微生物の核酸回収方法
【課題】繊維状物質中に捕集された微生物から、ＤＮＡを効率よく回収する方法の提供。
【解決手段】（ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程と、を有することを特徴とする、微生物の核酸回収方法。
【解決手段】（ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程と、を有することを特徴とする、微生物の核酸回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊維状物質中に捕集された微生物から核酸を回収する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
繊維状又はスポンジ状の構造体（以下、繊維状物質）を用いて微生物のサンプリングや濃縮を行う検査がある。例えば、セルロースやＰＶＤＦ等のフィルターを用いて、ビールや水等の液体、炭酸ガス等の気体等を濾過することにより、液体や気体に含まれている微生物を捕集・濃縮することができる。また、綿やポリプロピレン等によって、装置や床等の固体の表面を擦り取ることにより、固体に付着している微生物を捕集することができる。
【０００３】
繊維状物質によって捕集された微生物は、様々な手法によって検出・同定される。例えば、微生物が有するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をルシフェリン・ルシフェラーゼの発光により検出するＡＴＰ方法や、微生物の生育に適した条件に整えることで微生物の増殖を検出する培養法等がある。しかしながら、ＡＴＰ法では、検出感度が低く、かつ微生物の種類を特定することができない、という問題がある。さらに、ＡＴＰは微生物以外にも汚れや食品等の様々なものに含まれているため、微生物のみを検出することができないという問題もある。一方で、培養法では、培養に長時間を要するという問題がある。また、培養条件が不適切な場合には微生物は増殖できないため、微生物の存在を見逃してしまう擬陰性の問題や、死菌は検出できないという問題もある。
【０００４】
近年の核酸解析技術の進歩に伴い、より迅速かつ特異的に微生物を検出する方法として、微生物のＤＮＡを解析する方法が用いられている。例えば、液体中の微生物を検出する場合、まず、当該液体をフィルター濾過することにより濾過膜上に微生物を捕集し、この捕集された微生物からＤＮＡを抽出する。抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより、微生物を検出することができる。
【０００５】
例えば非特許文献１には、ポリカーボネイト又はポリスルホンからなる濾過膜を用いて飲料水をフィルター濾過した後、当該濾過膜にジルコニア・ガラスビーズを添加して振動を与えて菌体を破砕し、ＤＮＡを抽出する方法が開示されている。また、非特許文献２には、微生物を回収した濾過膜を溶解させることにより、当該濾過膜に捕集された微生物を回収する方法が開示されている。具体的には、ビールをポリカーボネイト膜で濾過した後、当該濾過膜に水とクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）溶液とを添加し、溶解した濾過膜から遊離した微生物を水相に回収している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】中村、ジャーナル・オブ・エアロゾル・リサーチ（Journal of Aerosol Research）、２００３年、第１８巻第３号、第１７７〜１８０ページ。
【非特許文献２】ディミッシェル（DiMichele）、他１名、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサエティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ（the Journal of the American Society of Brewing Chemists）、１９９３年、第５１巻第２号、第６３〜６６ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
繊維状物質に微生物を捕集する場合、微生物の多くは繊維の内部に埋め込まれるようにして捕集される。このため、繊維状物質の深部に捕集された微生物からＤＮＡを抽出・回収することは困難であり、ＤＮＡ回収効率が劣る結果、微生物の検出感度も低下してしまうという問題がある。
【０００８】
非特許文献１に記載の方法のように、微生物が捕集された濾過膜を、ジルコニア・ガラスビーズを用いて物理的に破壊する方法では、濾過膜を均一に破壊することは非常に困難である。このため、破壊されなかった部分に捕集されている微生物からは、依然としてＤＮＡを回収することは困難である。
また、非特許文献２に記載の方法では、微生物が捕集されたポリカーボネイト膜自体を溶解させるため、ポリカーボネイト膜から効率よく微生物を回収することができる。しかしながら、ポリカーボネイト以外の繊維から形成された繊維状物質に対しては上手く溶解処理が行えず、微生物由来のＤＮＡ回収の効率を改善させることは難しい。
【０００９】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、繊維状物質中に捕集された微生物から、ＤＮＡを効率よく回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、微生物を捕集した繊維状物質を、微生物溶解酵素を含有する抽出用溶液に浸漬させて、捕集されている微生物から核酸を抽出する際に、微生物溶解酵素処理の前後に繊維状物質に対して圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことにより、繊維状物質に捕集された微生物からの核酸の回収効率を改善し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１） （ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の核酸回収方法、
（２） 前記工程（ｂ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行い、
前記工程（ｄ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行うことを特徴とする前記（１）に記載の微生物の核酸回収方法、
（３） 前記圧力サイクル処理における圧力の範囲が１〜５０ｋｐｓｉであることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の微生物の核酸回収方法、
（４） 前記圧力サイクル処理におけるサイクル数が２〜９９回であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
（５） 前記圧力サイクル処理における各サイクルの圧力保持時間が１〜６０秒間であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
（６） 前記抽出用溶液が、キャリア核酸を含有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
（７） さらに、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された抽出用溶液から核酸を回収する工程と、
を有することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微生物の核酸回収方法は、繊維状物質からなる捕集具に捕集された微生物から核酸を高効率で回収することができる。このため、本発明の微生物の核酸回収方法を用いることにより、繊維状物質中に捕集された微生物が非常に微量であったとしても、遺伝子解析等に必要な核酸を当該微生物から回収し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の微生物の核酸回収方法は、捕集具に捕集された微生物に対して直接微生物溶解酵素反応を行い、微生物由来の核酸を抽出し、回収する方法である。本発明においては、微生物溶解酵素反応の前後において、微生物が捕集された捕集具に対して圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことを特徴とする。繊維状物質からなる捕集具を微生物溶解酵素を含む溶液に浸漬させた場合には、捕集具の内部にまで当該溶液が十分に浸透せず、当該捕集具の内部に捕集された微生物は微生物溶解酵素によって溶解されず、核酸の抽出・回収が不十分になりやすい。これに対して、捕集具に対して圧力サイクル処理等を行うことにより、当該捕集具の内部の繊維状物質同士の隙間に埋め込まれるようにして捕集されている微生物にも微生物溶解酵素を含む溶液が十分に浸透する結果、当該捕集具により捕集された全ての微生物から効率良く核酸を抽出・回収することができる。なお、本発明の微生物の核酸回収方法によって微生物から回収される核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。
【００１４】
本発明の微生物の核酸回収方法は、下記工程（ａ）〜（ｅ）を有することを特徴とする。
（ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程。
【００１５】
本発明及び本願明細書において、繊維状物質とは、アスペクト比が大きく、細長い紐状の構造を有する物質である。繊維状物質は適当な構造に形成することにより、繊維状物質同士の間に微生物を捕集することができる。本発明において用いられる繊維状物質としては、天然繊維であってもよく、合成繊維であってもよいが、核酸に対する吸着性が低いものが好ましい。具体的には、天然繊維としては、セルロース、綿繊維、パルプ、炭素繊維等が挙げられる。合成繊維としては、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ポリカーボネイト、ポリスルホン、ナイロン、レーヨン、アクリル、ビニロン等が挙げられる。
【００１６】
本発明の微生物の核酸回収方法に用いられる捕集具は、繊維状物質からなる。捕集具は、少なくともその一部に、微生物と接触した際に、繊維状物質の表面又は繊維状物質同士の間に微生物を捕集可能な構造、すなわち、繊維状物質同士によって多孔質が形成された構造を有していればよい。捕集具の形状としては、具体的には例えば、繊維状物質により織られた布、不織布、濾紙、メンブレンフィルター、スポンジ、綿棒、スワブ、カラムの充填剤等が挙げられる。捕集具を構成する繊維状物質は、１種類の繊維のみであってもよく、２種類以上の繊維を組み合わせて用いてもよい。また、捕集具は、使用の態様を考慮し、繊維状物質以外からなる構造により支持等されていてもよい。例えば、繊維状物質からなるメンブレンフィルターは、繊維状物質以外からなる外枠を有していてもよい。このようなメンブレンフィルターとして、孔径が０．１〜５．０μｍ、空隙率が６５〜８１％、質量が４．２〜６．３ｍｇ／ｃｍ２、厚さが１１０〜１６０μｍの市販のメンブレンフィルターを用いることができる。
【００１７】
まず、工程（ａ）として、微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する。具体的には、微生物が存在していると期待される液体や固体表面に、繊維状物質からなる捕集具を接触させる。捕集具は、繊維状物質同士によって多孔質が形成された構造であるため、当該捕集具と接触した微生物は、繊維状物質同士からなる隙間に埋め込まれるようにして捕集される。例えば、微生物を含む液体に捕集具を浸漬させたり、微生物が付着している固体の表面を、捕集具でこすったり拭いたりすることによって、捕集具に微生物を捕集することができる。捕集具がメンブレンフィルターや濾紙である場合には、微生物を含む液体をメンブレンフィルター等に透過させ、メンブレンフィルター等の表面やその内部に微生物を捕集することもできる。
【００１８】
次いで、工程（ｂ）として、前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う。具体的には、微生物が捕集された捕集具を、抽出用溶液に浸漬させ、その状態で、圧力サイクル処理等を行う。捕集具を浸漬させる抽出用溶液の容量は、捕集具全体を浸漬させた状態で圧力サイクル処理等が実行可能な容量 であればよい。
【００１９】
本発明及び本願明細書において、抽出用溶液は、微生物溶解酵素が添加されて適切な温度に調整されることにより、微生物溶解酵素反応が行われる際の反応用溶媒となり、微生物溶解酵素反応によって捕集具中の微生物から核酸が抽出される溶液である。抽出用溶液としては、各種緩衝液や水等を用いることができる。抽出用溶液として用いられる緩衝液としては、微生物溶解酵素による酵素反応に適当なｐＨ等を有していればよく、用いる微生物溶解酵素の種類等を考慮して、生体試料の希釈等に一般的に用いられるバッファーの中から適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、リン酸バッファー、トリスバッファー、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＨＵＮＫＳバッファー等が挙げられる。
【００２０】
抽出用溶液には、微生物溶解酵素反応を阻害しない限り、任意成分を添加してもよい。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤や、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート等を添加することもできる。抽出用溶液に添加される任意成分等の濃度は、微生物溶解酵素反応を阻害しない濃度であれば、特に限定されるものではなく、任意成分の種類、抽出用溶液の種類、微生物溶解酵素の種類等を考慮して適宜決定することができる。
【００２１】
圧力サイクル処理とは、捕集具を浸漬させた抽出用溶液の圧力を上昇させる加圧工程と、当該抽出用溶液の圧力を低下させる減圧工程とを、少なくとも１回ずつ繰り返す処理を意味する。例えば、１サイクルは、加圧工程と減圧工程とを１回ずつ含む。具体的には、初期圧力から圧力を上昇させる加圧工程と、その後初期圧力付近まで圧力を低下させる減圧工程とを１サイクルとしてもよい。その他、１サイクルには、２回以上の加圧工程、又は２回以上の減圧工程を含んでいてもよい。例えば、初期圧力から圧力を上昇させる加圧工程の後、次いでさらに圧力を上昇させる加圧工程を行い、その後初期圧力付近まで圧力を低下させる減圧工程を、１サイクルとしてもよい。
【００２２】
圧力サイクル処理においては、圧力サイクルを１サイクルのみ行ってもよく、２サイクル以上繰り返してもよい。本発明においては、圧力サイクルを２〜９９回繰り返すことが好ましく、２〜２０回繰り返すことがより好ましく、５〜２０回繰り返すことがさらに好ましく、５〜１０回繰り返すことがよりさらに好ましい。
【００２３】
圧力サイクル処理において、加圧工程終了時点における抽出用溶液の圧力（すなわち、一サイクルにおける抽出用溶液の最大圧力）は、抽出用溶液中に浸漬している捕集具全体に抽出用溶液が十分に浸透し得る圧力であれば特に限定されるものではなく、捕集具の構造（繊維状物質同士により形成される孔の孔径、柔軟性等）や繊維状物質の種類、抽出用溶液の種類や粘度等を考慮して、適宜調整することができる。例えば、加圧工程終了時点における抽出用溶液の圧力は、１〜５０ｋｐｓｉ（６．８９５〜３４４．７５ＭＰａ）の範囲内であることが好ましく、１０〜３５ｋｐｓｉ（６８．９５〜２４１．３２５ＭＰａ）の範囲内であることがより好ましい。
【００２４】
圧力サイクル処理においては、加圧工程終了後、直ちに減圧工程を開始してもよいが、加圧工程終了後減圧工程開始前に、加圧工程終了時点における抽出用溶液の圧力を所定時間保持していてもよい。加圧工程終了後減圧工程開始前に圧力保持する場合、圧力保持時間は、１〜６０秒間であることが好ましく、２〜１０秒間であることがより好ましい。
【００２５】
圧力サイクル処理は、液体を加圧・減圧処理するために通常用いられている圧力調整機を用いて行うことができる。当該圧力調整機として、例えばフレンチプレス、バロサイクラー等が挙げられる。また、圧力調整機は、加熱装置や冷却装置等の温度調整機を備えるものであってもよい。
【００２６】
超音波処理は、捕集具を浸漬させた抽出用溶液に、２０ｋＨｚ以上の超音波を照射する処理を意味する。超音波の照射は、超音波を発するチップを直接抽出用溶液に挿入して行う接触方式であってもよく、抽出用溶液が収容された容器を、超音波が照射されている水浴中に設置し、抽出用溶液が収容された容器の外側から超音波を照射する非接触方式で行ってもよい。また、超音波照射は、連続して１回のみ行ってもよく、所定時間の照射を２回以上、不連続に行ってもよい。
【００２７】
照射する超音波の波長、出力、照射時間は、抽出用溶液中に浸漬している捕集具全体に抽出用溶液を十分に浸透させ得る圧力であれば特に限定されるものではなく、超音波の照射方式、捕集具の構造（繊維状物質同士により形成される孔の孔径、柔軟性等）や繊維状物質の種類、抽出用溶液の種類や粘度等を考慮して、適宜調整することができる。
【００２８】
核酸は比較的高温環境下であっても分解等の影響を受け難い。このため、圧力サイクル処理時又は超音波処理時における抽出用溶液の温度は、抽出用溶液の沸点以下であれば特に限定されるものでない。
【００２９】
前記工程（ｂ）の後、工程（ｃ）として、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う。具体的には、微生物溶解酵素を含む抽出用溶液中に捕集具を浸漬させた状態で、所定時間インキュベートする。微生物溶解酵素は、前記工程（ｂ）の後、捕集具を含む抽出用溶液に添加してもよい。また、前記工程（ｂ）の前に、捕集具を浸漬させた抽出用溶液に微生物溶解酵素を添加してもよく、微生物溶解酵素を含む抽出用溶液に捕集具を浸漬させてもよい。
【００３０】
微生物溶解酵素は、微生物を溶かす活性を有する酵素である。使用される微生物溶解酵素は、微生物や培養真核細胞等から核酸を抽出する際に用いられる公知の酵素の中から、核酸を回収する対象とする微生物種によって適宜選択される。例えば、微生物が細菌の場合には、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、プロテイナーゼＫ等が微生物溶解酵素として挙げられる。微生物が酵母の場合には、β−１，３−グルカナーゼ活性を有するザイモリエイス、キタラーゼ、ツニカーゼ等が挙げられる。抽出用溶液に添加される微生物溶解酵素は、１種類のみであってもよく、複数種類を適宜組み合わせてもよい。
【００３１】
微生物溶解酵素反応の反応温度は、使用する微生物溶解酵素が酵素活性を示す温度とする。また、微生物溶解酵素反応の反応時間は、抽出用溶液中の微生物の細胞膜等を溶解させ、細胞内部に存在する核酸を細胞外へ抽出するために充分な時間であればよく、使用する微生物溶解酵素の種類や濃度等を考慮して、適宜調整することができる。
【００３２】
反応の至適温度が異なる複数種類の微生物溶解酵素を用いる場合、各微生物溶解酵素に適した温度で順次インキュベートする。反応の至適温度のみならず、反応溶液の塩濃度、ｐＨ等の条件が異なる複数種類の微生物溶解酵素を用いる場合、２回目の酵素反応を行う前に、反応溶液の組成を当該酵素の反応に適するように調整するために、適当な組成・量の緩衝液を添加してもよい。例えば、至適温度が３７℃である微生物溶解酵素と至適温度が５０℃である微生物溶解酵素とを用いる場合、工程（ｃ）として、まず、両酵素を含む抽出用溶液を、３７℃で所定時間インキュベートした後、反応溶液の組成等を調整するために適宜緩衝液を添加した後、５０℃で所定時間インキュベートする。この場合、３７℃におけるインキュベート終了後、５０℃におけるインキュベート前に、圧力サイクル処理又は超音波処理を行ってもよい。圧力サイクル処理又は超音波処理は、工程（ｂ）と同様にして行うことができる。
【００３３】
工程（ｃ）の後、工程（ｄ）として、抽出用溶液中の捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う。圧力サイクル処理又は超音波処理は、工程（ｂ）と同様にして行うことができる。微生物溶解酵素反応後に圧力サイクル処理等を行うことにより、抽出用溶液中に抽出された微生物由来の核酸を、捕集具、特に繊維状物質にからめとられることを防止し、工程（ｅ）において抽出用溶液からの核酸回収効率が改善される。
【００３４】
工程（ｂ）及び（ｄ）において、いずれも圧力サイクル処理を行ってもよく、いずれも超音波処理を行ってもよい。また、工程（ｂ）及び（ｄ）のいずれか一方を圧力サイクル処理とし、他方を超音波処理としてもよい。本発明においては、工程（ｂ）及び（ｄ）のいずれも圧力サイクル処理を行うことが好ましい。
【００３５】
前記工程（ｂ）の前に抽出用溶液に微生物溶解酵素を添加し、かつ工程（ｂ）及び（ｄ）における圧力サイクル処理等を当該微生物溶解酵素が酵素活性を示す温度で行う場合には、工程（ｂ）〜（ｄ）を一の工程で行うことができる。
【００３６】
その後、工程（ｅ）として、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する。回収方法は、捕集具が浸漬された抽出用溶液から、固形の捕集具と液体成分とを分離することが可能な方法であればよく、一般的に行われる固液分離の手法の中から適宜選択して用いることができる。固液分離法としては、具体的には、遠心分離処理、真空ポンプによるバキューム処理等が挙げられる。例えば、抽出用溶液を遠心分離処理することによって、捕集具を沈殿させ、上清を回収する。その他、工程（ｄ）の後、液体成分をピペット等で回収した後、残りを遠心分離処理して上清を回収してもよい。先に回収された液体成分と遠心分離処理後に回収された上清とを合わせて、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液とする。
【００３７】
工程（ｂ）〜（ｄ）において抽出用溶液中に抽出された核酸は、工程（ｅ）における固液分離によって、抽出用溶液に溶解された状態で回収される。抽出された核酸が固液分離時に捕集具、特に繊維状物質にからめとられると、核酸の回収効率が低下する。予めキャリア核酸を抽出用溶液に含有させることにより、工程（ｅ）において、より核酸含有量の高い抽出用溶液を回収することができる。
【００３８】
キャリア核酸は、核酸であればよく、具体的には、λＤＮＡ、ｔＲＮＡ、精子ＤＮＡ等が挙げられる。また、キャリア核酸は、工程（ｄ）の後工程（ｅ）の前に、捕集具が浸漬された抽出用溶液に添加してもよく、工程（ｃ）において微生物溶解酵素と共に抽出用溶液に添加してもよく、工程（ｂ）において、予めキャリア核酸を含有する抽出用溶液に捕集具を浸漬させてもよい。
【００３９】
工程（ｅ）において回収された抽出用溶液には、捕集具に捕集された微生物から抽出された核酸が溶解している。よって、一般的な核酸回収・精製方法によって、回収された抽出用溶液から核酸を回収し精製することができる。核酸回収・精製方法としては、アルコール沈殿法やシリカゲルカラム吸着法、塩化セシウム超遠心法等が挙げられる。その他、市販のＤＮＡ精製キットを用いてもよい。
【００４０】
核酸を回収・精製する前に、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液に対して、クロロホルム抽出処理等の除タンパク質処理を行ってもよい。除タンパク質処理は１回行ってもよく、２回以上繰り返して行ってもよい。
【００４１】
本発明においては、シリカメンブレンを材質（充填材）とするスピンカラムを用いることにより、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液から核酸を精製することが好ましい。抽出用溶液中の核酸が極微量である場合、フェノール・クロロホルム抽出やアルコール沈殿によって核酸回収率が低下する場合がある。シリカメンブレンを材質とするスピンカラムを用いた場合には、脱塩（アルコール沈殿）の必要が無く、溶媒抽出の必要も無いため、比較的損失の少ない精製濃縮が可能となる。
【００４２】
回収又は精製された微生物由来の核酸は、他の手法により精製された核酸と同様に、各種核酸解析法に用いることができる。当該核酸解析法としては、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅方法、ＤＮＡチップ法、ＤＧＧＥ法、メタゲノム等の遺伝子解析方法等が挙げられる。その他、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液は、他の手法により得られた核酸抽出液と同様に、各種核酸解析法にそのまま用いることもできる。
【００４３】
本発明の微生物の核酸回収方法により、繊維状物質中に存在する微量な微生物から核酸を高効率に抽出・回収することが可能になる。特に、ビール、水等の液体、炭酸ガス等の気体、設備等の固体表面等に存在する微量の微生物から核酸を回収し、高感度な遺伝子解析を行うことが可能になる。
【実施例】
【００４４】
次に参考例及び実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の参考例及び実施例に限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］
本発明の微生物の核酸回収方法において、圧力サイクル処理におけるサイクル数の核酸回収効率に対する影響を調べた。
まず、１０２ＣＦＵのビール有害乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）を含む液体をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。このＰＶＤＦメンブレンフィルターを折り畳んで、耐圧力チューブ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製、 製品名：ＦＴ５００−ＮＤ ＰＵＬＳＥ Ｔｕｂｅ、製品番号：♯ＦＴ００５００−ＮＤ）に投入した。続いて当該耐圧チューブに、１０μＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのＮ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）、１０μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)、及び１０μＬのλ−ＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ社製、製品番号：＃Ａ３４７７Ｌ）を含んだＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターを浸漬させた。その後Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して、圧力サイクル処理を行った。圧力サイクル条件は、３５ｋｐｓｉを１０秒間し、その後常圧を１０秒間する操作を１サイクルとし、１０サイクル又は９９サイクル実施した。
次いで、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。その後、再度当該耐圧チューブ内の溶液に対して前記と同じ圧力サイクル条件による圧力サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した。さらに、当該耐圧チューブに残留している内容物を１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理することにより、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターに含まれていた溶液を回収し、先のチューブに移した溶液と合体させた。こうして得られた溶液中には、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸が溶解していた。
【００４６】
回収された溶液に、当該溶液の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液をシリカメンブレンのスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品名：ＱＩＡａｍｐ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。その後、当該カラムをＡＷ１溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製）で洗浄した後、５０μＬのＡＷ２溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製）で当該カラムからＤＮＡを溶出させた。
得られたＤＮＡをＰＣＲ法で検査した。ＰＣＲの反応条件は、Ａｓａｎｏらの方法(J. Am. Soc. Brew. Chem. 66(1):37-42, 2008) に従った。具体的には、フォワードプライマーとして5’-CTGATTTCAACAATGAAGC-3’の配列（配列番号１）を有するプライマーを、リバースプライマーとして5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’の配列（配列番号２）を有するプライマーを、それぞれ使用した。ＰＣＲ試薬（酵素、緩衝液）は、ＰｅｒｆｅｃｔＳｈｏｔ Ｅｘ Ｔａｑ(Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製)を用い、サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ(ｍｏｄｅｌ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。反応条件は、９４℃で２．５分間保持した後、９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間からなるサイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で３分間保持した。増幅産物の確認は、２％(ｖ／ｗ)アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で染色し、ＵＶトランスイルミネーターでバンドを確認した。
【００４７】
この結果、ＰＣＲ産物量は、圧力サイクル数を１０回とした検体と９９回とした検体とで、同程度であった。当該結果は、両検体において、ＰＶＤＦメンブレンフィルターから回収されたＬ．ｂｒｅｖｉｓ由来の核酸はほぼ同程度であったことを示唆する。つまり、圧力サイクル処理において、サイクル数は９９回も実施する必要が無く、１０回程度で充分であるといえる。
【００４８】
［実施例２］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｅ）における抽出用溶液の回収の方法の核酸回収効率に対する影響を調べた。
具体的には、１０１、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。このＰＶＤＦメンブレンフィルターに対して、圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回とした以外は実施例１と同様にして圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回として圧力サイクル処理を行った。その後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した溶液と、当該耐圧チューブに残留している内容物を１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理することにより回収した当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターに含まれていた溶液と合体させた。得られた溶液を検体（遠心分離処理有り）とした。
一方で、１０１、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓを捕集したＰＶＤＦメンブレンフィルターに対して、圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回とした以外は実施例１と同様にして圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回として圧力サイクル処理を行った。その後、当該耐圧チューブ内の溶液を、特段の遠心分離処理等を行うことなく別のチューブに回収し、これを検体（遠心分離処理無し）とした。
【００４９】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体（遠心分離処理無し）では、１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０３ＣＦＵ以下のＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。これに対して、検体（遠心分離処理有り）では、１０３ＣＦＵ及び１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０２ＣＦＵ以下のＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。つまり、検体（遠心分離処理無し）と検体（遠心分離処理有り）とでは、核酸回収効率に、菌数レベルで１オーダー程度（１０倍）の差が観察された。これらの結果から、工程（ｅ）における抽出用溶液の回収を、遠心分離処理等により捕集具に含まれている抽出用溶液を充分に回収することによって、核酸回収効率が改善されることが明らかである。
【００５０】
［実施例３］
微生物を捕集した捕集具を、予め微生物溶解酵素を含有させた抽出用溶液に浸漬させた後、圧力サイクル処理を行うことによって、本発明の微生物の核酸回収方法により、微生物由来の核酸を回収した。
まず、１００、１０１、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬを、ポアサイズ０．４５μｍのセルロースメンブレンにより吸引濾過し、当該セルロースメンブレンにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。当該セルロースメンブレンをＰＢＳ１００ｍＬで洗浄した後、折り畳んで、耐圧力チューブ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製、 製品名：ＦＴ５００−ＮＤ ＰＵＬＳＥ Ｔｕｂｅ、製品番号：♯ＦＴ００５００−ＮＤ）に投入した。続いて当該耐圧チューブに、１０μＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのＮ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）、１０μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)、及び１０μＬのλ−ＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ社製、製品番号：＃Ａ３４７７Ｌ）を含んだＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該セルロースメンブレンを浸漬させた。その後Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して、圧力サイクル処理を行った。圧力サイクル条件は、３５ｋｐｓｉを１０秒間し、その後常圧を１０秒間する操作を１サイクルとし、１０サイクル実施した（圧力サイクル条件Ａ）。
その後、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。その後、再度当該耐圧チューブ内の溶液に対して圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した。さらに、当該耐圧チューブに残留している内容物を１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理することにより、当該セルロースメンブレンに含まれていた溶液を回収し、先のチューブに移した溶液と合体させた。こうして得られた溶液中には、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸が溶解していた。
【００５１】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。
ＰＣＲ産物の確認結果を表１に示す。この結果、ビールに添加したＬ．ｂｒｅｖｉｓの量依存的に、ＰＣＲ産物の量が多くなることが確認された。また、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓが３００ｍＬ当たり１００ＣＦＵと非常に微量にしか含まれていなかったビールからもＰＣＲ産物が確認されたことから、本発明の微生物の核酸回収方法により、極微量の微生物から効率よく核酸を回収し得ることがわかった。
【００５２】
【表１】
【００５３】
［実施例４］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｂ）及び工程（ｄ）において、圧力サイクル処理を行った場合と超音波処理を行った場合の核酸回収効率を調べた。
具体的には、実施例３と同様にして、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬからセルロースメンブレンを用いてＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した後、当該セルロースメンブレンに対して圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体（圧力サイクル処理）とした。
一方で、圧力サイクル条件Ａによる圧力サイクル処理に代えて、超音波処理を行った以外は、上記検体（圧力サイクル処理）の調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体（超音波処理）とした。超音波処理には、ブランソン超音波洗浄器１５１０Ｊ−ＭＴＨ（発信周波数：４２ｋＨｚ、出力：９０Ｗ）を用い、３分間実施した。
【００５４】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体（圧力サイクル処理）及び検体（超音波処理）のいずれにおいても、１０２〜１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡで、ＰＣＲ産物が検出された。これらの結果から、工程（ｂ）及び工程（ｄ）において、圧力サイクル処理を行った場合と超音波処理を行った場合とで、核酸回収効率に特段の差異はなく、いずれも効率よく核酸を回収し得ることが確認された。
【００５５】
［実施例５］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｄ）の有無の核酸回収効率に対する影響を調べた。
まず、１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。実施例１と同様にして、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターを折り畳んで耐圧力チューブに投入し、当該耐圧チューブに、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ、及びλ−ＤＮＡを含むＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕を添加して当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターを浸漬させた後、サイクル数を１０回として圧力サイクル処理を行った。
次いで、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該溶液耐圧チューブに実施例１で用いたＢ２緩衝液１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。
その後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収し、これを検体Ａとした。
さらに、当該耐圧チューブに残留している内容物（ＰＶＤＦメンブレンフィルター）に対してＢ１緩衝液４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該内容物を浸漬させた後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して、前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収し、これを検体Ｂとした。
【００５６】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。得られたＰＣＲ産物の濃度を測定したところ、検体Ａ由来のＰＣＲ産物は５．６７ｎｇ／μＬであり、検体Ｂ由来のＰＣＲ産物は２．０３ｎｇ／μＬであった。つまり、酵素反応後に圧力サイクル処理等を行わずに抽出用溶液を回収した場合には、当該抽出用溶液に抽出された核酸の約３０％程度が捕集具とともに残留してしまっていた。これらの結果から、酵素反応後に圧力サイクル処理等を行うことにより、圧力サイクル処理等を行わない場合よりもより多量の核酸を回収し得ることが確認された。これは、酵素反応後に圧力サイクル処理等を行うことにより、捕集具にからめとられていた核酸が捕集具から遊離するためと推察される。
【００５７】
［実施例６］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｂ）の有無の核酸回収効率に対する影響を調べた。
まず、実施例３と同様にして、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬからセルロースメンブレンを用いてＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した後、当該セルロースメンブレンに対して圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体Ａとした。
【００５８】
一方で、工程（ｂ）を行わない方法は、以下のようにして行った。まず、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬを、ポアサイズ０．４５μｍのセルロースメンブレンにより吸引濾過し、当該セルロースメンブレンにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。当該セルロースメンブレンをＰＢＳ１００ｍＬで洗浄した後、折り畳んで、実施例３と同様の耐圧力チューブに投入した。続いて当該耐圧チューブに、１０μＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのＮ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）、及び１０μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)を含んだＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該セルロースメンブレンを浸漬させた。当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加し、さらに当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。その後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して、実施例３と同様にして圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体Ｂとした。
【００５９】
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理に代えて超音波処理を行った以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂとした。超音波処理には、ブランソン超音波洗浄器１５１０Ｊ−ＭＴＨ（発信周波数：４２ｋＨｚ、出力：９０Ｗ）を用い、３分間実施した。
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行わなかった以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂ’とした。
【００６０】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体Ａでは、１０２〜１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡで、ＰＣＲ産物が検出された。これに対して、検体Ｂ、検体ｂ、及び検体ｂ’では、１０３ＣＦＵ及び１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０２ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。つまり、本発明の微生物の回収方法により調製された検体Ａと、工程（ｂ）を行わなかった方法により調製された検体Ｂ、検体ｂ、又は検体ｂ’とでは、核酸回収効率に、菌数レベルで１オーダー（１０倍）以上の差が観察された。これらの結果から、微生物溶解酵素反応の前に圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことにより、核酸回収効率を飛躍的に改善し得ることが明らかである。
【００６１】
［実施例７］
捕集具から微生物を分離回収せずに微生物溶解酵素反応により核酸を抽出する本発明の微生物の核酸回収方法と、捕集具から微生物を分離回収した後に核酸を抽出・回収する方法との核酸回収効率を比較した。
まず、実施例３と同様にして、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬからセルロースメンブレンを用いてＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した後、当該セルロースメンブレンに対して圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体Ａとした。
【００６２】
一方で、捕集具から微生物を分離回収した後に核酸を抽出・回収する方法は、以下のようにして行った。まず、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬを、ポアサイズ０．４５μｍのセルロースメンブレンにより吸引濾過し、当該セルロースメンブレンにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。当該セルロースメンブレンをＰＢＳ１００ｍＬで洗浄した後、折り畳んで、実施例３と同様の耐圧力チューブに投入した。続いて当該耐圧チューブにＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該セルロースメンブレンを浸漬させた後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して、実施例３と同様にして圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った。その後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。
回収された溶液に、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）を１０μＬ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)を１０μＬ、それぞれ添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加し、さらに当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベート後の溶液を回収し、これを検体Ｂとした。
【００６３】
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理に代えて超音波処理を行った以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂとした。超音波処理には、ブランソン超音波洗浄器１５１０Ｊ−ＭＴＨ（発信周波数：４２ｋＨｚ、出力：９０Ｗ）を用い、３分間実施した。
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行わなかった以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂ’とした。
【００６４】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体Ａでは、１０２〜１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡで、ＰＣＲ産物が検出された。これに対して、検体Ｂ、検体ｂ、及び検体ｂ’では、１０３ＣＦＵ及び１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０２ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。つまり、本発明の微生物の回収方法により調製された検体Ａと、捕集具から微生物を分離回収した後に核酸を抽出・回収する方法により調製された検体Ｂ、検体ｂ、又は検体ｂ’とでは、核酸回収効率に、菌数レベルで１オーダー（１０倍）以上の差が観察された。
【００６５】
［実施例８］
工程（a）における捕集具をスワブとして本発明の微生物の核酸回収方法を行い、核酸回収効率を調べた。
１０２、１０３、１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む１００μＬのＰＢＳを、ふき取り環境検査用スワブ（商品名：ふきふきチェックII、栄研科学株式会社製）を用いてそれぞれサンプリングした。シャフトから切り離したスワブを、実施例１と同様の耐圧力チューブに投入した。続いて当該耐圧チューブに、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ、及びλ−ＤＮＡを含むＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕を添加して当該スワブを浸漬させた後、サイクル数を１０回として実施例３と同様にして圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った。
次いで、当該耐圧チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該耐圧チューブに実施例１で用いたＢ２緩衝液１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブに対して前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブを５０℃で６０分間インキュベートした。その後、再度当該耐圧チューブ内の溶液に対して圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した。
その後、回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。その結果、各検体から回収されたＤＮＡ溶液からＬ．ｂｒｅｖｉｓ由来のＰＣＲ産物が検出された。すなわち、本発明の微生物の核酸回収方法は、捕集具をスワブとした場合でも高い核酸回収効率を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の微生物の回収方法により、効率よく微生物由来の核酸を回収することができる。そして、当該方法により精製されたＤＮＡは、ＰＣＲ等の核酸解析により、微生物の定性又は定量検出に供することができる。このため、本発明の微生物の回収方法は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な液状の商品の製造分野、特に品質管理等において利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊維状物質中に捕集された微生物から核酸を回収する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
繊維状又はスポンジ状の構造体（以下、繊維状物質）を用いて微生物のサンプリングや濃縮を行う検査がある。例えば、セルロースやＰＶＤＦ等のフィルターを用いて、ビールや水等の液体、炭酸ガス等の気体等を濾過することにより、液体や気体に含まれている微生物を捕集・濃縮することができる。また、綿やポリプロピレン等によって、装置や床等の固体の表面を擦り取ることにより、固体に付着している微生物を捕集することができる。
【０００３】
繊維状物質によって捕集された微生物は、様々な手法によって検出・同定される。例えば、微生物が有するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をルシフェリン・ルシフェラーゼの発光により検出するＡＴＰ方法や、微生物の生育に適した条件に整えることで微生物の増殖を検出する培養法等がある。しかしながら、ＡＴＰ法では、検出感度が低く、かつ微生物の種類を特定することができない、という問題がある。さらに、ＡＴＰは微生物以外にも汚れや食品等の様々なものに含まれているため、微生物のみを検出することができないという問題もある。一方で、培養法では、培養に長時間を要するという問題がある。また、培養条件が不適切な場合には微生物は増殖できないため、微生物の存在を見逃してしまう擬陰性の問題や、死菌は検出できないという問題もある。
【０００４】
近年の核酸解析技術の進歩に伴い、より迅速かつ特異的に微生物を検出する方法として、微生物のＤＮＡを解析する方法が用いられている。例えば、液体中の微生物を検出する場合、まず、当該液体をフィルター濾過することにより濾過膜上に微生物を捕集し、この捕集された微生物からＤＮＡを抽出する。抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより、微生物を検出することができる。
【０００５】
例えば非特許文献１には、ポリカーボネイト又はポリスルホンからなる濾過膜を用いて飲料水をフィルター濾過した後、当該濾過膜にジルコニア・ガラスビーズを添加して振動を与えて菌体を破砕し、ＤＮＡを抽出する方法が開示されている。また、非特許文献２には、微生物を回収した濾過膜を溶解させることにより、当該濾過膜に捕集された微生物を回収する方法が開示されている。具体的には、ビールをポリカーボネイト膜で濾過した後、当該濾過膜に水とクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）溶液とを添加し、溶解した濾過膜から遊離した微生物を水相に回収している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】中村、ジャーナル・オブ・エアロゾル・リサーチ（Journal of Aerosol Research）、２００３年、第１８巻第３号、第１７７〜１８０ページ。
【非特許文献２】ディミッシェル（DiMichele）、他１名、ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサエティ・オブ・ブリューイング・ケミスツ（the Journal of the American Society of Brewing Chemists）、１９９３年、第５１巻第２号、第６３〜６６ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
繊維状物質に微生物を捕集する場合、微生物の多くは繊維の内部に埋め込まれるようにして捕集される。このため、繊維状物質の深部に捕集された微生物からＤＮＡを抽出・回収することは困難であり、ＤＮＡ回収効率が劣る結果、微生物の検出感度も低下してしまうという問題がある。
【０００８】
非特許文献１に記載の方法のように、微生物が捕集された濾過膜を、ジルコニア・ガラスビーズを用いて物理的に破壊する方法では、濾過膜を均一に破壊することは非常に困難である。このため、破壊されなかった部分に捕集されている微生物からは、依然としてＤＮＡを回収することは困難である。
また、非特許文献２に記載の方法では、微生物が捕集されたポリカーボネイト膜自体を溶解させるため、ポリカーボネイト膜から効率よく微生物を回収することができる。しかしながら、ポリカーボネイト以外の繊維から形成された繊維状物質に対しては上手く溶解処理が行えず、微生物由来のＤＮＡ回収の効率を改善させることは難しい。
【０００９】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、繊維状物質中に捕集された微生物から、ＤＮＡを効率よく回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、微生物を捕集した繊維状物質を、微生物溶解酵素を含有する抽出用溶液に浸漬させて、捕集されている微生物から核酸を抽出する際に、微生物溶解酵素処理の前後に繊維状物質に対して圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことにより、繊維状物質に捕集された微生物からの核酸の回収効率を改善し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１） （ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の核酸回収方法、
（２） 前記工程（ｂ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行い、
前記工程（ｄ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行うことを特徴とする前記（１）に記載の微生物の核酸回収方法、
（３） 前記圧力サイクル処理における圧力の範囲が１〜５０ｋｐｓｉであることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の微生物の核酸回収方法、
（４） 前記圧力サイクル処理におけるサイクル数が２〜９９回であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
（５） 前記圧力サイクル処理における各サイクルの圧力保持時間が１〜６０秒間であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
（６） 前記抽出用溶液が、キャリア核酸を含有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
（７） さらに、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された抽出用溶液から核酸を回収する工程と、
を有することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の微生物の核酸回収方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の微生物の核酸回収方法は、繊維状物質からなる捕集具に捕集された微生物から核酸を高効率で回収することができる。このため、本発明の微生物の核酸回収方法を用いることにより、繊維状物質中に捕集された微生物が非常に微量であったとしても、遺伝子解析等に必要な核酸を当該微生物から回収し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の微生物の核酸回収方法は、捕集具に捕集された微生物に対して直接微生物溶解酵素反応を行い、微生物由来の核酸を抽出し、回収する方法である。本発明においては、微生物溶解酵素反応の前後において、微生物が捕集された捕集具に対して圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことを特徴とする。繊維状物質からなる捕集具を微生物溶解酵素を含む溶液に浸漬させた場合には、捕集具の内部にまで当該溶液が十分に浸透せず、当該捕集具の内部に捕集された微生物は微生物溶解酵素によって溶解されず、核酸の抽出・回収が不十分になりやすい。これに対して、捕集具に対して圧力サイクル処理等を行うことにより、当該捕集具の内部の繊維状物質同士の隙間に埋め込まれるようにして捕集されている微生物にも微生物溶解酵素を含む溶液が十分に浸透する結果、当該捕集具により捕集された全ての微生物から効率良く核酸を抽出・回収することができる。なお、本発明の微生物の核酸回収方法によって微生物から回収される核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。
【００１４】
本発明の微生物の核酸回収方法は、下記工程（ａ）〜（ｅ）を有することを特徴とする。
（ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程。
【００１５】
本発明及び本願明細書において、繊維状物質とは、アスペクト比が大きく、細長い紐状の構造を有する物質である。繊維状物質は適当な構造に形成することにより、繊維状物質同士の間に微生物を捕集することができる。本発明において用いられる繊維状物質としては、天然繊維であってもよく、合成繊維であってもよいが、核酸に対する吸着性が低いものが好ましい。具体的には、天然繊維としては、セルロース、綿繊維、パルプ、炭素繊維等が挙げられる。合成繊維としては、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ポリカーボネイト、ポリスルホン、ナイロン、レーヨン、アクリル、ビニロン等が挙げられる。
【００１６】
本発明の微生物の核酸回収方法に用いられる捕集具は、繊維状物質からなる。捕集具は、少なくともその一部に、微生物と接触した際に、繊維状物質の表面又は繊維状物質同士の間に微生物を捕集可能な構造、すなわち、繊維状物質同士によって多孔質が形成された構造を有していればよい。捕集具の形状としては、具体的には例えば、繊維状物質により織られた布、不織布、濾紙、メンブレンフィルター、スポンジ、綿棒、スワブ、カラムの充填剤等が挙げられる。捕集具を構成する繊維状物質は、１種類の繊維のみであってもよく、２種類以上の繊維を組み合わせて用いてもよい。また、捕集具は、使用の態様を考慮し、繊維状物質以外からなる構造により支持等されていてもよい。例えば、繊維状物質からなるメンブレンフィルターは、繊維状物質以外からなる外枠を有していてもよい。このようなメンブレンフィルターとして、孔径が０．１〜５．０μｍ、空隙率が６５〜８１％、質量が４．２〜６．３ｍｇ／ｃｍ２、厚さが１１０〜１６０μｍの市販のメンブレンフィルターを用いることができる。
【００１７】
まず、工程（ａ）として、微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する。具体的には、微生物が存在していると期待される液体や固体表面に、繊維状物質からなる捕集具を接触させる。捕集具は、繊維状物質同士によって多孔質が形成された構造であるため、当該捕集具と接触した微生物は、繊維状物質同士からなる隙間に埋め込まれるようにして捕集される。例えば、微生物を含む液体に捕集具を浸漬させたり、微生物が付着している固体の表面を、捕集具でこすったり拭いたりすることによって、捕集具に微生物を捕集することができる。捕集具がメンブレンフィルターや濾紙である場合には、微生物を含む液体をメンブレンフィルター等に透過させ、メンブレンフィルター等の表面やその内部に微生物を捕集することもできる。
【００１８】
次いで、工程（ｂ）として、前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う。具体的には、微生物が捕集された捕集具を、抽出用溶液に浸漬させ、その状態で、圧力サイクル処理等を行う。捕集具を浸漬させる抽出用溶液の容量は、捕集具全体を浸漬させた状態で圧力サイクル処理等が実行可能な容量 であればよい。
【００１９】
本発明及び本願明細書において、抽出用溶液は、微生物溶解酵素が添加されて適切な温度に調整されることにより、微生物溶解酵素反応が行われる際の反応用溶媒となり、微生物溶解酵素反応によって捕集具中の微生物から核酸が抽出される溶液である。抽出用溶液としては、各種緩衝液や水等を用いることができる。抽出用溶液として用いられる緩衝液としては、微生物溶解酵素による酵素反応に適当なｐＨ等を有していればよく、用いる微生物溶解酵素の種類等を考慮して、生体試料の希釈等に一般的に用いられるバッファーの中から適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、リン酸バッファー、トリスバッファー、クエン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＨＵＮＫＳバッファー等が挙げられる。
【００２０】
抽出用溶液には、微生物溶解酵素反応を阻害しない限り、任意成分を添加してもよい。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤や、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート等を添加することもできる。抽出用溶液に添加される任意成分等の濃度は、微生物溶解酵素反応を阻害しない濃度であれば、特に限定されるものではなく、任意成分の種類、抽出用溶液の種類、微生物溶解酵素の種類等を考慮して適宜決定することができる。
【００２１】
圧力サイクル処理とは、捕集具を浸漬させた抽出用溶液の圧力を上昇させる加圧工程と、当該抽出用溶液の圧力を低下させる減圧工程とを、少なくとも１回ずつ繰り返す処理を意味する。例えば、１サイクルは、加圧工程と減圧工程とを１回ずつ含む。具体的には、初期圧力から圧力を上昇させる加圧工程と、その後初期圧力付近まで圧力を低下させる減圧工程とを１サイクルとしてもよい。その他、１サイクルには、２回以上の加圧工程、又は２回以上の減圧工程を含んでいてもよい。例えば、初期圧力から圧力を上昇させる加圧工程の後、次いでさらに圧力を上昇させる加圧工程を行い、その後初期圧力付近まで圧力を低下させる減圧工程を、１サイクルとしてもよい。
【００２２】
圧力サイクル処理においては、圧力サイクルを１サイクルのみ行ってもよく、２サイクル以上繰り返してもよい。本発明においては、圧力サイクルを２〜９９回繰り返すことが好ましく、２〜２０回繰り返すことがより好ましく、５〜２０回繰り返すことがさらに好ましく、５〜１０回繰り返すことがよりさらに好ましい。
【００２３】
圧力サイクル処理において、加圧工程終了時点における抽出用溶液の圧力（すなわち、一サイクルにおける抽出用溶液の最大圧力）は、抽出用溶液中に浸漬している捕集具全体に抽出用溶液が十分に浸透し得る圧力であれば特に限定されるものではなく、捕集具の構造（繊維状物質同士により形成される孔の孔径、柔軟性等）や繊維状物質の種類、抽出用溶液の種類や粘度等を考慮して、適宜調整することができる。例えば、加圧工程終了時点における抽出用溶液の圧力は、１〜５０ｋｐｓｉ（６．８９５〜３４４．７５ＭＰａ）の範囲内であることが好ましく、１０〜３５ｋｐｓｉ（６８．９５〜２４１．３２５ＭＰａ）の範囲内であることがより好ましい。
【００２４】
圧力サイクル処理においては、加圧工程終了後、直ちに減圧工程を開始してもよいが、加圧工程終了後減圧工程開始前に、加圧工程終了時点における抽出用溶液の圧力を所定時間保持していてもよい。加圧工程終了後減圧工程開始前に圧力保持する場合、圧力保持時間は、１〜６０秒間であることが好ましく、２〜１０秒間であることがより好ましい。
【００２５】
圧力サイクル処理は、液体を加圧・減圧処理するために通常用いられている圧力調整機を用いて行うことができる。当該圧力調整機として、例えばフレンチプレス、バロサイクラー等が挙げられる。また、圧力調整機は、加熱装置や冷却装置等の温度調整機を備えるものであってもよい。
【００２６】
超音波処理は、捕集具を浸漬させた抽出用溶液に、２０ｋＨｚ以上の超音波を照射する処理を意味する。超音波の照射は、超音波を発するチップを直接抽出用溶液に挿入して行う接触方式であってもよく、抽出用溶液が収容された容器を、超音波が照射されている水浴中に設置し、抽出用溶液が収容された容器の外側から超音波を照射する非接触方式で行ってもよい。また、超音波照射は、連続して１回のみ行ってもよく、所定時間の照射を２回以上、不連続に行ってもよい。
【００２７】
照射する超音波の波長、出力、照射時間は、抽出用溶液中に浸漬している捕集具全体に抽出用溶液を十分に浸透させ得る圧力であれば特に限定されるものではなく、超音波の照射方式、捕集具の構造（繊維状物質同士により形成される孔の孔径、柔軟性等）や繊維状物質の種類、抽出用溶液の種類や粘度等を考慮して、適宜調整することができる。
【００２８】
核酸は比較的高温環境下であっても分解等の影響を受け難い。このため、圧力サイクル処理時又は超音波処理時における抽出用溶液の温度は、抽出用溶液の沸点以下であれば特に限定されるものでない。
【００２９】
前記工程（ｂ）の後、工程（ｃ）として、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う。具体的には、微生物溶解酵素を含む抽出用溶液中に捕集具を浸漬させた状態で、所定時間インキュベートする。微生物溶解酵素は、前記工程（ｂ）の後、捕集具を含む抽出用溶液に添加してもよい。また、前記工程（ｂ）の前に、捕集具を浸漬させた抽出用溶液に微生物溶解酵素を添加してもよく、微生物溶解酵素を含む抽出用溶液に捕集具を浸漬させてもよい。
【００３０】
微生物溶解酵素は、微生物を溶かす活性を有する酵素である。使用される微生物溶解酵素は、微生物や培養真核細胞等から核酸を抽出する際に用いられる公知の酵素の中から、核酸を回収する対象とする微生物種によって適宜選択される。例えば、微生物が細菌の場合には、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、プロテイナーゼＫ等が微生物溶解酵素として挙げられる。微生物が酵母の場合には、β−１，３−グルカナーゼ活性を有するザイモリエイス、キタラーゼ、ツニカーゼ等が挙げられる。抽出用溶液に添加される微生物溶解酵素は、１種類のみであってもよく、複数種類を適宜組み合わせてもよい。
【００３１】
微生物溶解酵素反応の反応温度は、使用する微生物溶解酵素が酵素活性を示す温度とする。また、微生物溶解酵素反応の反応時間は、抽出用溶液中の微生物の細胞膜等を溶解させ、細胞内部に存在する核酸を細胞外へ抽出するために充分な時間であればよく、使用する微生物溶解酵素の種類や濃度等を考慮して、適宜調整することができる。
【００３２】
反応の至適温度が異なる複数種類の微生物溶解酵素を用いる場合、各微生物溶解酵素に適した温度で順次インキュベートする。反応の至適温度のみならず、反応溶液の塩濃度、ｐＨ等の条件が異なる複数種類の微生物溶解酵素を用いる場合、２回目の酵素反応を行う前に、反応溶液の組成を当該酵素の反応に適するように調整するために、適当な組成・量の緩衝液を添加してもよい。例えば、至適温度が３７℃である微生物溶解酵素と至適温度が５０℃である微生物溶解酵素とを用いる場合、工程（ｃ）として、まず、両酵素を含む抽出用溶液を、３７℃で所定時間インキュベートした後、反応溶液の組成等を調整するために適宜緩衝液を添加した後、５０℃で所定時間インキュベートする。この場合、３７℃におけるインキュベート終了後、５０℃におけるインキュベート前に、圧力サイクル処理又は超音波処理を行ってもよい。圧力サイクル処理又は超音波処理は、工程（ｂ）と同様にして行うことができる。
【００３３】
工程（ｃ）の後、工程（ｄ）として、抽出用溶液中の捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う。圧力サイクル処理又は超音波処理は、工程（ｂ）と同様にして行うことができる。微生物溶解酵素反応後に圧力サイクル処理等を行うことにより、抽出用溶液中に抽出された微生物由来の核酸を、捕集具、特に繊維状物質にからめとられることを防止し、工程（ｅ）において抽出用溶液からの核酸回収効率が改善される。
【００３４】
工程（ｂ）及び（ｄ）において、いずれも圧力サイクル処理を行ってもよく、いずれも超音波処理を行ってもよい。また、工程（ｂ）及び（ｄ）のいずれか一方を圧力サイクル処理とし、他方を超音波処理としてもよい。本発明においては、工程（ｂ）及び（ｄ）のいずれも圧力サイクル処理を行うことが好ましい。
【００３５】
前記工程（ｂ）の前に抽出用溶液に微生物溶解酵素を添加し、かつ工程（ｂ）及び（ｄ）における圧力サイクル処理等を当該微生物溶解酵素が酵素活性を示す温度で行う場合には、工程（ｂ）〜（ｄ）を一の工程で行うことができる。
【００３６】
その後、工程（ｅ）として、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する。回収方法は、捕集具が浸漬された抽出用溶液から、固形の捕集具と液体成分とを分離することが可能な方法であればよく、一般的に行われる固液分離の手法の中から適宜選択して用いることができる。固液分離法としては、具体的には、遠心分離処理、真空ポンプによるバキューム処理等が挙げられる。例えば、抽出用溶液を遠心分離処理することによって、捕集具を沈殿させ、上清を回収する。その他、工程（ｄ）の後、液体成分をピペット等で回収した後、残りを遠心分離処理して上清を回収してもよい。先に回収された液体成分と遠心分離処理後に回収された上清とを合わせて、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液とする。
【００３７】
工程（ｂ）〜（ｄ）において抽出用溶液中に抽出された核酸は、工程（ｅ）における固液分離によって、抽出用溶液に溶解された状態で回収される。抽出された核酸が固液分離時に捕集具、特に繊維状物質にからめとられると、核酸の回収効率が低下する。予めキャリア核酸を抽出用溶液に含有させることにより、工程（ｅ）において、より核酸含有量の高い抽出用溶液を回収することができる。
【００３８】
キャリア核酸は、核酸であればよく、具体的には、λＤＮＡ、ｔＲＮＡ、精子ＤＮＡ等が挙げられる。また、キャリア核酸は、工程（ｄ）の後工程（ｅ）の前に、捕集具が浸漬された抽出用溶液に添加してもよく、工程（ｃ）において微生物溶解酵素と共に抽出用溶液に添加してもよく、工程（ｂ）において、予めキャリア核酸を含有する抽出用溶液に捕集具を浸漬させてもよい。
【００３９】
工程（ｅ）において回収された抽出用溶液には、捕集具に捕集された微生物から抽出された核酸が溶解している。よって、一般的な核酸回収・精製方法によって、回収された抽出用溶液から核酸を回収し精製することができる。核酸回収・精製方法としては、アルコール沈殿法やシリカゲルカラム吸着法、塩化セシウム超遠心法等が挙げられる。その他、市販のＤＮＡ精製キットを用いてもよい。
【００４０】
核酸を回収・精製する前に、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液に対して、クロロホルム抽出処理等の除タンパク質処理を行ってもよい。除タンパク質処理は１回行ってもよく、２回以上繰り返して行ってもよい。
【００４１】
本発明においては、シリカメンブレンを材質（充填材）とするスピンカラムを用いることにより、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液から核酸を精製することが好ましい。抽出用溶液中の核酸が極微量である場合、フェノール・クロロホルム抽出やアルコール沈殿によって核酸回収率が低下する場合がある。シリカメンブレンを材質とするスピンカラムを用いた場合には、脱塩（アルコール沈殿）の必要が無く、溶媒抽出の必要も無いため、比較的損失の少ない精製濃縮が可能となる。
【００４２】
回収又は精製された微生物由来の核酸は、他の手法により精製された核酸と同様に、各種核酸解析法に用いることができる。当該核酸解析法としては、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅方法、ＤＮＡチップ法、ＤＧＧＥ法、メタゲノム等の遺伝子解析方法等が挙げられる。その他、工程（ｅ）において回収された抽出用溶液は、他の手法により得られた核酸抽出液と同様に、各種核酸解析法にそのまま用いることもできる。
【００４３】
本発明の微生物の核酸回収方法により、繊維状物質中に存在する微量な微生物から核酸を高効率に抽出・回収することが可能になる。特に、ビール、水等の液体、炭酸ガス等の気体、設備等の固体表面等に存在する微量の微生物から核酸を回収し、高感度な遺伝子解析を行うことが可能になる。
【実施例】
【００４４】
次に参考例及び実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の参考例及び実施例に限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］
本発明の微生物の核酸回収方法において、圧力サイクル処理におけるサイクル数の核酸回収効率に対する影響を調べた。
まず、１０２ＣＦＵのビール有害乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）を含む液体をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。このＰＶＤＦメンブレンフィルターを折り畳んで、耐圧力チューブ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製、 製品名：ＦＴ５００−ＮＤ ＰＵＬＳＥ Ｔｕｂｅ、製品番号：♯ＦＴ００５００−ＮＤ）に投入した。続いて当該耐圧チューブに、１０μＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのＮ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）、１０μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)、及び１０μＬのλ−ＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ社製、製品番号：＃Ａ３４７７Ｌ）を含んだＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターを浸漬させた。その後Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して、圧力サイクル処理を行った。圧力サイクル条件は、３５ｋｐｓｉを１０秒間し、その後常圧を１０秒間する操作を１サイクルとし、１０サイクル又は９９サイクル実施した。
次いで、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。その後、再度当該耐圧チューブ内の溶液に対して前記と同じ圧力サイクル条件による圧力サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した。さらに、当該耐圧チューブに残留している内容物を１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理することにより、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターに含まれていた溶液を回収し、先のチューブに移した溶液と合体させた。こうして得られた溶液中には、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸が溶解していた。
【００４６】
回収された溶液に、当該溶液の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液をシリカメンブレンのスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品名：ＱＩＡａｍｐ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。その後、当該カラムをＡＷ１溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製）で洗浄した後、５０μＬのＡＷ２溶液（ＱＩＡＧＥＮ社製）で当該カラムからＤＮＡを溶出させた。
得られたＤＮＡをＰＣＲ法で検査した。ＰＣＲの反応条件は、Ａｓａｎｏらの方法(J. Am. Soc. Brew. Chem. 66(1):37-42, 2008) に従った。具体的には、フォワードプライマーとして5’-CTGATTTCAACAATGAAGC-3’の配列（配列番号１）を有するプライマーを、リバースプライマーとして5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’の配列（配列番号２）を有するプライマーを、それぞれ使用した。ＰＣＲ試薬（酵素、緩衝液）は、ＰｅｒｆｅｃｔＳｈｏｔ Ｅｘ Ｔａｑ(Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製)を用い、サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ(ｍｏｄｅｌ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。反応条件は、９４℃で２．５分間保持した後、９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間からなるサイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で３分間保持した。増幅産物の確認は、２％(ｖ／ｗ)アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)で染色し、ＵＶトランスイルミネーターでバンドを確認した。
【００４７】
この結果、ＰＣＲ産物量は、圧力サイクル数を１０回とした検体と９９回とした検体とで、同程度であった。当該結果は、両検体において、ＰＶＤＦメンブレンフィルターから回収されたＬ．ｂｒｅｖｉｓ由来の核酸はほぼ同程度であったことを示唆する。つまり、圧力サイクル処理において、サイクル数は９９回も実施する必要が無く、１０回程度で充分であるといえる。
【００４８】
［実施例２］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｅ）における抽出用溶液の回収の方法の核酸回収効率に対する影響を調べた。
具体的には、１０１、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。このＰＶＤＦメンブレンフィルターに対して、圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回とした以外は実施例１と同様にして圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回として圧力サイクル処理を行った。その後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した溶液と、当該耐圧チューブに残留している内容物を１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理することにより回収した当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターに含まれていた溶液と合体させた。得られた溶液を検体（遠心分離処理有り）とした。
一方で、１０１、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓを捕集したＰＶＤＦメンブレンフィルターに対して、圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回とした以外は実施例１と同様にして圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件におけるサイクル数を１０回として圧力サイクル処理を行った。その後、当該耐圧チューブ内の溶液を、特段の遠心分離処理等を行うことなく別のチューブに回収し、これを検体（遠心分離処理無し）とした。
【００４９】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体（遠心分離処理無し）では、１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０３ＣＦＵ以下のＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。これに対して、検体（遠心分離処理有り）では、１０３ＣＦＵ及び１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０２ＣＦＵ以下のＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。つまり、検体（遠心分離処理無し）と検体（遠心分離処理有り）とでは、核酸回収効率に、菌数レベルで１オーダー程度（１０倍）の差が観察された。これらの結果から、工程（ｅ）における抽出用溶液の回収を、遠心分離処理等により捕集具に含まれている抽出用溶液を充分に回収することによって、核酸回収効率が改善されることが明らかである。
【００５０】
［実施例３］
微生物を捕集した捕集具を、予め微生物溶解酵素を含有させた抽出用溶液に浸漬させた後、圧力サイクル処理を行うことによって、本発明の微生物の核酸回収方法により、微生物由来の核酸を回収した。
まず、１００、１０１、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬを、ポアサイズ０．４５μｍのセルロースメンブレンにより吸引濾過し、当該セルロースメンブレンにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。当該セルロースメンブレンをＰＢＳ１００ｍＬで洗浄した後、折り畳んで、耐圧力チューブ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製、 製品名：ＦＴ５００−ＮＤ ＰＵＬＳＥ Ｔｕｂｅ、製品番号：♯ＦＴ００５００−ＮＤ）に投入した。続いて当該耐圧チューブに、１０μＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのＮ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）、１０μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)、及び１０μＬのλ−ＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ社製、製品番号：＃Ａ３４７７Ｌ）を含んだＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該セルロースメンブレンを浸漬させた。その後Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して、圧力サイクル処理を行った。圧力サイクル条件は、３５ｋｐｓｉを１０秒間し、その後常圧を１０秒間する操作を１サイクルとし、１０サイクル実施した（圧力サイクル条件Ａ）。
その後、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。その後、再度当該耐圧チューブ内の溶液に対して圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した。さらに、当該耐圧チューブに残留している内容物を１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理することにより、当該セルロースメンブレンに含まれていた溶液を回収し、先のチューブに移した溶液と合体させた。こうして得られた溶液中には、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸が溶解していた。
【００５１】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。
ＰＣＲ産物の確認結果を表１に示す。この結果、ビールに添加したＬ．ｂｒｅｖｉｓの量依存的に、ＰＣＲ産物の量が多くなることが確認された。また、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓが３００ｍＬ当たり１００ＣＦＵと非常に微量にしか含まれていなかったビールからもＰＣＲ産物が確認されたことから、本発明の微生物の核酸回収方法により、極微量の微生物から効率よく核酸を回収し得ることがわかった。
【００５２】
【表１】
【００５３】
［実施例４］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｂ）及び工程（ｄ）において、圧力サイクル処理を行った場合と超音波処理を行った場合の核酸回収効率を調べた。
具体的には、実施例３と同様にして、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬからセルロースメンブレンを用いてＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した後、当該セルロースメンブレンに対して圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体（圧力サイクル処理）とした。
一方で、圧力サイクル条件Ａによる圧力サイクル処理に代えて、超音波処理を行った以外は、上記検体（圧力サイクル処理）の調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体（超音波処理）とした。超音波処理には、ブランソン超音波洗浄器１５１０Ｊ−ＭＴＨ（発信周波数：４２ｋＨｚ、出力：９０Ｗ）を用い、３分間実施した。
【００５４】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体（圧力サイクル処理）及び検体（超音波処理）のいずれにおいても、１０２〜１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡで、ＰＣＲ産物が検出された。これらの結果から、工程（ｂ）及び工程（ｄ）において、圧力サイクル処理を行った場合と超音波処理を行った場合とで、核酸回収効率に特段の差異はなく、いずれも効率よく核酸を回収し得ることが確認された。
【００５５】
［実施例５］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｄ）の有無の核酸回収効率に対する影響を調べた。
まず、１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液をＰＶＤＦメンブレンフィルターで濾過し、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。実施例１と同様にして、当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターを折り畳んで耐圧力チューブに投入し、当該耐圧チューブに、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ、及びλ−ＤＮＡを含むＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕を添加して当該ＰＶＤＦメンブレンフィルターを浸漬させた後、サイクル数を１０回として圧力サイクル処理を行った。
次いで、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該溶液耐圧チューブに実施例１で用いたＢ２緩衝液１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。
その後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収し、これを検体Ａとした。
さらに、当該耐圧チューブに残留している内容物（ＰＶＤＦメンブレンフィルター）に対してＢ１緩衝液４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該内容物を浸漬させた後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して、前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収し、これを検体Ｂとした。
【００５６】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。得られたＰＣＲ産物の濃度を測定したところ、検体Ａ由来のＰＣＲ産物は５．６７ｎｇ／μＬであり、検体Ｂ由来のＰＣＲ産物は２．０３ｎｇ／μＬであった。つまり、酵素反応後に圧力サイクル処理等を行わずに抽出用溶液を回収した場合には、当該抽出用溶液に抽出された核酸の約３０％程度が捕集具とともに残留してしまっていた。これらの結果から、酵素反応後に圧力サイクル処理等を行うことにより、圧力サイクル処理等を行わない場合よりもより多量の核酸を回収し得ることが確認された。これは、酵素反応後に圧力サイクル処理等を行うことにより、捕集具にからめとられていた核酸が捕集具から遊離するためと推察される。
【００５７】
［実施例６］
本発明の微生物の核酸回収方法において、工程（ｂ）の有無の核酸回収効率に対する影響を調べた。
まず、実施例３と同様にして、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬからセルロースメンブレンを用いてＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した後、当該セルロースメンブレンに対して圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体Ａとした。
【００５８】
一方で、工程（ｂ）を行わない方法は、以下のようにして行った。まず、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬを、ポアサイズ０．４５μｍのセルロースメンブレンにより吸引濾過し、当該セルロースメンブレンにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。当該セルロースメンブレンをＰＢＳ１００ｍＬで洗浄した後、折り畳んで、実施例３と同様の耐圧力チューブに投入した。続いて当該耐圧チューブに、１０μＬのＬｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのＮ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）、１０μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）、及び１０μＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)を含んだＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該セルロースメンブレンを浸漬させた。当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加し、さらに当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。その後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して、実施例３と同様にして圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体Ｂとした。
【００５９】
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理に代えて超音波処理を行った以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂとした。超音波処理には、ブランソン超音波洗浄器１５１０Ｊ−ＭＴＨ（発信周波数：４２ｋＨｚ、出力：９０Ｗ）を用い、３分間実施した。
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行わなかった以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂ’とした。
【００６０】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体Ａでは、１０２〜１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡで、ＰＣＲ産物が検出された。これに対して、検体Ｂ、検体ｂ、及び検体ｂ’では、１０３ＣＦＵ及び１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０２ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。つまり、本発明の微生物の回収方法により調製された検体Ａと、工程（ｂ）を行わなかった方法により調製された検体Ｂ、検体ｂ、又は検体ｂ’とでは、核酸回収効率に、菌数レベルで１オーダー（１０倍）以上の差が観察された。これらの結果から、微生物溶解酵素反応の前に圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことにより、核酸回収効率を飛躍的に改善し得ることが明らかである。
【００６１】
［実施例７］
捕集具から微生物を分離回収せずに微生物溶解酵素反応により核酸を抽出する本発明の微生物の核酸回収方法と、捕集具から微生物を分離回収した後に核酸を抽出・回収する方法との核酸回収効率を比較した。
まず、実施例３と同様にして、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬからセルロースメンブレンを用いてＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した後、当該セルロースメンブレンに対して圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、酵素反応処理を行い、さらに圧力サイクル条件Ａで圧力サイクル処理を行った後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。得られた溶液を検体Ａとした。
【００６２】
一方で、捕集具から微生物を分離回収した後に核酸を抽出・回収する方法は、以下のようにして行った。まず、１０２、１０３、又は１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを予め添加したビール３００ｍＬを、ポアサイズ０．４５μｍのセルロースメンブレンにより吸引濾過し、当該セルロースメンブレンにＬ．ｂｒｅｖｉｓを捕集した。当該セルロースメンブレンをＰＢＳ１００ｍＬで洗浄した後、折り畳んで、実施例３と同様の耐圧力チューブに投入した。続いて当該耐圧チューブにＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕４００μＬを添加し、当該Ｂ１緩衝液中に当該セルロースメンブレンを浸漬させた後、当該耐圧チューブ内の溶液に対して、実施例３と同様にして圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った。その後、遠心分離処理により、当該耐圧チューブ内の溶液を回収した。
回収された溶液に、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１００ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ（ＱＩＡＧＥＮ社製、製品番号：＃１９１３３）を１０μＬ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ(生化学バイオビジネス社製、製品番号：＃１２０４９１−１)を１０μＬ、それぞれ添加した後、当該耐圧チューブ内の溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、当該溶液耐圧チューブにＢ２緩衝液〔３Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ〕１６０μＬを添加し、さらに当該耐圧チューブ内の溶液を５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベート後の溶液を回収し、これを検体Ｂとした。
【００６３】
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理に代えて超音波処理を行った以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂとした。超音波処理には、ブランソン超音波洗浄器１５１０Ｊ−ＭＴＨ（発信周波数：４２ｋＨｚ、出力：９０Ｗ）を用い、３分間実施した。
また、圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行わなかった以外は、上記検体Ｂの調製と同様にして、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓから抽出された核酸を含む溶液を回収し、これを検体ｂ’とした。
【００６４】
回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。この結果、検体Ａでは、１０２〜１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡで、ＰＣＲ産物が検出された。これに対して、検体Ｂ、検体ｂ、及び検体ｂ’では、１０３ＣＦＵ及び１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物が検出されたが、１０２ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む溶液から回収されたＤＮＡではＰＣＲ産物は検出されなかった。つまり、本発明の微生物の回収方法により調製された検体Ａと、捕集具から微生物を分離回収した後に核酸を抽出・回収する方法により調製された検体Ｂ、検体ｂ、又は検体ｂ’とでは、核酸回収効率に、菌数レベルで１オーダー（１０倍）以上の差が観察された。
【００６５】
［実施例８］
工程（a）における捕集具をスワブとして本発明の微生物の核酸回収方法を行い、核酸回収効率を調べた。
１０２、１０３、１０４ＣＦＵのＬ．ｂｒｅｖｉｓを含む１００μＬのＰＢＳを、ふき取り環境検査用スワブ（商品名：ふきふきチェックII、栄研科学株式会社製）を用いてそれぞれサンプリングした。シャフトから切り離したスワブを、実施例１と同様の耐圧力チューブに投入した。続いて当該耐圧チューブに、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ、及びλ−ＤＮＡを含むＢ１緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕を添加して当該スワブを浸漬させた後、サイクル数を１０回として実施例３と同様にして圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った。
次いで、当該耐圧チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、当該耐圧チューブに実施例１で用いたＢ２緩衝液１６０μＬを添加した後、当該耐圧チューブに対して前記と同じ圧力サイクル条件による高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブを５０℃で６０分間インキュベートした。その後、再度当該耐圧チューブ内の溶液に対して圧力サイクル条件Ａによる高圧サイクル処理を行った後、当該耐圧チューブ内の溶液を別のチューブに回収した。
その後、回収された各検体に、当該検体の半分量（容量比）のエタノールを添加し、得られた混合液から実施例１と同様にしてＤＮＡを溶出させた後、ＰＣＲ法で検査した。その結果、各検体から回収されたＤＮＡ溶液からＬ．ｂｒｅｖｉｓ由来のＰＣＲ産物が検出された。すなわち、本発明の微生物の核酸回収方法は、捕集具をスワブとした場合でも高い核酸回収効率を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の微生物の回収方法により、効率よく微生物由来の核酸を回収することができる。そして、当該方法により精製されたＤＮＡは、ＰＣＲ等の核酸解析により、微生物の定性又は定量検出に供することができる。このため、本発明の微生物の回収方法は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な液状の商品の製造分野、特に品質管理等において利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の核酸回収方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行い、
前記工程（ｄ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行うことを特徴とする請求項１に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項３】
前記圧力サイクル処理における圧力の範囲が１〜５０ｋｐｓｉであることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項４】
前記圧力サイクル処理におけるサイクル数が２〜９９回であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項５】
前記圧力サイクル処理における各サイクルの圧力保持時間が１〜６０秒間であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項６】
前記抽出用溶液が、キャリア核酸を含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項７】
さらに、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された抽出用溶液から核酸を回収する工程と、
を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項１】
（ａ）微生物を、繊維状物質からなる捕集具に捕集する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、抽出用溶液中で、微生物が捕集された前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記捕集具を含む前記抽出用溶液中において、微生物溶解酵素反応を行う工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記抽出用溶液中の前記捕集具に対して、圧力サイクル処理又は超音波処理を行う工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）の後、微生物由来の核酸が抽出された抽出用溶液を回収する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の核酸回収方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行い、
前記工程（ｄ）において、前記捕集具に対して圧力サイクル処理を行うことを特徴とする請求項１に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項３】
前記圧力サイクル処理における圧力の範囲が１〜５０ｋｐｓｉであることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項４】
前記圧力サイクル処理におけるサイクル数が２〜９９回であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項５】
前記圧力サイクル処理における各サイクルの圧力保持時間が１〜６０秒間であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項６】
前記抽出用溶液が、キャリア核酸を含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【請求項７】
さらに、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後、回収された抽出用溶液から核酸を回収する工程と、
を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物の核酸回収方法。
【公開番号】特開２０１３−４２６７０（Ｐ２０１３−４２６７０Ａ）
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８０３７９（Ｐ２０１１−１８０３７９）
【出願日】平成２３年８月２２日（２０１１．８．２２）
【出願人】（３１１００７２０２）アサヒビール株式会社 (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２２日（２０１１．８．２２）
【出願人】（３１１００７２０２）アサヒビール株式会社 (36)
【Ｆターム（参考）】
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