微生物または生物由来物質含有微細粒子およびその製造方法
【課題】微生物または生物由来物質を含有し、保存安定性に優れた微細粒子を提供する。
【解決手段】最外殻層と、中間層と、芯部とからなる３重構造を有する粒子であって、前記最外殻層が、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、前記芯部が、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなり、粒子全体の水分量が５％以下、かつ水分活性が０．５以下であることを特徴とする微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【解決手段】最外殻層と、中間層と、芯部とからなる３重構造を有する粒子であって、前記最外殻層が、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、前記芯部が、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなり、粒子全体の水分量が５％以下、かつ水分活性が０．５以下であることを特徴とする微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば動物用経口ワクチンに好適に用いることができる、微生物または生物由来物質を含有する微細粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物または生物由来物質を含有するワクチン等の製剤は、通常注射によって対象動物に投与される場合が多いが、投与の簡便性に欠ける他に、作用部位での接種物の遺残や、発熱、発赤、筋萎縮症、ショック等の副作用を生じやすい欠点がある。特に、対象が牛，豚，鶏などの産業動物の場合は多数の動物を短時間のうち免疫処理する必要があるため、注射時の労力はきわめて大きく、経口投与が望ましい。
しかしながら、従来、ワクチン等を含むこれらの製剤においては有効な経口製剤は極めて少なく、実用化されているのは、微生物または生物由来物質が酸及びプロテアーゼに対して耐性を有しているか、又はその作用部位が酸等の攻撃を受ける胃よりも上部にあるもの、水分の影響を受けにくいもの、具体的にはポリオおよびニューカッスル病のワクチン等にすぎない。その理由としては、微生物または生物由来物質からなる微生物または生物由来物質の大半は、保存時の水分により失活したり、また胃酸に対する感受性が高いため、経口での投与から作用を発効する腸管の粘膜面に達する間に通過する胃において、酸やタンパク質分解酵素の影響を受けて失活することが挙げられる。
【０００３】
前記問題に対処する方法としては、微生物または生物由来物質が保存時の水分によって失活しないようにカプセル全体の水分を極力少なくすることや、胃酸に対する感受性が高い微生物または生物由来物質に対しては、胃では消化されず腸で溶解するカプセル（腸溶性カプセル）に微生物または生物由来物質を包んで投与する方法が有効である。
本発明者等は、先に、免疫原を含む芯球層と、該芯球層を被覆する１層または複数層の球殻層を有し、最外層が腸溶性物質で構成されている腸溶性粒子を、同心多重ノズルを用いて製造する方法を提案している（特許文献１）。具体的には、同心多重ノズルの中心管から免疫原の懸濁液を押し出すと同時に、最外管から腸溶性物質溶液を押し出し、硬化浴に滴下して硬化させる方法である。
しかしながら、製造条件によっては長時間の連続生産が不安定であったり、該腸溶性粒子に含まれる水分の影響により、長期保存において免疫原が失活するなど長期安定性が不充分であり、保存安定性をより向上させることが求められる。
【０００４】
特許文献２には、水性充填液滴を、中間層を介して、ゼラチンを主体とした殻材で覆ったシームレスカプセルが開示されている。このカプセルの目的は多量の水性充填液をカプセル内に封入することであり、芯液を水性液の状態に保持したままで、ゼラチンを主体とした殻材の水分のみを除去し、最終形態においてカプセル内に水分を保持している。
特許文献３には、腸内有用細菌が、常温時において非流動性の疎水性物質を介して、カプセル皮膜から隔離されているシームレスカプセルが開示されている。芯液は水性液ではなく、非水系であるグリセリンや非流動性の疎水性物質等に腸内有効細菌を分散した液である。また、中間層は非流動性の疎水性物質である木ロウからなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１３０１６６号公報
【特許文献２】特開平８−１０３１３号公報
【特許文献３】特開昭６２−２６３１２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、微生物または生物由来物質を含有し、保存安定性に優れた微生物または生物由来物質含有微細粒子およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明の微生物または生物由来物質含有微細粒子は、最外殻層と、中間層と、芯部とからなる３重構造を有する粒子であって、前記最外殻層が、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、前記芯部が、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなり、乾燥後における粒子全体の水分量が５％以下、かつ水分活性が０．５以下であることを特徴とする。
【０００８】
前記最外殻層に含まれる天然ガムと、２価のカチオンとの反応により形成された網目構造を有することが好ましい。
前記中間層をなす疎水性物質が、レシチンと油脂類の混合物であることが好ましい。
【０００９】
本発明の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法は、同心３重ノズルを用いて硬化用液中に押し出す方法で、最外殻層と、中間層と、芯液とからなる３重構造のシームレスカプセル前駆体を形成する工程と、前記シームレスカプセル前駆体を乾燥させて、粒子全体の水分量を５％以下、かつ水分活性を０．５以下とする工程を有し、前記最外殻層がゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、前記芯液が、微生物または生物由来物質を含有する水性液からなることを特徴とする。
【００１０】
前記同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を、乾燥させる前に、２価のカチオンを含む液中に浸漬させる工程を有することが好ましい。
前記シームレスカプセル前駆体の乾燥を、前記中間層の粘度が２５０ｃｐｓ以下となる温度以上であって、前記最外殻層をなす組成物の水溶液のゲル化温度以下の乾燥温度で行うことが好ましい。
前記同心３重ノズルの中心管および／または中間管が断熱性を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微生物または生物由来物質を含有し、安定性に優れた微生物または生物由来物質含有微細粒子が得られる。
微生物または生物由来物質の胃酸に対する感受性が高い場合には、同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を、乾燥させる前に、２価のカチオンを含む液中に浸漬させることにより、最外殻層に含まれる天然ガムと２価のカチオンとの反応により網目構造が形成され、乾燥後に腸溶性を有する微生物または生物由来物質含有微細粒子が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る微生物または生物由来物質含有微細粒子を製造するのに好適に用いられる装置の一例を示した概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜微生物または生物由来物質を含有する組成物（芯部、芯液）＞
芯部は、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなる。芯部は該組成物の水性液からなる芯液を乾燥させて形成される。
本発明において、微生物または生物由来物質を含む組成物の水性液は、同心３重ノズルを用いて３重構造のシームレスカプセル前駆体を製造する際に、芯液として用いられる。
該水性液（芯液）は、例えば、ウイルスあるいは細菌類やこれらの成分（ペプチドを含む）を免疫原とするワクチンや、微生物または生物由来物質を溶解あるいは分散した水性液である。また、分類方法が異なるが、遺伝子組換えワクチン、ＤＮＡワクチン等を用いることもできる。また、微生物または生物由来物質以外の他の成分としてゼラチン、ラクトース等の安定剤や、着色剤等を含んでもよい。
【００１４】
たとえば、弱毒化株のような生きたウイルス含有の水性液を芯液として用いる場合には、製造および使用の全過程において、ウイルスが失活しないようにすることが重要である。失活の条件は、詳細には各ウイルスにより異なる点もあるが、高い温度条件にさらされない、有機溶媒にさらされない、水分を多く含有し水分活性値が高いような湿度の高い状態に長時間さらされない、極端な高ｐＨまたは低ｐHにさらされない等が基本的な共通条件である。
【００１５】
本発明において使用できる微生物または生物由来物質の具体例としては、インフルエンザ、日本脳炎、百日咳、コレラ、肺炎球菌、ワイル病、赤痢、腸チフス、パラチフス、発しんチフス、しょう紅熱、流行性脳脊髄炎、ペスト、ラッサ熱、マラリア、黄熱、炭疽、伝染性下痢症、つつが虫病、フィフリア病、回帰熱、住血吸虫病、トラホーム、梅毒、淋病、軟性下かん、そけいリンパ肉芽腫症、らい、ニューカッスル病、伝染性コリーザ、鶏伝染性気管支炎、鶏伝染性フォブリキウス嚢病、マイコプラズマガリセプチカム症、家禽コレラ、家禽ペスト、ひな白痢、アヒルペスト、ウサギウイルス性出血病、豚ポルデテラ感染性、豚アクチノパチラス感染症、豚流行性下痢、豚ロタウイルス病、豚オーエスキー病、豚伝染性胃腸炎、豚アデノウイルス感染症、豚生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）、豚パルボウイルス感染症、グレーサー病、アフリカ豚コレラ、豚水胞病、水胞性口炎、豚赤痢、馬インフルエンザ、馬鼻肺炎、馬ゲタウイルス感染症、馬ウイルス性動脈炎、鼻疽、ウマ伝染性貧血、仮性皮疽、馬パラチフス、アフリカ馬疫、ウイルス性馬脳炎、口蹄疫、牛疫、牛流行熱、イバラキ病、チュウザン病、アカバネ病、牛伝染性鼻気管炎、牛ウイルス性下痢症、牛パラインフルエンザ感染症、牛アデノウイルス感染症、牛ロタウイルス感染症、牛肺疫、気腫疽、牛出血性負血症、ブルセラ病、ヨーネ病、ピロプラズマ病、アナプラズマ病、ブルータング病、リフトバレー熱、悪性カタル熱、ハートウォーター、羊痘、マエディービスナ病、山羊伝染性胸膜肺炎、ネコカリシウイルス感染症、ネコウイルス性鼻気管炎、ネコ汎白血球減少症、狂犬病、ジステンバー、イヌ伝染性肝炎、イヌ伝染性喉頭気管炎、イヌパラインフルエンザ病、イヌパルボウイルス病、イヌコロナウイルス病、イヌヘルペスウイルス病、イヌ口腔乳頭腫、ネコ伝染性腹膜炎、ネコ白血病、魚類のビブリオ病、せっそう病、ポリオ、麻疹、風疹、結核（ＢＣＧ）、チフス、痕そう、流行性耳下脳炎、鶏伝染性喉頭気管炎、鶏痘、マレック病、鶏脳脊髄炎、豚コレラ、豚丹毒、ジフテリア、破傷風、はぶトキソイド、ボツリヌス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス、ビフィズス菌、乳酸桿菌等のウイルスあるいは細菌類、サイトカイン、ホルモン等が挙げられる。
【００１６】
＜疎水性物質（中間層）＞
同心３重ノズルを用いて３重構造のシームレスカプセル前駆体を製造する際に、中間層として、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質が用いられる。疎水性物質とは水に不溶な油性物質をいう。
中間層を構成する疎水性物質の４０℃における粘度が２５０ｃｐｓより高いと、シームレスカプセル前駆体を乾燥させる際に、芯液と最外殻層との間に、流動性が悪い疎水性物質が存在することになり、芯液の水分が最外殻層に移行し難くなる。その結果、芯液の水分除去が不充分となり、残留する水分によって微生物または生物由来物質が失活してしまう。該４０℃における粘度は好ましくは２００ｃｐｓ以下であり、下限は３０ｃｐｓ以上が好ましい。
中間層を構成する疎水性物質の５℃における粘度が３００ｃｐｓより低いと、同心３重ノズルより各成分を硬化用液中に押し出してシームレスカプセル前駆体を形成する際に、最外殻層（水溶液）と芯液（水性液）との間に形成される中間層（疎水性物質の層）が、流動しやすいものとなり、良好な３重構造が形成されないおそれがある。該５℃における粘度は好ましくは３００〜５００ｃｐｓである。
【００１７】
かかる疎水性物質としては、レシチンと油脂類の混合物が好ましく、特にレシチンと中鎖脂肪酸トリグリセライド（ＭＣＴ）の混合物が好ましい。レシチンとＭＣＴの混合物において、レシチン：ＭＣＴの混合比（質量比）は１：９〜７：３が好ましく、３：７〜７：３がより好ましい。
【００１８】
＜ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物（最外殻層）＞
最外殻層は、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなる。該最外殻層は該組成物の水溶液（最外殻層液）を用いて形成される。
該最外殻層液のゲル化温度は６０℃以下である。同心３重ノズルを用いてシームレスカプセル前駆体を製造する際に、該最外殻層液は、そのゲル化温度よりも高い温度で使用される。したがって、該最外殻層液のゲル化温度が６０℃より高いと、同心３重ノズルの最外管が加温され、その結果、中間層および芯液が加温されて芯液に含まれる微生物または生物由来物質が変性（失活）しやすくなる。最外殻層液のゲル化温度は好ましくは５０℃以下である。
【００１９】
天然ガムはゲル化温度が６０℃以下のものが用いられ、ジェランガム、カラギーナン、キサンタンガム、アラビアガムからなる群から選ばれる１種以上が好ましい。これらの天然ガムのうちでもジェランガムは、２価のカチオンと反応して網目構造を形成し、ゲル化し易い点で特に好ましい。ゼラチン：天然ガムの混合比（質量比）は２５：０．１〜１０：２．０が好ましく、８：０．１〜８：０．５がより好ましい。
ゼラチンと天然ガムを含む組成物には、ゼラチンおよび天然ガム以外の他の成分としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールなどの可塑剤を含んでもよい。組成物中における該他の成分の合計の含有量はゼラチンと等量以下が好ましい。該他の成分がゼラチンに対して多すぎると最外殻層が柔らかくなりすぎ、少ないと最外殻層が堅くなりすぎ、ひび割れの原因となる。このため、該他の成分はゼラチンの含有量の２０．０〜４０．０質量％がより好ましい。
【００２０】
最外殻層液のｐＨは４．０〜９．０が好ましく、５．０〜８．０がより好ましい。この範囲外の場合、微生物または生物由来物質が変性（失活）しやすい。
【００２１】
＜２価のカチオンを含む液（反応液）＞
２価のカチオンを含む液は、同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を腸溶化させるための反応液として用いられる。
２価のカチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。これらのうちでカルシウムイオンが反応性の点で好ましい。
２価のカチオンを含む液としては、乳酸カルシウムの水溶液、クエン酸カルシウムの水溶液、塩化マグネシウムの水溶液等が挙げられる。これらのうちで乳酸カルシウムの水溶液がｐHを変化させないなどの点で好ましい。
【００２２】
＜製造方法＞
以下、本発明の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法の好ましい実施形態を説明する。
［３重構造のシームレスカプセル前駆体の形成］
まず、同心３重ノズルを用いて硬化用液中に押し出す方法で、最外殻層と中間層と芯液とからなる３重構造のシームレスカプセル前駆体（以下、多重カプセル前駆体ということもある。）を製造する。
図１は、本発明において好適に用いられる３重ノズルを備えた装置の一例を示した概略構成図である。図中符号８は同心３重ノズル（以下、単にノズルということもある。）を示す。この装置を用い、以下のようにして多重カプセル前駆体を製造する。
（１）ポンプ４にてタンク１より、微生物または生物由来物質の水性液（芯液）をノズル８の中心管８ａに送る。ポンプ５にてタンク２より液状の疎水性物質（中間層液）をノズル８の中間管８ｂに送る。ポンプ６にてタンク３より、ゼラチンと天然ガムを含む組成物の水溶液（最外殻層液）をノズル８の最外管８ｃに送る。中心管８ａの吐出口と、中間管８ｂの吐出口と、最外管８ｃの吐出口は同心状に設けられている。
【００２３】
（２）ノズル８に送られたそれぞれの液は、それぞれの管の吐出口より形成管９内に押し出される。すなわち中心管から芯液が押し出され、中間管から中間層液が押し出され、最外管から最外殻層液が押し出される。
形成管９内には、ポンプ１６から溢流式で硬化用液が常時上方から供給されており、ノズル８の液吐出口は硬化用液中に浸漬されている。
（３）液吐出口より押し出された液は、形成管内の硬化用液中で「ジェット」を形成し、該「ジェット」は、表面張力により液滴を形成する。この液滴は、芯液が中間層液で包まれ、さらに最外殻層液で包まれた状態となっている。
【００２４】
芯液、中間層液および最外殻層液それぞれの、硬化用液中に押し出される直前の温度（以下、ノズル出口温度ということもある。）条件は以下の範囲が好ましい。
芯液のノズル出口温度は、高すぎると芯液に含まれる微生物または生物由来物質が変性（失活）する。したがって中間層液のノズル出口温度以下が好ましく、室温以下がより好ましい。
中間層液のノズル出口温度は、高すぎると芯液ノズルが加温され、その結果微生物または生物由来物質の変性（失活）が生じるおそれがある。低すぎると中間層液の粘度が高くなり、カプセル前駆体の形成が不安定となる。したがって２０〜４０℃が好ましく、室温がより好ましい。
最外殻層液のノズル出口温度は、低すぎるとノズルの閉塞が起きる。したがって６０〜９５℃が好ましく、７０〜８５℃がより好ましい。
通常、ノズルの材質はステンレスが用いられるが、ステンレスの３００Ｋにおける熱伝導率が１５〜２０Ｗ／（ｍ・Ｋ）と高いため、最外殻層液により加温された最外管によって、中間管および中心管が加温され、芯液温度の上昇が起こりやすい。
芯液温度の上昇を抑えるために、中心管８ａおよび／または中間管８ｂが断熱性を有することが好ましい。具体的には中心管８ａおよび／または中間管８ｂの材質は、３００Kにおける熱伝導率が５Ｗ／（ｍ・Ｋ）以下であることが好ましく、２．５Ｗ／（ｍ・Ｋ）以下であることがより好ましい。かかる材質としては、例えば、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンサルファイド、ポリアミド、四ふっ化エチレン、ポリカボネート等の樹脂、セラミックスなどがあるが、これらに特に限定されるものではない。
【００２５】
硬化用液としては、例えば流動パラフィン、ナタネ油、ＭＣＴなどの植物油、シリコーン油等が挙げられる。
硬化用液の温度は、最外殻層液のゲル化不足を防ぐため、５〜２５℃が好ましく、７〜２０℃がより好ましい。
【００２６】
（５）液滴は、硬化用液の流れにのって移動しながら冷却されることにより固体化して多重カプセル前駆体となる。固体化した多重カプセル前駆体は冷却液量調節管１３を経て捕集装置１４に落下し、硬化用液と分離される。
（６）多重カプセル前駆体と分離された硬化用液は、脱水装置１２により水分を除去され、硬化用液タンク１５に送られ、熱交換機１７により設定温度に冷却された後、硬化用液ポンプ１６にて形成管９に送られ循環する。
【００２７】
こうして形成される多重カプセル前駆体は、硬化用液により冷却された状態では、中間層は冷却されて粘度が高く半流動性状態となっており、最外殻層は冷却されたことによってゲル化し固体化している。
【００２８】
［浸漬］
次に、得られた多重カプセル前駆体を腸溶性とする場合、２価のカチオンを含む液（反応液）中に浸漬させる。これにより最外殻層に含まれる天然ガムが２価のカチオンと反応して網目構造を形成し、乾燥後に腸溶性の性質を有する多重カプセルとなる。
該反応液の温度は、高すぎると、ゲル化により固体化している多重カプセル前駆体が溶解するため、硬化用液と同様もしくはそれ以下の温度が好ましい。したがって５〜２５℃が好ましく７〜２０℃がより好ましい。
また、天然ガムと２価のカチオンとの反応の程度が腸溶性に影響を及ぼす。浸漬時間（反応時間）は、長すぎると得られる微生物または生物由来物質含有微細粒子が不溶化してしまい、短すぎると十分な腸溶性が得られない。したがって２０分以内が好ましく、３〜１０分がより好ましい。ただし、腸溶性を必要としない場合、浸漬工程を行なう必要はない。
【００２９】
［乾燥］
次いで多重カプセル前駆体を乾燥させて、シームレスカプセルからなる粒子を得る。該多重カプセル前駆体において、最外殻層および芯液は水分を含んでおり、中間層を構成している疎水性物質は低温では半流動性であり温度が高くなるに従い流動性が増す。したがって、中間層を構成している疎水性物質が流動性を示す温度で、かつ最外殻層がゲル化して固体化している温度で乾燥することにより、最外殻層および芯液層の水分を除去することができる。すなわち、乾燥温度が高すぎると、多重カプセル前駆体の最外殻層のゲル化が破壊されて多重カプセルが溶解する。乾燥温度が低すぎると中間層の粘度が高く、芯液が、半流動性の中間層に被覆された状態となるため、最外殻層の水分のみが除去され、芯液の水分除去が不十分となる。したがって、乾燥温度は、中間層の粘度が２５０ｃｐｓ以下となる温度以上であって、最外殻層のゲル化温度以下が好ましい。具体的には、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。より好ましい乾燥温度は、中間層の粘度が２００ｃｐｓ以下となる温度以上であって、最外殻層のゲル化温度以下である。
【００３０】
乾燥方法は、特に限定されず、通風乾燥、静置乾燥、真空乾燥等を用いることができるが、大量生産に適用しやすい点で通風乾燥が好ましい。
通風乾燥は、上記の乾燥温度に制御された乾燥空気を多重カプセルに接触させる方法である。乾燥空気とはＲＨ（相対湿度）５０％以下をいう。
【００３１】
通風乾燥は、通気可能な周面を有する回転ドラムと、該回転ドラムの内部に乾燥空気を供給し、回転ドラムの周面を経て外部へ排気させる手段とを備えたドラム式通気型乾燥装置を用いて行うことが好ましい。ドラム式通気型乾燥装置にあっては、回転ドラム内多重カプセル前駆体を供給し、該ドラムを回転させながら乾燥空気の供給および排気を行うことによって、回転ドラム内で多重カプセル前駆体が流動しながら乾燥空気と接触して、多重カプセル前駆体内の水分が除去される。したがって多重カプセル前駆体の乾燥が効率良く行われるため、微生物または生物由来物質含有微細粒子を効率良く生産するうえで好ましい。
【００３２】
乾燥条件は、乾燥後の粒子全体の水分量が５％以下でかつ水分活性が０．５以下となるように設定する。粒子全体の水分量および水分活性が上記の範囲であると微生物または生物由来物質の活性が、水分の影響により低減するのを良好に防止できる。より好ましい水分量は３％以下であり、より好ましい水分活性の値は０．４以下である。
本明細書における粒子全体の水分量の値は第十五改正日本薬局方一般試験法乾燥減量試験法に従って測定した値であり、水分活性の値は水分活性測定装置（製品名：パウキット、アイネックス社製）により測定した値である。
【００３３】
乾燥前に２価のカチオンに浸漬した粒子は、乾燥後において腸溶性を有しており、腸管で作用する微生物または生物由来物質を含有する腸溶性微生物または生物由来物質含有微細粒子として用いることができる。本明細書において、腸溶性を有する粒子（腸溶性微生物または生物由来物質含有微細粒子）とは、人工胃液中に１時間浸漬させても崩壊せず、粒子状のままである粒子を意味する。
該微生物または生物由来物質含有微細粒子の大きさは、乾燥後の粒子径が０．２〜８ｍｍが好ましく、０．５〜５ｍｍがより好ましい。該粒子径が８ｍｍを越えると、経口投与に適さない傾向が大きくなり、また胃内滞留時間が長すぎて、腸管で作用する微生物または生物由来物質の失活を招き易いという問題がある。一方、０．２ｍｍ未満では腸溶性微生物または生物由来物質含有微細粒子の体積に比べて表面積が大きくなるので十分な耐胃液性を確保することが困難になる。
【００３４】
本実施形態の方法により得られる微生物または生物由来物質含有微細粒子は、疎水性物質からなる中間層を有するため、芯液を水性液とすることができる。該疎水性物質は４０℃で２５０ｃｐｓ以下、５℃で３００ｃｐｓ以上である物性を持つため、微生物または生物由来物質を失活させない程度に低い乾燥温度でも中間層を流動化させることができ、したがって熱による失活を防止しつつ、中間層の内側の芯液の水分も除去することができる。これにより、微生物または生物由来物質への、水分による悪影響を防止でき、微生物または生物由来物質含有微細粒子の良好な保存安定性が得られる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下において、「％」は特に断りのない限り「質量％」である。
（例１〜４）
図１に示す装置を用い、本発明の方法により多重カプセル前駆体を製造した。各液の処方および製造条件を下記表１に示す。
【００３６】
ワクチン成分としては、保存時の水分量および水分活性値の影響を受けやすく、かつ胃酸に対する感受性が高い微生物または生物由来物質として豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルス（脂質膜を有するウイルス）の弱毒ウイルス「ｈ−５株」の水溶液を用いた。この水溶液には安定剤（１０％ラクトース）等が含まれている。この弱毒ウイルスｈ−５株は、プロテアーゼ感受性となり、その感染部位を気道に移した株である。このウイルスは、通常の状況では、胃内の環境で失活するために小腸で増殖しない。腸溶性が得られるかどうかを評価するために好適な材料としてｈ−５株を選んだが、もとより本発明はこれに限定されるものではない。なお、強毒ＴＧＥウイルスは、主に若齢豚の小腸に感染し激しい水様下痢を引き起こし、７日齢以内のブタでは殆どが死亡する。
【００３７】
まず、表１に示す組成の芯液、中間層液、最外殻層液を同心３重ノズル８から硬化用液中に一定速度で押し出して多重カプセル前駆体を製造した。芯液、中間層液、最外殻層液および硬化用液の温度および押し出し速度（液速度）は表１の通りとした。硬化用液としてはココナードＭＴ（中鎖脂肪酸トリグリセライド、花王社製）を用いた。
実施例１および比較例１については、得られた多重カプセル前駆体を乾燥させた。
実施例２、３、および比較例２については、得られた多重カプセル前駆体を乳酸カルシウム水溶液（反応液）中に浸漬させた後、乾燥させた。反応液の組成、温度、浸漬時間（反応時間）は表１の通りとした。
乾燥は、インナーダクト式のドラム式通気型乾燥装置を用い、表1の条件で乾燥させ、乾燥多重カプセルを得た。
乾燥後に得られた乾燥多重カプセルの粒子径は、いずれの例も１〜２ｍｍの範囲内であり、実施例２、３および比較例２はいずれも腸溶性を示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［免疫効果確認試験１］
実施例２で得たＴＧＥ弱毒化ウイルス含有微細粒子を、１回当たり１０７ ＴＣＩＤ５０となる量で飼料中に混ぜ、８週間隔で２回、約３か月齢の肥育豚に自然給餌する方法で投与した。投与時から経時的に採血を行い、ＴＧＥウイルスに対する血清中中和抗体価を測定した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２に示した結果から、実施例２で得たＴＧＥ弱毒化ウイルス含有微細粒子の１回の投与でも免疫効果が認められ、さらに２回投与することで中和抗体価がより上昇することが確認された。
【００４２】
［免疫効果確認試験２］
実施例３で得たＴＧＥ弱毒化ウイルス含有微細粒子を、１回当たり１０７ ＴＣＩＤ５０となる量で飼料中に混ぜ、妊娠豚に、出産予定日の９週前より２週間隔で５回、自然給餌する方法で投与した。投与時から経時的に採血を行い、ＴＧＥウイルスに対する血清中中和抗体価を測定した。また、分娩後は乳清中中和抗体価も測定した。さらに、哺乳豚を免疫群（母乳摂取群）及び対照群（人工哺乳群）に分け、分娩後３日目にＴＧＥウイルス強毒株１０５ ＰＩＤ （ｐｉｇ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）５０／頭の経口投与により攻撃し、移行抗体による感染防御効果を調べた。結果を表３〜５に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
表３〜５に示した結果から、実施例３で得たTGE弱毒化ウイルス含有微細粒子の複数回投与により妊娠豚に免疫効果が認められた。また、分娩後の乳清中にも高い中和抗体価が認められ、それを摂取した哺乳豚に対するTGEウイルス強毒株の攻撃試験では、症状軽減効果が認められた。
【００４７】
［微生物または生物由来物質の保存安定性試験］
実施例１乃至３ならびに比較例１および２で製造した微生物または生物由来物質含有微細粒子を、乾燥剤とともに４℃で密閉保存したときのウイルス含有量（感染力価）の安定性を調べた。
ウイルス含有量（感染力価）は以下の方法で測定した。まず、微生物または生物由来物質含有微細粒子内に含有させる前のウイルス液量に換算して０．１ｍｌを含む量の粒子（０．２５３ｇ）を秤量した。これを３７〜４０℃に加温したウイルス増殖用培地１０ｍＬと混ぜて均一に乳剤化し、０．４５〜０．８μｍ孔径のフィルターでろ過した後、ウイルス増殖用細胞（ブタ腎株化細胞（ＭＰＫ細胞））を用いて測定した。
すなわち、４８穴プレートにＭＰＫ細胞の単層培養を作り、培地を除去後１０倍段階希釈した検体を１穴当たり０．１ｍｌずつ４穴に接種した。各穴に０．５ｍｌの細胞維持用の培養液を加えて３７℃の炭酸ガス孵卵器で１週間静置して細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現を観察した。感染性のウイルス量はＫａｒｂｅｒ法を用いて計算し、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（５０％組織培養感染量）で示した。
粒子内に含有させる前の芯液におけるウイルス含有量（粒子化前）、微生物または生物由来物質含有微細粒子を製造した直後のウイルス含有量（粒子化後）、および製造後３〜２１ヶ月保存した後のウイルス含有量（３、７、１２、２１か月後）を測定した。その結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】
表６の結果より、微生物または生物由来物質含有微細粒子内に保持されたウイルスは、４℃、２１か月の保存でもウイルス含有量の低下がほとんどなく、保存安定性に優れることが認められる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、動物を免疫しうる、微生物または生物由来物質を含有する微細粒子であるため、安全で安定な経口ワクチンとして有用な微生物または生物由来物質含有微細粒子を提供できる。
また、水溶液で調製できる最外殻層、および粘度が５０℃で５０ｃｐｓ以上、５℃で５００ｃｐｓ以下の疎水性物質からなる中間層で、微生物または生物由来物質を含む芯液を被覆するので、従来のコーティング法による場合のような、微生物または生物由来物質と、有機溶媒との接触や高温への曝露がなく、微生物または生物由来物質の失活を軽減できる。このため、特に弱毒病原体を用いる場合に極めて有効である。
さらに製造工程が簡易であり、連続生産も可能であるため生産性が高く、コストも安価にできる。
本発明における微生物または生物由来物質含有微細粒子は、全体の水分量が３％以下でありかつ水分活性値が０．５以下であるため、水分による微生物または生物由来物質の安定性を高く保持でき、商品流通過程での保存性を比較的長期間に渡って維持できる。
【符号の説明】
【００５１】
１，２，３ タンク、
４，５，６ ポンプ、
８ 同心３重ノズル、
９ 形成管、
１２ 脱水装置、
１３ 冷却液量調節管、
１４ 捕集装置、
１５ 硬化用液タンク、
１６ 硬化用液ポンプ、
１７ 熱交換機。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば動物用経口ワクチンに好適に用いることができる、微生物または生物由来物質を含有する微細粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物または生物由来物質を含有するワクチン等の製剤は、通常注射によって対象動物に投与される場合が多いが、投与の簡便性に欠ける他に、作用部位での接種物の遺残や、発熱、発赤、筋萎縮症、ショック等の副作用を生じやすい欠点がある。特に、対象が牛，豚，鶏などの産業動物の場合は多数の動物を短時間のうち免疫処理する必要があるため、注射時の労力はきわめて大きく、経口投与が望ましい。
しかしながら、従来、ワクチン等を含むこれらの製剤においては有効な経口製剤は極めて少なく、実用化されているのは、微生物または生物由来物質が酸及びプロテアーゼに対して耐性を有しているか、又はその作用部位が酸等の攻撃を受ける胃よりも上部にあるもの、水分の影響を受けにくいもの、具体的にはポリオおよびニューカッスル病のワクチン等にすぎない。その理由としては、微生物または生物由来物質からなる微生物または生物由来物質の大半は、保存時の水分により失活したり、また胃酸に対する感受性が高いため、経口での投与から作用を発効する腸管の粘膜面に達する間に通過する胃において、酸やタンパク質分解酵素の影響を受けて失活することが挙げられる。
【０００３】
前記問題に対処する方法としては、微生物または生物由来物質が保存時の水分によって失活しないようにカプセル全体の水分を極力少なくすることや、胃酸に対する感受性が高い微生物または生物由来物質に対しては、胃では消化されず腸で溶解するカプセル（腸溶性カプセル）に微生物または生物由来物質を包んで投与する方法が有効である。
本発明者等は、先に、免疫原を含む芯球層と、該芯球層を被覆する１層または複数層の球殻層を有し、最外層が腸溶性物質で構成されている腸溶性粒子を、同心多重ノズルを用いて製造する方法を提案している（特許文献１）。具体的には、同心多重ノズルの中心管から免疫原の懸濁液を押し出すと同時に、最外管から腸溶性物質溶液を押し出し、硬化浴に滴下して硬化させる方法である。
しかしながら、製造条件によっては長時間の連続生産が不安定であったり、該腸溶性粒子に含まれる水分の影響により、長期保存において免疫原が失活するなど長期安定性が不充分であり、保存安定性をより向上させることが求められる。
【０００４】
特許文献２には、水性充填液滴を、中間層を介して、ゼラチンを主体とした殻材で覆ったシームレスカプセルが開示されている。このカプセルの目的は多量の水性充填液をカプセル内に封入することであり、芯液を水性液の状態に保持したままで、ゼラチンを主体とした殻材の水分のみを除去し、最終形態においてカプセル内に水分を保持している。
特許文献３には、腸内有用細菌が、常温時において非流動性の疎水性物質を介して、カプセル皮膜から隔離されているシームレスカプセルが開示されている。芯液は水性液ではなく、非水系であるグリセリンや非流動性の疎水性物質等に腸内有効細菌を分散した液である。また、中間層は非流動性の疎水性物質である木ロウからなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１３０１６６号公報
【特許文献２】特開平８−１０３１３号公報
【特許文献３】特開昭６２−２６３１２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、微生物または生物由来物質を含有し、保存安定性に優れた微生物または生物由来物質含有微細粒子およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明の微生物または生物由来物質含有微細粒子は、最外殻層と、中間層と、芯部とからなる３重構造を有する粒子であって、前記最外殻層が、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、前記芯部が、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなり、乾燥後における粒子全体の水分量が５％以下、かつ水分活性が０．５以下であることを特徴とする。
【０００８】
前記最外殻層に含まれる天然ガムと、２価のカチオンとの反応により形成された網目構造を有することが好ましい。
前記中間層をなす疎水性物質が、レシチンと油脂類の混合物であることが好ましい。
【０００９】
本発明の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法は、同心３重ノズルを用いて硬化用液中に押し出す方法で、最外殻層と、中間層と、芯液とからなる３重構造のシームレスカプセル前駆体を形成する工程と、前記シームレスカプセル前駆体を乾燥させて、粒子全体の水分量を５％以下、かつ水分活性を０．５以下とする工程を有し、前記最外殻層がゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、前記芯液が、微生物または生物由来物質を含有する水性液からなることを特徴とする。
【００１０】
前記同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を、乾燥させる前に、２価のカチオンを含む液中に浸漬させる工程を有することが好ましい。
前記シームレスカプセル前駆体の乾燥を、前記中間層の粘度が２５０ｃｐｓ以下となる温度以上であって、前記最外殻層をなす組成物の水溶液のゲル化温度以下の乾燥温度で行うことが好ましい。
前記同心３重ノズルの中心管および／または中間管が断熱性を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微生物または生物由来物質を含有し、安定性に優れた微生物または生物由来物質含有微細粒子が得られる。
微生物または生物由来物質の胃酸に対する感受性が高い場合には、同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を、乾燥させる前に、２価のカチオンを含む液中に浸漬させることにより、最外殻層に含まれる天然ガムと２価のカチオンとの反応により網目構造が形成され、乾燥後に腸溶性を有する微生物または生物由来物質含有微細粒子が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係る微生物または生物由来物質含有微細粒子を製造するのに好適に用いられる装置の一例を示した概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜微生物または生物由来物質を含有する組成物（芯部、芯液）＞
芯部は、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなる。芯部は該組成物の水性液からなる芯液を乾燥させて形成される。
本発明において、微生物または生物由来物質を含む組成物の水性液は、同心３重ノズルを用いて３重構造のシームレスカプセル前駆体を製造する際に、芯液として用いられる。
該水性液（芯液）は、例えば、ウイルスあるいは細菌類やこれらの成分（ペプチドを含む）を免疫原とするワクチンや、微生物または生物由来物質を溶解あるいは分散した水性液である。また、分類方法が異なるが、遺伝子組換えワクチン、ＤＮＡワクチン等を用いることもできる。また、微生物または生物由来物質以外の他の成分としてゼラチン、ラクトース等の安定剤や、着色剤等を含んでもよい。
【００１４】
たとえば、弱毒化株のような生きたウイルス含有の水性液を芯液として用いる場合には、製造および使用の全過程において、ウイルスが失活しないようにすることが重要である。失活の条件は、詳細には各ウイルスにより異なる点もあるが、高い温度条件にさらされない、有機溶媒にさらされない、水分を多く含有し水分活性値が高いような湿度の高い状態に長時間さらされない、極端な高ｐＨまたは低ｐHにさらされない等が基本的な共通条件である。
【００１５】
本発明において使用できる微生物または生物由来物質の具体例としては、インフルエンザ、日本脳炎、百日咳、コレラ、肺炎球菌、ワイル病、赤痢、腸チフス、パラチフス、発しんチフス、しょう紅熱、流行性脳脊髄炎、ペスト、ラッサ熱、マラリア、黄熱、炭疽、伝染性下痢症、つつが虫病、フィフリア病、回帰熱、住血吸虫病、トラホーム、梅毒、淋病、軟性下かん、そけいリンパ肉芽腫症、らい、ニューカッスル病、伝染性コリーザ、鶏伝染性気管支炎、鶏伝染性フォブリキウス嚢病、マイコプラズマガリセプチカム症、家禽コレラ、家禽ペスト、ひな白痢、アヒルペスト、ウサギウイルス性出血病、豚ポルデテラ感染性、豚アクチノパチラス感染症、豚流行性下痢、豚ロタウイルス病、豚オーエスキー病、豚伝染性胃腸炎、豚アデノウイルス感染症、豚生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）、豚パルボウイルス感染症、グレーサー病、アフリカ豚コレラ、豚水胞病、水胞性口炎、豚赤痢、馬インフルエンザ、馬鼻肺炎、馬ゲタウイルス感染症、馬ウイルス性動脈炎、鼻疽、ウマ伝染性貧血、仮性皮疽、馬パラチフス、アフリカ馬疫、ウイルス性馬脳炎、口蹄疫、牛疫、牛流行熱、イバラキ病、チュウザン病、アカバネ病、牛伝染性鼻気管炎、牛ウイルス性下痢症、牛パラインフルエンザ感染症、牛アデノウイルス感染症、牛ロタウイルス感染症、牛肺疫、気腫疽、牛出血性負血症、ブルセラ病、ヨーネ病、ピロプラズマ病、アナプラズマ病、ブルータング病、リフトバレー熱、悪性カタル熱、ハートウォーター、羊痘、マエディービスナ病、山羊伝染性胸膜肺炎、ネコカリシウイルス感染症、ネコウイルス性鼻気管炎、ネコ汎白血球減少症、狂犬病、ジステンバー、イヌ伝染性肝炎、イヌ伝染性喉頭気管炎、イヌパラインフルエンザ病、イヌパルボウイルス病、イヌコロナウイルス病、イヌヘルペスウイルス病、イヌ口腔乳頭腫、ネコ伝染性腹膜炎、ネコ白血病、魚類のビブリオ病、せっそう病、ポリオ、麻疹、風疹、結核（ＢＣＧ）、チフス、痕そう、流行性耳下脳炎、鶏伝染性喉頭気管炎、鶏痘、マレック病、鶏脳脊髄炎、豚コレラ、豚丹毒、ジフテリア、破傷風、はぶトキソイド、ボツリヌス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス、ビフィズス菌、乳酸桿菌等のウイルスあるいは細菌類、サイトカイン、ホルモン等が挙げられる。
【００１６】
＜疎水性物質（中間層）＞
同心３重ノズルを用いて３重構造のシームレスカプセル前駆体を製造する際に、中間層として、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質が用いられる。疎水性物質とは水に不溶な油性物質をいう。
中間層を構成する疎水性物質の４０℃における粘度が２５０ｃｐｓより高いと、シームレスカプセル前駆体を乾燥させる際に、芯液と最外殻層との間に、流動性が悪い疎水性物質が存在することになり、芯液の水分が最外殻層に移行し難くなる。その結果、芯液の水分除去が不充分となり、残留する水分によって微生物または生物由来物質が失活してしまう。該４０℃における粘度は好ましくは２００ｃｐｓ以下であり、下限は３０ｃｐｓ以上が好ましい。
中間層を構成する疎水性物質の５℃における粘度が３００ｃｐｓより低いと、同心３重ノズルより各成分を硬化用液中に押し出してシームレスカプセル前駆体を形成する際に、最外殻層（水溶液）と芯液（水性液）との間に形成される中間層（疎水性物質の層）が、流動しやすいものとなり、良好な３重構造が形成されないおそれがある。該５℃における粘度は好ましくは３００〜５００ｃｐｓである。
【００１７】
かかる疎水性物質としては、レシチンと油脂類の混合物が好ましく、特にレシチンと中鎖脂肪酸トリグリセライド（ＭＣＴ）の混合物が好ましい。レシチンとＭＣＴの混合物において、レシチン：ＭＣＴの混合比（質量比）は１：９〜７：３が好ましく、３：７〜７：３がより好ましい。
【００１８】
＜ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物（最外殻層）＞
最外殻層は、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなる。該最外殻層は該組成物の水溶液（最外殻層液）を用いて形成される。
該最外殻層液のゲル化温度は６０℃以下である。同心３重ノズルを用いてシームレスカプセル前駆体を製造する際に、該最外殻層液は、そのゲル化温度よりも高い温度で使用される。したがって、該最外殻層液のゲル化温度が６０℃より高いと、同心３重ノズルの最外管が加温され、その結果、中間層および芯液が加温されて芯液に含まれる微生物または生物由来物質が変性（失活）しやすくなる。最外殻層液のゲル化温度は好ましくは５０℃以下である。
【００１９】
天然ガムはゲル化温度が６０℃以下のものが用いられ、ジェランガム、カラギーナン、キサンタンガム、アラビアガムからなる群から選ばれる１種以上が好ましい。これらの天然ガムのうちでもジェランガムは、２価のカチオンと反応して網目構造を形成し、ゲル化し易い点で特に好ましい。ゼラチン：天然ガムの混合比（質量比）は２５：０．１〜１０：２．０が好ましく、８：０．１〜８：０．５がより好ましい。
ゼラチンと天然ガムを含む組成物には、ゼラチンおよび天然ガム以外の他の成分としてグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールなどの可塑剤を含んでもよい。組成物中における該他の成分の合計の含有量はゼラチンと等量以下が好ましい。該他の成分がゼラチンに対して多すぎると最外殻層が柔らかくなりすぎ、少ないと最外殻層が堅くなりすぎ、ひび割れの原因となる。このため、該他の成分はゼラチンの含有量の２０．０〜４０．０質量％がより好ましい。
【００２０】
最外殻層液のｐＨは４．０〜９．０が好ましく、５．０〜８．０がより好ましい。この範囲外の場合、微生物または生物由来物質が変性（失活）しやすい。
【００２１】
＜２価のカチオンを含む液（反応液）＞
２価のカチオンを含む液は、同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を腸溶化させるための反応液として用いられる。
２価のカチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。これらのうちでカルシウムイオンが反応性の点で好ましい。
２価のカチオンを含む液としては、乳酸カルシウムの水溶液、クエン酸カルシウムの水溶液、塩化マグネシウムの水溶液等が挙げられる。これらのうちで乳酸カルシウムの水溶液がｐHを変化させないなどの点で好ましい。
【００２２】
＜製造方法＞
以下、本発明の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法の好ましい実施形態を説明する。
［３重構造のシームレスカプセル前駆体の形成］
まず、同心３重ノズルを用いて硬化用液中に押し出す方法で、最外殻層と中間層と芯液とからなる３重構造のシームレスカプセル前駆体（以下、多重カプセル前駆体ということもある。）を製造する。
図１は、本発明において好適に用いられる３重ノズルを備えた装置の一例を示した概略構成図である。図中符号８は同心３重ノズル（以下、単にノズルということもある。）を示す。この装置を用い、以下のようにして多重カプセル前駆体を製造する。
（１）ポンプ４にてタンク１より、微生物または生物由来物質の水性液（芯液）をノズル８の中心管８ａに送る。ポンプ５にてタンク２より液状の疎水性物質（中間層液）をノズル８の中間管８ｂに送る。ポンプ６にてタンク３より、ゼラチンと天然ガムを含む組成物の水溶液（最外殻層液）をノズル８の最外管８ｃに送る。中心管８ａの吐出口と、中間管８ｂの吐出口と、最外管８ｃの吐出口は同心状に設けられている。
【００２３】
（２）ノズル８に送られたそれぞれの液は、それぞれの管の吐出口より形成管９内に押し出される。すなわち中心管から芯液が押し出され、中間管から中間層液が押し出され、最外管から最外殻層液が押し出される。
形成管９内には、ポンプ１６から溢流式で硬化用液が常時上方から供給されており、ノズル８の液吐出口は硬化用液中に浸漬されている。
（３）液吐出口より押し出された液は、形成管内の硬化用液中で「ジェット」を形成し、該「ジェット」は、表面張力により液滴を形成する。この液滴は、芯液が中間層液で包まれ、さらに最外殻層液で包まれた状態となっている。
【００２４】
芯液、中間層液および最外殻層液それぞれの、硬化用液中に押し出される直前の温度（以下、ノズル出口温度ということもある。）条件は以下の範囲が好ましい。
芯液のノズル出口温度は、高すぎると芯液に含まれる微生物または生物由来物質が変性（失活）する。したがって中間層液のノズル出口温度以下が好ましく、室温以下がより好ましい。
中間層液のノズル出口温度は、高すぎると芯液ノズルが加温され、その結果微生物または生物由来物質の変性（失活）が生じるおそれがある。低すぎると中間層液の粘度が高くなり、カプセル前駆体の形成が不安定となる。したがって２０〜４０℃が好ましく、室温がより好ましい。
最外殻層液のノズル出口温度は、低すぎるとノズルの閉塞が起きる。したがって６０〜９５℃が好ましく、７０〜８５℃がより好ましい。
通常、ノズルの材質はステンレスが用いられるが、ステンレスの３００Ｋにおける熱伝導率が１５〜２０Ｗ／（ｍ・Ｋ）と高いため、最外殻層液により加温された最外管によって、中間管および中心管が加温され、芯液温度の上昇が起こりやすい。
芯液温度の上昇を抑えるために、中心管８ａおよび／または中間管８ｂが断熱性を有することが好ましい。具体的には中心管８ａおよび／または中間管８ｂの材質は、３００Kにおける熱伝導率が５Ｗ／（ｍ・Ｋ）以下であることが好ましく、２．５Ｗ／（ｍ・Ｋ）以下であることがより好ましい。かかる材質としては、例えば、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンサルファイド、ポリアミド、四ふっ化エチレン、ポリカボネート等の樹脂、セラミックスなどがあるが、これらに特に限定されるものではない。
【００２５】
硬化用液としては、例えば流動パラフィン、ナタネ油、ＭＣＴなどの植物油、シリコーン油等が挙げられる。
硬化用液の温度は、最外殻層液のゲル化不足を防ぐため、５〜２５℃が好ましく、７〜２０℃がより好ましい。
【００２６】
（５）液滴は、硬化用液の流れにのって移動しながら冷却されることにより固体化して多重カプセル前駆体となる。固体化した多重カプセル前駆体は冷却液量調節管１３を経て捕集装置１４に落下し、硬化用液と分離される。
（６）多重カプセル前駆体と分離された硬化用液は、脱水装置１２により水分を除去され、硬化用液タンク１５に送られ、熱交換機１７により設定温度に冷却された後、硬化用液ポンプ１６にて形成管９に送られ循環する。
【００２７】
こうして形成される多重カプセル前駆体は、硬化用液により冷却された状態では、中間層は冷却されて粘度が高く半流動性状態となっており、最外殻層は冷却されたことによってゲル化し固体化している。
【００２８】
［浸漬］
次に、得られた多重カプセル前駆体を腸溶性とする場合、２価のカチオンを含む液（反応液）中に浸漬させる。これにより最外殻層に含まれる天然ガムが２価のカチオンと反応して網目構造を形成し、乾燥後に腸溶性の性質を有する多重カプセルとなる。
該反応液の温度は、高すぎると、ゲル化により固体化している多重カプセル前駆体が溶解するため、硬化用液と同様もしくはそれ以下の温度が好ましい。したがって５〜２５℃が好ましく７〜２０℃がより好ましい。
また、天然ガムと２価のカチオンとの反応の程度が腸溶性に影響を及ぼす。浸漬時間（反応時間）は、長すぎると得られる微生物または生物由来物質含有微細粒子が不溶化してしまい、短すぎると十分な腸溶性が得られない。したがって２０分以内が好ましく、３〜１０分がより好ましい。ただし、腸溶性を必要としない場合、浸漬工程を行なう必要はない。
【００２９】
［乾燥］
次いで多重カプセル前駆体を乾燥させて、シームレスカプセルからなる粒子を得る。該多重カプセル前駆体において、最外殻層および芯液は水分を含んでおり、中間層を構成している疎水性物質は低温では半流動性であり温度が高くなるに従い流動性が増す。したがって、中間層を構成している疎水性物質が流動性を示す温度で、かつ最外殻層がゲル化して固体化している温度で乾燥することにより、最外殻層および芯液層の水分を除去することができる。すなわち、乾燥温度が高すぎると、多重カプセル前駆体の最外殻層のゲル化が破壊されて多重カプセルが溶解する。乾燥温度が低すぎると中間層の粘度が高く、芯液が、半流動性の中間層に被覆された状態となるため、最外殻層の水分のみが除去され、芯液の水分除去が不十分となる。したがって、乾燥温度は、中間層の粘度が２５０ｃｐｓ以下となる温度以上であって、最外殻層のゲル化温度以下が好ましい。具体的には、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。より好ましい乾燥温度は、中間層の粘度が２００ｃｐｓ以下となる温度以上であって、最外殻層のゲル化温度以下である。
【００３０】
乾燥方法は、特に限定されず、通風乾燥、静置乾燥、真空乾燥等を用いることができるが、大量生産に適用しやすい点で通風乾燥が好ましい。
通風乾燥は、上記の乾燥温度に制御された乾燥空気を多重カプセルに接触させる方法である。乾燥空気とはＲＨ（相対湿度）５０％以下をいう。
【００３１】
通風乾燥は、通気可能な周面を有する回転ドラムと、該回転ドラムの内部に乾燥空気を供給し、回転ドラムの周面を経て外部へ排気させる手段とを備えたドラム式通気型乾燥装置を用いて行うことが好ましい。ドラム式通気型乾燥装置にあっては、回転ドラム内多重カプセル前駆体を供給し、該ドラムを回転させながら乾燥空気の供給および排気を行うことによって、回転ドラム内で多重カプセル前駆体が流動しながら乾燥空気と接触して、多重カプセル前駆体内の水分が除去される。したがって多重カプセル前駆体の乾燥が効率良く行われるため、微生物または生物由来物質含有微細粒子を効率良く生産するうえで好ましい。
【００３２】
乾燥条件は、乾燥後の粒子全体の水分量が５％以下でかつ水分活性が０．５以下となるように設定する。粒子全体の水分量および水分活性が上記の範囲であると微生物または生物由来物質の活性が、水分の影響により低減するのを良好に防止できる。より好ましい水分量は３％以下であり、より好ましい水分活性の値は０．４以下である。
本明細書における粒子全体の水分量の値は第十五改正日本薬局方一般試験法乾燥減量試験法に従って測定した値であり、水分活性の値は水分活性測定装置（製品名：パウキット、アイネックス社製）により測定した値である。
【００３３】
乾燥前に２価のカチオンに浸漬した粒子は、乾燥後において腸溶性を有しており、腸管で作用する微生物または生物由来物質を含有する腸溶性微生物または生物由来物質含有微細粒子として用いることができる。本明細書において、腸溶性を有する粒子（腸溶性微生物または生物由来物質含有微細粒子）とは、人工胃液中に１時間浸漬させても崩壊せず、粒子状のままである粒子を意味する。
該微生物または生物由来物質含有微細粒子の大きさは、乾燥後の粒子径が０．２〜８ｍｍが好ましく、０．５〜５ｍｍがより好ましい。該粒子径が８ｍｍを越えると、経口投与に適さない傾向が大きくなり、また胃内滞留時間が長すぎて、腸管で作用する微生物または生物由来物質の失活を招き易いという問題がある。一方、０．２ｍｍ未満では腸溶性微生物または生物由来物質含有微細粒子の体積に比べて表面積が大きくなるので十分な耐胃液性を確保することが困難になる。
【００３４】
本実施形態の方法により得られる微生物または生物由来物質含有微細粒子は、疎水性物質からなる中間層を有するため、芯液を水性液とすることができる。該疎水性物質は４０℃で２５０ｃｐｓ以下、５℃で３００ｃｐｓ以上である物性を持つため、微生物または生物由来物質を失活させない程度に低い乾燥温度でも中間層を流動化させることができ、したがって熱による失活を防止しつつ、中間層の内側の芯液の水分も除去することができる。これにより、微生物または生物由来物質への、水分による悪影響を防止でき、微生物または生物由来物質含有微細粒子の良好な保存安定性が得られる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。以下において、「％」は特に断りのない限り「質量％」である。
（例１〜４）
図１に示す装置を用い、本発明の方法により多重カプセル前駆体を製造した。各液の処方および製造条件を下記表１に示す。
【００３６】
ワクチン成分としては、保存時の水分量および水分活性値の影響を受けやすく、かつ胃酸に対する感受性が高い微生物または生物由来物質として豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウイルス（脂質膜を有するウイルス）の弱毒ウイルス「ｈ−５株」の水溶液を用いた。この水溶液には安定剤（１０％ラクトース）等が含まれている。この弱毒ウイルスｈ−５株は、プロテアーゼ感受性となり、その感染部位を気道に移した株である。このウイルスは、通常の状況では、胃内の環境で失活するために小腸で増殖しない。腸溶性が得られるかどうかを評価するために好適な材料としてｈ−５株を選んだが、もとより本発明はこれに限定されるものではない。なお、強毒ＴＧＥウイルスは、主に若齢豚の小腸に感染し激しい水様下痢を引き起こし、７日齢以内のブタでは殆どが死亡する。
【００３７】
まず、表１に示す組成の芯液、中間層液、最外殻層液を同心３重ノズル８から硬化用液中に一定速度で押し出して多重カプセル前駆体を製造した。芯液、中間層液、最外殻層液および硬化用液の温度および押し出し速度（液速度）は表１の通りとした。硬化用液としてはココナードＭＴ（中鎖脂肪酸トリグリセライド、花王社製）を用いた。
実施例１および比較例１については、得られた多重カプセル前駆体を乾燥させた。
実施例２、３、および比較例２については、得られた多重カプセル前駆体を乳酸カルシウム水溶液（反応液）中に浸漬させた後、乾燥させた。反応液の組成、温度、浸漬時間（反応時間）は表１の通りとした。
乾燥は、インナーダクト式のドラム式通気型乾燥装置を用い、表1の条件で乾燥させ、乾燥多重カプセルを得た。
乾燥後に得られた乾燥多重カプセルの粒子径は、いずれの例も１〜２ｍｍの範囲内であり、実施例２、３および比較例２はいずれも腸溶性を示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［免疫効果確認試験１］
実施例２で得たＴＧＥ弱毒化ウイルス含有微細粒子を、１回当たり１０７ ＴＣＩＤ５０となる量で飼料中に混ぜ、８週間隔で２回、約３か月齢の肥育豚に自然給餌する方法で投与した。投与時から経時的に採血を行い、ＴＧＥウイルスに対する血清中中和抗体価を測定した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２に示した結果から、実施例２で得たＴＧＥ弱毒化ウイルス含有微細粒子の１回の投与でも免疫効果が認められ、さらに２回投与することで中和抗体価がより上昇することが確認された。
【００４２】
［免疫効果確認試験２］
実施例３で得たＴＧＥ弱毒化ウイルス含有微細粒子を、１回当たり１０７ ＴＣＩＤ５０となる量で飼料中に混ぜ、妊娠豚に、出産予定日の９週前より２週間隔で５回、自然給餌する方法で投与した。投与時から経時的に採血を行い、ＴＧＥウイルスに対する血清中中和抗体価を測定した。また、分娩後は乳清中中和抗体価も測定した。さらに、哺乳豚を免疫群（母乳摂取群）及び対照群（人工哺乳群）に分け、分娩後３日目にＴＧＥウイルス強毒株１０５ ＰＩＤ （ｐｉｇ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）５０／頭の経口投与により攻撃し、移行抗体による感染防御効果を調べた。結果を表３〜５に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
表３〜５に示した結果から、実施例３で得たTGE弱毒化ウイルス含有微細粒子の複数回投与により妊娠豚に免疫効果が認められた。また、分娩後の乳清中にも高い中和抗体価が認められ、それを摂取した哺乳豚に対するTGEウイルス強毒株の攻撃試験では、症状軽減効果が認められた。
【００４７】
［微生物または生物由来物質の保存安定性試験］
実施例１乃至３ならびに比較例１および２で製造した微生物または生物由来物質含有微細粒子を、乾燥剤とともに４℃で密閉保存したときのウイルス含有量（感染力価）の安定性を調べた。
ウイルス含有量（感染力価）は以下の方法で測定した。まず、微生物または生物由来物質含有微細粒子内に含有させる前のウイルス液量に換算して０．１ｍｌを含む量の粒子（０．２５３ｇ）を秤量した。これを３７〜４０℃に加温したウイルス増殖用培地１０ｍＬと混ぜて均一に乳剤化し、０．４５〜０．８μｍ孔径のフィルターでろ過した後、ウイルス増殖用細胞（ブタ腎株化細胞（ＭＰＫ細胞））を用いて測定した。
すなわち、４８穴プレートにＭＰＫ細胞の単層培養を作り、培地を除去後１０倍段階希釈した検体を１穴当たり０．１ｍｌずつ４穴に接種した。各穴に０．５ｍｌの細胞維持用の培養液を加えて３７℃の炭酸ガス孵卵器で１週間静置して細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現を観察した。感染性のウイルス量はＫａｒｂｅｒ法を用いて計算し、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（５０％組織培養感染量）で示した。
粒子内に含有させる前の芯液におけるウイルス含有量（粒子化前）、微生物または生物由来物質含有微細粒子を製造した直後のウイルス含有量（粒子化後）、および製造後３〜２１ヶ月保存した後のウイルス含有量（３、７、１２、２１か月後）を測定した。その結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】
表６の結果より、微生物または生物由来物質含有微細粒子内に保持されたウイルスは、４℃、２１か月の保存でもウイルス含有量の低下がほとんどなく、保存安定性に優れることが認められる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、動物を免疫しうる、微生物または生物由来物質を含有する微細粒子であるため、安全で安定な経口ワクチンとして有用な微生物または生物由来物質含有微細粒子を提供できる。
また、水溶液で調製できる最外殻層、および粘度が５０℃で５０ｃｐｓ以上、５℃で５００ｃｐｓ以下の疎水性物質からなる中間層で、微生物または生物由来物質を含む芯液を被覆するので、従来のコーティング法による場合のような、微生物または生物由来物質と、有機溶媒との接触や高温への曝露がなく、微生物または生物由来物質の失活を軽減できる。このため、特に弱毒病原体を用いる場合に極めて有効である。
さらに製造工程が簡易であり、連続生産も可能であるため生産性が高く、コストも安価にできる。
本発明における微生物または生物由来物質含有微細粒子は、全体の水分量が３％以下でありかつ水分活性値が０．５以下であるため、水分による微生物または生物由来物質の安定性を高く保持でき、商品流通過程での保存性を比較的長期間に渡って維持できる。
【符号の説明】
【００５１】
１，２，３ タンク、
４，５，６ ポンプ、
８ 同心３重ノズル、
９ 形成管、
１２ 脱水装置、
１３ 冷却液量調節管、
１４ 捕集装置、
１５ 硬化用液タンク、
１６ 硬化用液ポンプ、
１７ 熱交換機。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最外殻層と、中間層と、芯部とからなる３重構造を有する粒子であって、
前記最外殻層が、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、
前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、
前記芯部が、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなり、
粒子全体の水分量が５％以下、かつ水分活性が０．５以下であることを特徴とする微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【請求項２】
前記最外殻層に含まれる天然ガムと、２価のカチオンとの反応により形成された網目構造を有することを特徴とする請求項１記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【請求項３】
前記中間層をなす疎水性物質が、レシチンと油脂類の混合物である請求項１または２に記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【請求項４】
同心３重ノズルを用いて硬化用液中に押し出す方法で、最外殻層と、中間層と、芯液とからなる３重構造のシームレスカプセル前駆体を形成する工程と、
前記シームレスカプセル前駆体を乾燥させて、粒子全体の水分量を５％以下、かつ水分活性を０．５以下とする工程を有し、
前記最外殻層がゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、
前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、
前記芯液が、微生物または生物由来物質を含有する水性液からなることを特徴とする微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【請求項５】
前記同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を、乾燥させる前に、２価のカチオンを含む液中に浸漬させる工程を有することを特徴とする請求項４記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【請求項６】
前記シームレスカプセル前駆体の乾燥を、前記中間層の粘度が２５０ｃｐｓ以下となる温度以上であって、前記最外殻層をなす組成物の水溶液のゲル化温度以下の乾燥温度で行うことを特徴とする請求項４または５に記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【請求項７】
前記同心３重ノズルの中心管および／または中間管が断熱性を有することを特徴とする請求項４ないし６のいずれかに記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【請求項１】
最外殻層と、中間層と、芯部とからなる３重構造を有する粒子であって、
前記最外殻層が、ゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、
前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、
前記芯部が、微生物または生物由来物質を含有する組成物からなり、
粒子全体の水分量が５％以下、かつ水分活性が０．５以下であることを特徴とする微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【請求項２】
前記最外殻層に含まれる天然ガムと、２価のカチオンとの反応により形成された網目構造を有することを特徴とする請求項１記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【請求項３】
前記中間層をなす疎水性物質が、レシチンと油脂類の混合物である請求項１または２に記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子。
【請求項４】
同心３重ノズルを用いて硬化用液中に押し出す方法で、最外殻層と、中間層と、芯液とからなる３重構造のシームレスカプセル前駆体を形成する工程と、
前記シームレスカプセル前駆体を乾燥させて、粒子全体の水分量を５％以下、かつ水分活性を０．５以下とする工程を有し、
前記最外殻層がゼラチンおよび天然ガムを含む組成物からなり、該組成物の水溶液のゲル化温度が６０℃以下であり、
前記中間層が、４０℃における粘度が２５０ｃｐｓ以下、かつ５℃における粘度が３００ｃｐｓ以上である疎水性物質からなり、
前記芯液が、微生物または生物由来物質を含有する水性液からなることを特徴とする微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【請求項５】
前記同心３重ノズルから押し出されたシームレスカプセル前駆体を、乾燥させる前に、２価のカチオンを含む液中に浸漬させる工程を有することを特徴とする請求項４記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【請求項６】
前記シームレスカプセル前駆体の乾燥を、前記中間層の粘度が２５０ｃｐｓ以下となる温度以上であって、前記最外殻層をなす組成物の水溶液のゲル化温度以下の乾燥温度で行うことを特徴とする請求項４または５に記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【請求項７】
前記同心３重ノズルの中心管および／または中間管が断熱性を有することを特徴とする請求項４ないし６のいずれかに記載の微生物または生物由来物質含有微細粒子の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１８４９１３（Ｐ２０１０−１８４９１３Ａ）
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３１６９６（Ｐ２００９−３１６９６）
【出願日】平成２１年２月１３日（２００９．２．１３）
【出願人】（０００１１２９１２）フロイント産業株式会社 (55)
【出願人】（０００１７３８６５）財団法人日本生物科学研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１３日（２００９．２．１３）
【出願人】（０００１１２９１２）フロイント産業株式会社 (55)
【出願人】（０００１７３８６５）財団法人日本生物科学研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]