形状転換ガラス化装置
本発明は、形状記憶材料を使用して新規な形状転換の特徴を作り出す、冷凍保存のガラス化法のための貯蔵装置（冷凍容器）において、冷凍容器の該当する熱伝達ゾーンを、生体標本の取り扱いに資する形状と急速な熱伝達に資する形状の間で熱的に変形させることができる、貯蔵装置である。この特徴は、形状記憶材料の温度誘発性相変態を利用している。温度誘発は、ガラス化中に起こる普通の温度変化内で自然に起こる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年１１月１０日出願の米国非仮特許出願第１２／２６７７０８号「形状転換ガラス化装置」（Ｓｈａｐｅ Ｓｈｉｆｔｉｎｇ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ）の継続出願である。前記非仮特許出願を参考文献として援用する。
【０００２】
前記米国非仮特許出願第１２／２６７７０８号、それ自体は、「形状記憶ガラス化冷凍容器」（Ｓｈａｐｅ Ｍｅｍｏｒｙ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｙｏｃｏｎｔａｉｎｅｒ）の名称で２００７年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９８７，１１０号に対する優先権を主張している。前記仮特許出願を参考文献としてここに援用する。
【０００３】
本発明は、生体標本の冷凍保存のための装置の分野に属する。
【背景技術】
【０００４】
生命科学では、貴重な（単数又は複数の）細胞の生物活性を長期に亘り休止させることを目的に、冷凍保存技術が実践されている。冷凍保存の成功の１つの要因は、氷の結晶が形成されるという有害効果を低減又は排除することである。冷凍保存時に水が氷へと凍ってゆく自然傾向を阻止するには、高度な方法が必要である。
冷凍保存
【０００５】
氷結晶形成を最小限にする１つの方法は、「緩慢凍結」と呼ばれている。緩慢凍結の最初の工程は、浸透性及び非浸透性の凍害保護物質（「ＣＰＡ」）を含む水溶液（「緩慢凍結媒体」）を用いて、単一細胞又は複数細胞を脱水することである。単一細胞又は複数細胞は、少量の緩慢凍結媒体と共に「生体標本」を構成する。次いで、生体標本は、適した冷凍容器、即ち、極低温温度で使用するのに適した容器に入れられる。ここで使用されている「極低温温度」とは、−８０℃より冷たい温度を意味している。緩慢凍結冷凍保存には、生体標本を、室温からその最終的な極低温貯蔵温度まで、即ち、典型的には液体窒素（「ＬＮ２」）の大気圧下沸点である−１９６℃まで冷凍することが伴う。この温度範囲の一部、即ち、大凡−６℃から下へ−３０℃までについては、冷凍速度はプログラム可能なフリーザーによって厳密に０．１−０．３℃／分に制御される。−３０℃から−１９６℃までの冷凍は、冷凍容器をＬＮ２に押し込むことによって実現される。緩慢凍結プロセスは完了するまでに２−３時間掛かり、よってその名が付いている。このプロセスにより、氷の結晶は、実際に、単一細胞又は複数細胞を取り囲んでいるＣＰＡの中に形成され、単一細胞又は複数細胞内では最小限になる。緩慢凍結は、胚及び精子の様な含水量の少ない細胞には有効であるが、卵母細胞及び胚盤胞の様な含水量の多い細胞でも巧くいくとは限らない。この欠陥、高い機器費用、及び高時間消費が、ガラス化と呼ばれる、代わりの冷凍保存方法の開発をもたらした。
ガラス化
【０００６】
ガラス化は、細胞に損傷を負わせる氷の形成を完全に回避しようとしている点で、緩慢凍結とは異なる。緩慢凍結と同様、ガラス化の最初の工程は、「ガラス化媒体」と呼ばれるＣＰＡ含有流体を使用して、単一細胞又は複数細胞をできる限り多分に脱水することである。次いで、生体標本（緩慢凍結の場合と同じ定義）は、ＬＮ２の様な極低温流体への浸漬によって急速に冷凍される。冷凍速度とＣＰＡ濃度を適切に組み合わせることで、細胞内水分は、規則的で損傷を負わせる結晶質の氷の状態というより、むしろ固体で無害のガラス様（ガラス質）の状態を獲得することになる。ガラス化は、水分子をランダムな配列で閉じ込める流体粘度の急激な上昇、と書き表すことができる。しかしながら、ガラス化媒体は、緩慢凍結媒体より高いレベルのＣＰＡを含んでおり、ガラス質状態以外では細胞にとって毒性がある。従って、脱水及び解凍（氷が形成されないので「加温」と呼ばれる）時の細胞のガラス化媒体への曝露時間は、細胞損傷を回避するべく慎重に制御されなくてはならない。ガラス化と緩慢凍結の終点は同じ、つまり、ＬＮ２の様なクリオゲン内での長期貯蔵である。
【０００７】
１０６℃／分の冷凍速度が可能であったなら、ガラス化は、凍害保護物質を一切用いずに実現することもできよう。６０％ｗ／ｗのＣＰＡ濃度を有する極めて有毒なガラス化媒体は、普通の冷凍速度でガラス化させることができる。市販のガラス化媒体は、上記境界の間のＣＰＡ処方と最小冷凍可能速度を有している。ＣＰＡ濃度と最小冷凍可能速度の間の反比例関係は良く知られている。ガラス化媒体の毒性効果を最小限にするためのキーは、そのＣＰＡ濃度を最小化することである。従って、素早く冷凍することが望ましく、速ければ速いほど良い。上記に鑑みて、この分野で起こるべくして起こった初期の発見は、生体標本を直接ＬＮ２に押し込んで急速冷凍を実現することであった。このプロセスを円滑化し、制御するため、直接の押し込みを可能にする担持装置が作り出された。例を挙げると、電子顕微鏡グリッド、オープンプルストロー（ｏｐｅｎ ｐｕｌｌｅｄ ｓｔｒａｗ）、クリオループ（Ｃｒｙｏｌｏｏｐ）（商標）、ナイロンメッシュ、及びクリオトップ（Ｃｒｙｏｔｏｐ）である。クリオループは、ハンプトンリサーチ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社の商標である。これらの装置は、生体標本が冷凍用クリオゲン、典型的にはＬＮ２、と直接接触するという点で「開放型担持具」に分類される。開放型担持具は、生体標本の急速加温も可能にした。
【０００８】
しかしながら、ＬＮ２は無菌ではない。ＬＮ２は、細菌種及び真菌種を含んでいるかもしれず、それらは温められると生存能力を持つ。更に、ＬＮ２内に長期貯蔵状態に保たれているガラス化された細胞は、前記ＬＮ２に人工的に入れられたウイルス性病原体に感染し得ることが報告されている。従って、開放型担持具にはガラス化された生体標本の感染の可能性がある。
【０００９】
感染の可能性が、生体標本が冷凍容器内に入れられてＬＮ２内での冷凍前に密封される閉鎖型冷凍容器の開発をもたらした。冷凍容器は、長期貯蔵中に生体標本を、病原体を含んでいるクリオゲンから隔離する貯蔵装置としての役目も果たす。しかし、生体標本を保護する正にその表面が、ガラス化中の熱の除去を妨げ、冷凍速度及び加温速度を下げもする。この目的の対立のせいで、ガラス化に有効な閉鎖型冷凍容器の開発は難しい課題であることが判明している。
【００１０】
図１は、有効な閉鎖型冷凍容器の競合する設計制約５項目の間の関係１００を示している。これらの制約事項は、「安全なガラス化媒体」、「速い冷凍速度及び加温速度」、「無菌の細胞環境」、「標本の物理的保護」、及び「使い易さ」である。ガラス化には、速い冷凍速度及び加温速度が必要であり、速ければ速いほど良い。利用可能な冷凍速度により、細胞を毒することなく安全に使用することができるガラス化媒体中のＣＰＡレベルが決まる。矢印１０２は、これら２つの要因が相互に関係していることを示している。閉鎖型冷凍容器は、生体標本を無菌環境に維持しなければならない。生体標本は長期貯蔵の間中この様に保たれなくてはならない。冷凍容器は、通常の取り扱いと事故的な手荒な取り扱い（例えば落下）の両方で、その物理的完全性を維持できるほどに頑丈でなければならない。閉鎖型冷凍容器は、普通に訓練された技術者が過度のフラストレーション無しに生体標本を処理できるようになっていなくてはならないし、技法上の軽微な誤差を許容することができなければならない。
現在のガラス化用冷凍容器の限界
【００１１】
米国特許第７，３１６，８９６号「卵の凍結及び貯蔵用の用具と方法」（Ｅｇｇ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｏｏｌ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ）（‘８９６号装置）には、ガラス化用の閉鎖型冷凍容器が記載されている。この装置は、細いプラスチック管（公称外径（ＯＤ）が０．２５ｍｍで壁厚が０．０２ｍｍ）を備えている。典型的な生体標本は、０．１２５ｍｍのＯＤを有するヒト卵母細胞を含むことになろう。それが、ガラス化媒体を用いて脱水され、管に引き入れられる。次いで、管の両端が加熱シールされて無菌容器を作り出す。室温で毒性を有するガラス化媒体への曝露は制限されるべきであるため、装入時は時間が要である。生体標本のガラス化に何がしかの遅延があれば、ガラス化媒体中の温かいＣＰＡへの過剰曝露による細胞損傷に繋がるかもしれない。しかしながら、‘８９６号装置はサイズが極めて小さいため、その中へ生体標本を装入する行為は簡単ではない。‘８９６号装置の細さも、通常取り扱い時の頑丈さに関して疑問を呈する。更に、熱シールのうち一方は生体標本に非常に近接して作成されることから、熱が細胞を傷める懸念がある。
【００１２】
米国特許出願第２００８／０２２０５０７号「極低温ガラス化により保存させるべき規定体積の物質を充填するためのキット」（Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｂｙ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（‘５０７号装置）には、管内管閉鎖型冷凍容器の概念が記載されている。管は共にプラスチックから製作されている。内側の管は、生体標本が設置される一方の端にチャネルが作成されるように修正が加えられている。そうして、装入される内側の管が外側の管内に設置される。次に、外側の管の装入端が加熱シールされて、無菌の冷凍容器を作り出す。‘５０７号装置は、規模的には‘８９６号装置より大きい寸法を有し、従って、より使い易くはある。しなしながら、装入される内側の管が外側の管内に設置されるようにするためには、両者の間に多少のクリアランスがなくてはならない。従って、生体標本と外側の管の間に空気の隙間が存在する。空気は熱伝導率が低いので、生体標本をクリオゲンから効果的に断熱する。‘５０７号装置では、冷凍速度が相対的に遅くなるため、より高いＣＰＡレベルが必要となる。
【００１３】
国際特許出願ＷＯ０７／１２０８２９「哺乳類細胞の冷凍保存の方法」（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）（‘８２９号装置）には、ガラス化用の極細管の使用が記載されている。‘８２９号装置の１つの実施形態は、超微細な極細毛細管の石英管である。生体標本は、その様な装置の中に引き入れられてガラス化されることになる。格段に薄い壁断面（１０ミクロン）と、プラスチックとの比較における石英の熱伝導率の高さとにより、発明人らは‘８２９号装置が高い（３０，０００℃／分より大きい）冷凍速度を有することになるものと主張している。しかしながら、サイズが小さく壁が薄いということは、非常に脆弱な容器であることを示唆しており、どの様に無菌シールが作られるかに関しては何も示されていない。
【００１４】
１９８４年以来、ガラス化はヒト細胞を冷凍保存するのに使用されてきた。しかしながら、その緩慢凍結の同等物は、依然として、有力な冷凍保存方法である。適した冷凍容器の欠如が、ガラス化の実施を制限してきたのではないかと感じる。先行技術の冷凍容器は、図１の１つ又はそれ以上の設計制約事項を他の制約事項の利益のために無視するという妥協である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国非仮特許出願第１２／２６７７０８号
【特許文献２】米国仮特許出願第６０／９８７，１１０号
【特許文献３】米国特許第７，３１６，８９６号
【特許文献４】米国特許出願第２００８／０２２０５０７号
【特許文献５】国際特許出願ＷＯ０７／１２０８２９
【発明の概要】
【００１６】
本発明の概要を、本発明を理解するための手引きとして提供する。それは、必ずしも、本発明の最も一般的な実施形態を記述しているのでもなければ、ここに開示されている本発明のあらゆる種類を記述しているわけでもない。
改良されたガラス化用冷凍容器
【００１７】
本発明の目的は、改良された閉鎖型ガラス化冷凍容器を提供することである。本発明によって考案された装置は、図１の５つの属性全てを総体的に組み入れている。本発明は、小型化の進んだ脆弱な冷凍容器に解を求めるのではなく、むしろ新しい方向に進み、形状記憶材料の特徴を利用して新しい設計を作り出している。
【００１８】
本発明は、装入及び抜取りの容易さと急速冷凍の両方を実現する変形可能な壁を備えた閉鎖型ガラス化冷凍容器を備えている。この特徴は、形状記憶材料の固有の材料特性を利用している。形状記憶材料は、高温のオーステナイトと低温のマルテンサイトの２つの結晶構造で存在する。オーステナイト相は、堅さと超弾性の性質を特徴とする。マルテンサイト相は、柔らかくて可鍛性がある。物体のそのオーステナイト相における形状を「記憶形状」と呼ぶ。形状記憶材料が、そのオーステナイト相からマルテンサイト相に冷却され、そして変形した場合、それを加熱してそのオーステナイト相に戻せば、そのオーステナイト形状に戻るであろう。これらの２つの相の行き来が、好都合にも本発明に組み入れることができる設計オプションを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ガラス化冷凍容器に要求される設計属性を示す図である。
【図２】形状記憶材料（一方向形状記憶を呈する）の結晶状態と温度の関係を示す図である。
【図３】形状記憶材料（二方向形状記憶を呈する）の結晶状態と温度の関係を示す図である。
【図４】シャトル、シース、及び組み立てられた冷凍容器の特徴を示している。
【図４Ａ】シースの端部分の或る代わりの実施形態を示している。
【図５】本発明の形状転換の特徴を示している。
【図６】温度制御槽の特徴を示している。
【図７】体温ニチノールで構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図８】超弾性ニチノールで構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図９】二方向ニチノールで構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図１０】可鍛性金属で構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図１１】クリンプ付け用具の特徴を示している。
【図１２】冷凍容器の壁が形状記憶部材と非形状記憶部材の混成である或る代わりの実施形態を示している。
【図１３】変形可能な壁を有する冷凍容器を、形状記憶アクチュエータ閉鎖装置及び形状記憶アクチュエータ温度表示装置と組み合わせた或る実施形態を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下の詳細な説明では、本発明の様々な実施形態と特徴が開示されている。これらの実施形態と特徴は、例示であり制限を課すものではない。
【００２１】
「約」という用語がここで使用されている場合、それは、温度に関する場合を除き、また特に別途指示の無い限り、パラメータの所与の値の＋／−２０％内を意味する。温度については、「約」は所与の値の＋／−２℃を意味する。
【００２２】
本発明を使用すれば、様々な生体細胞を無菌で冷凍保存（ガラス化）することができる。細胞の１つの分類は、精子、卵母細胞、胚、桑実胚、胚盤胞、及び他の初期胚細胞の様な、哺乳類の発生細胞である。これらの細胞は、生殖補助処置ではごく普通に冷凍保存される。もう１つの分類に、再生医療で使用される幹細胞がある。最も広範な分類は、本発明の利用可能な冷凍速度と協調するガラス化媒体を使用してガラス化させることができるあらゆる細胞である。
形状記憶効果
【００２３】
形状記憶効果は、Ａｇ−Ｃｄ、Ａｕ−Ｃｄ、Ｃｕ−Ａｌ−Ｎｉ、Ｃｕ−Ｚｎ−Ａｌ、Ｃｕ−Ｚｎ−Ｓｉ、Ｃｕ−Ｚｎ−Ｓｎ、Ｃｕ−Ｓｎ、Ｃｕ−Ｚｎ、Ｆｅ−Ｐｔ、Ｆｅ−Ｍｎ−Ｓｉ、Ｉｎ−Ｔｉ、Ｍｎ−Ｃｕ、Ｍｎ−Ｓｉ、Ｎｉ−Ｔｉ、Ｎｉ−Ａｌ、その他の様な或る特定の金属の合金に存在する。このグループの中では、Ｎｉ−Ｔｉの合金が、商業的に最も普及している異体であり、ニチノールと呼ばれている。また、或る特定のポリマーにも形状記憶現象を呈するものがあり、形状記憶プラスチックと呼ばれている。本発明は、広範囲に様々な形状記憶合金又はプラスチックで実現することができる。使用される特定の合金又はプラスチックは、当業者が選択すればよい。本発明の理解を促すため、この説明の欄ではニチノールの形状記憶材料としての性質を使用して本発明の特徴を説明してゆく。
【００２４】
形状記憶効果は、物体が２つの異なる結晶状態で存在し得る現象である。第１の高温状態にある物体は、剛性を有し、固有の定形状を備えている。この物体は、冷却されると、容易に変形可能な状態へ変化する。当該物体は、材料を加熱することによって、その変形可能性を喪失させ、その固有の定形状に形態変化させて戻すことができる。材料科学は、これらの物理的状態の間の行き来は、材料の温度誘発性相変化によって引き起こされる現象であることを我々に教えてくれる。
【００２５】
図２は、「一方向」形状記憶材料の挙動を示している温度誘発性形状記憶相変化の図である。形状記憶材料は、オーステナイト（図像２００）とマルテンサイト（図像２１０）の２つの結晶構造で存在する。オーステナイト相は、堅さと超弾性の性質を特徴とする。マルテンサイト相は、柔らかく、可鍛性がある。オーステナイト物体の形状は「記憶形状」と呼ばれる。オーステナイト相の物体は、冷却によってマルテンサイトへ変態させることができる。柔らかいマルテンサイトのとき、物体は、変形させることができる。このマルテンサイト物体は、加熱によって変態させてオーステナイトへ戻すことができる。この相変換があると、物体の形状は、（多少の力を加えれば）「記憶形状」に戻るであろう。定オーステナイト形状から非定マルテンサイト形状への変態は、一方向形状記憶と呼ばれる。
【００２６】
機械的応力も、オーステナイト相からマルテンサイト相への変態を生じさせることができる。しかしながら、ひとたび応力が取り除かれると、材料はオーステナイトに復帰する。この属性は、超弾性と呼ばれており、大きな弾性変形を受け得る能力である。
【００２７】
ここで使用されている「変態」という用語は、記憶形状を備えた或る相への、又は記憶形状を備えた或る相からの、相変化をいう。マルテンサイトからオーステナイトへの変態２３０は、ＡＳ（オーステナイト開始）２３６からＡｆ（オーステナイト終了）２３８までの温度の範囲に亘って起こる。同様に、オーステナイトからマルテンサイトへの変態２４０は、ＭＳ（マルテンサイト開始）２４６からＭｆ（マルテンサイト終了）２４８までの温度の範囲に亘って起こる。オーステナイト変態とマルテンサイト変態は、異なる温度帯域で起こる。この現象は、変態ヒステリシス２５２と呼ばれている。変態ヒステリシスは、加熱されてオーステナイトに５０％変態している物体と冷却されてマルテンサイトに５０％変態復帰している物体の間の温度スプレッドである。全変態温度スパン２５４は、物体を１００％マルテンサイトと１００％オーステナイトの間で変態させるのに必要な温度範囲である。ニチノールでは、全変態温度スパンは大凡５０℃である。形状記憶材料の重要な特性は、或る物体が、その物体の加熱及び冷却の履歴に依って、変態温度帯域の間の或る温度で、そのオーステナイト相２６２かそのマルテンサイト相２６４の何れかになり得ることである。本発明を採用する方法は、室温で何れかの相にある形状記憶材料を利用する。所望の相は、１）温水槽（例えば、体温）内で温めてマルテンサイトをオーステナイトに変態させ、続いて室温まで冷却するか、又は２）ガラス化プロセスで容易に利用可能な極低温材料（例えば、ドライアイス、ＬＮ２、低温気体ヘリウム）を用いて冷凍してオーステナイトをマルテンサイトに変態させ、続いて室温まで温めるか、の何れかによって常に実現することができる。
【００２８】
ニチノールでは、変態温度２４６、２４８、２３６、及び２３８は、Ｎｉ対Ｔｉ原子比と、ニチノールの合金形成後の治金加工によって決まる。ニチノールのオーステナイト記憶形状は、材料がオーステナイト相にあるときに治金加工によって作られる。
【００２９】
図３は、二方向形状記憶を呈する形状記憶材料での温度誘発性形状記憶相変化の図である。殆どの形状記憶材料は一方向形状記憶を呈するが、それらを鍛えて二方向形状記憶を呈するようにすることができる。これらの材料は、オーステナイト（図像３００）とマルテンサイト（図像３１０）の２つの結晶構造で存在する。二方向形状記憶材料から製作された物体は、相に応じた２つの固有の形状を有することになる。オーステナイト物体は、「オーステナイト形状」を有していることをいう。マルテンサイト物体の形状は、「マルテンサイト形状」と呼ばれる。どちらの形状も、安定していて区別が付く。一方向形状記憶では「記憶形状」が１つであったのに対し、二方向形状記憶には２つの「記憶形状」がある。温度転換３２０及び３４０は、形状記憶材料を相の間で切り替え、結果として形状変化を生じさせる。変態ヒステリシス３５２と全変態温度スパン３５４は、一方向形状記憶材料の場合と同じ意味を有する。
本発明の基本的構成要素
【００３０】
図４は、代表的な冷凍容器の略管状要素の長手方向断面を示している。冷凍容器は、シャトル４００とシース４２０を備えている。シャトルは、チャネル４０６及び４７２を提供するべく端に切欠４０４（断面４７０も参照のこと）が切られた管４０２を備えている。チャネル表示４０８が、チャネル上のどこに生体標本４１０を置くべきかを定めている。チャネル表示は、溝又は印刷された線とすることもできる。シャトルの直径４１２は、生体標本の直径より大きくなくてはならない。典型的な生体標本は、体積が０．５マイクロリットルであり、直径約１ｍｍに相当する。従って、シャトルに適した直径は約２ｍｍである。シャトルには整列表示４１４を備えて、シャトルをシース内に設置するときに、シャトルを対応するシース側の整列表示４３８と整列させるのに役立ててもよい。表示４１４及び４３８は、印刷されたラインとすることができる。
【００３１】
シース４２０は、非形状記憶材料で作られている管状本体４２２と、形状記憶材料で作られている変形可能区間４２４と、端キャップ４２６を備えている。形状記憶材料は比較的高価であるので、複合構造はシステムのコストを削るのに役立つ。管状本体は、４２８で変形可能区間に取り付けられている。管状本体は、変形可能区間の外側に、両者の間にとまり嵌めが形成されるようにして配置されていてもよい。接合部は、接合部が無菌シールを形成して、極低温流体への浸漬に耐えられるようにするため、糊、溶接、又は他の接合手段によって強化することができる。端キャップは、４３０で変形可能区間に取り付けられている。以下で更に詳しく論じてゆくが、形状記憶材料は、適切な範囲の変態温度を有する如何なる材料とすることもできる。「体温ニチノール」が適している。
【００３２】
図４Ａは、シースの或る代わりの実施形態４Ａ００の該当する熱伝達ゾーンの長手方向上面図を示している。変形可能区間４Ａ０２は、端キャップ４Ａ０４と管状本体４Ａ０８の外部に同心に、それらとの間にとまり嵌めが形成されるようにして配置されている。接合部（４Ａ０６と４Ａ１０）は、糊、溶接、又は他の手段を使って補強することもできる。変形可能区間を管の外部にするか内部にするかの選定は、少なくとも部分的には、変形可能区間対管状本体及び端キャップの熱膨張の相対係数によって決まる。
【００３３】
本発明の基本的な構成要素は生体標本と接触するかもしれない。ヒト生殖細胞は、或る特定の材料に不都合な反応を示す。その様な反応を引き起こさない材料は、「非胎児毒性」と呼ばれる。よって、シャトル、シース、及び端キャップとして適切な材料には、極低温用役に適した非胎児毒性材料が含まれる。サーリン（Ｓｕｒｌｙｎ）８９２１の様なアイオノマー樹脂が適している。我々の試験により、ニチノールは非胎児毒性であり、従って同様に適していることが示されている。ニチノールは、極低温温度で使用することができる。
【００３４】
変形可能区間の長さ４３２、直径４３４、及び壁厚４３６は、変形可能区間が形状転換サイクルを果たすことができるように選定されている。形状転換サイクルは、２つの作用、即ち、１）変形可能区間の壁が、生体標本に触れるように変形する作用と、２）変形した壁が、オーステナイト変態を生じさせる加温によって、実質的にその変形前の形状に復元して生体標本から離れる作用、で構成されている。容易に変形可能であることは、手持ち用具を使用して壁にクリンプを付けることができることを意味する。２ｍｍのシャトル直径に適した変形可能区間の直径は２．１ｍｍ又はそれ以上である。適した壁厚は０．０２５から０．４ｍｍの範囲にある（０．０６５ｍｍが好適）。適した長さは、１０から２０ｍｍの範囲にある。
【００３５】
冷凍容器４５０の組み立ては、生体標本が入れられているシャトルの切欠端をシースの開口部４４０の中へ、シャトルの端が端キャップの内側表面４５６に接触するまで前進させることから開始される。このプロセス中は、シャトル側の整列表示４１４とシース側の整列表示４３８を整列させる。これを行うとき、変形可能区間側の生体標本位置表示４９２及び４９４（横断面４９０を参照）の向きを生体標本と合わせる。生体標本位置表示は、次に続く生体標本への又は同標本からの急速な熱伝達を目的として、変形可能区間上のクリンプを付けるのに適した位置を定めている。次いで、シースの開口端が熱融合される４５４。これにより無菌シール４５２が形成され、冷凍容器は今やクリンプ及びガラス化の準備が整った状態にある。十分に長い冷凍容器は、融合プロセスによって何がしかの熱が発生しても、生体標本に影響が及ぶのを防ぐ。４−６ｃｍの長さ４５８は十分である。
【００３６】
図５は、組み立てられた冷凍容器の該当する熱伝達ゾーンのクリンプが付けられる前５００とクリンプが付けられた後５２０の長手方向上面図を示している。アイテム５４０及び５６０は、これらのアイテムの横断面である。分かり易くするために、シャトルのチャネルは、アイテム５００及びアイテム５２０では省略されている。変形可能区間の壁は、マルテンサイト即ち可鍛性の相にあるニチノールである。
【００３７】
アイテム５００に示されている滴形状の生体標本５０２は、ガラス化媒体５０４と、冷凍保存させる１つ又はそれ以上の細胞５０６を備えている。横断面５４０を参照すると、生体標本５４８と冷凍容器５４４の壁の間には、生体標本がチャネル５４６に載せられた後、シースの壁に接触することなく、簡単に管状シース内に装入されるようにするのに十分なクリアランス５４２がある。
【００３８】
アイテム５２０及び対応している横断面５６０を参照すると、変形可能区間の壁はクリンプが付けられている。生体標本位置表示５５０及び５５２は、生体標本の上方に位置し、更にチャネルを避けた、変形可能区間上の点を指し示すことで、クリンプ付けを案内している。位置表示は、変形可能区間上に十字の形状に印刷されたマークであってもよい。それらは、レーザーマーキングによって作成されていてもよい。クリンプ付けは、ピンセットの使用の様な普通の手段によって実現することができる。生体標本５６２の一部分がシースと直接接触するような十分なクリンプ付けが施される。シースが過剰にクリンプを付けられ、場合によっては変形可能区間を損傷するのを防ぐため、幾つかの実施形態では変形可能区間に定量の変形を加えるべく、下で論じられている修正されたピンセット１１００（図１１）を使用してもよい。この直接接触は、生体標本と周囲環境の間の非常に高い熱伝達率を可能にするであろう。
【００３９】
変形可能区間の内部壁５６４は、変形可能区間が温められてその元の管状形状に戻されたときに、生体標本がそこから離れ、シャトルに付着したままになるように、疎水性であってもよい。必要であれば、変形可能区間の内壁は、ポリテトラフルオロエチレン（商標名テフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）で市販）又はポリキシレンポリマー（商標名パリレン（Ｐａｒｙｌｅｎｅ）で市販）の様な疎水性の非常に高い材料の層で被覆することによって、疎水性をより高めてもよい。
【００４０】
次いで、冷凍容器をＬＮ２（−１９６℃）の様な適したクリオゲンに曝露させることによってガラス化させる。冷却は極めて急速（例えば大凡１秒）であり、生体標本がガラス化する。
【００４１】
次に冷凍容器は、所望の期間、極低温貯蔵の状態に保たれることになる。生体標本を回復させることが必要になると、冷凍容器は、極低温貯蔵庫から温水槽（例えば、体温である３７℃）へ移される。水槽は、形状記憶シースを、その変形可能なマルテンサイト相からその堅いオーステナイト相へ変態させる、即ちオーステナイト変態に足るほどに温かい。これにより、シースは、抜取りに最適な形状である、その「記憶されている」円筒形状（アイテム５００及び対応する横断面５４０）に戻される。生体標本は滴形状に復帰し、クリアランスが復元されて、シャトルが容易に取り出せるようになる。冷凍容器が開かれ、生体標本を回復させるためシャトルが取り出される。
【００４２】
本発明の形状転換の特徴に加え、ニチノールの熱伝達面としての使用から追加の益がもたらされる。ニチノールは、冷凍容器を製作するのに使用される典型的なプラスチックより強い。更に、その熱伝導率はプラスチックより遥かに高い。これらの属性が一体に効果を発揮して、プラスチックより巧く熱を伝導する頑丈な変形可能区間を生み出す。
本発明を利用する方法
【００４３】
本発明は、様々な方法で適用することができる。例外と特記されない限り、以下に説明されている例は、一方向ニチノールを利用している。
【００４４】
ガラス化媒体を用いた生体標本の脱水は、通常は、室温、公称的に２０℃で行われる。これは装入温度でもある。急速冷凍は、通常は、ＬＮ２を用いて−１９６℃で実現される。加温は、通常は、３７℃で行われる。貯蔵時と使用時の２００℃を上回る温度差は、典型的に約５０℃であるニチノールの全変態温度スパンを大きく超えている。これは、オーステナイト終了温度が凡そ約３７℃のニチノールは如何なる等級のものであっても、ＬＮ２によって、常にマルテンサイトへと変態することができることを意味する。これは、大気圧下沸点が−４２℃の液体プロパンがクリオゲンとして使用された場合でも当てはまる。
【００４５】
冷凍容器を製作するのに使用されるニチノールは、室温では変形可能であるとともに、３７℃までに実質的にその記憶形状に復元している必要がある。これらの要件を実現させる１つの方法は、そのオーステナイト開始温度が室温より僅かに高く且つそのオーステナイト終了温度が体温である３７℃ぐらいのニチノールを製造することである。例えば、オーステナイト開始温度は、２０℃から２５℃の範囲内とすることができる。オーステナイト終了温度は、３７℃から４０℃の範囲内とすることができる。オーステナイト開始温度とオーステナイト終了温度のこの組み合わせを実現させる方法は、「体温」ニチノール（例えば、ＡＳが１５℃から１８℃の間でＡｆが３０から３５℃の間）を製造するためのプロセスを、ニッケル対チタンの比、合金の熱加工、又は銅の様な第３の合金化元素を追加する量のうち１つ又はそれ以上を調節することによって修正することを含んでいる。
【００４６】
意外にも、オーステナイト開始温度が室温より２乃至４℃下のニチノール合金も適している。当該合金は、そのオーステナイト開始温度を２−４℃上回っても、手でクリンプを付けることができるだけの可鍛性を依然として保持している。同様に、オーステナイト終了温度が体温より２−４℃上の合金も適している。ニチノールは、体温まで温められると、オーステナイト終了温度に完全に達しているわけではなくても、実質的に抜取りのためのその記憶形状を取り戻すであろう。
【００４７】
オーステナイト開始温度が室温より２−４℃下から更に下のニチノールは、適度に冷やされた状態、望ましくは同様に冷やされた手持ち用具を用いてクリンプを付けられた状態に保たれるなら、使用することができる。従って、標準的な体温ニチノールは、使用することができる。体温ニチノールは、約１５℃のオーステナイト開始温度と、約３３℃のオーステナイト終了温度を有する。体温ニチノールは、室温（例えば２０℃）では、手持ち用具を使ってクリンプを付けるには十分な可鍛性を有していないかもしれない。しかしながら、体温ニチノールは、装入中は可鍛性を維持するように、人為的に室温より下に保持することができる。適した保持温度は、０−１０℃の範囲にある。体温ニチノールから製作された冷凍容器は、最初に、そのマルテンサイト終了温度より下まで冷却されなくてはならない。これは、冷凍容器を従来型のフリーザー内に入れるか、又はそれをＬＮ２の中へ押し込むことにより、行うことができる。体温ニチノールがその可鍛性を維持するには、冷凍容器は、装入されてクリンプを付けられるときまで約１５℃のそのオーステナイト開始温度より下に保たれなくてはならない。これは、室内を冷たく保つ、シースを冷蔵庫に入れておく、シースを温度制御された槽に入れておく、又はそれらの組合せの様な、数々の手段によって行うことができる。
【００４８】
温度制御された槽の或る代表的な設計が、図６に示されている。槽６００は、平坦な底部６０４と上部の溜め６０６を有する略球形の容器６０２を備えている。槽は、２つの部品を継目６０８で接合して作られていてもよい。ポリカーボネートの様な透明なプラスチックは、適した構造材料である。槽の内部には、オーステナイト開始温度より下の温度で溶ける材料が充填されている。融点が１０℃のパラフィン６１０が適している。
【００４９】
実施時、先ず、槽を冷蔵庫内で冷やしてパラフィンを凍らす。槽は、使用前に取り出され、溜めに水６１２が入れられる。水がパラフィンを温めると、パラフィンが溶け始める。すると、水とパラフィンは共に、パラフィンの融点で熱平衡になる。そこで、自身のマルテンサイト終了温度より下まで冷やされたシース６１４を溜めに浸漬させることができ、シースは槽の温度に維持されることになる。ピンセットの様な用具を用いてクリンプ付けが行われる場合、用具は、用具自体が変形可能区間に接触して同区間をオーステナイト開始温度より上に上昇させないように、同様に水槽温度で平衡化させることができる。
【００５０】
図７に示されている様に、生体標本をガラス化するときになると、シースは溜めから取り出され、シャトルは生体標本と一体にシースの中へ入れられる。該当するガラス化熱伝達ゾーンは、横断面７００として示されている。生体標本は視界から隠されており、よって変形可能区間上の生体標本位置表示７０２及び７０４が、クリンプを形成する最適位置を指し示す。クリンピング点７２０及び７２２を有する、修正が加えられたピンセットの様な手持ち式用具が、冷凍容器にクリンプを付けて横断面７２４を形成する。横断面７２４はクリンプを付けられた直後の冷凍容器を示している。可鍛性の体温ニチノールは、外部から力を加えなくてもそのクリンプを付けられた形状を維持する。クリンプ付けは、速いプロセスなので、体温ニチノールはその可鍛性を損なう温度まで温まらない。次いで、冷凍容器の入口が、熱シールの様な従来の手段によって密封される。
【００５１】
その後、冷凍容器は、例えば、−１９６℃の液体窒素７４２が入っている極低温槽７４０に入れられる。冷却は極めて急速（例えば約１秒）であり、生体標本７４４がガラス化する。
【００５２】
その後、冷凍容器は、所望の期間、極低温貯蔵状態に保たれてもよい。
【００５３】
ガラス化した生体標本を回復させることが必要になると、冷凍容器は、液体窒素槽から、体温である３７℃の水７６２が入っている温水槽７６０へ移される。水槽は、形状記憶シースを、その変形可能なマルテンサイト相からその堅いオーステナイト相へ変態させるに足るほどに温かい。これにより、シースは、その「記憶されている」円筒形状７６４に戻される。こうして、生体標本７６６は安全に温められ、シャトルを簡単に取り出すためのクリアランスが再び提供される。
【００５４】
図８に示されている様に、オーステナイト終了温度が約１０℃の様な低い温度のニチノール合金は、オーステナイト相にあるときは、ニチノールの超弾性的性質を生かすことによって使用することができる。横断面８００は、室温ではオーステナイトであるニチノールから製作された冷凍容器を示している。シャトルが生体標本と一体に、上で説明されている様にシースと組み立てられる。次いで、無菌シールが形成される。生体標本位置表示８０２及び８０４は、冷凍容器の最適なクリンピング点を指し示している。オーステナイトのニチノールは、マルテンサイトに比べ、変形を実現するのにより高い力を必要とする。従って、オーステナイトを変形させるには、ピンセットではなく、一対の修正を加えられたピラーが必要である。そこで、その様な一対のピラーの接触点８２２及び８２４で冷凍容器にクリンプを付けて横断面８２０を形成する。冷凍容器がクリンプを付けられた状態を保てるように、ピラーはそのクリンプ付けの力を維持し続けなければならない。
【００５５】
クリンプを付けられた冷凍容器８４２を保持する締め付けられたピラー対は、次いで、ＬＮ２ ８４４が入っている極低温槽８４０に入れられる。冷却がＬＮ２からピラーの接触点を介して伝わり、ガラス化を実現する。同時に、変形可能区間はマルテンサイトに変態する。ここでピラーを取り出すことができる。冷凍容器８４６は、そのクリンプを付けられた形状、即ち、熱伝達に最適な形状を維持し、それが加温中に遊隙になってゆく。冷凍容器は今や長期極低温貯蔵の準備が整った状態である。
【００５６】
ガラス化された生体標本を回復させるには、冷凍容器を液体窒素槽から温水槽８６０（例えば体温である３７℃）に移す。水８６２は、形状記憶シースを、その変形可能なマルテンサイト相から、その堅いオーステナイト相に変態させるに足るほど温かい。これにより、シースは、その「記憶されている」円筒形状８６４に戻される。こうして、生体標本８６６は安全に温められ、シャトルを簡単に取り出すためのクリアランスが再び提供される。
二方向形状記憶合金
【００５７】
図９に示されている様に、本発明は、二方向ニチノールから製作された冷凍容器を用いて実装することもできる。一例として、−１０℃のマルテンサイト終了温度と、３７℃のオーステナイト終了温度を有する材料がある。この材料で作られたシースは、円筒形状のオーステナイト形状と、クリンプを付けられたマルテンサイト形状を有することができる。先に説明した様に、シャトルが生体標本と一体に、シースと組み立てられる。無菌シールが形成される。横断面９００は、二方向ニチノールから製作されていて、ガラス化の準備が整っている冷凍容器を示している。クリンプ付け用具は一切必要なく、よって生体標本の位置表示は必要ない。
【００５８】
ガラス化させるため、冷凍容器は、ＬＮ２ ９２２が入っている極低温槽９２０に入れられる。冷却は、マルテンサイト変態を誘発し、変形可能区間をそのオーステナイト形状９２４からそのマルテンサイト形状９２６へ形状転換させる。この形状は、熱伝達に最適であり、加温中に遊隙になってゆく。急速冷却は、相変化と同時に、生体標本をガラス化する。そうすると、冷凍容器を長期極低温貯蔵庫に入れることができる。
【００５９】
ガラス化された生体標本の回復は、他の実施形態と同じ工程に従う。冷凍容器は、液体窒素槽から温水槽９４０（例えば体温である３７℃）に移される。水９４２は、変形可能区間をその記憶されているオーステナイト形状９４４（円筒）に形状転換させるオーステナイト変態を誘発するに足るほど温かい。こうして、生体標本９４６は安全に温められ、シャトルを簡単に取り出すためのクリアランスが再び提供される。
可鍛性金属
【００６０】
図１０に示されている様に、金、銀、銅、錫、及びアルミニウムの様な可鍛性金属は、ピンセットの様な手持ち用具を用いて容易に変形させることができる。それらは、速い熱伝達に資する高い熱伝導率を有している。シースは、可鍛性金属の変形可能区間を備えて製作することができる。シャトルが生体標本と一体に、このシースと組み立てられる。無菌シールが形成される。横断面１０００は、変形可能区間が可鍛性金属から製作されている冷凍容器を示している。生体標本位置表示１００２及び１００４は、熱伝達に最適な形状を実現するのに最適なクリンプ付け位置を指し示している。クリンピング点１０２２及び１０２４を有する、修正が加えられたピンセットの様な手持ち用具が、冷凍容器にクリンプを付けて横断面１０２０を形成する。可鍛性金属は、外部から力を加えなくても、そのクリンプを付けられた形状を維持する。次いで、クリンプを付けられた冷凍容器は、ＬＮ２ １０４２の入った極低温槽１０４０に入れられる。冷却は極めて急速（例えば約１秒）であり、生体標本１０４４はガラス化する。冷凍容器は今や長期極低温貯蔵の準備が整った状態である。
【００６１】
ガラス化した生体標本を回復させるには、冷凍容器１０６４を、ＬＮ２から温水槽１０６０（例えば体温である３７℃）に移す。水１０６２は、生体標本１０６６を安全に温める。
【００６２】
可鍛性金属の変形可能区間は、温度変化ではその円筒形状に復帰しない。形状を復元する１つのやり方は、シースの入口４４０（図４）で気圧供給源を適用することである。圧力がシースの内部空洞に印加され、クリンプを付けられた可鍛性金属の管をその元の円筒形状に機械的に復元する。約６．９Ｐａ−３４４ｋＰａ（１−５０ｐｓｉｇ）の圧力が適しており、約６．９−１０３ｋＰａ（１−１５ｐｓｉｇ）の圧力が好適である。ヒト細胞は、高い（数百バール）圧力への短時間曝露に耐えることが示されている。従って、クリンプを付けられたシースを内からの空気圧を用いて外へ向けて変形できるようにするためのシースの設計パラメータは、普通は、生体標本によって制限されることはない。クリアランスが復元され、生体標本の回復のためにシャトルを簡単に取り出せるようになる。
【００６３】
或る代わりの回復方法は、温められた冷凍容器１０８０からシャトルを取り出し、生体標本を残留させることである。次に、細針シリンジをシースの入口に挿して内部空洞に洗浄液を灌注することができる。生体標本は、シャトル上に無ければ、排流された洗浄液中に見つけることができる。
クリンプ付け用の器材
【００６４】
図１１は、変形可能区間にクリンプを付けるのに使用することができる、修正が加えられたピンセット１１００と修正が加えられたピラー１１２０を示している。ピンセット（ピラー）は、確実に、クリンプが所定の深さになるようにするため、ストッパ１１０２（１１２２）を備えている。それらは、ユーザーが、クリンプを付けるときに、それら用具を変形可能区間側の生体標本位置表示と正しく整列させるのを支援するクリンピング表示１１０４（１１２４）も備えている。ジョー１１０６（１１２６）は、クリンプを付けるときに、変形可能な区間に所定の形状を与えるように修正されてもよい。機械的利点がより高いピラーは、ピンセットより多くのクリンピング力を掛けることができるであろう。この追加の力は、超弾性のニチノール合金にクリンプを付ける際に有用である。
代わりのシース構成と複合材料
【００６５】
図１２は、２つの互いに反対側のニチノール部分１２０２と２つの非ニチノール部分１２０４を備えて製作された複合壁を有する冷凍容器１２００の横断面を示している。ニチノールの量の削減は、材料費を低く抑えるのに役立つ。非ニチノール面は、極低温温度に適している非胎児毒性材料から製作されている。冷凍容器の４つの面は、１２０６で表されている４つの場所で接合されている。冷凍容器内で、生体標本１２０８は、チャネル１２１０に載せられている。複合壁型冷凍容器は、装入及び抜取りに適した記憶形状を有している。ここで説明されている他の実施形態と同様に、この複合冷凍容器のニチノールは、可鍛性のマルテンサイトかオーステナイトの何れかとすることができる。従って、クリンプ付け用具を使用することによって、それにクリンプを付けて横断面１２２０を形成することができる。この形状は、熱伝達が改善されるように生体標本に接触１２２２する。３７℃まで温めると、この冷凍容器は、その円筒形の記憶形状に復帰する。記憶形状は、生体標本を簡単に回復できるようにするクリアランスを復元する。
一般的考察
【００６６】
ニチノールから製作されている形状記憶装置は、８％回復可能歪みに相応する。銅を基材とする形状記憶材料は、１２％回復可能歪みに相応する。本発明は、少なくとも１％の回復可能歪みか非回復可能歪みの何れかに、破裂することなく耐えることができる材料を使用すれば効を奏する。回復可能歪みがより高いと、その結果、より深いクリンピングがもたらされ、それらの記憶形状への復帰を可能にしながらも熱伝達を向上させることができる。本発明は、利用可能な回復可能歪みをより効率良く利用することのできる非円形形状に適用し、更に速い冷凍速度を実現することができる。
形状記憶ポリマー
【００６７】
形状記憶ポリマーは、形状記憶現象を呈するポリマーである。しかしながら、ポリマーの当該現象は、２つの変態温度帯域を有する形状記憶合金での様な２つの結晶状態から生じるのではない。形状記憶ポリマーについて理解するには、ガラス転移温度Ｔｇと呼ばれる１つの特性温度しか必要でない。記憶形状は、製作中に、Ｔｇより上の温度で確立される。その後、ポリマー部分は、異なる形状に変形させて、Ｔｇより下に冷却することができる。当該部分は、Ｔｇより下に保たれている限り、その変形形状を維持することになる。当該部分は、Ｔｇより上に加熱されると、その記憶形状に復帰する。こうして、冷凍容器は、形状記憶ポリマーの変形可能区間を備えて製作することができ、図８に教示されている方法を使用することにより、形状転換ガラス化冷凍容器として機能することになる。幾つかの実施形態では、適した形状記憶ポリマーは、プラスチックであってもよい。ベリフレックス（Ｖｅｒｉｆｌｅｘ）（登録商標）は、適した形状記憶ポリマーである。
【００６８】
１５℃のＴｇを有する形状記憶ポリマーから製作されている冷凍容器は、室温でクリンプを付けられ、保持され、ガラス化させることができる。それは、極低温温度では、そのクリンプが付けられた形状を維持するであろう。冷凍容器は、Ｔｇより上に加熱されると、そのクリンプを付けられていない形状に戻ることができ、生体標本を取り出すことができる。
変形可能区間、形状記憶アクチュエータ閉鎖装置、及び形状記憶アクチュエータ温度表示器を備えた冷凍容器
【００６９】
図１３は、変形可能区間１３１０、形状記憶アクチュエータ閉鎖装置１３２０、及び形状記憶アクチュエータ温度表示器１３３０を備えた冷凍容器１３００を示している。
【００７０】
形状記憶アクチュエータ閉鎖装置は、形状記憶アクチュエータ１３２２と端キャップ１３２４を備えている。形状記憶アクチュエータは、形状記憶ばね１３２３と、従来の材料の付勢ばね１３２５を備えている。形状記憶ばねは、室温では、相対的に展開した記憶形状を有していて、付勢ばねより強い。端キャップは、従って、室温では冷凍容器の端部から押し離され、取り外すことができ、シャトル及び生体標本の装入及び抜取りが可能になる。しかしながら、冷やしたトングを用いて把持するなどによってアクチュエータが冷やされると、形状記憶ばねはマルテンサイトに変態し、付勢ばねより弱くなり、付勢ばねが端キャップを冷凍容器の端部にぴったり当てて引っ張る。こうして、持続的な閉鎖力が冷凍容器に印加されて、ガラス化及び貯蔵中、同容器を密封するのを助ける。
【００７１】
温度表示装置は、形状記憶アクチュエータ１３２２、警戒ロッド１３３４、及び外側チャンバ１３３６を備えている。形状記憶アクチュエータは、普通は、極低温温度では潰れ、−１３０Ｃの失透温度の様なより高い温度で展開する。よって、冷凍容器が、検査又は他の理由で極低温貯蔵庫から取り出されると、ユーザーは、アクチュエータが温まって、温度警戒ロッドがチャンバから外に出る動きによって、失透の可能性がある旨の警告を受けることになる。
結論
【００７２】
本開示は、１つ又はそれ以上の異なる代表的な実施形態に関連付けて説明してきたが、当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、また本開示の要素に等価物を置き換えることができることが理解頂けるであろう。更に、本開示の本質的な範囲又は教示から逸脱することなく、特定の状況に適合させるべく多くの修正を加えることができる。従って、本開示は、本発明を実施するための考えられている最良の形態として開示されている特定の実施形態に限定されるものではない。
【符号の説明】
【００７３】
１００ 閉鎖型冷凍容器の設計制約の関係
２００、３００ オーステナイト結晶構造
２１０、３１０ マルテンサイト結晶構造
２３０、３２０ マルテンサイトからオーステナイトへの変態
２３６ オーステナイト開始
２３８ オーステナイト終了
２４０、３４０ オーステナイトからマルテンサイトへの変態
２４６ マルテンサイト開始
２４８ マルテンサイト終了
２５２、３５２ 変態ヒステリシス
２５４、３５４ 全変態温度スパン
２６２ オーステナイト相
２６４ マルテンサイト相
４００ シャトル
４０２ 管
４０４ 切欠
４０６、４７２ チャネル
４０８ チャネル表示
４１０ 生体標本
４１２ シャトルの直径
４１４ 整列表示
４２０ シース
４２２ 管状本体
４２４ 変形可能区間
４２６ 端キャップ
４３２ 変形可能区間の長さ
４３４ 変形可能区間の直径
４３６ 変形可能区間の壁厚
４３８ シース側の整列表示
４４０ シースの開口部、シース入口
４５０ 冷凍容器
４５２ 無菌シール
４５４ 開口端部の熱融合
４５６ 端キャップの内側表面
４５８ 冷凍容器の長さ
４７０ 断面
４９２、４９４ 生体標本位置表示
４Ａ００ シース
４Ａ０２ 変形可能区間
４Ａ０４ 端キャップ
４Ａ０８ 管状本体
４Ａ０６、４Ａ１０ 接合部
５００ クリンプを付けられる前の冷凍容器
５０２ 生体標本
５０４ ガラス化媒体
５０６ 細胞
５２０ クリンプを付けられた後の冷凍容器
５４２ クリアランス
５４４ 冷凍容器
５４６ チャネル
５４８ 生体標本
５５０、５５２ 生体標本の位置表示
５６２ 生体標本
５６４ 変形可能区間の内部壁
６００ 槽
６０２ 球形の容器
６０４ 底部
６０６ 溜め
６０８ 継目
６１０ パラフィン
６１２ 水
６１４ シース
７０２、７０４ 生体標本位置表示
７４０ 極低温槽
７４２ 液体窒素
７４４ 生体標本
７６０ 水槽
７６２ 水
７６４ 記憶されている円筒形状
７６６ 生体標本
８０２、８０４ 生体標本位置表示
８２２、８２４ ピラーの接触点
８４０ 極低温槽
８４２ 冷凍容器
８４４ 液体窒素
８４６ 冷凍容器
８６２ 水
８６６ 生体標本
９２２ 液体窒素
９２０ 極低温槽
９２４ オーステナイト形状
９２６ マルテンサイト形状
９４０ 温水槽
９４２ 水
９４４ 記憶されているオーステナイト形状
９６６ 生体標本
１００２、１００４ 生体標本位置表示
１０２２、１０２４ クリンピング点
１０４０ 極低温槽
１０４２ 液体窒素
１０４４ 生体標本
１０６０ 温水槽
１０６２ 水
１０６４ 冷凍容器
１０６６ 生体標本
１０８０ 冷凍容器
１１００ ピンセット
１１２０ ピラー
１１０２、１１２２ ストッパ
１１０４、１１２４ クリンピング表示
１１０６、１１２６ ジョー
１２００ 冷凍容器
１２０２ ニチノール部分
１２０４ 非ニチノール部分
１２０６ 接合場所
１２０８ 生体標本
１２１０ チャネル
１３００ 冷凍容器
１３１０ 変形可能区間
１３２０ 形状記憶アクチュエータ閉鎖装置
１３２２ 形状記憶アクチュエータ
１３２３ 形状記憶ばね
１３２４ 端キャップ
１３２５ 付勢ばね
１３３０ 形状記憶アクチュエータ温度表示器
１３３４ 警戒ロッド
１３３６ 外側チャンバ
Ａｓ オーステナイト開始温度
Ａｆ オーステナイト終了温度
Ｍｓ マルテンサイト開始温度
Ｍｆ マルテンサイト終了温度
Ｔｇ 転移温度
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年１１月１０日出願の米国非仮特許出願第１２／２６７７０８号「形状転換ガラス化装置」（Ｓｈａｐｅ Ｓｈｉｆｔｉｎｇ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ）の継続出願である。前記非仮特許出願を参考文献として援用する。
【０００２】
前記米国非仮特許出願第１２／２６７７０８号、それ自体は、「形状記憶ガラス化冷凍容器」（Ｓｈａｐｅ Ｍｅｍｏｒｙ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｙｏｃｏｎｔａｉｎｅｒ）の名称で２００７年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９８７，１１０号に対する優先権を主張している。前記仮特許出願を参考文献としてここに援用する。
【０００３】
本発明は、生体標本の冷凍保存のための装置の分野に属する。
【背景技術】
【０００４】
生命科学では、貴重な（単数又は複数の）細胞の生物活性を長期に亘り休止させることを目的に、冷凍保存技術が実践されている。冷凍保存の成功の１つの要因は、氷の結晶が形成されるという有害効果を低減又は排除することである。冷凍保存時に水が氷へと凍ってゆく自然傾向を阻止するには、高度な方法が必要である。
冷凍保存
【０００５】
氷結晶形成を最小限にする１つの方法は、「緩慢凍結」と呼ばれている。緩慢凍結の最初の工程は、浸透性及び非浸透性の凍害保護物質（「ＣＰＡ」）を含む水溶液（「緩慢凍結媒体」）を用いて、単一細胞又は複数細胞を脱水することである。単一細胞又は複数細胞は、少量の緩慢凍結媒体と共に「生体標本」を構成する。次いで、生体標本は、適した冷凍容器、即ち、極低温温度で使用するのに適した容器に入れられる。ここで使用されている「極低温温度」とは、−８０℃より冷たい温度を意味している。緩慢凍結冷凍保存には、生体標本を、室温からその最終的な極低温貯蔵温度まで、即ち、典型的には液体窒素（「ＬＮ２」）の大気圧下沸点である−１９６℃まで冷凍することが伴う。この温度範囲の一部、即ち、大凡−６℃から下へ−３０℃までについては、冷凍速度はプログラム可能なフリーザーによって厳密に０．１−０．３℃／分に制御される。−３０℃から−１９６℃までの冷凍は、冷凍容器をＬＮ２に押し込むことによって実現される。緩慢凍結プロセスは完了するまでに２−３時間掛かり、よってその名が付いている。このプロセスにより、氷の結晶は、実際に、単一細胞又は複数細胞を取り囲んでいるＣＰＡの中に形成され、単一細胞又は複数細胞内では最小限になる。緩慢凍結は、胚及び精子の様な含水量の少ない細胞には有効であるが、卵母細胞及び胚盤胞の様な含水量の多い細胞でも巧くいくとは限らない。この欠陥、高い機器費用、及び高時間消費が、ガラス化と呼ばれる、代わりの冷凍保存方法の開発をもたらした。
ガラス化
【０００６】
ガラス化は、細胞に損傷を負わせる氷の形成を完全に回避しようとしている点で、緩慢凍結とは異なる。緩慢凍結と同様、ガラス化の最初の工程は、「ガラス化媒体」と呼ばれるＣＰＡ含有流体を使用して、単一細胞又は複数細胞をできる限り多分に脱水することである。次いで、生体標本（緩慢凍結の場合と同じ定義）は、ＬＮ２の様な極低温流体への浸漬によって急速に冷凍される。冷凍速度とＣＰＡ濃度を適切に組み合わせることで、細胞内水分は、規則的で損傷を負わせる結晶質の氷の状態というより、むしろ固体で無害のガラス様（ガラス質）の状態を獲得することになる。ガラス化は、水分子をランダムな配列で閉じ込める流体粘度の急激な上昇、と書き表すことができる。しかしながら、ガラス化媒体は、緩慢凍結媒体より高いレベルのＣＰＡを含んでおり、ガラス質状態以外では細胞にとって毒性がある。従って、脱水及び解凍（氷が形成されないので「加温」と呼ばれる）時の細胞のガラス化媒体への曝露時間は、細胞損傷を回避するべく慎重に制御されなくてはならない。ガラス化と緩慢凍結の終点は同じ、つまり、ＬＮ２の様なクリオゲン内での長期貯蔵である。
【０００７】
１０６℃／分の冷凍速度が可能であったなら、ガラス化は、凍害保護物質を一切用いずに実現することもできよう。６０％ｗ／ｗのＣＰＡ濃度を有する極めて有毒なガラス化媒体は、普通の冷凍速度でガラス化させることができる。市販のガラス化媒体は、上記境界の間のＣＰＡ処方と最小冷凍可能速度を有している。ＣＰＡ濃度と最小冷凍可能速度の間の反比例関係は良く知られている。ガラス化媒体の毒性効果を最小限にするためのキーは、そのＣＰＡ濃度を最小化することである。従って、素早く冷凍することが望ましく、速ければ速いほど良い。上記に鑑みて、この分野で起こるべくして起こった初期の発見は、生体標本を直接ＬＮ２に押し込んで急速冷凍を実現することであった。このプロセスを円滑化し、制御するため、直接の押し込みを可能にする担持装置が作り出された。例を挙げると、電子顕微鏡グリッド、オープンプルストロー（ｏｐｅｎ ｐｕｌｌｅｄ ｓｔｒａｗ）、クリオループ（Ｃｒｙｏｌｏｏｐ）（商標）、ナイロンメッシュ、及びクリオトップ（Ｃｒｙｏｔｏｐ）である。クリオループは、ハンプトンリサーチ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社の商標である。これらの装置は、生体標本が冷凍用クリオゲン、典型的にはＬＮ２、と直接接触するという点で「開放型担持具」に分類される。開放型担持具は、生体標本の急速加温も可能にした。
【０００８】
しかしながら、ＬＮ２は無菌ではない。ＬＮ２は、細菌種及び真菌種を含んでいるかもしれず、それらは温められると生存能力を持つ。更に、ＬＮ２内に長期貯蔵状態に保たれているガラス化された細胞は、前記ＬＮ２に人工的に入れられたウイルス性病原体に感染し得ることが報告されている。従って、開放型担持具にはガラス化された生体標本の感染の可能性がある。
【０００９】
感染の可能性が、生体標本が冷凍容器内に入れられてＬＮ２内での冷凍前に密封される閉鎖型冷凍容器の開発をもたらした。冷凍容器は、長期貯蔵中に生体標本を、病原体を含んでいるクリオゲンから隔離する貯蔵装置としての役目も果たす。しかし、生体標本を保護する正にその表面が、ガラス化中の熱の除去を妨げ、冷凍速度及び加温速度を下げもする。この目的の対立のせいで、ガラス化に有効な閉鎖型冷凍容器の開発は難しい課題であることが判明している。
【００１０】
図１は、有効な閉鎖型冷凍容器の競合する設計制約５項目の間の関係１００を示している。これらの制約事項は、「安全なガラス化媒体」、「速い冷凍速度及び加温速度」、「無菌の細胞環境」、「標本の物理的保護」、及び「使い易さ」である。ガラス化には、速い冷凍速度及び加温速度が必要であり、速ければ速いほど良い。利用可能な冷凍速度により、細胞を毒することなく安全に使用することができるガラス化媒体中のＣＰＡレベルが決まる。矢印１０２は、これら２つの要因が相互に関係していることを示している。閉鎖型冷凍容器は、生体標本を無菌環境に維持しなければならない。生体標本は長期貯蔵の間中この様に保たれなくてはならない。冷凍容器は、通常の取り扱いと事故的な手荒な取り扱い（例えば落下）の両方で、その物理的完全性を維持できるほどに頑丈でなければならない。閉鎖型冷凍容器は、普通に訓練された技術者が過度のフラストレーション無しに生体標本を処理できるようになっていなくてはならないし、技法上の軽微な誤差を許容することができなければならない。
現在のガラス化用冷凍容器の限界
【００１１】
米国特許第７，３１６，８９６号「卵の凍結及び貯蔵用の用具と方法」（Ｅｇｇ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｏｏｌ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ）（‘８９６号装置）には、ガラス化用の閉鎖型冷凍容器が記載されている。この装置は、細いプラスチック管（公称外径（ＯＤ）が０．２５ｍｍで壁厚が０．０２ｍｍ）を備えている。典型的な生体標本は、０．１２５ｍｍのＯＤを有するヒト卵母細胞を含むことになろう。それが、ガラス化媒体を用いて脱水され、管に引き入れられる。次いで、管の両端が加熱シールされて無菌容器を作り出す。室温で毒性を有するガラス化媒体への曝露は制限されるべきであるため、装入時は時間が要である。生体標本のガラス化に何がしかの遅延があれば、ガラス化媒体中の温かいＣＰＡへの過剰曝露による細胞損傷に繋がるかもしれない。しかしながら、‘８９６号装置はサイズが極めて小さいため、その中へ生体標本を装入する行為は簡単ではない。‘８９６号装置の細さも、通常取り扱い時の頑丈さに関して疑問を呈する。更に、熱シールのうち一方は生体標本に非常に近接して作成されることから、熱が細胞を傷める懸念がある。
【００１２】
米国特許出願第２００８／０２２０５０７号「極低温ガラス化により保存させるべき規定体積の物質を充填するためのキット」（Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂｅ Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｂｙ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（‘５０７号装置）には、管内管閉鎖型冷凍容器の概念が記載されている。管は共にプラスチックから製作されている。内側の管は、生体標本が設置される一方の端にチャネルが作成されるように修正が加えられている。そうして、装入される内側の管が外側の管内に設置される。次に、外側の管の装入端が加熱シールされて、無菌の冷凍容器を作り出す。‘５０７号装置は、規模的には‘８９６号装置より大きい寸法を有し、従って、より使い易くはある。しなしながら、装入される内側の管が外側の管内に設置されるようにするためには、両者の間に多少のクリアランスがなくてはならない。従って、生体標本と外側の管の間に空気の隙間が存在する。空気は熱伝導率が低いので、生体標本をクリオゲンから効果的に断熱する。‘５０７号装置では、冷凍速度が相対的に遅くなるため、より高いＣＰＡレベルが必要となる。
【００１３】
国際特許出願ＷＯ０７／１２０８２９「哺乳類細胞の冷凍保存の方法」（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）（‘８２９号装置）には、ガラス化用の極細管の使用が記載されている。‘８２９号装置の１つの実施形態は、超微細な極細毛細管の石英管である。生体標本は、その様な装置の中に引き入れられてガラス化されることになる。格段に薄い壁断面（１０ミクロン）と、プラスチックとの比較における石英の熱伝導率の高さとにより、発明人らは‘８２９号装置が高い（３０，０００℃／分より大きい）冷凍速度を有することになるものと主張している。しかしながら、サイズが小さく壁が薄いということは、非常に脆弱な容器であることを示唆しており、どの様に無菌シールが作られるかに関しては何も示されていない。
【００１４】
１９８４年以来、ガラス化はヒト細胞を冷凍保存するのに使用されてきた。しかしながら、その緩慢凍結の同等物は、依然として、有力な冷凍保存方法である。適した冷凍容器の欠如が、ガラス化の実施を制限してきたのではないかと感じる。先行技術の冷凍容器は、図１の１つ又はそれ以上の設計制約事項を他の制約事項の利益のために無視するという妥協である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国非仮特許出願第１２／２６７７０８号
【特許文献２】米国仮特許出願第６０／９８７，１１０号
【特許文献３】米国特許第７，３１６，８９６号
【特許文献４】米国特許出願第２００８／０２２０５０７号
【特許文献５】国際特許出願ＷＯ０７／１２０８２９
【発明の概要】
【００１６】
本発明の概要を、本発明を理解するための手引きとして提供する。それは、必ずしも、本発明の最も一般的な実施形態を記述しているのでもなければ、ここに開示されている本発明のあらゆる種類を記述しているわけでもない。
改良されたガラス化用冷凍容器
【００１７】
本発明の目的は、改良された閉鎖型ガラス化冷凍容器を提供することである。本発明によって考案された装置は、図１の５つの属性全てを総体的に組み入れている。本発明は、小型化の進んだ脆弱な冷凍容器に解を求めるのではなく、むしろ新しい方向に進み、形状記憶材料の特徴を利用して新しい設計を作り出している。
【００１８】
本発明は、装入及び抜取りの容易さと急速冷凍の両方を実現する変形可能な壁を備えた閉鎖型ガラス化冷凍容器を備えている。この特徴は、形状記憶材料の固有の材料特性を利用している。形状記憶材料は、高温のオーステナイトと低温のマルテンサイトの２つの結晶構造で存在する。オーステナイト相は、堅さと超弾性の性質を特徴とする。マルテンサイト相は、柔らかくて可鍛性がある。物体のそのオーステナイト相における形状を「記憶形状」と呼ぶ。形状記憶材料が、そのオーステナイト相からマルテンサイト相に冷却され、そして変形した場合、それを加熱してそのオーステナイト相に戻せば、そのオーステナイト形状に戻るであろう。これらの２つの相の行き来が、好都合にも本発明に組み入れることができる設計オプションを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ガラス化冷凍容器に要求される設計属性を示す図である。
【図２】形状記憶材料（一方向形状記憶を呈する）の結晶状態と温度の関係を示す図である。
【図３】形状記憶材料（二方向形状記憶を呈する）の結晶状態と温度の関係を示す図である。
【図４】シャトル、シース、及び組み立てられた冷凍容器の特徴を示している。
【図４Ａ】シースの端部分の或る代わりの実施形態を示している。
【図５】本発明の形状転換の特徴を示している。
【図６】温度制御槽の特徴を示している。
【図７】体温ニチノールで構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図８】超弾性ニチノールで構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図９】二方向ニチノールで構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図１０】可鍛性金属で構成されている冷凍容器を用いたガラス化プロセスを示している。
【図１１】クリンプ付け用具の特徴を示している。
【図１２】冷凍容器の壁が形状記憶部材と非形状記憶部材の混成である或る代わりの実施形態を示している。
【図１３】変形可能な壁を有する冷凍容器を、形状記憶アクチュエータ閉鎖装置及び形状記憶アクチュエータ温度表示装置と組み合わせた或る実施形態を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下の詳細な説明では、本発明の様々な実施形態と特徴が開示されている。これらの実施形態と特徴は、例示であり制限を課すものではない。
【００２１】
「約」という用語がここで使用されている場合、それは、温度に関する場合を除き、また特に別途指示の無い限り、パラメータの所与の値の＋／−２０％内を意味する。温度については、「約」は所与の値の＋／−２℃を意味する。
【００２２】
本発明を使用すれば、様々な生体細胞を無菌で冷凍保存（ガラス化）することができる。細胞の１つの分類は、精子、卵母細胞、胚、桑実胚、胚盤胞、及び他の初期胚細胞の様な、哺乳類の発生細胞である。これらの細胞は、生殖補助処置ではごく普通に冷凍保存される。もう１つの分類に、再生医療で使用される幹細胞がある。最も広範な分類は、本発明の利用可能な冷凍速度と協調するガラス化媒体を使用してガラス化させることができるあらゆる細胞である。
形状記憶効果
【００２３】
形状記憶効果は、Ａｇ−Ｃｄ、Ａｕ−Ｃｄ、Ｃｕ−Ａｌ−Ｎｉ、Ｃｕ−Ｚｎ−Ａｌ、Ｃｕ−Ｚｎ−Ｓｉ、Ｃｕ−Ｚｎ−Ｓｎ、Ｃｕ−Ｓｎ、Ｃｕ−Ｚｎ、Ｆｅ−Ｐｔ、Ｆｅ−Ｍｎ−Ｓｉ、Ｉｎ−Ｔｉ、Ｍｎ−Ｃｕ、Ｍｎ−Ｓｉ、Ｎｉ−Ｔｉ、Ｎｉ−Ａｌ、その他の様な或る特定の金属の合金に存在する。このグループの中では、Ｎｉ−Ｔｉの合金が、商業的に最も普及している異体であり、ニチノールと呼ばれている。また、或る特定のポリマーにも形状記憶現象を呈するものがあり、形状記憶プラスチックと呼ばれている。本発明は、広範囲に様々な形状記憶合金又はプラスチックで実現することができる。使用される特定の合金又はプラスチックは、当業者が選択すればよい。本発明の理解を促すため、この説明の欄ではニチノールの形状記憶材料としての性質を使用して本発明の特徴を説明してゆく。
【００２４】
形状記憶効果は、物体が２つの異なる結晶状態で存在し得る現象である。第１の高温状態にある物体は、剛性を有し、固有の定形状を備えている。この物体は、冷却されると、容易に変形可能な状態へ変化する。当該物体は、材料を加熱することによって、その変形可能性を喪失させ、その固有の定形状に形態変化させて戻すことができる。材料科学は、これらの物理的状態の間の行き来は、材料の温度誘発性相変化によって引き起こされる現象であることを我々に教えてくれる。
【００２５】
図２は、「一方向」形状記憶材料の挙動を示している温度誘発性形状記憶相変化の図である。形状記憶材料は、オーステナイト（図像２００）とマルテンサイト（図像２１０）の２つの結晶構造で存在する。オーステナイト相は、堅さと超弾性の性質を特徴とする。マルテンサイト相は、柔らかく、可鍛性がある。オーステナイト物体の形状は「記憶形状」と呼ばれる。オーステナイト相の物体は、冷却によってマルテンサイトへ変態させることができる。柔らかいマルテンサイトのとき、物体は、変形させることができる。このマルテンサイト物体は、加熱によって変態させてオーステナイトへ戻すことができる。この相変換があると、物体の形状は、（多少の力を加えれば）「記憶形状」に戻るであろう。定オーステナイト形状から非定マルテンサイト形状への変態は、一方向形状記憶と呼ばれる。
【００２６】
機械的応力も、オーステナイト相からマルテンサイト相への変態を生じさせることができる。しかしながら、ひとたび応力が取り除かれると、材料はオーステナイトに復帰する。この属性は、超弾性と呼ばれており、大きな弾性変形を受け得る能力である。
【００２７】
ここで使用されている「変態」という用語は、記憶形状を備えた或る相への、又は記憶形状を備えた或る相からの、相変化をいう。マルテンサイトからオーステナイトへの変態２３０は、ＡＳ（オーステナイト開始）２３６からＡｆ（オーステナイト終了）２３８までの温度の範囲に亘って起こる。同様に、オーステナイトからマルテンサイトへの変態２４０は、ＭＳ（マルテンサイト開始）２４６からＭｆ（マルテンサイト終了）２４８までの温度の範囲に亘って起こる。オーステナイト変態とマルテンサイト変態は、異なる温度帯域で起こる。この現象は、変態ヒステリシス２５２と呼ばれている。変態ヒステリシスは、加熱されてオーステナイトに５０％変態している物体と冷却されてマルテンサイトに５０％変態復帰している物体の間の温度スプレッドである。全変態温度スパン２５４は、物体を１００％マルテンサイトと１００％オーステナイトの間で変態させるのに必要な温度範囲である。ニチノールでは、全変態温度スパンは大凡５０℃である。形状記憶材料の重要な特性は、或る物体が、その物体の加熱及び冷却の履歴に依って、変態温度帯域の間の或る温度で、そのオーステナイト相２６２かそのマルテンサイト相２６４の何れかになり得ることである。本発明を採用する方法は、室温で何れかの相にある形状記憶材料を利用する。所望の相は、１）温水槽（例えば、体温）内で温めてマルテンサイトをオーステナイトに変態させ、続いて室温まで冷却するか、又は２）ガラス化プロセスで容易に利用可能な極低温材料（例えば、ドライアイス、ＬＮ２、低温気体ヘリウム）を用いて冷凍してオーステナイトをマルテンサイトに変態させ、続いて室温まで温めるか、の何れかによって常に実現することができる。
【００２８】
ニチノールでは、変態温度２４６、２４８、２３６、及び２３８は、Ｎｉ対Ｔｉ原子比と、ニチノールの合金形成後の治金加工によって決まる。ニチノールのオーステナイト記憶形状は、材料がオーステナイト相にあるときに治金加工によって作られる。
【００２９】
図３は、二方向形状記憶を呈する形状記憶材料での温度誘発性形状記憶相変化の図である。殆どの形状記憶材料は一方向形状記憶を呈するが、それらを鍛えて二方向形状記憶を呈するようにすることができる。これらの材料は、オーステナイト（図像３００）とマルテンサイト（図像３１０）の２つの結晶構造で存在する。二方向形状記憶材料から製作された物体は、相に応じた２つの固有の形状を有することになる。オーステナイト物体は、「オーステナイト形状」を有していることをいう。マルテンサイト物体の形状は、「マルテンサイト形状」と呼ばれる。どちらの形状も、安定していて区別が付く。一方向形状記憶では「記憶形状」が１つであったのに対し、二方向形状記憶には２つの「記憶形状」がある。温度転換３２０及び３４０は、形状記憶材料を相の間で切り替え、結果として形状変化を生じさせる。変態ヒステリシス３５２と全変態温度スパン３５４は、一方向形状記憶材料の場合と同じ意味を有する。
本発明の基本的構成要素
【００３０】
図４は、代表的な冷凍容器の略管状要素の長手方向断面を示している。冷凍容器は、シャトル４００とシース４２０を備えている。シャトルは、チャネル４０６及び４７２を提供するべく端に切欠４０４（断面４７０も参照のこと）が切られた管４０２を備えている。チャネル表示４０８が、チャネル上のどこに生体標本４１０を置くべきかを定めている。チャネル表示は、溝又は印刷された線とすることもできる。シャトルの直径４１２は、生体標本の直径より大きくなくてはならない。典型的な生体標本は、体積が０．５マイクロリットルであり、直径約１ｍｍに相当する。従って、シャトルに適した直径は約２ｍｍである。シャトルには整列表示４１４を備えて、シャトルをシース内に設置するときに、シャトルを対応するシース側の整列表示４３８と整列させるのに役立ててもよい。表示４１４及び４３８は、印刷されたラインとすることができる。
【００３１】
シース４２０は、非形状記憶材料で作られている管状本体４２２と、形状記憶材料で作られている変形可能区間４２４と、端キャップ４２６を備えている。形状記憶材料は比較的高価であるので、複合構造はシステムのコストを削るのに役立つ。管状本体は、４２８で変形可能区間に取り付けられている。管状本体は、変形可能区間の外側に、両者の間にとまり嵌めが形成されるようにして配置されていてもよい。接合部は、接合部が無菌シールを形成して、極低温流体への浸漬に耐えられるようにするため、糊、溶接、又は他の接合手段によって強化することができる。端キャップは、４３０で変形可能区間に取り付けられている。以下で更に詳しく論じてゆくが、形状記憶材料は、適切な範囲の変態温度を有する如何なる材料とすることもできる。「体温ニチノール」が適している。
【００３２】
図４Ａは、シースの或る代わりの実施形態４Ａ００の該当する熱伝達ゾーンの長手方向上面図を示している。変形可能区間４Ａ０２は、端キャップ４Ａ０４と管状本体４Ａ０８の外部に同心に、それらとの間にとまり嵌めが形成されるようにして配置されている。接合部（４Ａ０６と４Ａ１０）は、糊、溶接、又は他の手段を使って補強することもできる。変形可能区間を管の外部にするか内部にするかの選定は、少なくとも部分的には、変形可能区間対管状本体及び端キャップの熱膨張の相対係数によって決まる。
【００３３】
本発明の基本的な構成要素は生体標本と接触するかもしれない。ヒト生殖細胞は、或る特定の材料に不都合な反応を示す。その様な反応を引き起こさない材料は、「非胎児毒性」と呼ばれる。よって、シャトル、シース、及び端キャップとして適切な材料には、極低温用役に適した非胎児毒性材料が含まれる。サーリン（Ｓｕｒｌｙｎ）８９２１の様なアイオノマー樹脂が適している。我々の試験により、ニチノールは非胎児毒性であり、従って同様に適していることが示されている。ニチノールは、極低温温度で使用することができる。
【００３４】
変形可能区間の長さ４３２、直径４３４、及び壁厚４３６は、変形可能区間が形状転換サイクルを果たすことができるように選定されている。形状転換サイクルは、２つの作用、即ち、１）変形可能区間の壁が、生体標本に触れるように変形する作用と、２）変形した壁が、オーステナイト変態を生じさせる加温によって、実質的にその変形前の形状に復元して生体標本から離れる作用、で構成されている。容易に変形可能であることは、手持ち用具を使用して壁にクリンプを付けることができることを意味する。２ｍｍのシャトル直径に適した変形可能区間の直径は２．１ｍｍ又はそれ以上である。適した壁厚は０．０２５から０．４ｍｍの範囲にある（０．０６５ｍｍが好適）。適した長さは、１０から２０ｍｍの範囲にある。
【００３５】
冷凍容器４５０の組み立ては、生体標本が入れられているシャトルの切欠端をシースの開口部４４０の中へ、シャトルの端が端キャップの内側表面４５６に接触するまで前進させることから開始される。このプロセス中は、シャトル側の整列表示４１４とシース側の整列表示４３８を整列させる。これを行うとき、変形可能区間側の生体標本位置表示４９２及び４９４（横断面４９０を参照）の向きを生体標本と合わせる。生体標本位置表示は、次に続く生体標本への又は同標本からの急速な熱伝達を目的として、変形可能区間上のクリンプを付けるのに適した位置を定めている。次いで、シースの開口端が熱融合される４５４。これにより無菌シール４５２が形成され、冷凍容器は今やクリンプ及びガラス化の準備が整った状態にある。十分に長い冷凍容器は、融合プロセスによって何がしかの熱が発生しても、生体標本に影響が及ぶのを防ぐ。４−６ｃｍの長さ４５８は十分である。
【００３６】
図５は、組み立てられた冷凍容器の該当する熱伝達ゾーンのクリンプが付けられる前５００とクリンプが付けられた後５２０の長手方向上面図を示している。アイテム５４０及び５６０は、これらのアイテムの横断面である。分かり易くするために、シャトルのチャネルは、アイテム５００及びアイテム５２０では省略されている。変形可能区間の壁は、マルテンサイト即ち可鍛性の相にあるニチノールである。
【００３７】
アイテム５００に示されている滴形状の生体標本５０２は、ガラス化媒体５０４と、冷凍保存させる１つ又はそれ以上の細胞５０６を備えている。横断面５４０を参照すると、生体標本５４８と冷凍容器５４４の壁の間には、生体標本がチャネル５４６に載せられた後、シースの壁に接触することなく、簡単に管状シース内に装入されるようにするのに十分なクリアランス５４２がある。
【００３８】
アイテム５２０及び対応している横断面５６０を参照すると、変形可能区間の壁はクリンプが付けられている。生体標本位置表示５５０及び５５２は、生体標本の上方に位置し、更にチャネルを避けた、変形可能区間上の点を指し示すことで、クリンプ付けを案内している。位置表示は、変形可能区間上に十字の形状に印刷されたマークであってもよい。それらは、レーザーマーキングによって作成されていてもよい。クリンプ付けは、ピンセットの使用の様な普通の手段によって実現することができる。生体標本５６２の一部分がシースと直接接触するような十分なクリンプ付けが施される。シースが過剰にクリンプを付けられ、場合によっては変形可能区間を損傷するのを防ぐため、幾つかの実施形態では変形可能区間に定量の変形を加えるべく、下で論じられている修正されたピンセット１１００（図１１）を使用してもよい。この直接接触は、生体標本と周囲環境の間の非常に高い熱伝達率を可能にするであろう。
【００３９】
変形可能区間の内部壁５６４は、変形可能区間が温められてその元の管状形状に戻されたときに、生体標本がそこから離れ、シャトルに付着したままになるように、疎水性であってもよい。必要であれば、変形可能区間の内壁は、ポリテトラフルオロエチレン（商標名テフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）で市販）又はポリキシレンポリマー（商標名パリレン（Ｐａｒｙｌｅｎｅ）で市販）の様な疎水性の非常に高い材料の層で被覆することによって、疎水性をより高めてもよい。
【００４０】
次いで、冷凍容器をＬＮ２（−１９６℃）の様な適したクリオゲンに曝露させることによってガラス化させる。冷却は極めて急速（例えば大凡１秒）であり、生体標本がガラス化する。
【００４１】
次に冷凍容器は、所望の期間、極低温貯蔵の状態に保たれることになる。生体標本を回復させることが必要になると、冷凍容器は、極低温貯蔵庫から温水槽（例えば、体温である３７℃）へ移される。水槽は、形状記憶シースを、その変形可能なマルテンサイト相からその堅いオーステナイト相へ変態させる、即ちオーステナイト変態に足るほどに温かい。これにより、シースは、抜取りに最適な形状である、その「記憶されている」円筒形状（アイテム５００及び対応する横断面５４０）に戻される。生体標本は滴形状に復帰し、クリアランスが復元されて、シャトルが容易に取り出せるようになる。冷凍容器が開かれ、生体標本を回復させるためシャトルが取り出される。
【００４２】
本発明の形状転換の特徴に加え、ニチノールの熱伝達面としての使用から追加の益がもたらされる。ニチノールは、冷凍容器を製作するのに使用される典型的なプラスチックより強い。更に、その熱伝導率はプラスチックより遥かに高い。これらの属性が一体に効果を発揮して、プラスチックより巧く熱を伝導する頑丈な変形可能区間を生み出す。
本発明を利用する方法
【００４３】
本発明は、様々な方法で適用することができる。例外と特記されない限り、以下に説明されている例は、一方向ニチノールを利用している。
【００４４】
ガラス化媒体を用いた生体標本の脱水は、通常は、室温、公称的に２０℃で行われる。これは装入温度でもある。急速冷凍は、通常は、ＬＮ２を用いて−１９６℃で実現される。加温は、通常は、３７℃で行われる。貯蔵時と使用時の２００℃を上回る温度差は、典型的に約５０℃であるニチノールの全変態温度スパンを大きく超えている。これは、オーステナイト終了温度が凡そ約３７℃のニチノールは如何なる等級のものであっても、ＬＮ２によって、常にマルテンサイトへと変態することができることを意味する。これは、大気圧下沸点が−４２℃の液体プロパンがクリオゲンとして使用された場合でも当てはまる。
【００４５】
冷凍容器を製作するのに使用されるニチノールは、室温では変形可能であるとともに、３７℃までに実質的にその記憶形状に復元している必要がある。これらの要件を実現させる１つの方法は、そのオーステナイト開始温度が室温より僅かに高く且つそのオーステナイト終了温度が体温である３７℃ぐらいのニチノールを製造することである。例えば、オーステナイト開始温度は、２０℃から２５℃の範囲内とすることができる。オーステナイト終了温度は、３７℃から４０℃の範囲内とすることができる。オーステナイト開始温度とオーステナイト終了温度のこの組み合わせを実現させる方法は、「体温」ニチノール（例えば、ＡＳが１５℃から１８℃の間でＡｆが３０から３５℃の間）を製造するためのプロセスを、ニッケル対チタンの比、合金の熱加工、又は銅の様な第３の合金化元素を追加する量のうち１つ又はそれ以上を調節することによって修正することを含んでいる。
【００４６】
意外にも、オーステナイト開始温度が室温より２乃至４℃下のニチノール合金も適している。当該合金は、そのオーステナイト開始温度を２−４℃上回っても、手でクリンプを付けることができるだけの可鍛性を依然として保持している。同様に、オーステナイト終了温度が体温より２−４℃上の合金も適している。ニチノールは、体温まで温められると、オーステナイト終了温度に完全に達しているわけではなくても、実質的に抜取りのためのその記憶形状を取り戻すであろう。
【００４７】
オーステナイト開始温度が室温より２−４℃下から更に下のニチノールは、適度に冷やされた状態、望ましくは同様に冷やされた手持ち用具を用いてクリンプを付けられた状態に保たれるなら、使用することができる。従って、標準的な体温ニチノールは、使用することができる。体温ニチノールは、約１５℃のオーステナイト開始温度と、約３３℃のオーステナイト終了温度を有する。体温ニチノールは、室温（例えば２０℃）では、手持ち用具を使ってクリンプを付けるには十分な可鍛性を有していないかもしれない。しかしながら、体温ニチノールは、装入中は可鍛性を維持するように、人為的に室温より下に保持することができる。適した保持温度は、０−１０℃の範囲にある。体温ニチノールから製作された冷凍容器は、最初に、そのマルテンサイト終了温度より下まで冷却されなくてはならない。これは、冷凍容器を従来型のフリーザー内に入れるか、又はそれをＬＮ２の中へ押し込むことにより、行うことができる。体温ニチノールがその可鍛性を維持するには、冷凍容器は、装入されてクリンプを付けられるときまで約１５℃のそのオーステナイト開始温度より下に保たれなくてはならない。これは、室内を冷たく保つ、シースを冷蔵庫に入れておく、シースを温度制御された槽に入れておく、又はそれらの組合せの様な、数々の手段によって行うことができる。
【００４８】
温度制御された槽の或る代表的な設計が、図６に示されている。槽６００は、平坦な底部６０４と上部の溜め６０６を有する略球形の容器６０２を備えている。槽は、２つの部品を継目６０８で接合して作られていてもよい。ポリカーボネートの様な透明なプラスチックは、適した構造材料である。槽の内部には、オーステナイト開始温度より下の温度で溶ける材料が充填されている。融点が１０℃のパラフィン６１０が適している。
【００４９】
実施時、先ず、槽を冷蔵庫内で冷やしてパラフィンを凍らす。槽は、使用前に取り出され、溜めに水６１２が入れられる。水がパラフィンを温めると、パラフィンが溶け始める。すると、水とパラフィンは共に、パラフィンの融点で熱平衡になる。そこで、自身のマルテンサイト終了温度より下まで冷やされたシース６１４を溜めに浸漬させることができ、シースは槽の温度に維持されることになる。ピンセットの様な用具を用いてクリンプ付けが行われる場合、用具は、用具自体が変形可能区間に接触して同区間をオーステナイト開始温度より上に上昇させないように、同様に水槽温度で平衡化させることができる。
【００５０】
図７に示されている様に、生体標本をガラス化するときになると、シースは溜めから取り出され、シャトルは生体標本と一体にシースの中へ入れられる。該当するガラス化熱伝達ゾーンは、横断面７００として示されている。生体標本は視界から隠されており、よって変形可能区間上の生体標本位置表示７０２及び７０４が、クリンプを形成する最適位置を指し示す。クリンピング点７２０及び７２２を有する、修正が加えられたピンセットの様な手持ち式用具が、冷凍容器にクリンプを付けて横断面７２４を形成する。横断面７２４はクリンプを付けられた直後の冷凍容器を示している。可鍛性の体温ニチノールは、外部から力を加えなくてもそのクリンプを付けられた形状を維持する。クリンプ付けは、速いプロセスなので、体温ニチノールはその可鍛性を損なう温度まで温まらない。次いで、冷凍容器の入口が、熱シールの様な従来の手段によって密封される。
【００５１】
その後、冷凍容器は、例えば、−１９６℃の液体窒素７４２が入っている極低温槽７４０に入れられる。冷却は極めて急速（例えば約１秒）であり、生体標本７４４がガラス化する。
【００５２】
その後、冷凍容器は、所望の期間、極低温貯蔵状態に保たれてもよい。
【００５３】
ガラス化した生体標本を回復させることが必要になると、冷凍容器は、液体窒素槽から、体温である３７℃の水７６２が入っている温水槽７６０へ移される。水槽は、形状記憶シースを、その変形可能なマルテンサイト相からその堅いオーステナイト相へ変態させるに足るほどに温かい。これにより、シースは、その「記憶されている」円筒形状７６４に戻される。こうして、生体標本７６６は安全に温められ、シャトルを簡単に取り出すためのクリアランスが再び提供される。
【００５４】
図８に示されている様に、オーステナイト終了温度が約１０℃の様な低い温度のニチノール合金は、オーステナイト相にあるときは、ニチノールの超弾性的性質を生かすことによって使用することができる。横断面８００は、室温ではオーステナイトであるニチノールから製作された冷凍容器を示している。シャトルが生体標本と一体に、上で説明されている様にシースと組み立てられる。次いで、無菌シールが形成される。生体標本位置表示８０２及び８０４は、冷凍容器の最適なクリンピング点を指し示している。オーステナイトのニチノールは、マルテンサイトに比べ、変形を実現するのにより高い力を必要とする。従って、オーステナイトを変形させるには、ピンセットではなく、一対の修正を加えられたピラーが必要である。そこで、その様な一対のピラーの接触点８２２及び８２４で冷凍容器にクリンプを付けて横断面８２０を形成する。冷凍容器がクリンプを付けられた状態を保てるように、ピラーはそのクリンプ付けの力を維持し続けなければならない。
【００５５】
クリンプを付けられた冷凍容器８４２を保持する締め付けられたピラー対は、次いで、ＬＮ２ ８４４が入っている極低温槽８４０に入れられる。冷却がＬＮ２からピラーの接触点を介して伝わり、ガラス化を実現する。同時に、変形可能区間はマルテンサイトに変態する。ここでピラーを取り出すことができる。冷凍容器８４６は、そのクリンプを付けられた形状、即ち、熱伝達に最適な形状を維持し、それが加温中に遊隙になってゆく。冷凍容器は今や長期極低温貯蔵の準備が整った状態である。
【００５６】
ガラス化された生体標本を回復させるには、冷凍容器を液体窒素槽から温水槽８６０（例えば体温である３７℃）に移す。水８６２は、形状記憶シースを、その変形可能なマルテンサイト相から、その堅いオーステナイト相に変態させるに足るほど温かい。これにより、シースは、その「記憶されている」円筒形状８６４に戻される。こうして、生体標本８６６は安全に温められ、シャトルを簡単に取り出すためのクリアランスが再び提供される。
二方向形状記憶合金
【００５７】
図９に示されている様に、本発明は、二方向ニチノールから製作された冷凍容器を用いて実装することもできる。一例として、−１０℃のマルテンサイト終了温度と、３７℃のオーステナイト終了温度を有する材料がある。この材料で作られたシースは、円筒形状のオーステナイト形状と、クリンプを付けられたマルテンサイト形状を有することができる。先に説明した様に、シャトルが生体標本と一体に、シースと組み立てられる。無菌シールが形成される。横断面９００は、二方向ニチノールから製作されていて、ガラス化の準備が整っている冷凍容器を示している。クリンプ付け用具は一切必要なく、よって生体標本の位置表示は必要ない。
【００５８】
ガラス化させるため、冷凍容器は、ＬＮ２ ９２２が入っている極低温槽９２０に入れられる。冷却は、マルテンサイト変態を誘発し、変形可能区間をそのオーステナイト形状９２４からそのマルテンサイト形状９２６へ形状転換させる。この形状は、熱伝達に最適であり、加温中に遊隙になってゆく。急速冷却は、相変化と同時に、生体標本をガラス化する。そうすると、冷凍容器を長期極低温貯蔵庫に入れることができる。
【００５９】
ガラス化された生体標本の回復は、他の実施形態と同じ工程に従う。冷凍容器は、液体窒素槽から温水槽９４０（例えば体温である３７℃）に移される。水９４２は、変形可能区間をその記憶されているオーステナイト形状９４４（円筒）に形状転換させるオーステナイト変態を誘発するに足るほど温かい。こうして、生体標本９４６は安全に温められ、シャトルを簡単に取り出すためのクリアランスが再び提供される。
可鍛性金属
【００６０】
図１０に示されている様に、金、銀、銅、錫、及びアルミニウムの様な可鍛性金属は、ピンセットの様な手持ち用具を用いて容易に変形させることができる。それらは、速い熱伝達に資する高い熱伝導率を有している。シースは、可鍛性金属の変形可能区間を備えて製作することができる。シャトルが生体標本と一体に、このシースと組み立てられる。無菌シールが形成される。横断面１０００は、変形可能区間が可鍛性金属から製作されている冷凍容器を示している。生体標本位置表示１００２及び１００４は、熱伝達に最適な形状を実現するのに最適なクリンプ付け位置を指し示している。クリンピング点１０２２及び１０２４を有する、修正が加えられたピンセットの様な手持ち用具が、冷凍容器にクリンプを付けて横断面１０２０を形成する。可鍛性金属は、外部から力を加えなくても、そのクリンプを付けられた形状を維持する。次いで、クリンプを付けられた冷凍容器は、ＬＮ２ １０４２の入った極低温槽１０４０に入れられる。冷却は極めて急速（例えば約１秒）であり、生体標本１０４４はガラス化する。冷凍容器は今や長期極低温貯蔵の準備が整った状態である。
【００６１】
ガラス化した生体標本を回復させるには、冷凍容器１０６４を、ＬＮ２から温水槽１０６０（例えば体温である３７℃）に移す。水１０６２は、生体標本１０６６を安全に温める。
【００６２】
可鍛性金属の変形可能区間は、温度変化ではその円筒形状に復帰しない。形状を復元する１つのやり方は、シースの入口４４０（図４）で気圧供給源を適用することである。圧力がシースの内部空洞に印加され、クリンプを付けられた可鍛性金属の管をその元の円筒形状に機械的に復元する。約６．９Ｐａ−３４４ｋＰａ（１−５０ｐｓｉｇ）の圧力が適しており、約６．９−１０３ｋＰａ（１−１５ｐｓｉｇ）の圧力が好適である。ヒト細胞は、高い（数百バール）圧力への短時間曝露に耐えることが示されている。従って、クリンプを付けられたシースを内からの空気圧を用いて外へ向けて変形できるようにするためのシースの設計パラメータは、普通は、生体標本によって制限されることはない。クリアランスが復元され、生体標本の回復のためにシャトルを簡単に取り出せるようになる。
【００６３】
或る代わりの回復方法は、温められた冷凍容器１０８０からシャトルを取り出し、生体標本を残留させることである。次に、細針シリンジをシースの入口に挿して内部空洞に洗浄液を灌注することができる。生体標本は、シャトル上に無ければ、排流された洗浄液中に見つけることができる。
クリンプ付け用の器材
【００６４】
図１１は、変形可能区間にクリンプを付けるのに使用することができる、修正が加えられたピンセット１１００と修正が加えられたピラー１１２０を示している。ピンセット（ピラー）は、確実に、クリンプが所定の深さになるようにするため、ストッパ１１０２（１１２２）を備えている。それらは、ユーザーが、クリンプを付けるときに、それら用具を変形可能区間側の生体標本位置表示と正しく整列させるのを支援するクリンピング表示１１０４（１１２４）も備えている。ジョー１１０６（１１２６）は、クリンプを付けるときに、変形可能な区間に所定の形状を与えるように修正されてもよい。機械的利点がより高いピラーは、ピンセットより多くのクリンピング力を掛けることができるであろう。この追加の力は、超弾性のニチノール合金にクリンプを付ける際に有用である。
代わりのシース構成と複合材料
【００６５】
図１２は、２つの互いに反対側のニチノール部分１２０２と２つの非ニチノール部分１２０４を備えて製作された複合壁を有する冷凍容器１２００の横断面を示している。ニチノールの量の削減は、材料費を低く抑えるのに役立つ。非ニチノール面は、極低温温度に適している非胎児毒性材料から製作されている。冷凍容器の４つの面は、１２０６で表されている４つの場所で接合されている。冷凍容器内で、生体標本１２０８は、チャネル１２１０に載せられている。複合壁型冷凍容器は、装入及び抜取りに適した記憶形状を有している。ここで説明されている他の実施形態と同様に、この複合冷凍容器のニチノールは、可鍛性のマルテンサイトかオーステナイトの何れかとすることができる。従って、クリンプ付け用具を使用することによって、それにクリンプを付けて横断面１２２０を形成することができる。この形状は、熱伝達が改善されるように生体標本に接触１２２２する。３７℃まで温めると、この冷凍容器は、その円筒形の記憶形状に復帰する。記憶形状は、生体標本を簡単に回復できるようにするクリアランスを復元する。
一般的考察
【００６６】
ニチノールから製作されている形状記憶装置は、８％回復可能歪みに相応する。銅を基材とする形状記憶材料は、１２％回復可能歪みに相応する。本発明は、少なくとも１％の回復可能歪みか非回復可能歪みの何れかに、破裂することなく耐えることができる材料を使用すれば効を奏する。回復可能歪みがより高いと、その結果、より深いクリンピングがもたらされ、それらの記憶形状への復帰を可能にしながらも熱伝達を向上させることができる。本発明は、利用可能な回復可能歪みをより効率良く利用することのできる非円形形状に適用し、更に速い冷凍速度を実現することができる。
形状記憶ポリマー
【００６７】
形状記憶ポリマーは、形状記憶現象を呈するポリマーである。しかしながら、ポリマーの当該現象は、２つの変態温度帯域を有する形状記憶合金での様な２つの結晶状態から生じるのではない。形状記憶ポリマーについて理解するには、ガラス転移温度Ｔｇと呼ばれる１つの特性温度しか必要でない。記憶形状は、製作中に、Ｔｇより上の温度で確立される。その後、ポリマー部分は、異なる形状に変形させて、Ｔｇより下に冷却することができる。当該部分は、Ｔｇより下に保たれている限り、その変形形状を維持することになる。当該部分は、Ｔｇより上に加熱されると、その記憶形状に復帰する。こうして、冷凍容器は、形状記憶ポリマーの変形可能区間を備えて製作することができ、図８に教示されている方法を使用することにより、形状転換ガラス化冷凍容器として機能することになる。幾つかの実施形態では、適した形状記憶ポリマーは、プラスチックであってもよい。ベリフレックス（Ｖｅｒｉｆｌｅｘ）（登録商標）は、適した形状記憶ポリマーである。
【００６８】
１５℃のＴｇを有する形状記憶ポリマーから製作されている冷凍容器は、室温でクリンプを付けられ、保持され、ガラス化させることができる。それは、極低温温度では、そのクリンプが付けられた形状を維持するであろう。冷凍容器は、Ｔｇより上に加熱されると、そのクリンプを付けられていない形状に戻ることができ、生体標本を取り出すことができる。
変形可能区間、形状記憶アクチュエータ閉鎖装置、及び形状記憶アクチュエータ温度表示器を備えた冷凍容器
【００６９】
図１３は、変形可能区間１３１０、形状記憶アクチュエータ閉鎖装置１３２０、及び形状記憶アクチュエータ温度表示器１３３０を備えた冷凍容器１３００を示している。
【００７０】
形状記憶アクチュエータ閉鎖装置は、形状記憶アクチュエータ１３２２と端キャップ１３２４を備えている。形状記憶アクチュエータは、形状記憶ばね１３２３と、従来の材料の付勢ばね１３２５を備えている。形状記憶ばねは、室温では、相対的に展開した記憶形状を有していて、付勢ばねより強い。端キャップは、従って、室温では冷凍容器の端部から押し離され、取り外すことができ、シャトル及び生体標本の装入及び抜取りが可能になる。しかしながら、冷やしたトングを用いて把持するなどによってアクチュエータが冷やされると、形状記憶ばねはマルテンサイトに変態し、付勢ばねより弱くなり、付勢ばねが端キャップを冷凍容器の端部にぴったり当てて引っ張る。こうして、持続的な閉鎖力が冷凍容器に印加されて、ガラス化及び貯蔵中、同容器を密封するのを助ける。
【００７１】
温度表示装置は、形状記憶アクチュエータ１３２２、警戒ロッド１３３４、及び外側チャンバ１３３６を備えている。形状記憶アクチュエータは、普通は、極低温温度では潰れ、−１３０Ｃの失透温度の様なより高い温度で展開する。よって、冷凍容器が、検査又は他の理由で極低温貯蔵庫から取り出されると、ユーザーは、アクチュエータが温まって、温度警戒ロッドがチャンバから外に出る動きによって、失透の可能性がある旨の警告を受けることになる。
結論
【００７２】
本開示は、１つ又はそれ以上の異なる代表的な実施形態に関連付けて説明してきたが、当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、また本開示の要素に等価物を置き換えることができることが理解頂けるであろう。更に、本開示の本質的な範囲又は教示から逸脱することなく、特定の状況に適合させるべく多くの修正を加えることができる。従って、本開示は、本発明を実施するための考えられている最良の形態として開示されている特定の実施形態に限定されるものではない。
【符号の説明】
【００７３】
１００ 閉鎖型冷凍容器の設計制約の関係
２００、３００ オーステナイト結晶構造
２１０、３１０ マルテンサイト結晶構造
２３０、３２０ マルテンサイトからオーステナイトへの変態
２３６ オーステナイト開始
２３８ オーステナイト終了
２４０、３４０ オーステナイトからマルテンサイトへの変態
２４６ マルテンサイト開始
２４８ マルテンサイト終了
２５２、３５２ 変態ヒステリシス
２５４、３５４ 全変態温度スパン
２６２ オーステナイト相
２６４ マルテンサイト相
４００ シャトル
４０２ 管
４０４ 切欠
４０６、４７２ チャネル
４０８ チャネル表示
４１０ 生体標本
４１２ シャトルの直径
４１４ 整列表示
４２０ シース
４２２ 管状本体
４２４ 変形可能区間
４２６ 端キャップ
４３２ 変形可能区間の長さ
４３４ 変形可能区間の直径
４３６ 変形可能区間の壁厚
４３８ シース側の整列表示
４４０ シースの開口部、シース入口
４５０ 冷凍容器
４５２ 無菌シール
４５４ 開口端部の熱融合
４５６ 端キャップの内側表面
４５８ 冷凍容器の長さ
４７０ 断面
４９２、４９４ 生体標本位置表示
４Ａ００ シース
４Ａ０２ 変形可能区間
４Ａ０４ 端キャップ
４Ａ０８ 管状本体
４Ａ０６、４Ａ１０ 接合部
５００ クリンプを付けられる前の冷凍容器
５０２ 生体標本
５０４ ガラス化媒体
５０６ 細胞
５２０ クリンプを付けられた後の冷凍容器
５４２ クリアランス
５４４ 冷凍容器
５４６ チャネル
５４８ 生体標本
５５０、５５２ 生体標本の位置表示
５６２ 生体標本
５６４ 変形可能区間の内部壁
６００ 槽
６０２ 球形の容器
６０４ 底部
６０６ 溜め
６０８ 継目
６１０ パラフィン
６１２ 水
６１４ シース
７０２、７０４ 生体標本位置表示
７４０ 極低温槽
７４２ 液体窒素
７４４ 生体標本
７６０ 水槽
７６２ 水
７６４ 記憶されている円筒形状
７６６ 生体標本
８０２、８０４ 生体標本位置表示
８２２、８２４ ピラーの接触点
８４０ 極低温槽
８４２ 冷凍容器
８４４ 液体窒素
８４６ 冷凍容器
８６２ 水
８６６ 生体標本
９２２ 液体窒素
９２０ 極低温槽
９２４ オーステナイト形状
９２６ マルテンサイト形状
９４０ 温水槽
９４２ 水
９４４ 記憶されているオーステナイト形状
９６６ 生体標本
１００２、１００４ 生体標本位置表示
１０２２、１０２４ クリンピング点
１０４０ 極低温槽
１０４２ 液体窒素
１０４４ 生体標本
１０６０ 温水槽
１０６２ 水
１０６４ 冷凍容器
１０６６ 生体標本
１０８０ 冷凍容器
１１００ ピンセット
１１２０ ピラー
１１０２、１１２２ ストッパ
１１０４、１１２４ クリンピング表示
１１０６、１１２６ ジョー
１２００ 冷凍容器
１２０２ ニチノール部分
１２０４ 非ニチノール部分
１２０６ 接合場所
１２０８ 生体標本
１２１０ チャネル
１３００ 冷凍容器
１３１０ 変形可能区間
１３２０ 形状記憶アクチュエータ閉鎖装置
１３２２ 形状記憶アクチュエータ
１３２３ 形状記憶ばね
１３２４ 端キャップ
１３２５ 付勢ばね
１３３０ 形状記憶アクチュエータ温度表示器
１３３４ 警戒ロッド
１３３６ 外側チャンバ
Ａｓ オーステナイト開始温度
Ａｆ オーステナイト終了温度
Ｍｓ マルテンサイト開始温度
Ｍｆ マルテンサイト終了温度
Ｔｇ 転移温度
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体標本をガラス化するための冷凍容器において、
ａ．前記生体標本を保持するためのチャネルを備えているシャトルと、
ｂ．変形可能区間を備えているシースと、を備えており、
前記シャトルと前記シースは、前記シャトルが前記シースの中へ装入されたときに、前記チャネルの少なくとも一部分が、前記変形可能区間内に置かれるような寸法であり、前記変形可能区間は、形状記憶材料を備えている、冷凍容器。
【請求項２】
前記形状記憶材料はプラスチックである、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項３】
前記形状記憶材料は金属である、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項４】
前記金属はニチノール合金であり、前記ニチノール合金は、
ａ．１０℃から２５℃の範囲のオーステナイト開始温度と、
ｂ．３０℃から４５℃の範囲のオーステナイト終了温度と、を有する、請求項３に記載の冷凍容器。
【請求項５】
ａ．前記オーステナイト開始温度は２０℃から２５℃の範囲にあり、
ｂ．前記オーステナイト終了温度は３５℃から４０℃の範囲にある、請求項４に記載の冷凍容器。
【請求項６】
前記金属のオーステナイト終了温度は２５℃未満である、請求項３に記載の冷凍容器。
【請求項７】
ａ．前記シャトルは約２ｍｍの直径を有し、
ｂ．前記変形可能区間は管状形状を有し、
ｃ．前記変形可能区間は、前記シャトル直径より少なくとも０．１ｍｍ大きい内径を有し、
ｄ．前記変形可能区間は、１０ｍｍより長く、
ｅ．前記変形可能区間の壁は、０．０２５から０．４ｍｍの範囲の厚さを有している、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項８】
前記変形可能区間の前記壁は、手持ち用具によって、破裂させることなく、前記変形可能区間の最小内側スペーシングが約１ｍｍになる点までクリンプを付けることができる、請求項７に記載の冷凍容器。
【請求項９】
ａ．前記変形可能区間の外部表面上には、前記変形可能区間のどこにクリンプを付けるべきかを指し示すべく、生体標本位置表示が設けられており、
ｂ．前記シャトルと前記シース上には、この２つを組み立てるときにどのように整列させるかを指し示すべく、整列表示が設けられている、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項１０】
ａ．前記チャネルの表面は、非胎児毒性であり、
ｂ．前記変形可能区間の内側表面は、非胎児毒性であり、疎水性である、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項１１】
ａ．形状記憶アクチュエータ閉鎖装置と、
ｂ．形状記憶アクチュエータ温度表示器と、を更に備えている、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項１２】
生体標本をガラス化するための冷凍容器において、
ａ．前記生体標本を保持するためのチャネルを備えているシャトルと、
ｂ．変形可能区間を備えているシースと、を備えており、
前記シャトルと前記シースは、前記シャトルが前記シースの中へ装入されたとき、前記チャネルの少なくとも一部分が、前記変形可能区間内に置かれるような寸法であり、前記変形可能区間は、可鍛性金属材料を備えている、冷凍容器。
【請求項１３】
前記可鍛性金属は、金、銀、銅、錫、又はアルミニウムである、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１４】
ａ．前記シャトルは約２ｍｍの直径を有し、
ｂ．前記変形可能区間は管状形状を有し、
ｃ．前記変形可能区間は、前記シャトル直径より少なくとも０．１ｍｍ大きい内径を有し、
ｄ．前記変形可能区間は、１０ｍｍより長く、
ｅ．前記変形可能区間の壁は、０．０２５から０．４ｍｍの範囲の厚さを有している、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１５】
前記変形可能区間の前記壁は、手持ち用具によって、破裂させることなく、前記変形可能区間の最小内側スペーシングが約１ｍｍになる点までクリンプを付けることができる、請求項１４に記載の冷凍容器。
【請求項１６】
ａ．前記変形可能区間の外部表面上には、前記変形可能区間のどこにクリンプを付けるべきかを指し示すべく、生体標本位置表示が設けられており、
ｂ．前記シャトルと前記シース上には、この２つを組み立てるときにどのように整列させるかを指し示すべく、整列表示が設けられている、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１７】
ａ．前記チャネルの表面は、非胎児毒性であり、
ｂ．前記変形可能区間の内側表面は、非胎児毒性であり、疎水性である、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１８】
ａ．形状記憶アクチュエータ閉鎖装置と、
ｂ．形状記憶アクチュエータ温度表示器と、を更に備えている、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１９】
生体標本をガラス化する方法において、
ａ．前記生体標本を、変形可能な壁を備えている極低温容器内部に設置する工程と、
ｂ．前記変形可能な壁に、前記変更可能な壁が前記生体標本に接触して、それへの熱伝達率を上げるように、クリンプを付ける工程と、
ｃ．前記変更可能な壁を、前記生体標本がガラス化されるように、極低温物質と接触させる工程と、から成る方法。
【請求項２０】
前記変形可能な壁は、２０℃から２５℃の範囲のオーステナイト開始温度を有するニチノールを備えており、前記変形可能な壁にクリンプを付ける工程は、約２０℃で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変形可能な壁は、体温ニチノールを備えており、前記方法は、
ａ．前記生体標本の前記挿入に先立ち、前記変形可能な壁を、前記ニチノールのマルテンサイト終了温度より下の温度まで冷やす工程と、
ｂ．クリンプ付け用具を、前記ニチノールの前記オーステナイト開始温度より下の温度まで冷やす工程と、
ｃ．前記変形可能な壁にクリンプを付ける前記工程を、前記冷やされたクリンプ付け用具を使用して行う工程と、を更に含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記クリンプ付け用具は手持ち用具であり、前記変形可能な壁は表示を備えており、前記クリンプ付け用具は、前記のクリンプを付ける工程時に前記表示と整列される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変形可能な壁は、二方向形状記憶金属を備えており、前記二方向形状記憶金属のオーステナイト形状は、開放形状であり、且つ、前記二方向形状記憶金属のマルテンサイト形状は、クリンプを付けられた形状であり、前記クリンプを付ける前記工程は、前記変形可能な壁を、前記二方向形状記憶金属のマルテンサイト開始温度より下に冷却する工程を含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ａ．前記生体標本を３７℃まで温める工程と、
ｂ．前記変形可能区間を、気体圧力を使用して、前記変形可能な壁が前記生体標本から離れるように展開する工程と、を更に含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記変形可能な壁は、室温で、そのオーステナイト相にあるニチノールであり、前記方法は、
ａ．前記変形可能な壁に一対のピラーを用いてクリンプを付け、保持する工程と、
ｂ．前記変形可能な壁を前記極低温物質と接触させる前記工程の間、前記変形可能区間をクリンプを付けられた位置に保持する工程と、を更に含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記変形可能な壁は、可鍛性金属であり、表示を備えており、前記クリンプを付ける工程は、前記表示と整列させたクリンプ付け用具を用いて実現される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
或る方法によって加工された生体標本において、
ａ．前記生体標本を、変形可能な壁を備えている極低温容器内部に設置する工程と、
ｂ．前記変形可能な壁に、当該壁が前記生体標本に接触するようにクリンプを付ける工程と、
ｃ．前記変更可能な壁を、前記生体標本がガラス化されるように、極低温物質と接触させる工程と、から成る方法によって処理された生体標本。
【請求項２８】
前記変形可能な壁はニチノールを含み、前記生体標本は、前記変更可能な壁を大凡体温の水槽に浸漬することによって前記生体標本を温める工程で更に処理され、その結果、前記生体標本は、前記極低温容器から前記変形可能な壁に接触することなく取り出せるように、前記変更可能な壁が記憶形状に変態する、請求項２７に記載の生体標本。
【請求項２９】
前記変形可能な壁の内部表面は、前記変形可能な壁がその記憶形状に変態したときに前記生体標本が前記壁から浮かせられるように、テフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）又は類似物で被覆されている、請求項２８に記載の生体標本。
【請求項１】
生体標本をガラス化するための冷凍容器において、
ａ．前記生体標本を保持するためのチャネルを備えているシャトルと、
ｂ．変形可能区間を備えているシースと、を備えており、
前記シャトルと前記シースは、前記シャトルが前記シースの中へ装入されたときに、前記チャネルの少なくとも一部分が、前記変形可能区間内に置かれるような寸法であり、前記変形可能区間は、形状記憶材料を備えている、冷凍容器。
【請求項２】
前記形状記憶材料はプラスチックである、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項３】
前記形状記憶材料は金属である、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項４】
前記金属はニチノール合金であり、前記ニチノール合金は、
ａ．１０℃から２５℃の範囲のオーステナイト開始温度と、
ｂ．３０℃から４５℃の範囲のオーステナイト終了温度と、を有する、請求項３に記載の冷凍容器。
【請求項５】
ａ．前記オーステナイト開始温度は２０℃から２５℃の範囲にあり、
ｂ．前記オーステナイト終了温度は３５℃から４０℃の範囲にある、請求項４に記載の冷凍容器。
【請求項６】
前記金属のオーステナイト終了温度は２５℃未満である、請求項３に記載の冷凍容器。
【請求項７】
ａ．前記シャトルは約２ｍｍの直径を有し、
ｂ．前記変形可能区間は管状形状を有し、
ｃ．前記変形可能区間は、前記シャトル直径より少なくとも０．１ｍｍ大きい内径を有し、
ｄ．前記変形可能区間は、１０ｍｍより長く、
ｅ．前記変形可能区間の壁は、０．０２５から０．４ｍｍの範囲の厚さを有している、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項８】
前記変形可能区間の前記壁は、手持ち用具によって、破裂させることなく、前記変形可能区間の最小内側スペーシングが約１ｍｍになる点までクリンプを付けることができる、請求項７に記載の冷凍容器。
【請求項９】
ａ．前記変形可能区間の外部表面上には、前記変形可能区間のどこにクリンプを付けるべきかを指し示すべく、生体標本位置表示が設けられており、
ｂ．前記シャトルと前記シース上には、この２つを組み立てるときにどのように整列させるかを指し示すべく、整列表示が設けられている、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項１０】
ａ．前記チャネルの表面は、非胎児毒性であり、
ｂ．前記変形可能区間の内側表面は、非胎児毒性であり、疎水性である、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項１１】
ａ．形状記憶アクチュエータ閉鎖装置と、
ｂ．形状記憶アクチュエータ温度表示器と、を更に備えている、請求項１に記載の冷凍容器。
【請求項１２】
生体標本をガラス化するための冷凍容器において、
ａ．前記生体標本を保持するためのチャネルを備えているシャトルと、
ｂ．変形可能区間を備えているシースと、を備えており、
前記シャトルと前記シースは、前記シャトルが前記シースの中へ装入されたとき、前記チャネルの少なくとも一部分が、前記変形可能区間内に置かれるような寸法であり、前記変形可能区間は、可鍛性金属材料を備えている、冷凍容器。
【請求項１３】
前記可鍛性金属は、金、銀、銅、錫、又はアルミニウムである、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１４】
ａ．前記シャトルは約２ｍｍの直径を有し、
ｂ．前記変形可能区間は管状形状を有し、
ｃ．前記変形可能区間は、前記シャトル直径より少なくとも０．１ｍｍ大きい内径を有し、
ｄ．前記変形可能区間は、１０ｍｍより長く、
ｅ．前記変形可能区間の壁は、０．０２５から０．４ｍｍの範囲の厚さを有している、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１５】
前記変形可能区間の前記壁は、手持ち用具によって、破裂させることなく、前記変形可能区間の最小内側スペーシングが約１ｍｍになる点までクリンプを付けることができる、請求項１４に記載の冷凍容器。
【請求項１６】
ａ．前記変形可能区間の外部表面上には、前記変形可能区間のどこにクリンプを付けるべきかを指し示すべく、生体標本位置表示が設けられており、
ｂ．前記シャトルと前記シース上には、この２つを組み立てるときにどのように整列させるかを指し示すべく、整列表示が設けられている、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１７】
ａ．前記チャネルの表面は、非胎児毒性であり、
ｂ．前記変形可能区間の内側表面は、非胎児毒性であり、疎水性である、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１８】
ａ．形状記憶アクチュエータ閉鎖装置と、
ｂ．形状記憶アクチュエータ温度表示器と、を更に備えている、請求項１２に記載の冷凍容器。
【請求項１９】
生体標本をガラス化する方法において、
ａ．前記生体標本を、変形可能な壁を備えている極低温容器内部に設置する工程と、
ｂ．前記変形可能な壁に、前記変更可能な壁が前記生体標本に接触して、それへの熱伝達率を上げるように、クリンプを付ける工程と、
ｃ．前記変更可能な壁を、前記生体標本がガラス化されるように、極低温物質と接触させる工程と、から成る方法。
【請求項２０】
前記変形可能な壁は、２０℃から２５℃の範囲のオーステナイト開始温度を有するニチノールを備えており、前記変形可能な壁にクリンプを付ける工程は、約２０℃で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変形可能な壁は、体温ニチノールを備えており、前記方法は、
ａ．前記生体標本の前記挿入に先立ち、前記変形可能な壁を、前記ニチノールのマルテンサイト終了温度より下の温度まで冷やす工程と、
ｂ．クリンプ付け用具を、前記ニチノールの前記オーステナイト開始温度より下の温度まで冷やす工程と、
ｃ．前記変形可能な壁にクリンプを付ける前記工程を、前記冷やされたクリンプ付け用具を使用して行う工程と、を更に含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記クリンプ付け用具は手持ち用具であり、前記変形可能な壁は表示を備えており、前記クリンプ付け用具は、前記のクリンプを付ける工程時に前記表示と整列される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変形可能な壁は、二方向形状記憶金属を備えており、前記二方向形状記憶金属のオーステナイト形状は、開放形状であり、且つ、前記二方向形状記憶金属のマルテンサイト形状は、クリンプを付けられた形状であり、前記クリンプを付ける前記工程は、前記変形可能な壁を、前記二方向形状記憶金属のマルテンサイト開始温度より下に冷却する工程を含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ａ．前記生体標本を３７℃まで温める工程と、
ｂ．前記変形可能区間を、気体圧力を使用して、前記変形可能な壁が前記生体標本から離れるように展開する工程と、を更に含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記変形可能な壁は、室温で、そのオーステナイト相にあるニチノールであり、前記方法は、
ａ．前記変形可能な壁に一対のピラーを用いてクリンプを付け、保持する工程と、
ｂ．前記変形可能な壁を前記極低温物質と接触させる前記工程の間、前記変形可能区間をクリンプを付けられた位置に保持する工程と、を更に含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記変形可能な壁は、可鍛性金属であり、表示を備えており、前記クリンプを付ける工程は、前記表示と整列させたクリンプ付け用具を用いて実現される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
或る方法によって加工された生体標本において、
ａ．前記生体標本を、変形可能な壁を備えている極低温容器内部に設置する工程と、
ｂ．前記変形可能な壁に、当該壁が前記生体標本に接触するようにクリンプを付ける工程と、
ｃ．前記変更可能な壁を、前記生体標本がガラス化されるように、極低温物質と接触させる工程と、から成る方法によって処理された生体標本。
【請求項２８】
前記変形可能な壁はニチノールを含み、前記生体標本は、前記変更可能な壁を大凡体温の水槽に浸漬することによって前記生体標本を温める工程で更に処理され、その結果、前記生体標本は、前記極低温容器から前記変形可能な壁に接触することなく取り出せるように、前記変更可能な壁が記憶形状に変態する、請求項２７に記載の生体標本。
【請求項２９】
前記変形可能な壁の内部表面は、前記変形可能な壁がその記憶形状に変態したときに前記生体標本が前記壁から浮かせられるように、テフロン（登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）又は類似物で被覆されている、請求項２８に記載の生体標本。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４Ａ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４Ａ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１１−５１４８８２（Ｐ２０１１−５１４８８２Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４１２１（Ｐ２０１０−５３４１２１）
【出願日】平成２０年１１月１１日（２００８．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４７０８
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８０６４３２２）ヴァンス プロダクツ インコーポレイテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＮＣＥ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１１日（２００８．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４７０８
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８０６４３２２）ヴァンス プロダクツ インコーポレイテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＮＣＥ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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