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微生物の代謝経路制御方法
説明

微生物の代謝経路制御方法

【課題】微生物のピルビン酸代謝経路を制御する。
【解決手段】ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を制御しながら培養することにより、微生物のピルビン酸を起点とした代謝を制御するようにした。より具体的には、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を制御対象微生物とし、この微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を促進させると共に酸化経路における酸化反応を減退させるようにした。逆に、電極の電位を酸化電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を減退させると共に酸化経路における酸化反応を促進させるようにした。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物の代謝経路制御方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物の代謝経路を制御する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物が様々な代謝経路を経て様々な代謝産物を産生し得ることはよく知られている。例えば、大腸菌(E.coli)は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物である。より具体的には、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物である。アセチル補酵素Aは最終的には酢酸及びエタノールに変換される(図1及び非特許文献1参照)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】J.Bacteriol(2000), vol182, 3, p620-626
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
大腸菌の代謝経路において、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させることができれば、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸の産生量を増加させることが可能となる。逆に、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Aへの酸化反応を促進させることができれば、バイオ燃料として有用なエタノールの産生量を増加させることが可能となる。
【0005】
また、加水分解菌は、メタン発酵槽内において、水素資化性メタン菌がメタンを産生する際に必要な水素を生育時に産生する機能を有している微生物である。しかし、その一方で、加水分解菌はピルビン酸のアセチル補酵素Aへの酸化経路を代謝経路として有しており、アセチル補酵素Aが最終的に変換されて生じる酢酸がメタン発酵槽の酸敗の要因となり得る。そこで、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Aへの酸化反応を減退させることができれば、メタン発酵槽の酸敗を引き起こし得る酢酸の産生量を低下させることが可能となり、メタン発酵槽の長期安定化を実現することも可能となる。
【0006】
このように、微生物のピルビン酸を起点とする代謝経路を制御することで、種々の利点が生み出され得るものと考えられる。
【0007】
そこで、本発明は、微生物のピルビン酸を起点とする代謝経路を制御する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
かかる課題を解決するため、本願発明者等が鋭意研究を行った結果、大腸菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、乳酸の産生量が増加すると共に酢酸及びエタノールの産生量が減少することを知見した。逆に、電極の電位を酸化電位に制御することで、乳酸の産生量が減少すると共に酢酸及びエタノールの産生量が増加することを知見した。
【0009】
さらに、本願発明者等は、超好熱性の加水分解菌であるサーモトガ マリティマ(Thermotoga maritima)を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、通常は殆ど産生されない乳酸が産生されると共に酢酸の産生量が減少することも知見した。
【0010】
本願発明者等は、これらの知見に基づき、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物全般について、その培養環境に電極を接触させ、電極の電位を制御することで、ピルビン酸を起点とする代謝経路を制御することが可能であることが導き出されることを知見するに至り、さらに種々検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【0011】
即ち、本発明の微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を制御しながら培養することにより、微生物のピルビン酸を起点とした代謝を制御するようにしている。
【0012】
ここで、本発明の微生物の代謝経路制御方法において、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を制御対象微生物とし、この微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を促進させると共に酸化経路における酸化反応を減退させることが好ましい。
【0013】
また、本発明の微生物の代謝経路制御方法において、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を制御対象微生物とし、この微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を酸化電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を減退させると共に酸化経路における酸化反応を促進させることが好ましい。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物について、ピルビン酸を起点とする代謝経路を人為的に制御することが可能となる。したがって、この代謝経路からの代謝産物の産生量を増加させたり減少させたりする制御を所望の条件に応じて実施することが可能となる。
【0015】
例えば、大腸菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させて、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸の産生量を増加させることが可能となる。逆に、電極の電位を酸化電位に制御することで、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Aへの酸化反応を促進させて、バイオ燃料として有用なエタノールの産生量を増加させることが可能となる。
【0016】
また、加水分解菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御することで、酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Aへの酸化反応を減退させ、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させることができるので、例えば培養環境をメタン発酵槽とした場合には、メタン発酵槽の酸敗を引き起こし得る酢酸の産生量を低下させることが可能となり、メタン発酵槽の酸敗を防いで長期安定化を実現することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】大腸菌の代謝経路を示す図である。
【図2】サーモトガ マリティマ(Thermotoga maritima)の代謝経路を示す図である。
【図3】第一の実施形態Aにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図4】第一の実施形態Bにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図5】第一の実施形態Cにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図6】第一の実施形態Dにかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図7】第二の実施形態にかかる電気培養装置の一例を示す断面図である。
【図8】本発明を実施するための電気培養装置の他の構成の一例を示す断面図である。
【図9】菌体密度の経時変化を示す図である(実施例1)。
【図10】培養液中のスターチ残存量を示す図である(実施例1)。
【図11】ガス発生量を示す図である(実施例1)。
【図12】培養液のpHの経時変化を示す図である(実施例1)。
【図13】培養液の酢酸濃度の経時変化を示す図である(実施例1)。
【図14】培養試験における培養液の乳酸濃度の経時変化を示す図である(実施例1)。
【図15】培養期間中の電流値の測定結果を示す図である(実施例1)。
【図16】培養液の乳酸濃度を示す図である(実施例2)。
【図17】培養液の酢酸及びエタノール濃度を示す図である(実施例2)。
【図18】実施例において使用した電気培養装置の構成を示す断面図である。
【図19】実施例において使用した電気培養装置の小容器の構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【0019】
本発明の微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を制御しながら培養することにより、微生物のピルビン酸を起点とした代謝を制御するようにしている。
【0020】
より具体的には、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物を制御対象微生物とし、この微生物を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を促進させると共に酸化経路における酸化反応を減退させるようにしている。逆に、電極の電位を酸化電位に制御しながら培養することにより、還元経路における還元反応を減退させると共に酸化経路における酸化反応を促進させるようにしている。
【0021】
本発明を適用する対象となり得る微生物としては、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物であれば特に限定されない。例えば、好適には、大腸菌、加水分解菌が挙げられるが、他にも、ヘテロ乳酸発酵を行う乳酸菌 (例えばLactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactococcus cremoris, L. buchnerii, L. cellobisous, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus helveticus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc oenos等) や、 ホモ乳酸発酵を行う乳酸菌(Lactobacillus delburueckii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvantus, Lactobacillus plantarum, Sporolactobacillus inulinus, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Pdeiococcus damnosus, Streptococcus acidominimus, Streptococcus agalactiae, Streptococcusequinus, Streptococcus milleri, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus uberis等)、 Bacillus subtilis, Bacillus caldolyticus, Bacillus megaterium, Carnobacterium divergens, Lactosphaera pasteurii, Oenococcus oeni, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae, Clostridium perfringens, Clostridium thermocellum, Salmonella enterica, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Serratia marcescens, Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Geobacillus stearothermophilus, Thermoanaerobacter ethanolicus, Bacillus caldolyticus, Nocardia asteroids, Selenomonas ruminantium, Actinomyces viscosus, Butyrivibrio fibrisolvens, Staphylococcus aureus, Rhizopus oryzae, Acinetobacter calcoaceticus等が挙げられる。
【0022】
ここで、好適な微生物として例示した大腸菌の代謝経路(図1)に基づいて本発明を説明する。ピルビン酸はグルコースからホスホエノールピルビン酸を経て産生される。このピルビン酸は還元経路を経て乳酸に還元され、酸化経路を経てアセチル補酵素A(アセチル−CoA)に酸化される。アセチル補酵素Aはアセチルアルデヒドを経てエタノールに変換され、アセチル−Pを経て酢酸に変換される。即ち、大腸菌は、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物である。
【0023】
大腸菌を含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御すると、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が促進され、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Aへの酸化反応が減退する。これにより、乳酸の産生量が増加し、酢酸及びエタノールの産生量が減少する。この場合、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸を大腸菌により多く産生させることが可能となる。
【0024】
これとは逆に、電極の電位を酸化電位に制御すると、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が減退し、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Aへの酸化反応が促進される。これにより、乳酸の産生量が減少し、酢酸及びエタノールの産生量が増加する。この場合、バイオ燃料として有用なエタノールを大腸菌により多く産生させることが可能となる。
【0025】
次に、好適な微生物として例示した加水分解菌のうち、超好熱性の加水分解菌であるサーモトガ マリティマ(Thermotoga maritima、以下、サーモトガと呼ぶこともある)の代謝経路(図2)に基づいて本発明を説明する。ピルビン酸はグルコースからグリセルアルデヒド 3−ホスフェート及び1,3−ビスホスホグリセリン酸を経て産生される。このピルビン酸は酸化経路を経てアセチル補酵素A(アセチル−CoA)に酸化される。アセチル補酵素Aは酢酸に変換される。また、通常はピルビン酸からの乳酸の産生が殆ど起こらないが、培養条件等によってはピルビン酸から乳酸が産生され得る。したがって、サーモトガは、ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物である。
【0026】
サーモトガを含む培養環境に電極を接触させ、電極の電位を還元電位に制御すると、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が促進され、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Aへの酸化反応が減退する。これにより、通常は殆ど乳酸を産生することのないサーモトガが、ピルビン酸を還元して乳酸を産生するようになると共に、酢酸の産生量が減少する。これにより、例えば培養環境をメタン発酵槽とした場合に、メタン発酵槽の酸敗を引き起こし得る酢酸の産生量を低下させることが可能となり、メタン発酵槽の酸敗を防いで長期安定化を実現することが可能となる。
【0027】
また、ヘテロ乳酸発酵を行う乳酸菌もピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物であり、電極の電位を還元電位とすることで、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が促進され、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Aへの酸化反応が減退する。逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、還元経路におけるピルビン酸から乳酸への還元反応が減退し、酸化経路におけるピルビン酸からアセチル補酵素Aへの酸化反応が促進される。ヘテロ乳酸発酵においても、アセチル補酵素Aを経て酢酸やエタノールが産生される。したがって、大腸菌の場合と同様、電極の電位を還元電位とすることで、生分解性プラスチックであるポリ乳酸の原料として有用な乳酸を乳酸菌により多く産生させることが可能となる。逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、バイオ燃料として有用なエタノールを乳酸菌により多く産生させることが可能となる。
【0028】
また、ホモ乳酸発酵を行う乳酸菌においても、培養条件等によっては酢酸等の副産物が微量ではあるが産生され得ることから、本発明における制御対象微生物とすることで、ヘテロ乳酸発酵を行う乳酸菌と同様の効果が奏され得る。また、ホモ乳酸発酵を行う乳酸菌のピルビン酸からの代謝経路がピルビン酸から乳酸への代謝経路に限定される場合であっても、電極の電位を還元電位とすることで、ピルビン酸から乳酸への還元反応を促進して乳酸の産生量を増加させ得る。逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、ピルビン酸から乳酸への還元反応を減退して乳酸の産生量を減少させ得る。
【0029】
ここで、本発明において、電極電位の還元電位への制御は、電極電位を培養環境の酸化還元電位よりも小さくすることで実現される。逆に、電極電位の酸化電位への制御は、電極電位を培養環境の酸化還元電位よりも大きくすることで実現される。
【0030】
即ち、培養環境の酸化還元電位をA(V)とし、電極電位をX(V)とすると、電極電位Xの還元電位への制御は、X<Aとすることで実現される。逆に、電極電位Xの酸化電位への制御は、X>Aとすることで実現される。
【0031】
具体的には、電極電位Xの還元電位への制御は、銀・塩化銀電極電位基準で、X≦−0.6(V)とすることが好適であり、X<−0.6(V)とすることがより好適であり、X≦−0.8(V)とすることがさらに好適である。但し、電極電位Xを低くし過ぎると、例えば培養環境において水の電気分解等が生じることにより、投入した電気エネルギーが代謝経路の制御以外にも消費され得るので、X≧−1.4(V)とすることが好適であり、X≧−1.2(V)とすることがより好適であり、X≧−1.0(V)とすることがさらに好適である。
【0032】
尚、X≦−0.6(V)とすることで、加水分解菌を制御対象微生物とした場合に、微生物の増殖開始時間が短縮される効果が得られることが本願発明者等の実験により確認されている。また、X≦−0.8(V)とすることで、上記効果に加えて、有機物の分解促進効果及び水素発生量の顕著な増加効果、さらには培養環境のpHの中性維持効果が奏され得ることから、加水分解菌を制御対象微生物とした場合には、X≦−0.6(V)、特にX≦−0.8(V)とすることが極めて好適であると言える。
【0033】
次に、電極電位Xの酸化電位への制御は、銀・塩化銀電極電位基準で、X≧−0.3(V)とすることが好適であり、X>−0.3(V)とすることがより好適であり、X≧0(V)とすることがさらに好適である。但し、電極電位Xをプラス側に大きくしすぎると、培養環境からの水の電気分解等が生じ、代謝産物の制御以外にも投入した電気エネルギーが消費され得るので、X≦+1.4(V)とすることが好適であり、X≦+1.2(V)とすることがより好適であり、X≦+1.0(V)とすることがさらに好適である。
【0034】
ここで、培養環境(培養液)には、微生物の代謝を阻害することのない酸化還元物質を添加するようにしてもよい。酸化還元物質を添加することで、培養環境の電位を制御し易くできる。酸化還元物質としては、鉄イオン、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲンなどのビオロゲン誘導体等を用いることができる。尚、酸化還元物質として鉄イオンを用いる場合には、鉄イオンをキレート剤に配位させて、鉄イオンを培養液中で安定に存在させるようにすることが好ましい。キレート剤としては、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、テトラエチレントリアミン(TET)、エチレンジアミン(EDA)、ジエチレントリアミン(DETA)、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチン等、鉄イオンを配位し得る任意のキレート剤を挙げることができる。
【0035】
また、電極電位を制御する際には、電極(作用電極)を培養環境(例えば培養液)と接触させ、この電極と対を成す電極(対電極)をイオン交換膜を介して培養環境と接触させるようにしてもよい。また、対電極とイオン交換膜は直接接触させてもよいし、電解液を介して間接的に接触させてもよい。イオン交換膜は酸化還元物質を透過させることなく培養液に留めることができるものとすることが好ましい。この場合、培養液全体の電位を制御し易いものとできる。但し、イオン交換膜を設けずとも、作用電極の周辺の電位は制御されるので、本発明の効果は奏され得る。したがって、イオン交換膜の使用は必須ではない。また、イオン交換膜に代えて、透析膜を使用するようにしてもよい。
【0036】
本発明の微生物の代謝経路制御方法は、例えば、図3〜7に示す電気培養装置により実施される。以下、第一の実施形態を図3〜図6に基づいて説明し、第二の実施形態を図7に基づいて説明する。
【0037】
<第一の実施形態>
第一の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を培養液に投入し、培養液と電解液とをイオン交換膜を介して接触させ、培養液に作用電極と参照電極を接触させ、電解液に対電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、作用電極の電位を3電極方式で制御して、微生物の代謝経路を制御するようにしている。
【0038】
第一の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、例えば図3〜6に示す電気培養装置1により実施される。即ち、図3〜図6に示す電気培養装置1は、イオン交換膜6によって仕切られた二つの槽のうちの一方の槽を培養槽7とし、他方の槽を対電極槽8とし、培養槽7には微生物と酸化還元物質とを含む培養液4が収容されると共に作用電極9と参照電極11が浸され、対電極槽8には電解液4aが収容されると共に対電極10が浸され、作用電極9と対電極10と参照電極11は定電位設定装置12に結線され、定電位設定装置12により作用電極9の電位を3電極方式で制御するようにしている。
【0039】
このように、3電極方式で作用電極9の電位を制御することで、作用電極9の電位を厳密に設定電位に制御することができる。詳細には、定電位設定装置(ポテンシオスタット)12により、作用電極9と参照電極11との間の電位差を測定し、この電位差が設定電位に達するように作用電極9と対電極10との間に電流を流し、基準となる参照電極11には一切電流が流れないようにしている。尚、3電極方式による電位制御については、例えば、電気化学測定法(上)、技報動出版株式会社、第1版15刷、2004年6月発行の6〜9ページにその詳細が記載されている。但し、作用電極9と対電極10の極間電圧のみで作用電極9の電位を制御できる場合には、3電極方式とせずともよい。
【0040】
また、図3〜図6に示す電気培養装置1では、培養槽7内の培養液4の液面よりも上部の空間(ヘッドスペース)に滞留するガスを培養槽7の外(電気培養装置1の外)へ導くガス排出管15aを備え、このガス排出管15aをバルブ15bにより開閉可能としたガス回収手段15により、培養槽7内のガスを回収するようにしている。但し、ガスの回収方法は、この方法に限定されない。例えば、ガス回収手段15を備えることなく、培養槽7の上部に開口部を設けて合成ゴム等(例えばシリコーンゴム)の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガスを回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がる。したがって、ガスの回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽7からガスが漏れ出すことがない。このようにしてガスを回収することで、ガスや揮発物を産生する微生物、例えば水素を産生する加水分解菌を対象として代謝経路制御を行った場合に発生する水素を漏れなく回収することができる。そして、加水分解菌を対象として代謝経路制御を行った場合に奏され得る水素発生量の顕著な増加効果により、ヘッドスペースに多量に滞留し得る水素ガスを漏れなく回収することが可能となる。また、代謝産物がエタノールや酢酸等のように揮発性物質の場合には、ヘッドスペースに滞留する揮発分を回収することも可能となる。
【0041】
さらに、図3〜図6に示す電気培養装置1では、培養槽7内の培養液4の液面よりも下部に、培養槽7内の培養液4を培養槽7の外に導く培養液排出管16aを備え、この培養液排出管16aをバルブ16bにより開閉可能とした培養液採取手段16により、培養槽7内から培養液4を採取するようにしている。但し、培養液4の採取方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養液採取手段16を備えることなく、培養槽7に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液4を採取するようにしてもよい。または両端が開口された管の一端の注射器に接続し、他端を培養液4に浸けて、管を介して培養液4を採取するようにしてもよい。このようにして培養液4を回収することで、培養液4に含まれる微生物2の代謝産物を回収することができる。
【0042】
また、ガス回収手段15や培養液採取手段16とは別に、培養液4に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽7の外部から培養液4に物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、培養液4に栄養源、中和剤、物質生産に必要な物質等を必要に応じて添加することができる。勿論、微生物2をこの導入管から供給することもできる。また、嫌気条件とするためのガス(窒素ガス等)を供給することもできる。但し、培養液4に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段15や培養液採取手段16を培養液4に物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液4に物質を添加・供給するようにしてもよい。
【0043】
以下、図3に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Aとして説明し、図4に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Bとして説明し、図5に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Cとして説明し、図6に示す電気培養装置を用いた場合を第一の実施形態Dとして説明する。
【0044】
(第一の実施形態A)
図3に示す電気培養装置1は、密閉構造の容器20を培養槽7とし、容器20に収容可能な密閉構造の小容器21を対電極槽8とし、小容器21は少なくとも一部にイオン交換膜6を備えると共にガス(対電極10から発生するガス)を容器20の外に排出するガス排出管22を備えるものとしている。また、対電極10と定電位設定装置12を結線する配線は、ガス排出管22の中を通過させている。尚、図3に示す電気培養装置1では、対電極10と定電位設定装置12を結線する配線は、ガス排出管22の中を通過させているが、必ずしもこの構成には限定されず、配線をガス排出管22を通さずに定電位設定装置12と結線するようにしてもよい。
【0045】
培養槽7としての密閉構造の容器20は、対電極槽8としての密閉構造の小容器21を収容可能な大きさの容器であり、形状は特に限定されない。容器の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過性の膜材をヒートシール等により袋状に形成した容器を培養槽7として用いるようにしてもよい。
【0046】
対電極槽8としての密閉構造の小容器21は、培養槽7としての容器20に収容可能な大きさの容器であり、少なくとも一部にイオン交換膜6を備えるものとしている。ここで、小容器21はその全体をイオン交換膜6で形成した袋状の容器としてもよいが、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜6で構成したり、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜6のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜6を用いる場合には、その他の部分は容器20と同様の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜6以外の膜材、例えばガス不透過性の膜材により構成してもよい。
【0047】
このように、容器20に小容器21を収容することで、容器20に収容されている培養液4に小容器21が浸され、小容器21の少なくとも一部に備えられているイオン交換膜6は培養液4と接触する。換言すれば、培養液4はイオン交換膜6を介して電解液4aと接触する。
【0048】
ここで、第一の実施形態Aでは、小容器21を密閉構造とすることが好ましい。この場合、小容器21において発生するガスを容器20の外に排出するガス排出管を備えるようにすることで、対電極10から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく回収することができる。但し、小容器21は必ずしも密閉構造とせずともよい。
【0049】
また、培養槽7(容器20)は、密閉構造とすることが好ましい。この場合には、培養槽7を嫌気条件に制御し易い。さらに、微生物がガスを産生する場合には、培養槽7を密閉構造とし、且つ上述のガス回収手段15等を備えることが好ましい。この場合には、微生物が産生するガスを容器20の外に漏れ出させることなく、ガスによる容器20内の圧力上昇を防ぎながらその全量を回収し易いものとできる。但し、培養槽7を密閉構造とすることは必須条件ではない。即ち、微生物がガスを産生して培養液4の液面からガスが発生することによって、培養液4の液面への遊離酸素の接触が抑制され、培養槽7の嫌気条件が維持され得るような場合には、培養槽7を密閉構造とせずとも構わない。
【0050】
本実施形態において使用できる作用電極9は、特に限定されるものではなく、その表面にて酸化反応または還元反応が生じ得る電極、例えば炭素電極や白金電極等を適宜用いることができる。また、対電極10としては、作用電極9における酸化反応または還元反応を補完する反応が生じ得る電極、例えば炭素電極や白金電極等を適宜用いることができる。
【0051】
(第一の実施形態B)
図4に示す電気培養装置1は、上方が開放されている容器23をイオン交換膜6で仕切ることにより開放された二つの槽が形成され、培養槽7としての一方の槽の上方開放部がガス不透過膜またはガス不透過部材24により塞がれているものとしている。つまり、図4に示す電気培養装置1は、イオン交換膜6による培養槽7と対電極槽8の仕切り構成以外は、実質的には図3と同一の構成であり、図3に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が奏され得る。
【0052】
尚、図4に示す電気培養装置1において、対電極槽8は、開放したままでもよいが、培養槽7と同様に密閉構造とし、対電極槽8において発生するガスを対電極槽8の外に排出するガス排出管を備えるようにしてもよい。このように構成することで、対電極10から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく回収することができる。
【0053】
また、図4に示す電気培養装置1において、培養槽7のヘッドスペースと対電極槽8のヘッドスペースは連通させてもよいし、隔壁等により仕切って連通させないようにしてもよい。
【0054】
また、培養槽7は、第一の実施形態Aと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段15等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【0055】
図4に示す電気培養装置1において、ガス不透過膜またはガス不透過部材24としては、各種分野で一般に用いられているものを適宜用いることができる。例えば、ガス不透過部材としては、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過膜としては、例えばイオン交換膜6を用いることもできるがこれに限定されるものではない。
【0056】
尚、本実施形態において使用できる容器23の材質は、第一の実施形態Aと同様である。本実施形態において使用できる作用電極9と対電極10についても、第一の実施形態Aと同様である。
【0057】
(第一の実施形態C)
図5に示す電気培養装置1は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器25aと25bがイオン交換膜6を介して開口部で連結されてU字型の容器25が形成され、一方の容器25aを密閉構造として培養槽7とし、他方の容器25bを開放して対電極槽8としている。この場合、培養液4と電解液4aがイオン交換膜6を介して接触すると共に、培養槽7の培養液4の液面よりも上部の空間と対電極槽8の電解液4aの液面よりも上部の空間とが容器25自体のU字型構造によって隔てて配置される。つまり、図5に示す電気培養装置1は、容器25の形状以外の構成については、実質的には図4と同一の構成である。したがって、図4(さらには図3)に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が奏され得る。
【0058】
ここで、第一の実施形態Cにおける電気培養装置1の他方の容器25bの開放とは、例えば他方の容器25bの端部を完全に開放した場合は勿論のこと、図5に示すように、一方の容器25aと同様に密閉構造としつつ、対電極槽8において発生するガスを対電極槽8の外の排出するガス排出管22を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管22を備えることで、対電極槽8から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく容易に回収することが可能となる。
【0059】
また、培養槽7は、第一の実施形態Aと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段15等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【0060】
尚、本実施形態において使用できる容器25の材質は、第一の実施形態Aと同様である。本実施形態において使用できる作用電極9と対電極10についても、第一の実施形態Aと同様である。
【0061】
(第一の実施形態D)
図6に示す電気培養装置1は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器26aと26bがイオン交換膜6を介して開口部で連結されてH字型の容器26が形成され、一方の容器26aを密閉構造として培養槽7とし、他方の容器26bを開放して対電極槽8としている。この場合にも、培養液4と電解液4aがイオン交換膜6を介して接触すると共に、培養槽7の培養液4の液面よりも上部の空間と対電極槽8の電解液4aの液面よりも上部の空間とが容器26自体のH字型構造によって隔てて配置される。つまり、図6に示す電気培養装置1は、容器25の形状以外の構成については、実質的には図4と同一の構成である。したがって、図4(さらには図3)に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が奏され得る。
【0062】
ここで、第一の実施形態Dにおける電気培養装置1の他方の容器26bの開放とは、例えば他方の容器26bの上部等を完全に開放した場合は勿論のこと、図6に示すように、一方の容器25aと同様に密閉構造としつつ、対電極槽8において発生するガスを対電極槽8の外の排出するガス排出管22を備える場合も含むことを意味している。ガス排出管22を備えることで、対電極槽8から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく容易に回収することが可能となる。
【0063】
また、培養槽7は、第一の実施形態Aと同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段15等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。
【0064】
尚、本実施形態において使用できる容器26の材質は、第一の実施形態Aと同様である。本実施形態において使用できる作用電極9と対電極10についても、第一の実施形態Aと同様である。
【0065】
<第二の実施形態>
第二の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を培養液に投入し、培養液に作用電極と参照電極を接触させ、培養液と対電極とをイオン交換膜を介して接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、作用電極の電位を3電極方式で制御して、微生物の代謝経路を制御するようにしている。つまり、第一の実施形態における微生物の代謝経路制御方法とは、電解液を用いることなく対電極を直接イオン交換膜に接触させている点のみが異なっている。
【0066】
しかしながら、第一の実施形態のように電解液4aを用いずとも、作用電極9と対電極10との間でイオン交換膜6を介してイオン電流は流れるので、第二の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法によれば、第一の実施形態と同様に作用電極9の電位を制御して、同様の効果を得ることが可能である。
【0067】
第二の実施形態にかかる微生物の代謝経路制御方法は、例えば図7に示す電気培養装置により実施される。図7に示す電気培養装置1は、イオン交換膜6を少なくとも一部に備える密閉構造の容器5内に作用電極9と参照電極11が配置され、容器5の外側に対電極10が配置され、容器5に培養液4が収容されると共に作用電極9と参照電極11が培養液4に浸され、容器4のイオン交換膜6は容器5に培養液4が収容されたときに少なくともその一部がイオン交換膜6と接触しうる位置に備えられ、イオン交換膜6の培養液4の接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極10が接触して配置されているものとしている。図7に示す電気培養装置1では、容器5の培養液4の液面よりも下部に開口部5aが設けられ、開口部5aがイオン交換膜6で塞がれ、容器5の外側のイオン交換膜6の表面の少なくとも一部に対電極10が接触して配置されているものとしている。つまり、図7に示す電気培養装置1では、容器5全体が培養槽7として機能することとなる。
【0068】
したがって、図7に示す電気培養装置1によれば、容器5を密閉構造としているので、容器5からガスが漏洩することがない。また、第一の実施形態と同様、容器5内を嫌気条件に制御し易い利点もある。
【0069】
尚、図7に示す電気培養装置1では、第一の実施形態と同様に、ガス回収手段15、培養液採取手段16を備えるようにしているが、上記の通り、ガス回収方法、培養液採取方法は、これらの手段を利用したものには限定されない。また、第一の実施形態と同様、培養液4に物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。
【0070】
以下、図7に示す電気培養装置1の詳細について説明する。但し、以下に説明する以外の構成については、第一の実施形態と実質的に同一であり、説明は省略する。
【0071】
容器5は、イオン交換膜6を少なくとも一部に備える密閉構造としている。容器5の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。尚、図7では、密閉構造の容器5の培養液4の液面よりも下部に設けられた開口部5aをイオン交換膜6により塞ぐようにしているが、容器5の形態や構造は特に限定されない。例えば容器5全体をイオン交換膜6で形成した袋状の容器としてもよいし、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜6で構成してもよいし、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜6のみで構成するようにしてもよい。部分的にイオン交換膜6を用いる場合には、その他の部分はガラス等の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜6以外の膜材、例えば培養液4と培養液4中の成分の双方を透過させることがない膜材により構成してもよい。要は、容器5に収容される培養液4が容器5の少なくとも一部を構成するイオン交換膜6と接触しうる構造の容器とすればよい。
【0072】
対電極10は、イオン交換膜6の培養液4との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に接触させるようにしている。本実施形態において、対電極10は板状の炭素電極としているが、対電極10の形状と材質はこれに限定されるものではなく、要は、イオン交換膜6との接触が可能な形状であり、且つ作用電極9における酸化反応に対して電子の授受を補完する還元反応を進行させることが可能な材質、つまり、作用電極9において還元反応が生じる際に酸化反応を進行させることが可能な材質の電極とすればよい。また、本実施形態では、対電極10の面積をイオン交換膜6の面積よりも大きなものとしてイオン交換膜6全体を対電極10で完全に覆うようにし、イオン交換膜6と対電極10とを接触させるようにしているが、イオン交換膜6の培養液4との接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対電極10を接触させれば、イオン交換膜6を介して培養液4から対電極10にイオンが伝達するので、必ずしもイオン交換膜6全体を対電極10で完全に覆うようにしてイオン交換膜6と対電極10とを接触させずともよい。但し、イオン交換膜6全体を対電極10で完全に覆うことで、対電極10をイオン交換膜6の保護材としても機能させることができると共に、培養液4からのイオンの伝達面が増大する結果として、培養液4の電位制御性を高めることができる利点があり、好適である。イオン交換膜6全体を対電極10で完全に覆う方法としては、例えば、容器5の開口部5aの周囲に接着剤を塗布して対電極10を接着することにより、開口部5aを塞ぐイオン交換膜6全体と対電極10とを接触させるようにしてもよいし、容器5の開口部5aの周囲に接着剤を塗布して対電極10の表面の少なくとも一部に塗布形成されたイオン交換膜6を接着することにより、開口部5aをイオン交換膜6で塞ぎつつ、開口部5aを塞ぐイオン交換膜6全体と対電極10とを接触させるようにしてもよい。イオン交換膜6を塗布形成するための薬剤としては、例えばナフィオン分散液が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、対電極10の表面にナフィオン分散液を塗布し、ナフィオン分散液が乾燥する前にイオン交換膜6を貼り付けるようにしてもよい。この場合には、イオン交換膜6の対電極10の表面への接着性と接触性とを十分なものとすることができる。
【0073】
ここで、対電極10は多孔質体とすることが好適である。この場合には、イオン交換膜6と対電極10との接触面で発生したガスを接触面とは反対側の面に通過させやすくなる。尚、対電極10を多孔質体とし、ナフィオン分散液を用いてイオン交換膜6を貼り付けることで、ナフィオン分散液の多孔質体の孔への侵入によりイオン交換膜6と対電極10との接触面積を増大させて電気化学反応をより進行させやすくすることができ、好適である。
【0074】
また、培養槽7として機能する容器5は、第一の実施形態と同様、密閉構造とすること、及びガス回収手段15等を備えることが好ましいが、必ずしもこれらの構成を採らずともよい。また、容器5の外側の対電極10をガス不透過部材等で覆って密封構造とし、対電極10から発生するガスを回収するためのガス回収手段を設けてもよい。このように構成することで、対電極10から有用なガスが発生する場合には、これを漏れなく回収することができる。
【0075】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、図8に示すように、培養液4と電解質4aをイオン交換膜6ではなく、イオンや微生物を一切透過させることのない不透過部材40で隔て、あるいは培養槽7と対電極槽8を別の容器で形成し、塩橋41(寒天等にKCl等の飽和電解質溶液を入れたもの)を介して培養液4と電解質4aを接触(液絡)させるようにしてもよい。この場合にも、塩橋41によってイオン電流の流れが許容され、上述の実施形態と同様の効果が得られる。
【実施例】
【0076】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【0077】
<実験装置>
(1)実施例1において使用した電気培養装置
実施例1では、図6に示す電気培養装置を用いて実験を行った。250mL容の2つのガラスバイアル瓶(Duran製)のうちの一方を培養槽7とし、他方を対電極槽26bとし、下部開口部において陽イオン交換膜(ナフィオンK、デュポン製)106を介して2つのバイアル瓶を接続し、H字型の容器26とした。培養槽7には蓋をし、蓋の上面にはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極を通した際の密閉製を確保した。
【0078】
培養期間中に培養槽7から発生したガスは、ガス回収手段15に接続したアルミニウム製サンプリングバッグ(ジーエルサイエンス製、商品名:アルミニウムバッグ、1L)に回収した。
【0079】
対電極槽8には、電解液4aを収容すると共に対電極10を収容して電解液4aに浸した。対電極槽8も蓋をし、蓋の上面にはシリコーンゴム栓を設けて、シリコーンゴム栓にガス排出管22を貫通させた。そして、対電極10と電位制御装置12を結線するための配線をガス排出管22に通した。ガス排出管22は両端が開口されており、一端を対電極槽8の内部に、他端を対電極槽8の外側に配置するようにした。
【0080】
作用電極9は、培養槽7に収容して培養液4に浸し、作用電極9から電位制御装置12への配線はシリコーンゴム栓を通して培養槽7の外側に引き出した。参照電極11(銀・塩化銀電極(RE-1B, BAS株式会社))は培養槽7の外側からシリコーンゴム栓に差し込んで、培養液4と接触させた。作用電極9と対電極10と参照電極11とを3電極式の定電位設定装置(ポテンシオスタット)12に結線して、作用電極9の電位を厳密に制御可能とした。培養中は攪拌子により培養液4を攪拌した。
【0081】
作用電極9は炭素電極(サイズ:7.5 cm ×2.5 cm)とした。対電極10は炭素電極(サイズ:6.5 cm×1.2 cm)とした。
【0082】
(2)実施例2において使用した電気培養装置
実施例2では、図18に示す電気培養装置を用いて実験を行った。培養槽7としての容器20は250mL容のガラスバイアル瓶(Duran製)とした。培養液4は容器20の八分目程度まで入れた。容器20には蓋30をした。蓋30の上面30aにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器20の密閉性を確保した。また、シリコーンゴム栓を設けることにより注射針の突き刺しを可能とし、且つ注射針の差し込みにより生じた孔が注射針を抜いた際に塞がるようにした。
【0083】
対電極槽8としての小容器21は、イオン交換膜6を成型して袋状(以下、袋21と呼ぶ)とした。実験で用いた小容器21の形態を図19に示す。具体的には、イオン交換膜(ナフィオンK、デュポン製)をヒートシーラーで熱圧着により加工して上部が開口した袋状の容器21とし、袋21の内部には電解液4aを収容すると共に対電極10を収容して電解液4aに浸した。そして、対電極10と定電位設定装置12を結線するための配線31をガス排出管22に通した。ガス排出管22は両端が開口されており、一端を小容器21の内部に、他端を容器20の外側に配置するようにして、小容器21内で発生するガスが容器20の外側に排出されるようにした。袋状の小容器21の上部の開口部は、シリコン接着剤32で塞いだ。
【0084】
小容器21と作用電極9とを培養液4に浸漬し、小容器21のガス排出管22と作用電極4の配線は蓋30に設けたシリコーンゴム栓に通して容器20の外側に引き出した。銀・塩化銀参照電極11(RE-1B, BAS株式会社)は容器20の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことにより培養液4と接触させた。培養液採取管16は容器20の外側からシリコーンゴム栓に通して差し込むことによりその一端を培養液4と接触させた。作用電極9と対電極10と参照電極11とを3電極式の定電位設定装置(ポテンシオスタット)12に結線して、作用電極9の電位を厳密に制御可能とした。培養液採取管16の他端は注射器と接続して培養液4を採取可能とした。培養中は攪拌子34により培養液4を攪拌した。
【0085】
作用電極9は炭素電極(サイズ:7.5 cm ×2.5 cm)とした。対電極10は炭素電極(サイズ:6.5 cm×1.2 cm)とした。
【0086】
<分析方法>
【0087】
菌体密度は、測定値(OD660)から計算した。
【0088】
培養液4のスターチ濃度は、フェノール/硫酸法により測定した。
【0089】
図18に示す電気培養装置1のサンプリングバッグに回収されたガスの量を水上置換法を用いて分析し、ガスの組成をガスクロマトグラフィー(VARIAN、CR4900)で分析して、これらの分析結果を基に、COガス量とHガス量を計算した。
【0090】
培養液4の乳酸濃度及び酢酸濃度は、イオンクロマトグラフィー(ICS-2000、DIONEX製)にて測定した。
【0091】
エタノール濃度は、液体クロマトグラフィー(LachromeElite, Hitachi)にて測定した。
【0092】
(実施例1)
ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物として、超好熱性の加水分解菌であるサーモトガ マリティマ DSM3109(Thermotoga maritima DSM3109、以下、サーモトガと呼ぶ)を用いて、培養試験を実施した。
【0093】
以下の組成の培地(JSCC237, Thermotoga medium)を培養液4とし、初期菌体密度を3.2×10cells/mLとなるようにサーモトガをこの培養液4に添加して、これを培養槽7に250mL収容した。
[培地組成]
スターチ :1.0g
KHPO:0.5g
NaCl :20g
NiCl・HO :0.002g
イーストエクストラクト:0.5g
人工海水 :250mL
微量元素溶液 :10mL
pH6.5
[微量元素溶液の組成(L−1)]
ニトリロ三酢酸 1.5g
MgSO4・7H2O 3g
MnSO4・2H2O 0.5g
NaCl 1.0g
FeSO4・7H2O 0.1g
CoSO4・7H2O 0.18g
CaCl2・2H2O 0.1g
ZnSO4・7H2O 0.18g
CuSO4・5H2O 0.01g
H3BO3 0.01g
Na2MoO4・2H2O 0.01g
NiCl2・6H2O 0.025g
Na2SeO3・5H2O 0.8mg
Na2WO4 0.8mg
KAl(SO4)2・12H2O 4mg
水 1L
[人工海水]
MgSO4・7H2O 7g
MgCl2・6H2O 5.5g
NaCl 27.7g
CaCl2・2H2O 2.25g
KCl 0.65g
NaBr 0.1g
H3BO3 30mg
SrCl2・6H2O 15mg
クエン酸 10mg
KI 0.05mg
水 1L
【0094】
電解液4aは、NaCl溶液(30g/L)とした。
【0095】
培養温度(培養液温度)は80℃とした。
【0096】
酸化還元物質として、アントラキノン 2,6−ジスルホン酸(AQDS)を0.2mMとなるように培養液4に添加した。
【0097】
作用電極9の設定電位は、銀・塩化銀電極電位基準で、−0.8V、−0.6V、−0.3V、0V、+0.3Vとして培養試験を実施した。
【0098】
また、コントロールとして、培養液4にNaSとL−システインを0.5g/L添加して通電無しで培養試験を実施した。このときの培養液4の酸化還元電位は約−0.45Vであったことから、本実施例では、設定電位を−0.8V、−0.6Vとした場合には作用電極9の電位が還元電位に制御されていることになり、設定電位を−0.3V、0V、+0.3Vとした場合には作用電極9の電位が酸化電位に制御されていることになる。
【0099】
培養槽7を窒素パージし、培養槽7を嫌気条件としてから培養試験を開始した。
【0100】
菌体密度の経時変化を図9に示す。設定電位を−0.3V、−0.6V、−0.8Vにすることで、最終菌体密度をコントロールと同程度にできると共に、−0.6V、−0.8Vとすることで、増殖開始までの時間がコントロールよりも短縮される傾向が見られた。
【0101】
培養試験終了後のスターチの残存量を図10に示す。設定電位を−0.8Vとすることで、コントロールよりもスターチ濃度が減少している傾向が見られた。このことから、設定電位を−0.8Vとすることで、スターチの分解量が増加していることが明らかとなった。
【0102】
ガス発生量の測定結果を図11に示す。二酸化炭素発生量については条件による違いが殆ど見られなかったものの、設定電位を−0.8Vとすることで、コントロールよりも水素発生量が顕著に増加することが明らかとなった。
【0103】
培養液4のpHの経時変化を図12に示す。設定電位を−0.8Vとすることで、培養液4のpHを7付近に維持できることが明らかとなった。
【0104】
培養液4の酢酸濃度の経時変化を図13に示す。設定電位を−0.6V、−0.8Vとすることで、コントロールよりも酢酸濃度が低下する傾向が見られた。
【0105】
培養液4の乳酸濃度の経時変化を図14に示す。コントロールでは全培養期間に亘って乳酸が検出されなかったが、設定電位を−0.6V、−0.8Vとすることで、乳酸が検出されるようになることが確認された。
【0106】
培養期間中における電流値の測定結果を図15に示す。通電開始時点で設定した電位環境に調整するために電流が流れ、それ以後、サーモトガの増殖が定常期に入るまでは電流はほぼ一定値を示した。このことから、増殖の過程で、酸化還元物質として添加したAQDSとサーモトガとの間で電子授受は生じていないものと考えられた。したがって、本発明の効果は、AQDS等の酸化還元物質と微生物との間における電子授受に依存するものではないことが明らかとなった。また、設定電位を−0.8Vとした場合には、培養後期においてより多くの還元電流が流れていることが確認されたことから、この還元電流の増加が、水素発生量の増加と何らかの相関を有している可能性が示唆された。
【0107】
以上の結果から、作用電極9の設定電位を還元電位(−0.6V、−0.8V)とすることで、サーモトガの酸化経路におけるピルビン酸のアセチル補酵素Aへの酸化反応を減退させて酢酸産生量を減少させることができると共に、還元経路におけるピルビン酸の乳酸への還元反応を促進させて、乳酸の産生が可能になることが示された。また、増殖開始までの時間が短縮される効果が得られることも明らかとなった。
【0108】
さらに、作用電極9の設定電位を−0.8Vとすることで、有機物の分解促進効果、水素発生量の顕著な増加効果、pHの中性維持効果が得られることがわかった。即ち、有機物の分解効率を高めて、水素発生量を顕著に増加させながらも、培養液4のpHを酸性シフトさせることなく中性領域に維持できる極めて優れた効果が奏されることが明らかとなった。
【0109】
尚、設定電位を−0.8Vとすることで、水素発生量が顕著に増加したこと、及びpHが中性に維持されたことから、設定電位を−0.8Vとすることで、還元力が水素として系外に放出された可能性が示唆された。
【0110】
(実施例2)
ピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物として、大腸菌を用いて培養試験を実施した。
【0111】
以下の組成の培養液4に、大腸菌(E.coli JM109)を初期菌体密度を8×106 cells/mLとなるように添加して、これを培養槽7に200mL収容した。
[培養液の組成(L−1)]
・グルコース: 5.0g
・KHPO: 4.2g
・NHCl: 0.6g
・MgCl・7HO: 0.08g
・カザミノ酸: 5.0g
・微量元素溶液: 1mL
[微量元素溶液の組成(L−1)]
・FeSO・7HO: 0.2g
・CuSO・5HO: 1.0g
・NaMoO・2HO: 0.034g
・CaCl・2HO: 0.015g
・NaSeO: 0.5g
【0112】
培養温度(培養液温度)は30℃とした。
【0113】
酸化還元物質として、アントラキノン 2,6−ジスルホン酸(AQDS)を0.2mMとなるように培養液4に添加した。
【0114】
培養液4のpHは7.0とした。
【0115】
作用電極9の設定電位は、銀・塩化銀電極電位基準で、−1.0V、−0.8V、−0.6V、−0.3V、0Vとして培養試験を実施した。
【0116】
尚、本実施例では、設定電位を−1.0V、−0.8V、−0.6Vとした場合には作用電極9の電位が還元電位に制御されていることになり、設定電位を−0.3V、0Vとした場合には作用電極9の電位が酸化電位に制御されていることになる。
【0117】
培養槽7を窒素パージし、培養槽7を嫌気条件としてから培養試験を開始した。
【0118】
培養試験終了後の培養液4の乳酸濃度の測定結果を図16に示す。設定電位を−1.0V、−0.8V、−0.6Vとすることで、乳酸濃度が高くなる傾向が見られ、逆に設定電位を−0.3V、0Vとすることで、乳酸濃度が低くなる傾向が見られた。
【0119】
培養試験終了後の培養液4の酢酸及びエタノール濃度の測定結果を図17に示す。エタノール濃度については、設定電位を−1.0V、−0.8V、−0.6Vとすることで、低くなる傾向が見られ、設定電位を−0.3V、0Vとすることで高くなる傾向が見られた。特に、設定電位を0Vとすることでエタノール濃度が高くなる傾向が顕著であった。酢酸濃度については、設定電位を−0.8Vとすることで低くなる傾向が見られ、0Vとすることで高くなる傾向が見られた。その他の設定電位については酢酸濃度の大きな差が見られなかった。
【0120】
以上の結果から、電極の電位を還元電位とすることで、エタノール産生量を減少させると共に乳酸産生量を増加させることができ、逆に、電極の電位を酸化電位とすることで、エタノール産生量を増加させると共に乳酸産生量を減少させることができることが明らかとなった。
【0121】
また、酢酸についても、還元電位である−0.8Vで濃度が低くなり、酸化電位である0Vで濃度が高くなったことから、還元電位において産生量が減少し、酸化電位において産生量が増加する傾向にあることが明らかとなった。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
ピルビン酸から代謝産物を産生する微生物を含む培養環境に電極を接触させ、前記電極の電位を制御しながら培養することにより、前記微生物のピルビン酸を起点とした代謝を制御することを特徴とする微生物の代謝経路制御方法。
【請求項2】
前記微生物をピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物とし、前記電極の電位を還元電位に制御して、前記還元経路における還元反応を促進させると共に前記酸化経路における酸化反応を減退させる請求項1に記載の微生物の代謝経路制御方法。
【請求項3】
前記微生物をピルビン酸を乳酸に還元する還元経路とピルビン酸をアセチル補酵素Aに酸化する酸化経路とを代謝経路として有する微生物とし、前記電極の電位を酸化電位に制御して、前記還元経路における還元反応を減退させると共に前記酸化経路における酸化反応を促進させる請求項1に記載の微生物の代謝経路制御方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図18】
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【図19】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【公開番号】特開2012−200200(P2012−200200A)
【公開日】平成24年10月22日(2012.10.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−67404(P2011−67404)
【出願日】平成23年3月25日(2011.3.25)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り 平成22年9月25日 社団法人日本生物工学会発行の「第62回 日本生物工学会大会 講演要旨集」に発表
【出願人】(000173809)一般財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Fターム(参考)】