微生物の集積培養方法
【課題】簡便な方法を提供する。微生物の培養に有害物質を使用する場合、その有害物質の使用量を減らす。
【解決手段】培養対象微生物１以外の微生物の育成環境を悪化させる物質２に対して還元活性を有する培養対象微生物１を、物質２を溶解させた培養液３中で選択的に集積培養する際、培養対象微生物によって還元された物質２を培養液３中に流した電気により酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行う。
【解決手段】培養対象微生物１以外の微生物の育成環境を悪化させる物質２に対して還元活性を有する培養対象微生物１を、物質２を溶解させた培養液３中で選択的に集積培養する際、培養対象微生物によって還元された物質２を培養液３中に流した電気により酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の集積培養方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、特定の物質に対し還元活性と耐性を有する培養対象微生物を、前記物質を溶解させた培養液中で選択的に集積培養する微生物の集積培養方法であって、培養対象微生物以外の微生物に対して前記物質が毒性等の生育環境を悪化させる性質を有している場合の微生物の集積培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロム還元菌は、嫌気的環境で培養すると、培地中に含まれる有害な六価クロムを三価に還元する作用がある。三価クロムは、溶解度が低いため、沈殿させて溶液から分離することができる。このようにクロム還元菌の作用は、六価クロムで汚染された排水や土壌を浄化するのに有効である。
【０００３】
ところで、クロム還元菌の培養には、六価クロムを培養液中に溶解させて行うが、培養初期段階においては六価クロムの毒性のために、六価クロムに耐性のあるクロム還元菌が優先的に増殖することができる。しかし、クロム還元菌の作用によって次第に培養液中の六価クロム濃度が減少してくると、それまで増殖ができないでいた雑多な菌群が増殖を開始してくるといった問題があった。これは、クロム還元菌を用いた浄化を考える際に、クロム還元菌の集積培養を困難なものとする要因となりうる。このような、雑多な菌群の増殖を防ぐには、（１）クロム還元菌を純粋分離し、雑菌の混入のないクリーンな環境で培養操作を実施する、（２）六価クロムを連続的に培地に添加しながら培養を実施する、などの手法が考えられる。
【０００４】
なお、クロム還元菌を用いた六価クロムの除去方法として、特開平２−２６８８９９号公報、特開２００２−２８１９６０号公報に開示されている技術がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平２−２６８８９９号
【特許文献２】特開２００２−２８１９６０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記（１）の手法においては、特殊な培養環境を整える必要があり、簡便な培養方法とはなりえない。また、上記（２）の手法においては、結果的に有害である六価クロムを大量に使用することとなり、好ましくない。
【０００７】
そして、これらの不都合は、六価クロムを使用したクロム還元菌の培養に限るものではなく、毒性のある物質を使用した培養であって、その物質に耐性のある微生物の培養についても同様である。
【０００８】
本発明は、培養の対象となる微生物の選択的な培養を簡便に行うことができる微生物の集積培養方法を提供することを目的とする。また、本発明は、微生物の培養に有害物質を使用する場合、その有害物質を大量に使用しなくても培養の対象となる微生物を選択的に集積培養することができる微生物の集積培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる目的を達成するために、請求項１記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物が還元活性を有し且つ耐性のある物質を溶解させた培養液中で培養対象微生物を選択的に集積培養する際、培養対象微生物によって還元された前記物質を培養液中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うものである。
【００１０】
したがって、前記物質の溶解した培養液は培養対象微生物以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、前記物質に耐性のある培養対象微生物を選択的に培養することができる。培養対象微生物の培養により培養液中の前記物質がつぎつぎに還元されることになるが、培養液中の電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで還元された前記物質を再生させることができる。このため、前記物質を新たに補充しなくても、培養液中の前記物質の濃度を維持することができる。
【００１１】
また、請求項２記載の微生物の集積培養方法は、培養液には有機物が含まれており、培養対象微生物は有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元するものである。即ち、培養対象微生物は呼吸するために前記物質を必要とするのではなく、発酵を行う過程で結果的に前記物質を還元する。
【００１２】
また、請求項３記載の微生物の集積培養方法は、前記物質が、培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有しているものである。したがって、培養液が培養対象微生物以外の微生物にとって生息に適さないものとなる。
【００１３】
また、請求項４記載の微生物の集積培養のように、前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることが好ましい。銀、銅、水銀、ヨウ素は、多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有している。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は、多くの種類の微生物に対し生態毒性を有している。したがって、これらの物質に耐性のある微生物が、耐性の無い他の雑多な微生物に対し優先的に増殖する。
【００１４】
また、請求項５記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がクロム還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うものである。
【００１５】
したがって、培養液はクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、六価クロムに耐性のあるクロム還元菌を選択的に培養することができる。クロム還元菌の培養により培養液中の六価クロムがつぎつぎに三価クロムに還元されることになるが、培養液中に浸した電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで三価に還元されたクロムを六価に再生させることができる。このため、培養液中の六価クロムの濃度を維持することができる。
【００１６】
また、請求項６記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がウラン還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うものである。
【００１７】
したがって、培養液はウラン還元菌以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、六価クロムに耐性のあるウラン還元菌を選択的に培養することができる。ウラン還元菌の培養により培養液中の六価クロムがつぎつぎに三価クロムに還元されることになるが、培養液中に浸した電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで三価に還元されたクロムを六価に再生させることができる。このため、培養液中の六価クロムの濃度を維持することができる。
【発明の効果】
【００１８】
しかして、請求項１記載の微生物の集積培養方法によれば、上述のようにして微生物を集積培養するので、培養液中に前記物質を補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、培養対象微生物の培養に適した環境を維持することができる。前記物質の再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストで微生物を集積培養することができる。また、前記物質を再生して使用するので、その使用量が少量で足り、この点からもコストを安くすることができる。
【００１９】
また、請求項２記載の微生物の集積培養方法は、培養液には有機物が含まれており、培養対象微生物は有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元するものである。即ち、培養対象微生物は呼吸するために前記物質を必要とするのではなく、発酵を行う過程で結果的に前記物質を還元する。
【００２０】
また、請求項３記載の微生物の集積培養方法では、前記物質が培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有しているので、培養液が培養対象微生物以外の微生物にとって生息に適さないものとなる。このため、培養対象微生物以外の微生物の繁殖を抑え、培養対象微生物をより優先的に培養することができる。
【００２１】
また、請求項４記載の微生物の集積培養のように、前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることが好ましい。銀、銅、水銀、ヨウ素は、多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有している。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は、多くの種類の微生物に対し生態毒性を有している。したがって、これらの物質に耐性のある微生物を優先的に培養することができる。
【００２２】
また、請求項５記載の微生物の集積培養方法では、培養対象微生物がクロム還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うので、培養液中に六価クロムを補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、クロム還元菌の培養に適した環境を維持することができる。六価クロムの再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストでクロム還元菌を集積培養することができる。また、六価クロムを再生して使用するので、その使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。
【００２３】
さらに、請求項６記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がウラン還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うので、培養液中に六価クロムを補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、ウラン還元菌の培養に適した環境を維持することができる。六価クロムの再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストでウラン還元菌を集積培養することができる。また、六価クロムを再生して使用するので、その使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。即ち、クロム還元菌と同様の方法で、ウラン還元菌を選択的に集積培養することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
図１に、本発明の微生物の集積培養方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物１が還元活性を有し且つ耐性のある物質２を溶解させた培養液３中で培養対象微生物１を選択的に集積培養する際、培養対象微生物１によって還元された物質２を培養液３中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うものである。即ち、物質２に対し耐性のある培養対象微生物１を、耐性のない微生物に優先して培養を行うものである。本実施形態では、培養対象微生物１は六価クロムに耐性のあるクロム還元菌（以下、クロム還元菌１という）であり、物質２は六価クロム（以下、六価クロム２という）であり、クロム還元菌１によって還元された三価クロムを六価クロム２に再生しながら培養を行うものである。
【００２６】
電解槽４はイオン交換膜５によって培養槽６と対極槽７に仕切られており、培養槽６には六価クロム２を含む培地に懸濁させたクロム還元菌１を、対極槽７には六価クロム２を含まない培地成分を含んだ溶液を充填している。また、培養槽６には陽極８を、対極槽７には陰極９を浸している。
【００２７】
培養槽６中の培地には、例えば乳酸、酵母エキス等の有機物が投入されている。クロム還元菌１はこれらの有機物を使用して発酵を行い、その過程で六価クロム２を還元する。六価クロム２は、クロム還元菌１以外の微生物に対して毒性を有しており、その他の雑多な微生物の繁殖を抑えることができる。
【００２８】
つまり、六価クロム２が溶解した培養液３はクロム還元菌１にとっては増殖し易いものであるが、その他の雑多な微生物にとっては増殖し難いものであり、クロム還元菌１を選択的に培養することができる。クロム還元菌１の培養により培養液３中の六価クロム２がつぎつぎに還元されて三価クロムとなるが、陽極８に電位を与えることで三価クロムを六価クロム２に再生することができる。このため、培養液３中の六価クロム２の濃度を維持することができ、クロム還元菌１の優先的な培養に適した環境を維持することができる。
【００２９】
このように、本発明では電気分解によりクロムを三価から六価に再生するので、簡便であり、必要な装置類も簡単なもので足りる。このため、低コストでクロム還元菌１を集積培養することができる。また、培養槽６中の六価クロム２を再生して使用するので、六価クロム２の使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。
【００３０】
クロム還元菌１としては、例えば表１に掲げるものがある。即ち、例えばShwanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacterである。ただし、これらのクロム還元菌１に限るものではない。
【００３１】
【表１】
【００３２】
電気分解を行うために培養液３には、三価クロムを六価クロム２に酸化させることができる値の電位を与える。実験では、図６に示すように、１Ｖ付近の電位で三価クロムが六価クロム２に酸化された。したがって、三価クロムを六価クロム２に酸化させる電位は約１Ｖであると判断できるので、培養液３に１Ｖの電位をかけながら培養を行うことが好ましい。
【００３３】
また、培養液３中の六価クロム２の濃度が高すぎると、六価クロムの毒性によりクロム還元菌１自身も増殖し難くなるので、六価クロム２の濃度の上限値は、例えば０．５ｍ mol／Ｌが好ましい。
【００３４】
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の説明では、培養対象微生物がクロム還元菌１であったが、クロム還元菌１以外の微生物でも良い。
【００３５】
また、上述の説明では、物質２として六価クロムを使用していたが、六価クロムに限るものではない。例えば、銀（Ａｇ＋）、銅（Ｃｕ２＋）、水銀（Ｈｇ２＋）、ヨウ素（Ｉ２）、亜ヒ酸（ＡｓＯ２−）、マンガン（Ｍｎ２＋）、ニッケル（Ｎｉ＋）、亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）のいずれかでも良い。即ち、これらの物質２に還元活性のある微生物１を、これらの物質２を再生しながら培養しても良い。六価クロム２と同様に銀、銅、水銀、ヨウ素も多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有しており、銀、銅、水銀、ヨウ素に耐性のある微生物１を選択的に集積培養することができる。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は多くの種類の微生物に対し生態毒性を有しており、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸に耐性のある微生物１を選択的に集積培養することができる。これらの場合にも、上述のクロム還元菌１を培養する場合と同様の効果を得ることができる。
【００３６】
なお、物質２が銀の場合、培養液３中のＡｇ＋を銀還元菌１がＡｇに還元し、これを電気分解によってＡｇ＋に再生することが考えられる。また、物質２が銅の場合、培養液３中のＣｕ２＋を銅還元菌１がＣｕに還元し、これを電気分解によってＣｕ２＋に再生することが考えられる。また、物質２が水銀の場合、培養液３中のＨｇ２＋を水銀還元菌１がＨｇに還元し、これを電気分解によってＨｇ２＋に再生することが考えられる。また、物質２がヨウ素の場合、培養液３中のＩ２をヨウ素還元菌１がＩ−に還元し、これを電気分解によってＩ２に再生することが考えられる。また、物質２が亜ヒ酸の場合、培養液３中の亜ヒ酸を亜ヒ酸還元菌１がヒ素に還元し、これを電気分解によって亜ヒ酸に再生することが考えられる。また、物質２がマンガンの場合、培養液３中のＭｎ２＋をマンガン還元菌１がＭｎに還元し、これを電気分解によってＭｎ２＋に再生することが考えられる。また、物質２がニッケルの場合、培養液３中のＮｉ＋をニッケル還元菌１がＮｉに還元し、これを電気分解によってＮｉ＋に再生することが考えられる。また、物質２が亜セレン酸の場合、培養液３中の亜セレン酸を亜セレン酸還元菌１がセレンに還元し、これを電気分解によって亜セレン酸に再生することが考えられる。
【００３７】
また、物質２として六価クロム２を使用して、ウラン還元菌１を選択的に集積培養しても良い。即ち、ウラン還元菌１によって還元された三価クロムを培養液３中に流した電気により酸化反応を生じさせて六価クロム２に再生しながら培養を行うようにしても良い。この場合にも、クロム還元菌１を培養する場合と同様の効果を得ることができる。ウラン還元菌１として、六価クロムに対し還元活性を有し且つ耐性のあるものがある。ウランを溶解させた培養液３でウラン還元菌１を培養することが安全面、コスト面等で不利な場合がある。このような場合には、ウラン還元菌１を六価クロムを溶解させた培養液３中で培養することが安全面、コスト面等で有利となることも考えられる。
【００３８】
また、上述の説明では、発酵の過程で物質２を還元する微生物１を例に説明していたが、必ずしも発酵の過程で物質３を還元する微生物１に限るものではなく、呼吸の過程で物質２を還元する微生物１を培養しても良い。
【実施例１】
【００３９】
本発明により、クロム還元菌１を良好に培養できることを確認するための実験を行った。使用した培養装置を図２に示す。電解槽４は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）５で仕切った二槽式とし、片方を培養槽６、もう一方を対極槽７とした。培養槽６には白金網（４０ｍｍ×７０ｍｍ、８０ｍｅｓｈ）製の陽極８、および銀・塩化銀参照電極１０（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。さらに、対極槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）を陰極９として設置した。これら３本の電極８，９，１０を電位制御装置１１に結線する事で、培養槽６内の陽極８の電位を厳密に設定可能とした 。
【００４０】
培養に際しては、電解槽４をアクリル製の嫌気ボックス１２内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０度に設定した恒温槽（図示せず）内に設置した。嫌気ボックス１２には、常時窒素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。
【００４１】
培養液３の組成を表２に、その中の金属溶液の組成を表３に示す。なお、以下の実験では、全てこの組成の培養液３を用いた。
【００４２】
【表２】
【表３】
【００４３】
培養液３はまず、無機基本成分を調整後にオートクレーブ滅菌を施した。実験直前に、クロム塩および有機成分（Yeast Extract：０．２ｇ／Ｌ、乳酸ナトリウム：１ｇ／Ｌ）を混合し、フィルター（０．２２μｍ，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）によりろ過除菌した。
【００４４】
陽極８に＋１．０Ｖの電位を与えながら２週間にわたり培養を行った。その結果を図３に示す。２週間の培養でクロム還元菌１の濃度が初期状態の約３倍に増加したことを確認できた。本発明によってクロム還元菌１を培養できることを確認できた。なお、クロム還元菌１の数は、光学顕微鏡観察による菌数カウントによって計測した。
【００４５】
また、微生物の形状に関する、より詳細な視覚的情報の取得を目的として、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Digital Instruments社、Nanoscope IIIa）による観察を行った。上記実験後の試料（本発明試料）と、比較のためにバイアル瓶を用いて培養を行った試料（比較試料）について観察を行った。ＡＦＭ観察試料は、アセトン中で超音波洗浄したカバーガラス（MATSUNAMI，Micro cover glass，１８×１８ｍｍ）を用いて作成した。カバーガラス上に微生物の懸濁液５０μＬを滴下し、約１時間常温で静置後、カバーガラスを蒸留水中に１０秒間浸漬させ、培養液３成分を洗い流した。その後、約１時間常温大気中で乾燥させ、測定に供した。ＡＦＭ測定は大気中にておこない、探針の制御法はコンタクトモードを採用した。個々のサンプルに対し、２０μｍ×２０μｍの領域をスキャンし、画像を取得した。なお、比較試料を得るためのバイアル瓶を用いた培養は、以下の通り行った。即ち、微生物懸濁液にクロム塩、および有機成分を添加し、１００ｍＬ容のバイアル瓶に３０ｍＬ注入し、ブチルゴム栓およびアルミキャップにより密栓した。続いて、バイアル瓶内のガスを窒素に置換し、最終ガス圧を１．５気圧に調整した。バイアル瓶は３０度の恒温室にて振とう培養に供した。
【００４６】
その結果を図４に示す。図４（Ａ）は比較試料についての画像写真、図４（Ｂ）は本発明試料についての画像写真である。なお、各図中右下の線の長さは５μｍに相当する。比較試料では複数種の微生物の増殖が確認されたのに対し、本発明試料では菌形のそろった単一の微生物の増殖が確認できた。本発明試料で確認された微生物はクロム還元菌１であり、本発明によってクロム還元菌１を選択的に集積培養を行うことができることを確認できた。
【００４７】
さらに念のため、上記実験（陽極８に＋１．０Ｖの電位を与えながらの実験）によって集積培養した微生物を、今度は陽極８に電位を与えずに２週間培養した。その結果を図５に示す。図５からも明らかなように、培養液３中の六価クロム２の濃度の減少が確認された。これにより、上記実験によって集積培養された微生物がクロム還元菌１であることを再確認できた。
【実施例２】
【００４８】
陽極８に与える電位を決定するための実験を行った。クロムをはじめとする種々の電極活性物質２の酸化還元電位の測定は、電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル６６０Ｂ、BAS社）を使用し、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法により実施した。この際、電解系は３極式で行い、電極反応を見るための作用極には白金円盤電極（面積：０．７８５ｍｍ２、BAS社）を、参照電極には銀・塩化銀電極（ＲＥ−１Ｂ、BAS社）、さらに電流を流すための対極には白金棒電極（１ｍｍ径×５ｃｍ、自作）を使用した。それぞれの電極活性物質２、具体的には六価クロムについては１ｍ mol／Ｌ濃度で調整し、銀，銅，水銀，ヨウ素，亜ヒ酸，マンガン，ニッケル，亜セレン酸については５ｍ mol／Ｌ濃度で調整し、電解質溶液中に溶解させた。ＣＶ結果は、それぞれの物質２ごとに、物質２の入っていない電解質溶液をベースラインとして表示した。
【００４９】
六価クロム２についての酸化電位の測定結果を図６に示す。図６において、薄い色の実線はクロムを含まない培養液３（バックグラウンド）についての測定結果、濃い色の実線は１ｍ mol／Ｌのクロムイオンを含む培養液３についての測定結果である。なお、横軸（電位）は、銀塩化銀参照電極に対する値である（図７〜図１４において同じ）。培養液３にクロムが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、０Ｖ付近（矢印Ａ）に還元電流、＋１Ｖ付近（矢印Ｂ）に酸化電流の増加が確認できた。これらはそれぞれ、Ｃｒ(VI)→Ｃｒ(III)、Ｃｒ(III)→Ｃｒ(VI)の反応に起因する電流値であると判断できる。これは、培養液３に常時＋１Ｖの電位を加えることで、培養液３中のクロムをＣｒ(VI)に保持できることを示している。したがって、培養中に与える電位は＋１．０Ｖが適している。
【００５０】
銀（Ａｇ＋）についての酸化電位の測定結果を図７に示す。図７において、実線は銀を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの銀イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に銀が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖが適している。
【００５１】
銅（Ｃｕ２＋）についての酸化電位の測定結果を図８に示す。図８において、実線は銅を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの銅イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に銅が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、０Ｖ付近と＋０．２Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、０Ｖ又は＋０．２Ｖが適している。
【００５２】
水銀（Ｈｇ２＋）についての酸化電位の測定結果を図９に示す。図９において、実線は水銀を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの水銀イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に水銀が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．３Ｖ付近と＋０．６Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．３Ｖ又は＋０．６Ｖが適している。
【００５３】
ヨウ素（Ｉ２）についての酸化電位の測定結果を図１０に示す。図１０において、実線はヨウ素を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのヨウ素を含む培養液についての測定結果である。培養液にヨウ素が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近と＋０．８Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖ又は＋０．８Ｖが適している。
【００５４】
亜ヒ酸（ＡｓＯ２−）についての酸化電位の測定結果を図１１に示す。図１１において、実線は亜ヒ酸を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの亜ヒ酸を含む培養液についての測定結果である。培養液に亜ヒ酸が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．７Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．７Ｖが適している。
【００５５】
マンガン（Ｍｎ２＋）についての酸化電位の測定結果を図１２に示す。図１２において、実線はマンガンを含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのマンガンイオンを含む培養液についての測定結果である。培養液にマンガンが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．７Ｖ付近と＋１．０Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．７Ｖ又は＋１．０Ｖが適している。
【００５６】
ニッケル（Ｎｉ＋）についての酸化電位の測定結果を図１３に示す。図１３において、実線はニッケルを含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのニッケルイオンを含む培養液についての測定結果である。培養液にニッケルが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、−０．４Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、−０．４Ｖが適している。
【００５７】
亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）についての酸化電位の測定結果を図１４に示す。図１４において、実線は亜セレン酸を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの亜セレン酸を含む培養液についての測定結果である。培養液に亜セレン酸が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖが適している。
【実施例３】
【００５８】
培養液３中の六価クロム２の濃度の適正値を求めるための実験を行った。実験ではバイアル瓶を使用し、電位を与えない状態（六価クロム２の再生を行わない状態）で実験を行った。微生物懸濁液にクロム塩、および有機成分を添加し、１００ｍＬ容のバイアル瓶に３０ｍＬ注入し、ブチルゴム栓およびアルミキャップにより密栓した。続いて、バイアル瓶内のガスを窒素に置換し、最終ガス圧を１．５気圧に調整した。バイアル瓶は３０度の恒温室にて振とう培養に供した。微生物として２箇所の土壌（土壌Ａ、土壌Ｂ）から採取したクロム還元菌１を使用し、培養液３中の六価クロム２の初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌ、０．２ｍ mol／Ｌ、０．５ｍ mol／Ｌ、１．０ｍ mol／Ｌの４つの値について実験を行った。また、比較のために、クロム還元菌１を投入しない場合（control）についても実験を行った。
【００５９】
まず最初に、クロム還元菌１による培養液３中の六価クロム濃度の時間変化についての測定結果を図１５に示す。図１５（Ａ）は六価クロム２の初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌの場合、（Ｂ）は六価クロム２の初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌの場合、（Ｃ）は六価クロム２の初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合、（Ｄ）は六価クロム２の初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合である。なお、各図では縦軸のスケールが異なっている。六価クロム２の初発濃度が０．１と０．２ｍ mol／Ｌの場合には、実験開始から１〜２週間で六価クロム２の濃度が０近くまで減少した。また、六価クロム２の初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合には、六価クロム濃度の減少は僅かであった。一方、六価クロム２の初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合、六価クロム濃度の有意な減少はみられなかった。
【００６０】
なお、培養液３中のクロムは、六価クロム２の状態では溶液中に溶解しているが、三価クロムの状態では沈殿するので、培養液３をフィルター（０．２２μm，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）で三価クロムをろ過することにより、六価クロム２のみを抽出し、クロム濃度を分析した。クロムの定量にはＩＣＰ発光分析装置（Ｐ８０００、HITACHI社）を使用した。
【００６１】
次に、各初発濃度における菌濃度の時間変化についての測定結果を図１６に示す。なお、図中縦軸は、クロム還元菌１を含む菌全体（クロム還元菌１以外の雑多な菌も含む）の濃度（cells／ｍＬ）である。また、図中右上四角枠内の数値（０．１／０．２／０．５／１．０）は、六価クロム２の初発濃度（ｍ mol／Ｌ）を示している。図１６（Ａ）は土壌Ａについての測定結果、図１６（Ｂ）は土壌Ｂについての測定結果である。
【００６２】
六価クロム初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌ以下の場合、培養後半では六価クロム２の濃度がほぼゼロになっている（図１５（Ａ）（Ｂ））ことから、図１６（Ａ）（Ｂ）の０．１、０．２ｍ mol／Ｌで増えている菌は、雑多な菌も含まれていると考えられる。一方、六価クロム初発濃度０．５ｍ mol／Ｌの場合、培養後半でも六価クロム２が維持されている（図１５（Ｃ））ので、図１６（Ａ）（Ｂ）の０．５ｍ mol／Ｌで増えている菌は、クロム還元菌１であると考えられる。すなわち、土壌Ａ、土壌Ｂに含まれるクロム還元菌１は、与えられた培養液３環境において、少なくともそれぞれ、１．４×１０９cells／ｍＬ、６×１０８cells／ｍＬまで増殖できることが確認できた。
【００６３】
なお、六価クロム２が培養液３中に残っているにもかかわらず、微生物１の増殖が止まっているのは、六価クロム２が微生物１の増殖に直接関与しない物質である（即ち、微生物が呼吸するのに六価クロム２を必要とするのではなく、微生物１の発酵の過程で六価クロム２を還元する）証であり、おそらくは増殖に必要な有機物が使い尽くされたためと考えられる。
【００６４】
一方、六価クロム２の初発濃度１．０ｍ mol／Ｌの場合、ここで増えているのはクロム還元菌１と考えられる（図１５（Ｄ）より培養液３中に六価クロム２が存在しているため）が、０．５ｍ mol／Ｌの場合に比べて明らかに菌体濃度が低いことから（図１６）、１．０ｍ mol／Ｌの場合の六価クロム２は、クロム還元菌１自体の増殖を阻害していると考えられる。
【００６５】
以上より、培養液３中の六価クロム濃度が高過ぎても培養に適さないことがわかった。そして、具体的には、クロム還元菌１の集積培養の際には、０．５ｍ mol／Ｌ以下の六価クロム濃度にて、培養液３中の六価クロム２がなくならないような条件の下で培養することが好ましいことがわかった。
【００６６】
また、培養液３中の六価クロム濃度が低すぎるとクロム還元菌１以外の雑多な菌の繁殖を許してしまうことになるので、六価クロム濃度としては、最低でも雑多な菌の繁殖を抑えることができる濃度を確保する必要がある。例えば、０．１ｍ mol程度の濃度を確保することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の微生物の集積培養方法の実施形態の一例を示す概念図である。
【図２】クロム還元菌の集積培養の実験に使用した培養装置の概念図である。
【図３】クロム還元菌の集積培養の実験結果を示す図である。
【図４】培養後の微生物群の顕微鏡画像を示し、（Ａ）は比較試料についての顕微鏡画像、（Ｂ）は本発明試料についての顕微鏡画像である。
【図５】培養後の微生物がクロム還元菌であることを再確認するための実験結果を示す図である。
【図６】クロムの酸化電位の測定結果を示す図である。
【図７】銀の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図８】銅の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図９】水銀の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１０】ヨウ素の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１１】亜ヒ酸の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１２】マンガンの酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１３】ニッケルの酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１４】亜セレン酸の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１５】クロム還元菌による六価クロム濃度の時間変化を示し、（Ａ）は六価クロム初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌの場合の測定結果、（Ｂ）は六価クロム初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌの場合の測定結果、（Ｃ）は六価クロム初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合の測定結果、（Ｄ）は六価クロム初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合の測定結果である。
【図１６】六価クロム初発濃度ごとのクロム還元菌濃度の時間変化を示し、（Ａ）は土壌Ａより採取したクロム還元菌についての測定結果、（Ｂ）は土壌Ｂより採取したクロム還元菌についての測定結果である。
【符号の説明】
【００６８】
１ 培養対象微生物
２ 六価クロム（物質）
３ 培養液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の集積培養方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、特定の物質に対し還元活性と耐性を有する培養対象微生物を、前記物質を溶解させた培養液中で選択的に集積培養する微生物の集積培養方法であって、培養対象微生物以外の微生物に対して前記物質が毒性等の生育環境を悪化させる性質を有している場合の微生物の集積培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロム還元菌は、嫌気的環境で培養すると、培地中に含まれる有害な六価クロムを三価に還元する作用がある。三価クロムは、溶解度が低いため、沈殿させて溶液から分離することができる。このようにクロム還元菌の作用は、六価クロムで汚染された排水や土壌を浄化するのに有効である。
【０００３】
ところで、クロム還元菌の培養には、六価クロムを培養液中に溶解させて行うが、培養初期段階においては六価クロムの毒性のために、六価クロムに耐性のあるクロム還元菌が優先的に増殖することができる。しかし、クロム還元菌の作用によって次第に培養液中の六価クロム濃度が減少してくると、それまで増殖ができないでいた雑多な菌群が増殖を開始してくるといった問題があった。これは、クロム還元菌を用いた浄化を考える際に、クロム還元菌の集積培養を困難なものとする要因となりうる。このような、雑多な菌群の増殖を防ぐには、（１）クロム還元菌を純粋分離し、雑菌の混入のないクリーンな環境で培養操作を実施する、（２）六価クロムを連続的に培地に添加しながら培養を実施する、などの手法が考えられる。
【０００４】
なお、クロム還元菌を用いた六価クロムの除去方法として、特開平２−２６８８９９号公報、特開２００２−２８１９６０号公報に開示されている技術がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平２−２６８８９９号
【特許文献２】特開２００２−２８１９６０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記（１）の手法においては、特殊な培養環境を整える必要があり、簡便な培養方法とはなりえない。また、上記（２）の手法においては、結果的に有害である六価クロムを大量に使用することとなり、好ましくない。
【０００７】
そして、これらの不都合は、六価クロムを使用したクロム還元菌の培養に限るものではなく、毒性のある物質を使用した培養であって、その物質に耐性のある微生物の培養についても同様である。
【０００８】
本発明は、培養の対象となる微生物の選択的な培養を簡便に行うことができる微生物の集積培養方法を提供することを目的とする。また、本発明は、微生物の培養に有害物質を使用する場合、その有害物質を大量に使用しなくても培養の対象となる微生物を選択的に集積培養することができる微生物の集積培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる目的を達成するために、請求項１記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物が還元活性を有し且つ耐性のある物質を溶解させた培養液中で培養対象微生物を選択的に集積培養する際、培養対象微生物によって還元された前記物質を培養液中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うものである。
【００１０】
したがって、前記物質の溶解した培養液は培養対象微生物以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、前記物質に耐性のある培養対象微生物を選択的に培養することができる。培養対象微生物の培養により培養液中の前記物質がつぎつぎに還元されることになるが、培養液中の電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで還元された前記物質を再生させることができる。このため、前記物質を新たに補充しなくても、培養液中の前記物質の濃度を維持することができる。
【００１１】
また、請求項２記載の微生物の集積培養方法は、培養液には有機物が含まれており、培養対象微生物は有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元するものである。即ち、培養対象微生物は呼吸するために前記物質を必要とするのではなく、発酵を行う過程で結果的に前記物質を還元する。
【００１２】
また、請求項３記載の微生物の集積培養方法は、前記物質が、培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有しているものである。したがって、培養液が培養対象微生物以外の微生物にとって生息に適さないものとなる。
【００１３】
また、請求項４記載の微生物の集積培養のように、前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることが好ましい。銀、銅、水銀、ヨウ素は、多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有している。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は、多くの種類の微生物に対し生態毒性を有している。したがって、これらの物質に耐性のある微生物が、耐性の無い他の雑多な微生物に対し優先的に増殖する。
【００１４】
また、請求項５記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がクロム還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うものである。
【００１５】
したがって、培養液はクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、六価クロムに耐性のあるクロム還元菌を選択的に培養することができる。クロム還元菌の培養により培養液中の六価クロムがつぎつぎに三価クロムに還元されることになるが、培養液中に浸した電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで三価に還元されたクロムを六価に再生させることができる。このため、培養液中の六価クロムの濃度を維持することができる。
【００１６】
また、請求項６記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がウラン還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うものである。
【００１７】
したがって、培養液はウラン還元菌以外の雑多な微生物にとって生息し難いものとなる。このため、六価クロムに耐性のあるウラン還元菌を選択的に培養することができる。ウラン還元菌の培養により培養液中の六価クロムがつぎつぎに三価クロムに還元されることになるが、培養液中に浸した電極に電位を与えて酸化反応を生じさせることで三価に還元されたクロムを六価に再生させることができる。このため、培養液中の六価クロムの濃度を維持することができる。
【発明の効果】
【００１８】
しかして、請求項１記載の微生物の集積培養方法によれば、上述のようにして微生物を集積培養するので、培養液中に前記物質を補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、培養対象微生物の培養に適した環境を維持することができる。前記物質の再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストで微生物を集積培養することができる。また、前記物質を再生して使用するので、その使用量が少量で足り、この点からもコストを安くすることができる。
【００１９】
また、請求項２記載の微生物の集積培養方法は、培養液には有機物が含まれており、培養対象微生物は有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元するものである。即ち、培養対象微生物は呼吸するために前記物質を必要とするのではなく、発酵を行う過程で結果的に前記物質を還元する。
【００２０】
また、請求項３記載の微生物の集積培養方法では、前記物質が培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有しているので、培養液が培養対象微生物以外の微生物にとって生息に適さないものとなる。このため、培養対象微生物以外の微生物の繁殖を抑え、培養対象微生物をより優先的に培養することができる。
【００２１】
また、請求項４記載の微生物の集積培養のように、前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることが好ましい。銀、銅、水銀、ヨウ素は、多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有している。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は、多くの種類の微生物に対し生態毒性を有している。したがって、これらの物質に耐性のある微生物を優先的に培養することができる。
【００２２】
また、請求項５記載の微生物の集積培養方法では、培養対象微生物がクロム還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うので、培養液中に六価クロムを補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、クロム還元菌の培養に適した環境を維持することができる。六価クロムの再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストでクロム還元菌を集積培養することができる。また、六価クロムを再生して使用するので、その使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。
【００２３】
さらに、請求項６記載の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物がウラン還元菌であり、前記物質が六価クロムであり、ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うので、培養液中に六価クロムを補充しなくてもその濃度を維持することができる。このため、ウラン還元菌の培養に適した環境を維持することができる。六価クロムの再生には電気分解を利用するので、簡便であり、必要な装置類は簡単なもので足りる。このため、低コストでウラン還元菌を集積培養することができる。また、六価クロムを再生して使用するので、その使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。即ち、クロム還元菌と同様の方法で、ウラン還元菌を選択的に集積培養することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
図１に、本発明の微生物の集積培養方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明の微生物の集積培養方法は、培養対象微生物１が還元活性を有し且つ耐性のある物質２を溶解させた培養液３中で培養対象微生物１を選択的に集積培養する際、培養対象微生物１によって還元された物質２を培養液３中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うものである。即ち、物質２に対し耐性のある培養対象微生物１を、耐性のない微生物に優先して培養を行うものである。本実施形態では、培養対象微生物１は六価クロムに耐性のあるクロム還元菌（以下、クロム還元菌１という）であり、物質２は六価クロム（以下、六価クロム２という）であり、クロム還元菌１によって還元された三価クロムを六価クロム２に再生しながら培養を行うものである。
【００２６】
電解槽４はイオン交換膜５によって培養槽６と対極槽７に仕切られており、培養槽６には六価クロム２を含む培地に懸濁させたクロム還元菌１を、対極槽７には六価クロム２を含まない培地成分を含んだ溶液を充填している。また、培養槽６には陽極８を、対極槽７には陰極９を浸している。
【００２７】
培養槽６中の培地には、例えば乳酸、酵母エキス等の有機物が投入されている。クロム還元菌１はこれらの有機物を使用して発酵を行い、その過程で六価クロム２を還元する。六価クロム２は、クロム還元菌１以外の微生物に対して毒性を有しており、その他の雑多な微生物の繁殖を抑えることができる。
【００２８】
つまり、六価クロム２が溶解した培養液３はクロム還元菌１にとっては増殖し易いものであるが、その他の雑多な微生物にとっては増殖し難いものであり、クロム還元菌１を選択的に培養することができる。クロム還元菌１の培養により培養液３中の六価クロム２がつぎつぎに還元されて三価クロムとなるが、陽極８に電位を与えることで三価クロムを六価クロム２に再生することができる。このため、培養液３中の六価クロム２の濃度を維持することができ、クロム還元菌１の優先的な培養に適した環境を維持することができる。
【００２９】
このように、本発明では電気分解によりクロムを三価から六価に再生するので、簡便であり、必要な装置類も簡単なもので足りる。このため、低コストでクロム還元菌１を集積培養することができる。また、培養槽６中の六価クロム２を再生して使用するので、六価クロム２の使用量が少量で足り、安全性が高く、集積培養に要するコストを更に安くすることができる。
【００３０】
クロム還元菌１としては、例えば表１に掲げるものがある。即ち、例えばShwanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacterである。ただし、これらのクロム還元菌１に限るものではない。
【００３１】
【表１】
【００３２】
電気分解を行うために培養液３には、三価クロムを六価クロム２に酸化させることができる値の電位を与える。実験では、図６に示すように、１Ｖ付近の電位で三価クロムが六価クロム２に酸化された。したがって、三価クロムを六価クロム２に酸化させる電位は約１Ｖであると判断できるので、培養液３に１Ｖの電位をかけながら培養を行うことが好ましい。
【００３３】
また、培養液３中の六価クロム２の濃度が高すぎると、六価クロムの毒性によりクロム還元菌１自身も増殖し難くなるので、六価クロム２の濃度の上限値は、例えば０．５ｍ mol／Ｌが好ましい。
【００３４】
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の説明では、培養対象微生物がクロム還元菌１であったが、クロム還元菌１以外の微生物でも良い。
【００３５】
また、上述の説明では、物質２として六価クロムを使用していたが、六価クロムに限るものではない。例えば、銀（Ａｇ＋）、銅（Ｃｕ２＋）、水銀（Ｈｇ２＋）、ヨウ素（Ｉ２）、亜ヒ酸（ＡｓＯ２−）、マンガン（Ｍｎ２＋）、ニッケル（Ｎｉ＋）、亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）のいずれかでも良い。即ち、これらの物質２に還元活性のある微生物１を、これらの物質２を再生しながら培養しても良い。六価クロム２と同様に銀、銅、水銀、ヨウ素も多くの種類の微生物に対し殺菌効果を有しており、銀、銅、水銀、ヨウ素に耐性のある微生物１を選択的に集積培養することができる。また、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸は多くの種類の微生物に対し生態毒性を有しており、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸に耐性のある微生物１を選択的に集積培養することができる。これらの場合にも、上述のクロム還元菌１を培養する場合と同様の効果を得ることができる。
【００３６】
なお、物質２が銀の場合、培養液３中のＡｇ＋を銀還元菌１がＡｇに還元し、これを電気分解によってＡｇ＋に再生することが考えられる。また、物質２が銅の場合、培養液３中のＣｕ２＋を銅還元菌１がＣｕに還元し、これを電気分解によってＣｕ２＋に再生することが考えられる。また、物質２が水銀の場合、培養液３中のＨｇ２＋を水銀還元菌１がＨｇに還元し、これを電気分解によってＨｇ２＋に再生することが考えられる。また、物質２がヨウ素の場合、培養液３中のＩ２をヨウ素還元菌１がＩ−に還元し、これを電気分解によってＩ２に再生することが考えられる。また、物質２が亜ヒ酸の場合、培養液３中の亜ヒ酸を亜ヒ酸還元菌１がヒ素に還元し、これを電気分解によって亜ヒ酸に再生することが考えられる。また、物質２がマンガンの場合、培養液３中のＭｎ２＋をマンガン還元菌１がＭｎに還元し、これを電気分解によってＭｎ２＋に再生することが考えられる。また、物質２がニッケルの場合、培養液３中のＮｉ＋をニッケル還元菌１がＮｉに還元し、これを電気分解によってＮｉ＋に再生することが考えられる。また、物質２が亜セレン酸の場合、培養液３中の亜セレン酸を亜セレン酸還元菌１がセレンに還元し、これを電気分解によって亜セレン酸に再生することが考えられる。
【００３７】
また、物質２として六価クロム２を使用して、ウラン還元菌１を選択的に集積培養しても良い。即ち、ウラン還元菌１によって還元された三価クロムを培養液３中に流した電気により酸化反応を生じさせて六価クロム２に再生しながら培養を行うようにしても良い。この場合にも、クロム還元菌１を培養する場合と同様の効果を得ることができる。ウラン還元菌１として、六価クロムに対し還元活性を有し且つ耐性のあるものがある。ウランを溶解させた培養液３でウラン還元菌１を培養することが安全面、コスト面等で不利な場合がある。このような場合には、ウラン還元菌１を六価クロムを溶解させた培養液３中で培養することが安全面、コスト面等で有利となることも考えられる。
【００３８】
また、上述の説明では、発酵の過程で物質２を還元する微生物１を例に説明していたが、必ずしも発酵の過程で物質３を還元する微生物１に限るものではなく、呼吸の過程で物質２を還元する微生物１を培養しても良い。
【実施例１】
【００３９】
本発明により、クロム還元菌１を良好に培養できることを確認するための実験を行った。使用した培養装置を図２に示す。電解槽４は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）５で仕切った二槽式とし、片方を培養槽６、もう一方を対極槽７とした。培養槽６には白金網（４０ｍｍ×７０ｍｍ、８０ｍｅｓｈ）製の陽極８、および銀・塩化銀参照電極１０（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。さらに、対極槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）を陰極９として設置した。これら３本の電極８，９，１０を電位制御装置１１に結線する事で、培養槽６内の陽極８の電位を厳密に設定可能とした 。
【００４０】
培養に際しては、電解槽４をアクリル製の嫌気ボックス１２内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０度に設定した恒温槽（図示せず）内に設置した。嫌気ボックス１２には、常時窒素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。
【００４１】
培養液３の組成を表２に、その中の金属溶液の組成を表３に示す。なお、以下の実験では、全てこの組成の培養液３を用いた。
【００４２】
【表２】
【表３】
【００４３】
培養液３はまず、無機基本成分を調整後にオートクレーブ滅菌を施した。実験直前に、クロム塩および有機成分（Yeast Extract：０．２ｇ／Ｌ、乳酸ナトリウム：１ｇ／Ｌ）を混合し、フィルター（０．２２μｍ，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）によりろ過除菌した。
【００４４】
陽極８に＋１．０Ｖの電位を与えながら２週間にわたり培養を行った。その結果を図３に示す。２週間の培養でクロム還元菌１の濃度が初期状態の約３倍に増加したことを確認できた。本発明によってクロム還元菌１を培養できることを確認できた。なお、クロム還元菌１の数は、光学顕微鏡観察による菌数カウントによって計測した。
【００４５】
また、微生物の形状に関する、より詳細な視覚的情報の取得を目的として、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Digital Instruments社、Nanoscope IIIa）による観察を行った。上記実験後の試料（本発明試料）と、比較のためにバイアル瓶を用いて培養を行った試料（比較試料）について観察を行った。ＡＦＭ観察試料は、アセトン中で超音波洗浄したカバーガラス（MATSUNAMI，Micro cover glass，１８×１８ｍｍ）を用いて作成した。カバーガラス上に微生物の懸濁液５０μＬを滴下し、約１時間常温で静置後、カバーガラスを蒸留水中に１０秒間浸漬させ、培養液３成分を洗い流した。その後、約１時間常温大気中で乾燥させ、測定に供した。ＡＦＭ測定は大気中にておこない、探針の制御法はコンタクトモードを採用した。個々のサンプルに対し、２０μｍ×２０μｍの領域をスキャンし、画像を取得した。なお、比較試料を得るためのバイアル瓶を用いた培養は、以下の通り行った。即ち、微生物懸濁液にクロム塩、および有機成分を添加し、１００ｍＬ容のバイアル瓶に３０ｍＬ注入し、ブチルゴム栓およびアルミキャップにより密栓した。続いて、バイアル瓶内のガスを窒素に置換し、最終ガス圧を１．５気圧に調整した。バイアル瓶は３０度の恒温室にて振とう培養に供した。
【００４６】
その結果を図４に示す。図４（Ａ）は比較試料についての画像写真、図４（Ｂ）は本発明試料についての画像写真である。なお、各図中右下の線の長さは５μｍに相当する。比較試料では複数種の微生物の増殖が確認されたのに対し、本発明試料では菌形のそろった単一の微生物の増殖が確認できた。本発明試料で確認された微生物はクロム還元菌１であり、本発明によってクロム還元菌１を選択的に集積培養を行うことができることを確認できた。
【００４７】
さらに念のため、上記実験（陽極８に＋１．０Ｖの電位を与えながらの実験）によって集積培養した微生物を、今度は陽極８に電位を与えずに２週間培養した。その結果を図５に示す。図５からも明らかなように、培養液３中の六価クロム２の濃度の減少が確認された。これにより、上記実験によって集積培養された微生物がクロム還元菌１であることを再確認できた。
【実施例２】
【００４８】
陽極８に与える電位を決定するための実験を行った。クロムをはじめとする種々の電極活性物質２の酸化還元電位の測定は、電気化学アナライザー（ＡＬＳモデル６６０Ｂ、BAS社）を使用し、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法により実施した。この際、電解系は３極式で行い、電極反応を見るための作用極には白金円盤電極（面積：０．７８５ｍｍ２、BAS社）を、参照電極には銀・塩化銀電極（ＲＥ−１Ｂ、BAS社）、さらに電流を流すための対極には白金棒電極（１ｍｍ径×５ｃｍ、自作）を使用した。それぞれの電極活性物質２、具体的には六価クロムについては１ｍ mol／Ｌ濃度で調整し、銀，銅，水銀，ヨウ素，亜ヒ酸，マンガン，ニッケル，亜セレン酸については５ｍ mol／Ｌ濃度で調整し、電解質溶液中に溶解させた。ＣＶ結果は、それぞれの物質２ごとに、物質２の入っていない電解質溶液をベースラインとして表示した。
【００４９】
六価クロム２についての酸化電位の測定結果を図６に示す。図６において、薄い色の実線はクロムを含まない培養液３（バックグラウンド）についての測定結果、濃い色の実線は１ｍ mol／Ｌのクロムイオンを含む培養液３についての測定結果である。なお、横軸（電位）は、銀塩化銀参照電極に対する値である（図７〜図１４において同じ）。培養液３にクロムが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、０Ｖ付近（矢印Ａ）に還元電流、＋１Ｖ付近（矢印Ｂ）に酸化電流の増加が確認できた。これらはそれぞれ、Ｃｒ(VI)→Ｃｒ(III)、Ｃｒ(III)→Ｃｒ(VI)の反応に起因する電流値であると判断できる。これは、培養液３に常時＋１Ｖの電位を加えることで、培養液３中のクロムをＣｒ(VI)に保持できることを示している。したがって、培養中に与える電位は＋１．０Ｖが適している。
【００５０】
銀（Ａｇ＋）についての酸化電位の測定結果を図７に示す。図７において、実線は銀を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの銀イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に銀が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖが適している。
【００５１】
銅（Ｃｕ２＋）についての酸化電位の測定結果を図８に示す。図８において、実線は銅を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの銅イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に銅が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、０Ｖ付近と＋０．２Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、０Ｖ又は＋０．２Ｖが適している。
【００５２】
水銀（Ｈｇ２＋）についての酸化電位の測定結果を図９に示す。図９において、実線は水銀を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの水銀イオンを含む培養液についての測定結果である。培養液に水銀が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．３Ｖ付近と＋０．６Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．３Ｖ又は＋０．６Ｖが適している。
【００５３】
ヨウ素（Ｉ２）についての酸化電位の測定結果を図１０に示す。図１０において、実線はヨウ素を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのヨウ素を含む培養液についての測定結果である。培養液にヨウ素が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近と＋０．８Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖ又は＋０．８Ｖが適している。
【００５４】
亜ヒ酸（ＡｓＯ２−）についての酸化電位の測定結果を図１１に示す。図１１において、実線は亜ヒ酸を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの亜ヒ酸を含む培養液についての測定結果である。培養液に亜ヒ酸が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．７Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．７Ｖが適している。
【００５５】
マンガン（Ｍｎ２＋）についての酸化電位の測定結果を図１２に示す。図１２において、実線はマンガンを含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのマンガンイオンを含む培養液についての測定結果である。培養液にマンガンが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．７Ｖ付近と＋１．０Ｖ付近（２つの矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．７Ｖ又は＋１．０Ｖが適している。
【００５６】
ニッケル（Ｎｉ＋）についての酸化電位の測定結果を図１３に示す。図１３において、実線はニッケルを含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌのニッケルイオンを含む培養液についての測定結果である。培養液にニッケルが存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、−０．４Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、−０．４Ｖが適している。
【００５７】
亜セレン酸（ＳｅＯ３２−）についての酸化電位の測定結果を図１４に示す。図１４において、実線は亜セレン酸を含まない培養液（バックグラウンド）についての測定結果、破線は５ｍ mol／Ｌの亜セレン酸を含む培養液についての測定結果である。培養液に亜セレン酸が存在する状態で、電気化学的に酸化還元を行わせると、＋０．５Ｖ付近（矢印）に酸化電流の増加が確認できた。したがって、培養中に与える電位は、＋０．５Ｖが適している。
【実施例３】
【００５８】
培養液３中の六価クロム２の濃度の適正値を求めるための実験を行った。実験ではバイアル瓶を使用し、電位を与えない状態（六価クロム２の再生を行わない状態）で実験を行った。微生物懸濁液にクロム塩、および有機成分を添加し、１００ｍＬ容のバイアル瓶に３０ｍＬ注入し、ブチルゴム栓およびアルミキャップにより密栓した。続いて、バイアル瓶内のガスを窒素に置換し、最終ガス圧を１．５気圧に調整した。バイアル瓶は３０度の恒温室にて振とう培養に供した。微生物として２箇所の土壌（土壌Ａ、土壌Ｂ）から採取したクロム還元菌１を使用し、培養液３中の六価クロム２の初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌ、０．２ｍ mol／Ｌ、０．５ｍ mol／Ｌ、１．０ｍ mol／Ｌの４つの値について実験を行った。また、比較のために、クロム還元菌１を投入しない場合（control）についても実験を行った。
【００５９】
まず最初に、クロム還元菌１による培養液３中の六価クロム濃度の時間変化についての測定結果を図１５に示す。図１５（Ａ）は六価クロム２の初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌの場合、（Ｂ）は六価クロム２の初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌの場合、（Ｃ）は六価クロム２の初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合、（Ｄ）は六価クロム２の初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合である。なお、各図では縦軸のスケールが異なっている。六価クロム２の初発濃度が０．１と０．２ｍ mol／Ｌの場合には、実験開始から１〜２週間で六価クロム２の濃度が０近くまで減少した。また、六価クロム２の初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合には、六価クロム濃度の減少は僅かであった。一方、六価クロム２の初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合、六価クロム濃度の有意な減少はみられなかった。
【００６０】
なお、培養液３中のクロムは、六価クロム２の状態では溶液中に溶解しているが、三価クロムの状態では沈殿するので、培養液３をフィルター（０．２２μm，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）で三価クロムをろ過することにより、六価クロム２のみを抽出し、クロム濃度を分析した。クロムの定量にはＩＣＰ発光分析装置（Ｐ８０００、HITACHI社）を使用した。
【００６１】
次に、各初発濃度における菌濃度の時間変化についての測定結果を図１６に示す。なお、図中縦軸は、クロム還元菌１を含む菌全体（クロム還元菌１以外の雑多な菌も含む）の濃度（cells／ｍＬ）である。また、図中右上四角枠内の数値（０．１／０．２／０．５／１．０）は、六価クロム２の初発濃度（ｍ mol／Ｌ）を示している。図１６（Ａ）は土壌Ａについての測定結果、図１６（Ｂ）は土壌Ｂについての測定結果である。
【００６２】
六価クロム初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌ以下の場合、培養後半では六価クロム２の濃度がほぼゼロになっている（図１５（Ａ）（Ｂ））ことから、図１６（Ａ）（Ｂ）の０．１、０．２ｍ mol／Ｌで増えている菌は、雑多な菌も含まれていると考えられる。一方、六価クロム初発濃度０．５ｍ mol／Ｌの場合、培養後半でも六価クロム２が維持されている（図１５（Ｃ））ので、図１６（Ａ）（Ｂ）の０．５ｍ mol／Ｌで増えている菌は、クロム還元菌１であると考えられる。すなわち、土壌Ａ、土壌Ｂに含まれるクロム還元菌１は、与えられた培養液３環境において、少なくともそれぞれ、１．４×１０９cells／ｍＬ、６×１０８cells／ｍＬまで増殖できることが確認できた。
【００６３】
なお、六価クロム２が培養液３中に残っているにもかかわらず、微生物１の増殖が止まっているのは、六価クロム２が微生物１の増殖に直接関与しない物質である（即ち、微生物が呼吸するのに六価クロム２を必要とするのではなく、微生物１の発酵の過程で六価クロム２を還元する）証であり、おそらくは増殖に必要な有機物が使い尽くされたためと考えられる。
【００６４】
一方、六価クロム２の初発濃度１．０ｍ mol／Ｌの場合、ここで増えているのはクロム還元菌１と考えられる（図１５（Ｄ）より培養液３中に六価クロム２が存在しているため）が、０．５ｍ mol／Ｌの場合に比べて明らかに菌体濃度が低いことから（図１６）、１．０ｍ mol／Ｌの場合の六価クロム２は、クロム還元菌１自体の増殖を阻害していると考えられる。
【００６５】
以上より、培養液３中の六価クロム濃度が高過ぎても培養に適さないことがわかった。そして、具体的には、クロム還元菌１の集積培養の際には、０．５ｍ mol／Ｌ以下の六価クロム濃度にて、培養液３中の六価クロム２がなくならないような条件の下で培養することが好ましいことがわかった。
【００６６】
また、培養液３中の六価クロム濃度が低すぎるとクロム還元菌１以外の雑多な菌の繁殖を許してしまうことになるので、六価クロム濃度としては、最低でも雑多な菌の繁殖を抑えることができる濃度を確保する必要がある。例えば、０．１ｍ mol程度の濃度を確保することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の微生物の集積培養方法の実施形態の一例を示す概念図である。
【図２】クロム還元菌の集積培養の実験に使用した培養装置の概念図である。
【図３】クロム還元菌の集積培養の実験結果を示す図である。
【図４】培養後の微生物群の顕微鏡画像を示し、（Ａ）は比較試料についての顕微鏡画像、（Ｂ）は本発明試料についての顕微鏡画像である。
【図５】培養後の微生物がクロム還元菌であることを再確認するための実験結果を示す図である。
【図６】クロムの酸化電位の測定結果を示す図である。
【図７】銀の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図８】銅の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図９】水銀の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１０】ヨウ素の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１１】亜ヒ酸の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１２】マンガンの酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１３】ニッケルの酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１４】亜セレン酸の酸化電位の測定結果を示す図である。
【図１５】クロム還元菌による六価クロム濃度の時間変化を示し、（Ａ）は六価クロム初発濃度が０．１ｍ mol／Ｌの場合の測定結果、（Ｂ）は六価クロム初発濃度が０．２ｍ mol／Ｌの場合の測定結果、（Ｃ）は六価クロム初発濃度が０．５ｍ mol／Ｌの場合の測定結果、（Ｄ）は六価クロム初発濃度が１．０ｍ mol／Ｌの場合の測定結果である。
【図１６】六価クロム初発濃度ごとのクロム還元菌濃度の時間変化を示し、（Ａ）は土壌Ａより採取したクロム還元菌についての測定結果、（Ｂ）は土壌Ｂより採取したクロム還元菌についての測定結果である。
【符号の説明】
【００６８】
１ 培養対象微生物
２ 六価クロム（物質）
３ 培養液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養対象微生物が還元活性を有し且つ耐性のある物質を溶解させた培養液中で前記培養対象微生物を選択的に集積培養する際、前記培養対象微生物によって還元された前記物質を前記培養液中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うことを特徴とする微生物の集積培養方法。
【請求項２】
前記培養液には有機物が含まれており、前記培養対象微生物は前記有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元することを特徴とする請求項１記載の微生物の集積培養方法。
【請求項３】
前記物質は、前記培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有していることを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の集積培養方法。
【請求項４】
前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることを特徴とする請求項３記載の微生物の集積培養方法。
【請求項５】
前記培養対象微生物はクロム還元菌であり、前記物質は六価クロムであり、前記クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の集積培養方法。
【請求項６】
前記培養対象微生物はウラン還元菌であり、前記物質は六価クロムであり、前記ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の集積培養方法。
【請求項１】
培養対象微生物が還元活性を有し且つ耐性のある物質を溶解させた培養液中で前記培養対象微生物を選択的に集積培養する際、前記培養対象微生物によって還元された前記物質を前記培養液中に浸した電極に電位を与えることで酸化反応を生じさせて再生しながら培養を行うことを特徴とする微生物の集積培養方法。
【請求項２】
前記培養液には有機物が含まれており、前記培養対象微生物は前記有機物を利用した発酵の過程で前記物質を還元することを特徴とする請求項１記載の微生物の集積培養方法。
【請求項３】
前記物質は、前記培養対象微生物以外の微生物に対して毒性を有していることを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の集積培養方法。
【請求項４】
前記物質は、六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸のいずれか１つであることを特徴とする請求項３記載の微生物の集積培養方法。
【請求項５】
前記培養対象微生物はクロム還元菌であり、前記物質は六価クロムであり、前記クロム還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の集積培養方法。
【請求項６】
前記培養対象微生物はウラン還元菌であり、前記物質は六価クロムであり、前記ウラン還元菌によって還元された三価クロムを六価クロムに再生しながら培養を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の集積培養方法。
【図１】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００６−５５１３４（Ｐ２００６−５５１３４Ａ）
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２４２９３９（Ｐ２００４−２４２９３９）
【出願日】平成１６年８月２３日（２００４．８．２３）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２３日（２００４．８．２３）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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