当帰芍薬散の評価方法およびその評価用マーカー遺伝子の同定方法
【課題】当帰芍薬散の患者に対する効果および適合性を評価する方法、ならびに当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法などを提供する。
【解決手段】当帰芍薬散投与前後における発現変動遺伝子を、統計学的手法を用いて、網羅的に解析し投薬前後で遺伝子発現比が有意に変動している遺伝子のなかから、当帰芍薬散の効果を評価するためのマーカー遺伝子になりうる遺伝子を同定し、その同定されたマーカー遺伝子の投薬前後における発現変動を解析することにより当帰芍薬散の効果および適合性を評価する。
【解決手段】当帰芍薬散投与前後における発現変動遺伝子を、統計学的手法を用いて、網羅的に解析し投薬前後で遺伝子発現比が有意に変動している遺伝子のなかから、当帰芍薬散の効果を評価するためのマーカー遺伝子になりうる遺伝子を同定し、その同定されたマーカー遺伝子の投薬前後における発現変動を解析することにより当帰芍薬散の効果および適合性を評価する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、当帰芍薬散の薬効評価用のマーカー遺伝子を利用した当帰芍薬散の薬効評価方法、ならびに当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子を同定する方法に関する。詳しくは、当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子の発現変動を解析することにより、当帰芍薬散の患者に対する効果および適合性を評価する方法、ならびに当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法に関する。更に、当帰芍薬散投与による被験者の発現遺伝子変動をＤＮＡマイクロアレイにて測定し、そのデータを統計学的手法により解析することによる当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方医学には、３千年にもおよぶ長い歴史があり、その間、漢方薬は、実際に数え切れないほど多くの人に使われてきており、その中で副作用が少なくて、効果のある漢方薬だけが受け継がれ、現在まで残っている。代表的漢方薬の一つの当帰芍薬散は、当帰、芍薬、茯苓、朮、沢瀉、川きゅうの生薬からなり、古くより多くの女性に用いられてきた漢方薬である。その効能効果は月経不順、月経異常、月経痛、更年期障害、産前産後あるいは流産による障害(貧血、疲労倦怠、めまい、むくみ)、めまい、頭重、肩こり、腰痛、足腰の冷え症、しもやけ、むくみ、しみ等である。
【０００３】
漢方薬は、副作用が少ない反面、効果も穏やかな面があり、その効能・効果の科学的根拠や作用メカニズムなどは、解明されていない面もある。また、近年、医療の分野において、ＥＢＭ（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：根拠に基づいた医療）という考え方、つまり、臨床的な試験・研究によって治療効果を確認して、それを根拠に治療を行うべきであるという考え方が世界的な潮流となってきており、漢方医学もその例外ではない。
【０００４】
さらに、漢方薬は、複数の生薬からなり有効成分の数、量、状態、あるいは、有効成分の効果を増減する成分の混入割合など、様々な要因によりその効果が影響されるために有効な活性探索及び活性評価並びに品質管理の方法が無かった。特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）あるいは質量分析法などによる成分分析は、活性や効果を評価する方法ではないため、有効成分の効果を増減する成分についてはその影響を評価できないという欠点がある。
【０００５】
近年、格段の進歩を遂げた西洋医学におけるポストゲノム研究技術を、漢方医学に応用し、客観的な指標（診断バイオマーカー等）の構築の努力がなされてきている。即ち、漢方医学において重視される「証」の診断を、ゲノミクスやプロテオミクス技術で支援するシステムの構築が検討されている。例えば、香蘇散および半夏厚朴湯の証について、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた客観的で信頼性および再現性の高い診断を可能にする遺伝子およびその利用技術が開示されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００６】
一方、当帰芍薬散の作用メカニズムを調べるため、抹消血細胞やラットおける当帰芍薬散による発現遺伝子変動をＤＮＡマイクロアレイ技術により解明しようとしている報告がなされているが（非特許文献２、３）、ヒトの遺伝子発現変動については報告がなく、また、当帰芍薬散の患者に対する効果・適合性やその方剤の活性を評価する方法は報告されていない。さらに遺伝子発現変動解析において、被検体の個体差やデータのバラツキを補正し、統計学的に有意に変動する遺伝子を評価用マーカー遺伝子として同定する方法に関する記載もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−１１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓａｋｉら、ジャーナル オブ クリニカル ファーマシ ー アンド セラピュティクス（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒ）、３２巻、２４ ７−２５２頁、２００７年
【非特許文献２】Ｋａｗａｍｕｒａら、バイオオーガニック アンド メディシナル ケミストリー レターズ（Ｂｉｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１７巻、６８７９ −８２頁、２００７年
【非特許文献３】Ｃｈｕｎｇら、ジャーナル オブ トラディショナル メディシン（Ｊ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２４巻、２４−３０頁及び３１−３８頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、当帰芍薬散投薬の患者の生体試料、特に抹消血由来のＲＮＡを用いて、特定の遺伝子の発現プロファイルの変化を調べることにより当帰芍薬散の効果・適合性を評価する方法、および当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法、ならびに当帰芍薬散の効果・適合性や当帰芍薬散方剤の活性を評価するための試薬等の提供を目的とする。更に、当帰芍薬散投与によるＤＮＡマイクロアレイにて遺伝子発現変動遺子を統計学的手法により解析することによる該当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子を同定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以上の目的を達成するために、先ず月経不順、冷え症およびむくみの３つの症状を認め、かつ他に基礎疾患をもたない女性被験者に当帰芍薬散を４週間投与し、問診票による問診にて症状改善を確認した被験者の抹消血からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡマイクロアレイ・チップ（アジレント・テクノロジー社）を用いて、当帰芍薬散投与前後における発現遺伝子を網羅的に解析し、投薬前後で遺伝子発現比が有意に変動している遺伝子のなかから、統計学的手法を用いて当帰芍薬散の効果の評価マーカーになりうる遺伝子群を決定し、その遺伝子発現変動を解析することにより当帰芍薬散の効果および適合性を評価出来る方法を検討し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は、
（１）当帰芍薬散を投与した被験者の生体試料由来のＲＮＡを用いた、表１から選ばれるいずれかのマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、当帰芍薬散の該被験者に対する薬効を評価することを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価方法、
（２）前記生体試料が抹消血である（１）記載の評価方法、
（３）前記遺伝子発現解析が、該被験者への当帰芍薬散の投薬前後の遺伝子発現比であることを特徴とする（１）または（２）記載の評価方法、
（４）前記マーカー遺伝子が、ＺＮＦ２６７，ＣＡＳＰ３，ＳＡＭＤ９，ＨＭＧＢ１，ＩＦＩ４４，ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ，ＲＰＳ６ＫＢ，ＲＢ１ＣＣ１，ＣＨＭＰ５，ＳＬＣ２５Ａ４，ＴＬＲ７，ＳＬＣ３０Ａ１，ＲＯＣＫ１，ＨＳＰＡ５，ＣＳＦ１Ｒ，ＮＲＩＰ１，ＣＣＲ５，ＧＦＡＰ，ＥＰＯＲ，ＲＥＲＧ，ＡＧＴＲ１，ＨＳＰＢ９，ＴＡＳ１Ｒ１，ＨＴＲ１Ｂ，ＩＧＦＢＰ２，ＴＥＡＤ１，ＲＧＳ１２，ＫＣＮＮ２，ＡＧＲＩＮ，ＥＦＮＡ１，ＰＤＥ４Ｃ，ＧＬＰ２Ｒ，ＳＬＣ１４Ａ２などからなる群より選ばれる１つ以上であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法、
（５）前記遺伝子発現解析が、チップ、アレイ、メンブレンフィルターおよびビーズを含むＤＮＡ固相化試料のいずれかを用いて行われることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法、
（６）前記遺伝子発現解析が、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれかの方法を用いて行われることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法、
（７）当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法である（１）〜（６）のいずれかに記載の評価方法、
（８）表１に記載のマーカー遺伝子にそれぞれ特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための各プローブのうち複数個を、固相上に固定化したことを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価用固相化試料、
（９）漢方薬の評価用マーカー遺伝子を同定する方法であって、該漢方薬投与被験者由来の生体試料についてのＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現変動データ解析おいて、得られたデータをノーマライズ処理した後、統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする、上記方法、
（１０）前記漢方薬が当帰芍薬散である（９）記載の方法、
（１１）前記ノーマライズ処理が、クオンタイルノーマライゼイション（Ｑｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）であることを特徴とする（９）または（１０）記載の方法、
（１２）フォールスディスカバリーレイト（Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ；ＦＤＲ）と遺伝子発現変動の関係をプロットしたボルケーノプロットを用いて統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする（９）〜（１１）いずれかに記載の方法、
（１３）（９）〜（１２）いずれかに記載の方法によって同定される表１に示す当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子、
などを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、当帰芍薬散評価用のマーカー遺伝子を同定することが可能となり、その遺伝子発現変動を解析することにより、被験者の当帰芍薬散に対する効果や適合性を評価すること、および当帰芍薬散方剤の活性を評価することが可能となる。また、マーカー遺伝子を検出するためのプローブを、固相上に固定化した当帰芍薬散の効果・適合性および活性の評価用固相化試料を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】当帰芍薬散投与前後の被験者に対して問診に用いた問診票を示す。
【図２】問診票の解析による愁訴改善効果が確認された項目を示す（＊、＊＊記号が付いているものが、統計学的有意に改善効果が確認された項目）。
【図３】当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子の同定方法のうち、（１）ノーマライゼーション過程を図示する。
【図４】当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子の同定方法のうち、（２）遺伝子発現比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）の統計解析過程を図示する。
【図５】当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子の同定方法のうち、（３）遺伝子発現比によるプローブの選択過程を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下において、本発明を詳細に説明する。当帰芍薬散は、「芍薬」、「茯苓」、「朮」、「沢瀉」、「当帰」、「川きゅう」の６種類の生薬からなり、その混合比は、通常４：４：４：４：３：３や３：３：３：３：２：２等のものが使用される。本明細書における当帰芍薬散方剤は、例えば、芍薬４ｇ、茯苓４ｇ、蒼朮４ｇ、沢瀉４ｇ、当帰３ｇ、川きゅう３ｇの混合物を用い、この方剤を煎じて約２００ｍＬとしたものを１日量とし、１日２回（朝夕、１回投与量は約１００ｍＬ）被験者に投与した。また、当帰芍薬散を被験者に投与する試験において、他の５種の生薬は全く同じロットの生薬を用いて、当帰のみ奈良県産大和当帰（高級品として取引されている）と中国産大和当帰（低級品として取引されているもの）の２種の当帰を用いた比較実験を実施した。高級品、低級品の区別は、生薬マイスター（財団法人日本特産農産物協会認定）の鑑定結果によるものである。なお、本明細書では、奈良県産大和当帰とは、大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｃｕｔｉｌｏｂａ Ｋｉｔａｇａｗａ）を奈良県で栽培・加工したものであり、中国産大和当帰とは、大和トウキの種子を中国へ持ち込み、中国で栽培・加工したものをいう。
【００１５】
問診は、特に限定されないが、例えば、図１に示す問診票に示すごとく、当帰芍薬散が対象とされる１１症状に分けられた６７項目について、被験者が、当帰芍薬散投薬前後の被験者の状態を記入した。問診票の１１症状のうち冷えとむくみ症状については、「ぜんぜんない」１点、「まれにある」２点、「ときどきある」３点、「ひんぱんにある」４点、「いつもある」５点の５段階、その他の９症状については、「ない」１点、「どちらともいえない」２点、「ある」３点の３段階に分けて点数化した。投薬前後の問診データについて、対応あるｔ−検定（Ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を実施すると、統計学的有意に改善された症状と、その改善程度等を解析できる。
【００１６】
生体試料とは、ＲＮＡが採取できるものであれば特に制限はなく、例えば、組織サンプル、抹消血、骨髄液などが用いられるが、被験者への負担を考慮すると抹消血が好ましい。これらの生体試料は、所定の処理（例えば、分画処理など）に供されたものであってもよい。
【００１７】
遺伝子発現解析に際しては、全ＲＮＡをそのまま用いるほか、精製した全ＲＮＡ標品からｍＲＮＡを単離して用いるが、ｍＲＮＡの単離に際しては、当該分野で周知のＲＮＡ単離方法を用いることが出来る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編， １９８７−１９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。また、抹消血から全ＲＮＡの抽出は、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（キアゲン社製）等のキットを用いて、そのキットに記載されている手順書に従って抽出することもできる。
【００１８】
遺伝子の発現解析方法は、ＤＮＡチップ、ＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等の他のＤＮＡ固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法等、当該技術分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。特に、多数の遺伝子を一度に網羅的に解析する場合は、ＤＮＡチップ、ＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター、及びビーズ等のＤＮＡ固相化試料を用いた解析方法が好ましい。一方、特定の遺伝子の発現量を解析する場合は、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法を用いた解析方法が好ましい。
【００１９】
遺伝子を検出するためのプローブは、周知の方法に従って、例えば、表１から選ばれる各マーカー遺伝子の特異性の高い領域に相補的な配列として設計することができ、２５−１００塩基長の合成オリゴプローブ、あるいは３００−１０００塩基長のＰＣＲ産物を使用することができる。固相上へのプローブの固定化方法は、特に限定されず、周知の方法に従い、合成したプローブを固相上にスポットするか、プローブを固相上で合成すればよい。さらに、ＤＮＡマイクロアレイにおいては、基板上にスポットしたＤＮＡを標識したサンプルＤＮＡとハイブリダイズさせるが、この標識方法も限られず、蛍光標識、放射性同位体による標識等を含む。例えば、標識化したｃＲＮＡをＷｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（アジレント・テクロノロジー社）とハイブリダイズさせ、マイクロアレイスキャナー（アジレント・テクノロジー社）でスキャンすることにより、遺伝子発現データを得ることができる。
【００２０】
ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現データの解析から、マーカー遺伝子の候補を選択することができる。上記のハイブリダイゼーションをＤＮＡチップに用いて得られたデータには、ノイズリダクションおよびノーマライゼーション等の補正を行う必要がある。なぜなら、プローブの物理的、化学的な変化による測定値のばらつき、実験環境のばらつき、時間によるずれ、チップ製造時に生じる不均一性などのチップ間のばらつきが存在するためである。ノイズリダクションの手法は、例えば、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社）を用いて行うことができる。また、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸから得られるスポット情報を用いて、ハイブリダイゼーションの品質を評価し、サチュレーションの排除、バックグランドと有意な差のないシグナルを有するスポットの排除を行うことができる。ノーマライゼーションの手法は、例えば、Ｇｌｏｂａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ、Ｌｏｅｓｓ ＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎおよびＱｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎなどの手法がある。本発明では、複数の被験者からのデータのヒストグラムを同じにするＱｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎが好ましい。この手法は臨床実験による被験者のばらつきを最小にすることから、本発明のような臨床実験データの解析には最適である。ノーマライゼーション後、各プローブにおける投薬前後のシグナル強度の間に差異がないという帰無仮説の下でｔ−検定を行い、投薬前後でシグナル強度の有意に異なる、すなわち統計的に有意な発現の変化を示すプローブ(遺伝子)を検出することができる。
【００２１】
上記の遺伝子発現データの統計的解析から得られた結果を、縦軸にＦａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）、横軸に発現比（投薬後シグナル強度／投薬前シグナル強度）をプロットしたボルケーノプロットを参考に、発現が有意に変化した遺伝子を検出することが可能である。ここで、ＦＤＲは、帰無仮説が棄却された遺伝子群に含まれる偽陽性の割合を示す。なお、ＦＤＲの算出は、Ｓｔｏｒｅｙらの方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００， ９４４０-９４４５， ２００３）に従った。
【００２２】
以下実施例にて具体的に述べるが、このように奈良県産大和当帰含有当帰芍薬散（ＴＳＳｎ）および中国産含有当帰芍薬散（ＴＳＳｃ）を投薬した被験者の投薬前後の問診結果の統計解析により（図２に示す）、冷え、むくみ、婦人科症状および精神・神経症状の４つの症状に改善が認められた被験者において、当帰芍薬散服用前後において統計学的有意に発現変動している遺伝子を同定し、そのうち発現変動が大きい等、評価用マーカーとして適当であると判断された遺伝子を当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子として選択した。即ち、当帰芍薬散の投薬前後での発現量比が、１．３０以上または０．７０以下の発現比で有意に変動している（ｐ＜０．０１、ＦＤＲ＜０．０１）２２４個の遺伝子を選択し、さらに、機能不明および重複する遺伝子を削除して、当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子として１３０個の遺伝子を選択し、表１に、配列番号、マーカー遺伝子のＧｅｎＢａｎｋデータベース記載のＵｎｉＧｅｎｅ名とＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
表１に示される遺伝子のなかには、当帰芍薬散の効能であり、問診結果、有意に改善効果が認められた冷え、むくみ、婦人科症状および精神・神経症状の改善や免疫作用等と関係が示唆される遺伝子が含まれる。そのような遺伝子として、例えば、ＺＮＦ２６７，ＣＡＳＰ３，ＳＡＭＤ９，ＨＭＧＢ１，ＩＦＩ４４，ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ，ＲＰＳ６ＫＢ，ＲＢ１ＣＣ１，ＣＨＭＰ５，ＳＬＣ２５Ａ４，ＴＬＲ７，ＳＬＣ３０Ａ１，ＲＯＣＫ１，ＨＳＰＡ５，ＣＳＦ１Ｒ，ＮＲＩＰ１，ＣＣＲ５，ＧＦＡＰ，ＥＰＯＲ，ＲＥＲＧ，ＡＧＴＲ１，ＨＳＰＢ９，ＴＡＳ１Ｒ１，ＨＴＲ１Ｂ，ＩＧＦＢＰ２，ＴＥＡＤ１，ＲＧＳ１２，ＫＣＮＮ２，ＡＧＲＩＮ，ＥＦＮＡ１，ＰＤＥ４Ｃ，ＧＬＰ２Ｒ，ＳＬＣ１４Ａ２などがあげられる。表１の遺伝子マーカーの複数個以上の遺伝子の発現変動を解析することにより、または表１に示される特定の遺伝子を特定の遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法を用いて解析することにより、被験者の当帰芍薬散への効果が判定できるとともに、一定期間の投薬による発現変動および／または発現量を解析することにより、被験者の当帰芍薬散への相性、即ち適用性を調べることができる。さらには種々の品質の生薬原料からなる当帰芍薬散方剤の活性も調べることが可能である。
【００２５】
また、表１に示されるマーカー遺伝子の複数個以上を検出するためのプローブを固相上に固定化することにより、当帰芍薬散の効果・適用性や当帰芍薬散方剤の活性を評価する固相化試料を作製することが出来る。固相の形状は特に限定されず、その全体または一部が平坦な面を有する固相が好ましい。例えばスライドガラス（ポリＬ−リシンコート、シリレン化、シラン化などを行ってもよい）、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。固定化する際、市販のスポッティング装置などを用いてもよい。特にＤＮＡマイクロアレイについては多くの作製装置が市販されており、作製方法も担体上に直接ＤＮＡを合成する方法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）もある。例えばＤＮＡマイクロアレイについては、細胞工学別冊、ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、村松正明、那波宏之監修、秀潤社、ｐ．２６−３４、サザンブロットについては、実験医学別冊、改訂第４版、新遺伝子工学ハンドブック、村松正實ら編、羊土社、ｐ．９０−９４、ＤＮＡマクロアレイについては、実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座１、ゲノム機能研究プロトコール、辻本豪三ら編、羊土社、ｐ．７８−８３を参照して作製することができる。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明を参考例および実施例に基づいて説明する。本発明は以下の参考例および実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。なお、本研究は、北里大学東洋医学総合研究所倫理委員会の承認を得ている。また、各参加者から書面のインフォームド・コンセントを得ている。
【００２７】
試験に用いた当帰芍薬散の原料生薬のうち、シャクヤク（芍薬，Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ，日本産）、ブクリョウ（茯苓，Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ Ｗｏｌｆ，韓国産）、ソウジュツ（蒼朮，Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ， 中国産）、タクシャ（沢瀉，Ａｌｉｓｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ （Ｓａｍ．） Ｊｕｚｅｐｃｚｕｋｅ，中国産）、センキュウ（川きゅう，Ｃｎｉｄｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｍａｋｉｎｏ， 日本産）は、ウチダ和漢（東京）より購入した。２種類の大和トウキ（大和当帰，Ａｎｇｌｉｃａ ａｃｕｔｉｌｏｂａ Ｋｉｔａｇａｗａ，日本産と中国産）は、福田商店（奈良）より購入した。また、大和当帰の高級および低級の等級判定は、生薬マイスター（財団法人日本特産農産物協会認定）による判定結果である。
【００２８】
実施例１（投薬試験１）
冷え、むくみ、婦人科症状（３症状）をいずれも持ち、かつ他に基礎的疾患を持たず、妊娠していない非喫煙女性で、２１〜４７歳（平均年齢３４．８歳）の女性２４名を被験者とした。一方、奈良県産大和当帰含有当帰芍薬散（芍薬４ｇ、茯苓４ｇ、蒼朮４ｇ、沢瀉４ｇ、川きゅう３ｇおよび奈良県産大和当帰３ｇ）（ＴＳＳｎ）に水４００ｍＬを加え、煎じて２００ｍＬまで煮詰めた当帰芍薬湯を１日量とした。この当帰芍薬湯を上記被験者に４週間、朝夕の空腹時２回（１回分１００ｍＬ）投与した。投与開始前と４週間後の終了時に、各被験者に対する愁訴程度の診断は、図１に示す問診票による自己記入方式により行った。また、各被験者から抹消血を採取した。
【００２９】
実施例２（投薬試験２）
実施例１と同様の条件の２６〜４９歳（平均年齢３９．６歳）の女性被験者１８名に、中国産大和当帰含有当帰芍薬散（芍薬４ｇ、茯苓４ｇ、蒼朮４ｇ、沢瀉４ｇ、川きゅう３ｇおよび中国産大和当帰３ｇ；当帰以外は実施例１にて用いたものと同じロットの生薬を用いた）（ＴＳＳｃ）を、同様に処理したものを、同様に投与し、問診結果を得、また末梢血を採取した。
【００３０】
実施例３（問診結果）
実施例１および２で得られた各被験者の投薬前後の問診結果について統計解析を実施した。即ち、冷えとむくみの２症状は、５段階の程度を、回答するようにした。すなわち、回答１ （全く愁訴がない）、２ （希に愁訴がある）、３ （時々、愁訴がある、）、４ （大体、常に愁訴がある）、５ （常に、愁訴がある）。その他の９の症状（全身症状、精神・神経症状、眼・耳・鼻・のど症状、呼吸・循環器症状、消化器症状、泌尿器症状、皮膚症状、筋・骨・関節症状、婦人科症状）は、３段階の程度を回答するようにした。すなわち、回答１ （愁訴がない）、２ （愁訴がある時と無い時がある）、３ （愁訴がある）。それを愁訴得点とした。投薬前と投薬後の得点に対して、関連２群のｔ−検定を行い、かつ、得点を比べることによって、改善程度を判断した。結果を図２に示す。以上のように問診票の愁訴得点を解析した結果、冷え症、むくみ、婦人科病および精神・神経症状の愁訴改善効果が認められた。
【００３１】
実施例４（マーカー遺伝子の同定）
実施例１および２で得られた投薬前と投薬後に採取した被試験者の末梢血より、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付されたプロトコールに従い、全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの合成とそれに続く、Ｃｙａｎｉｎｅ３ ＣＴＰで標識されたｃＲＮＡの増幅合成は、Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社）で行った。標識ｃＲＮＡを、Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ４４Ｋ×４ ｐａｃｋ（アジレント・テクノロジー社）にハイブリダイズし、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｃａｎｎｅｒ（アジレント・テクノロジー社）で、蛍光をスキャンした。
【００３２】
プローブの検出は、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔソフト（アジレント・テクノロジー社）で行い、データ・マイニングはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸソフト（アジレント・テクノロジー社）を用いて行った。全てのスポットのシグナル強度が解析対象にはならない。なぜなら、コントロールスポットやシグナル強度が低いスポットを除外しておかなければ、解析においてノイズとなってしまうためである。そこで、８４枚のアレイに対して、以下のＱｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌを行った。１）コントロールスポットの除去（ＣｏｎｔｒｏｌＴｙｐｅ＝０を選択）；２）サチュレーションしたスポットの除去（ｇｌｓＳａｔｕｒａｔｅｄ＝０を選択）；３）ある閾値よりも低いシグナル強度であるスポットの除去（ｇｌｓＷｅｌｌＡｂｏｖｅＢＧ＝１を選択）；４）スポット（バックグランド）内のむら、均一性にフラグがたっているスポットを除去（ｇｌｓＦｅａｔＮｏｎＵｎｉｆＯＬ＝０， ｇｌｓＢＧＮｏｎＵｎｉｆＯＬ＝０を選択）；５）プローブが複数のアレイにプリントされている場合にそれらのプローブとスポット間の均一性にフラグがたっているスポットを除去（ｇｌｓＦｅａｔＰｏｐｎＯＬ＝０， ｇｌｓＢＧＰｏｐｎＯＬ＝０を選択）。さらに、全てのアレイ（８４枚）で上記のＱｕａｌｉｔｙを満たす９，０７０個のスポットを分析対象とし、これらは、８，７９５個のプローブと７，７８７個の遺伝子に相当した。
【００３３】
データ・マイニングの後、スポットのシグナル強度に対するＱｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行い、各アレイのシグナル強度の分布を全て同じにした。その後、各プローブに対応したＲＮＡ発現比（投薬後シグナル強度／投薬前シグナル強度）を計算した。それから、各プローブのｌｏｇ２（発現比）の平均が０に等しいという帰無仮説の下で、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を行った。統計的に有意な発現の変化を示したプローブ（遺伝子）を、Ｓｔｏｒｅｙらの方法に従い算出したＦａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｉｏ（ＦＤＲ）と発現比からなるボルケーノプロットを用いて選択した。具体的には、縦軸にＦＤＲの−ｌｏｇ１０値、横軸に発現比の平均を設定したボルケーノプロットによりフィルタリングを行った。フィルタリングの結果、８，７９５個のプローブのうちＦＤＲ値が０．０１以下のプローブは２，４５４個であり、ｐ値は０．００７以下であった。
【００３４】
それらのプローブにおいて発現比が１．３以上または０．７以下であったプローブは、それぞれ、１２９個と９５個であった。さらに、それらのプローブから、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている遺伝子のプローブを選択し、機能性不明の遺伝子のプローブを除き、さらにプローブ間で遺伝子の重複がある場合は発現比の絶対値の大きいほうのプローブを選択した。その結果、発現比が１．３以上および０．７以下である遺伝子はそれぞれ７５個と５５個であり、それらの遺伝子を当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子として選択した（表１）。上記のマーカー遺伝子の選択過程を図３、図４および図５に示す。
【００３５】
表１のマーカー遺伝子において、投薬前後で遺伝子発現量が増加したマーカー遺伝子を表２に、減少したマーカー遺伝子を表３に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により同定された当帰芍薬散薬効評価用の遺伝子マーカーの発現変動を解析することにより、被験者の当帰芍薬散に対する薬効や適合性を評価すること、および当帰芍薬散方剤の活性を評価することが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、当帰芍薬散の薬効評価用のマーカー遺伝子を利用した当帰芍薬散の薬効評価方法、ならびに当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子を同定する方法に関する。詳しくは、当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子の発現変動を解析することにより、当帰芍薬散の患者に対する効果および適合性を評価する方法、ならびに当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法に関する。更に、当帰芍薬散投与による被験者の発現遺伝子変動をＤＮＡマイクロアレイにて測定し、そのデータを統計学的手法により解析することによる当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方医学には、３千年にもおよぶ長い歴史があり、その間、漢方薬は、実際に数え切れないほど多くの人に使われてきており、その中で副作用が少なくて、効果のある漢方薬だけが受け継がれ、現在まで残っている。代表的漢方薬の一つの当帰芍薬散は、当帰、芍薬、茯苓、朮、沢瀉、川きゅうの生薬からなり、古くより多くの女性に用いられてきた漢方薬である。その効能効果は月経不順、月経異常、月経痛、更年期障害、産前産後あるいは流産による障害(貧血、疲労倦怠、めまい、むくみ)、めまい、頭重、肩こり、腰痛、足腰の冷え症、しもやけ、むくみ、しみ等である。
【０００３】
漢方薬は、副作用が少ない反面、効果も穏やかな面があり、その効能・効果の科学的根拠や作用メカニズムなどは、解明されていない面もある。また、近年、医療の分野において、ＥＢＭ（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：根拠に基づいた医療）という考え方、つまり、臨床的な試験・研究によって治療効果を確認して、それを根拠に治療を行うべきであるという考え方が世界的な潮流となってきており、漢方医学もその例外ではない。
【０００４】
さらに、漢方薬は、複数の生薬からなり有効成分の数、量、状態、あるいは、有効成分の効果を増減する成分の混入割合など、様々な要因によりその効果が影響されるために有効な活性探索及び活性評価並びに品質管理の方法が無かった。特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）あるいは質量分析法などによる成分分析は、活性や効果を評価する方法ではないため、有効成分の効果を増減する成分についてはその影響を評価できないという欠点がある。
【０００５】
近年、格段の進歩を遂げた西洋医学におけるポストゲノム研究技術を、漢方医学に応用し、客観的な指標（診断バイオマーカー等）の構築の努力がなされてきている。即ち、漢方医学において重視される「証」の診断を、ゲノミクスやプロテオミクス技術で支援するシステムの構築が検討されている。例えば、香蘇散および半夏厚朴湯の証について、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた客観的で信頼性および再現性の高い診断を可能にする遺伝子およびその利用技術が開示されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００６】
一方、当帰芍薬散の作用メカニズムを調べるため、抹消血細胞やラットおける当帰芍薬散による発現遺伝子変動をＤＮＡマイクロアレイ技術により解明しようとしている報告がなされているが（非特許文献２、３）、ヒトの遺伝子発現変動については報告がなく、また、当帰芍薬散の患者に対する効果・適合性やその方剤の活性を評価する方法は報告されていない。さらに遺伝子発現変動解析において、被検体の個体差やデータのバラツキを補正し、統計学的に有意に変動する遺伝子を評価用マーカー遺伝子として同定する方法に関する記載もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−１１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓａｋｉら、ジャーナル オブ クリニカル ファーマシ ー アンド セラピュティクス（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒ）、３２巻、２４ ７−２５２頁、２００７年
【非特許文献２】Ｋａｗａｍｕｒａら、バイオオーガニック アンド メディシナル ケミストリー レターズ（Ｂｉｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１７巻、６８７９ −８２頁、２００７年
【非特許文献３】Ｃｈｕｎｇら、ジャーナル オブ トラディショナル メディシン（Ｊ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２４巻、２４−３０頁及び３１−３８頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、当帰芍薬散投薬の患者の生体試料、特に抹消血由来のＲＮＡを用いて、特定の遺伝子の発現プロファイルの変化を調べることにより当帰芍薬散の効果・適合性を評価する方法、および当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法、ならびに当帰芍薬散の効果・適合性や当帰芍薬散方剤の活性を評価するための試薬等の提供を目的とする。更に、当帰芍薬散投与によるＤＮＡマイクロアレイにて遺伝子発現変動遺子を統計学的手法により解析することによる該当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子を同定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以上の目的を達成するために、先ず月経不順、冷え症およびむくみの３つの症状を認め、かつ他に基礎疾患をもたない女性被験者に当帰芍薬散を４週間投与し、問診票による問診にて症状改善を確認した被験者の抹消血からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡマイクロアレイ・チップ（アジレント・テクノロジー社）を用いて、当帰芍薬散投与前後における発現遺伝子を網羅的に解析し、投薬前後で遺伝子発現比が有意に変動している遺伝子のなかから、統計学的手法を用いて当帰芍薬散の効果の評価マーカーになりうる遺伝子群を決定し、その遺伝子発現変動を解析することにより当帰芍薬散の効果および適合性を評価出来る方法を検討し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は、
（１）当帰芍薬散を投与した被験者の生体試料由来のＲＮＡを用いた、表１から選ばれるいずれかのマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、当帰芍薬散の該被験者に対する薬効を評価することを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価方法、
（２）前記生体試料が抹消血である（１）記載の評価方法、
（３）前記遺伝子発現解析が、該被験者への当帰芍薬散の投薬前後の遺伝子発現比であることを特徴とする（１）または（２）記載の評価方法、
（４）前記マーカー遺伝子が、ＺＮＦ２６７，ＣＡＳＰ３，ＳＡＭＤ９，ＨＭＧＢ１，ＩＦＩ４４，ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ，ＲＰＳ６ＫＢ，ＲＢ１ＣＣ１，ＣＨＭＰ５，ＳＬＣ２５Ａ４，ＴＬＲ７，ＳＬＣ３０Ａ１，ＲＯＣＫ１，ＨＳＰＡ５，ＣＳＦ１Ｒ，ＮＲＩＰ１，ＣＣＲ５，ＧＦＡＰ，ＥＰＯＲ，ＲＥＲＧ，ＡＧＴＲ１，ＨＳＰＢ９，ＴＡＳ１Ｒ１，ＨＴＲ１Ｂ，ＩＧＦＢＰ２，ＴＥＡＤ１，ＲＧＳ１２，ＫＣＮＮ２，ＡＧＲＩＮ，ＥＦＮＡ１，ＰＤＥ４Ｃ，ＧＬＰ２Ｒ，ＳＬＣ１４Ａ２などからなる群より選ばれる１つ以上であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法、
（５）前記遺伝子発現解析が、チップ、アレイ、メンブレンフィルターおよびビーズを含むＤＮＡ固相化試料のいずれかを用いて行われることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法、
（６）前記遺伝子発現解析が、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれかの方法を用いて行われることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法、
（７）当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法である（１）〜（６）のいずれかに記載の評価方法、
（８）表１に記載のマーカー遺伝子にそれぞれ特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための各プローブのうち複数個を、固相上に固定化したことを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価用固相化試料、
（９）漢方薬の評価用マーカー遺伝子を同定する方法であって、該漢方薬投与被験者由来の生体試料についてのＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現変動データ解析おいて、得られたデータをノーマライズ処理した後、統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする、上記方法、
（１０）前記漢方薬が当帰芍薬散である（９）記載の方法、
（１１）前記ノーマライズ処理が、クオンタイルノーマライゼイション（Ｑｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）であることを特徴とする（９）または（１０）記載の方法、
（１２）フォールスディスカバリーレイト（Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ；ＦＤＲ）と遺伝子発現変動の関係をプロットしたボルケーノプロットを用いて統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする（９）〜（１１）いずれかに記載の方法、
（１３）（９）〜（１２）いずれかに記載の方法によって同定される表１に示す当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子、
などを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、当帰芍薬散評価用のマーカー遺伝子を同定することが可能となり、その遺伝子発現変動を解析することにより、被験者の当帰芍薬散に対する効果や適合性を評価すること、および当帰芍薬散方剤の活性を評価することが可能となる。また、マーカー遺伝子を検出するためのプローブを、固相上に固定化した当帰芍薬散の効果・適合性および活性の評価用固相化試料を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】当帰芍薬散投与前後の被験者に対して問診に用いた問診票を示す。
【図２】問診票の解析による愁訴改善効果が確認された項目を示す（＊、＊＊記号が付いているものが、統計学的有意に改善効果が確認された項目）。
【図３】当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子の同定方法のうち、（１）ノーマライゼーション過程を図示する。
【図４】当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子の同定方法のうち、（２）遺伝子発現比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）の統計解析過程を図示する。
【図５】当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子の同定方法のうち、（３）遺伝子発現比によるプローブの選択過程を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下において、本発明を詳細に説明する。当帰芍薬散は、「芍薬」、「茯苓」、「朮」、「沢瀉」、「当帰」、「川きゅう」の６種類の生薬からなり、その混合比は、通常４：４：４：４：３：３や３：３：３：３：２：２等のものが使用される。本明細書における当帰芍薬散方剤は、例えば、芍薬４ｇ、茯苓４ｇ、蒼朮４ｇ、沢瀉４ｇ、当帰３ｇ、川きゅう３ｇの混合物を用い、この方剤を煎じて約２００ｍＬとしたものを１日量とし、１日２回（朝夕、１回投与量は約１００ｍＬ）被験者に投与した。また、当帰芍薬散を被験者に投与する試験において、他の５種の生薬は全く同じロットの生薬を用いて、当帰のみ奈良県産大和当帰（高級品として取引されている）と中国産大和当帰（低級品として取引されているもの）の２種の当帰を用いた比較実験を実施した。高級品、低級品の区別は、生薬マイスター（財団法人日本特産農産物協会認定）の鑑定結果によるものである。なお、本明細書では、奈良県産大和当帰とは、大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｃｕｔｉｌｏｂａ Ｋｉｔａｇａｗａ）を奈良県で栽培・加工したものであり、中国産大和当帰とは、大和トウキの種子を中国へ持ち込み、中国で栽培・加工したものをいう。
【００１５】
問診は、特に限定されないが、例えば、図１に示す問診票に示すごとく、当帰芍薬散が対象とされる１１症状に分けられた６７項目について、被験者が、当帰芍薬散投薬前後の被験者の状態を記入した。問診票の１１症状のうち冷えとむくみ症状については、「ぜんぜんない」１点、「まれにある」２点、「ときどきある」３点、「ひんぱんにある」４点、「いつもある」５点の５段階、その他の９症状については、「ない」１点、「どちらともいえない」２点、「ある」３点の３段階に分けて点数化した。投薬前後の問診データについて、対応あるｔ−検定（Ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を実施すると、統計学的有意に改善された症状と、その改善程度等を解析できる。
【００１６】
生体試料とは、ＲＮＡが採取できるものであれば特に制限はなく、例えば、組織サンプル、抹消血、骨髄液などが用いられるが、被験者への負担を考慮すると抹消血が好ましい。これらの生体試料は、所定の処理（例えば、分画処理など）に供されたものであってもよい。
【００１７】
遺伝子発現解析に際しては、全ＲＮＡをそのまま用いるほか、精製した全ＲＮＡ標品からｍＲＮＡを単離して用いるが、ｍＲＮＡの単離に際しては、当該分野で周知のＲＮＡ単離方法を用いることが出来る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編， １９８７−１９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。また、抹消血から全ＲＮＡの抽出は、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（キアゲン社製）等のキットを用いて、そのキットに記載されている手順書に従って抽出することもできる。
【００１８】
遺伝子の発現解析方法は、ＤＮＡチップ、ＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等の他のＤＮＡ固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法等、当該技術分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。特に、多数の遺伝子を一度に網羅的に解析する場合は、ＤＮＡチップ、ＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター、及びビーズ等のＤＮＡ固相化試料を用いた解析方法が好ましい。一方、特定の遺伝子の発現量を解析する場合は、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法を用いた解析方法が好ましい。
【００１９】
遺伝子を検出するためのプローブは、周知の方法に従って、例えば、表１から選ばれる各マーカー遺伝子の特異性の高い領域に相補的な配列として設計することができ、２５−１００塩基長の合成オリゴプローブ、あるいは３００−１０００塩基長のＰＣＲ産物を使用することができる。固相上へのプローブの固定化方法は、特に限定されず、周知の方法に従い、合成したプローブを固相上にスポットするか、プローブを固相上で合成すればよい。さらに、ＤＮＡマイクロアレイにおいては、基板上にスポットしたＤＮＡを標識したサンプルＤＮＡとハイブリダイズさせるが、この標識方法も限られず、蛍光標識、放射性同位体による標識等を含む。例えば、標識化したｃＲＮＡをＷｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（アジレント・テクロノロジー社）とハイブリダイズさせ、マイクロアレイスキャナー（アジレント・テクノロジー社）でスキャンすることにより、遺伝子発現データを得ることができる。
【００２０】
ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現データの解析から、マーカー遺伝子の候補を選択することができる。上記のハイブリダイゼーションをＤＮＡチップに用いて得られたデータには、ノイズリダクションおよびノーマライゼーション等の補正を行う必要がある。なぜなら、プローブの物理的、化学的な変化による測定値のばらつき、実験環境のばらつき、時間によるずれ、チップ製造時に生じる不均一性などのチップ間のばらつきが存在するためである。ノイズリダクションの手法は、例えば、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社）を用いて行うことができる。また、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸから得られるスポット情報を用いて、ハイブリダイゼーションの品質を評価し、サチュレーションの排除、バックグランドと有意な差のないシグナルを有するスポットの排除を行うことができる。ノーマライゼーションの手法は、例えば、Ｇｌｏｂａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ、Ｌｏｅｓｓ ＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎおよびＱｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎなどの手法がある。本発明では、複数の被験者からのデータのヒストグラムを同じにするＱｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎが好ましい。この手法は臨床実験による被験者のばらつきを最小にすることから、本発明のような臨床実験データの解析には最適である。ノーマライゼーション後、各プローブにおける投薬前後のシグナル強度の間に差異がないという帰無仮説の下でｔ−検定を行い、投薬前後でシグナル強度の有意に異なる、すなわち統計的に有意な発現の変化を示すプローブ(遺伝子)を検出することができる。
【００２１】
上記の遺伝子発現データの統計的解析から得られた結果を、縦軸にＦａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）、横軸に発現比（投薬後シグナル強度／投薬前シグナル強度）をプロットしたボルケーノプロットを参考に、発現が有意に変化した遺伝子を検出することが可能である。ここで、ＦＤＲは、帰無仮説が棄却された遺伝子群に含まれる偽陽性の割合を示す。なお、ＦＤＲの算出は、Ｓｔｏｒｅｙらの方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００， ９４４０-９４４５， ２００３）に従った。
【００２２】
以下実施例にて具体的に述べるが、このように奈良県産大和当帰含有当帰芍薬散（ＴＳＳｎ）および中国産含有当帰芍薬散（ＴＳＳｃ）を投薬した被験者の投薬前後の問診結果の統計解析により（図２に示す）、冷え、むくみ、婦人科症状および精神・神経症状の４つの症状に改善が認められた被験者において、当帰芍薬散服用前後において統計学的有意に発現変動している遺伝子を同定し、そのうち発現変動が大きい等、評価用マーカーとして適当であると判断された遺伝子を当帰芍薬散の薬効評価用マーカー遺伝子として選択した。即ち、当帰芍薬散の投薬前後での発現量比が、１．３０以上または０．７０以下の発現比で有意に変動している（ｐ＜０．０１、ＦＤＲ＜０．０１）２２４個の遺伝子を選択し、さらに、機能不明および重複する遺伝子を削除して、当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子として１３０個の遺伝子を選択し、表１に、配列番号、マーカー遺伝子のＧｅｎＢａｎｋデータベース記載のＵｎｉＧｅｎｅ名とＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
表１に示される遺伝子のなかには、当帰芍薬散の効能であり、問診結果、有意に改善効果が認められた冷え、むくみ、婦人科症状および精神・神経症状の改善や免疫作用等と関係が示唆される遺伝子が含まれる。そのような遺伝子として、例えば、ＺＮＦ２６７，ＣＡＳＰ３，ＳＡＭＤ９，ＨＭＧＢ１，ＩＦＩ４４，ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ，ＲＰＳ６ＫＢ，ＲＢ１ＣＣ１，ＣＨＭＰ５，ＳＬＣ２５Ａ４，ＴＬＲ７，ＳＬＣ３０Ａ１，ＲＯＣＫ１，ＨＳＰＡ５，ＣＳＦ１Ｒ，ＮＲＩＰ１，ＣＣＲ５，ＧＦＡＰ，ＥＰＯＲ，ＲＥＲＧ，ＡＧＴＲ１，ＨＳＰＢ９，ＴＡＳ１Ｒ１，ＨＴＲ１Ｂ，ＩＧＦＢＰ２，ＴＥＡＤ１，ＲＧＳ１２，ＫＣＮＮ２，ＡＧＲＩＮ，ＥＦＮＡ１，ＰＤＥ４Ｃ，ＧＬＰ２Ｒ，ＳＬＣ１４Ａ２などがあげられる。表１の遺伝子マーカーの複数個以上の遺伝子の発現変動を解析することにより、または表１に示される特定の遺伝子を特定の遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法を用いて解析することにより、被験者の当帰芍薬散への効果が判定できるとともに、一定期間の投薬による発現変動および／または発現量を解析することにより、被験者の当帰芍薬散への相性、即ち適用性を調べることができる。さらには種々の品質の生薬原料からなる当帰芍薬散方剤の活性も調べることが可能である。
【００２５】
また、表１に示されるマーカー遺伝子の複数個以上を検出するためのプローブを固相上に固定化することにより、当帰芍薬散の効果・適用性や当帰芍薬散方剤の活性を評価する固相化試料を作製することが出来る。固相の形状は特に限定されず、その全体または一部が平坦な面を有する固相が好ましい。例えばスライドガラス（ポリＬ−リシンコート、シリレン化、シラン化などを行ってもよい）、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。固定化する際、市販のスポッティング装置などを用いてもよい。特にＤＮＡマイクロアレイについては多くの作製装置が市販されており、作製方法も担体上に直接ＤＮＡを合成する方法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）もある。例えばＤＮＡマイクロアレイについては、細胞工学別冊、ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、村松正明、那波宏之監修、秀潤社、ｐ．２６−３４、サザンブロットについては、実験医学別冊、改訂第４版、新遺伝子工学ハンドブック、村松正實ら編、羊土社、ｐ．９０−９４、ＤＮＡマクロアレイについては、実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座１、ゲノム機能研究プロトコール、辻本豪三ら編、羊土社、ｐ．７８−８３を参照して作製することができる。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明を参考例および実施例に基づいて説明する。本発明は以下の参考例および実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。なお、本研究は、北里大学東洋医学総合研究所倫理委員会の承認を得ている。また、各参加者から書面のインフォームド・コンセントを得ている。
【００２７】
試験に用いた当帰芍薬散の原料生薬のうち、シャクヤク（芍薬，Ｐａｅｏｎｉａ ｌａｃｔｉｆｌｏｒａ Ｐａｌｌａｓ，日本産）、ブクリョウ（茯苓，Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ Ｗｏｌｆ，韓国産）、ソウジュツ（蒼朮，Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ， 中国産）、タクシャ（沢瀉，Ａｌｉｓｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ （Ｓａｍ．） Ｊｕｚｅｐｃｚｕｋｅ，中国産）、センキュウ（川きゅう，Ｃｎｉｄｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｍａｋｉｎｏ， 日本産）は、ウチダ和漢（東京）より購入した。２種類の大和トウキ（大和当帰，Ａｎｇｌｉｃａ ａｃｕｔｉｌｏｂａ Ｋｉｔａｇａｗａ，日本産と中国産）は、福田商店（奈良）より購入した。また、大和当帰の高級および低級の等級判定は、生薬マイスター（財団法人日本特産農産物協会認定）による判定結果である。
【００２８】
実施例１（投薬試験１）
冷え、むくみ、婦人科症状（３症状）をいずれも持ち、かつ他に基礎的疾患を持たず、妊娠していない非喫煙女性で、２１〜４７歳（平均年齢３４．８歳）の女性２４名を被験者とした。一方、奈良県産大和当帰含有当帰芍薬散（芍薬４ｇ、茯苓４ｇ、蒼朮４ｇ、沢瀉４ｇ、川きゅう３ｇおよび奈良県産大和当帰３ｇ）（ＴＳＳｎ）に水４００ｍＬを加え、煎じて２００ｍＬまで煮詰めた当帰芍薬湯を１日量とした。この当帰芍薬湯を上記被験者に４週間、朝夕の空腹時２回（１回分１００ｍＬ）投与した。投与開始前と４週間後の終了時に、各被験者に対する愁訴程度の診断は、図１に示す問診票による自己記入方式により行った。また、各被験者から抹消血を採取した。
【００２９】
実施例２（投薬試験２）
実施例１と同様の条件の２６〜４９歳（平均年齢３９．６歳）の女性被験者１８名に、中国産大和当帰含有当帰芍薬散（芍薬４ｇ、茯苓４ｇ、蒼朮４ｇ、沢瀉４ｇ、川きゅう３ｇおよび中国産大和当帰３ｇ；当帰以外は実施例１にて用いたものと同じロットの生薬を用いた）（ＴＳＳｃ）を、同様に処理したものを、同様に投与し、問診結果を得、また末梢血を採取した。
【００３０】
実施例３（問診結果）
実施例１および２で得られた各被験者の投薬前後の問診結果について統計解析を実施した。即ち、冷えとむくみの２症状は、５段階の程度を、回答するようにした。すなわち、回答１ （全く愁訴がない）、２ （希に愁訴がある）、３ （時々、愁訴がある、）、４ （大体、常に愁訴がある）、５ （常に、愁訴がある）。その他の９の症状（全身症状、精神・神経症状、眼・耳・鼻・のど症状、呼吸・循環器症状、消化器症状、泌尿器症状、皮膚症状、筋・骨・関節症状、婦人科症状）は、３段階の程度を回答するようにした。すなわち、回答１ （愁訴がない）、２ （愁訴がある時と無い時がある）、３ （愁訴がある）。それを愁訴得点とした。投薬前と投薬後の得点に対して、関連２群のｔ−検定を行い、かつ、得点を比べることによって、改善程度を判断した。結果を図２に示す。以上のように問診票の愁訴得点を解析した結果、冷え症、むくみ、婦人科病および精神・神経症状の愁訴改善効果が認められた。
【００３１】
実施例４（マーカー遺伝子の同定）
実施例１および２で得られた投薬前と投薬後に採取した被試験者の末梢血より、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付されたプロトコールに従い、全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの合成とそれに続く、Ｃｙａｎｉｎｅ３ ＣＴＰで標識されたｃＲＮＡの増幅合成は、Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社）で行った。標識ｃＲＮＡを、Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ４４Ｋ×４ ｐａｃｋ（アジレント・テクノロジー社）にハイブリダイズし、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｃａｎｎｅｒ（アジレント・テクノロジー社）で、蛍光をスキャンした。
【００３２】
プローブの検出は、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔソフト（アジレント・テクノロジー社）で行い、データ・マイニングはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸソフト（アジレント・テクノロジー社）を用いて行った。全てのスポットのシグナル強度が解析対象にはならない。なぜなら、コントロールスポットやシグナル強度が低いスポットを除外しておかなければ、解析においてノイズとなってしまうためである。そこで、８４枚のアレイに対して、以下のＱｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌを行った。１）コントロールスポットの除去（ＣｏｎｔｒｏｌＴｙｐｅ＝０を選択）；２）サチュレーションしたスポットの除去（ｇｌｓＳａｔｕｒａｔｅｄ＝０を選択）；３）ある閾値よりも低いシグナル強度であるスポットの除去（ｇｌｓＷｅｌｌＡｂｏｖｅＢＧ＝１を選択）；４）スポット（バックグランド）内のむら、均一性にフラグがたっているスポットを除去（ｇｌｓＦｅａｔＮｏｎＵｎｉｆＯＬ＝０， ｇｌｓＢＧＮｏｎＵｎｉｆＯＬ＝０を選択）；５）プローブが複数のアレイにプリントされている場合にそれらのプローブとスポット間の均一性にフラグがたっているスポットを除去（ｇｌｓＦｅａｔＰｏｐｎＯＬ＝０， ｇｌｓＢＧＰｏｐｎＯＬ＝０を選択）。さらに、全てのアレイ（８４枚）で上記のＱｕａｌｉｔｙを満たす９，０７０個のスポットを分析対象とし、これらは、８，７９５個のプローブと７，７８７個の遺伝子に相当した。
【００３３】
データ・マイニングの後、スポットのシグナル強度に対するＱｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行い、各アレイのシグナル強度の分布を全て同じにした。その後、各プローブに対応したＲＮＡ発現比（投薬後シグナル強度／投薬前シグナル強度）を計算した。それから、各プローブのｌｏｇ２（発現比）の平均が０に等しいという帰無仮説の下で、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を行った。統計的に有意な発現の変化を示したプローブ（遺伝子）を、Ｓｔｏｒｅｙらの方法に従い算出したＦａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｉｏ（ＦＤＲ）と発現比からなるボルケーノプロットを用いて選択した。具体的には、縦軸にＦＤＲの−ｌｏｇ１０値、横軸に発現比の平均を設定したボルケーノプロットによりフィルタリングを行った。フィルタリングの結果、８，７９５個のプローブのうちＦＤＲ値が０．０１以下のプローブは２，４５４個であり、ｐ値は０．００７以下であった。
【００３４】
それらのプローブにおいて発現比が１．３以上または０．７以下であったプローブは、それぞれ、１２９個と９５個であった。さらに、それらのプローブから、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている遺伝子のプローブを選択し、機能性不明の遺伝子のプローブを除き、さらにプローブ間で遺伝子の重複がある場合は発現比の絶対値の大きいほうのプローブを選択した。その結果、発現比が１．３以上および０．７以下である遺伝子はそれぞれ７５個と５５個であり、それらの遺伝子を当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子として選択した（表１）。上記のマーカー遺伝子の選択過程を図３、図４および図５に示す。
【００３５】
表１のマーカー遺伝子において、投薬前後で遺伝子発現量が増加したマーカー遺伝子を表２に、減少したマーカー遺伝子を表３に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により同定された当帰芍薬散薬効評価用の遺伝子マーカーの発現変動を解析することにより、被験者の当帰芍薬散に対する薬効や適合性を評価すること、および当帰芍薬散方剤の活性を評価することが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
当帰芍薬散を投与した被験者の生体試料由来のＲＮＡを用いた、表１から選ばれるいずれかのマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、当帰芍薬散の該被験者に対する薬効を評価することを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価方法。
【請求項２】
前記生体試料が抹消血である請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
前記遺伝子発現解析が、該被験者への当帰芍薬散の投薬前後の遺伝子発現比であることを特徴とする請求項１または２記載の評価方法。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子が、ＺＮＦ２６７，ＣＡＳＰ３，ＳＡＭＤ９，ＨＭＧＢ１，ＩＦＩ４４，ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ，ＲＰＳ６ＫＢ，ＲＢ１ＣＣ１，ＣＨＭＰ５，ＳＬＣ２５Ａ４，ＴＬＲ７，ＳＬＣ３０Ａ１，ＲＯＣＫ１，ＨＳＰＡ５，ＣＳＦ１Ｒ，ＮＲＩＰ１，ＣＣＲ５，ＧＦＡＰ，ＥＰＯＲ，ＲＥＲＧ，ＡＧＴＲ１，ＨＳＰＢ９，ＴＡＳ１Ｒ１，ＨＴＲ１Ｂ，ＩＧＦＢＰ２，ＴＥＡＤ１，ＲＧＳ１２，ＫＣＮＮ２，ＡＧＲＩＮ，ＥＦＮＡ１，ＰＤＥ４Ｃ，ＧＬＰ２Ｒ，ＳＬＣ１４Ａ２からなる群より選ばれる１つ以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項５】
前記遺伝子発現解析が、チップ、アレイ、メンブレンフィルターおよびビーズを含むＤＮＡ固相化試料のいずれかを用いて行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項６】
前記遺伝子発現解析が、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれかの方法を用いて行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項７】
当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法で請求項１〜６のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項８】
表１に記載のマーカー遺伝子のそれぞれに特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための各プローブのうち複数個を、固相上に固定化したことを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価用固相化試料。
【請求項９】
漢方薬の評価用マーカー遺伝子を同定する方法であって、該漢方薬投与被験者由来の生体試料についてのＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現変動データ解析おいて、得られたデータをノーマライズ処理した後、統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする、上記方法。
【請求項１０】
前記漢方薬が当帰芍薬散である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ノーマライズ処理が、クオンタイルノーマライゼイション（Ｑｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）であることを特徴とする請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
フォールスディスカバリーレイト（Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ；ＦＤＲ）と遺伝子発現変動の関係をプロットしたボルケーノプロットを用いて統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする請求項９〜１１いずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２いずれか１項記載の方法によって同定される表１に示す当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子。
【請求項１】
当帰芍薬散を投与した被験者の生体試料由来のＲＮＡを用いた、表１から選ばれるいずれかのマーカー遺伝子の発現解析結果に基づき、当帰芍薬散の該被験者に対する薬効を評価することを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価方法。
【請求項２】
前記生体試料が抹消血である請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
前記遺伝子発現解析が、該被験者への当帰芍薬散の投薬前後の遺伝子発現比であることを特徴とする請求項１または２記載の評価方法。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子が、ＺＮＦ２６７，ＣＡＳＰ３，ＳＡＭＤ９，ＨＭＧＢ１，ＩＦＩ４４，ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ，ＲＰＳ６ＫＢ，ＲＢ１ＣＣ１，ＣＨＭＰ５，ＳＬＣ２５Ａ４，ＴＬＲ７，ＳＬＣ３０Ａ１，ＲＯＣＫ１，ＨＳＰＡ５，ＣＳＦ１Ｒ，ＮＲＩＰ１，ＣＣＲ５，ＧＦＡＰ，ＥＰＯＲ，ＲＥＲＧ，ＡＧＴＲ１，ＨＳＰＢ９，ＴＡＳ１Ｒ１，ＨＴＲ１Ｂ，ＩＧＦＢＰ２，ＴＥＡＤ１，ＲＧＳ１２，ＫＣＮＮ２，ＡＧＲＩＮ，ＥＦＮＡ１，ＰＤＥ４Ｃ，ＧＬＰ２Ｒ，ＳＬＣ１４Ａ２からなる群より選ばれる１つ以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項５】
前記遺伝子発現解析が、チップ、アレイ、メンブレンフィルターおよびビーズを含むＤＮＡ固相化試料のいずれかを用いて行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項６】
前記遺伝子発現解析が、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、及びディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれかの方法を用いて行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項７】
当帰芍薬散方剤の活性を評価する方法で請求項１〜６のいずれか１項記載の評価方法。
【請求項８】
表１に記載のマーカー遺伝子のそれぞれに特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための各プローブのうち複数個を、固相上に固定化したことを特徴とする当帰芍薬散の効果の評価用固相化試料。
【請求項９】
漢方薬の評価用マーカー遺伝子を同定する方法であって、該漢方薬投与被験者由来の生体試料についてのＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現変動データ解析おいて、得られたデータをノーマライズ処理した後、統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする、上記方法。
【請求項１０】
前記漢方薬が当帰芍薬散である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ノーマライズ処理が、クオンタイルノーマライゼイション（Ｑｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）であることを特徴とする請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
フォールスディスカバリーレイト（Ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ；ＦＤＲ）と遺伝子発現変動の関係をプロットしたボルケーノプロットを用いて統計学的に有意に変動している遺伝子を選択することを特徴とする請求項９〜１１いずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２いずれか１項記載の方法によって同定される表１に示す当帰芍薬散評価用マーカー遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−３０５２８（Ｐ２０１１−３０５２８Ａ）
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８１８０５（Ｐ２００９−１８１８０５）
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里研究所 (180)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里研究所 (180)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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