして１日３回の食事毎に摂取される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類であるフコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤に関する。より詳細には、本発明は、低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコイダンは、硫酸多糖の一種であり、藻類や棘皮動物由来の粘質物に多く含まれる。主に L-フコース（６−デオキシ−ガラクトース）が α1-2、α1-4結合で数十から数十万個も繋がった化合物を含み、平均分子量は約２０万程度である。
【０００３】
フコイダンの構造は、由来とする藻類やその生育環境などにより多様性があることが知られており、グルクロン酸を含むU-フコイダン、硫酸化フコースだけからなるF-フコイダン、ガラクトースを含むG-フコイダンなどに分けられる。
【０００４】
一方、フコイダンを加水分解して低分子化する方法が報告されている。例えば、フコイダンを酸加水分解する方法（特許文献１）、酸を外部から添加することなくフコイダンを加水分解してオリゴ糖を得る方法（特許文献２）、酵素によりフコイダンを加水分解する方法（特許文献３）などである。
【０００５】
また、フコイダンの生理作用については、抗炎症作用、血液凝固作用、コレステロール沈着防止作用、抗腫瘍作用、抗ガン作用などの他、アレルギーに対する生理学的、生化学的な作用（特許文献４）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２１５９９０号公報
【特許文献２】特開２００２−２２６４９６号公報
【特許文献３】特開２０００−２３６８８９号公報
【特許文献４】特開平１１−２１２４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで解明されていない低分子フコイダンの新たな生理活性を見出し、適合する用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、低分子フコイダンに弾性線維形成促進能があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
上記弾性線維形成促進剤について、上記低分子フコイダンの重量平均分子量は、７００〜３００００であり得る。
【００１０】
上記低分子フコイダンは、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、イシゲ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種に由来することが好ましい。
【００１１】
本発明はまた、上記いずれかの弾性線維形成促進剤を含有する、弾性線維形成促進用組成物、に関する。
【００１２】
上記弾性線維形成促進用組成物は、低分子フコイダンを、全量に対して、０．０００００１〜９９重量％含み得る。
【００１３】
上記弾性線維形成促進用組成物は、化粧料であり得る。
【００１４】
上記弾性線維形成促進用組成物は、食品であり得る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤が提供される。さらには、このような弾性線維形成促進剤を含有する弾性線維形成用組成物であって、化粧料あるいは食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】培養細胞を用いたインビトロでの評価において、フコイダン無添加（コントロール：写真上）、低分子フコイダン添加（写真中）および高分子フコイダン添加（下写真）の場合における弾性線維形成を蛍光発色によって示した写真である。
【図２】図１の写真におけるそれぞれのサンプルの蛍光量を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
肌、血管、肺などの特定の臓器、靱帯などにおける弾力向上又は維持は、細胞だけでなく、細胞外マトリクスを合わせた組織構成によって保たれている。細胞は、伸縮など外部強度に弱いため、細胞の回りに細胞外マトリックスを形成して、組織の形状を保っている。細胞外マトリクスとしては、コラーゲン線維、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、へパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸など）、弾性線維（エラスチン線維）などがある。コラーゲン線維やグリコサミノグリカンは外部強度に対して伸び縮みができないが、弾性線維は引き延ばしても元に戻る特性、すなわち弾性を有しており、伸び縮みの機能が必須である動脈，肺、皮膚の組織には弾性線維は重要な因子である。弾性線維は、ミクロフィブリルという線維の周りにエラスチンが沈着・架橋してできると考えられている。
【００１８】
弾性線維のターンオーバーは非常に遅いため、加齢等によって弾性線維が劣化・断裂した結果、または炎症細胞から分泌されるプロテアーゼ等の外的要因によって弾性線維が劣化・断裂した結果、皮膚のたるみ、動脈硬化、肺が無理に引き延ばされたことに起因する肺気腫などが生じる。動脈においては、弾性線維は太い動脈の質量の半分程度を占めており、脈圧（収縮期圧−拡張期圧）を吸収している。弾性線維の機能が低下すると、動脈は硬い管となって脈圧が上昇する。脈圧の上昇は心疾患の予後を悪化させることがわかっている。
【００１９】
弾性線維の再生が所望される状態又は疾患は、肺気腫、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの、皮膚のたるみ）、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニア、脳底動脈瘤、消化管運動障害、褥瘡などがあり、本願発明の弾性線維形成促進剤によって、弾性線維の伸び縮みの機能が必須である疾患または状態の改善や予防が可能となる。
【００２０】
本発明でいう弾性線維形成促進能とは、ミクロフィブリルの周りにエラスチンが沈着・架橋する工程が促進される能力をいい、その程度は問わず、処置を施さない場合と比較して、エラスチンの沈着がある程度でも促進されている状況であればよい。
【００２１】
本発明においては、このような弾性線維を形成することを促進する作用が低分子フコイダンに見出され、低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤が提供される。
【００２２】
本発明でいうフコイダンは、褐藻類や有棘動物から抽出される粘着質に含まれる硫酸多糖の一種であり、基本的には、Ｌ−フコース−４−硫酸の１，２−結合を主体とする。しかしながら、Ｌ−フコース−４−硫酸の１，３−結合、１，４−結合なども存在するほか、構成糖としては、グルクロン酸などのウロン酸やガラクトース、キシロース、ラムノース、マンノースなどの中性糖を含む場合も多く、その組成は、海藻種によって多様性がある。本発明において「低分子フコイダン」または「フコイダンの低分子量画分」という用語は、同意義で用いられる。そして、これらの用語は、硫酸化フコースを構成成分として含む硫酸化フコース含有多糖のうち、典型的には、重量平均分子量７００〜３００００のフコイダンを意味する。好ましくは、１０万以上の分子量の画分を除いたものがよいが、特に限定はされない。このような重量平均分子量が７００〜３００００の範囲のフコイダンは、優れた弾性線維形成促進能を有する。低分子フコイダンとして、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品その他市販で通常用いられているものをそのまま用いることもできる。
【００２３】
本発明でいう分子量、平均分子量は、重量平均分子量のことであり、ＧＰＣ（ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー）により測定し、ポリスチレン換算により算出された値をいう。すなわち、試料を２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ含有、ｐＨ７．５）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの被験溶液を調製し、これを一晩静置した後、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した濾液を用いて、カラムで溶出する。カラムは、Superdex peptide 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流量：0.4ml／min、カラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製）およびSuperdex 200 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流速：0.4ml/minカラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製)を利用し、上記緩衝液で平衡化後、被験溶液を注入して試料を溶出し、溶出時間から重量平均分子量を決定し、本願発明の効果を発揮する弾性線維形成促進剤を調製する。検出は、示差屈折計（ＲＩ）で行う。
【００２４】
本願発明の低分子フコイダンは、より詳細には、フコイダンのピーク重量平均分子量は、約７００以上が好ましく、約１０００以上がより好ましく、約１５００以上がさらにより好ましい。また、重量平均分子量が約３００００以下が好ましく、約２００００以下がより好ましく、約１５０００以下がさらにより好ましい。上記範囲内であれば、本願発明の十分な効果を得ることができる。
【００２５】
このような低分子フコイダンは、動物、植物、真菌、単細胞生物、原生生物及び原核生物からなる群より選択される一種又は二種以上より抽出されたものや、合成によって得られるものであってもよい。典型的には、海藻類または有棘動物類から得られ得るが、限定はされない。低分子フコイダンは、例えば、天然の海藻類等から抽出されたフコイダン成分を分子量で分画し、低分子フコイダンのみを選択する方法で得られ得る。あるいは、天然の材料から抽出方法を工夫することで、抽出されたフコイダン成分が低分子量化している場合、そのような成分をそのまま使用することもできる。
【００２６】
以下に、本発明の内容を詳細に説明する。本発明に用いられる低分子フコイダンを抽出する原料の由来としては、例えば海藻類または有棘動物類が挙げられるが、これらのうち、特に褐藻類が好ましく用いられる。
【００２７】
ここで、褐藻類とは、褐藻綱に属する海藻をいい、イソガワラ目 （マツモ、キンイロハンモン）、アミジグサ目（エゾヤハズ、ヤハズグサ、ヘラヤハズ、シワヤハズ、アミジグサ、イトアミジ、フクリンアミジ、フタエオオギ、サナダグサ、ウミウチワ、コナウミウチワ、アツバコモングサ、コモングサ、シマオオギ）、ナガマツモ目（クロモ、フトモズク、ネバリモ、シワノカワ、ナガマツモ、モズク）、カヤモノリ目（ワタモ、ホソクビワタモ、フクロノリ、カゴメノリ、イワヒゲ、ハバノリ、セイヨウハバノリ、カヤモドキ、カヤモノリ）、ムチモ目（ムチモ）、ケヤリモ目（イチメガサ）、ウルシグサ目（ウルシグサ、タバコグサ）、コンブ目（ワカメ、ツルモ、スジメ、カジメ、クロメ、アラメ、マコンブ、ホソメコンブ、チガイソ）、イシゲ目（イシゲ、イロロ）、ヒバマタ目（ウガノモク、ヤバネモク、ジョロモク、スナビキモク、フシスジモク、ホンダワラ、ヒジキ、オオバノコギリモク、イソモク、アカモク、ノコギリモク、タマハハキモク、ナラサモ、ヒラネジモク、ヤツマタモク、マメタワラ、オオバモク、ウミトラノオ、アズマネジモク、ヨレモクモドキ、エンドウモク、ラッパモク）、シオミドロ目（特にシオミドロ科に属するもの）、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種または２種以上の組み合わせに由来することが好ましい。
【００２８】
より具体的には、低分子フコイダンを得る為の褐藻類として、例えば、ガゴメコンブ、マコンブ、ホソメコンブ、ミツイシコンブ、チジミコンブ、ヒメコンブ、トロロコンブ、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、レッソニア ニグレセンス、アスコフィラム ノドッサム、ジャイアントケルプ等のコンブ目、オキナワモズク、ナガマツモ、クロモ、イシモズク、フトモズク等のナガマツモ目、ヒバマタ、エゾイシゲ、オオバモク、アカモク、ウガノモク、フジスジモク、ウミトラノオ等のヒバマタ目、アミジグサ、エゾハヤズ等のアミジグサ目等に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種または２種以上の組み合わせが例示される。好ましくは、ガゴメコンブ、マコンブ、ホソメコンブ、ミツイシコンブ、チジミコンブ、ヒメコンブ、トロロコンブ、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、レッソニア ニグレセンス、アスコフィラム ノドッサム、ジャイアントケルプ等のコンブ目、特に好ましくは、ガゴメコンブが用いられる。
【００２９】
上記低分子フコイダンは、天然物からの抽出液として、粗生成物をそのままで用いても、また、粗生成物から低分子フコイダンのみを分離精製したものを用いてもよい。
【００３０】
低分子フコイダンを得る方法としては、特に限定されず、通常の抽出法が採用される。
例えば海藻であれば、限定はされないが、典型的には、ガゴメコンブを粉砕機などで細断したものを、水、あるいは有機溶媒を単独あるいは組み合わせて得られる溶媒を用いて抽出、溶解または懸濁することにより得ることができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等のアルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。
【００３１】
さらに、酸、アルカリの条件下で抽出する事ができる。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、又は、酢酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸などの有機酸が挙げられる。アルカリとしては、アルカリ無機塩が好ましく用いられ、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等を例示できる。
【００３２】
また、粉砕後に、洗浄、脱脂および／または脱色を目的に、有機溶媒および／または水を単独あるいは組み合わせて得られる溶媒を用いて処理してもよい。
【００３３】
低分子フコイダンの抽出物の抽出条件としては、室温又は常温の溶媒を用いることもできるが、「加熱した溶媒」や「加温した熱溶媒」を用いることもできる。具体的には、抽出溶媒が水の場合、抽出時の温度は、溶媒の沸点以下であればよく、特に限定されないが、加圧熱水による抽出方法を利用する場合もあるため、約０〜２００℃が好ましく、約２０〜１３０℃がより好ましい。また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒間〜数日間に設定すれば良く、更に好ましくはい３０分〜６時間に設定すれば良い。溶媒の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明の分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。上記範囲であれば、弾性線維形成能を有する成分を十分に抽出することができる。
【００３４】
限定はされないが、詳細な一例を挙げると、例えば、低分子フコイダンの分解物の製造に際しては、ガゴメコンブをカッターミルで粉砕後、脱色及び/又は脱脂するために７５％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌した後、ろ紙でろ過し、残渣を得る。残渣に水を加えて、９５℃以上で１０時間処理後に、処理液を室温まで冷却し、最終濃度が３０％になるようにエタノールを添加する。この処理液を室温で約２４時間静置し、遠心分離によって固液分離を行う。得られた上清に０．５Ｎ塩酸を添加して低温に２４時間静置し、生じた沈殿を遠心分離で除去し、得られた上清に０．５Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥して低分子フコイダンを得ることができる。
【００３５】
さらに、別の調製例では、例えば、ガゴメコンブ５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて内径４０ｃｍの容器で２５℃で２日間、１分間当り１２０回転の速度で攪拌し、フコイダンを抽出し、抽出物を網目３２μｍのステンレス金網でろ過し、低分子フコイダン溶液を調製する。これを凍結乾燥し、低分子フコイダン粉末を得る。
【００３６】
本発明では、このように抽出した抽出液を低分子フコイダンとして、そのままの状態で用いることもできるが、有機溶媒が含まれている場合には減圧蒸留等により有機溶媒を除去することが好ましい。また、本発明において、低分子フコイダンを含む抽出液は、液状のものを使用してもよいが、必要に応じて、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理を行って液体分を低減又は除去することにより、濃縮液状、半固形状、固形状、又は粉末状にしたものを使用してもよい。
【００３７】
あるいはまた、本発明においては、抽出液に含まれるフコイダンまたは低分子フコイダンを精製することも可能である。フコイダンを精製する場合、精製後に、高分子量画分を含むフコイダンを酸処理したり、酵素処理を施すことで、低分子化し使用することもできる。精製されたＦ−、Ｕ−又はＧ−フコイダンからその低分子量画分を分画することにより得ることもできる。
【００３８】
例えば、ガゴメコンブからフコイダンを調製し、該フコイダンから、グルクロン酸含有フコイダンとグルクロン酸非含有フコイダンを分離できる。また、硫酸化フコガラクタンを調製できる。これらの精製されたフコイダンから低分子量画分を分離して本発明に使用できる。
【００３９】
粗生成物からフコイダンあるいは低分子フコイダンを分離精製する方法としては、特に限定されないが、例えば、塩化セチルピリジニウムなどの４級アンモニウム塩を添加し、フコイダンまたは低分子フコイダンを沈殿させ、アルコール溶液で洗浄する方法やＤＥＡＥセルロースなどの陰イオン交換樹脂などを用いたクロマトグラフィーを用いる方法がある。
【００４０】
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる方法では、得られた抽出液を、濾過などによりさらに処理して陰イオン交換クロマトグラフィーに供することも好ましい。用いられる陰イオン交換樹脂は特に限定されるものではない。陰イオン交換樹脂の活性基としては、例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル基）、ＱＡＥ〔ジエチル（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル基〕、Ｑ（又はＴＥＡＥ）（トリエチルアミノエチル基）、ジメチル（２−ヒドロキシエチル）アミノメチル基、ＰＡＢ（パラアミノベンジル基）、ＡＥ（アミノエチル基）、ＧＥ（グアニドエチル基）などが好適であり、これらを有する陰イオン交換樹脂を用いることができる。陰イオン交換樹脂の担体としては、例えばセルロース系の物質、デキストラン系の物質、アガロース系の物質、スチレンジビニルベンゼン重合体や、親水性ビニルポリマーなどの合成ポリマー系の物質などが用いられており、いかなる担体を用いた陰イオン交換樹脂でも用いることができる。これらの活性基と担体とを組合せた市販の陰イオン交換樹脂として、例えばＤＥＡＥ−セファロース系、ＤＥＡＥ−セファセル系、ＤＥＡＥ−セファデックス系、ＱＡＥ−セファデックス系、Ｑ−セファロースファストフロー（以上ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−バイオゲル系、ＡＧ系（以上バイオラッド社製）、ＤＥＡＥ−トヨパール系、ＴＳＫゲルトヨパール系（以上東ソー社製）、ＤＥＡＥ−セルロファイン系（生化学工業社製）、ダウエックス系（ダウケミカル社製）、ＴＥＡＥ−セルロース（セルバ社製）、アンバーライト系（ロームアンド ハース社製）などがある。
【００４１】
低分子フコイダンを得る方法としては、さらに、抽出物として得られたフコイダンや精製フコイダンをサイズ排除クロマトグラフィーなどに供することも例示される。
【００４２】
限定はされないが、本発明において、分子量１０万以上の画分が排除された低分子フコイダンを調製することも好ましい。この場合には、例えば、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて分子量分画することによって、排除できる。
【００４３】
また、本発明においては、フコイダンには、フコイダンの塩も包含され得る。フコイダンの塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基等との塩が例示され、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、またはジエタノールアミン、エチレンジアミン等との塩が挙げられる。これらの塩は、たとえば、フコイダン等に存在する硫酸基やカルボキシル基を公知の方法により塩に変換することで得られる。さらには、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩などが挙げられる。また、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩なども挙げられる。
【００４４】
使用の目的によっては、薬理学的に許容され得る塩が好ましいが、弾性線維形成のインビトロの実験に供する場合等はこれに限定はされない。
【００４５】
あるいは、本発明の低分子フコイダンは、塩の溶媒和物または水和物を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤は、弾性線維の再生が所望される状態又は疾患、例えば、肺気腫、肺線維症、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの）、皮膚硬化症、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニア、脳底動脈瘤、消化管運動障害、褥瘡などの予防、治療又は改善に有用である他、皮膚のたるみやしわの予防や改善といった美容目的のためにも有用である。また、本発明の弾性線維形成促進剤は、弾性線維の再生能を有する細胞の培養用試薬などとしても有用である。さらに、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に役立つ。さらに、十分解明されているとはいえない弾性線維自体の研究への応用も考えられ、非常に広い範囲で有用である。
【００４７】
本発明の弾性線維形成剤は、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品などとして幅広く利用可能な任意の製剤または組成物の形態で提供され得るが、好ましくは、機能性食品または化粧品として利用可能な製剤または組成物である。
【００４８】
本発明の弾性線維活性促進剤を含む組成物が、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品のいずれの形態を取る場合でも、低分子フコイダンの含有量は、０．０００００１〜９９重量％が好ましく、より好ましくは０．００００１〜３０重量％、さらに好ましくは０．０００１〜１０重量％、特に好ましくは０．００１〜５重量％である。
【００４９】
本発明を医薬品または健康食品などの食品の用途に用いる場合の低分子フコイダンの投与量は、乾燥重量にして、成人1日当たり、０．０００１〜１０ｇ／ｋｇ程度、より好ましくは、成人１日当り０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇとすることができる。上記範囲であれば、弾性線維の伸び縮みの機能を必須とする疾患または状態の改善や予防が可能となる。
【００５０】
内服用形態
【００５１】
本発明の有効成分である低分子フコイダンは、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの固形製剤;またはシロップ剤、注射剤などの液状製剤として経口または非経口的に投与することもできる。さらに、坐剤、貼付剤、吸入剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤が挙げられる。これらの製剤は、常法の添加剤を含んでいても良い。薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００５２】
賦形剤の好適な例としては、例えばＤ−ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどの糖アルコール、ブドウ糖、白糖、乳糖、果糖などの糖類、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、リン酸水素カルシウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、β−シクロデキストリン、軽質無水ケイ酸、酸化チタン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、タルク、カオリンなどが挙げられる。
【００５３】
結合剤の好適な例としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アクリル酸系高分子、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、アルファー化デンプン、カンテン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどが挙げられる。
【００５４】
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルスターチ、部分アルファー化デンプンなどが挙げられる。溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
【００５５】
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ポリオキシル、セタノール、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ジメチルポリシロキサン、ミツロウ、サラシミツロウなどが挙げられる。
【００５６】
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤;例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
【００５７】
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００５８】
本発明の低分子フコイダンを含む弾性線維形成促進剤を固形製剤とする場合、このような製剤を製造する方法としては、低分子フコイダンを製剤原料と混合して固形製剤を製造する工程を含むものであれば特に限定はなく、公知の方法を使用することができる。
【００５９】
例えば、低分子フコイダンと製剤原料を含む製剤組成物を練合し、スクリーンを通過させることで成型する押出造粒物を、粉砕し、整粒する方法、前記製剤組成物に練合水を加えバーチカルグラニュレーターによって成型する攪拌造粒の後に、コーミルを用いて粉砕・篩過する方法、及び前記製剤組成物をローラーコンパクターで圧縮した後、ロールグラニュレーターで粉砕し篩過する方法、撹拌造粒の後に、流動層乾燥する方法が例示される。
【００６０】
また、例えば、直打により製造する場合には、低分子フコイダンと製剤原料を含む製剤組成物を混合した後、直接、打錠機に投入して打錠すればよい。
【００６１】
皮膚外用剤形態
【００６２】
本発明の低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤は、医薬品、医薬部外品として、皮膚外用剤として、あるいは化粧品の形態で使用され得る。これらの外用剤形態においては、低分子フコイダンに加えて、本発明の効果を損なわない範囲で、外皮用剤(化粧料、医薬部外品、医薬品）に添加される公知の基剤又は担体と共に混合して組成物とすることができる。その他に、このような外皮用剤には、例えば、界面活性剤、油分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、分散剤、香料、着色剤、色素、パール光沢付与剤、血行促進成分、保湿成分、紫外線吸収成分、紫外線散乱成分、洗浄成分、抗菌成分、収斂成分、ビタミン類、アミノ酸類、老化防止成分、抗炎症成分、美白成分、角質柔軟成分、細胞賦活化成分、水等を配合することができる。添加剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００６３】
本発明の低分子フコイダンを有効成分とする弾性線維形成促進剤は、医薬品、化粧料又は医薬部外品の公知の形態として、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、パウダー剤、パップ剤、不織布等のシートに薬液を含浸させたシート剤、リップスティックのようなスティック剤などが挙げられる。中でも、好ましくは、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、ゲル剤の形態で用いられる。かかる形態とすることにより、弾性線維形成効果を十分に発揮することができる。
【００６４】
また、化粧料組成物のより詳細で具体的な形態としては、化粧水、乳液、クリーム、美容液、日焼け止め用化粧料、パック、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリームのような基礎化粧料；洗顔料、メイク落とし、ボディーシャンプー、シャンプー、リンスのような洗浄用化粧料；ファンデーション、化粧下地、リップクリーム、口紅、チークカラーのようなメークアップ化粧料；入浴剤などが挙げられる。
【００６５】
＜基剤又は担体＞
基剤又は担体としては、流動パラフィン、スクワラン、ゲル化炭化水素（プラスチベースなど）、オゾケライト、α−オレフィンオリゴマー、軽質流動パラフィンのような炭化水素；メチルポリシロキサン、架橋型メチルポリシロキサン、高重合メチルポリシロキサン、環状シリコーン、アルキル変性シリコーン、架橋型アルキル変性シリコーン、アミノ変性シリコーン、ポリエーテル変性シリコーン、ポリグリセリン変性シリコーン、架橋型ポリエーテル変性シリコーン、架橋型アルキルポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリグリセリン変性シリコーン、ポリエーテル変性分岐シリコーン、ポリグリセリン変性分岐シリコーン、アクリルシリコン、フェニル変性シリコーン、シリコーンレジンのようなシリコーン油；エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン；カラギーナン；ポリビニルブチラート；ポリエチレングリコール；ジオキサン；ブチレングリコールアジピン酸ポリエステル；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリットのようなエステル類；デキストリン、マルトデキストリンのような多糖類；エタノール、イソプロパノールのような低級アルコール；エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ジプロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールモノプロピルエーテルのようなグリコールエーテル；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、グリセリン、イソプレングリコールなどの多価アルコール；水などの水系基剤などが挙げられる。
【００６６】
基剤又は担体は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００６７】
酸化防止剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ソルビン酸、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、エリソルビン酸、Ｌ−システイン塩酸塩などが挙げられる。
【００６８】
界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタンのようなソルビタン脂肪酸エステル類；モノステアリン酸プロピレングリコールのようなプロピレングリコール脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０（ＨＣＯ−４０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油８０などの硬化ヒマシ油誘導体；モノラウリル酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート２０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート６０）、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート８０）、イソステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレンモノヤシ油脂肪酸グリセリル；グリセリンアルキルエーテル；アルキルグルコシド；ポリオキシエチレンセチルエーテルのようなポリオキシアルキレンアルキルエーテル；ステアリルアミン、オレイルアミンのようなアミン類；ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体、ラウリルＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン、ＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコンのようなシリコーン系界面活性剤などが挙げられる。
【００６９】
増粘剤としては、例えば、グアーガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸メタクリル酸アルキル共重合体、ポリエチレングリコール、ベントナイト、（アクリル酸ヒドロキシエチル／アクリロイルジメチルタウリンＮａ）コポリマー、（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリドン）コポリマーなどが挙げられる。
【００７０】
保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、フェノキシエタノールなどが挙げられる。
【００７１】
ｐＨ調整剤としては、無機酸（塩酸、硫酸など）、有機酸（乳酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなど）、有機塩基（トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミンなど）などが挙げられる。
キレート剤としては、ＥＤＴＡ・２ナトリウム塩、ＥＤＴＡ・カルシウム・２ナトリウム塩などが挙げられる。
【００７２】
安定化剤としては、ポリアクリル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられる。
【００７３】
添加剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００７４】
＜その他の有効成分＞
本発明の外用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の有効成分を含むことができる。有効成分の具体例としては、例えば、保湿成分、抗炎症成分、抗菌成分、ビタミン類、ペプチド又はその誘導体、アミノ酸又はその誘導体、細胞賦活化成分、老化防止成分、血行促進成分などが挙げられる。
【００７５】
保湿成分としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジグリセリントレハロースのような多価アルコール；ヒアルロン酸ナトリウム、ヘパリン類似物質、コンドロイチン硫酸ナトリウム、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、キチン、キトサンのような高分子化合物；グリシン、アスパラギン酸、アルギニンのようなアミノ酸；乳酸ナトリウム、尿素、ピロリドンカルボン酸ナトリウムのような天然保湿因子；セラミド、コレステロール、リン脂質のような脂質；カミツレエキス、ハマメリスエキス、チャエキス、シソエキスのような植物抽出エキスなどが挙げられる。
【００７６】
ビタミン類としては、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロールカルシウム等のビタミンＥ類；リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、リボフラビン酪酸エステル、リボフラビンテトラ酪酸エステル、リボフラビン５’−リン酸エステルナトリウム、リボフラビンテトラニコチン酸エステル等のビタミンＢ２類；ニコチン酸ｄｌ−α−トコフェロール、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸メチル、ニコチン酸β−ブトキシエチル、ニコチン酸１−（４−メチルフェニル）エチル等のニコチン酸類；アスコルビゲン−Ａ、アスコルビン酸ステアリン酸エステル、アスコルビン酸パルミチン酸エステル、ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビルなどのビタミンＣ類；メチルヘスペリジン、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロールなどのビタミンＤ類；フィロキノン、ファルノキノン等のビタミンＫ類、γ−オリザノール、ジベンゾイルチアミン、ジベンゾイルチアミン塩酸塩；チアミン塩酸塩、チアミンセチル塩酸塩、チアミンチオシアン酸塩、チアミンラウリル塩酸塩、チアミン硝酸塩、チアミンモノリン酸塩、チアミンリジン塩、チアミントリリン酸塩、チアミンモノリン酸エステルリン酸塩、チアミンモノリン酸エステル、チアミンジリン酸エステル、チアミンジリン酸エステル塩酸塩、チアミントリリン酸エステル、チアミントリリン酸エステルモノリン酸塩等のビタミンＢ１類；塩酸ピリドキシン、酢酸ピリドキシン、塩酸ピリドキサール、５’−リン酸ピリドキサール、塩酸ピリドキサミン等のビタミンＢ６類；シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、デオキシアデノシルコバラミン等のビタミンＢ１２類；葉酸、プテロイルグルタミン酸等の葉酸類；ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどのニコチン酸類；パントテン酸、パントテン酸カルシウム、パントテニルアルコール（パンテノール）、Ｄ−パンテサイン、Ｄ−パンテチン、補酵素Ａ、パントテニルエチルエーテル等のパントテン酸類；ビオチン、ビオチシン等のビオチン類；アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム等のアスコルビン酸誘導体であるビタミンＣ類；カルニチン、フェルラ酸、α−リポ酸、オロット酸等のビタミン様作用因子などが挙げられる。
【００７７】
ペプチド又はその誘導体としては、ケラチン分解ペプチド、加水分解ケラチン、コラーゲン、魚由来コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、エラスチン、エラスチン分解ペプチド、コラーゲン分解ペプチド、加水分解コラーゲン、塩化ヒドロキシプロピルアンモニウム加水分解コラーゲン、エラスチン分解ペプチド、コンキオリン分解ペプチド、加水分解コンキオリン、シルク蛋白分解ペプチド、加水分解シルク、ラウロイル加水分解シルクナトリウム、大豆蛋白分解ペプチド、加水分解大豆蛋白、小麦蛋白、小麦蛋白分解ペプチド、加水分解小麦蛋白、カゼイン分解ペプチド、アシル化ペプチド（パルミトイルオリゴペプチド、パルミトイルペンタペプチド、パルミトイルテトラペプチド等）などが挙げられる。
【００７８】
アミノ酸又はその誘導体としては、ベタイン（トリメチルグリシン）、プロリン、ヒドロキシプロリン、アルギニン、リジン、セリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、β−アラニン、スレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ヒスチジン、タウリン、γ−アミノ酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、カルニチン、カルノシン、クレアチン等が挙げられる。
【００７９】
食品
【００８０】
本発明の低分子フコイダンを含む弾性線維形成促進剤は、食品または機能性食品に含有させて提供され得る。このような食品または機能性食品としては、米飯；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺、カップ麺を含む各種の麺類；清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等の飲料；カレールー、シチュー、各種スープ類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；飴、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、その他の焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、ドレッシング、味噌、醤油、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品などが例示される。
【００８１】
さらには、本発明の弾性線維形成剤を含有するサプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）を調製してもよい。
【００８２】
また、ペットなどの動物用の餌に対して本発明の弾性線維形成剤を含有させることもできる。
【００８３】
食品には、必要に応じて、添加物が加えられる。このような添加物としては、例えばブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、マンニット、デキストリン、クエン酸、クエン酸ソーダ、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ類、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存剤などが挙げられる。
【００８４】
本発明の低分子フコイダンを弾性線維形成促進剤として、弾性線維の再生能を有する細胞の培養用試薬、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に用いる場合、弾性線維自体の研究への応用に用いる場合、そのままの形で用いることも好ましい。
【００８５】
本発明の弾性線維形成促進剤を用いて、人工弾性線維をインビトロで作成すること、弾性線維の研究への応用に用いることも可能である。本発明の弾性線維形成促進剤を用いて、インビトロで弾性線維を形成させ、人工弾性線維の培養用試薬、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に用いることもできる。このようなインビトロでの研究や実施への応用に用いる場合、低分子フコイダンをそのままの形で用いることも好ましい。
【００８６】
本発明の弾性線維形成促進剤は、さらに、ＤＡＮＣＥ発現増強因子（ＤＡＮＣＥ誘導因子）を含んでいてもよい。ＤＡＮＣＥ発現増強因子を用いることができ、例えば、ナンテンカズラエキス、シカクマメエキス、フィチン酸及びその生理学的に許容される塩、並びにＬ−ヒドロキシプロリン及びその生理学的に許容される塩等のＤＡＮＣＥ発現増強因子；ＤＡＮＣＥ発現ベクター、またはＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターなどが挙げられる。
【００８７】
なお、本発明の弾性線維形成促進剤を医薬用途に用いる場合、キットの形態で用いても良い。具体的には、医薬組成物を構成する異種の構成成分を、予め、別々の容器またはパック中に包装しておき、使用直前に混合して使用する態様が挙げられる。容器としては、例えば、封着されたアンプル、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはこれらの類似物が挙げられる。
【実施例】
【００８８】
次に、試験例、実施例等により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８９】
〔製造例１〕（フコイダンの低分子量画分の製造）
ガゴメコンブ５００ｇをカッターミルで細断し、洗浄及び／又は脱色するために１０リットルの８０％エタノール中に懸濁して、３時間攪拌した後、ろ紙でろ過し、残渣を得た。残渣に５０リットルの精製水を添加し、９５℃で１０時間処理後に、処理液を室温まで冷却し、最終濃度が３０％になるようにエタノールを添加した。この処理液を室温で約２４時間静置し、遠心分離によって固液分離を行った。得られた上清に０．５Ｎ塩酸を添加して低温に２４時間静置し、生じた沈殿を遠心分離で除去し、得られた上清に０．５Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを中性付近に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥して低分子フコイダンを得た。
分子量の測定方法としては、ＧＰＣ法により、フコイダン抽出液を２５ｍＭ Tris-HCl緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．５）に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの被験溶液を調製し、ＨＰＬＣカラム Superdex peptide 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流量：0.4ml／min、カラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製）およびSuperdex 200 10/300 GL（10mm I.D.×30cm，流速：0.4ml/minカラム温度40℃、注入量100μｌ、GEヘルスケア社製)を同じ緩衝液で平衡化し、このカラムに被験溶液を１００μL注入する。そして、溶出時間から重量平均分子量１８００〜１２０００の範囲内であることを確認した。
【００９０】
〔比較製造例〕（フコイダンの高分子量画分の製造）
市販のフコイダン（タカラバイオ社製、商品名：TaKaRa海藻エキス、エタノール抽出）をそのまま利用した。
【００９１】
〔試験例１〕
無血清下での実験
２４ウエルプレートの底にMicroscope Cover Glass（Fisherbrandから購入）を置き、その上にヒト皮膚線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０4個播種し、継代用培地（DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium,Invitrogenから購入）、１０％ウシ胎仔血清（FBS、JRH Bioscienceから購入）、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシン）にて３７℃、５％ＣＯ2で培養した。さらに、血清を含まない弾性線維形成培地、すなわち、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用い、ヒト線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０4個播種し、この無血清培地に、製造例１または比較製造例で得た低分子フコイダンまたは高分子フコイダンを０．０００１％加えて、あるいは加えないで、３７℃、５％ＣＯ2で4週間培養した。4週間の培養後、弾性線維の蛍光免疫染色を行なった。詳細には、１ｍＬのＰＢＳを用いて３回洗浄した後、１００％メタノールを用い、−２０℃で20分間固定した。更にＰＢＳを用いて洗浄した後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳを用い、室温で1時間ブロッキングした後、１次抗体として抗エラスチンポリクローナル抗体（Elastin Products Companyから購入）を用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８−抗ウサギＩｇＧ抗体（Invitrogenから購入）を用いた。１次抗体と室温で１時間以上インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、上記の２次抗体と室温で１時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定し、再びPBSで洗浄した後、Hoechst33258(Dojindoから購入)を用いて室温で5分間反応させ、再びPBSで洗浄した後、Aqua Poly/Mount(Poluscienceから購入)にてスライドガラス上にサンプルをマウントした。観察は蛍光顕微鏡DMIRE２（LEICA）IX71（Olympus）を用いて行った。その結果を図１に示す。
【００９２】
すなわち、図1は、弾性線維であるエラスチンを蛍光染色したものである。本蛍光染色法ではエラスチンに加えて細胞質も同時に染色されるためコントロールでは斑点状の蛍光発色が認められるが、これは細胞質を染色したものでありエラスチンを染色したものではない。一方、低分子フコイダンでは、コントロール同様に細胞質は斑点状に染色されるが、写真全面に著明な線維状の蛍光染色が確認された。このことから低分子フコイダンには、著明な弾性線維（エラスチン線維）形成促進効果が確認された。低分子フコイダンおよびコントロールの細胞数に変化がないことは確認済みである。
【００９３】
さらに、蛍光量を数値化する為に、Image J(数値化に用いた画像ソフト)を用いて蛍光量を数値化した。た。その結果を図２に示す。
【００９４】
製造例１で得た低分子フコイダンおよび比較製造例の高分子フコイダンを利用して弾性線維形成促進作用を比較検討した結果製造例１で得られる低分子フコイダンは、比較製造例の高分子フコイダンと比較して優れた効果を示すことがわかった。
【００９５】
(組成物調製例１)
化粧料組成物
以下の化粧品組成物を調製する。処方例中の数値の単位は「重量％」である。
以下の低分子フコイダンとは、ガゴメ由来の重量平均分子量７００〜３００００のものである。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
(組成物調製例２)
内服組成物
以下の食品組成物の処方例において、フコイダンの重量は乾燥重量である。
食品組成物の全処方において、フコイダンとしては、エタノール抽出物を行う。
【００９９】
【表３】
【０１００】
この錠剤は、１日３回の食事毎に３錠摂取される。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
この粉末飲料は、１パックを水に溶かして１日３回の食事毎に摂取される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が７００〜３００００である低分子フコイダンを有効成分として含有する弾性線維形成促進剤。
【請求項２】
前記低分子フコイダンが、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、イシゲ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種に由来する、請求項１記載の弾性線維形成促進剤。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項記載の弾性線維形成促進剤を含有する、弾性線維形成促進用組成物。
【請求項４】
低分子フコイダンを、全量に対して、０．０００００１〜９９重量％含む、請求項３項記載の弾性線維形成促進用組成物。
【請求項５】
化粧料である、請求項３または４記載の弾性線維形成促進用組成物。
【請求項６】
食品である、請求項３または４記載の弾性線維形成促進用組成物。
【請求項１】
重量平均分子量が７００〜３００００である低分子フコイダンを有効成分として含有する弾性線維形成促進剤。
【請求項２】
前記低分子フコイダンが、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、イシゲ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、アミジグサ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも１種に由来する、請求項１記載の弾性線維形成促進剤。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項記載の弾性線維形成促進剤を含有する、弾性線維形成促進用組成物。
【請求項４】
低分子フコイダンを、全量に対して、０．０００００１〜９９重量％含む、請求項３項記載の弾性線維形成促進用組成物。
【請求項５】
化粧料である、請求項３または４記載の弾性線維形成促進用組成物。
【請求項６】
食品である、請求項３または４記載の弾性線維形成促進用組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１３−３５８０６（Ｐ２０１３−３５８０６Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７５１３０（Ｐ２０１１−１７５１３０）
【出願日】平成２３年８月１０日（２０１１．８．１０）
【出願人】（０００１１５９９１）ロート製薬株式会社 (366)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１０日（２０１１．８．１０）
【出願人】（０００１１５９９１）ロート製薬株式会社 (366)
【Ｆターム（参考）】
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