循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）：転移癌患者における増悪までの時間、生存および療法に対する応答の早期評価
ＣＴＣの存在および数に基づくＭＢＣを有する患者における疾患増悪までの時間、全体生存および療法に対する応答を予想することに予測有用性を有する癌試験。Cell Spotter（登録商標）Systemを用いて血中のＣＴＣを計数する。該システムは上皮細胞を免疫磁気的に濃縮し、該細胞を蛍光標識し、ＣＴＣを同定および定量する。末梢血液腫瘍負荷で検出されたＣＴＣの絶対数は、一部、生存、増悪までの時間および療法までの応答の予測における要素である。患者の生存の平均時間は、７.５ｍｌの血液当たり５のＣＴＣの閾値数に依存する。転移癌におけるＣＴＣの検出は、転移癌を有する患者における新規な診断要素を表し、血液中の腫瘍細胞の存在の生物学的役割を示唆し、ＣＴＣの検出が将来的な療法臨床試験の適当な代理マーカーと考えられ得ることを示している。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、すべて出典明示して本明細書の一部とみなす、２００３年２月２７日に出願された米国仮特許出願60／450,519号および２００３年１１月２５日に出願された米国仮特許出願60／524,759号に対して優先権を主張する非仮特許出願である。
【０００２】
背景
発明の分野
本発明は、一般的に、血中の形態的に完全な（intact）循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の存在に基づく、転移癌患者の癌予測および生存に関する。より詳細には、転移性乳癌患者の７.５ｍｌの血液中の循環腫瘍細胞の存在を疾患増悪までの時間および生存性と相関付ける、診断方法、試薬および装置を記載する。循環腫瘍細胞は、約５ないし５０ｍｌの末梢血液中の１または２の癌細胞を単離およびイメージングすることができる高感度な方法によって決定し、腫瘍細胞の数のレベルと治療の間の腫瘍細胞の数における増加を、増悪までの時間、死亡までの時間および療法に対する応答と相関付ける。
【０００３】
背景技術
癌患者の治療および管理を改善するための努力にもかかわらず、癌患者における生存は多くの癌のタイプについて過去２０年間にわたって改善されていない。したがって、大部分の癌患者は原発性癌によって殺されないが、その代わりに転移：元の腫瘍から離脱し、体中を移動し、遠位まで移動する場合もある悪性細胞によって確立された複数の広範に拡がる腫瘍コロニー、に倒れる。癌における最も首尾のよい療法ストラテジーは、早期の検出およびなお組織は制限されるが腫瘍の外科的除去である。癌の早期検出は、癌によっては実行可能であることが証明されており、特に子宮頸癌におけるＰＡＰスメア、乳癌におけるマンモグラフィーおよび前立腺癌における血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のような適当な診断テストが存在する場合には実行可能であることが証明されている。しかしながら、早期ステージに検出される多くの癌は外科的切除の前に微小転移を確立している。したがって、癌の悪性の可能性の早期および正確な決定は、適当な療法の選択に重要である。
【０００４】
最適な療法は、診断および予測情報の組合せに基づくであろう。正確および再現性のある診断テストは、生存に関する詳細な情報を提供するであろう予測評価と一緒に、特定の癌の転移性質に関する詳細な情報を提供する必要がある。
【０００５】
適当に設計された予測テストは、危険性および生存の確率に関する情報を医師に与え、この情報はかわって、不必要な治療を授かることに利益がないことを患者に与える。選択した療法が予測テストに基づいて有効であるという知識から、患者のモラルも持ち上げられるであろう。そのようなテストに関連する費用の節約は、医師が有効でない療法を置き換える理論的根拠が提供されるため、有意義になり得る。生存に焦点を合わせた転移癌の治療および検出における適当に開発された診断および予測データバンクは、明らかに、医学に対して膨大な恩恵を提供するであろう（米国特許第6,063,586号）。
【０００６】
原発性癌が十分に早期に検出されれば、それは外科的手術、放射または化学療法、あるいはこれらの治療の幾つかの組合せによって排除し得る場合がある。
【０００７】
残念ながら、転移コロニーは検出および除去するのが困難であり、それらのすべてを首尾良く治療するのは不可能な場合もある。したがって、臨床的見地からは、転移は、癌の本来的な増悪における決定的な事象と考えることができる。さらに、転移する能力は、悪性腫瘍を独特に特徴付ける性質である。
【０００８】
可用性腫瘍抗原：
癌および癌転移の複雑性ならびに長年にわたる癌患者を治療することにおける失敗に基づいて、治療を案内するための診断テストを開発し、転移または再発に対するかかる治療の効果をモニターすることに多くの試みがなされている。
【０００９】
診断腫瘍学に有用なテストを開発する最初の試みのうちの１は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の処方であった。この抗原は、胎児細胞に見られ、ある種の癌における腫瘍細胞において再度見られる。ＣＥＡを試験する有用性ならびに前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１５.３、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ２７.２９、可溶性細胞残渣として組織試料または血液のいずれかに見出されるｐ２７のごとき他の多くの"腫瘍"抗原の有用性を評価するために膨大な努力がなされている。これらおよび他の残渣抗原は、循環および非−循環の癌細胞の両方の破壊から由来すると考えられ、したがって、それらの存在が常に転移の可能性を、特にアポトティック状態（apoptotic state）にある間に細胞が破裂する場合は、反映しているとは限らない。
【００１０】
癌患者における腫瘍増悪を予測するために用いるさらなる試験は、バイオプシー収集した腫瘍試料中のテロメラーゼ活性のような酵素インデックスを、好ましくないまたは好ましい予測の指標と関連付けるのに焦点をあてている（米国特許第5,693,474号；米国特許第5,639,613号）。このタイプの分析において酵素活性を評価することには、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング分析のような時間のかかる研究室手順が含まれ得る。また、腫瘍の起源に基づく信号対ノイズ比および感度には変動がある。これらの欠点にも関わらず、血中の特異的可溶性腫瘍マーカーは、治療の早期に、治療ストラテジーを開発するための迅速かつ有効なアプローチを提供し得る。例えば、転移乳癌を有する患者における血清ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび血清ＣＡ１５−３の検出は、転移乳癌の予測ファクターとなることが示されている（Ali S. M., Leitzel K., Chinchilli V. M., Engle L., Demers L., Harvey H. A., Carney W., Allard J. W.およびLipton A., Relationship of SerumHER-2/neu and Serum CA15-3 in Patients with Metastatic Breast Cancer, Clinical Chemistry, 48(8): 1314-1320(2002)).ＨＥＲ−２／ｎｅｕの増加は、ホルモン療法に対する応答の低下を生じ、ホルモン受容体−陽性転移乳癌に対する応答を予想するのに重要な予想ファクターである。ＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーン産物が関係する悪性腫瘍において、レベルの上昇に基づく療法をモニターし、または危険性を評価する方法が記載されている（米国特許第5,876,712号）。しかしながら、両方の場合において、緩解の間のまたは健全な正常における場合でさえ、基底レベルは比較的高く、患者において見出された濃度と重複する場合があり、したがって多重の試験およびモニターを行って、患者依存性のベースラインおよびカットオフ・レベルを確立する必要がある。
【００１１】
前立腺癌においては、血清中のＰＳＡレベルが早期検出に有用であることが証明されている。追跡医師検査（デジタル直腸検査）およびバイオプシーと共に使用する場合、ＰＳＡテストはそれが最善に治療される場合、早期ステージでの前立腺癌の改善された検出を有する。
【００１２】
しかしながら、ＰＳＡまたは関連するＰＳＭＡ試験は、望まれるものを多くを残す。例えば、ＰＳＡの上昇したレベルは、疾患のステージと弱く相関し、腫瘍の転移可能性の信頼し得るインジケーターとなるように思えない。これは、一部はＰＳＡが正常前立腺組織および良性の前立腺過形成（ＢＨＰ）組織の成分であるという事実に起因する。さらに、申し立てられた局在化された前立腺癌および対応する低血清ＰＳＡ濃度を有する患者の約３０％は、転移疾患を有し得る（Morenoら, Cancer Research, 52: 6110 (1992))。
【００１３】
遺伝マーカー：
悪性前立腺癌細胞の存在を判定する１のアプローチは、血中のＰＳＡからのメッセンジャーＲＮＡの発現について試験されている。これは、血液試料から全ｍＲＮＡを単離し、逆転写ＰＣＲを行うという面倒な手順を介して行われている。血中の離脱した細胞の存在といずれの患者がより活発な治療からの恩恵を受けるかを同定する能力との間の有意な相関は全く記載されていない（Gomella LG., J of Urology, 158: 326-337 (1997))。また、この技術を用いて、偽陽性が観察される場合もある。追加された欠点も存在する。それは、試料サイズに基づくこの技術の感度に対して、有限の実際的な限界が存在するということである。典型的には、試験は、シグナルを検出する前に、１腫瘍細胞／血液０.１ｍｌ（血液１ｍｌ中の約１０の腫瘍細胞）の実際的感度下限に対応する、干渉する赤血球から単離した１０５ないし１０６細胞に対して行う。より高い感度は、血液から単離された腫瘍細胞中のｈＫ２ ＲＮＡを検出することによって示唆されている（米国特許第6,479,263号；米国特許第6,235,486号）。
【００１４】
血液ベースのヌクレオチドマーカーを用いる定性的ＲＴ−ＰＣＲに基づく実験を用いて、操作前血液中の陽性ＣＥＡ ｍＲＮＡを有する患者に対しての無疾患生存の可能性はＣＥＡ ｍＲＮＡについて陰性の患者のものよりも悪いことが示されている（Hardingham J. E., Hewett P. J., Sage R. E., Finch J. L., Nuttat J. D., Kotasel D.およびDovrovic A., Molecular detection of blood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease, Int. J. Cancer, 89: 8-13(2000): Taniguchi T., Makino M., Suzuki K., Kaibara N., Prognostic significance of reverse transcriptase-polymerase chain reaction measurement of carcinoembryonic antigen mRNA levels in tumor drainage blood and peripheral blood of patients with colorectal carcinoma, Cancer 89: 970-976 (2000))。この終点の予測値はＣＥＡ ｍＲＮＡレベルに依存し、それはＧ−ＣＳＦ、サイトカイン、ステロイドまたは環境因子によって、健全な個人においても誘導される。したがって、ＣＥＡ ｍＲＮＡマーカーは特異性を欠いており、循環結腸直腸癌細胞に対して明らかにユニークではない。ステージＩＩ−ＩＶ患者における悪性メラノーマのマーカーとしての末梢血液および骨髄中のチロシナーゼｍＲＮＡを含意している報告もある（Ghossein R. A., Coit D., Brennan M., Zhang Z. F., Wang Y., Bhattacharya S., Houghton A.およびRosai J., Prognostic significance of peripheral blood and bone marrow tyrosinase messenger RNA in malignant melanoma, Clin. Cancer Res., 4 (2): 419-428 (1998))。ここでも、可溶性腫瘍マーカーとしてチロシナーゼｍＲＮＡを用いることが、転移可能性および患者生存のインジケーターとして可溶性腫瘍抗原の以前に引用した限界にあてられている。
【００１５】
実験条件下では外観上は予想的であるが、前記および他の実験は、長期の追跡期間でのまたは満足のいく特異性での一定のデータを提供していない。したがって、これらの努力は、血中の抗原に対するｍＲＮＡの外観が一般的に大部分の癌に対して予測的でなく、しかも患者にほとんど希望がない場合に検出される場合があるため、幾分役に立たないことを証明している。
【００１６】
これにもかかわらず、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、循環腫瘍細胞の定量的検出と患者予測とを相関付けると報告された唯一の方法となっている。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、大腸結腸癌患者の末梢血液中のＣＥＡ ｍＲＮＡを定量化するために使用されている（Ito S., Nakanishi H., Hirai T., Kato T., Kodera Y., Feng Z., Kasai Y., Ito K., Akiyama S., Nakao A.およびTatematsu M., Quantitative detection of CEA expressing free tumor cells in the peripheral blood of colorectal cancer patients during surgery with real-time RT-PCR on a Light Cycler, Cancer Letters, 183: 195-203 (2002)）。カプラン・メイヤー型分析（Kaplan-Meier type analysis）を用いると、操作後血液中に陽性ＣＥＡ ｍＲＮＡを有する患者の無増悪生存は、ＣＥＡ ｍＲＮＡについて陰性である場合よりも有意に短い。これらの結果は、腫瘍細胞は血流に分離し（おそらくは、外科的手順の間に、または、操作時にすでに存在していた微小転移から）、直腸結腸癌を有する患者における乏しい患者成果を生じたことを示唆している。このアッセイの感度は、感度において従来のＲＴ−ＰＣＲと同様の再現性よい検出可能なレンジを提供した。言及したように、これらの検出レンジは、多数の腫瘍細胞への増幅した産物の信じられない変換に基づく。外挿した細胞カウントは、転移増幅することができない損傷したＣＴＣも含み得る。さらに、ＰＣＲ−ベースのアッセイは、腫瘍細胞を定量化できないということと共に、可能性のある試料コンタミネーションによって制限される。最も重要なことには、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、細胞質酵素および循環腫瘍抗原に基づく方法は、仮定したＣＴＣの転移可能性の基礎をなす構造一体性を確認する本質的形態情報を提供できず、したがって、その一部分を本発明において具体化する高感度イメージング法よりも機能的に信頼性の低い代理アッセイを構成する。
【００１７】
癌の検出および予測における完全な腫瘍細胞の評価：
血中における完全な腫瘍細胞の検出は、その原発性腫瘍の切除を受けた癌患者における再発転移疾患への直接的な関連を提供する。残念ながら、悪性細胞の同じ広がりは、従来の腫瘍ステージ検査（tumor staging)手順によって見落とすべく続く。最近の研究は、癌患者の骨髄中の単一のカルシノーマ細胞の存在が転移再発の独立した予測ファクターであることを示している（Diel IJ, Kaufman M, Goerner R, Costa SD, Kaul S, Bastert G. Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer: a prognostic factor for distant metastasis. J Clin Oncol, 10: 1534-1539, 1992）。しかし、これらの侵入的技術は、血中のばら播かれた上皮腫瘍細胞の検出と比較して、ルーチンまたは多重の臨床アッセイには望ましくないまたは受け入れられないように考えられる。
【００１８】
別のアプローチは免疫磁気分離技術を取込み、完全な循環癌細胞の決定的な検出におけるより大きな感度および特異性を提供する。このシンプルかつ感度の高い診断ツールは、記載されているように（米国特許第6,365,362号；米国特許第6,551,843号；米国特許第6,623,982号；米国特許第6,620,627号；米国特許第6,645,731号；WO 02/077604；W0 03/065042；およびWO 03/019141）本願発明において用いて、７.５ないし３０ｍｌの血液中の５以上の腫瘍細胞の閾値レベルに基づく個々の患者の統計学的生存可能性と相関する（１ないし２の腫瘍細胞は所定の個人の循環中の約３０００ないし４０００の合計腫瘍細胞に相当する）。
【００１９】
この診断ツールを用いれば、癌患者からの血液試料（WO 03/018757）を、例えばＥｐＣＡＭのような上皮細胞抗原に対して向けられた抗体でコートした磁性ビーズと一緒にインキュベートする。抗−ＥｐＣＡＭコート磁性ナノ粒子で標識した後に、磁気的に標識した細胞を磁気分離器を用いて単離する。免疫磁気的に富む画分は、下流の免疫細胞化学分析用またはイメージサイトメトリー、例えばCell Spotter（登録商標） System（Immunicon Corp., PA）用にさらに処理する。磁性画分は、下流の免疫細胞化学分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、フローサイトメトリー、または他の型のイメージサイトメトリー用にも用い得る。
【００２０】
Cell Spotter（登録商標） Systemは、免疫磁気的な選択および分離を利用して全血試料中に存在するいずれの上皮細胞をも高度に富化および濃縮する。捕捉された細胞は白血球特異的マーカーでおよび１またはそれを超える腫瘍細胞特異的蛍光モノクローナル抗体で検出可能に標識して、捕捉された ＣＴＣの同定および計数を可能とし、ならびに多義的装置またはコンタミネーションしている非標的細胞からの目視識別を可能とする。７.５−３０ｍｌの血液当たり１または２の上皮細胞という並はずれた感度では、このアッセイにより低い腫瘍細胞の大きさの早期ステージにおいても腫瘍細胞の検出が許容される。本発明の形態はCell Spotter（登録商標） Systemに限定されるものではなく、匹敵する感度および特異性のいずれの単離およびイメージング・プロトコールをも含む。
【００２１】
現在利用し得る予測プロトコールは、転移乳癌（ＭＢＣ）のごとき癌を有する患者における無増悪生存期間または生存期間を予想するためにＣＴＣを相関付けるための堅実な信頼し得る手段を実証していない。したがって、ＭＢＣのみならず一般に転移癌における転移可能性を有する癌細胞の正確な検出に対する明らかな要望が存在する。また、この要望は、所定の患者に対して最も有効な療法を選択する要望によって強調される。
【００２２】
発明の概要
本発明は、転移癌を有する患者における循環上皮細胞の絶対数、変化、またはその両方に基づく、疾患増悪までの時間、生存および療法に対する応答を評価することにおける、Cell Spotter（登録商標） Systemのごとき診断ツールを取り込んでいる癌を予想するための方法および手段である。
当該システムは、上皮細胞を免疫磁気的に濃縮し、細胞を蛍光標識し、陽性計数につきＣＴＣを同定および定量化する。細胞カウントの統計解析により、生存を予想する。
【００２３】
より詳細には、本発明は、ＭＢＣにおける患者生存、疾患増悪までの時間および療法に対する応答を評価するための装置、方法およびキットを提供する。生存の予想は、死亡および疾患増悪までの経時的な血中の循環腫瘍細胞の数の閾値比較に基づく。癌を有すると診断された患者の長期間の追跡研究の統計解析により、血中に見出されたＣＴＣの数の閾値および生存の予想を確立した。ＣＴＣの不存在は、５よりも少ない形態学的に完全なＣＴＣと定義する。生存を予想するためのＣＴＣの存在または不存在は、治療を選択するのに有用である。例えば、転移乳癌について以前に未治療の女性におけるＣＴＣの不存在を用いて、より少ない副作用およびより高いクウォリティー・オブ・ライフをもってホルモン療法と、より高い副作用を有するが高危険性集団の中でより有効に生存を延長し得る化学療法とから選択し得るであろう。したがって、本発明は、転移乳癌を有する女性におけるＣＴＣの検出における予後役割を有する。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、患者生存の早期予想インジケーターとしての循環腫瘍細胞の検出を提供する。
本発明の最も広い態様においては、一貫性が維持される限り、試料の収集および操作に制限は存在しない。したがって、細胞は当該技術分野で知られている方法によって得ることができる。
【００２５】
血中のＣＴＣを単離し、富化しおよび分析するためのいずれかの有効な機構が適当であるが、循環腫瘍細胞を収集する１の方法は、免疫磁気的富化技術、免疫蛍光標識技術と最初の血液引き出し後の適当な分析プラットフォームとを結合する。関連した試験は、全血試料中のこれら希薄細胞を検出するための、および、上皮起源の悪性腫瘍における疾患の臨床過程におけるそれらの役割を調べるための感度および特異性を有している。全血試料から感度および特異性をもって希薄細胞が検出され、本発明の診断アッセイにおいて、すなわち悪性腫瘍における疾患の臨床過程を予測することにおいてそれらを収集し、使用することが許容される。
【００２６】
本技術を用いて、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が検出可能な量で血中に存在することが示されている。このことは、癌患者の末梢循環における上皮起源の細胞の意義を調べるためのツールを創製した（Racila E., Euhus D., Weiss A. J., Rao C., McConnell J., Terstappen L. W. M. M.およびUhr J. W., Detection and characterization of carcinoma cells in the blood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4589-4594 (1998)）。この実験は、これらの血液−骨細胞が癌の病態生理学において極めて重要な役割を有し得ることを実証した。血液５ｍｌ当たり１の上皮細胞の検出感度を有すれば、アッセイは、免疫磁気試料富化および蛍光モノクローナル抗体染色につづいて、試料の迅速および高感度分析のためのフローサイトメトリーを取り込む。結果は、乳房の転移カルシノーマについて治療した８の患者の末梢血液中の上皮細胞の数が疾患の増悪および療法に対する応答と相関することを示す。局在化した疾患を有する１４の患者のうちの１３、リンパ節巻添え(involvement)を有する５の患者のうちの５、および遠位転移を有する１１の患者のうちの１１で、上皮細胞が末梢血液中に見出された。上皮細胞の数は、広範囲な疾患を有する患者におけるよりも顕著に多かった。
【００２７】
免疫磁気的に富化した試料をCell Spotter（登録商標） Systemによって分析するように、アッセイをイメージサイトメトリー分析に形成した（実施例を参照されたい）。これは、蛍光ベースの顕微鏡イメージ分析システムであり、これは、フローサイトメトリー分析と対比して、事象の視覚化および形態的特徴の評価を許容してさらに対象を同定することを許容する。
【００２８】
Cell Spotter（登録商標） Systemとは、血液からの単離した細胞を自動的に計数するための自動蛍光顕微鏡システムをいう。このシステムは、一体化されたコンピュータ制御蛍光顕微鏡およびディスポーザブルな試料カートリッジを支持する磁気くびきアセンブリーを有する自動ステージを含む。磁気くびきは、試料チャンバー内の鉄標識した候補腫瘍細胞を顕微鏡観察するために試料カートリッジの上方の観察表面に磁気的に局在し得るように設計されている。ソフトウェアにより、サイトケラチンに対する抗体で標識され、上皮起源を有する疑わしい癌細胞は、最終的な選抜のためにオペレーターに示される。
【００２９】
Cell Spotter（登録商標） System用の腫瘍細胞の単離は当該技術分野において知られているいずれの手段によってもなし得るが、１の形態では７.５ｍｌの全血を用いて腫瘍細胞を単離するためにImmunicon CellPrep（商品商標） Systemを用いる。上皮細胞特異的な磁気粒子を添加し、２０分間インキュベートする。磁気分離後に、免疫磁気結合した抗体に結合した細胞を試験管の壁に磁気的に保持する。ついで、結合しなかった試料を吸引し、等張溶液を添加して試料を再懸濁する。核酸色素、サイトケラチン（上皮細胞のマーカー）に対するモノクローナル抗体およびＣＤ４５（広スペクトル白血球マーカー）を試料とインキュベートする。磁気分離後に、結合しなかった画分を再度吸引し、結合および標識した細胞を０.２ｍｌの等張溶液に再懸濁する。Cell Spotter（登録商標） Systemにおいて蛍光顕微鏡検鏡するために、試料を細胞提示チャンバーに懸濁し、磁場が磁気標識細胞に向いている磁気デバイスに入れる。細胞はCell Spotter（登録商標） Systemで自動的に同定され、チェックリスト計数のためにオペレーターに候補循環腫瘍細胞が示される。
【００３０】
計数チェックリストは、完全細胞を構成する所定の形態基準からなる（実施例１を参照されたい）。
【００３１】
癌生存における予測因子として完全な循環腫瘍細胞を用いることと一緒に、Cell Spotter（登録商標） Systemの診断可能性は、適当な治療を決定するための迅速かつ高感度な方法を提供し得る。したがって、本発明においては、装置、方法およびキットが、生存可能性の予想評価のための転移および原発性患者の血液に落とされた腫瘍細胞の迅速な計数および特徴付けのために提供される。
【００３２】
本発明の方法は、好ましいまたは好ましくない生存を評価し、予想が好ましいものである場合に有害な副作用を生じ得る必要でない療法を防止することにさえ有用である。したがって、本発明は、広範な種々の癌のいずれの予想にも使用し得、かかる癌には限定するものではないが、以下の強調する癌を含む固形癌および白血病が含まれる：Apudo細胞腫、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心臓病、癌腫（すなわち、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、Brown-Pearce、腺管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮癌および移行上皮癌）、造血障害、白血病（すなわち、Ｂ細胞型白血病、混合型白血病、ヌル細胞型白血病、Ｔ細胞型白血病、T細胞性慢性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、リンパ球性急性白血病、リンパ球性慢性白血病、肥満細胞型白血病および骨髄性白血球）、悪性組織球症、ホジキン病、免疫増殖性小腸疾患、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、細網内皮症、メラノーマ、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、骨線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、リンパ腺腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、真珠腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝細胞癌、汗腺腫、膵島細胞腫、icydig細胞腫、乳頭腫、Sertoli細胞腫、莢膜細胞腫、平滑筋腫、子宮筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経節腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経細胞腫、傍神経節腫、非クロム親和傍神経筋腫、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮細胞腫、血管腫、血管周皮腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、嚢胞肉腫、葉状嚢胞肉腫、線維肉腫、血管肉腫、子宮肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、myoswarcoma、粘液肉腫、卵巣カルシノーマ、横紋筋肉腫、肉腫（すなわち、ユーイング実験、カポシおよびマスト細胞）、新生物（すなわち、骨、胸部、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭部および首部、中枢神経系、聴覚、骨盤、気道および尿生殖器）、神経繊維腫症および子宮頸部形成異常。
【００３３】
以下の実施例は、患者からの血液中のＣＴＣの予報および予想値を説明する。以下の実施例は説明のために提供するものであり、いかなる場合においても本発明の範囲を限定するものでないことを注記しておく。
【００３４】
実施例１
Cell Prep（商品商標）を用いた循環サイトケラチン陽性細胞の計数
サイトケラチン陽性細胞は、全血の７.５ｍｌ試料を用いてCell Prep（商品商標） Systemによって単離する。上皮細胞特異的な免疫磁気流体を添加し、２０分間インキュベートする。２０分間の磁気分離後に、免疫磁気結合した抗体に結合した細胞を試験管の壁に磁気的に保持する。ついで、結合しなかった試料を吸引し、等張溶液を添加して試料を再懸濁する。核酸色素、サイトケラチン（上皮細胞のマーカー）に対するモノクローナル抗体およびＣＤ４５（広スペクトルの白血球マーカー）を試料と一緒に１５分間インキュベートする。磁気分離後に、結合しなかった画分を再度吸引し、結合および標識した細胞を０.２ｍｌの等張溶液に再懸濁する。試料を、Cell Spotter（登録商標） Systemにおいて蛍光顕微鏡検鏡するために、細胞提示チャンバーに懸濁し、その磁場が磁気標識した細胞に向いている磁気装置に入れる。細胞はCell Spotter（登録商標） Systemで自動的に同定され；当該システムによって対照細胞が計数され；一方で、示したチェックリストを用いる計数のために操作者に候補循環癌細胞が提示される（図１）。
【００３５】
実施例２
腫瘍負荷の評価：ラジオグラフィーイメージ分析とＣＴＣの絶対数との間の比較
転移病変のラジオグラフィー測定が最近使用されて、転移疾患を有する癌患者における腫瘍負荷が評価されている。一般的に、最大の病変を測定し、合算して腫瘍負荷が得られる。乳癌患者における肝臓転移の二次元測定の例を図２Ａに図示する。血流中の腫瘍負荷を測定する必要性を図示するモデルを、実際の活性腫瘍負荷の測定として、したがって疾患の全体活性のより良好な測定として図２Ｂに図示する。ＣＴＣの絶対数がイメージングによって測定した腫瘍の寸法と相関するかを決定するために、ＭＢＣを有する患者における予想実験を行った。
【００３６】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、測定可能なＭＢＣを有する６９の患者からの７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。腫瘍負荷は、療法を開始する前の８の測定可能な病変にのぼる二次元ラジオグラフィー測定によって評価した。腫瘍負荷は、個々の測定（ｍｍ２）を付加することによって決定した。ＣＴＣは、療法の開始前に引き出した血液中で計数した。
【００３７】
図３は６９の患者における７.５ｍｌ中のＣＴＣの数−対−腫瘍測定の二次元合算を示す。図３から、腫瘍のサイズと血中の腫瘍細胞の絶対数との間に相関は存在しない。イメージングによって測定して大きな腫瘍を有する何人かの患者は、少数のＣＴＣを有するかまたはその反対であった。
【００３８】
したがって、ラジオグラフィーによって測定した腫瘍負荷は、血中に存在する腫瘍細胞の絶対数と相関しない。
【００３９】
実施例３
腫瘍負荷の評価：ラジオグラフィーイメージにおける変化とＣＴＣの絶対数における変化との間の比較
ラジオグラフィーイメージングは、特定の疾患が治療に応答しているか、安定化しているか、または増悪しているかを評価するための最近の標準である。ラジオグラフィー測定間の間隔は、意味のある結果を得るために少なくとも３ヶ月としなければならない。したがって、治療サイクルの間の早期の療法に対する応答を予想し得る試験は、転移疾患について治療した患者の管理を改善して、クウォリティー・オブ・ライフを潜在的に向上し、かつ、生存を潜在的に改善し得るであろう。この実験においては、ＭＢＣについて新たな系統の治療を開始した患者を評価して、ＣＴＣの数における変化がイメージングによって測定した患者状態における変化と相関するかを決定した。
【００４０】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、新たな療法を開始することに関して、および治療サイクルの間の種々の時点で、ＭＢＣ患者における７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。ラジオグラフィー測定は療法開始前、療法開始１０−１２週後および治療サイクル完了後（療法開始約６月後）に、または最初になろうがなかろうが、患者が療法で増悪した時点に行った。
【００４１】
イメージ分析から、１４の患者において部分的な応答が見出され（１７のデータセグメント）、ＣＴＣはすべての症例において減少したかまたは検出不可能のままであった（図４を参照されたい）。イメージングによって安定な疾患は、３０の患者において見出された（３７のデータセグメント）。ＣＴＣはすべての症例において減少したかまたは検出不可能のままであった（図４を参照されたい）。イメージングによる疾患増悪は、１４の患者において見出された（１５のデータセグメント）。ＣＴＣは１５の症例のうちの７において増加した。他の８の症例では、いずれの時点においてもＣＴＣは全く検出されなかった。
【００４２】
ＣＴＣの増加は、疾患増悪を有する患者においてのみ観察された（１００％）。ＣＴＣの減少は部分的応答ないし安定な疾患を有する患者においてのみ観察された（１００％）。部分的応答または安定疾患を有する患者においては、６１の症例のうちの５４においてＣＴＣは両方の時点においても全く検出されなかった（８９％）。
【００４３】
実施例４
治療の案内としての、ＭＢＣについて処理した患者におけるＣＴＣの数における傾向
ＭＢＣを有する患者における研究を行い、ＣＴＣの数の変化における明らかな傾向がＭＢＣについて治療した患者において観察し得るか、および、ＭＢＣを有する患者の治療の最適化に治療する医師を案内するために、かかる傾向に単純なルールを適用し得るかを決定した。
【００４４】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。ＭＢＣに対して新たな系統の療法を開始した８１の患者を当該研究に登録した。ＣＴＣは、療法を開始する前におよびその後はほぼ毎月吸い出した血液中で計数した。
【００４５】
８１の患者のうちの７６（９４％）において、ＣＴＣの数における明らかな傾向が観察された。療法の過程の間は、５０％の患者の血液７.５ｍｌ当たりにＣＴＣの数が検出できないか、または５未満のＣＴＣが残存していた。典型的な例を図６Ａに示す。ＣＴＣの数は２２％の患者において療法の過程の間に減少した。典型的な例を図６Ｂに示す。６％の患者においては、ＣＴＣの数における減少につづいて療法の過程の間に増加することが観察された。典型的な例を図６Ｃに示す。１６％の患者においては、療法の過程の間にＣＴＣの数が増加した。典型的な例を図６Ｄに示す。４２の例において、各血液の引き出し時に、２の血液試料を調製し、分析した。最初の時点に引き出した第１の試験管および追跡時点に引き出した第１の試験管を用いた結果を、各時点に引き出した第２の試験管を用いた結果と比較した。これらの例のうちの１のみにおいて、ＣＴＣの数における変化が、引き出した第１の試験管と引き出した第２の試験管の間で（あるいは、二重で）異なっていた（９８％の合致）。この場合においては、引き出した第１の血液からの両方の試験管ともに０のＣＴＣを有していたが、引き出した第２の血液に関しては、１の試験管が５のＣＴＣを有し（カットオフの下）、第２の試験管が６のＣＴＣ（カットオフの上）を有していた。ＣＴＣ測定の再現性の比較において、同じフィルムを２の異なるエキスパート放射線技師によって判読させた場合のラジオグラフィーイメージングの判読者間変動は、わずか８１％の合致しか生じなかった。さらに、１４６のイメージング・セグメントのセットにおける２の放射線技師間の合致は、増悪−対−無増悪を測定した場合は８５％であり、増悪、安定な疾患および部分的応答を測定した場合にはわずか５８％まで低下した。それに対して、２の異なる放射線技師によって同じデータセットに対してＣＴＣ測定の分析を行うと、１００％の合致を生じた。
【００４６】
したがって、ＭＢＣについて治療した患者におけるＣＴＣの検出およびモニタリングは、ラジオグラフィーイメージングよりも、療法に対する応答を測定する方がより再現性のよい手法である。
【００４７】
実施例５
療法の開始前のＰＦＳおよびＯＳの予測
療法の開始前のＣＴＣレベルを無増悪生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）と関連付ける実験を行い、それによって＞５ ＣＴＣ／７.５ｍｌの閾値を用いた。
【００４８】
測定し得るＭＢＣを有する１１７の患者を、新たな系列の治療を開始する前のおよび６ヶ月にのぼるつづく１ヶ月間隔の７.５ｍｌの血液中のＣＴＣについて試験した。いずれかの型の療法およびいずれかの系統の療法に入る患者を当該試行に含めた。疾患の増悪または応答は、各患者の部位において医師によって評価した。
【００４９】
図７に示すごとく、中央値ＰＦＳはＣＴＣレベルが上昇するに従って減少し、５のＣＴＣで平行になるプラトーに達した（水平線）。中央ＰＦＳはすべての患者についてほぼ５.９ヶ月であった（黒点）。陽性患者についての中央ＰＦＳにおける変化およびに基づき、Ｃｏｘハザード比に基づいて、＞５ ＣＴＣのカットオフをすべてのつづく分析に用いた。
【００５０】
図８は、ベースライン血液引き抜き中で測定されたＣＴＣの数を用いた無増悪生存（ＰＳＦ）および全生存（ＯＳ）のカプラン・メイヤー分析を示している。１７７の患者において、中央ＰＦＳ時間はほぼ５.０ヶ月であった。ベースラインにて＞５ ＣＴＣ／７.５ｍｌの血液を有する患者は、＜５ ＣＴＣを有する患者よりも有意に短いＰＳＦを有していた（各々、ほぼ２.７ヶ月−対−７.０ヶ月）。全体生存（ＯＳ）は、＞５ ＣＴＣ−対−＜５ ＣＴＣを有する患者について、各々、１０.１ヶ月−対−＞１８ヶ月の中央ＯＳを有して同じ傾向を反映した。
【００５１】
新しい系統の療法を開始する前のＣＴＣの数の測定は、患者がその療法において増悪するまでの時間を予想し、生存時間を予想する。この予想能力に基づいて、ベースラインにおけるＣＴＣの検出および測定は適当な治療の選択において有用であろう情報を医師に提供する。また、ＰＦＳおよびＯＳの観点から患者を高危険性および低危険性に階層化する能力は、療法試行に入れる適当な患者を選択するのに非常に有用となり得る。潜在的に高い毒性を有する新規な薬剤に関しては、乏しい予想因子を有する患者はより適当な標的集団となり得る。それに対して、最小限の毒性を有する薬剤および将来有望な療法効力は、好ましい予想因子を有する患者に向けてより適当に標的化し得る。
【００５２】
実施例６
療法の開始後のＰＦＳおよびＯＳの予想
療法の開始後のＣＴＣレベルを無増悪生存（ＰＦＳ）および全体生存（ＯＳ）と関連付けるための実験を、第１の追跡時におけるＣＴＣの数を用いて行い、ＰＦＳおよびＯＳを予想した。
【００５３】
測定し得るＭＢＣを有する１６３の患者を、この分析のために評価した。血液は、新たな系統の療法の開始後平均４週間に引き出した。疾患の増悪または応答は、療法開始後１２週間の平均時間に各患者についての部位において医師によって評価した。
【００５４】
図９に示すごとく、第１の追跡時に７.５ｍｌ当たり＞５ ＣＴＣを有する４９の患者は、７.５ｍｌ当たり＜５ ＣＴＣを有する１１４の患者と比較して、有意により短い中央ＰＳＦ、各々ほぼ２.１ヶ月−対−７.０ヶ月を有していた。同じ傾向は全生存における中央値においても観察された。＞５ ＣＴＣについてほぼ８.２ヶ月−対−＜５ ＣＴＣについて＞１８ヶ月。
【００５５】
別の分析においては、本発明者らは、既知のより短いまたはより長いＰＦＳおよびＯＳを有する２の群を、減少しているＣＴＣを有する患者と比較した。詳細には、ベースラインおよび第１の追跡におけるＣＴＣが＜５である患者は、比較的長いＰＳＦおよびＯＳを有することが知られている；すなわち、これは、比較的良好な性能を有する集団であった。逆に、第１の追跡において＞５のＣＴＣレベルを有してＣＴＣがベースラインから第１の追跡までに上昇した患者は、比較的短いＰＦＳおよびＯＳを有することが知られている；すなわち、これは、比較的乏しい性能を有する集団であった。ついで、本発明者らは、これらの第１の２の群に対して、２のさらなる患者の群を比較した：最初に、＜５のレベルまで、ベースラインから第１の追跡にＣＴＣが減少した患者。第２に、本発明者らは、ベースラインから第１の追跡にＣＴＣが減少したが、第１の追跡におけるＣＴＣの数が＞５であった患者を評価した。結果を図１０に示す。ベースラインおよび第１の追跡において＜５ ＣＴＣを有する第１の対照群については、ＰＦＳおよびＯＳは予想したように比較的長かった。上昇する細胞を有する第２の対照群については、ＰＦＳおよびＯＳは、再度予想したように、比較的はるかに短かった。第１の追跡において＜５までＣＴＣが減少した患者については、ＰＦＳおよびＯＳを両方の時点において＜５ ＣＴＣを有する患者のものに近似した。逆に、ＣＴＣが減少したが、＜５まで減少しなかった患者については、その予測は上昇するＣＴＣを有する患者とちょうど同じ位に乏しかった。
【００５６】
したがって、ＣＴＣは第１の追跡において５未満まで衰えてＰＦＳおよびＯＳを最高化し、療法と関連する利益を最大限化しなければならない。
【００５７】
実施例７
ＰＦＳおよびＯＳの予報値の一変量および多変量解析
ＣＴＣレベルをＰＦＳおよびＯＳと関連する既知のパラメータとを比較するために、一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード回帰分析を行った。ＰＦＳを予測することについては、療法の系統、療法の型およびベースラインおよび第１の追跡におけるＣＴＣレベルのみが、一変量的に有意であった。ＯＳについては、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、またはその両方のいずれかが陽性である場合にＥＲ／ＰＲが陽性であると考えられる場合には、ＥＲ／ＰＲ状態も一変量的に有意であった。ＥＣＯＧガイドラインを用いて測定した患者状態も、ＥＣＯＧがEuropean Cooperative Oncology Groupパフォーマンス・ステータスにおいて０ないし５にランクされる場合にはＯＳについて一変量的に有意であった（表２）。
【００５８】
【表１】
【００５９】
ステージ＝第１の診断時における疾患ステージ、Ｐｏｓ＝陽性、Ｎｅｇ＝陰性、化学＝他の療法を含むまたは含まない化学療法、ホルモン＝ホルモン療法および／または免疫療法、ＨＲ＝Ｃｏｘハザード比、転移までの時間は連続変数として評価した。
【００６０】
パラメータを含むおよび排除する両方に対してｐ＜０.０５のストリンジェンシーレベルでの逐次Ｃｏｘ回帰を、ベースラインおよび第１の追跡におけるＣＴＣレベルについて別々に用いてＰＦＳおよびＯＳを予想した。幾つかの臨床因子は多変量分析においてその適当性を維持したが、ベースラインＣＴＣおよび第１の追跡における持続性の陽性ＣＴＣが、ＰＦＳおよびＯＳの最強の予報値として現れた（表３）。
【００６１】
【表２】
【００６２】
逐次選抜プロセスを用いる多変量Ｃｏｘ回帰分析を用いて、ＰＦＳおよびＯＳとの関連性を評価した。０.０５のストリンジェンシーレベル（ｐ−値）を、多変量分析におけるパラメータを含むおよび排除する両方に対して用いた。ＰＦＳおよびＯＳに対して統計上有意な相関を実証する各パラメータについての結果を表に要約する。ＣＴＣ数はＰＦＳおよびＯＳの最強の予報値であった。
ステージ＝第１の診断時における疾患ステージ、Ｐｏｓ＝陽性
Ｎｅｇ＝陰性、ＨＲ＝Ｃｏｘハザード比、ｎｓ＝多変量分析において有意性なし
【００６３】
実施例８
第１の追跡後のＣＴＣに基づく療法に対する応答の評価
ＭＢＣを有する患者における研究を行って、第１の追跡後のＣＴＣの数が療法に対する応答を評価するのに適当な指数を与えるのかを決定した。
【００６４】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。１６３の臨床学的に診断された転移乳癌患者を、ベースライン血液引き抜きの時点から平均４.５±２.４週間（中央値４.０週間、１.４ないし１６.９週の範囲）である第１の追跡血液引き抜きにおけるＣＴＣについて比較した。ＣＴＣは療法の開始の前およびその後ほぼ毎月に引き抜いた血液において計数した。７.５ｍｌの血液当たり５ ＣＴＣ未満の閾値を用いて、第１の追跡におけるＣＴＣカウントを、安定または応答している疾患を有する患者が増悪なしに分類され、ベースラインおよび第１の追跡からの二次元イメージング決定に基づいて臨床疾患増悪を有する患者が増悪として分類されるように、患者の臨床状況と比較した（表４）。
【００６５】
【表３】
【００６６】
第１の追跡においてアッセイした場合に５未満のＣＴＣを有する９４の患者は疾患増悪なしを示し、ＣＴＣカウントと療法に対する応答との間の一致を示した。第１の追跡においてアッセイした場合に５以上のＣＴＣを有する３５の患者は疾患増悪を示し、ここでも、第１の追跡におけるＣＴＣ数と療法に対する応答の欠如との間の一致を示した。２０の患者は疾患増悪と共に５未満のＣＴＣを示し、これは偽陰性結果を表した。これらの患者は彼らがしてきたようにＣＴＣ分析を使用することなく療法を受けることを続けるため、これらの結果は臨床的に有害とならないであろう。しかしながら、１４の患者が、増悪のラジオグラフィー証拠を有さずに第１の追跡において＞５ ＣＴＣを示し、これは偽陽性応答を示している。これらの応答はその療法から恩恵を受け得る患者における療法の変更を生じ得るが、新たな療法はこれらの患者において役に立つことが予想され、偽陽性の数は許容できる低さである。したがって、全体的にみて、第１の追跡におけるＣＴＣの計数は、評価した１６０の患者のうちの１２９において療法に対する応答の指標を与えた。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】腫瘍細胞として捕捉した対象を確認するために用いたCell Spotter（登録商標）蛍光分析プロフィール。チェックマークは、複合イメージに基づく陽性腫瘍細胞を示す。複合イメージは、上皮細胞マーカー（ＥＣ−ＰＥ）および核染色（ＮＡＤＹＥ）についての陽性選抜に由来する。陰性選抜も、白血球マーカー（Ｌ−ＡＰＣ）および対照（ＣＮＴＬ）に必要である。
【図２】腫瘍状態における変化を測定するための診断方法の比較。ラジオグラフィー・イメージングを用いた分離した病変の物理学的測定の最近の標準を示す（パネルＡ）。血中のＣＴＣの数をカウントすることによって負った転移癌における変化を評価する能力を図示するモデルを示す（パネルＢ）。
【図３】６９の患者におけるＣＴＣと腫瘍サイズとの間の相関の欠如。
【図４】療法に対して部分的な応答または安定した疾患状態を有する患者におけるＣＴＣの数における変化。すべての症例において減少または検出不可能のままであったかのいずれかのＣＴＣ。
【図５】疾患増悪を有する患者におけるＣＴＣの数における変化。疾患増悪に伴い増加したかまたは検出不可能のままであったかのいずれかのＣＴＣ。
【図６ａ】ＣＴＣの数における患者の傾向。パネルＡは７.５ｍｌの血液当たり５よりも少ないＣＴＣを有する典型的な患者を示す。パネルＢは療法の過程の間にＣＴＣの減少を有する典型的な患者を示す。
【図６ｂ】ＣＴＣの数における患者の傾向。パネルＣはＣＴＣの減少につづいて増加を有する典型的な患者を示す。パネルＤはＣＴＣにおける増加を有する典型的な患者を示す。
【図７】迅速な増悪を有するＭＢＣ患者を識別するための最適ＣＴＣカットオフの決定。解析は、トレーニング・セットに含まれる１０２の患者からのベースラインで得たＣＴＣ数を用いて行った。７.５ｍｌの血液中のＣＴＣの選択した数以上を有する患者の中央ＰＦＳは実線によって示し、選択したＣＴＣレベル未満を有する患者の中央ＰＦＳは破線によって示す。ＣＴＣが増加し、５のＣＴＣで安定になるプラトーに達する（水平線によって示した）にしたがい中央ＰＦＳは低下した。黒色の点はすべての１０２の患者に対する〜５.９ヶ月の中央ＰＦＳを示す。＞ＣＴＣ／７.５ｍｌの選択したカットオフを、すべての続く解析に用いた。
【図８】ＰＦＳおよびＯＳについてのベースラインＣＴＣの予想値。新たな系列の療法を開始する前に採取したベースライン血液を用いた、７.５ｍｌの血液中に＜５（黒線）および＞５（灰色線）のＣＴＣを有するＭＢＣ患者のＰＦＳおよびＯＳの確率を示す。ＰＦＳおよびＯＳは、ベースライン血液を採取した時点から計算した。パネルＡ：ベースラインＣＴＣカウントを用いたＰＦＳの確率（ｎ＝１７７、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＝０．０００１、ＣｏｘＨＲ＝１．９５、カイ２＝１５．３３、ｐ＝０．０００１）。パネルＢ：ベースラインＣＴＣカウントを用いたＯＳの確率（ｎ＝１０２、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＝０．０００３、ＣｏｘＨＲ＝３．９８、カイ２＝１２．６４、ｐ＝０．０００４）。
【図９】ＰＦＳおよびＯＳについて最初の追跡時におけるＣＴＣの予想値。新たな系統の療法を開始した後の最初の追跡時の７.５ｍｌの血液中に＜５（黒線）および＞５（灰色線）のＣＴＣを有するＭＢＣ患者のＰＦＳおよびＯＳの確率。ＰＦＳおよびＯＳは採取したベースライン血液の時点から計算した。パネルＡ：採取した血液の最初の追跡を用いたＰＦＳの確率（ｎ＝１６３、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＜０．０００１、ＣｏｘＨＲ＝２．７３、カイ２＝２５．２５、ｐ＜０．０００１）。パネルＢ：採取した血液の最初の追跡を用いたＯＳの確率（ｎ＝６８、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＝０．０００１、ＣｏｘＨＲ＝６．１２、カイ２＝１３．２４、ｐ＝０．０００３）。
【図１０】療法開始後（〜４−５週間後）に採取した最初の追跡血液における５未満までのＣＴＣカウントにおける減少は、改善された中央ＰＦＳおよびＯＳを予想する。両方のパネルにつき、黒色実線はベースラインおよび採取した最初の追跡血液の両方において＜５のＣＴＣを示す。黒色点線はベースラインでは最初に＞５ ＣＴＣを示したが、最初の追跡時に５未満まで減少したＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡を示す。灰色破線はベースライン時および追跡の両方において＞５ ＣＴＣを示し、灰色実線は追跡時の＞５ ＣＴＣを有するベースライン・レベルからのＣＴＣにおける増加を示す。パネルＡは患者におけるＰＦＳの確率を図示し、一方でパネルＢはＯＳの確率を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、すべて出典明示して本明細書の一部とみなす、２００３年２月２７日に出願された米国仮特許出願60／450,519号および２００３年１１月２５日に出願された米国仮特許出願60／524,759号に対して優先権を主張する非仮特許出願である。
【０００２】
背景
発明の分野
本発明は、一般的に、血中の形態的に完全な（intact）循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の存在に基づく、転移癌患者の癌予測および生存に関する。より詳細には、転移性乳癌患者の７.５ｍｌの血液中の循環腫瘍細胞の存在を疾患増悪までの時間および生存性と相関付ける、診断方法、試薬および装置を記載する。循環腫瘍細胞は、約５ないし５０ｍｌの末梢血液中の１または２の癌細胞を単離およびイメージングすることができる高感度な方法によって決定し、腫瘍細胞の数のレベルと治療の間の腫瘍細胞の数における増加を、増悪までの時間、死亡までの時間および療法に対する応答と相関付ける。
【０００３】
背景技術
癌患者の治療および管理を改善するための努力にもかかわらず、癌患者における生存は多くの癌のタイプについて過去２０年間にわたって改善されていない。したがって、大部分の癌患者は原発性癌によって殺されないが、その代わりに転移：元の腫瘍から離脱し、体中を移動し、遠位まで移動する場合もある悪性細胞によって確立された複数の広範に拡がる腫瘍コロニー、に倒れる。癌における最も首尾のよい療法ストラテジーは、早期の検出およびなお組織は制限されるが腫瘍の外科的除去である。癌の早期検出は、癌によっては実行可能であることが証明されており、特に子宮頸癌におけるＰＡＰスメア、乳癌におけるマンモグラフィーおよび前立腺癌における血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のような適当な診断テストが存在する場合には実行可能であることが証明されている。しかしながら、早期ステージに検出される多くの癌は外科的切除の前に微小転移を確立している。したがって、癌の悪性の可能性の早期および正確な決定は、適当な療法の選択に重要である。
【０００４】
最適な療法は、診断および予測情報の組合せに基づくであろう。正確および再現性のある診断テストは、生存に関する詳細な情報を提供するであろう予測評価と一緒に、特定の癌の転移性質に関する詳細な情報を提供する必要がある。
【０００５】
適当に設計された予測テストは、危険性および生存の確率に関する情報を医師に与え、この情報はかわって、不必要な治療を授かることに利益がないことを患者に与える。選択した療法が予測テストに基づいて有効であるという知識から、患者のモラルも持ち上げられるであろう。そのようなテストに関連する費用の節約は、医師が有効でない療法を置き換える理論的根拠が提供されるため、有意義になり得る。生存に焦点を合わせた転移癌の治療および検出における適当に開発された診断および予測データバンクは、明らかに、医学に対して膨大な恩恵を提供するであろう（米国特許第6,063,586号）。
【０００６】
原発性癌が十分に早期に検出されれば、それは外科的手術、放射または化学療法、あるいはこれらの治療の幾つかの組合せによって排除し得る場合がある。
【０００７】
残念ながら、転移コロニーは検出および除去するのが困難であり、それらのすべてを首尾良く治療するのは不可能な場合もある。したがって、臨床的見地からは、転移は、癌の本来的な増悪における決定的な事象と考えることができる。さらに、転移する能力は、悪性腫瘍を独特に特徴付ける性質である。
【０００８】
可用性腫瘍抗原：
癌および癌転移の複雑性ならびに長年にわたる癌患者を治療することにおける失敗に基づいて、治療を案内するための診断テストを開発し、転移または再発に対するかかる治療の効果をモニターすることに多くの試みがなされている。
【０００９】
診断腫瘍学に有用なテストを開発する最初の試みのうちの１は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の処方であった。この抗原は、胎児細胞に見られ、ある種の癌における腫瘍細胞において再度見られる。ＣＥＡを試験する有用性ならびに前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１５.３、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ２７.２９、可溶性細胞残渣として組織試料または血液のいずれかに見出されるｐ２７のごとき他の多くの"腫瘍"抗原の有用性を評価するために膨大な努力がなされている。これらおよび他の残渣抗原は、循環および非−循環の癌細胞の両方の破壊から由来すると考えられ、したがって、それらの存在が常に転移の可能性を、特にアポトティック状態（apoptotic state）にある間に細胞が破裂する場合は、反映しているとは限らない。
【００１０】
癌患者における腫瘍増悪を予測するために用いるさらなる試験は、バイオプシー収集した腫瘍試料中のテロメラーゼ活性のような酵素インデックスを、好ましくないまたは好ましい予測の指標と関連付けるのに焦点をあてている（米国特許第5,693,474号；米国特許第5,639,613号）。このタイプの分析において酵素活性を評価することには、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング分析のような時間のかかる研究室手順が含まれ得る。また、腫瘍の起源に基づく信号対ノイズ比および感度には変動がある。これらの欠点にも関わらず、血中の特異的可溶性腫瘍マーカーは、治療の早期に、治療ストラテジーを開発するための迅速かつ有効なアプローチを提供し得る。例えば、転移乳癌を有する患者における血清ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび血清ＣＡ１５−３の検出は、転移乳癌の予測ファクターとなることが示されている（Ali S. M., Leitzel K., Chinchilli V. M., Engle L., Demers L., Harvey H. A., Carney W., Allard J. W.およびLipton A., Relationship of SerumHER-2/neu and Serum CA15-3 in Patients with Metastatic Breast Cancer, Clinical Chemistry, 48(8): 1314-1320(2002)).ＨＥＲ−２／ｎｅｕの増加は、ホルモン療法に対する応答の低下を生じ、ホルモン受容体−陽性転移乳癌に対する応答を予想するのに重要な予想ファクターである。ＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーン産物が関係する悪性腫瘍において、レベルの上昇に基づく療法をモニターし、または危険性を評価する方法が記載されている（米国特許第5,876,712号）。しかしながら、両方の場合において、緩解の間のまたは健全な正常における場合でさえ、基底レベルは比較的高く、患者において見出された濃度と重複する場合があり、したがって多重の試験およびモニターを行って、患者依存性のベースラインおよびカットオフ・レベルを確立する必要がある。
【００１１】
前立腺癌においては、血清中のＰＳＡレベルが早期検出に有用であることが証明されている。追跡医師検査（デジタル直腸検査）およびバイオプシーと共に使用する場合、ＰＳＡテストはそれが最善に治療される場合、早期ステージでの前立腺癌の改善された検出を有する。
【００１２】
しかしながら、ＰＳＡまたは関連するＰＳＭＡ試験は、望まれるものを多くを残す。例えば、ＰＳＡの上昇したレベルは、疾患のステージと弱く相関し、腫瘍の転移可能性の信頼し得るインジケーターとなるように思えない。これは、一部はＰＳＡが正常前立腺組織および良性の前立腺過形成（ＢＨＰ）組織の成分であるという事実に起因する。さらに、申し立てられた局在化された前立腺癌および対応する低血清ＰＳＡ濃度を有する患者の約３０％は、転移疾患を有し得る（Morenoら, Cancer Research, 52: 6110 (1992))。
【００１３】
遺伝マーカー：
悪性前立腺癌細胞の存在を判定する１のアプローチは、血中のＰＳＡからのメッセンジャーＲＮＡの発現について試験されている。これは、血液試料から全ｍＲＮＡを単離し、逆転写ＰＣＲを行うという面倒な手順を介して行われている。血中の離脱した細胞の存在といずれの患者がより活発な治療からの恩恵を受けるかを同定する能力との間の有意な相関は全く記載されていない（Gomella LG., J of Urology, 158: 326-337 (1997))。また、この技術を用いて、偽陽性が観察される場合もある。追加された欠点も存在する。それは、試料サイズに基づくこの技術の感度に対して、有限の実際的な限界が存在するということである。典型的には、試験は、シグナルを検出する前に、１腫瘍細胞／血液０.１ｍｌ（血液１ｍｌ中の約１０の腫瘍細胞）の実際的感度下限に対応する、干渉する赤血球から単離した１０５ないし１０６細胞に対して行う。より高い感度は、血液から単離された腫瘍細胞中のｈＫ２ ＲＮＡを検出することによって示唆されている（米国特許第6,479,263号；米国特許第6,235,486号）。
【００１４】
血液ベースのヌクレオチドマーカーを用いる定性的ＲＴ−ＰＣＲに基づく実験を用いて、操作前血液中の陽性ＣＥＡ ｍＲＮＡを有する患者に対しての無疾患生存の可能性はＣＥＡ ｍＲＮＡについて陰性の患者のものよりも悪いことが示されている（Hardingham J. E., Hewett P. J., Sage R. E., Finch J. L., Nuttat J. D., Kotasel D.およびDovrovic A., Molecular detection of blood-borne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease, Int. J. Cancer, 89: 8-13(2000): Taniguchi T., Makino M., Suzuki K., Kaibara N., Prognostic significance of reverse transcriptase-polymerase chain reaction measurement of carcinoembryonic antigen mRNA levels in tumor drainage blood and peripheral blood of patients with colorectal carcinoma, Cancer 89: 970-976 (2000))。この終点の予測値はＣＥＡ ｍＲＮＡレベルに依存し、それはＧ−ＣＳＦ、サイトカイン、ステロイドまたは環境因子によって、健全な個人においても誘導される。したがって、ＣＥＡ ｍＲＮＡマーカーは特異性を欠いており、循環結腸直腸癌細胞に対して明らかにユニークではない。ステージＩＩ−ＩＶ患者における悪性メラノーマのマーカーとしての末梢血液および骨髄中のチロシナーゼｍＲＮＡを含意している報告もある（Ghossein R. A., Coit D., Brennan M., Zhang Z. F., Wang Y., Bhattacharya S., Houghton A.およびRosai J., Prognostic significance of peripheral blood and bone marrow tyrosinase messenger RNA in malignant melanoma, Clin. Cancer Res., 4 (2): 419-428 (1998))。ここでも、可溶性腫瘍マーカーとしてチロシナーゼｍＲＮＡを用いることが、転移可能性および患者生存のインジケーターとして可溶性腫瘍抗原の以前に引用した限界にあてられている。
【００１５】
実験条件下では外観上は予想的であるが、前記および他の実験は、長期の追跡期間でのまたは満足のいく特異性での一定のデータを提供していない。したがって、これらの努力は、血中の抗原に対するｍＲＮＡの外観が一般的に大部分の癌に対して予測的でなく、しかも患者にほとんど希望がない場合に検出される場合があるため、幾分役に立たないことを証明している。
【００１６】
これにもかかわらず、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、循環腫瘍細胞の定量的検出と患者予測とを相関付けると報告された唯一の方法となっている。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、大腸結腸癌患者の末梢血液中のＣＥＡ ｍＲＮＡを定量化するために使用されている（Ito S., Nakanishi H., Hirai T., Kato T., Kodera Y., Feng Z., Kasai Y., Ito K., Akiyama S., Nakao A.およびTatematsu M., Quantitative detection of CEA expressing free tumor cells in the peripheral blood of colorectal cancer patients during surgery with real-time RT-PCR on a Light Cycler, Cancer Letters, 183: 195-203 (2002)）。カプラン・メイヤー型分析（Kaplan-Meier type analysis）を用いると、操作後血液中に陽性ＣＥＡ ｍＲＮＡを有する患者の無増悪生存は、ＣＥＡ ｍＲＮＡについて陰性である場合よりも有意に短い。これらの結果は、腫瘍細胞は血流に分離し（おそらくは、外科的手順の間に、または、操作時にすでに存在していた微小転移から）、直腸結腸癌を有する患者における乏しい患者成果を生じたことを示唆している。このアッセイの感度は、感度において従来のＲＴ−ＰＣＲと同様の再現性よい検出可能なレンジを提供した。言及したように、これらの検出レンジは、多数の腫瘍細胞への増幅した産物の信じられない変換に基づく。外挿した細胞カウントは、転移増幅することができない損傷したＣＴＣも含み得る。さらに、ＰＣＲ−ベースのアッセイは、腫瘍細胞を定量化できないということと共に、可能性のある試料コンタミネーションによって制限される。最も重要なことには、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、細胞質酵素および循環腫瘍抗原に基づく方法は、仮定したＣＴＣの転移可能性の基礎をなす構造一体性を確認する本質的形態情報を提供できず、したがって、その一部分を本発明において具体化する高感度イメージング法よりも機能的に信頼性の低い代理アッセイを構成する。
【００１７】
癌の検出および予測における完全な腫瘍細胞の評価：
血中における完全な腫瘍細胞の検出は、その原発性腫瘍の切除を受けた癌患者における再発転移疾患への直接的な関連を提供する。残念ながら、悪性細胞の同じ広がりは、従来の腫瘍ステージ検査（tumor staging)手順によって見落とすべく続く。最近の研究は、癌患者の骨髄中の単一のカルシノーマ細胞の存在が転移再発の独立した予測ファクターであることを示している（Diel IJ, Kaufman M, Goerner R, Costa SD, Kaul S, Bastert G. Detection of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer: a prognostic factor for distant metastasis. J Clin Oncol, 10: 1534-1539, 1992）。しかし、これらの侵入的技術は、血中のばら播かれた上皮腫瘍細胞の検出と比較して、ルーチンまたは多重の臨床アッセイには望ましくないまたは受け入れられないように考えられる。
【００１８】
別のアプローチは免疫磁気分離技術を取込み、完全な循環癌細胞の決定的な検出におけるより大きな感度および特異性を提供する。このシンプルかつ感度の高い診断ツールは、記載されているように（米国特許第6,365,362号；米国特許第6,551,843号；米国特許第6,623,982号；米国特許第6,620,627号；米国特許第6,645,731号；WO 02/077604；W0 03/065042；およびWO 03/019141）本願発明において用いて、７.５ないし３０ｍｌの血液中の５以上の腫瘍細胞の閾値レベルに基づく個々の患者の統計学的生存可能性と相関する（１ないし２の腫瘍細胞は所定の個人の循環中の約３０００ないし４０００の合計腫瘍細胞に相当する）。
【００１９】
この診断ツールを用いれば、癌患者からの血液試料（WO 03/018757）を、例えばＥｐＣＡＭのような上皮細胞抗原に対して向けられた抗体でコートした磁性ビーズと一緒にインキュベートする。抗−ＥｐＣＡＭコート磁性ナノ粒子で標識した後に、磁気的に標識した細胞を磁気分離器を用いて単離する。免疫磁気的に富む画分は、下流の免疫細胞化学分析用またはイメージサイトメトリー、例えばCell Spotter（登録商標） System（Immunicon Corp., PA）用にさらに処理する。磁性画分は、下流の免疫細胞化学分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、フローサイトメトリー、または他の型のイメージサイトメトリー用にも用い得る。
【００２０】
Cell Spotter（登録商標） Systemは、免疫磁気的な選択および分離を利用して全血試料中に存在するいずれの上皮細胞をも高度に富化および濃縮する。捕捉された細胞は白血球特異的マーカーでおよび１またはそれを超える腫瘍細胞特異的蛍光モノクローナル抗体で検出可能に標識して、捕捉された ＣＴＣの同定および計数を可能とし、ならびに多義的装置またはコンタミネーションしている非標的細胞からの目視識別を可能とする。７.５−３０ｍｌの血液当たり１または２の上皮細胞という並はずれた感度では、このアッセイにより低い腫瘍細胞の大きさの早期ステージにおいても腫瘍細胞の検出が許容される。本発明の形態はCell Spotter（登録商標） Systemに限定されるものではなく、匹敵する感度および特異性のいずれの単離およびイメージング・プロトコールをも含む。
【００２１】
現在利用し得る予測プロトコールは、転移乳癌（ＭＢＣ）のごとき癌を有する患者における無増悪生存期間または生存期間を予想するためにＣＴＣを相関付けるための堅実な信頼し得る手段を実証していない。したがって、ＭＢＣのみならず一般に転移癌における転移可能性を有する癌細胞の正確な検出に対する明らかな要望が存在する。また、この要望は、所定の患者に対して最も有効な療法を選択する要望によって強調される。
【００２２】
発明の概要
本発明は、転移癌を有する患者における循環上皮細胞の絶対数、変化、またはその両方に基づく、疾患増悪までの時間、生存および療法に対する応答を評価することにおける、Cell Spotter（登録商標） Systemのごとき診断ツールを取り込んでいる癌を予想するための方法および手段である。
当該システムは、上皮細胞を免疫磁気的に濃縮し、細胞を蛍光標識し、陽性計数につきＣＴＣを同定および定量化する。細胞カウントの統計解析により、生存を予想する。
【００２３】
より詳細には、本発明は、ＭＢＣにおける患者生存、疾患増悪までの時間および療法に対する応答を評価するための装置、方法およびキットを提供する。生存の予想は、死亡および疾患増悪までの経時的な血中の循環腫瘍細胞の数の閾値比較に基づく。癌を有すると診断された患者の長期間の追跡研究の統計解析により、血中に見出されたＣＴＣの数の閾値および生存の予想を確立した。ＣＴＣの不存在は、５よりも少ない形態学的に完全なＣＴＣと定義する。生存を予想するためのＣＴＣの存在または不存在は、治療を選択するのに有用である。例えば、転移乳癌について以前に未治療の女性におけるＣＴＣの不存在を用いて、より少ない副作用およびより高いクウォリティー・オブ・ライフをもってホルモン療法と、より高い副作用を有するが高危険性集団の中でより有効に生存を延長し得る化学療法とから選択し得るであろう。したがって、本発明は、転移乳癌を有する女性におけるＣＴＣの検出における予後役割を有する。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、患者生存の早期予想インジケーターとしての循環腫瘍細胞の検出を提供する。
本発明の最も広い態様においては、一貫性が維持される限り、試料の収集および操作に制限は存在しない。したがって、細胞は当該技術分野で知られている方法によって得ることができる。
【００２５】
血中のＣＴＣを単離し、富化しおよび分析するためのいずれかの有効な機構が適当であるが、循環腫瘍細胞を収集する１の方法は、免疫磁気的富化技術、免疫蛍光標識技術と最初の血液引き出し後の適当な分析プラットフォームとを結合する。関連した試験は、全血試料中のこれら希薄細胞を検出するための、および、上皮起源の悪性腫瘍における疾患の臨床過程におけるそれらの役割を調べるための感度および特異性を有している。全血試料から感度および特異性をもって希薄細胞が検出され、本発明の診断アッセイにおいて、すなわち悪性腫瘍における疾患の臨床過程を予測することにおいてそれらを収集し、使用することが許容される。
【００２６】
本技術を用いて、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が検出可能な量で血中に存在することが示されている。このことは、癌患者の末梢循環における上皮起源の細胞の意義を調べるためのツールを創製した（Racila E., Euhus D., Weiss A. J., Rao C., McConnell J., Terstappen L. W. M. M.およびUhr J. W., Detection and characterization of carcinoma cells in the blood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4589-4594 (1998)）。この実験は、これらの血液−骨細胞が癌の病態生理学において極めて重要な役割を有し得ることを実証した。血液５ｍｌ当たり１の上皮細胞の検出感度を有すれば、アッセイは、免疫磁気試料富化および蛍光モノクローナル抗体染色につづいて、試料の迅速および高感度分析のためのフローサイトメトリーを取り込む。結果は、乳房の転移カルシノーマについて治療した８の患者の末梢血液中の上皮細胞の数が疾患の増悪および療法に対する応答と相関することを示す。局在化した疾患を有する１４の患者のうちの１３、リンパ節巻添え(involvement)を有する５の患者のうちの５、および遠位転移を有する１１の患者のうちの１１で、上皮細胞が末梢血液中に見出された。上皮細胞の数は、広範囲な疾患を有する患者におけるよりも顕著に多かった。
【００２７】
免疫磁気的に富化した試料をCell Spotter（登録商標） Systemによって分析するように、アッセイをイメージサイトメトリー分析に形成した（実施例を参照されたい）。これは、蛍光ベースの顕微鏡イメージ分析システムであり、これは、フローサイトメトリー分析と対比して、事象の視覚化および形態的特徴の評価を許容してさらに対象を同定することを許容する。
【００２８】
Cell Spotter（登録商標） Systemとは、血液からの単離した細胞を自動的に計数するための自動蛍光顕微鏡システムをいう。このシステムは、一体化されたコンピュータ制御蛍光顕微鏡およびディスポーザブルな試料カートリッジを支持する磁気くびきアセンブリーを有する自動ステージを含む。磁気くびきは、試料チャンバー内の鉄標識した候補腫瘍細胞を顕微鏡観察するために試料カートリッジの上方の観察表面に磁気的に局在し得るように設計されている。ソフトウェアにより、サイトケラチンに対する抗体で標識され、上皮起源を有する疑わしい癌細胞は、最終的な選抜のためにオペレーターに示される。
【００２９】
Cell Spotter（登録商標） System用の腫瘍細胞の単離は当該技術分野において知られているいずれの手段によってもなし得るが、１の形態では７.５ｍｌの全血を用いて腫瘍細胞を単離するためにImmunicon CellPrep（商品商標） Systemを用いる。上皮細胞特異的な磁気粒子を添加し、２０分間インキュベートする。磁気分離後に、免疫磁気結合した抗体に結合した細胞を試験管の壁に磁気的に保持する。ついで、結合しなかった試料を吸引し、等張溶液を添加して試料を再懸濁する。核酸色素、サイトケラチン（上皮細胞のマーカー）に対するモノクローナル抗体およびＣＤ４５（広スペクトル白血球マーカー）を試料とインキュベートする。磁気分離後に、結合しなかった画分を再度吸引し、結合および標識した細胞を０.２ｍｌの等張溶液に再懸濁する。Cell Spotter（登録商標） Systemにおいて蛍光顕微鏡検鏡するために、試料を細胞提示チャンバーに懸濁し、磁場が磁気標識細胞に向いている磁気デバイスに入れる。細胞はCell Spotter（登録商標） Systemで自動的に同定され、チェックリスト計数のためにオペレーターに候補循環腫瘍細胞が示される。
【００３０】
計数チェックリストは、完全細胞を構成する所定の形態基準からなる（実施例１を参照されたい）。
【００３１】
癌生存における予測因子として完全な循環腫瘍細胞を用いることと一緒に、Cell Spotter（登録商標） Systemの診断可能性は、適当な治療を決定するための迅速かつ高感度な方法を提供し得る。したがって、本発明においては、装置、方法およびキットが、生存可能性の予想評価のための転移および原発性患者の血液に落とされた腫瘍細胞の迅速な計数および特徴付けのために提供される。
【００３２】
本発明の方法は、好ましいまたは好ましくない生存を評価し、予想が好ましいものである場合に有害な副作用を生じ得る必要でない療法を防止することにさえ有用である。したがって、本発明は、広範な種々の癌のいずれの予想にも使用し得、かかる癌には限定するものではないが、以下の強調する癌を含む固形癌および白血病が含まれる：Apudo細胞腫、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心臓病、癌腫（すなわち、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、Brown-Pearce、腺管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮癌および移行上皮癌）、造血障害、白血病（すなわち、Ｂ細胞型白血病、混合型白血病、ヌル細胞型白血病、Ｔ細胞型白血病、T細胞性慢性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、リンパ球性急性白血病、リンパ球性慢性白血病、肥満細胞型白血病および骨髄性白血球）、悪性組織球症、ホジキン病、免疫増殖性小腸疾患、非ホジキンリンパ腫、骨髄腫、細網内皮症、メラノーマ、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、骨線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、リンパ腺腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、真珠腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝細胞癌、汗腺腫、膵島細胞腫、icydig細胞腫、乳頭腫、Sertoli細胞腫、莢膜細胞腫、平滑筋腫、子宮筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経節腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経細胞腫、傍神経節腫、非クロム親和傍神経筋腫、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮細胞腫、血管腫、血管周皮腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、嚢胞肉腫、葉状嚢胞肉腫、線維肉腫、血管肉腫、子宮肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、myoswarcoma、粘液肉腫、卵巣カルシノーマ、横紋筋肉腫、肉腫（すなわち、ユーイング実験、カポシおよびマスト細胞）、新生物（すなわち、骨、胸部、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩、頭部および首部、中枢神経系、聴覚、骨盤、気道および尿生殖器）、神経繊維腫症および子宮頸部形成異常。
【００３３】
以下の実施例は、患者からの血液中のＣＴＣの予報および予想値を説明する。以下の実施例は説明のために提供するものであり、いかなる場合においても本発明の範囲を限定するものでないことを注記しておく。
【００３４】
実施例１
Cell Prep（商品商標）を用いた循環サイトケラチン陽性細胞の計数
サイトケラチン陽性細胞は、全血の７.５ｍｌ試料を用いてCell Prep（商品商標） Systemによって単離する。上皮細胞特異的な免疫磁気流体を添加し、２０分間インキュベートする。２０分間の磁気分離後に、免疫磁気結合した抗体に結合した細胞を試験管の壁に磁気的に保持する。ついで、結合しなかった試料を吸引し、等張溶液を添加して試料を再懸濁する。核酸色素、サイトケラチン（上皮細胞のマーカー）に対するモノクローナル抗体およびＣＤ４５（広スペクトルの白血球マーカー）を試料と一緒に１５分間インキュベートする。磁気分離後に、結合しなかった画分を再度吸引し、結合および標識した細胞を０.２ｍｌの等張溶液に再懸濁する。試料を、Cell Spotter（登録商標） Systemにおいて蛍光顕微鏡検鏡するために、細胞提示チャンバーに懸濁し、その磁場が磁気標識した細胞に向いている磁気装置に入れる。細胞はCell Spotter（登録商標） Systemで自動的に同定され；当該システムによって対照細胞が計数され；一方で、示したチェックリストを用いる計数のために操作者に候補循環癌細胞が提示される（図１）。
【００３５】
実施例２
腫瘍負荷の評価：ラジオグラフィーイメージ分析とＣＴＣの絶対数との間の比較
転移病変のラジオグラフィー測定が最近使用されて、転移疾患を有する癌患者における腫瘍負荷が評価されている。一般的に、最大の病変を測定し、合算して腫瘍負荷が得られる。乳癌患者における肝臓転移の二次元測定の例を図２Ａに図示する。血流中の腫瘍負荷を測定する必要性を図示するモデルを、実際の活性腫瘍負荷の測定として、したがって疾患の全体活性のより良好な測定として図２Ｂに図示する。ＣＴＣの絶対数がイメージングによって測定した腫瘍の寸法と相関するかを決定するために、ＭＢＣを有する患者における予想実験を行った。
【００３６】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、測定可能なＭＢＣを有する６９の患者からの７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。腫瘍負荷は、療法を開始する前の８の測定可能な病変にのぼる二次元ラジオグラフィー測定によって評価した。腫瘍負荷は、個々の測定（ｍｍ２）を付加することによって決定した。ＣＴＣは、療法の開始前に引き出した血液中で計数した。
【００３７】
図３は６９の患者における７.５ｍｌ中のＣＴＣの数−対−腫瘍測定の二次元合算を示す。図３から、腫瘍のサイズと血中の腫瘍細胞の絶対数との間に相関は存在しない。イメージングによって測定して大きな腫瘍を有する何人かの患者は、少数のＣＴＣを有するかまたはその反対であった。
【００３８】
したがって、ラジオグラフィーによって測定した腫瘍負荷は、血中に存在する腫瘍細胞の絶対数と相関しない。
【００３９】
実施例３
腫瘍負荷の評価：ラジオグラフィーイメージにおける変化とＣＴＣの絶対数における変化との間の比較
ラジオグラフィーイメージングは、特定の疾患が治療に応答しているか、安定化しているか、または増悪しているかを評価するための最近の標準である。ラジオグラフィー測定間の間隔は、意味のある結果を得るために少なくとも３ヶ月としなければならない。したがって、治療サイクルの間の早期の療法に対する応答を予想し得る試験は、転移疾患について治療した患者の管理を改善して、クウォリティー・オブ・ライフを潜在的に向上し、かつ、生存を潜在的に改善し得るであろう。この実験においては、ＭＢＣについて新たな系統の治療を開始した患者を評価して、ＣＴＣの数における変化がイメージングによって測定した患者状態における変化と相関するかを決定した。
【００４０】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、新たな療法を開始することに関して、および治療サイクルの間の種々の時点で、ＭＢＣ患者における７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。ラジオグラフィー測定は療法開始前、療法開始１０−１２週後および治療サイクル完了後（療法開始約６月後）に、または最初になろうがなかろうが、患者が療法で増悪した時点に行った。
【００４１】
イメージ分析から、１４の患者において部分的な応答が見出され（１７のデータセグメント）、ＣＴＣはすべての症例において減少したかまたは検出不可能のままであった（図４を参照されたい）。イメージングによって安定な疾患は、３０の患者において見出された（３７のデータセグメント）。ＣＴＣはすべての症例において減少したかまたは検出不可能のままであった（図４を参照されたい）。イメージングによる疾患増悪は、１４の患者において見出された（１５のデータセグメント）。ＣＴＣは１５の症例のうちの７において増加した。他の８の症例では、いずれの時点においてもＣＴＣは全く検出されなかった。
【００４２】
ＣＴＣの増加は、疾患増悪を有する患者においてのみ観察された（１００％）。ＣＴＣの減少は部分的応答ないし安定な疾患を有する患者においてのみ観察された（１００％）。部分的応答または安定疾患を有する患者においては、６１の症例のうちの５４においてＣＴＣは両方の時点においても全く検出されなかった（８９％）。
【００４３】
実施例４
治療の案内としての、ＭＢＣについて処理した患者におけるＣＴＣの数における傾向
ＭＢＣを有する患者における研究を行い、ＣＴＣの数の変化における明らかな傾向がＭＢＣについて治療した患者において観察し得るか、および、ＭＢＣを有する患者の治療の最適化に治療する医師を案内するために、かかる傾向に単純なルールを適用し得るかを決定した。
【００４４】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。ＭＢＣに対して新たな系統の療法を開始した８１の患者を当該研究に登録した。ＣＴＣは、療法を開始する前におよびその後はほぼ毎月吸い出した血液中で計数した。
【００４５】
８１の患者のうちの７６（９４％）において、ＣＴＣの数における明らかな傾向が観察された。療法の過程の間は、５０％の患者の血液７.５ｍｌ当たりにＣＴＣの数が検出できないか、または５未満のＣＴＣが残存していた。典型的な例を図６Ａに示す。ＣＴＣの数は２２％の患者において療法の過程の間に減少した。典型的な例を図６Ｂに示す。６％の患者においては、ＣＴＣの数における減少につづいて療法の過程の間に増加することが観察された。典型的な例を図６Ｃに示す。１６％の患者においては、療法の過程の間にＣＴＣの数が増加した。典型的な例を図６Ｄに示す。４２の例において、各血液の引き出し時に、２の血液試料を調製し、分析した。最初の時点に引き出した第１の試験管および追跡時点に引き出した第１の試験管を用いた結果を、各時点に引き出した第２の試験管を用いた結果と比較した。これらの例のうちの１のみにおいて、ＣＴＣの数における変化が、引き出した第１の試験管と引き出した第２の試験管の間で（あるいは、二重で）異なっていた（９８％の合致）。この場合においては、引き出した第１の血液からの両方の試験管ともに０のＣＴＣを有していたが、引き出した第２の血液に関しては、１の試験管が５のＣＴＣを有し（カットオフの下）、第２の試験管が６のＣＴＣ（カットオフの上）を有していた。ＣＴＣ測定の再現性の比較において、同じフィルムを２の異なるエキスパート放射線技師によって判読させた場合のラジオグラフィーイメージングの判読者間変動は、わずか８１％の合致しか生じなかった。さらに、１４６のイメージング・セグメントのセットにおける２の放射線技師間の合致は、増悪−対−無増悪を測定した場合は８５％であり、増悪、安定な疾患および部分的応答を測定した場合にはわずか５８％まで低下した。それに対して、２の異なる放射線技師によって同じデータセットに対してＣＴＣ測定の分析を行うと、１００％の合致を生じた。
【００４６】
したがって、ＭＢＣについて治療した患者におけるＣＴＣの検出およびモニタリングは、ラジオグラフィーイメージングよりも、療法に対する応答を測定する方がより再現性のよい手法である。
【００４７】
実施例５
療法の開始前のＰＦＳおよびＯＳの予測
療法の開始前のＣＴＣレベルを無増悪生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）と関連付ける実験を行い、それによって＞５ ＣＴＣ／７.５ｍｌの閾値を用いた。
【００４８】
測定し得るＭＢＣを有する１１７の患者を、新たな系列の治療を開始する前のおよび６ヶ月にのぼるつづく１ヶ月間隔の７.５ｍｌの血液中のＣＴＣについて試験した。いずれかの型の療法およびいずれかの系統の療法に入る患者を当該試行に含めた。疾患の増悪または応答は、各患者の部位において医師によって評価した。
【００４９】
図７に示すごとく、中央値ＰＦＳはＣＴＣレベルが上昇するに従って減少し、５のＣＴＣで平行になるプラトーに達した（水平線）。中央ＰＦＳはすべての患者についてほぼ５.９ヶ月であった（黒点）。陽性患者についての中央ＰＦＳにおける変化およびに基づき、Ｃｏｘハザード比に基づいて、＞５ ＣＴＣのカットオフをすべてのつづく分析に用いた。
【００５０】
図８は、ベースライン血液引き抜き中で測定されたＣＴＣの数を用いた無増悪生存（ＰＳＦ）および全生存（ＯＳ）のカプラン・メイヤー分析を示している。１７７の患者において、中央ＰＦＳ時間はほぼ５.０ヶ月であった。ベースラインにて＞５ ＣＴＣ／７.５ｍｌの血液を有する患者は、＜５ ＣＴＣを有する患者よりも有意に短いＰＳＦを有していた（各々、ほぼ２.７ヶ月−対−７.０ヶ月）。全体生存（ＯＳ）は、＞５ ＣＴＣ−対−＜５ ＣＴＣを有する患者について、各々、１０.１ヶ月−対−＞１８ヶ月の中央ＯＳを有して同じ傾向を反映した。
【００５１】
新しい系統の療法を開始する前のＣＴＣの数の測定は、患者がその療法において増悪するまでの時間を予想し、生存時間を予想する。この予想能力に基づいて、ベースラインにおけるＣＴＣの検出および測定は適当な治療の選択において有用であろう情報を医師に提供する。また、ＰＦＳおよびＯＳの観点から患者を高危険性および低危険性に階層化する能力は、療法試行に入れる適当な患者を選択するのに非常に有用となり得る。潜在的に高い毒性を有する新規な薬剤に関しては、乏しい予想因子を有する患者はより適当な標的集団となり得る。それに対して、最小限の毒性を有する薬剤および将来有望な療法効力は、好ましい予想因子を有する患者に向けてより適当に標的化し得る。
【００５２】
実施例６
療法の開始後のＰＦＳおよびＯＳの予想
療法の開始後のＣＴＣレベルを無増悪生存（ＰＦＳ）および全体生存（ＯＳ）と関連付けるための実験を、第１の追跡時におけるＣＴＣの数を用いて行い、ＰＦＳおよびＯＳを予想した。
【００５３】
測定し得るＭＢＣを有する１６３の患者を、この分析のために評価した。血液は、新たな系統の療法の開始後平均４週間に引き出した。疾患の増悪または応答は、療法開始後１２週間の平均時間に各患者についての部位において医師によって評価した。
【００５４】
図９に示すごとく、第１の追跡時に７.５ｍｌ当たり＞５ ＣＴＣを有する４９の患者は、７.５ｍｌ当たり＜５ ＣＴＣを有する１１４の患者と比較して、有意により短い中央ＰＳＦ、各々ほぼ２.１ヶ月−対−７.０ヶ月を有していた。同じ傾向は全生存における中央値においても観察された。＞５ ＣＴＣについてほぼ８.２ヶ月−対−＜５ ＣＴＣについて＞１８ヶ月。
【００５５】
別の分析においては、本発明者らは、既知のより短いまたはより長いＰＦＳおよびＯＳを有する２の群を、減少しているＣＴＣを有する患者と比較した。詳細には、ベースラインおよび第１の追跡におけるＣＴＣが＜５である患者は、比較的長いＰＳＦおよびＯＳを有することが知られている；すなわち、これは、比較的良好な性能を有する集団であった。逆に、第１の追跡において＞５のＣＴＣレベルを有してＣＴＣがベースラインから第１の追跡までに上昇した患者は、比較的短いＰＦＳおよびＯＳを有することが知られている；すなわち、これは、比較的乏しい性能を有する集団であった。ついで、本発明者らは、これらの第１の２の群に対して、２のさらなる患者の群を比較した：最初に、＜５のレベルまで、ベースラインから第１の追跡にＣＴＣが減少した患者。第２に、本発明者らは、ベースラインから第１の追跡にＣＴＣが減少したが、第１の追跡におけるＣＴＣの数が＞５であった患者を評価した。結果を図１０に示す。ベースラインおよび第１の追跡において＜５ ＣＴＣを有する第１の対照群については、ＰＦＳおよびＯＳは予想したように比較的長かった。上昇する細胞を有する第２の対照群については、ＰＦＳおよびＯＳは、再度予想したように、比較的はるかに短かった。第１の追跡において＜５までＣＴＣが減少した患者については、ＰＦＳおよびＯＳを両方の時点において＜５ ＣＴＣを有する患者のものに近似した。逆に、ＣＴＣが減少したが、＜５まで減少しなかった患者については、その予測は上昇するＣＴＣを有する患者とちょうど同じ位に乏しかった。
【００５６】
したがって、ＣＴＣは第１の追跡において５未満まで衰えてＰＦＳおよびＯＳを最高化し、療法と関連する利益を最大限化しなければならない。
【００５７】
実施例７
ＰＦＳおよびＯＳの予報値の一変量および多変量解析
ＣＴＣレベルをＰＦＳおよびＯＳと関連する既知のパラメータとを比較するために、一変量および多変量のＣｏｘ比例ハザード回帰分析を行った。ＰＦＳを予測することについては、療法の系統、療法の型およびベースラインおよび第１の追跡におけるＣＴＣレベルのみが、一変量的に有意であった。ＯＳについては、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、またはその両方のいずれかが陽性である場合にＥＲ／ＰＲが陽性であると考えられる場合には、ＥＲ／ＰＲ状態も一変量的に有意であった。ＥＣＯＧガイドラインを用いて測定した患者状態も、ＥＣＯＧがEuropean Cooperative Oncology Groupパフォーマンス・ステータスにおいて０ないし５にランクされる場合にはＯＳについて一変量的に有意であった（表２）。
【００５８】
【表１】
【００５９】
ステージ＝第１の診断時における疾患ステージ、Ｐｏｓ＝陽性、Ｎｅｇ＝陰性、化学＝他の療法を含むまたは含まない化学療法、ホルモン＝ホルモン療法および／または免疫療法、ＨＲ＝Ｃｏｘハザード比、転移までの時間は連続変数として評価した。
【００６０】
パラメータを含むおよび排除する両方に対してｐ＜０.０５のストリンジェンシーレベルでの逐次Ｃｏｘ回帰を、ベースラインおよび第１の追跡におけるＣＴＣレベルについて別々に用いてＰＦＳおよびＯＳを予想した。幾つかの臨床因子は多変量分析においてその適当性を維持したが、ベースラインＣＴＣおよび第１の追跡における持続性の陽性ＣＴＣが、ＰＦＳおよびＯＳの最強の予報値として現れた（表３）。
【００６１】
【表２】
【００６２】
逐次選抜プロセスを用いる多変量Ｃｏｘ回帰分析を用いて、ＰＦＳおよびＯＳとの関連性を評価した。０.０５のストリンジェンシーレベル（ｐ−値）を、多変量分析におけるパラメータを含むおよび排除する両方に対して用いた。ＰＦＳおよびＯＳに対して統計上有意な相関を実証する各パラメータについての結果を表に要約する。ＣＴＣ数はＰＦＳおよびＯＳの最強の予報値であった。
ステージ＝第１の診断時における疾患ステージ、Ｐｏｓ＝陽性
Ｎｅｇ＝陰性、ＨＲ＝Ｃｏｘハザード比、ｎｓ＝多変量分析において有意性なし
【００６３】
実施例８
第１の追跡後のＣＴＣに基づく療法に対する応答の評価
ＭＢＣを有する患者における研究を行って、第１の追跡後のＣＴＣの数が療法に対する応答を評価するのに適当な指数を与えるのかを決定した。
【００６４】
Cell Spotter（登録商標） Systemを用いて、７.５ｍｌの血液中のＣＴＣを計数した。１６３の臨床学的に診断された転移乳癌患者を、ベースライン血液引き抜きの時点から平均４.５±２.４週間（中央値４.０週間、１.４ないし１６.９週の範囲）である第１の追跡血液引き抜きにおけるＣＴＣについて比較した。ＣＴＣは療法の開始の前およびその後ほぼ毎月に引き抜いた血液において計数した。７.５ｍｌの血液当たり５ ＣＴＣ未満の閾値を用いて、第１の追跡におけるＣＴＣカウントを、安定または応答している疾患を有する患者が増悪なしに分類され、ベースラインおよび第１の追跡からの二次元イメージング決定に基づいて臨床疾患増悪を有する患者が増悪として分類されるように、患者の臨床状況と比較した（表４）。
【００６５】
【表３】
【００６６】
第１の追跡においてアッセイした場合に５未満のＣＴＣを有する９４の患者は疾患増悪なしを示し、ＣＴＣカウントと療法に対する応答との間の一致を示した。第１の追跡においてアッセイした場合に５以上のＣＴＣを有する３５の患者は疾患増悪を示し、ここでも、第１の追跡におけるＣＴＣ数と療法に対する応答の欠如との間の一致を示した。２０の患者は疾患増悪と共に５未満のＣＴＣを示し、これは偽陰性結果を表した。これらの患者は彼らがしてきたようにＣＴＣ分析を使用することなく療法を受けることを続けるため、これらの結果は臨床的に有害とならないであろう。しかしながら、１４の患者が、増悪のラジオグラフィー証拠を有さずに第１の追跡において＞５ ＣＴＣを示し、これは偽陽性応答を示している。これらの応答はその療法から恩恵を受け得る患者における療法の変更を生じ得るが、新たな療法はこれらの患者において役に立つことが予想され、偽陽性の数は許容できる低さである。したがって、全体的にみて、第１の追跡におけるＣＴＣの計数は、評価した１６０の患者のうちの１２９において療法に対する応答の指標を与えた。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】腫瘍細胞として捕捉した対象を確認するために用いたCell Spotter（登録商標）蛍光分析プロフィール。チェックマークは、複合イメージに基づく陽性腫瘍細胞を示す。複合イメージは、上皮細胞マーカー（ＥＣ−ＰＥ）および核染色（ＮＡＤＹＥ）についての陽性選抜に由来する。陰性選抜も、白血球マーカー（Ｌ−ＡＰＣ）および対照（ＣＮＴＬ）に必要である。
【図２】腫瘍状態における変化を測定するための診断方法の比較。ラジオグラフィー・イメージングを用いた分離した病変の物理学的測定の最近の標準を示す（パネルＡ）。血中のＣＴＣの数をカウントすることによって負った転移癌における変化を評価する能力を図示するモデルを示す（パネルＢ）。
【図３】６９の患者におけるＣＴＣと腫瘍サイズとの間の相関の欠如。
【図４】療法に対して部分的な応答または安定した疾患状態を有する患者におけるＣＴＣの数における変化。すべての症例において減少または検出不可能のままであったかのいずれかのＣＴＣ。
【図５】疾患増悪を有する患者におけるＣＴＣの数における変化。疾患増悪に伴い増加したかまたは検出不可能のままであったかのいずれかのＣＴＣ。
【図６ａ】ＣＴＣの数における患者の傾向。パネルＡは７.５ｍｌの血液当たり５よりも少ないＣＴＣを有する典型的な患者を示す。パネルＢは療法の過程の間にＣＴＣの減少を有する典型的な患者を示す。
【図６ｂ】ＣＴＣの数における患者の傾向。パネルＣはＣＴＣの減少につづいて増加を有する典型的な患者を示す。パネルＤはＣＴＣにおける増加を有する典型的な患者を示す。
【図７】迅速な増悪を有するＭＢＣ患者を識別するための最適ＣＴＣカットオフの決定。解析は、トレーニング・セットに含まれる１０２の患者からのベースラインで得たＣＴＣ数を用いて行った。７.５ｍｌの血液中のＣＴＣの選択した数以上を有する患者の中央ＰＦＳは実線によって示し、選択したＣＴＣレベル未満を有する患者の中央ＰＦＳは破線によって示す。ＣＴＣが増加し、５のＣＴＣで安定になるプラトーに達する（水平線によって示した）にしたがい中央ＰＦＳは低下した。黒色の点はすべての１０２の患者に対する〜５.９ヶ月の中央ＰＦＳを示す。＞ＣＴＣ／７.５ｍｌの選択したカットオフを、すべての続く解析に用いた。
【図８】ＰＦＳおよびＯＳについてのベースラインＣＴＣの予想値。新たな系列の療法を開始する前に採取したベースライン血液を用いた、７.５ｍｌの血液中に＜５（黒線）および＞５（灰色線）のＣＴＣを有するＭＢＣ患者のＰＦＳおよびＯＳの確率を示す。ＰＦＳおよびＯＳは、ベースライン血液を採取した時点から計算した。パネルＡ：ベースラインＣＴＣカウントを用いたＰＦＳの確率（ｎ＝１７７、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＝０．０００１、ＣｏｘＨＲ＝１．９５、カイ２＝１５．３３、ｐ＝０．０００１）。パネルＢ：ベースラインＣＴＣカウントを用いたＯＳの確率（ｎ＝１０２、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＝０．０００３、ＣｏｘＨＲ＝３．９８、カイ２＝１２．６４、ｐ＝０．０００４）。
【図９】ＰＦＳおよびＯＳについて最初の追跡時におけるＣＴＣの予想値。新たな系統の療法を開始した後の最初の追跡時の７.５ｍｌの血液中に＜５（黒線）および＞５（灰色線）のＣＴＣを有するＭＢＣ患者のＰＦＳおよびＯＳの確率。ＰＦＳおよびＯＳは採取したベースライン血液の時点から計算した。パネルＡ：採取した血液の最初の追跡を用いたＰＦＳの確率（ｎ＝１６３、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＜０．０００１、ＣｏｘＨＲ＝２．７３、カイ２＝２５．２５、ｐ＜０．０００１）。パネルＢ：採取した血液の最初の追跡を用いたＯＳの確率（ｎ＝６８、ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｐ＝０．０００１、ＣｏｘＨＲ＝６．１２、カイ２＝１３．２４、ｐ＝０．０００３）。
【図１０】療法開始後（〜４−５週間後）に採取した最初の追跡血液における５未満までのＣＴＣカウントにおける減少は、改善された中央ＰＦＳおよびＯＳを予想する。両方のパネルにつき、黒色実線はベースラインおよび採取した最初の追跡血液の両方において＜５のＣＴＣを示す。黒色点線はベースラインでは最初に＞５ ＣＴＣを示したが、最初の追跡時に５未満まで減少したＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡を示す。灰色破線はベースライン時および追跡の両方において＞５ ＣＴＣを示し、灰色実線は追跡時の＞５ ＣＴＣを有するベースライン・レベルからのＣＴＣにおける増加を示す。パネルＡは患者におけるＰＦＳの確率を図示し、一方でパネルＢはＯＳの確率を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験対象における循環希薄細胞（circulating rare cell）の転移可能性を評価する方法であって：
ａ）該試験対象から生物標本を得、該標本は該希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
ｃ）該希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
ｄ）該完全な希薄細胞を分析することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該試験対象の完全な希薄細胞の数と該転移可能性とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項２】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、ついで標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項１記載の方法。
【請求項３】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項１記載の方法。
【請求項４】
該分析が該完全な希薄細胞の数における変化に基づき、該変化が該転移可能性の指標である請求項１記載の方法。
【請求項５】
該標本に存在する該完全な希薄細胞の数における増加が疾患増悪に対応する請求項１記載の方法。
【請求項６】
該転移可能性を、転移乳癌試験対象、転移前立腺癌試験対象、膀胱癌試験対象、転移大腸癌試験対象およびそれらの組合せよりなる群から選択される該試験対象について決定する請求項１記載の方法。
【請求項７】
試験対象における転移可能性を評価する希薄細胞分析システムであって：
ａ）該試験対象からの生物標本中の細胞を安定化する手段、該手段は該標本中の該希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析して巨視的転移を決定する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて該完全な希薄細胞の数と該転移可能性とを相関付ける該システム。
【請求項８】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項９】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項１０】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＲ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項１１】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項１２】
試験対象からの希薄細胞を含有する生物標本において転移可能性をスクリーニングする試験キットであって：
ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；
ｃ）該希薄細胞以外の試料成分を分析から排除するための細胞特異的色素を含む該試験キット。
【請求項１３】
該抗体が該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物学的緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項１２記載のキット。
【請求項１５】
患者における生存予測の方法であって：
ａ）該患者から生物標本を得、該標本は希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
ｃ）該希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
ｄ）該完全な希薄細胞を分析して患者生存を決定することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該患者の完全な希薄細胞の数と該生存予測とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項１６】
該循環希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、ついで標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該生物特異的リガンドが、上皮細胞表面抗原に対して向けられた抗体である請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
該希薄細胞が、該上皮細胞表面抗原としてＥｐＣＡＭを有する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
該分析が、該生存予測を示す該完全な希薄細胞の数における変化に基づく請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
該分析が閾値の数に対する循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）数の測定に基づき、該閾値以上の該測定がより低い該生存予測の指標である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該閾値が５の循環腫瘍細胞である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該生存予測を、転移乳癌患者、転移前立腺患者、膀胱癌患者、転移大腸癌患者およびそれらの組合せよりなる群から選択される患者について決定する請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
患者における生存予測を評価する希薄細胞分析システムであって：
ａ）該患者からの生物標本中の細胞を安定化する手段、該手段は該標本中の希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて該完全な希薄細胞の数と該生存予測とを相関付ける該システム。
【請求項２６】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項２７】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項２８】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＴ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項２９】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項３０】
患者における生存予測を評価するキットであって：
（ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該患者からの生物標本中の希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
（ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；および
（ｃ）分析から該希薄細胞以外の試料成分を排除する細胞特異的色素
を含む該キット。
【請求項３１】
該抗体が、該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項３０記載のキット。
【請求項３３】
該希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項３０記載のキット。
【請求項３４】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が乳癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基がＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビターおよびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される、乳癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３５】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が前立腺癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が前立腺特異的抗原、前立腺酸性フォスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベーシック前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される、前立腺癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３６】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が大腸癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が癌胚抗原、プロテインＣ、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される、大腸癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３７】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が膀胱癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２）、Ｂａｒｄ膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、およびフィブリン分解産物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される、膀胱癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３８】
該少なくとも１の抗体が、各々が異なる癌細胞特徴決定基に結合特異性を有する一連の抗体を含む請求項３０記載のキット。
【請求項３９】
患者における疾患増悪までの時間を評価する方法であって：
ａ）該患者から生物標本を得、該標本は希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
ｃ）該希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
ｄ）該完全な希薄細胞を分析して疾患増悪までの時間を決定することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該患者の完全な希薄細胞の数と疾患増悪までの時間とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項４０】
該循環希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
該生物特異的リガンドが、上皮細胞表面抗原に対して向けられた抗体である請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
該希薄細胞が該上皮細胞表面抗原としてＥｐＣＡＭを有する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
該分析が該完全な希薄細胞の数における変化に基づき、該疾患増悪までの時間を示す請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
該分析が閾値数に対するＣＴＣの数の測定に基づき、該閾値以上の該測定が疾患増悪までのより少ない該時間の指標である請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
該閾値が５の循環腫瘍細胞である請求項３９記載の方法。
【請求項４８】
該増悪までの時間を、転移乳癌患者、転移前立腺癌患者、転移大腸癌患者、膀胱癌患者およびそれらの組合せよりなる群から選択される該癌患者について決定する請求項３９記載の方法。
【請求項４９】
患者における疾患増悪までの時間を評価する希薄細胞分析システムであって：
ａ）該患者からの生物標本中の細胞を安定化する手段、該手段は該標本中の希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて該完全な希薄細胞の数と該疾患進行までの時間とを相関付けることを特徴とする該システム。
【請求項５０】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５１】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５２】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＴ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５３】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５４】
患者における疾患増悪までの時間を評価するキットであって：
ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該患者からの生物標本中の希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；および
ｃ）該希薄細胞以外の試料成分を分析から排除する細胞特異的色素を含む該キット。
【請求項５５】
該抗体が該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項５４記載のキット。
【請求項５６】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物学的緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項５４記載のキット。
【請求項５７】
該希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項５４記載のキット。
【請求項５８】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が乳癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基がＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビターおよびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される請求項５４記載のキット。
【請求項５９】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が前立腺癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が前立腺特異的抗原、前立腺酸性フォスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベーシック前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される、前立腺癌を有する患者における疾患増悪までの時間を評価する請求項５４記載のキット。
【請求項６０】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が大腸癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が癌胚抗原、プロテインＣ、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される、大腸癌を有する患者における疾患増悪までの時間を評価する請求項５４記載のキット。
【請求項６１】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が膀胱癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２）、Ｂａｒｄ膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、およびフィブリン分解産物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される、膀胱癌を有する患者における無増悪生存を評価する請求項５４記載のキット。
【請求項６２】
該少なくとも１の抗体が、各々が異なる癌細胞特徴決定基に結合特異性を有する一連の抗体を含む請求項５４記載のキット。
【請求項６３】
療法に対する患者の応答を評価する方法であって：
（ａ）該患者から生物標本を得、該標本は希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
（ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
（ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
（ｄ）該完全な希薄細胞を分析して療法に対する患者の応答を決定することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該癌患者の完全な希薄細胞の数と該療法に対する応答とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項６４】
該循環希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該完全な希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、ついで標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した完全な希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
該生物特異的リガンドが、上皮細胞表面抗原に対して向けられた抗体である請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
該完全な希薄細胞が、該上皮細胞表面抗原としてＥｐＣＡＭを有する請求項６３記載の方法。
【請求項６８】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項６３記載の方法。
【請求項６９】
該分析が該完全な希薄細胞の数における変化に基づき、療法に対する該患者の応答を示す請求項６３記載の方法。
【請求項７０】
該分析が閾値数に対するＣＴＣの数の測定に基づき、該閾値以上の該測定が療法に対するより低い該患者の応答の指標である請求項６３記載の方法。
【請求項７１】
該閾値が５の循環腫瘍細胞である請求項６３記載の方法。
【請求項７２】
該療法に対する応答を、転移乳癌患者、転移前立腺癌患者、転移大腸癌患者およびそれらの組合せよりなる群から選択される患者について決定する請求項６３記載の方法。
【請求項７３】
療法に対する患者の応答のための希薄細胞分析システムであって：
ａ）該患者からの生物標本中の細胞を安定化させる手段、該手段は該標本中の希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて療法に対する該患者の応答の完全な希薄細胞の数を相関付けることを特徴とする該システム。
【請求項７４】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７５】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７６】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＲ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７７】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７８】
患者における療法に対する患者の応答を評価するキットであって：
ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該患者からの生物標本中の希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；および
ｃ）該希薄細胞以外の試料成分を分析から排除する細胞特異的色素を含む該キット。
【請求項７９】
該抗体が該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項７８記載のキット。
【請求項８０】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物学的緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項７８記載のキット。
【請求項８１】
該希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７８記載のキット。
【請求項８２】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が乳癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基がＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビターおよびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される、乳癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８３】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が前立腺癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が前立腺特異的抗原、前立腺酸性フォスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベーシック前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される、前立腺癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８４】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が大腸癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が癌胚抗原、プロテインＣ、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される、大腸癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８５】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が膀胱癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２）、Ｂａｒｄ膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）およびフィブリン分解産物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される、膀胱癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８６】
該少なくとも１の抗体が、各々が異なる癌細胞特徴決定基に結合特異性を有する一連の抗体を含む請求項７８記載のキット。
【請求項１】
試験対象における循環希薄細胞（circulating rare cell）の転移可能性を評価する方法であって：
ａ）該試験対象から生物標本を得、該標本は該希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
ｃ）該希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
ｄ）該完全な希薄細胞を分析することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該試験対象の完全な希薄細胞の数と該転移可能性とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項２】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、ついで標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項１記載の方法。
【請求項３】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項１記載の方法。
【請求項４】
該分析が該完全な希薄細胞の数における変化に基づき、該変化が該転移可能性の指標である請求項１記載の方法。
【請求項５】
該標本に存在する該完全な希薄細胞の数における増加が疾患増悪に対応する請求項１記載の方法。
【請求項６】
該転移可能性を、転移乳癌試験対象、転移前立腺癌試験対象、膀胱癌試験対象、転移大腸癌試験対象およびそれらの組合せよりなる群から選択される該試験対象について決定する請求項１記載の方法。
【請求項７】
試験対象における転移可能性を評価する希薄細胞分析システムであって：
ａ）該試験対象からの生物標本中の細胞を安定化する手段、該手段は該標本中の該希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析して巨視的転移を決定する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて該完全な希薄細胞の数と該転移可能性とを相関付ける該システム。
【請求項８】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項９】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項１０】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＲ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項１１】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７記載の希薄細胞分析システム。
【請求項１２】
試験対象からの希薄細胞を含有する生物標本において転移可能性をスクリーニングする試験キットであって：
ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；
ｃ）該希薄細胞以外の試料成分を分析から排除するための細胞特異的色素を含む該試験キット。
【請求項１３】
該抗体が該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物学的緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項１２記載のキット。
【請求項１５】
患者における生存予測の方法であって：
ａ）該患者から生物標本を得、該標本は希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
ｃ）該希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
ｄ）該完全な希薄細胞を分析して患者生存を決定することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該患者の完全な希薄細胞の数と該生存予測とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項１６】
該循環希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、ついで標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該生物特異的リガンドが、上皮細胞表面抗原に対して向けられた抗体である請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
該希薄細胞が、該上皮細胞表面抗原としてＥｐＣＡＭを有する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
該分析が、該生存予測を示す該完全な希薄細胞の数における変化に基づく請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
該分析が閾値の数に対する循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）数の測定に基づき、該閾値以上の該測定がより低い該生存予測の指標である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該閾値が５の循環腫瘍細胞である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該生存予測を、転移乳癌患者、転移前立腺患者、膀胱癌患者、転移大腸癌患者およびそれらの組合せよりなる群から選択される患者について決定する請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
患者における生存予測を評価する希薄細胞分析システムであって：
ａ）該患者からの生物標本中の細胞を安定化する手段、該手段は該標本中の希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて該完全な希薄細胞の数と該生存予測とを相関付ける該システム。
【請求項２６】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項２７】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項２８】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＴ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項２９】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項２５記載の希薄細胞分析システム。
【請求項３０】
患者における生存予測を評価するキットであって：
（ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該患者からの生物標本中の希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
（ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；および
（ｃ）分析から該希薄細胞以外の試料成分を排除する細胞特異的色素
を含む該キット。
【請求項３１】
該抗体が、該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項３０記載のキット。
【請求項３３】
該希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項３０記載のキット。
【請求項３４】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が乳癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基がＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビターおよびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される、乳癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３５】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が前立腺癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が前立腺特異的抗原、前立腺酸性フォスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベーシック前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される、前立腺癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３６】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が大腸癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が癌胚抗原、プロテインＣ、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される、大腸癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３７】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が膀胱癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２）、Ｂａｒｄ膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、およびフィブリン分解産物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される、膀胱癌を有する患者における生存予測を評価する請求項３０記載のキット。
【請求項３８】
該少なくとも１の抗体が、各々が異なる癌細胞特徴決定基に結合特異性を有する一連の抗体を含む請求項３０記載のキット。
【請求項３９】
患者における疾患増悪までの時間を評価する方法であって：
ａ）該患者から生物標本を得、該標本は希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
ｃ）該希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
ｄ）該完全な希薄細胞を分析して疾患増悪までの時間を決定することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該患者の完全な希薄細胞の数と疾患増悪までの時間とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項４０】
該循環希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
該生物特異的リガンドが、上皮細胞表面抗原に対して向けられた抗体である請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
該希薄細胞が該上皮細胞表面抗原としてＥｐＣＡＭを有する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
該分析が該完全な希薄細胞の数における変化に基づき、該疾患増悪までの時間を示す請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
該分析が閾値数に対するＣＴＣの数の測定に基づき、該閾値以上の該測定が疾患増悪までのより少ない該時間の指標である請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
該閾値が５の循環腫瘍細胞である請求項３９記載の方法。
【請求項４８】
該増悪までの時間を、転移乳癌患者、転移前立腺癌患者、転移大腸癌患者、膀胱癌患者およびそれらの組合せよりなる群から選択される該癌患者について決定する請求項３９記載の方法。
【請求項４９】
患者における疾患増悪までの時間を評価する希薄細胞分析システムであって：
ａ）該患者からの生物標本中の細胞を安定化する手段、該手段は該標本中の希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて該完全な希薄細胞の数と該疾患進行までの時間とを相関付けることを特徴とする該システム。
【請求項５０】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５１】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５２】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＴ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５３】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項４９記載の希薄細胞分析システム。
【請求項５４】
患者における疾患増悪までの時間を評価するキットであって：
ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該患者からの生物標本中の希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；および
ｃ）該希薄細胞以外の試料成分を分析から排除する細胞特異的色素を含む該キット。
【請求項５５】
該抗体が該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項５４記載のキット。
【請求項５６】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物学的緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項５４記載のキット。
【請求項５７】
該希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項５４記載のキット。
【請求項５８】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が乳癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基がＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビターおよびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される請求項５４記載のキット。
【請求項５９】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が前立腺癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が前立腺特異的抗原、前立腺酸性フォスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベーシック前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される、前立腺癌を有する患者における疾患増悪までの時間を評価する請求項５４記載のキット。
【請求項６０】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が大腸癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が癌胚抗原、プロテインＣ、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される、大腸癌を有する患者における疾患増悪までの時間を評価する請求項５４記載のキット。
【請求項６１】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が膀胱癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２）、Ｂａｒｄ膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、およびフィブリン分解産物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される、膀胱癌を有する患者における無増悪生存を評価する請求項５４記載のキット。
【請求項６２】
該少なくとも１の抗体が、各々が異なる癌細胞特徴決定基に結合特異性を有する一連の抗体を含む請求項５４記載のキット。
【請求項６３】
療法に対する患者の応答を評価する方法であって：
（ａ）該患者から生物標本を得、該標本は希薄細胞を含有することが疑われる混合した細胞集団を含み；
（ｂ）該標本の画分を富化し、該画分は該希薄細胞を含有し；
（ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性が完全であることを確認し；ついで
（ｄ）該完全な希薄細胞を分析して療法に対する患者の応答を決定することを含み、ここに該分析が予め決定した統計連関に基づいて該癌患者の完全な希薄細胞の数と該療法に対する応答とを相関付けることを特徴とする該方法。
【請求項６４】
該循環希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
該画分を免疫磁気的富化によって得、該標本を該完全な希薄細胞に特異的に結合する生物特異的リガンドに結合した磁気粒子と混合して他の集団を実質的に排除し、ついで標本−磁気粒子混合物を磁場に付して磁気粒子結合した完全な希薄細胞に富む細胞懸濁液を生成する請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
該生物特異的リガンドが、上皮細胞表面抗原に対して向けられた抗体である請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
該完全な希薄細胞が、該上皮細胞表面抗原としてＥｐＣＡＭを有する請求項６３記載の方法。
【請求項６８】
該構造一体性を、免疫組織化学法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、フローサイトメトリー法、イメージサイトメトリー法およびそれらの組合せよりなる群から選択される方法によって決定する請求項６３記載の方法。
【請求項６９】
該分析が該完全な希薄細胞の数における変化に基づき、療法に対する該患者の応答を示す請求項６３記載の方法。
【請求項７０】
該分析が閾値数に対するＣＴＣの数の測定に基づき、該閾値以上の該測定が療法に対するより低い該患者の応答の指標である請求項６３記載の方法。
【請求項７１】
該閾値が５の循環腫瘍細胞である請求項６３記載の方法。
【請求項７２】
該療法に対する応答を、転移乳癌患者、転移前立腺癌患者、転移大腸癌患者およびそれらの組合せよりなる群から選択される患者について決定する請求項６３記載の方法。
【請求項７３】
療法に対する患者の応答のための希薄細胞分析システムであって：
ａ）該患者からの生物標本中の細胞を安定化させる手段、該手段は該標本中の希薄細胞の特徴決定基を保護し；
ｂ）該標本の画分を富化する手段、該画分は完全な希薄細胞を含有し；
ｃ）該完全な希薄細胞の構造一体性を確認する手段；および
ｄ）該完全な希薄細胞を分析する手段を含み、ここに該手段が予め決定した統計連関に基づいて療法に対する該患者の応答の完全な希薄細胞の数を相関付けることを特徴とする該システム。
【請求項７４】
該安定化手段が、抗凝固剤、安定化剤およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７５】
該富化手段が、免疫磁気的手段、密度勾配遠心分離およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７６】
該確認手段が、免疫組織化学的手段、ＲＴ−ＰＣＲ手段、ＰＣＲ手段、ＦＩＳＨ手段、フローサイトメトリー手段、イメージサイトメトリー手段およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７７】
該分析手段が、カプラン・メイヤー型分析、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７３記載の希薄細胞分析システム。
【請求項７８】
患者における療法に対する患者の応答を評価するキットであって：
ａ）磁気コア材料、タンパク質ベース被覆材料、および該患者からの生物標本中の希薄細胞の第１の特徴決定基に特異的に結合する抗体を含む被覆磁気ナノ粒子、該抗体は該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合しており；
ｂ）該希薄細胞の第２の特徴決定基に結合特異性を有する少なくとも１の抗体；および
ｃ）該希薄細胞以外の試料成分を分析から排除する細胞特異的色素を含む該キット。
【請求項７９】
該抗体が該ベース被覆材料に直接的または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭである請求項７８記載のキット。
【請求項８０】
さらに、非標的細胞に結合アフィニティーを有する抗体、生物学的緩衝液、透過緩衝液、プロトコール、情報シートおよびそれらの組合せよりなる群から選択される成分を含む請求項７８記載のキット。
【請求項８１】
該希薄細胞が、内皮細胞、母体血中の胎児細胞、細菌細胞、心筋細胞、上皮細胞、ウイルス感染細胞およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７８記載のキット。
【請求項８２】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が乳癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基がＭＵＣ−１、エストロゲン、プロゲステロン受容体、カテプシンＤ、ｐ５３、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡ２７.２９、ＣＡ１５.５、前立腺特異的抗原、プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビターおよびＨｅｒ２−ｎｅｕよりなる群から選択される、乳癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８３】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が前立腺癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が前立腺特異的抗原、前立腺酸性フォスファターゼ、チモシンｂ−１５、ｐ５３、ＨＰＣ１ベーシック前立腺遺伝子、クレアチンキナーゼおよび前立腺特異的膜抗原よりなる群から選択される、前立腺癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８４】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が大腸癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が癌胚抗原、プロテインＣ、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−９）よりなる群から選択される、大腸癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８５】
癌細胞決定基に結合特異性を有する該少なくとも１の抗体が膀胱癌細胞決定基に特異的に結合し、該決定基が核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ２２）、Ｂａｒｄ膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）およびフィブリン分解産物（ＦＤＰ）よりなる群から選択される、膀胱癌を有する患者における療法に対する患者の応答を評価する請求項７８記載のキット。
【請求項８６】
該少なくとも１の抗体が、各々が異なる癌細胞特徴決定基に結合特異性を有する一連の抗体を含む請求項７８記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５２５６４２（Ｐ２００７−５２５６４２Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０３８９９（Ｐ２００６−５０３８９９）
【出願日】平成１６年２月２６日（２００４．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５８４８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７６６４３
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【出願人】（３９９０１２９６３）イムニベスト・コーポレイション (10)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＩＶＥＳＴ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月２６日（２００４．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５８４８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７６６４３
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【出願人】（３９９０１２９６３）イムニベスト・コーポレイション (10)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＩＶＥＳＴ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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