説明

微生物の濃縮精製装置及び濃縮精製方法

【課題】 免疫学的手法によらずに、微生物の生化学的性質に基づき、環境中の特定微生物をターゲットとした選択的な濃縮、精製を簡単に行うこと。
【解決手段】 イオン交換能を有する物質からなる担体11と、この担体11が収容されるカラム13と、緩衝液のpHを経時的に上げながら緩衝液をカラム13に供給する緩衝液供給手段15と、カラム13から排出された緩衝液を経時的に所定量ずつ回収する緩衝液回収手段18とを備えて濃縮精製装置10が構成されている。この装置10は、緩衝液のpHの変化に伴う微生物の表面電荷の変化の状態が、微生物の種類によって相違する点を利用し、緩衝液のpHを経時的に変えることで、担体11に付着してから脱落する微生物の種類を時間毎に変えて当該微生物を回収することで、微生物の濃縮精製が行われる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、より多くの種類の微生物に対する濃縮、精製に有用となる微生物の濃縮精製装置及び濃縮精製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
自然環境中には、多種多様な微生物が存在しているが、これら微生物は、複合微生物系を形成しており、この複合微生物系から、より多くの微生物を分離培養することで、有用な微生物の発掘や未利用遺伝子資源としての活用等が可能となる。
【0003】
従来における微生物の培養方法としては、例えば、特許文献1等で紹介されている平板培養法がある。この平板培養法は、対象微生物が含まれたサンプルを希釈することにより、対象微生物の所定単位当たりの細胞数を少なくした上で、当該希釈後のサンプルを容器内の寒天培地に載せ、所定期間に亘って対象微生物を培養し、増殖させる方法である。
【0004】
しかしながら、この平板培養法では、いわゆる難培養性微生物が多く存在し、環境中の99パーセント以上の微生物の分離培養を行うことは困難である。このような難培養性微生物の分離培養を試みる場合には、前記平板培養法などを用い、多くのトライアル数を重ねる必要がある。従って、当然のことながら、サンプル中に存在するターゲットとなる微生物の割合(濃度)を短時間に上昇させることができれば、ターゲットとなる微生物を獲得する効率は飛躍的に向上することが確実である。また、前記平板培養法により対象微生物を分離培養することに一見成功しても、実は僅かに存在する共存微生物を除去しきれていない場合がある。従って、環境中からターゲットとなる微生物を分離培養する操作の前又は後で特異的に濃縮精製することは有効である。
【0005】
ところで、ターゲットとなる細胞を選択的に濃縮精製する手法として、特許文献2に記載されている手法がある。この特許文献2では、蛍光抗体標識細胞分離法(FACS)、免疫吸着分離法、免疫磁気分離法、遠心分離法が従来技術として紹介されている他、特許文献2の発明に係る特異的リガンドを用いた吸着分離法が開示されている。
【特許文献1】特開平6−277095号公報
【特許文献2】特開平6−269499号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、特許文献2に開示されている各手法は、体液又は血液などの細胞混合液からターゲット細胞を分離する目的で用いられており、従来、分離培養ができなかった微生物の濃縮精製に用いることはできない。すなわち、自然環境中には、多種多様な微生物(細菌・古細菌など)が存在しているが、前述したように、そのうち99%以上の微生物は、従来、分離培養できていないことから、未知の微生物が数多くあり、当該微生物の性状が殆ど不明である。従って、前記FACS、前記免疫吸着分離法、前記免疫磁気分離法等の免疫学的手法では、分離目的細胞に特異的に結合する抗体を用いる必要があるが、当該抗体を作成するためには純粋な培養株が必要であり、環境中の未知・未培養の微生物に対しては、当該培養株を得られず、これら手法を利用することができない。また、前記遠心分離法にあっては、細胞の密度や比重の違いで細胞を分離するが、物理的な差の小さい微生物では有用な濃縮精製手法とならない。更に、前記特異的リガンドを用いた吸着分離法にあっては、目的細胞を認識する抗体にヌクレオチドを結合させる必要があるが、環境中の未知・未培養の微生物に対しては、その性状が未知である故に、前記抗体を見つけることが難しく、この手法の利用も実用的でない。
【0007】
そこで、本発明者らは、環境中の未知・未培養の微生物に対しても、微生物細胞表面の生化学的、物理化学的な性質に基づいて濃縮、精製できるように、鋭意、実験研究を行った結果、微生物の表面電荷は、当該微生物を含む溶液のpHに応じて変化し、当該変化の度合いが微生物の種類によって異なるという事象を知見した。この事象は、微生物の生化学的性質によるものであり、未知の微生物についても、当然に、同様の事象が発生するものと考えられる。
【0008】
本発明は、このような発明者の知見に基づいて創出されたものであり、その目的は、免疫学的手法によらずに、微生物細胞表面の生化学的、物理化学的な性質に基づき、環境中の特定微生物をターゲットとした選択的な濃縮、精製を簡単に行うことができる微生物の濃縮精製装置及び濃縮精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
(1)前記目的を達成するため、本発明の濃縮精製装置は、複数の微生物を含む微生物含有溶液が通過する流路と、当該流路に配置された担体と、前記微生物含有溶液が前記流路を通過した後で、前記流路に所定の緩衝液を供給する緩衝液供給手段と、前記流路を通過した前記緩衝液を回収する緩衝液回収手段とを備え、
前記担体は、表面が正又は負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のpHを経時的に変化させながら当該緩衝液を供給可能に設けられ、
前記緩衝液回収手段は、前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収可能に設けられる、という構成を採っている。
【0010】
(2)ここで、前記担体は、中性付近で表面が負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のpHを経時的に上げながら当該緩衝液を供給可能に設けられる、という構成を採ることが好ましい。
【0011】
(3)また、本発明の濃縮精製方法は、表面が正又は負に帯電する担体が配置された流路に、複数の微生物が含まれる微生物含有溶液を通した後で、経時的にpHが変化する緩衝液を前記流路に供給し、当該流路から排出された前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収する、という手法を採っている。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、緩衝液のpHの変化に伴う微生物の表面電荷の変化の状態が、微生物の種類によって相違する点を利用し、緩衝液のpHを経時的に変えることで、担体に付着してから脱落する微生物の種類を時間毎に変えながら当該微生物を回収することにより、ターゲットとなる微生物の濃縮、精製が可能になる。従って、免疫学的手法によらずに、微生物細胞表面の生化学的、物理化学的性質に基づき、環境中の特定微生物をターゲットとした選択的な濃縮、精製を簡単に行うことができ、従来の未知・未培養の微生物のうち、新たに分離培養可能となる微生物の発現が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0013】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
【0014】
図1には、本実施形態に係る濃縮精製装置の概略構成図が示されている。この図において、濃縮精製装置10は、イオン交換能を有する物質からなる担体11と、この担体11が収容されるカラム13と、カラム13内に緩衝液(バッファー)を供給する緩衝液供給手段15と、カラム13内から排出された緩衝液を回収する緩衝液回収手段18とを備えている。
【0015】
前記担体11は、正又は負に帯電する物質、或いは、陰イオン交換体又は陽イオン交換体を持つ物質であれば何でも良い。本実施形態では、中性付近で負に帯電するガラスビーズが用いられている。なお、当該ガラスビーズの直径は、微生物の数十倍の大きさとなる50〜150μm程度となっている。その他、担体11としては、ガラスウール、セラミックス類等を例示できる。
【0016】
前記カラム13は、上下両側が開放する筒状をなしており、その内部空間Sに担体11が充填されている。カラム13の上端側は、複数の微生物を含む微生物含有溶液と緩衝液供給手段15からの緩衝液とを内部空間Sに注入するための液注入口13Aとなっている。一方、カラム13の下端側は、前記微生物含有溶液及び緩衝液が緩衝液回収手段18に排出される液排出口13Bとなっている。これにより、前記微生物含有溶液及び緩衝液は、液注入口13Aから内部空間Sに流入し、各担体11間の隙間を抜けて液排出口13Bからカラム13の外側に流出することになるため、内部空間Sは、前記微生物含有溶液及び緩衝液の流路となる。なお、内部空間Sにおける液排出口13B側には、カラム13の外側への担体11の流出防止用のフィルタFが設けられている。
【0017】
前記緩衝液供給手段15は、緩衝液のpHを経時的に上げながら緩衝液をカラム13に供給するようになっている。ここで、本実施形態の緩衝液としては、クエン酸バッファー、すなわち、クエン酸溶液と、当該クエン酸溶液よりもpHの大きい重リン酸ナトリウム(NaHPO)溶液との混合溶液が用いられる。なお、本発明において適用可能な緩衝液としては、前記クエン酸バッファーに限定されず、微生物に対する毒性のないものであれば何でも良い。
【0018】
この緩衝液供給手段15は、所定濃度のクエン酸溶液が収容された第1の液槽20と、所定濃度の重リン酸ナトリウム溶液が収容された第2の液槽21と、これら第1及び第2の液槽20,21内の各溶液を所定割合で混合してカラム13に連続的に供給するグラジエントポンプ24とを備えている。このグラジェントポンプ24は、第1の液槽20からのクエン酸溶液の抽出量を経時的に一定割合で減少させながら、第2の液槽21からの重リン酸ナトリウム溶液の抽出量を経時的に一定割合で増大させるようになっている。従って、カラム13に供給される緩衝液は、pHが時間に対して比例的(直線的)に上がるように変化する。なお、緩衝液のpHの上昇は、所定時間単位で段階的に行っても良い。
【0019】
前記緩衝液回収手段18は、カラム13から排出された緩衝液を経時的に所定量ずつ回収する回収装置27と、カラム13から回収装置27に緩衝液を送り込むポンプ28とを備えて構成されている。前記回収装置27は、図示しない試験管に緩衝液を経時的に所定量ずつ分画する公知のフラクションコレクターである。
【0020】
以上の構成の濃縮精製装置10により、次の手順で微生物の濃縮或いは精製が行われる。
【0021】
先ず、複数の微生物を含む微生物含有溶液をカラム13の液注入口13Aから注入する。この際の微生物含有溶液としては、培養溶液、海水、湖水等を例示でき、当該微生物含有溶液のpHは、緩衝液の最低pHよりも小さく設定されており、本実施形態では、pH3程度の弱酸性に設定されている。そして、微生物含有溶液は、カラム13の内部空間Sを通って、回収装置27にて経時的に試験管(図示省略)に回収される。この際、本発明者らの知見によれば、pH3程度の弱酸性溶液中に存在する微生物のうちの多くは、その表面側に正電荷が存在しており、当該多くの微生物は、表面が負に帯電している担体11に付着する。そして、ここで付着されない残りの微生物が、微生物含有溶液とともにカラム13の液排出口13Bから排出される。
【0022】
次に、グラジエントポンプ24の作用により、緩衝液が、そのpHを経時的に上昇させながらカラム13の液注入口13Aから注入され、内部空間Sを通過して回収装置27側に排出される。このとき、本発明者らの知見によれば、微生物の中には、当該微生物がさらされる液体のpHが上昇すると、あるpHを境界にして当該微生物の表面側に負電荷が存在するように変わるものがあり、この境界となるpHは、微生物によって一様ではない。従って、担体11を通過する緩衝液のpHの経時的な上昇に伴い、先の工程で担体11に付着した微生物のうち、表面が負電荷になるものが次第に増え、時間の経過に伴い、担体11から脱落する微生物の種類が増え、これら微生物が緩衝液とともに回収装置27で回収される。このため、回収装置27での回収時間によって、前記試験管内で回収される微生物の組み合わせが異なって、結果的にターゲットとなる微生物の濃縮、精製が可能になる。
【0023】
なお、カラム13から回収された緩衝液中の微生物は、吸光度測定によって存在状況が確認され、必要に応じ、FISH(蛍光 in situ hybridization)により、ターゲット微生物の定量が行われる。
【0024】
次に、前記濃縮精製装置10による微生物の濃縮精製効果を確認するための実験を行った。
【0025】
本実験は、次の条件及び手順で行った。
【0026】
先ず、担体11として粒径0.1mmのガラスビーズを用意し、当該ガラスビーズを充填高さ15cmとしてカラム13内に充填した。そして、クエン酸溶液の比率が80%となるpH3.8のクエン酸バッファーからなる原液に、所定の微生物の菌体を含ませてなる微生物含有溶液を用意し、当該微生物含有溶液をカラム13に10ml注入した。この微生物含有溶液は、担体11を通過してカラム13から排出されて回収された。
【0027】
ここでの微生物としては、既存のB.subtilis、A.faecalis、E.coliの三種類の微生物を用い、本実験は、これら三種類の微生物をそれぞれ単独で前記原液に含有させた場合と、B.subtilis、A.faecalisの二種類の微生物を混合して前記原液に含有させた場合との合計四種類について行った。また、これら各原液中の微生物の総濃度であるが、波長600nmでの吸光度が1Absとなるように調整した。
【0028】
次に、1mmol/lのクエン酸溶液と2mmol/lの重リン酸ナトリウム(pH8.5)を混合してなるクエン酸バッファーを流量5ml/minで35分間、カラム13内に注入した。この際、クエン酸バッファーにおけるクエン酸溶液の混合割合を35分間で65%(pH4.2)から0%(pH8.5)に減少するように、直線的に変化させた。そして、クエン酸溶液の混合割合が0%(pH8.5)すなわち重リン酸ナトリウムが100%となるクエン酸バッファーを流量5ml/minで3分間、カラム13内に注入した。
【0029】
同時に、カラム13から流量5ml/minでクエン酸バッファーを排出し、回収装置27により、クエン酸バッファーを試験管に一本ずつ各5ml注入した(以下、このときの試験管を「フラクション」と称する)。そして、回収した各フラクション内のバッファーについて、600nmの吸光度測定をし、必要であれば、FISHでターゲット微生物の定量を行った。
【0030】
以上の実験結果は、図2及び図3のグラフに示される通りである。なお、これらグラフにおいて、X軸の「フラクションNo.」に付されている番号は、回収時間順に付されており、X軸の左から右に向って、回収までの経過時間が次第に長くなるフラクションを意味する。
【0031】
図2は、前記三種類の微生物をそれぞれ単独で前記原液に含有させた場合の各フラクションの吸光度変化を示している。また、図3は、前記二種類の微生物を混合して前記原液に含有させた場合の各フラクションの吸光度変化を示している。
【0032】
図2によれば、カラム13から流出した後の菌体濃度は、各微生物で固有のピークを持つことが分かる。このことは、クエン酸バッファーのpHを段階的に変化させたときでも同様である。以上から、未知の環境サンプルにおいても、様々な微生物固有のピークを持ち、当該ピークの相違に基づいて、ターゲットの微生物を濃縮、精製可能となることが十分に考えられる。
【0033】
また、図3によれば、グラフ上、二箇所のピークが確認され、これらピークは、図2の結果を参酌すると、B.subtilis、A.faecalis由来のものと思われる。そこで、各フラクションの中のそれぞれの微生物の割合をFISHにより測定した。つまり、ここでは、特定の微生物をその遺伝子型に基づいて顕微鏡下で直接計数し、全体の微生物に対する割合を算出した。その結果を図4に示す。図4は、図3における符号a〜iのフラクションにおけるB.subtilis、A.faecalisの各割合を示す図表である。この図表から、A.faecalisについて述べると、カラム13に注入される前の原液中には、22.4%存在していたが、図3中で一つ目のピークが得られるフラクションbでは、2.5%まで減少し、同図中で二つ目のピーク付近のフラクションgでは、52.7%となっていることが確認できる。また、B.subtilisについて述べると、カラム13に注入される前の原液中には、77.6%存在していたが、前記フラクションbでは、97.5%と高濃度に濃縮されている。
【0034】
従って、以上の結果から、複数の微生物種が混合された状態でも、ターゲットとなる微生物種を特異的に濃縮可能であることが実証された。このことは、緩衝液となるクエン酸バッファーのpHを段階的に変化させたときでも同様である。
【0035】
なお、前記実施形態では、担体として負に帯電する物質を用いているが、濃縮、精製のターゲットとなる微生物によっては、担体11として正に帯電する物質を用いることもでき、また、緩衝液のpHを経時的に下げるようにしてもよい。要するに、カラム13内の担体11として正又は負に帯電する物質を用い、カラム13に注入される緩衝液のpHを経時的に変化させる限りにおいて、種々の構成を採ることができる。
【0036】
その他、本発明における装置各部の構成は図示構成例に限定されるものではなく、実質的に同様の作用を奏する限りにおいて、種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】本実施形態に係る濃縮精製装置の概略構成図。
【図2】三種類の微生物をそれぞれ単独で原液に含有させた場合における各フラクションの吸光度変化を示すグラフ。
【図3】二種類の微生物を混合して原液に含有させた場合における各フラクションの吸光度変化を示すグラフ。
【図4】図3における符号a〜iのフラクションにおける各微生物の割合を示す図表。
【符号の説明】
【0038】
10 濃縮精製装置
11 担体
15 緩衝液供給手段
18 緩衝液回収手段
S 内部空間(流路)

【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の微生物を含む微生物含有溶液が通過する流路と、当該流路に配置された担体と、前記微生物含有溶液が前記流路を通過した後で、前記流路に所定の緩衝液を供給する緩衝液供給手段と、前記流路を通過した前記緩衝液を回収する緩衝液回収手段とを備え、
前記担体は、表面が正又は負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のpHを経時的に変化させながら当該緩衝液を供給可能に設けられ、
前記緩衝液回収手段は、前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収可能に設けられていることを特徴とする微生物の濃縮精製装置。
【請求項2】
前記担体は、中性付近で表面が負に帯電する物質により構成され、
前記緩衝液供給手段は、前記緩衝液のpHを経時的に上げながら当該緩衝液を供給可能に設けられていることを特徴とする微生物の濃縮精製装置。
【請求項3】
表面が正又は負に帯電する担体が配置された流路に、複数の微生物が含まれる微生物含有溶液を通した後で、経時的にpHが変化する緩衝液を前記流路に供給し、当該流路から排出された前記緩衝液を経時的に所定量ずつ回収することを特徴とする微生物の濃縮精製方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【公開番号】特開2009−65915(P2009−65915A)
【公開日】平成21年4月2日(2009.4.2)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−238595(P2007−238595)
【出願日】平成19年9月14日(2007.9.14)
【出願人】(899000068)学校法人早稲田大学 (602)
【Fターム(参考)】