説明

微生物またはこのサブユニット用の担体粒子、このような粒子を含む医薬組成物、この組成物の調製方法および動物の治療におけるこの使用

本発明は、微生物および/またはこのサブユニットを含有する親水相を含み、親水相が室温において固体である疎水連続相中に分散しており、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含む担体粒子に関する。本発明はまた、前記粒子を含む医薬組成物、医薬組成物の調製方法および動物の治療におけるこの組成物の使用に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物および/またはこのサブユニット用の担体、この担体を含む医薬組成物、医薬組成物の調製方法、ならびに動物を微生物関連疾患について治療するためのこの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
疾患、特に伝染性感染性疾患から(ヒトを含む)動物を保護するにあたり、例えば野生型微生物による感染に直面した場合、動物に能力を発揮させ、防御応答を効果的に発現させるため、疾患に関連する1種以上の微生物(即ち、細菌およびウイルスを含むミクロンまたはサブミクロンサイズの生活形)および/またはこのサブユニット(一般に「抗原」と呼ばれる。)を含む医薬組成物、例えばワクチンを投与することは慣習的である。この目的のため、微生物が組成物中で使用される場合、微生物は生存形であるが非毒性形(「弱毒生」と称されることが多い。)または不活化形(「死滅」形)で投与されることが慣例である。微生物のサブユニット、即ち、動物内で微生物自体に対して免疫応答を誘導することができる抗原決定基を構成する微生物の一部を使用することも一般的である。例えば、一般に使用される細菌のサブユニットは、外膜タンパク質の一部である。死滅微生物および/またはサブユニットが使用される場合、標的動物内で免疫応答を刺激する成分が添加されることが多い。このような免疫応答刺激成分は、通常、「アジュバント」という用語により称される。様々な種類のアジュバントが公知である。これらのアジュバントの多くは、免疫刺激剤として鉱油をベースとする。これらの油は、水と配合されてエマルションを形成することが多い。相が不連続相であるか連続相であるかに応じて、エマルションの幾つかの種類を区別することでき、例えば、W/O(水滴が油中に分散している。)、O/W(油滴が水中に分散している。)またはW/O/Wエマルション(水滴が油滴中に分散しており、さらに油滴が水中に分散している。)などである。アジュバント配合物は、医薬組成物中の微生物および/またはこのサブユニットを運搬する担体手段として使用することができる。担体は、微生物またはサブユニット自体の安定性に関してだけでなく、医薬組成物の物理的構成に関しても、貯蔵中に安定性を提供することが重要である。さらに、担体により容易な投与が可能になるべきであり、例えば、注射が好ましい経路である場合は低粘度が可能になるべきである。また、例えばエネルギーの最小量が製造時に費やされるほど、担体により医薬組成物の容易な配合が可能になることが重要である。この容易な配合は、エネルギーの取込みが通常、(少なくとも局所的な)温度増加を導き、この温度増加が微生物およびサブユニットの不可逆的変化を導くことが多く、さらに、治療される動物内での適切な免疫応答の誘導能の損失を導き得るので重要であり得る。
【0003】
EP 1 179 349から、貯蔵中に安定性を提供し、(低粘度に起因して)注射による容易な投与が可能になり、配合が容易である微生物および/またはこのサブユニット用の担体手段が公知である。この公知の担体手段は、液体脂またはワックスをベースとする連続油相中に分散水相を含む。油相は、チキソトロピー効果を提供する二酸化ケイ素粒子をこの相中に含む。このように、油相は、機械的に離隔された場合、油滴の凝固傾向が高度に低減するので、エマルションの極めて良好な機械的安定性を提供する高度に粘性である相と同様に挙動する。振とうされた場合、エマルションにより注射を介する投与が可能になるほど粘度が降下する。また、二酸化ケイ素粒子を含む油相が撹拌された場合、粘度は極めて低くなる。従って、チキソトロピー油相により、過剰なエネルギーの取込みなしで容易な配合が可能になる。しかしながら、この公知の担体は、幾つかの重要な欠点を有する。第一に、二酸化ケイ素は毒性、病変および膿瘍を伴うことが多い。従って、医薬組成物用の担体に適用することは好ましくない。さらに、レシピエントの体内の固体粒子の貯留物があまり認識されない。ヒト適用については、一般にリスクが高すぎるとみなされており、種畜における適用については、貯留物がヒト消費に好適ではない部位を導き得る。第二に、油相のチキソトロピー特性は、油相がもはや機械的に乱されていない場合、高粘度のほぼ即時的な再生を提供する。この高粘度のほぼ即時的な再生は、注射による投与にとって実用的ではなく:充填された注射器を実際の注射直前に十分に振とうしなければならない。それというのも、十分に振とうしなければ円滑な注射方法にとっては粘度が高すぎるからである。この「注射器を注射前に十分に振とうすること」は、医師または獣医師にとって慣用的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】欧州特許第1 179 349号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、従来技術の担体手段の欠点を克服または少なくとも緩和し、同時にこの担体手段の利点を可能な限り多く提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
この目的のため、微生物および/またはこのサブユニットを含有する親水相を含み、親水相が室温において固体である疎水連続相中に分散しており、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含む粒子である、担体粒子を発明した。本発明による粒子において、微生物および/またはサブユニットは、親水相(この意味における親水は、水との混合後に均質な一相混合物を形成することができるような水との親和性を有することを意味する。)中に含有され、親水相が、連続疎水相(疎水は、親水の反対である。)中に分散しており、疎水相が、室温、即ち25℃において固体である。疎水相が室温において固体であるという事実は、少なくとも室温まで極めて良好な物理的安定性を提供する。本発明の極めて重要な態様は、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含むことである。一般に知られている通り、一次転移は不連続転移、即ち転移点におけるエントロピーの不連続変化を伴う転移である(P.Ehrenfest,Proc.Acad.Sci.Amsterdam,36,153,1933を参照のこと)。一次転移は、転移を受ける化合物についての特性の急変に対応する。転移のこの種類の例は、氷から水への融解である。氷が融解するにつれて、HO分子内の「次数」が変化し、転移点を超える温度および転移点未満の温度において完全に異なる特性が物質に提供される。本発明において、固液変換は一次転移を含むので、転移点を超える温度において粘度の極めて急激な降下を提供することができる。温度が、転移が生じる温度を超える温度に保持されている限り、粘度は低いままとすることができる。粘度を低いままとすることにより、一次転移が生じる温度をちょうど超える温度においてエマルションの容易な配合が可能になる。室温を超える温度における二次以上の転移(より正確には:連続転移)の場合、相の粘度は徐々に降下するにすぎず、このことは、比較的高いエネルギーの取込みが通常の結果であることを意味する(相が比較的高温に加温され、または粘度が比較的高いからである。)。本発明の意味における用語「固体」は、「自己担持(self−bearing)」、即ち、「固体」組成物がこのようにみなされている場合、この物理的環境(例えば、「固体」が配置されている容器の形状)とは独立してこの形状を肉眼上保持するのに十分な内部強度を有することを意味することが留意される。本特許の意味における「液体」は、「液体」組成物がこのようにみなされている場合、この形状を保持するのに不十分な内部強度を有し、形状がこの物理的環境(例えば、「液体」が配置されている容器の形状)によりほぼ即時的に決まることを意味する。例えば、ゴム製バウンスボール(変形可能であるが)、ガラス片(非晶質ゆえ粘性であるが)および一部のゲル化流体(例えば、コンクリート、流体を含有するが)は、本特許出願の意味における固体であるとみなすことができる一方、糖蜜、サンタンクリームおよびパンケーキ生地(これらは、いくぶんのせん断力に耐えることができるが)のような組成物は、本特許出願の意味における液体であるとみなすことができる。「固体」は、固体組成物中の各化合物が固体構成でなくてはならないことを必ずしも意味するものでないことが特に留意される。例えば、固体ゲルの場合、組成物に自己担持特性を付与する分子の網目が組成物における実際の質量の10%にすぎない一方、網目の間隙は液体により充填されている(従って、液体が組成物の90%を形成している。)ということがあってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】Witepsol E85のDSCイメージである。
【図2】本発明による担体粒子の写真である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
一実施形態において、一次転移は、疎水相中に含まれる結晶化合物、即ち、各次元における均質な構造を有する構成(しかし、各次元については必ずしも同一ではない。)を凝結後に形成することができる化合物の融解方法に対応する。このような化合物は、結晶化温度未満の温度においてこの固有の安定性およびこの融解温度を超える温度においてより低次の構成へのこの極めて迅速な変化が付与されるので、本発明による担体粒子における適用に極めて好適であることが考えられる。
【0009】
さらなる実施形態において、化合物は、代謝化合物、特に脂肪酸エステルである。代謝化合物、例えば天然ワックス、例えばヤシ油(融点±26℃)、パーム油(融点±35℃)および羊脂(融点±42℃)は、代謝により、特に標的動物の代謝により変化することができる特性を有する。この代謝による変化は、例えば鉱油が担体手段に使用される場合に慣例である貯留物の問題を緩和または完全に解決しさえする。この意味におけるワックスは、室温において固体であり、凝結後に通常結晶を形成し、手でこすると広がり、75℃未満の融点を有する物質と定義される。
【0010】
別の実施形態において、親水相は、水および追加の化合物を含む。水は、最も一般に使用される抗原用担体であり、実際、水は医薬組成物中の構成成分として極めて許容されるものである。この実施形態において、第2の化合物は、水に隣接して存在する。第2の化合物が水に隣接して存在することは、微生物またはサブユニット自体の安定性の改善を導くことができると考えられる。さらなる実施形態において、追加の化合物は、ポリアルコール、好ましくはグリセロールである。
【0011】
別の実施形態において、疎水相は第2の微生物および/またはこのサブユニットを含有し、第2の微生物および/またはこのサブユニットは、第1の微生物および/またはこのサブユニットと同一であっても異なっていてもよい。この実施形態により、粒子のより大きい部分を微生物および/またはこのサブユニットの実際の運搬に使用することができるので、抗原による粒子のより高い負荷が可能になる。さらに、接触した場合に反応し、例えば動物に投与した場合に不十分な免疫応答を導く微生物またはサブユニットは、これらを2つの別個の相中に配置することにより離して保持することができ、含有物交換の耐久性が優れており、本発明の担体粒子についても同様である。また、抗原を2つの別個の相中に配置することにより、抗原放出のタイミングの差異を提供することができる。この抗原放出のタイミングの差異の提供により、例えば、適用後にプライマー/ブースター投与の効果を模倣するワンショット医薬製剤の配合が可能になる。
【0012】
本発明はまた、本発明による担体粒子を含む動物治療用の医薬組成物に関する。この場合における動物治療は、胎内の動物、例えばニワトリ胚の治療をも含む。粒子はこれ自体使用することができ、例えば融解滴の形で動物に投与することができるが、一実施形態において、医薬組成物は、上記定義の担体粒子が分散している連続親水相を含む。この組成物の粘度は、相当部分が第2の親水相の粘度により決まり、第2の親水相は、例えば、1種以上の他の流体と場合により組み合わせられており、医薬的に許容される、特に治療すべき動物内で肉眼上確認可能な組織損傷を惹起しないオスモル濃度を親水相に付与する溶解および/または分散材料を場合により含む水であってよい。この組成物の粘度は、相当部分が第2の親水相の粘度により決まるという事実は、粘度が主として系の機械的乱れにより決まる従来技術の医薬組成物と比べて重要な改善である。本発明の意味における「治療」は、疾患またはこの疾患に関連する徴候の予防、診断、治癒および軽減を提供することを目的としてなされる行為を含むことが留意される。本明細書において上記の成分とは別に、(2つまたは3つの別個の相の1つ以上において)医薬組成物は、助剤の全ての種類、例えば、乳化剤、安定剤、酸化防止剤、アジュバント(例えば、アルミニウム塩、免疫刺激複合体、サポニン、リポ多糖の誘導体、マイコバクテリアなど)、診断目的用の追跡化合物、緩衝用または他の目的のための塩などを含むことができる。
【0013】
EP 1 097 721から、担体としてW/O/Wエマルションを含み、疎水相(「O」)は室温未満の温度において固体である、良好な貯蔵安定性を有する医薬組成物が公知であることが留意される。しかしながら、室温において、この公知の組成物の疎水相は液体である(実際、全ての例示組成物において、疎水相は0℃ほどの低温においても液体である。)。室温において液体であることに次いで、室温を超える温度において疎水相は一次転移を受けず、(過剰な機械的労力なしでW/Oエマルションの配合を可能にするため)疎水相を疎水相の主要構成成分の融解温度を超える53℃から125℃の範囲の比較的高温に加熱することを要する。従って、この組成物は、EP 1 179 349から公知である組成物よりも本発明からさらに遠くに除外される。
【0014】
一実施形態において、疎水相は、動物の体温に関する所定温度において一次転移が生じるように構成されている。この実施形態は、微生物および/またはサブユニットの放出を高度に制御することができるという極めて重要な利点を有する。即ち、本出願人は、放出が標的動物内で一次転移が生じるモーメントもしくは速度に依存し、または標的動物内で一次転移が生じるか全く生じないかにさえ依存することを認識した。さらに、放出は、担体粒子が投与後に存在する部位(例えば、医薬組成物が筋肉内投与される場合は筋肉内の部位、経口投与される場合は胃腸管内の部位、血管内投与される場合は血中の部位)における体の温度に実質的に依存する。これらの見識が本出願人により組み合わせられ、一次転移が生じる温度が、標的動物の体温に関する結果でなく、この動物の体温(即ち、担体粒子が医薬組成物の投与後に局在化する部位において生じる温度)から数度離れていることまたはこの動物の体温と同一であることの所望により実際決まるこの実施形態を発明する基礎として機能した。
【0015】
一実施形態において、一次転移は、動物の体温未満の温度において生じる。この実施形態において、抗原の放出は、動物に投与後、組成物が容易に加温されて体温に到達することができる事実が付与され、疎水相がほぼ即時的に、または少なくとも極めて速やかに液体になるので比較的迅速であり得る。固液転移後、得られたW/Oタイプのエマルションが不安定である場合、抗原の放出はほぼ即時的である。エマルションが安定であればあるほど、抗原材料が全て動物体に放出されるまで長くかかる。幾つかの場合において、エマルションの安定性が優れている場合、放出は、例えば合計3ヵ月ほど長くかかり得る。
【0016】
別の実施形態において、一次転移は、動物の体温において生じる。この意味における「体温において」は、担体粒子が医薬組成物の投与後に局在化する部位における動物体の温度と1度以下で異なることを意味する。こうして、緩慢な長期持続放出を(とりわけ、一次転移が生じた後に得られるエマルションの安定性に依存する期間)提供することができ、例えば、いわゆるプライム−ブーストワクチン接種により得られる応答と同等である動物内での免疫応答を創出する。
【0017】
さらに別の実施形態において、一次転移は、動物の体温を超える温度において生じる。こうして、極めて緩慢な放出または放出の延長さえも提供することができる。例えば、動物が発熱している場合に動物体内において到達するにすぎない一次転移が生じる温度を選択することが可能である。実際の転移が生じる前、例えば、固体疎水相への抗原の拡散を介する放出が考えられる。とりわけ、このような拡散は、抗原の種類および疎水相の種類に依存し、中間速度により、または比較的早く完全に妨害し、または極めて遅延させることができる。この実施形態における放出のための代替経路は、疎水相が動物により代謝される場合に提供することができる。こうして、放出のための経路を担体粒子において創出することができる。これらの実施形態は、例えば、放出を合計3ヵ月を超えて行うべき場合、または、例えば、動物が発熱を発症するまで、もしくは(局所的な)温度上昇を誘導する別の方法を受けるまで延長すべき場合に使用することができる。
【0018】
本発明はまた、微生物および/またはこのサブユニットを第1の親水相中に混合すること、得られた混合物を、室温を超える温度において固液変換を受けることができる疎水相中で、固液変換が生じる温度を超える温度において乳化し、連続疎水相中の親水相滴の単一エマルション(即ち、1つの相が別の相中に分散しているエマルション)をもたらすこと、得られた単一エマルションを固液変換が生じる温度を超える温度において第2の親水相と混合し、第2の親水相が医薬組成物の連続相になる二重エマルション(即ち、1つの相が別の相中に分散しており、この別の相はさらに別の相中に順次分散しているエマルション)をもたらすこと、および二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度に冷却することを含む、医薬組成物を調製する方法に関する。
【0019】
この調製方法の一実施形態において、第2の親水相は、非水性化合物、好ましくはポリアルコール、より好ましくはグリセロールを含む。こうして、本出願人は、分散疎水滴が小サイズ(典型的には50μm未満)および極めて狭い粒子分布、例えば20μm±10μm(d95、体積平均)を有する二重エマルションを得ることができることを見出した。
【0020】
一実施形態において、冷却は、二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度を有する流体を含有する水と混合することにより行う。この冷却は、医薬組成物を得る極めて便利な手段である。
【0021】
本発明はまた、動物を微生物関連疾患について治療するための、本明細書において上記の医薬組成物の使用に関する。
【0022】
本発明は、微生物またはこのサブユニットの特定の種類に限定されないことが留意される。原則として、本発明は、任意の微生物および/またはこのサブユニットと組み合わせて使用することができる。本発明を、目下のところ、本明細書において下記の実施例および図面を使用することによりさらに説明する。
【0023】
実施例1 本発明による担体粒子および医薬組成物を調製する方法。
【0024】
実施例2 アクチノバチルス・プルロニューモニア(Actinobacillus pleuropneumoniae)(APP)抗原を含有する担体粒子の使用。
【0025】
実施例3 ブタサーコウイルス(Porcine circo virus)抗原を含有する担体粒子の使用。
【0026】
実施例4 トリウイルスおよび細菌抗原を含有する担体粒子の使用。
【0027】
実施例5 担体粒子の疎水相の特性決定。
【0028】
図1 Witepsol E85のDSCイメージ
図2 本発明による担体粒子の写真。
【実施例1】
【0029】
本実施例においては、本発明による担体粒子および医薬組成物を得る方法を記載する。最初に、Inutec SP1界面活性剤(Orafti,Belgium)0.44gを緩衝溶液10.56gに添加することにより緩衝溶液を作出する。得られた混合物(「混合物1」)を、磁気撹拌子を使用して1時間撹拌する。次いで、混合物1を撹拌することなく121℃において1時間高圧滅菌する(Varioklav,H+P Labortechnik,Germany)。この後、高圧滅菌を止め、ドアを開放し、混合物1を撹拌しながら48℃に冷却させておく。この冷却を約1から2時間行う。
【0030】
混合物1の冷却工程の間、7.83gのWitepsol E85(Sasol,Germany)を0.16gのArlacel P135(Uniqema,The Netherlands)に添加することにより次の混合物(「混合物2」)を作出し、混合物を50℃に加熱し、次いで混合物を、油性溶液に好適なフィルター(このようなフィルターは、例えば、Pall、Sigma AldrichおよびMilliporeから入手可能である。)による0.22μm濾過により滅菌する。得られた混合物2を使用まで48℃において貯蔵する。
【0031】
抗原の滅菌混合物は、抗原を滅菌緩衝液中に入れることにより調製する。緩衝液中の抗原の量は、最終ワクチン中の抗原単位の所望量に依存する。この抗原混合物(「混合物3」)は、使用まで室温において貯蔵する。
【0032】
混合物3は、約60℃の温度を有する水のバッチを使用することにより48℃に迅速に加熱する。加熱工程は、好ましくは、5分未満で行うべきである。その間、混合物2 7.26gをウルトラタラックス(ultra turrax)(T25B,IKA Labortechnik,Germany)を24.000rpmで使用して48℃において均質化する。混合物3 4.84gを混合物2 7.26gにゆっくり添加することにより次の混合物を調製し、この調製は約2分間で行うべきである。得られた混合物を、混合物(「混合物4」)の質が許容されるものになるまで24.000rpmで均質化する。質は、48℃をわずかに超える温度に予熱した対物ガラス(試料プレートとも称される。)を使用する標準的な光学顕微鏡(Olympus BX50)を使用することにより確認される保温生成物の質である。混合物の質は、抗原相滴の95%が5μmより小さい場合に許容される。混合物4は、48℃において10分間貯蔵する。
【0033】
次いで、混合物1を、ウルトラタラックス(T25B)を24.000rpmで使用して48℃において均質化する。この混合物1に、混合物4 11.00gを3分間ゆっくり添加する。均質化は、規格が合致したらすぐに停止する。規格は:粒子の99%が80μmより小さい(上記光学顕微鏡により確認)。得られた生成物(「混合物5」)は、48℃において短時間(典型的には5分未満)貯蔵する。この生成物は、油(疎水性Witepsol)が液体であるW/O/Wエマルションである。混合物5中の油滴の密度は、比較的高い。混合物5の冷却後の油滴の凝集を防止するため、固体球状物にするための滴の冷却に滴の希釈が伴うように、混合物を緩衝化し連続撹拌した溶液中で冷却する。この緩衝化溶液は、混合物1を調製するために使用した緩衝液と同一の緩衝液中のホルムアルデヒド10%溶液0.54g、アジュバントMicrosol Diluvac Forte(「MDF」アジュバント、製品Myco Silencer OnceおよびEnd−FLUence2に使用されるもの、Intervet USA)11.44gおよび混合物1を構成するために使用した緩衝液と同一の緩衝液66.65gを混合することにより作出し、この混合物を5℃に冷却する。この混合物(「混合物6」)を100rpmで撹拌する(Euro−STP CV撹拌機、IKA Labortechnik,Germany)。この混合物6に、(48℃において貯蔵していた)混合物5 20.00gを添加する。得られた医薬組成物を8℃未満において保持し、バイアル中に充填し、ワクチン接種まで2から8℃において貯蔵する。MDFアジュバントに代えて、アジュバントを取り除き、アジュバントを例えば緩衝化滅菌水により置き換えること、または任意の他のアジュバント、例えば、EP 382271またはEP 1613346に記載のアジュバントの1種以上を使用することを決定することができることに留意されたい。
【実施例2】
【0034】
本実験のため、市販のワクチンPorcillis APP(Intervet,Boxmeer,The Netherlandsから入手可能)から公知である抗原、即ちApxI、ApxII、ApxIIIおよびOMPを使用した。これらの抗原を滅菌Tris−HCl緩衝液(40mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン、HClによりpH7.5にした)中に入れ、実施例1に概説した混合物3を得た(注:同一の緩衝液を使用して混合物1を得る。)。この混合物3は、1ml当たり各抗原250Unitを含有した。この混合物3は、最終的に、市販製品の1ml当たり25Unitと比べて1ml当たりAPP抗原10Unitを含有する配合物をもたらした。
【0035】
試験に使用した動物は6週齢の仔ブタであった。6匹の仔ブタは、本明細書において上記の通り得られた配合物1mlを頸部筋肉内注射により受けた。ブースターワクチン接種を4週間後に行った。6匹の仔ブタに、6および10週齢において、市販のPorcillis APPワクチンをワクチン2mlの頸部筋肉内注射により与えた。6匹の仔ブタの対照群には、6および10週齢において、リン酸緩衝生理食塩水2mlを頸部筋肉内注射により与えた。動物を、局所反応、直腸温、臨床徴候およびアクチノバチルス・プルロニューモニアに対する抗体価について試験した。
【0036】
APPワクチンを与えた仔ブタ数匹は、第1および第2のワクチン接種後、穏やかな臨床徴候、例えば、震え、嘔吐および/または呼吸の増加、ならびに時折局所反応を示した。本発明による担体粒子を含む配合物を与えた動物は、対照動物の場合と同様、臨床徴候または局所反応を全く示さなかった。直腸温は、対照動物と比較した場合、担体粒子を含む配合物についてわずかに上昇した。最大の差異は、第1のワクチン接種後が0.7℃であり、第2のワクチン接種後が1.1℃であった。この差異は、許容レベル内であり、Porcillis APPが投与されている場合の直腸温増加と等しく、またはこの直腸温増加より小さくさえある。得られた抗体価を表1に示す。これらの力価は、市販製品Porcillis APPにより得られた力価に関して正規化する。
【0037】
【表1】

表に示されている通り、Porcillis APPワクチン2mlと比較して、新規配合物1mlの投与により抗原の約20%のみを注射したという事実に関わらず、力価は同等であり、またはわずかに改善さえしている。
【実施例3】
【0038】
本実験のため、ブタサーコウイルス2型抗原を使用した。これらの抗原は、当分野において公知である、例えばWO2007/028823に記載のバキュロウイルス発現系内で発現される、ORF2によりコードされるPCV2のタンパク質である。SF−900 II SFM培地(Invitrogen,USAから入手可能)中で緩衝化したホールセル溶解物を使用して実施例1に概説した混合物3を得た。この混合物は、抗原100.000(Elisa)Unit/mlを含有する(これらのUnitの2.5E03はORF2によりコードされるタンパク質20μgに等しい。)。最終配合物を得るため、実施例1による方法を以下の通り変更して続けた:混合物1を得るため、Inutec0.20gをSF−900 II SFM(緩衝液として)9.80gに添加し;混合物2を得るため、Witepsol H185 9.80gおよびArlacel P135 0.20gを使用し;混合物4を得るため、混合物3 5.00グラムおよび混合物2 5.00グラムを使用し;混合物5を得るため、混合物4 10.00グラムを混合物1に添加し;混合物6を得るための緩衝溶液を、PCV抗原濃縮物(221528U/g含有)0.68グラムを16.72gのMDFおよび35.32gのSF−900 II SFMと混合することにより作出し;この緩衝溶液に混合物5 6.00グラムを添加して混合物6を得た。この混合物6は、最終的に、1mlの生成物当たり、PCV抗原2500UnitをW/O/W二重エマルションの疎水相中に含有し、PCV抗原2500UnitをW/O/W二重エマルションの連続親水相中に含有する配合物をもたらした。
【0039】
試験に使用した動物は2週齢の仔ブタであった。10匹の仔ブタは、実施例1により得られた配合物2mlを頸部筋肉内注射により受けた。10匹の仔ブタに、1用量当たり5000Unitを含有する、WO2007/028823により作出したPCVワクチンをワクチン2mlの頸部筋肉内注射により与えた。これらの仔ブタは、第1のワクチン接種から2週間後にブースターワクチン接種と同一のワクチン接種を受けた。10匹の仔ブタの対照群には、SF−900 II SFM2mlを頸部筋肉内注射により与えた。動物を、公知ワクチンによるブースターワクチン接種8週間後まで局所反応およびブタサーコウイルスに対する抗体価について試験した。
【0040】
新規配合物を受けた仔ブタの数匹(3匹)について、この配合物の残存物が実験終盤においていくらか可視的であった。新規ワクチン接種により得られた抗体価の発現は、ブースターワクチン接種を与えていないという事実に関わらず、得られた力価レベルが公知ワクチンにより得られるレベルの約80%の最大値(対数スケール上)に限定されてはいるが、公知ワクチンとほぼ同一であった。依然として、これらの力価は仔ブタ保護を顕著なレベルで提供するのに十分である。
【実施例4】
【0041】
本実験のため、ウイルスおよび細菌トリ抗原の組合せを使用する。これらの抗原は、ワクチンNobilis IB multi+ND+EDS(第1のウイルスワクチン)、Nobilis RT Inac(第2のウイルスワクチン)およびNobilis Salenvac T(細菌ワクチン)(全て、Intervet,Boxmeer,The Netherlandsから入手可能)中に存在する抗原と同一の抗原である。最終配合物は、生成物1ml当たり、市販ワクチンの場合と同一の抗原量を含有する。この配合物を得るため、最初の2種の(ウイルス)ワクチンの抗原を8.56グラムの滅菌水中に懸濁させて混合物3を得た。混合物1は、0.96グラムのInutec SP1および滅菌水(緩衝化せず)47.04グラムを使用することにより作出した。混合物2は、Witepsol E85 24.50グラムおよびArlacel P135 0.50グラムを使用することにより得た。混合物4は、混合物3 16.5グラムおよび混合物2 16.50グラムを使用することにより得た。混合物5は、混合物1および3それぞれ33.0グラムを使用することにより得た。混合物6を得るための緩衝溶液は、Trometamol(Merck,Germanyから入手可能)0.26グラム、マレイン酸(Sigma Aldrichから入手可能)0.25グラム、塩化ナトリウム(Merckから入手可能)0.90グラム、滅菌水79ml、水酸化アルミニウムゲル(Brenntag Nordic,Swedenから入手可能)27.50グラムおよびNobilis Salenvac T中に存在する死滅サルモネラ菌を混合することにより作出した。混合物6は、最終的に、この溶液の他、混合物5 22.00グラムを使用することにより得た。
【0042】
この配合物を使用して4週齢のニワトリにワクチン接種した。10羽のニワトリの第1群に、新規配合物0.5mlにより左胸筋中にワクチン接種した。10羽のニワトリの第2群は、市販ワクチンNobilis IB multi+ND+EDSおよびNobilis RT Inacを受けた。10羽のニワトリの第3群は、市販製品Nobilis Salenvac Tを受けた。トリをワクチン接種4および6週間後に採血し、回収した血清を抗原に対する抗体について試験した。新規組合せ配合物を既存製品と比較した場合、IB、RTおよびサルモネラ抗原に対して良好な抗体価を得ることができたことは明らかである。しかしながら、EDSおよびND抗原に対する抗体価は、既存製品により得られる力価と比較した場合、低かった。
【実施例5】
【0043】
本発明による担体粒子の疎水相における使用に好適な材料は、室温を超える温度において固液変換を受けなければならず、変換は一次転移を含む。このような材料は、例えば、実際に一次転移を含む転移か否かを判断するため、示差走査熱量測定計(DSC)、例えばPerkin Elmer DSC7において室温を超える融点または融解範囲を有すると考えられる材料を選別することにより見出すことができる。このような転移を検出するのに好適な方法は、例えば、試料を5℃/分の速度においてこの融解温度を10℃を上回って超える温度に加熱し、次いで試料を同一速度において10℃に冷却することによりあらゆる熱履歴作用を除外する第1の加熱サイクルに試料を供することである。次いで、第2の加熱サイクルを使用して、材料が室温を超える温度において一次転移を受けるか否かを確かめる。この加熱サイクルは、試料を5℃の速度においてこの融解温度を10°超える温度に加熱し、次いで試料を同一速度において10℃に冷却することを含むことができる。この方法を、本発明による担体粒子の構成に好適な材料を選択するために使用した。図1に、同一方法を使用することにより得たWitepsol E85のDSCダイアグラムを示す。
【0044】
図1
図1は、実施例5により計測したWitepsol E85のDSCダイアグラムを示す(X軸は温度(℃)を示し;Y軸は熱流H(任意単位)を示す)。Witepsol E85は、この材料が10℃から約60℃に加温された場合に種々の転移を生じる化合物の混合物である。融解ピークAの非対称形状が付与されるので、Witepsol化合物を融解させた場合に2つの一次転移が生じる。融点は、それぞれ約40および47℃である。さらに、約35℃において、この温度においてわずかな「ふくらみ」およびピークA)の左から右に移行した場合にベースラインの上昇が付与されるので、より高次の転移が生じることが考えられる。全体として、これらの転移は、30℃付近において始まり、50℃付近において終わる1つの幅広ピークとして現れる。融解材料を冷却した場合、融解材料は35℃をちょうど超える温度において結晶化し始める。2つの区別される結晶化ピークBが、一方は33℃付近において、他方は24℃付近において測定されるという事実は、Witepsol E85を融解させた場合に見られる2つの一次転移の出現に対応する。
【0045】
本実施例においてWitepsol E85およびH185を本発明による担体粒子を構成するために使用したが、疎水性であり、室温を超える温度において固液変換(変換は一次転移を含む。)を受ける限り、他の材料を使用することができることが明白であり得る。このような材料は、例えばWitepsol H5(融解範囲約34から36℃)または分枝鎖アルコール、例えばISOFOL28(融解範囲32から39℃)およびISOFOL32(融解範囲44から48℃)である。ISOFOL28およびISOFOL32の2つの材料は、Sasol(Germany)から入手することもできる。他の好適な材料は、例えば水素化油、例えば、水素化ヒマシ油、パルミチン酸セチル、高融点オレイルアルコール(最大35℃)、多数のトリグリセリドおよびCognis(Monheim Germany)からNovataの商標(同社のPharmalineの一部)で入手可能な硬化脂またはCognisからさらに入手可能な植物系ステアリン酸/パルミチン酸のEdenor L2 SM GSである。他の材料は、例えば、室温において液体であるが、室温を超える温度において(一次転移を受けて)融解する結晶ゲル化剤を含む油である。こうして、疎水材料の主要成分は液体であるが、ゲル化剤のゲル化分子の網目の間隙に収容される。このようなゲル化油は、実際、ゲル化剤の融解後に流体になる(半)固体担体粒子である。好ましくは、疎水相の構成に使用される材料は医薬的に許容されるものであり、即ち、これらの材料は医薬組成物中で投与された場合に顕著な物理的問題を誘発しない。より好ましくは、材料は医薬賦形剤と認識される。実務上、特に哺乳動物における使用について、一次転移のための典型的な温度は60℃未満である。
【0046】
図2
図2は、本発明による担体粒子の顕微鏡写真である。実施例2において得られた粒子のエマルションを1000rpmで39℃の温度において15分間撹拌する。次いで、試料を取り出し、光学顕微鏡に好適な透明試料プレート上に配置する。浸漬油を添加し、試料を第2の透明試料プレートにより被覆する。次いで、標準的な光学顕微鏡の透過モードにおいて標準的な光源を使用して図1に表す像を得ることができる。図2の最小粒子は、直径約5μmである。中央の大きい粒子は、約50μmの直径を有する。これらの粒子は、疎水連続相からなり、疎水連続相中に分散している水性滴を有し、水性滴は典型的には0.5から5μmのサイズであり、APP抗原を含む。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
微生物および/またはこのサブユニットを含有する親水相を含み、親水相が室温において固体である疎水連続相中に分散しており、疎水相が室温を超える温度において固液変換を受けるように構成されており、変換が一次転移を含む担体粒子。
【請求項2】
一次転移が、疎水相中に含まれる結晶化合物の融解方法に対応することを特徴とする、請求項1に記載の担体粒子。
【請求項3】
化合物が、代謝化合物、特に脂肪酸エステルであることを特徴とする、請求項2に記載の担体粒子。
【請求項4】
親水相が、水および追加の化合物を含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれかに記載の担体粒子。
【請求項5】
追加の化合物が、ポリアルコール、好ましくはグリセロールであることを特徴とする、請求項4に記載の担体粒子。
【請求項6】
疎水相が、第2の微生物および/またはこのサブユニットを含有することを特徴とする、請求項1から5のいずれかに記載の担体粒子。
【請求項7】
請求項1から6のいずれかに記載の担体粒子を含む、動物治療用の医薬組成物。
【請求項8】
担体粒子が分散している連続親水相を含む、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項9】
疎水相が、一次転移が動物の体温に関する所定温度において生じるように構成されていることを特徴とする、請求項7または8に記載の医薬組成物。
【請求項10】
一次転移が、動物の体温未満の温度において生じることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項11】
一次転移が、動物の体温において生じることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項12】
一次転移が、動物の体温を超える温度において生じることを特徴とする、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項13】
微生物および/またはこのサブユニットを第1の親水相中に混合すること、
得られた混合物を、室温を超える温度において固液変換を受けることができる疎水相中で、固液変換が生じる温度を超える温度において乳化し、連続疎水相中の親水相滴の単一エマルションをもたらすこと、
得られたエマルションを固液変換が生じる温度を超える温度において第2の親水相と混合し、第2の親水相が医薬組成物の連続相になる二重エマルションをもたらすこと、
二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度に冷却すること
を含む、医薬組成物を調製する方法。
【請求項14】
第2の親水相が、非水性化合物、好ましくはポリアルコール、より好ましくはグリセロールを含むことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【請求項15】
冷却を、二重エマルションを固液変換が生じる温度未満の温度を有する流体を含有する水と混合することにより行うことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項16】
動物を微生物関連疾患について治療するための、請求項7から12のいずれかに記載の医薬組成物の使用。

【図1】
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【図2】
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【公表番号】特表2011−504906(P2011−504906A)
【公表日】平成23年2月17日(2011.2.17)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−535364(P2010−535364)
【出願日】平成20年11月26日(2008.11.26)
【国際出願番号】PCT/EP2008/066188
【国際公開番号】WO2009/068545
【国際公開日】平成21年6月4日(2009.6.4)
【出願人】(506196247)インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Fターム(参考)】