微生物の培養方法
【課題】ラウリン酸成分を高含有する炭素源を用いてポリヒドロキシアルカン酸を効率生産させる培養制御方法（酸素移動速度制御方法）に関して、これまで有効に利用されていなかったラウリン酸含量が高い炭素源を有効に利用する方法であり、具体的には、ラウリン酸含量が４１重量％以上である油脂、及び/又は脂肪酸を用いて、工業的に効率良くポリヒドロキシアルカン酸、特にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造する方法を提供する。
【解決手段】酸素移動速度を制御し、ポリヒドロキシアルカン酸の平均時間生産性が１．５ｇ/Ｌ/ｈ以上になるような培養生産が可能になった場合、ラウリン酸含量が４１重量％以上であるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
【解決手段】酸素移動速度を制御し、ポリヒドロキシアルカン酸の平均時間生産性が１．５ｇ/Ｌ/ｈ以上になるような培養生産が可能になった場合、ラウリン酸含量が４１重量％以上であるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラウリン酸含量が高い油脂、及び／又は脂肪酸を炭素源として利用して、工業的に効率良く微生物によりポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと記す）を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＨＡは、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子である。また、ＰＨＡは再生可能資源から産生されうる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業で利用する試みが行われている。
【０００３】
現在までに数多くの微生物が、エネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを菌体内に蓄積することが知られている。ＰＨＡの代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記す）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は１９２５年にBacillus megateriumで最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。
【０００４】
そこで、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記す）の共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と記す）の製造方法が開示されている（特許文献１、特許文献２）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰＨＡの一種である。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。
【０００５】
Ｐ（３ＨＢ）の柔軟性を高めるために、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記す）の共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と記す）及びその製造方法について研究がなされた（特許文献３、特許文献４）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）もＰＨＡの一種である。これらの報告におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたAeromonas caviaeやAeromonas hydrophilaを用い、炭素源としてラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸や、グルコースを用いた方法であった。いずれの方法で得られたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）も３ＨＨ組成は１０ｍｏｌ％以上であり、柔軟性は向上していた。しかし、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性は５０ｇ／Ｌ程度かそれを大きく下回っていたため、実用化に向けて更に生産性を高める方法が探索されてきた（非特許文献１〜３）。また、これらの培養生産で用いられているラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの脂肪酸は高価であるため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用が求められていた。
【０００６】
このため、より安価な炭素源である植物油脂を用い、高い柔軟性と生産性を両立させるため、以下のような取組みが行なわれた。A. caviaeよりクローニングされたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子をCupriavidus necator (旧分類：Ralstonia eutropha或いはAlcaligenes eutrophus)に導入した形質転換体を用い、炭素源としてオリーブオイル、パームオイルなどの植物油脂を用いて培養した結果、３ＨＨ組成は４〜５ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献４）。これらの製造方法は安価な植物油脂を炭素源とし、ポリマー含量も高いものの、菌体量が低いため、ポリマー生産性が低く、且つ３ＨＨ組成４〜５ｍｏｌ％ではフィルム等の用途に適用できるほど柔らかいものではなかった。
【０００７】
さらに、パーム核油やヤシ油といった油脂を用いた３ＨＨ組成向上検討が行われている。しかしながら、この研究では、３ＨＨ組成８．２〜８．６ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が培養７２時間で３０ｇ／Ｌ以下の生産性で得られる程度であった。そこで、さらに３ＨＨ組成を高める目的で高価なへキサン酸を油脂に混合して培養しているが、へキサン酸の混合量が増加するに従って３ＨＨ組成は高まるものの、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産量が顕著に低下した（特許文献５）。また、パーム核オレイン油、パーム核油、ヤシ油のみを用いたＰＨＡの製造研究も行なわれた（特許文献６）。本製造方法では、パーム核油やヤシ油、パーム核オレイン油単独での使用やパーム核オレイン油と大豆油の混合油脂などを用いた検討がなされたが、培養６０時間でＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産性（７２ｇ／Ｌ）と低い生産性であった。また、パーム核油やヤシ油などのラウリン酸含量が比較的高い、特に４１重量％超の油脂を用いた場合、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産量が低下し、上記炭素源を用い、高い３ＨＨ組成（例えば６ｍｏｌ％以上、特に柔軟性に富む７ｍｏｌ％以上、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上）と高い生産性を両立させることは困難であった。
【０００８】
その他にもラウリン酸含量が比較的高い炭素源を用いた３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨの共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ）と記す）の生産研究（非特許文献５）などが行なわれているが、フラスコレベルの検討に留まっており、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性は培養７２時間で４ｇ／Ｌ程度と非常に低かった。
【０００９】
この様に、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）やＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ）などＰＨＡの生産において、大量生産されている植物油は経済性や再生可能性を考慮すると原料として好適であるが、ラウリン酸含量の高い油脂、例えば上述したパーム核油やヤシ油などはこれまで有効に利用されてきたとは言い難い。ＰＨＡの原料として多様な油脂及び／又は脂肪酸を利用するという観点から、パーム核油、ヤシ油、ラウリン酸などを用いた効率的なＰＨＡの製造方法が求められていた。また、上述したように３ＨＨ組成を高め、より柔軟性に富むＰＨＡを製造するためには、へキサン酸、オクタン酸、ラウリン酸などの比較的炭素数の少ない脂肪酸や、それらを構成成分として含む油脂を炭素源として用いることが好ましく、特にパーム油やヤシ油などの天然油脂の構成成分として多く含まれることからも、これら炭素源を用いたＰＨＡの製造方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公開公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公開公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公開公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公開公報
【特許文献５】特開２００１−３４００７８号公開公報
【特許文献６】米国特許７２３５６２１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８，４８２２−４８２３（１９９５）
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６７，２４０（２０００）
【非特許文献３】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７，５０（２００１）
【非特許文献４】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４９，３３３−３３６（１９９８）
【非特許文献５】Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ９３，１７−２３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ラウリン酸含量が高い炭素源を有効に利用する方法を提供することを課題とする。具体的には、ラウリン酸含量が４１重量％超である油脂、及び／又は脂肪酸を用いて、工業的に効率良くＰＨＡ、特にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、構成脂肪酸中のラウリン酸含量が４１重量％超の油脂、及び／又は脂肪酸をＰＨＡの製造に好適に利用するための検討を鋭意行った。その結果、酸素移動速度をコントロールすることにより、構成脂肪酸中のラウリン酸含量が４１重量％超の油脂、及び／又は脂肪酸をＰＨＡ製造に好適に使用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明は、構成脂肪酸としてラウリン酸を４１重量％超含有する油脂、及び／又は脂肪酸を炭素源とし、酸素移動速度をコントロールし、培養開始時からのＰＨＡの平均時間生産性を１．５ｇ／Ｌ／ｈ以上に制御するＰＨＡの培養生産方法である。また本発明は、炭素源としてパーム核油、ヤシ油、及びこれらの油脂を分別して得られる分別油脂、脂肪酸の群から選ばれる少なくとも１種の油脂及び／又は脂肪酸を用いることを特徴とする、微生物によるＰＨＡの製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ラウリン酸含量の高い油脂、及び／又は脂肪酸をＰＨＡの原料として有効に利用することが可能になった。また、本発明により、ラウリン酸含量の高い油脂及び／又は脂肪酸をＰＨＡの原料として３ＨＨ組成が６ｍｏｌ％以上のＰＨＡを１００ｇ／Ｌ以上の生産性にて生産可能になった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
微生物によるＰＨＡ、特に３ＨＨを含むモノマーユニットを重合して得られるＰＨＡの製造に関しては、その３ＨＨ組成比率を広い範囲でコントロールすることができれば、硬い共重合体から軟らかい共重合体まで発酵生産可能となり、より幅広い分野への応用が期待できる。これまで、様々な微生物を用いて、油脂及び／又は脂肪酸を原料としたＰＨＡの製造技術が開発されてきた。しかし、例えばパーム核油、ヤシ油などのようなラウリン酸含量が高い油脂を用いた場合、例えばパーム油、大豆油、綿実油、ナタネ油、コーン油や、ラウリン酸含量が低くなるよう複数の油脂及び／又は脂肪酸を混合調製した組成物のようなラウリン酸含量が低い油脂を用いた場合に比べてＰＨＡの生産性の低下が認められていた（米国特許７２３５６２１号）。
【００１８】
しかしながら、本発明によれば、構成脂肪酸中のラウリン酸含量の高いパーム核油、ヤシ油、またラウリン酸含量が高くなるよう混合調製した油脂及び／又は脂肪酸の混合調製組成物を炭素源として極めて有効に利用できる。
【００１９】
本発明は少なくとも３ＨＢと３ＨＨを含むモノマーユニットを重合して得られるＰＨＡの微生物による生産方法であって、構成脂肪酸としてラウリン酸を４１重量％超含有する油脂及び／又は脂肪酸を炭素源とし、酸素移動速度をコントロールすることにより培養開始時からのＰＨＡの平均時間生産性を１．５ｇ／Ｌ／ｈ以上に制御するＰＨＡの培養生産方法である。本発明によれば、驚くべきことに、酸素移動速度をコントロールすることにより、ラウリン酸を高含有する炭素源を用いた際のＰＨＡの生産性は、ラウリン酸含量が低い、又は、ラウリン酸を構成成分として含まない炭素源を利用した場合と同等以上に改善されることを見出した。酸素移動速度を制御するには、通気量、攪拌数、通気酸素濃度、培養槽内圧力、を制御するなどの方法を適宜選択することが出来る。本発明は、ＰＨＡの平均時間生産性１．５ｇ／Ｌ／ｈ以上が達成されるように酸素移動速度を制御し、且つ、上記平均時間生産性が達成されるように炭素源を供給することで達成される。本発明における、ＰＨＡの平均時間生産性とは、培養終点（Ａ（ｈ））における培養液中のＰＨＡ濃度（Ｂ（ｇ/Ｌ））からＢ/Ａ（ｇ/Ｌ/ｈ）として計算する。炭素源の添加方法は、一度に大量に添加する、分割して添加する、連続的にあるいは間欠的に流加する等の方法が考えられるが、本発明においては、連続流加、あるいは間欠流加することが好ましい。本発明では、酸素移動速度は亜流酸ソーダ酸化法、DO電極法、直接法、排ガス分析法などによって求めることができる。酸素移動速度（ＯＴＲ）は次式に示すとおりである。
【００２０】
ＯＴＲ（ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ）＝｛７.３１７（ＰiｙiＱｉ／Ｔi）−（ＰoｙoＱo／Ｔo）｝/Ｖ
Ｐは圧力（単位ａｔｍ）、yは酸素モル分率（％）、Ｑは通気量（Ｌ／ｍｉｎ）、Ｖは液量（ｍ３）、Ｔは気体温度（Ｋ）である。また、「ｉ」は培養槽の入り口における値を示し、「ｏ」は培養槽の出口における値を示す。７.３１７は６０ｍｉｎ/ｈ、気体定数Ｒ＝０．０８２、及び、酸素モル分率の百分率表記からの換算定数である。
【００２１】
本発明における好ましい酸素移動速度は７０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上である、より好ましくは８０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上、さらに好ましくは１００ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上であり、１２０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上が特に好ましい。
【００２２】
実液中の酸素移動速度は、同じ通気攪拌条件、液量であっても、液の性質、例えば水、培地、培養液などによって厳密には同じ値を示すわけではないが、本発明を実施する上では、水中で測定した酸素移動速度を用いても実質的に問題は生じない。本発明における酸素移動速度とは、培養開始から培養終了までの酸素移動速度の水における値のことである。
【００２３】
我々の検討によれば、水にて計測したＯＴＲが７０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上の培養条件であれば、驚くべきことに培養を通じてラウリン酸含量が４１重量％以上の炭素源を用いて、ラウリン酸含量が４１重量％以下の炭素源、例えばパーム核オレイン油やヤシ油と同様、良好にＰＨＡを生産することが可能であった。しかしながら、上記条件はあくまでも一例であり、培養中に通気攪拌条件を変更するような培養方法や、培養液量を変化させる培養方法なども考えられることから、ＰＨＡの平均時間生産性１．５ｇ／Ｌ／ｈが達成される培養条件、特に酸素移動速度条件は全て本特許に含まれる。
【００２４】
用いる炭素源としては、構成脂肪酸中のラウリン酸含量が４１重量％以上である油脂、例えば、パーム核油やヤシ油、また植物油脂由来のラウリン酸、を使用することが好ましい。また、ラウリン酸含量の高いパーム核油やヤシ油を有効利用する観点から、ラウリン酸含量として、好ましくは４１重量％以上、より好ましくは４２重量％以上、さらに好ましくは４５重量％以上の炭素源を用いることで、本発明の効果がより顕著に得られる。
【００２５】
いうまでも無く、上記油脂、及び／又は脂肪酸の単独使用のみならず、複数の油脂、及び／又は脂肪酸を混合した組成物も使用できる。
【００２６】
また、本発明を用いることで、６ｍｏｌ％以上の３ＨＨ組成のＰＨＡを効率的に生産することが出来る。
【００２７】
また本発明のＰＨＡの製造に用いられる微生物としては、ラウリン酸を含有する植物油脂や脂肪酸を資化可能であり、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は、該アミノ酸配列対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が組み込まれていれば特に限定はないが、天然から単離された微生物や、遺伝子操作された微生物等を好適に使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カピリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属等の微生物を使用することが好ましい。勿論、前記微生物を人工的突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された菌株も使用できる。
【００２８】
カピリアビダス属の微生物としては、例えばカピリアビダス・ネケータ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）を例示できる。アルカリゲネス属の微生物としては、例えばアルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔａｓ）を例示できる。シュードモナス属の微生物としては、例えばシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を例示できる。バチルス属の微生物としては、例えばバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を例示できる。アエロモナス属の微生物としては、例えばアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｏ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を例示できる。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、４５０−４７２頁（１９９０年）に記載の微生物を好適に用いることができる。これら微生物等の他にも遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えばエシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母類が利用できる。
【００２９】
例えばＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅやＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａなど元来３ＨＢと３ＨＨからなるＰＨＡを生産する微生物を用いる方法や、元来３ＨＢと３ＨＨからなるＰＨＡを生産しない微生物に遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。遺伝子を導入するホスト微生物としては、たとえばＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを好適に用いることができる。
【００３０】
また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子としてはＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅやＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子やそれらの改変体などを用いることができる。改変体としてはアミノ酸基が欠失、付加、挿入、若しくは置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。ＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子である限りは本発明に用いることが出来る。例えば配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素を用いることが出来る。また、野生型ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子を本発明に好適に用いることが出来る。配列同一性は、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９７％以上である。欠失、付加、挿入、若しくは置換するアミノ酸残基の数は好ましくは８０個以下であり、より好ましくは６０個以下であり、さらに好ましくは４０個以下であり、さらにより好ましくは３０個以下であり、最も好ましくは２０個以下、１０個以下、５個以下である。
【００３１】
３ＨＢと３ＨＨからなるＰＨＡの種類としては、３ＨＢと３ＨＨからなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ））や３ＨＢと３ＨＶ、３ＨＨからなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ））や、３ＨＢと３ＨＨ、４−ヒドロキシ酪酸（以下、４ＨＢと記すこともある）からなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ−ｃｏ−４ＨＢ））、３ＨＢと３ＨＨ、３−ヒドロキシオクタン酸（以下、３ＨＯと記すこともある）からなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ−ｃｏ−３ＨＯ））などが挙げられる。
【００３２】
本発明のＰＨＡの製造方法は、上述した培養方法によって微生物内にＰＨＡを蓄積させ、その後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収すれば良い。例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する方法などが挙げられる。
【００３３】
本発明者らは、本発明が１０Ｌ規模で好適に実施でき、更に１６０００Ｌ以上の規模でも好適に再現できることを確認した。この５０００倍以上のスケールアップの達成は、より大きな工業的規模での製造において、本発明の効果が好適に、かつ、最大限に発揮されることを意味する。
【実施例】
【００３４】
以下、比較例、及び実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。尚、一般的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従い使用することができる。尚、酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００３５】
(比較例１)
実験にはＫＮＫ−００５株（米国特許ＵＳ７３８４７６６参照）を用いた。
【００３６】
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
【００３７】
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパーム核油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
【００３８】
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ 塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
【００３９】
まず、ＫＮＫ−００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【００４０】
次に、前培養液を６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。油脂としては、パーム核オレイン油、パーム核油、及びパーム核オレイン油にラウリン酸を２０部加えたものを使用した。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は７０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。培養は６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
【００４１】
得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。
【００４２】
乾燥菌体重量及びポリマー含量より、ＰＨＡ生産量を算出した。生産されたＰＨＡの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＡ２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、化学式（１）に示すようなＰＨＡ、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。ＰＨＡ生産量、ＰＨＡ時間生産性、及び、３ＨＨ組成を表１に示した。
【００４３】
【化１】
【００４４】
（実施例１）
１０Ｌジャーの攪拌数を４３０ｒｐｍにした以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は８０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。結果を表１に示した。
【００４５】
（実施例２）
１０Ｌジャーの攪拌数を５５０ｒｐｍにした以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は１１０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。結果を表１に示した。
【００４６】
（実施例３）
１０Ｌジャーの攪拌数を６３０ｒｐｍにした以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は１５０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。結果を表１に示した。
【００４７】
（実施例４）
ＫＮＫ−６３１株の作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１および配列番号２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−５Ｐ＋Ｅｃｏとした。 次に、特開2008-029218号公報[0038]に記載のＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
【００４８】
特開2008-029218号公報[0036]に記載のＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号３および配列番号４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。
【００４９】
ＰＡｃ−５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をｂＰａｃ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。
【００５０】
次に、該遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号５および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。
【００５１】
ｂＰａｃ−５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをｂＡＯ／ｐＢｌｕとした。ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。
【００５２】
続いて、特開2008-029218号公報[0037]に記載のｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。
【００５３】
＜遺伝子挿入株Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
次に、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換した。得られた形質転換体をＫＮＫ−００５ＡＳ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して２回目の組換えが生じた株を取得した。さらにＰＣＲによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。
【００５４】
この遺伝子挿入株をＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
【００５５】
＜ｃｃｒ遺伝子のクローニング及び発現ユニット構築＞
クロトニル−ＣｏＡを、３ＨＨモノマーの前駆体であるブチリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードするｃｃｒ遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）Ｏｋａｍｉ株（ＤＳＭ １０４２）の染色体ＤＮＡからクローニングした。配列番号７及び配列番号８記載のＤＮＡをプライマーとしＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で９０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩで切断した。ＥＥ３２ｄ１３断片（J. Bacteriol., 179, 4821 (1997)）を、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このプラスミドをＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ断片としたｃｃｒ遺伝子と断片を置換することによってｃｃｒ発現ユニットを構築した。
【００５６】
＜ｐｈａＣ遺伝子のクローニング及び発現ユニット調製＞
配列番号９を含むｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製した。特開2007-228894号公報[0031]に記載のＨＧ：：ＰＲｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕを鋳型とし、配列番号１０と配列番号１１に示すプライマーとしてＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＳｐｅＩで切断して発現ユニットを調製した。
【００５７】
＜発現ベクターの構築＞
発現ベクターｐＣＵＰ２−６３１は以下のようにして構築した。
【００５８】
C. necatorにおける発現ベクター構築用のプラスミドベクターとしては、国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２を用いた。まず構築したｃｃｒ遺伝子発現ユニットをＥｃｏＲＩ処理により切り出し、この断片をＭｕｎＩで切断したｐＣＵＰ２と連結した。次にｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製し、ｃｃｒ遺伝子発現ユニットを含むｐＣＵＰ２のＳｐｅＩ部位に挿入してｐＣＵＰ２−６３１ベクターを構築した。
【００５９】
＜形質転換細胞の作製＞
ｐＣＵＰ２−６３１ベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏ−ｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏ−ｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株のコンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体ＫＮＫ―６３１株を取得した。
【００６０】
（比較例２）
実験にＫＮＫ−６３１株を用いた以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。
【００６１】
（実施例５）
実験にＫＮＫ−６３１株を用いた以外は実施例３と同じ方法にて、培養を行なった。
【００６２】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラウリン酸含量が高い油脂、及び／又は脂肪酸を炭素源として利用して、工業的に効率良く微生物によりポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと記す）を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＨＡは、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子である。また、ＰＨＡは再生可能資源から産生されうる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業で利用する試みが行われている。
【０００３】
現在までに数多くの微生物が、エネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを菌体内に蓄積することが知られている。ＰＨＡの代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記す）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は１９２５年にBacillus megateriumで最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。
【０００４】
そこで、３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記す）の共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と記す）の製造方法が開示されている（特許文献１、特許文献２）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰＨＡの一種である。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。
【０００５】
Ｐ（３ＨＢ）の柔軟性を高めるために、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記す）の共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と記す）及びその製造方法について研究がなされた（特許文献３、特許文献４）。Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）もＰＨＡの一種である。これらの報告におけるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたAeromonas caviaeやAeromonas hydrophilaを用い、炭素源としてラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸や、グルコースを用いた方法であった。いずれの方法で得られたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）も３ＨＨ組成は１０ｍｏｌ％以上であり、柔軟性は向上していた。しかし、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性は５０ｇ／Ｌ程度かそれを大きく下回っていたため、実用化に向けて更に生産性を高める方法が探索されてきた（非特許文献１〜３）。また、これらの培養生産で用いられているラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの脂肪酸は高価であるため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用が求められていた。
【０００６】
このため、より安価な炭素源である植物油脂を用い、高い柔軟性と生産性を両立させるため、以下のような取組みが行なわれた。A. caviaeよりクローニングされたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子をCupriavidus necator (旧分類：Ralstonia eutropha或いはAlcaligenes eutrophus)に導入した形質転換体を用い、炭素源としてオリーブオイル、パームオイルなどの植物油脂を用いて培養した結果、３ＨＨ組成は４〜５ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献４）。これらの製造方法は安価な植物油脂を炭素源とし、ポリマー含量も高いものの、菌体量が低いため、ポリマー生産性が低く、且つ３ＨＨ組成４〜５ｍｏｌ％ではフィルム等の用途に適用できるほど柔らかいものではなかった。
【０００７】
さらに、パーム核油やヤシ油といった油脂を用いた３ＨＨ組成向上検討が行われている。しかしながら、この研究では、３ＨＨ組成８．２〜８．６ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が培養７２時間で３０ｇ／Ｌ以下の生産性で得られる程度であった。そこで、さらに３ＨＨ組成を高める目的で高価なへキサン酸を油脂に混合して培養しているが、へキサン酸の混合量が増加するに従って３ＨＨ組成は高まるものの、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産量が顕著に低下した（特許文献５）。また、パーム核オレイン油、パーム核油、ヤシ油のみを用いたＰＨＡの製造研究も行なわれた（特許文献６）。本製造方法では、パーム核油やヤシ油、パーム核オレイン油単独での使用やパーム核オレイン油と大豆油の混合油脂などを用いた検討がなされたが、培養６０時間でＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産性（７２ｇ／Ｌ）と低い生産性であった。また、パーム核油やヤシ油などのラウリン酸含量が比較的高い、特に４１重量％超の油脂を用いた場合、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産量が低下し、上記炭素源を用い、高い３ＨＨ組成（例えば６ｍｏｌ％以上、特に柔軟性に富む７ｍｏｌ％以上、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上）と高い生産性を両立させることは困難であった。
【０００８】
その他にもラウリン酸含量が比較的高い炭素源を用いた３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨの共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ）と記す）の生産研究（非特許文献５）などが行なわれているが、フラスコレベルの検討に留まっており、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性は培養７２時間で４ｇ／Ｌ程度と非常に低かった。
【０００９】
この様に、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）やＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ）などＰＨＡの生産において、大量生産されている植物油は経済性や再生可能性を考慮すると原料として好適であるが、ラウリン酸含量の高い油脂、例えば上述したパーム核油やヤシ油などはこれまで有効に利用されてきたとは言い難い。ＰＨＡの原料として多様な油脂及び／又は脂肪酸を利用するという観点から、パーム核油、ヤシ油、ラウリン酸などを用いた効率的なＰＨＡの製造方法が求められていた。また、上述したように３ＨＨ組成を高め、より柔軟性に富むＰＨＡを製造するためには、へキサン酸、オクタン酸、ラウリン酸などの比較的炭素数の少ない脂肪酸や、それらを構成成分として含む油脂を炭素源として用いることが好ましく、特にパーム油やヤシ油などの天然油脂の構成成分として多く含まれることからも、これら炭素源を用いたＰＨＡの製造方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公開公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公開公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公開公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公開公報
【特許文献５】特開２００１−３４００７８号公開公報
【特許文献６】米国特許７２３５６２１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８，４８２２−４８２３（１９９５）
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６７，２４０（２０００）
【非特許文献３】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７，５０（２００１）
【非特許文献４】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４９，３３３−３３６（１９９８）
【非特許文献５】Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ９３，１７−２３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ラウリン酸含量が高い炭素源を有効に利用する方法を提供することを課題とする。具体的には、ラウリン酸含量が４１重量％超である油脂、及び／又は脂肪酸を用いて、工業的に効率良くＰＨＡ、特にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、構成脂肪酸中のラウリン酸含量が４１重量％超の油脂、及び／又は脂肪酸をＰＨＡの製造に好適に利用するための検討を鋭意行った。その結果、酸素移動速度をコントロールすることにより、構成脂肪酸中のラウリン酸含量が４１重量％超の油脂、及び／又は脂肪酸をＰＨＡ製造に好適に使用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明は、構成脂肪酸としてラウリン酸を４１重量％超含有する油脂、及び／又は脂肪酸を炭素源とし、酸素移動速度をコントロールし、培養開始時からのＰＨＡの平均時間生産性を１．５ｇ／Ｌ／ｈ以上に制御するＰＨＡの培養生産方法である。また本発明は、炭素源としてパーム核油、ヤシ油、及びこれらの油脂を分別して得られる分別油脂、脂肪酸の群から選ばれる少なくとも１種の油脂及び／又は脂肪酸を用いることを特徴とする、微生物によるＰＨＡの製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ラウリン酸含量の高い油脂、及び／又は脂肪酸をＰＨＡの原料として有効に利用することが可能になった。また、本発明により、ラウリン酸含量の高い油脂及び／又は脂肪酸をＰＨＡの原料として３ＨＨ組成が６ｍｏｌ％以上のＰＨＡを１００ｇ／Ｌ以上の生産性にて生産可能になった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
微生物によるＰＨＡ、特に３ＨＨを含むモノマーユニットを重合して得られるＰＨＡの製造に関しては、その３ＨＨ組成比率を広い範囲でコントロールすることができれば、硬い共重合体から軟らかい共重合体まで発酵生産可能となり、より幅広い分野への応用が期待できる。これまで、様々な微生物を用いて、油脂及び／又は脂肪酸を原料としたＰＨＡの製造技術が開発されてきた。しかし、例えばパーム核油、ヤシ油などのようなラウリン酸含量が高い油脂を用いた場合、例えばパーム油、大豆油、綿実油、ナタネ油、コーン油や、ラウリン酸含量が低くなるよう複数の油脂及び／又は脂肪酸を混合調製した組成物のようなラウリン酸含量が低い油脂を用いた場合に比べてＰＨＡの生産性の低下が認められていた（米国特許７２３５６２１号）。
【００１８】
しかしながら、本発明によれば、構成脂肪酸中のラウリン酸含量の高いパーム核油、ヤシ油、またラウリン酸含量が高くなるよう混合調製した油脂及び／又は脂肪酸の混合調製組成物を炭素源として極めて有効に利用できる。
【００１９】
本発明は少なくとも３ＨＢと３ＨＨを含むモノマーユニットを重合して得られるＰＨＡの微生物による生産方法であって、構成脂肪酸としてラウリン酸を４１重量％超含有する油脂及び／又は脂肪酸を炭素源とし、酸素移動速度をコントロールすることにより培養開始時からのＰＨＡの平均時間生産性を１．５ｇ／Ｌ／ｈ以上に制御するＰＨＡの培養生産方法である。本発明によれば、驚くべきことに、酸素移動速度をコントロールすることにより、ラウリン酸を高含有する炭素源を用いた際のＰＨＡの生産性は、ラウリン酸含量が低い、又は、ラウリン酸を構成成分として含まない炭素源を利用した場合と同等以上に改善されることを見出した。酸素移動速度を制御するには、通気量、攪拌数、通気酸素濃度、培養槽内圧力、を制御するなどの方法を適宜選択することが出来る。本発明は、ＰＨＡの平均時間生産性１．５ｇ／Ｌ／ｈ以上が達成されるように酸素移動速度を制御し、且つ、上記平均時間生産性が達成されるように炭素源を供給することで達成される。本発明における、ＰＨＡの平均時間生産性とは、培養終点（Ａ（ｈ））における培養液中のＰＨＡ濃度（Ｂ（ｇ/Ｌ））からＢ/Ａ（ｇ/Ｌ/ｈ）として計算する。炭素源の添加方法は、一度に大量に添加する、分割して添加する、連続的にあるいは間欠的に流加する等の方法が考えられるが、本発明においては、連続流加、あるいは間欠流加することが好ましい。本発明では、酸素移動速度は亜流酸ソーダ酸化法、DO電極法、直接法、排ガス分析法などによって求めることができる。酸素移動速度（ＯＴＲ）は次式に示すとおりである。
【００２０】
ＯＴＲ（ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ）＝｛７.３１７（ＰiｙiＱｉ／Ｔi）−（ＰoｙoＱo／Ｔo）｝/Ｖ
Ｐは圧力（単位ａｔｍ）、yは酸素モル分率（％）、Ｑは通気量（Ｌ／ｍｉｎ）、Ｖは液量（ｍ３）、Ｔは気体温度（Ｋ）である。また、「ｉ」は培養槽の入り口における値を示し、「ｏ」は培養槽の出口における値を示す。７.３１７は６０ｍｉｎ/ｈ、気体定数Ｒ＝０．０８２、及び、酸素モル分率の百分率表記からの換算定数である。
【００２１】
本発明における好ましい酸素移動速度は７０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上である、より好ましくは８０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上、さらに好ましくは１００ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上であり、１２０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上が特に好ましい。
【００２２】
実液中の酸素移動速度は、同じ通気攪拌条件、液量であっても、液の性質、例えば水、培地、培養液などによって厳密には同じ値を示すわけではないが、本発明を実施する上では、水中で測定した酸素移動速度を用いても実質的に問題は生じない。本発明における酸素移動速度とは、培養開始から培養終了までの酸素移動速度の水における値のことである。
【００２３】
我々の検討によれば、水にて計測したＯＴＲが７０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈ以上の培養条件であれば、驚くべきことに培養を通じてラウリン酸含量が４１重量％以上の炭素源を用いて、ラウリン酸含量が４１重量％以下の炭素源、例えばパーム核オレイン油やヤシ油と同様、良好にＰＨＡを生産することが可能であった。しかしながら、上記条件はあくまでも一例であり、培養中に通気攪拌条件を変更するような培養方法や、培養液量を変化させる培養方法なども考えられることから、ＰＨＡの平均時間生産性１．５ｇ／Ｌ／ｈが達成される培養条件、特に酸素移動速度条件は全て本特許に含まれる。
【００２４】
用いる炭素源としては、構成脂肪酸中のラウリン酸含量が４１重量％以上である油脂、例えば、パーム核油やヤシ油、また植物油脂由来のラウリン酸、を使用することが好ましい。また、ラウリン酸含量の高いパーム核油やヤシ油を有効利用する観点から、ラウリン酸含量として、好ましくは４１重量％以上、より好ましくは４２重量％以上、さらに好ましくは４５重量％以上の炭素源を用いることで、本発明の効果がより顕著に得られる。
【００２５】
いうまでも無く、上記油脂、及び／又は脂肪酸の単独使用のみならず、複数の油脂、及び／又は脂肪酸を混合した組成物も使用できる。
【００２６】
また、本発明を用いることで、６ｍｏｌ％以上の３ＨＨ組成のＰＨＡを効率的に生産することが出来る。
【００２７】
また本発明のＰＨＡの製造に用いられる微生物としては、ラウリン酸を含有する植物油脂や脂肪酸を資化可能であり、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は、該アミノ酸配列対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が組み込まれていれば特に限定はないが、天然から単離された微生物や、遺伝子操作された微生物等を好適に使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カピリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属等の微生物を使用することが好ましい。勿論、前記微生物を人工的突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された菌株も使用できる。
【００２８】
カピリアビダス属の微生物としては、例えばカピリアビダス・ネケータ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）を例示できる。アルカリゲネス属の微生物としては、例えばアルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔａｓ）を例示できる。シュードモナス属の微生物としては、例えばシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を例示できる。バチルス属の微生物としては、例えばバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を例示できる。アエロモナス属の微生物としては、例えばアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｏ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を例示できる。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、４５０−４７２頁（１９９０年）に記載の微生物を好適に用いることができる。これら微生物等の他にも遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えばエシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母類が利用できる。
【００２９】
例えばＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅやＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａなど元来３ＨＢと３ＨＨからなるＰＨＡを生産する微生物を用いる方法や、元来３ＨＢと３ＨＨからなるＰＨＡを生産しない微生物に遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。遺伝子を導入するホスト微生物としては、たとえばＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを好適に用いることができる。
【００３０】
また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子としてはＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅやＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子やそれらの改変体などを用いることができる。改変体としてはアミノ酸基が欠失、付加、挿入、若しくは置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。ＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子である限りは本発明に用いることが出来る。例えば配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素を用いることが出来る。また、野生型ＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子を本発明に好適に用いることが出来る。配列同一性は、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９７％以上である。欠失、付加、挿入、若しくは置換するアミノ酸残基の数は好ましくは８０個以下であり、より好ましくは６０個以下であり、さらに好ましくは４０個以下であり、さらにより好ましくは３０個以下であり、最も好ましくは２０個以下、１０個以下、５個以下である。
【００３１】
３ＨＢと３ＨＨからなるＰＨＡの種類としては、３ＨＢと３ＨＨからなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ））や３ＨＢと３ＨＶ、３ＨＨからなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−３ＨＨ））や、３ＨＢと３ＨＨ、４−ヒドロキシ酪酸（以下、４ＨＢと記すこともある）からなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ−ｃｏ−４ＨＢ））、３ＨＢと３ＨＨ、３−ヒドロキシオクタン酸（以下、３ＨＯと記すこともある）からなる（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ−ｃｏ−３ＨＯ））などが挙げられる。
【００３２】
本発明のＰＨＡの製造方法は、上述した培養方法によって微生物内にＰＨＡを蓄積させ、その後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収すれば良い。例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する方法などが挙げられる。
【００３３】
本発明者らは、本発明が１０Ｌ規模で好適に実施でき、更に１６０００Ｌ以上の規模でも好適に再現できることを確認した。この５０００倍以上のスケールアップの達成は、より大きな工業的規模での製造において、本発明の効果が好適に、かつ、最大限に発揮されることを意味する。
【実施例】
【００３４】
以下、比較例、及び実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。尚、一般的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従い使用することができる。尚、酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【００３５】
(比較例１)
実験にはＫＮＫ−００５株（米国特許ＵＳ７３８４７６６参照）を用いた。
【００３６】
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
【００３７】
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパーム核油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
【００３８】
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ 塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
【００３９】
まず、ＫＮＫ−００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【００４０】
次に、前培養液を６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。油脂としては、パーム核オレイン油、パーム核油、及びパーム核オレイン油にラウリン酸を２０部加えたものを使用した。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は７０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。培養は６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
【００４１】
得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。
【００４２】
乾燥菌体重量及びポリマー含量より、ＰＨＡ生産量を算出した。生産されたＰＨＡの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＡ２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、化学式（１）に示すようなＰＨＡ、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であった。ＰＨＡ生産量、ＰＨＡ時間生産性、及び、３ＨＨ組成を表１に示した。
【００４３】
【化１】
【００４４】
（実施例１）
１０Ｌジャーの攪拌数を４３０ｒｐｍにした以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は８０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。結果を表１に示した。
【００４５】
（実施例２）
１０Ｌジャーの攪拌数を５５０ｒｐｍにした以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は１１０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。結果を表１に示した。
【００４６】
（実施例３）
１０Ｌジャーの攪拌数を６３０ｒｐｍにした以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。尚、該培養条件の水系における酸素移動速度は１５０ｍｏｌＯ２／ｍ３／ｈであった。結果を表１に示した。
【００４７】
（実施例４）
ＫＮＫ−６３１株の作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１および配列番号２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−５Ｐ＋Ｅｃｏとした。 次に、特開2008-029218号公報[0038]に記載のＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
【００４８】
特開2008-029218号公報[0036]に記載のＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号３および配列番号４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。
【００４９】
ＰＡｃ−５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をｂＰａｃ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。
【００５０】
次に、該遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号５および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。
【００５１】
ｂＰａｃ−５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをｂＡＯ／ｐＢｌｕとした。ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。
【００５２】
続いて、特開2008-029218号公報[0037]に記載のｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。
【００５３】
＜遺伝子挿入株Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
次に、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換した。得られた形質転換体をＫＮＫ−００５ＡＳ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して２回目の組換えが生じた株を取得した。さらにＰＣＲによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。
【００５４】
この遺伝子挿入株をＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
【００５５】
＜ｃｃｒ遺伝子のクローニング及び発現ユニット構築＞
クロトニル−ＣｏＡを、３ＨＨモノマーの前駆体であるブチリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードするｃｃｒ遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）Ｏｋａｍｉ株（ＤＳＭ １０４２）の染色体ＤＮＡからクローニングした。配列番号７及び配列番号８記載のＤＮＡをプライマーとしＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で９０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩで切断した。ＥＥ３２ｄ１３断片（J. Bacteriol., 179, 4821 (1997)）を、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このプラスミドをＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ断片としたｃｃｒ遺伝子と断片を置換することによってｃｃｒ発現ユニットを構築した。
【００５６】
＜ｐｈａＣ遺伝子のクローニング及び発現ユニット調製＞
配列番号９を含むｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製した。特開2007-228894号公報[0031]に記載のＨＧ：：ＰＲｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕを鋳型とし、配列番号１０と配列番号１１に示すプライマーとしてＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＳｐｅＩで切断して発現ユニットを調製した。
【００５７】
＜発現ベクターの構築＞
発現ベクターｐＣＵＰ２−６３１は以下のようにして構築した。
【００５８】
C. necatorにおける発現ベクター構築用のプラスミドベクターとしては、国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２を用いた。まず構築したｃｃｒ遺伝子発現ユニットをＥｃｏＲＩ処理により切り出し、この断片をＭｕｎＩで切断したｐＣＵＰ２と連結した。次にｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製し、ｃｃｒ遺伝子発現ユニットを含むｐＣＵＰ２のＳｐｅＩ部位に挿入してｐＣＵＰ２−６３１ベクターを構築した。
【００５９】
＜形質転換細胞の作製＞
ｐＣＵＰ２−６３１ベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏ−ｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏ−ｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株のコンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体ＫＮＫ―６３１株を取得した。
【００６０】
（比較例２）
実験にＫＮＫ−６３１株を用いた以外は比較例１と同じ方法にて、培養を行なった。
【００６１】
（実施例５）
実験にＫＮＫ−６３１株を用いた以外は実施例３と同じ方法にて、培養を行なった。
【００６２】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシへキサン酸を含むモノマーユニットを重合して得られるポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法であって、構成脂肪酸としてラウリン酸を４１重量％以上含有する油脂、及び/又は脂肪酸を炭素源とし、かつ培養開始時からのポリヒドロキシアルカン酸の平均時間生産性が１．５ｇ/Ｌ/ｈ以上になるよう、酸素移動速度を調整して微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法。
【請求項２】
前記酸素移動速度が７０ｍｏｌＯ２/ｍ３/ｈ以上であることを特徴とする請求項１の生産方法。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカン酸中の３ＨＨ組成比率が６ｍｏｌ％以上であることを特徴とする請求項１の生産方法。
【請求項４】
前記炭素源がパーム核油、ヤシ油、及びこれらの油脂を分別して得られる分別油脂、脂肪酸の群から選ばれる少なくとも１種の油脂、及び/又は脂肪酸である請求項１の生産方法。
【請求項５】
前記微生物が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が組み込まれていることを特徴とする請求項１の生産方法。
【請求項６】
前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の微生物である請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である請求項１に記載の生産方法。
【請求項１】
少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシへキサン酸を含むモノマーユニットを重合して得られるポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法であって、構成脂肪酸としてラウリン酸を４１重量％以上含有する油脂、及び/又は脂肪酸を炭素源とし、かつ培養開始時からのポリヒドロキシアルカン酸の平均時間生産性が１．５ｇ/Ｌ/ｈ以上になるよう、酸素移動速度を調整して微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法。
【請求項２】
前記酸素移動速度が７０ｍｏｌＯ２/ｍ３/ｈ以上であることを特徴とする請求項１の生産方法。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカン酸中の３ＨＨ組成比率が６ｍｏｌ％以上であることを特徴とする請求項１の生産方法。
【請求項４】
前記炭素源がパーム核油、ヤシ油、及びこれらの油脂を分別して得られる分別油脂、脂肪酸の群から選ばれる少なくとも１種の油脂、及び/又は脂肪酸である請求項１の生産方法。
【請求項５】
前記微生物が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカン酸重合活性を有するポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が組み込まれていることを特徴とする請求項１の生産方法。
【請求項６】
前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の微生物である請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
前記微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である請求項１に記載の生産方法。
【公開番号】特開２０１３−９６２７（Ｐ２０１３−９６２７Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４４５０７（Ｐ２０１１−１４４５０７）
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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