微生物を利用した肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療
本発明は、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療に関するもので、特に、腸内細菌叢の変化を通して肥満を予防及び治療することに関するものである。本発明では、自由脂肪酸吸収能が改善された微生物製剤の摂取を通して小腸内細菌の特性改善及び移植で胃腸管内での脂肪酸吸収を減少できることが確認される。本発明では、このような実験結果に基づいて、肥満と肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防及び治療方法、予防及び治療用薬学的組成物と機能性食品、そして、このような目的で使用可能な改良乳酸菌株が提供される。本発明は、現在抗肥満治療剤として最も広く使用されているオルリスタットと同じ水準の体重減少効果を有する。本発明は、小腸内細菌の特性改善及び移植を通して胃腸管内での脂肪酸吸収を防止することによって肥満を治療できることを示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療に関するものであり、特に、微生物を利用した予防と治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、全世界的に問題となっている慢性疾患であり、効果的な治療方法がなく、継続して増加しつつある深刻な疾患である。また、肥満は、他の様々な深刻な慢性疾患をもたらす。肥満によって引き起こされる代謝性疾患としては、高血圧、糖尿病、高脂血症、動脈硬化症、虚血性心臓疾患、脂肪肝、胆石症、関節炎、肺機能障害、生殖器異常などがある。
【０００３】
現在、肥満治療剤として使用されている処方薬は、シブトラミン（アボット社のメリディア）とオルリスタット（ロシュ社のゼニカル）である。シブトラミンは、ノルアドレナリンとセロトニンの再吸収を防止することによって食欲を調節し、食物の摂取量を減少させる。しかし、シブトラミンは、中枢神経系に作用する物質という特性のため、心臓搏動と血圧などに影響を与えるという副作用を有している。シブトラミンと異なり、オルリスタットは局所的に作用する。オルリスタットは、胃と小臓の脂肪分解酵素であるリパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）の阻害剤であって、脂肪の加水分解を妨害する役割をするので、食物で摂取された脂肪の３０％程度が体内に吸収されずに排出されるようになり、結果的に体重調節効果を有する。しかし、消化されていない脂肪が胃腸管に沿って移動しながら下痢、脂肪便などの副作用をもたらすが、これは、不便なだけでなく、正常な社会生活を困難にするほどの副作用である。したがって、このような既存の肥満治療剤の問題のため、新しい概念の肥満治療剤が要求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂ．Ｓ．Ｄｒｅｗ，Ａ．Ｆ．Ｄｉｘｎ，Ｊ．Ｂ．Ｄｉｘｏｎ，Ｖａｓｃ．Ｈｅａｌｔｈ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ．３，８１７（２００７）
【非特許文献２】Ｐ．Ｇ．Ｋｏｐｅｌｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４０４，６３５（２０００）
【非特許文献３】Ｍｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２８２，１５２３（１９９９）
【非特許文献４】Ｒ．Ｐａｄｗａｌ，ＳＫ Ｌｉ，ＤＣ Ｌａｕ，Ｃｏｃｈｒａｎｅ ＤａｔａｂａｓｅＳｙｓｔ．Ｒｅｖ．３，ＣＤ００４０９４（２００３）
【非特許文献５】Ｒ．Ｓ．Ｐａｄｗａｌ，Ｓ．Ｒ．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ｌａｎｃｅｔ ３６９，７１（２００７）
【非特許文献６】Ｊ．Ｒｏｌｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｓｈｉｄｅ，Ｍ．Ｌ．Ｔｈｏｒｗａｒｔ，Ｊ．Ｓ．Ｕｌｂｒｅｃｈｔ，Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．６，１（１９９８）
【非特許文献７】Ｇ．Ａ．Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．７，１８９（１９９９）
【非特許文献８】Ｒ．Ｇｕｅｒｃｏｌｉｎｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２１，Ｓ１２（１９９７）
【非特許文献９】Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｐｔｍａｎ，Ｆ．Ｓ．Ｊｅｕｎｅｔ，Ｄ．Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５５，３０９Ｓ（１９９２）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｏ．Ｈｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６９，１１０８（１９９９）
【非特許文献１１】Ｒ．Ｅ．Ｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｓ．Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４４４，１０２２（２００６）
【非特許文献１２】Ｐ．Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｒ．Ｅ．Ｌｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｍａｈｏｗａｌｄ，Ｖ．Ｍａｇｒｉｎｉ，Ｅ．Ｒ．Ｍａｒｄｉｓ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４４４，１０２７（２００６）
【非特許文献１３】Ｐ．Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｆ．Ｂａｃｋｈｅｄ，Ｌ．Ｆｕｌｔｏｎ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ３，２１３（２００８）
【非特許文献１４】Ｗ．Ｈ．Ｌｉｎ，Ｃ．Ｆ．Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂ．２３，７４（２００６）
【非特許文献１５】Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９，１５（１９９３）
【非特許文献１６】Ｒ．Ｌｅｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３，Ｅ９１３（１９９２）
【非特許文献１７】Ｙ．Ｋｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．１５，２０５（１９９１）
【非特許文献１８】Ｍｏｌａｖｉ，Ｎ．Ｒａｓｏｕｌｉ，Ｐ．Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２１，４７９（２００６）
【非特許文献１９】Ｒ．Ｔ．Ｓｐｉｏｔｔａ，Ｇ．Ｂ．Ｌｕｍａ，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ７８，１０５２（２００８）
【非特許文献２０】Ｓ．Ｒａｎｄ，Ｊ．ＣｈｒｏｎｉｃＤｉｓ．４０，９１１（１９８７）
【非特許文献２１】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．６，５１Ｓ（１９９８）
【非特許文献２２】Ｊ．Ｏ．Ｈｉｌｌ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２７，７５０（２００６）
【非特許文献２３】Ｃ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ―Ｃｈａｇｏｙｏｎ，Ｊ．Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，Ａ．Ｇｉｌ，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．５２，２０６９（２００７）
【非特許文献２４】Ｂ．Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｗ．Ｄ．Ｈａｒｄｔ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６，１０７（２００８）
【非特許文献２５】Ｉｓｏｌａｕｒｉ，Ｍ．Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉ，Ｋ．Ｌａｉｔｉｎｅｎ，Ｓ．Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．１４，１３６８（２００８）
【非特許文献２６】Ｗ．Ｊｉａ，Ｈ．Ｌｉ，Ｌ．Ｚａｏ，Ｊ．Ｋ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．７，１２３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、肥満ネズミと低体重ネズミの臓内細菌叢を無菌ネズミに移植した実験を通して胃腸管（ＧＩ ｔｒａｃｋ）内の細菌叢の組成を変化させると、食物からのカロリー摂取効率に差が生じ、これによって体重の変化をもたらすという結論を得た。この結果によると、胃腸管でのカロリー摂取効率が少し変わる場合にも、体重が有意に増加又は減少するようになる。したがって、本発明者らは、最も主要なカロリー摂取源である脂肪が体内で自由脂肪酸の形態で摂取されるという事実を勘案した上で、胃腸管内で自由脂肪酸を減少させる微生物を棲息させると、この微生物が、体内に吸収される直前の自由脂肪酸を除去するので、食物からの脂肪摂取を効果的に減少できるようになり、その結果、カロリー摂取率を低下させることによって肥満治療剤になり得ると判断し、これを実験を通して立証することによって、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の目的は、新しい肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防・治療剤及び予防・治療方法を提供することにあり、特に、体内で脂肪分解物である自由脂肪酸を除去することによって食物を通した脂肪摂取を減少させる方法及びこのための薬学的組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、既存の肥満治療剤であるシブトラミンやオルリスタットの問題である副作用を解消した肥満治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、一般の乳酸菌であるラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を段階的に突然変異させ、一般の乳酸菌に比べて自由脂肪酸吸収能が改善された改良乳酸菌（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｏｂｂｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅ、ＦＡＲＭ）を得た後、これをネズミに一定期間摂取させ、ネズミの体脂肪蓄積と体重増加に及ぼす効果を確認する実験を実施し、その結果、現在の抗肥満治療剤として最も広く使用されているオルリスタットと同じ水準の体重減少効果を確認する。すなわち、本発明では、自由脂肪酸吸収能が改善された微生物製剤の摂取を通して小腸内細菌の特性改善及び移植で胃腸管内での脂肪酸吸収を減少できることを確認し、これは、本発明の微生物製剤及び方法で肥満を治療できることを意味する。
【０００８】
本発明では、このような実験結果に基づいて、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を有効成分として含有する、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療のための薬学的組成物を提供する。本発明で提供する薬学的組成物が有効成分として含む微生物は、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物であって、望ましくは、ヒトの腸内細菌叢を構成する微生物又はヒトの腸管から由来した微生物である。より望ましくは、前記微生物は乳酸菌である。本発明の実施例では、自由脂肪酸の吸収能力が増加した改良乳酸菌株としてラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）を得た。
【０００９】
また、本発明では、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある乳酸菌を含む、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と改善のための機能性食品を提供する。本明細書における「機能性食品」は、食品の本来の目的以外に特定の機能性が付加された食品であって、健康食品、健康機能性食品などを全て含む意味である。本発明の機能性食品が目的とする機能性は、肥満予防及び改善である。
【００１０】
また、本発明では、自由脂肪酸吸収能が改善された改良乳酸菌であるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）を提供する。
【００１１】
また、本発明では、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を投与し、体内での自由脂肪酸吸収を減少させることを含む、肥満と肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防及び治療方法を提供する。
【００１２】
本発明によって自由脂肪酸吸収能がある微生物を投与又は摂取すると、体内での自由脂肪酸吸収を減少できるので、効果的な肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療方法になり得る。
【発明の効果】
【００１３】
食物からのカロリー過多摂取は、肥満をもたらす最も重要な決定要素であり、これは、低開発国で肥満を最も速く増加させる要因でもある。ほとんど場合、体内カロリー消費より１％でもカロリー摂取が超えると、体脂肪が蓄積されるようになり、結局、これが肥満につながる。本発明の薬学的組成物は、自由脂肪酸摂取能が改善された乳酸菌を宿主の小腸管内に移植させることによって宿主のカロリー摂取を制限し、抗肥満効果をもたらすが、これは、抗肥満治療剤として最も広く使用されているオルリスタットとも類似した水準である。さらに、自由脂肪酸吸収能がある微生物を有効成分として含有する本発明の薬学的組成物は、既存の肥満治療剤に比べて次のような非常に優れた長所を有している。第一に、中枢神経系に作用しないので、シブトラミンなどの中枢神経系に作用する薬物に比べて遥かに優れた長期安全性を有している。第二に、脂肪分解に関与しないので、小腸管内で下痢や脂肪便などの副作用を引き起こさない。第三に、乳酸菌などの人体に有益な微生物を有効成分としているので、医薬品の素材として非常に優れた安全性を確保している。
【００１４】
また、腸内細菌叢は、肥満の他にも感染疾患、癌、アレルギー疾患などの多様な複合疾患と関連している。したがって、生菌移植を通した治療は、腸内細菌叢と関連した多様な疾患に適用できる可能性を有している。本発明は、自由脂肪酸摂取能が改善された腸内細菌を小腸管内に移植させることによって宿主の腸内細菌叢を効果的に変化させ、宿主の疾患を治療できることを証明することによって、今後の腸内細菌叢と関連した多様な疾患に対する生菌移植を通した治療の可能性を示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】乳酸菌の脂肪酸吸収能を測定した結果を示したグラフである。
【図２】乳酸菌がコロニー形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）された宿主でのカロリー摂取変化を測定した結果を示したグラフである。
【図３】実験群の体重変化を測定した結果を示したグラフである。
【図４】実験群の内臓脂肪を磁気共鳴映像装置（ＭＲＩ）で測定し、映像分析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｊ、ＵＳＡ）で分析した結果を示したグラフである。
【図５】２２週間の高脂肪食餌群とＦＡＲＭ乳酸菌摂取群の内臓脂肪蓄積イメージを示した図である。
【図６】実験群の血中脂質濃度変化を示したグラフである（ＴＧは トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ＴＣは総コレステロール（ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＨＤＬは高比重リポタンパクコレステロール（ｈｉｇｈ―ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＬＤＬは低比重リポタンパクコレステロール（ｌｏｗ―ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を示す。）。
【図７】実験群の血中インスリンとレプチンの濃度変化を示したグラフである。
【図８】実験群の血糖変化を示したグラフである。
【図９】ＦＡＲＭ３乳酸菌のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）脂肪酸吸収能を３１７９乳酸菌と比較して示したグラフである。
【図１０】ＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主でのカロリー摂取の減少を示す結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した改良菌株）
人体に存在する乳酸菌の一種であるラクトバチルス・アシドフィラスＫＣＴＣ ３１７９をＮＴＧ（Ｎ―ｍｅｔｈｙｌ―Ｎ―ｎｉｔｒｏ―Ｎ―ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で処理して突然変異を誘導した後、自由脂肪酸の吸収能力が増加した改良乳酸菌の菌株を見出した。この改良乳酸菌は、一般の乳酸菌に比べて周辺環境から自由脂肪酸を吸収する能力が２．１倍以上である菌株であって、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｏｂｂｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅ １）と命名し、これを２００９年５月１９日付けで韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰで寄託した。本発明では、これを「ＦＡＲＭ１」と略称する。そして、ＦＡＲＭ１を利用して４ＮＱＯ（４―ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ １―ｏｘｉｄｅ：４−ニトロキノリン １−オキシド）で２次突然変異を誘導し、自由脂肪酸の吸収能が遥かに増加した改良菌株ＦＡＲＭ２を得た後、これを２００９年５月１９日付けで韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰで寄託した。本発明では、これを「ＦＡＲＭ２」と略称する。放射能標識実験によると、ＦＡＲＭ２は、一般の菌株に比べて自由脂肪酸を３．１倍以上速く吸収する特性を有していた。
【００１７】
食用乳酸菌の最も重要な特徴は、摂取された後、宿主の小腸管内で集落を形成して成長する特性、すなわち、コロニー形成能（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）である。乳酸菌としての特性を調査するために、改良菌株ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２を用いて小腸管内での集落形成及び成長能力を調査した。ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２は、ヨーグルトに発酵する過程で正常な成長と酸性化能力を維持し、宿主にヨーグルトの形態で摂取された後にもネズミの小腸管内で成功的にコロニー形成された。このような結果は、脂肪酸吸収能が向上したＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２が乳酸菌の特性を維持していることを示す。
【００１８】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した乳酸菌が小腸管の自由脂肪酸を除去することによって実際に宿主のカロリー摂取を減少させるかどうかを確認）
私たちが乳酸菌を摂取したとき、乳酸菌は小腸に一時的に菌叢を形成するようになるが、小腸は、体内で脂肪分解物である脂肪酸が主に吸収される部分である。ほとんどの脂肪酸が摂取される小腸でＦＡＲＭが自由脂肪酸を消耗するようになると、これによって人体に吸収可能な自由脂肪酸が減少するので、一種の生物捕捉剤（ｂｉｏ―ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）として作用するようになり、その結果、宿主のカロリー摂取量を減少させる。ＦＡＲＭが小腸管の自由脂肪酸を除去することによって実際に宿主のカロリー摂取を減少させるかどうかを実験するために、ＦＡＲＭ菌株で発酵させたヨーグルトをネズミに８週間摂取させた。ＦＡＲＭ乳酸菌がネズミの小腸管内にコロニー形成されることを確認した後、放射能標識されたトリオレインを給餌し、血清内の放射能量を測定した。この結果は、放射能標識されたトリオレインの消化物である放射能標識された自由脂肪酸の吸収がどれほど減少したかを示すようになる。ＦＡＲＭをコロニー形成したネズミの場合、胃腸管に定着された改良菌株が周辺から自由脂肪酸を摂取する能力が遥かに向上したことを示し、これに比例して宿主の自由脂肪酸摂取が減少することを示した。ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２をコロニー形成したネズミの場合、一般の乳酸菌をコロニー形成したネズミに比べて、宿主の自由脂肪酸摂取がそれぞれ３５％と４７％減少することが分かる。これは、ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２がネズミの小腸管内で吸収可能な自由脂肪酸を減少させることによって、結局、宿主に摂取される食物のカロリー量を減少させる結果を意味する。
【００１９】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した小腸管内乳酸菌によるカロリー摂取減少が肥満に及ぼす効果）
小腸管内のＦＡＲＭによるカロリー摂取の減少が肥満に及ぼす効果を見るために、肥満ネズミに２２週間ＦＡＲＭで発酵させたヨーグルトを摂取させた。一般の乳酸菌又はＦＡＲＭ乳酸菌を発酵させ、１ｍｌ当たり１０９ＣＦＵを含有しているヨーグルト３ｍｌを毎日摂取させると、４週後にネズミの小腸管内に乳酸菌がコロニー形成されるようになる。予想した通り、正常な乳酸菌を摂取させたネズミに比べて、ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２乳酸菌を摂取させたネズミの体重がそれぞれ１５％と１９％に減少する効果を示した。哺乳動物のカロリー過多摂取によると、ほとんどが内臓脂肪として蓄積されるので、体重の増加は内臓脂肪の増加量に比例する。したがって、乳酸菌給餌実験の終了日にオープンタイプの０．３テスラＭＲＩを利用してネズミの内臓脂肪を測定した。非処理対照群、一般の乳酸菌を摂取させたネズミ実験群、ＦＡＲＭ１を摂取させたネズミ実験群、ＦＡＲＭ２を摂取させたネズミ実験群の内臓脂肪量は、それぞれ２７％、２４％、１４％及び１３％であった。この結果は、ＦＡＲＭが宿主の小腸管内にコロニー形成されると、ＦＡＲＭが小腸管内の自由脂肪酸吸収を減少させ、結局、宿主の体重増加と体脂肪蓄積を防止する効果を有することを意味する。すなわち、宿主の自由脂肪酸摂取／吸収量を減少させると、カロリー摂取の減少によって内臓脂肪と体重が減少する。
【００２０】
（代謝性症侯群と関連している血清内生化学分析）
肥満は、インスリン抵抗性、グルコース耐性、高脂血症、心血管疾患などの代謝性症侯群と密接に関連している。したがって、乳酸菌給餌実験の終了日には、代謝性症侯群と関連している血清内生化学分析をした。乳酸菌を全く摂取させていない対照群と一般の乳酸菌を摂取させたネズミにおけるＴＧ、ＴＣ及びＬＤＬ―コレステロール量は、ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させたネズミに比べて高かった。一方、予想した通り、ＨＤＬコレステロール数値は、対照群では低かったが、ＦＡＲＭグループでは高かった。抗肥満効果を示したＦＡＲＭ乳酸菌は、予想通りに糖尿でも優れた効果を示した。ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させると、乳酸菌を全く摂取させていない対照群に比べて血清インスリン数値がそれぞれ２３％と３０％減少した。血清レプチン数値も、乳酸菌を全く摂取させなかった対照群に比べて、ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させたネズミではそれぞれ２０％と４５％減少した。血清グルコース数値も、乳酸菌を全く摂取させていない対照群と一般の乳酸菌を摂取させたネズミの場合は１２２．１ｍｇ／ｄｌと１２３．４ｍｇ／ｄｌである一方、ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させたネズミではそれぞれ１０７．６ｍｇ／ｄｌと１０８．４ｍｇ／ｄｌ程度に減少したことが分かる。体重の増加とともに人体のレプチンとインスリンに対する感受性が減少し、これと同時に血清脂質プロファイルが悪化するが、その結果、レプチン、インスリン、グルコース、ＬＤＬコレステロール、総コレステロールの血中濃度が増加するようになる。この結果は、ＦＡＲＭ乳酸菌が体重増加を防止することによって血中脂質プロファイルを改善し、インスリンとレプチンの耐性を阻害するのに効果的であることを示す。また、ＦＡＲＭ乳酸菌が肥満治療剤として優れた性質を有していることを示す。
【００２１】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した乳酸菌の抗肥満治療剤としての可能性）
ＦＡＲＭをコロニー形成したネズミは、自由脂肪酸の摂取を減少させ、その結果、体重増加と内臓脂肪蓄積を防止する優れた特性を有しているので、自由脂肪酸摂取能が改善されたＦＡＲＭ乳酸菌の抗肥満治療剤としての可能性を実験した。ＦＡＲＭ２乳酸菌を利用してＥＭＳ（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ：エチレンメタン スルフォネート）で３次突然変異を誘導することによって、自由脂肪酸摂取能がさらに向上した乳酸菌株を見出した。見出した３次突然変異株ＦＡＲＭ３は、一般の乳酸菌より自由脂肪酸摂取能が５．０倍以上改善された菌株であって、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３と命名し、これを２００９年５月１９日付けで韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰで寄託した。本発明では、これを「ＦＡＲＭ３」と略称する。ＦＡＲＭ３で発酵させたヨーグルトを毎日３ｍｌずつネズミに４週間摂取させると、一般の乳酸菌を摂取させた対照群に比べて体重が１８％以上減少する結果を示した。このようなＦＡＲＭ３の体重減少程度は、現在医薬品として使用されているオルリスタットと類似した水準である。そして、オルリスタットと異なり、ＦＡＲＭ３の場合は、摂取時に体重の効果的な減少以外に脂肪便などの副作用を示さなかった。これは、ＦＡＲＭ３が安全かつ効果的な肥満治療剤として開発可能な医薬品素材であることを意味する。本発明では、乳酸菌ＦＡＲＭ３を用いて実験したが、本発明の技術思想がＦＡＲＭ３や乳酸菌に限定されることはない。肥満治療に関する本発明の技術思想は、哺乳類、特に、ヒトの胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物であればいずれにも適用可能であり、これは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００２２】
以下、具体的な実施例を通して本発明をより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されることはない。
【００２３】
（試薬）
試薬は、下記に示したもの以外は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製のものを購入して使用した。
【００２４】
［１―１４Ｃ］―パルミチン酸：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製
【００２５】
液体シンチレーションカクテル（ＬＳＣ）：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製
【００２６】
［カルボキシル―１４Ｃ］―トリオレイン：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製
【００２７】
ＭＲＡ（Ｍａｎ―Ｒｏｇｏｓａ―Ｓｈａｒｐｅ）：Ｄｉｆｃｏ社製
【００２８】
オルリスタット（ゼニカル）：Ｒｏｃｈｅ社製
【００２９】
殺菌可能な（ｓｔｅｒｉｌｉｚａｂｌｅ）３８４―ウェルプレート及び３８４―ピンレプリケーター：Ｎｕｎｃ社製
【００３０】
メンブレン半乾燥システム（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｍｉ―ｄｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）：Ｂｉｏ―Ｒａｄ社製
【００３１】
Ｘ―線フィルム：Ｋｏｄａｋ社製
【００３２】
Ｇｅｌ―Ｐｒｏアナライザーソフトウェア（ａｎａｌｙｚｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）：Ｍｅｄｉａ ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製
【００３３】
嫌気培養：ＢＢＬガスパック嫌気システム（Ｇａｓ―Ｐａｃｋ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）の嫌気性ジャーで行われる。
【００３４】
ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ―Ｄａｗｌｅｙ）雄ネズミ：Ｄａｅ Ｈａｎ Ｂｉｏｌｉｎｋ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【００３５】
ＭＲＩイメージ：ブルカーバイオスペック４７／４０ ４．７―テスラ機器（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ４７／４０ ４．７―Ｔｅｓｌａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｂｒｕｋｅｒ社製）から得てＩｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）で分析される。
【００３６】
血清（Ｓｅｒｕｍ）：それぞれラット／マウスＥＬＩＳＡキット（ＬＩＮＣＯ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、レプチンＥＬＩＳＡキット（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍ社製）、血糖測定器（Ａｃｃｕ―Ｃｈｅｋ社製）及びコレステロールＥＬＩＳＡキット（Ａｓａｎ Ｐｈａｒｍ．Ｃｏ製）で分析される。
【００３７】
（突然変異を通して脂肪酸吸収能が改善された乳酸菌の開発）
Ｌ．アシドフィラスＫＣＴＣ３１７９乳酸菌をＭＲＳ培地に接種し、ＢＢＬガスパック（Ｇａｓ―Ｐａｃｋ）によりｐＨ７．２、３７℃で嫌気培養した。自由脂肪酸吸収能が改善されたＦＡＲＭ菌株を得るための突然変異実験は、次のように行われた。Ｌ．アシドフィラスＫＣＴＣ３１７９乳酸菌を２４時間精製培養した後、液状培養液にＮＴＧ（Ｎ―ｍｅｔｈｙｌ―Ｎ―ｎｉｔｒｏ―Ｎ―ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。２５℃で３０分間培養した後、ＭＲＳブロスで３回洗浄し、ＭＲＳブロスに再び懸濁した。連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）後、処理された各細胞をＭＲＳ寒天プレートに置き、嫌気状態で３７℃、４８時間培養した後、５０μｌのＭＲＳブロスが入っている３８４―ウェルプレートに接種し、３７℃で１２時間嫌気培養した。培養が終了した後、ＭＲＳブロス培養液のみが入っている３８４―ウェルプレートと、０．１ｎＣｉ／ｍｌの１４Ｃ―パルミチン酸が含まれたＭＲＳブロス培養液が入っている３８４―ウェルプレートを３８４―ピンレプリケーターを用いて複製した。複製されたプレートは、パラフィルムで覆った後、３７℃でやわらく揺らしながら３０分間培養した後、１４Ｃと放射能標識された培養液を２μｌずつナイロンメンブレンにそれぞれ移した後、半乾燥システム（ｓｅｍｉ―ｄｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）で乾燥させた。乾燥した膜は、ＭＲＳブロスで３回洗浄し、付着している１４Ｃ―パルミチン酸を除去した後、−８０℃で３日間Ｘ線フィルムに露出させた。Ｘ線フィルムから得た放射能程度は、Ｇｅｌ―Ｐｒｏアナライザーソフトウェアで分析して信号の強いコロニーを選別し、これから最終的に脂肪酸吸収能が改善された乳酸菌株を探してＦＡＲＭ１（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｏｂｂｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅ １）と命名した。次に、ＦＡＲＭ１に前記のような方法で４ＮＱＯ（４―ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ １―ｏｘｉｄｅ：４−ニトロキノリン １−オキシド）を処理してＦＡＲＭ２を得た後、前記と同じ方法でＦＡＲＭ２にＥＭＳ（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ：エチルメタン スルフォネート）を処理してＦＡＲＭ３を得た。
【００３８】
（インビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）脂肪酸吸収能評価）
見出された乳酸菌株の脂肪酸吸収能を評価するために、各乳酸菌株を放射能標識された１４Ｃパルミチン酸と共に培養した後、放射能程度を測定した。このために、各乳酸菌株をＭＲＳブロス２ｍｌに接種した後、培養して代数生長期に到逹すると遠心分離し、１ｎＣｉ／ｍｌの濃度で１４Ｃ―パルミチン酸が入っているＭＲＳ培地に接種した後、３７℃で１時間培養した。１４Ｃと標識された各細胞をＭＲＳブロスで３回洗浄した後、ＭＲＳブロス１ｍｌに懸濁し、そのうち０．２ｍｌを２ｍｌの液体シンチレーションカクテルが入っているシンチレーションバイアルに移した。混合物を１分間ボルテックスした後、液体シンチレーションスペクトロメーターを用いて１４Ｃ活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した。
【００３９】
（乳酸能評価）
各乳酸菌株をＭＲＳ培地により３７℃で嫌気培養して代数生長期に到逹すると、１ｍｌの細胞培養液を無菌状態の脱脂牛乳（１０％）とグルコース（２％）を含有した１００ｍｌに接種した後、３７℃で培養しながら２４時間の間隔でｐＨ変化を測定した。細胞生長曲線を測定するためには、４８時間発酵した後で作られたヨーグルト５ｍｌを１５ｍｌのコニカルチューブに移した後、ボルテックスをした。均質化された混合物１ｍｌをＰＢＳで希釈し、希釈液５０μｌをＭＲＳプレートに塗抹し、４８時間嫌気培養した後、コロニーの数を数えた。
【００４０】
（動物実験）
全ての動物実験は、動物管理及び利用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規定にしたがって行われた。体重が２００〜２２０ｇ程度であるＳＤ雄ネズミを二匹ずつ檻に入れ、最初の１週間は一般の飼料と水を自由に級餌した。実験期間の間は１２時間の間隔で昼と夜の照明を変え、温度は２２±１℃、湿度は４０〜５０％に一定に維持した。一週間後、ネズミたちを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、対照群（高脂肪飼料摂取群）、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭグループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）に分けた。この実験に使用された高脂肪飼料は、一般のネズミ飼料（複合炭水化物６０％、タンパク質２２％、脂肪３.５％、繊維素５％、粗灰分８％、カルシウム０.６％、リン１．２％）に豚脂を２０％添加した特殊飼料であって、組成は、複合炭水化物４８％、タンパク質１７.６％、脂肪２２.８％、繊維素４％、粗灰分６.４％、カルシウム０.４８％、リン０.９６％で構成されている。食餌実験のためのヨーグルトは、脱脂粉乳１０％、砂糖２％、１０９／ｍｌ以上の菌体濃度を有するＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ培養液１％である。実験期間の間、ネズミたちは、それぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、発酵ヨーグルト３ｍｌが口腔に直接給餌された。体重は、１２時間禁食した後、午前９時から１時の間に測定された。
【００４１】
＜１．胃腸管集落形成能＞
ネズミに各実験群によるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ発酵ヨーグルトを８週間級餌した後、各実験群から４匹のネズミを無作為に選び、エーテルで麻酔させた後、犠牲させた。ネズミから胃と小腸などの胃腸管組織を直ちに収去し、５０ｍｌのコニカルチューブに移した後、無菌食塩水で希釈した。次に、胃腸管組織の内容物を排出するために、ホモジナイザーを用いて均質化した後、乳酸菌選別寒天プレート（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇａｒ ｐｌａｔｅｓ）に塗抹し、４８時間の間嫌気培養した。乳酸菌選別培地で形成された乳酸菌コロニーの数を数え、胃腸管内の組織部位別の１グラム当たりのｌｏｇ１０ＣＦＵ（湿重量）で計算した。
【００４２】
＜２．ＦＡＲＭ乳酸菌の肥満誘導抑制効果＞
長い鎖構造を有しているトリグリセリドの一種であるトリオレインを用いてＦＡＲＭ乳酸菌の肥満誘導抑制効果に対する実験が行われた。［１４Ｃ］と放射能標識されたトリオレインをベンゼン溶液に作り、−７０℃で保管して使用した。［１４Ｃ］と放射能標識されたトリオレイン１μＣｉを放射能標識されていないトリオレインと混ぜた後、室温で窒素ガスを用いて溶媒を揮発させた。トリオレイン混合物を、乳酸菌を２２週間摂取させたネズミに体重１００ｇ当たり０.５ｍｍｏｌで級餌した後、１０時間の間２時間の間隔で心臓穿刺でネズミの血液サンプルを収去した。各血清から０．１ｍｌを１．８ｍｌのＬＳＣに添加した後、液体シンチレーションスペクトロメーターで１４Ｃ活性を測定した。ＦＡＲＭ乳酸菌の肥満誘導抑制は、各乳酸菌発酵ヨーグルトを摂取させたネズミでの脂肪酸摂取能の差による血清内放射能程度の差を測定することによって判断した。
【００４３】
＜３．内臓脂肪の磁気共鳴映像測定＞
内臓脂肪部位の体脂肪を磁気共鳴映像（ＭＲＩ）機器で分析するために、ブルカーバイオスペック４７／４０ ４．７―テスラ機器を使用した。実験に使用されたネズミは、ゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ）（２５ｍｇ／ｋｇ）とロンパン（ｒｏｍｐｕｎ）（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。映像を得るためにネズミたちを磁石板に位置させ、ボディコイルを送信機と受信機として使用して記録した。内臓脂肪と皮下脂肪部位を測定するために、第４〜第５の腰椎間で上から８ｃｍ、下から８ｃｍの部位をＴ１強調映像として得た。内臓脂肪と皮下脂肪部位はイメージＪプログラムで分析された。
【００４４】
＜４．血清生化学分析＞
実験ネズミたちの血液は、実験開始日と終了日である２２週後に収去され、生化学分析に使用された。血液採取前に全ての実験動物は節食し、エーテルで麻酔した状態で心臓穿刺で全ての血液を得た。血液を２，０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離して得た血清は、分析するまで７０℃で保管した。血清生化学分析のために、ラット／マウスＥＬＩＳＡキット（インスリン）、レプチンＥＬＩＳＡキット（レプチン）、血糖測定器、ＥＬＩＳＡキット（血清総コレステロール、ＨＤＬ―コレステロール、ＬＤＬ―コレステロール、トリグリセリド）などが使用された。
【００４５】
＜５．ＦＡＲＭ３乳酸菌の抗肥満効果＞
３ヶ月になったＳＤ雄ネズミは、８週間高脂肪を食餌し、平均体重が４２５ｇになるように肥満を誘導した。これらネズミたちを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭ３グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ３乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、オルリスタットグループ（高脂肪飼料にゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）（登録商標）を２００ｍｇ／ｋｇの食物として添加して摂取させた群）に分けた。その後、４週間、ネズミたちはそれぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、体重は、１２時間禁食した後、午前９時から１時の間に測定された。
【００４６】
＜６．統計処理＞
全てのデータは平均値±標準偏差に表示され、ＡＮＯＶＡ（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ：分散分析）テストによってｐ＜０．０５である場合に統計的に有意であると判断された。
【００４７】
（結果）
＜１．乳酸菌の脂肪酸吸収能及び乳酸菌がコロニー形成された宿主のカロリー摂取変化＞
図１は、乳酸菌の脂肪酸吸収能を測定した結果を示している。ラクトバチルス・アシドフィラスＫＣＴＣ ３１７９（「３１７９」と表示される。）乳酸菌をＮＴＧ（Ｎ―ｍｅｔｈｙｌ―Ｎ―ｎｉｔｒｏ―Ｎ―ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で突然変異させて見出されたＦＡＲＭ１乳酸菌は、脂肪酸吸収能が増加していた。ＦＡＲＭ１乳酸菌を４ＮＱＯ（４―ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ １―ｏｘｉｄｅ：４−ニトロキノリン １−オキシド）で２次突然変異させて得たＦＡＲＭ２は、ＦＡＲＭ１より改善された脂肪酸吸収能を有していた。外部から脂肪酸を吸収する能力の差を測定するために、１ｎＣｉ／ｍｌの濃度で１４Ｃ放射能標識されたパルミチン酸と乳酸菌を１時間培養した後、乳酸菌の放射能程度を液体シンチレーションスペクトロメーターで測定し、これは標準偏差（ｎ＝４）に表示された。
【００４８】
図２は、乳酸菌がコロニー形成された宿主でのカロリー摂取変化を測定した結果を示している。ＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主でカロリー摂取の減少が確認された。ＳＤネズミに８週間ＦＡＲＭ乳酸菌又は一般の乳酸菌Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ ３１７９を給餌し、胃腸管に乳酸菌をコロニー形成した後、１４Ｃ―標識されたトリオレインを摂取させ、血液を採取して血清内放射能程度を測定することによって宿主のカロリー摂取変化を測定した。
【００４９】
図１及び図２の結果から、ＦＡＲＭ乳酸菌の脂肪酸吸収能とＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主の胃腸管での脂肪吸収が反比例することが分かる。
【００５０】
＜２．乳酸能＞
各乳酸菌株は、無菌状態のグルコース（２％）を含有した脱脂牛乳（１０％）１００ｍｌに接種し、３７℃でヨーグルトに発酵させた。ヨーグルトに発酵される過程で乳酸菌の乳酸能を測定するために、ｐＨ変化を２４時間後、４８時間後、７２時間後に測定した。１０個の試料の測定値は平均値±標準偏差に表示された。結果は、次の表１に示す通りである。
【００５１】
表１
１０個の試料の測定値は平均値±標準偏差
【００５２】
＜３．胃腸管内の集落形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）能力＞
ネズミに各実験群によるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＫＣＴＣ３１７９又はＦＡＲＭ）発酵ヨーグルトを８週間給餌した後、胃と小腸などの胃腸管組織を収去し、胃腸管内の組織部位別の１グラム当たりのｌｏｇ１０ＣＦＵ（湿重量）を得た。対照群は乳酸菌無処理群で、５個の試料の測定値は平均値±標準偏差に表示された。結果は、次の表２に示す通りである。
【００５３】
表２
５個の試料の測定値は平均値±標準偏差
【００５４】
＜４．食餌で肥満を誘導する間におけるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９、ＦＡＲＭ１、ＦＡＲＭ２の胃腸管内の集落形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）能力＞
ネズミに各実験群によるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＫＣＴＣ３１７９又はＦＡＲＭ）発酵ヨーグルトを４週間給餌した後、胃と小腸などの胃腸管組織を収去し、胃腸管内の組織部位別の１グラム当たりのｌｏｇ１０ＣＦＵ（湿重量）を得た。対照群は乳酸菌無処理群で、５個の試料の測定値は平均値±標準偏差に表示された。結果は、次の表３に示す通りである。
【００５５】
表３
５個の試料の測定値は平均値±標準偏差
【００５６】
＜５．高脂肪食餌で誘導された肥満に対するＦＡＲＭのカロリー摂取減少の効果＞
結果は、図３〜図５に示す通りである。図３は、実験群の体重変化を測定した結果を示している。体重が２００〜２２０ｇ程度の３ヶ月になったＳＤ雄ネズミを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、対照群（高脂肪飼料摂取群）、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭグループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）に分けた。その後、２２週間、ネズミたちはそれぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、体重変化は平均値±標準偏差に表示された。
【００５７】
図４は、実験群の内臓脂肪を磁気共鳴映像装置（ＭＲＩ）で測定して分析し、映像分析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｊ、ＵＳＡ）で分析した結果を示している。内臓脂肪量の変化は平均値±標準偏差に表示された。
【００５８】
図５は、２２週間の高脂肪食餌群とＦＡＲＭ乳酸菌摂取群の内臓脂肪蓄積イメージを示している。
【００５９】
＜６．一般の乳酸菌ＫＣＴＣ ３１７９とＦＡＲＭ乳酸菌給餌後の血清数値の比較結果＞
結果は、図６〜図８に示す通りである。体重が２００〜２２０ｇ程度の３ヶ月になったＳＤ雄ネズミを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、対照群（高脂肪飼料摂取群）、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭグループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）に分けた。実験開始日及び終了日に採取された血液から得た血清数値を分析した結果は、標準偏差に表示された。図６は、血中脂質濃度の変化を示したもので、ＴＧはトリグリセリド、ＴＣは総コレステロール、ＨＤＬは高比重リポタンパクコレステロール、ＬＤＬは低比重リポタンパクコレステロールを示す。図７は、血中インスリンとレプチン濃度の変化を示したもので、図８は血糖変化を示している。
【００６０】
＜７．食餌で誘導された肥満に対するＦＡＲＭ３の抗肥満効果＞
結果は、図９及び図１０に示す通りである。図９は、ＦＡＲＭ３乳酸菌のインビトロ脂肪酸吸収能を３１７９乳酸菌と比較したものである。ＦＡＲＭ２乳酸菌をＥＭＳ（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ：エチルメタン スルフォネート）で３次突然変異させて得たＦＡＲＭ３は、ＦＡＲＭ２より改善された脂肪酸吸収能を有する。外部から脂肪酸を吸収する能力の差を測定するために、１ｎＣｉ／ｍｌの濃度で１４Ｃと放射能標識されたパルミチン酸と乳酸菌を１時間培養した後、乳酸菌の放射能程度を液体シンチレーションスペクトロメーターで測定し、これは標準偏差（ｎ＝４）に表示された。
【００６１】
図１０は、ＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主でのカロリー摂取の減少を示す結果を示している。ＳＤネズミに８週間ＦＡＲＭ乳酸菌又は一般の乳酸菌Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９を給餌し、胃腸管に乳酸菌をコロニー形成した後、１４Ｃ―標識されたトリオレインを摂取させ、血液を採取して血清内放射能程度を測定することによって宿主のカロリー摂取変化を測定した。まず、３ヶ月になったＳＤ雄ネズミは、８週間高脂肪を食餌し、平均体重が４２５ｇになるように肥満を誘導した。
【００６２】
これらネズミたちを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、３１７９グループ（○、高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭ３グループ（●、高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ３乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、オルリスタットグループ（△、高脂肪飼料にゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）（登録商標）を２００ｍｇ／ｋｇの食物として添加して摂取させた群）に分けた。その後、４週間、ネズミたちはそれぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、体重変化は平均値±標準偏差に表示された。
【００６３】
（翻訳文）
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
原寄託に対する受託証
下記の国際寄託機関によって規則第７．１条の規定によって発行された。
受信：ＪＩＮＩＳ
大韓民国 全羅北道 完州郡 鳳東邑 デゥン山里 ９４８―９（〒５６５―９０２）
【００６４】
（翻訳文）
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
原寄託に対する受託証
下記の国際寄託機関によって規則第７．１条の規定によって発行された。
受信：ＪＩＮＩＳ
大韓民国 全羅北道 完州郡 鳳東邑 デゥン山里 ９４８―９（〒５６５―９０２）
【００６５】
（翻訳文）
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
原寄託に対する受託証
下記の国際寄託機関によって規則第７．１条の規定によって発行された。
受信：ＪＩＮＩＳ
大韓民国 全羅北道 完州郡 鳳東邑 デゥン山里 ９４８―９（〒５６５―９０２）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療に関するものであり、特に、微生物を利用した予防と治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、全世界的に問題となっている慢性疾患であり、効果的な治療方法がなく、継続して増加しつつある深刻な疾患である。また、肥満は、他の様々な深刻な慢性疾患をもたらす。肥満によって引き起こされる代謝性疾患としては、高血圧、糖尿病、高脂血症、動脈硬化症、虚血性心臓疾患、脂肪肝、胆石症、関節炎、肺機能障害、生殖器異常などがある。
【０００３】
現在、肥満治療剤として使用されている処方薬は、シブトラミン（アボット社のメリディア）とオルリスタット（ロシュ社のゼニカル）である。シブトラミンは、ノルアドレナリンとセロトニンの再吸収を防止することによって食欲を調節し、食物の摂取量を減少させる。しかし、シブトラミンは、中枢神経系に作用する物質という特性のため、心臓搏動と血圧などに影響を与えるという副作用を有している。シブトラミンと異なり、オルリスタットは局所的に作用する。オルリスタットは、胃と小臓の脂肪分解酵素であるリパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）の阻害剤であって、脂肪の加水分解を妨害する役割をするので、食物で摂取された脂肪の３０％程度が体内に吸収されずに排出されるようになり、結果的に体重調節効果を有する。しかし、消化されていない脂肪が胃腸管に沿って移動しながら下痢、脂肪便などの副作用をもたらすが、これは、不便なだけでなく、正常な社会生活を困難にするほどの副作用である。したがって、このような既存の肥満治療剤の問題のため、新しい概念の肥満治療剤が要求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂ．Ｓ．Ｄｒｅｗ，Ａ．Ｆ．Ｄｉｘｎ，Ｊ．Ｂ．Ｄｉｘｏｎ，Ｖａｓｃ．Ｈｅａｌｔｈ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ．３，８１７（２００７）
【非特許文献２】Ｐ．Ｇ．Ｋｏｐｅｌｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４０４，６３５（２０００）
【非特許文献３】Ｍｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２８２，１５２３（１９９９）
【非特許文献４】Ｒ．Ｐａｄｗａｌ，ＳＫ Ｌｉ，ＤＣ Ｌａｕ，Ｃｏｃｈｒａｎｅ ＤａｔａｂａｓｅＳｙｓｔ．Ｒｅｖ．３，ＣＤ００４０９４（２００３）
【非特許文献５】Ｒ．Ｓ．Ｐａｄｗａｌ，Ｓ．Ｒ．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ｌａｎｃｅｔ ３６９，７１（２００７）
【非特許文献６】Ｊ．Ｒｏｌｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｓｈｉｄｅ，Ｍ．Ｌ．Ｔｈｏｒｗａｒｔ，Ｊ．Ｓ．Ｕｌｂｒｅｃｈｔ，Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．６，１（１９９８）
【非特許文献７】Ｇ．Ａ．Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．７，１８９（１９９９）
【非特許文献８】Ｒ．Ｇｕｅｒｃｏｌｉｎｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２１，Ｓ１２（１９９７）
【非特許文献９】Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｐｔｍａｎ，Ｆ．Ｓ．Ｊｅｕｎｅｔ，Ｄ．Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５５，３０９Ｓ（１９９２）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｏ．Ｈｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．６９，１１０８（１９９９）
【非特許文献１１】Ｒ．Ｅ．Ｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｓ．Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４４４，１０２２（２００６）
【非特許文献１２】Ｐ．Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｒ．Ｅ．Ｌｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｍａｈｏｗａｌｄ，Ｖ．Ｍａｇｒｉｎｉ，Ｅ．Ｒ．Ｍａｒｄｉｓ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４４４，１０２７（２００６）
【非特許文献１３】Ｐ．Ｊ．Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｆ．Ｂａｃｋｈｅｄ，Ｌ．Ｆｕｌｔｏｎ，Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ３，２１３（２００８）
【非特許文献１４】Ｗ．Ｈ．Ｌｉｎ，Ｃ．Ｆ．Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂ．２３，７４（２００６）
【非特許文献１５】Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９，１５（１９９３）
【非特許文献１６】Ｒ．Ｌｅｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３，Ｅ９１３（１９９２）
【非特許文献１７】Ｙ．Ｋｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．１５，２０５（１９９１）
【非特許文献１８】Ｍｏｌａｖｉ，Ｎ．Ｒａｓｏｕｌｉ，Ｐ．Ａ．Ｋｅｒｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２１，４７９（２００６）
【非特許文献１９】Ｒ．Ｔ．Ｓｐｉｏｔｔａ，Ｇ．Ｂ．Ｌｕｍａ，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ７８，１０５２（２００８）
【非特許文献２０】Ｓ．Ｒａｎｄ，Ｊ．ＣｈｒｏｎｉｃＤｉｓ．４０，９１１（１９８７）
【非特許文献２１】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｏｂｅｓ．Ｒｅｓ．６，５１Ｓ（１９９８）
【非特許文献２２】Ｊ．Ｏ．Ｈｉｌｌ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２７，７５０（２００６）
【非特許文献２３】Ｃ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ―Ｃｈａｇｏｙｏｎ，Ｊ．Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，Ａ．Ｇｉｌ，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．５２，２０６９（２００７）
【非特許文献２４】Ｂ．Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｗ．Ｄ．Ｈａｒｄｔ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６，１０７（２００８）
【非特許文献２５】Ｉｓｏｌａｕｒｉ，Ｍ．Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉ，Ｋ．Ｌａｉｔｉｎｅｎ，Ｓ．Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．１４，１３６８（２００８）
【非特許文献２６】Ｗ．Ｊｉａ，Ｈ．Ｌｉ，Ｌ．Ｚａｏ，Ｊ．Ｋ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．７，１２３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、肥満ネズミと低体重ネズミの臓内細菌叢を無菌ネズミに移植した実験を通して胃腸管（ＧＩ ｔｒａｃｋ）内の細菌叢の組成を変化させると、食物からのカロリー摂取効率に差が生じ、これによって体重の変化をもたらすという結論を得た。この結果によると、胃腸管でのカロリー摂取効率が少し変わる場合にも、体重が有意に増加又は減少するようになる。したがって、本発明者らは、最も主要なカロリー摂取源である脂肪が体内で自由脂肪酸の形態で摂取されるという事実を勘案した上で、胃腸管内で自由脂肪酸を減少させる微生物を棲息させると、この微生物が、体内に吸収される直前の自由脂肪酸を除去するので、食物からの脂肪摂取を効果的に減少できるようになり、その結果、カロリー摂取率を低下させることによって肥満治療剤になり得ると判断し、これを実験を通して立証することによって、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の目的は、新しい肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防・治療剤及び予防・治療方法を提供することにあり、特に、体内で脂肪分解物である自由脂肪酸を除去することによって食物を通した脂肪摂取を減少させる方法及びこのための薬学的組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、既存の肥満治療剤であるシブトラミンやオルリスタットの問題である副作用を解消した肥満治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、一般の乳酸菌であるラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を段階的に突然変異させ、一般の乳酸菌に比べて自由脂肪酸吸収能が改善された改良乳酸菌（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｏｂｂｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅ、ＦＡＲＭ）を得た後、これをネズミに一定期間摂取させ、ネズミの体脂肪蓄積と体重増加に及ぼす効果を確認する実験を実施し、その結果、現在の抗肥満治療剤として最も広く使用されているオルリスタットと同じ水準の体重減少効果を確認する。すなわち、本発明では、自由脂肪酸吸収能が改善された微生物製剤の摂取を通して小腸内細菌の特性改善及び移植で胃腸管内での脂肪酸吸収を減少できることを確認し、これは、本発明の微生物製剤及び方法で肥満を治療できることを意味する。
【０００８】
本発明では、このような実験結果に基づいて、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を有効成分として含有する、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療のための薬学的組成物を提供する。本発明で提供する薬学的組成物が有効成分として含む微生物は、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物であって、望ましくは、ヒトの腸内細菌叢を構成する微生物又はヒトの腸管から由来した微生物である。より望ましくは、前記微生物は乳酸菌である。本発明の実施例では、自由脂肪酸の吸収能力が増加した改良乳酸菌株としてラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）を得た。
【０００９】
また、本発明では、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある乳酸菌を含む、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と改善のための機能性食品を提供する。本明細書における「機能性食品」は、食品の本来の目的以外に特定の機能性が付加された食品であって、健康食品、健康機能性食品などを全て含む意味である。本発明の機能性食品が目的とする機能性は、肥満予防及び改善である。
【００１０】
また、本発明では、自由脂肪酸吸収能が改善された改良乳酸菌であるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）を提供する。
【００１１】
また、本発明では、哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を投与し、体内での自由脂肪酸吸収を減少させることを含む、肥満と肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防及び治療方法を提供する。
【００１２】
本発明によって自由脂肪酸吸収能がある微生物を投与又は摂取すると、体内での自由脂肪酸吸収を減少できるので、効果的な肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療方法になり得る。
【発明の効果】
【００１３】
食物からのカロリー過多摂取は、肥満をもたらす最も重要な決定要素であり、これは、低開発国で肥満を最も速く増加させる要因でもある。ほとんど場合、体内カロリー消費より１％でもカロリー摂取が超えると、体脂肪が蓄積されるようになり、結局、これが肥満につながる。本発明の薬学的組成物は、自由脂肪酸摂取能が改善された乳酸菌を宿主の小腸管内に移植させることによって宿主のカロリー摂取を制限し、抗肥満効果をもたらすが、これは、抗肥満治療剤として最も広く使用されているオルリスタットとも類似した水準である。さらに、自由脂肪酸吸収能がある微生物を有効成分として含有する本発明の薬学的組成物は、既存の肥満治療剤に比べて次のような非常に優れた長所を有している。第一に、中枢神経系に作用しないので、シブトラミンなどの中枢神経系に作用する薬物に比べて遥かに優れた長期安全性を有している。第二に、脂肪分解に関与しないので、小腸管内で下痢や脂肪便などの副作用を引き起こさない。第三に、乳酸菌などの人体に有益な微生物を有効成分としているので、医薬品の素材として非常に優れた安全性を確保している。
【００１４】
また、腸内細菌叢は、肥満の他にも感染疾患、癌、アレルギー疾患などの多様な複合疾患と関連している。したがって、生菌移植を通した治療は、腸内細菌叢と関連した多様な疾患に適用できる可能性を有している。本発明は、自由脂肪酸摂取能が改善された腸内細菌を小腸管内に移植させることによって宿主の腸内細菌叢を効果的に変化させ、宿主の疾患を治療できることを証明することによって、今後の腸内細菌叢と関連した多様な疾患に対する生菌移植を通した治療の可能性を示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】乳酸菌の脂肪酸吸収能を測定した結果を示したグラフである。
【図２】乳酸菌がコロニー形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）された宿主でのカロリー摂取変化を測定した結果を示したグラフである。
【図３】実験群の体重変化を測定した結果を示したグラフである。
【図４】実験群の内臓脂肪を磁気共鳴映像装置（ＭＲＩ）で測定し、映像分析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｊ、ＵＳＡ）で分析した結果を示したグラフである。
【図５】２２週間の高脂肪食餌群とＦＡＲＭ乳酸菌摂取群の内臓脂肪蓄積イメージを示した図である。
【図６】実験群の血中脂質濃度変化を示したグラフである（ＴＧは トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ＴＣは総コレステロール（ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＨＤＬは高比重リポタンパクコレステロール（ｈｉｇｈ―ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＬＤＬは低比重リポタンパクコレステロール（ｌｏｗ―ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を示す。）。
【図７】実験群の血中インスリンとレプチンの濃度変化を示したグラフである。
【図８】実験群の血糖変化を示したグラフである。
【図９】ＦＡＲＭ３乳酸菌のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）脂肪酸吸収能を３１７９乳酸菌と比較して示したグラフである。
【図１０】ＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主でのカロリー摂取の減少を示す結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した改良菌株）
人体に存在する乳酸菌の一種であるラクトバチルス・アシドフィラスＫＣＴＣ ３１７９をＮＴＧ（Ｎ―ｍｅｔｈｙｌ―Ｎ―ｎｉｔｒｏ―Ｎ―ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で処理して突然変異を誘導した後、自由脂肪酸の吸収能力が増加した改良乳酸菌の菌株を見出した。この改良乳酸菌は、一般の乳酸菌に比べて周辺環境から自由脂肪酸を吸収する能力が２．１倍以上である菌株であって、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｏｂｂｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅ １）と命名し、これを２００９年５月１９日付けで韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰで寄託した。本発明では、これを「ＦＡＲＭ１」と略称する。そして、ＦＡＲＭ１を利用して４ＮＱＯ（４―ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ １―ｏｘｉｄｅ：４−ニトロキノリン １−オキシド）で２次突然変異を誘導し、自由脂肪酸の吸収能が遥かに増加した改良菌株ＦＡＲＭ２を得た後、これを２００９年５月１９日付けで韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰで寄託した。本発明では、これを「ＦＡＲＭ２」と略称する。放射能標識実験によると、ＦＡＲＭ２は、一般の菌株に比べて自由脂肪酸を３．１倍以上速く吸収する特性を有していた。
【００１７】
食用乳酸菌の最も重要な特徴は、摂取された後、宿主の小腸管内で集落を形成して成長する特性、すなわち、コロニー形成能（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）である。乳酸菌としての特性を調査するために、改良菌株ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２を用いて小腸管内での集落形成及び成長能力を調査した。ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２は、ヨーグルトに発酵する過程で正常な成長と酸性化能力を維持し、宿主にヨーグルトの形態で摂取された後にもネズミの小腸管内で成功的にコロニー形成された。このような結果は、脂肪酸吸収能が向上したＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２が乳酸菌の特性を維持していることを示す。
【００１８】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した乳酸菌が小腸管の自由脂肪酸を除去することによって実際に宿主のカロリー摂取を減少させるかどうかを確認）
私たちが乳酸菌を摂取したとき、乳酸菌は小腸に一時的に菌叢を形成するようになるが、小腸は、体内で脂肪分解物である脂肪酸が主に吸収される部分である。ほとんどの脂肪酸が摂取される小腸でＦＡＲＭが自由脂肪酸を消耗するようになると、これによって人体に吸収可能な自由脂肪酸が減少するので、一種の生物捕捉剤（ｂｉｏ―ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）として作用するようになり、その結果、宿主のカロリー摂取量を減少させる。ＦＡＲＭが小腸管の自由脂肪酸を除去することによって実際に宿主のカロリー摂取を減少させるかどうかを実験するために、ＦＡＲＭ菌株で発酵させたヨーグルトをネズミに８週間摂取させた。ＦＡＲＭ乳酸菌がネズミの小腸管内にコロニー形成されることを確認した後、放射能標識されたトリオレインを給餌し、血清内の放射能量を測定した。この結果は、放射能標識されたトリオレインの消化物である放射能標識された自由脂肪酸の吸収がどれほど減少したかを示すようになる。ＦＡＲＭをコロニー形成したネズミの場合、胃腸管に定着された改良菌株が周辺から自由脂肪酸を摂取する能力が遥かに向上したことを示し、これに比例して宿主の自由脂肪酸摂取が減少することを示した。ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２をコロニー形成したネズミの場合、一般の乳酸菌をコロニー形成したネズミに比べて、宿主の自由脂肪酸摂取がそれぞれ３５％と４７％減少することが分かる。これは、ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２がネズミの小腸管内で吸収可能な自由脂肪酸を減少させることによって、結局、宿主に摂取される食物のカロリー量を減少させる結果を意味する。
【００１９】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した小腸管内乳酸菌によるカロリー摂取減少が肥満に及ぼす効果）
小腸管内のＦＡＲＭによるカロリー摂取の減少が肥満に及ぼす効果を見るために、肥満ネズミに２２週間ＦＡＲＭで発酵させたヨーグルトを摂取させた。一般の乳酸菌又はＦＡＲＭ乳酸菌を発酵させ、１ｍｌ当たり１０９ＣＦＵを含有しているヨーグルト３ｍｌを毎日摂取させると、４週後にネズミの小腸管内に乳酸菌がコロニー形成されるようになる。予想した通り、正常な乳酸菌を摂取させたネズミに比べて、ＦＡＲＭ１及びＦＡＲＭ２乳酸菌を摂取させたネズミの体重がそれぞれ１５％と１９％に減少する効果を示した。哺乳動物のカロリー過多摂取によると、ほとんどが内臓脂肪として蓄積されるので、体重の増加は内臓脂肪の増加量に比例する。したがって、乳酸菌給餌実験の終了日にオープンタイプの０．３テスラＭＲＩを利用してネズミの内臓脂肪を測定した。非処理対照群、一般の乳酸菌を摂取させたネズミ実験群、ＦＡＲＭ１を摂取させたネズミ実験群、ＦＡＲＭ２を摂取させたネズミ実験群の内臓脂肪量は、それぞれ２７％、２４％、１４％及び１３％であった。この結果は、ＦＡＲＭが宿主の小腸管内にコロニー形成されると、ＦＡＲＭが小腸管内の自由脂肪酸吸収を減少させ、結局、宿主の体重増加と体脂肪蓄積を防止する効果を有することを意味する。すなわち、宿主の自由脂肪酸摂取／吸収量を減少させると、カロリー摂取の減少によって内臓脂肪と体重が減少する。
【００２０】
（代謝性症侯群と関連している血清内生化学分析）
肥満は、インスリン抵抗性、グルコース耐性、高脂血症、心血管疾患などの代謝性症侯群と密接に関連している。したがって、乳酸菌給餌実験の終了日には、代謝性症侯群と関連している血清内生化学分析をした。乳酸菌を全く摂取させていない対照群と一般の乳酸菌を摂取させたネズミにおけるＴＧ、ＴＣ及びＬＤＬ―コレステロール量は、ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させたネズミに比べて高かった。一方、予想した通り、ＨＤＬコレステロール数値は、対照群では低かったが、ＦＡＲＭグループでは高かった。抗肥満効果を示したＦＡＲＭ乳酸菌は、予想通りに糖尿でも優れた効果を示した。ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させると、乳酸菌を全く摂取させていない対照群に比べて血清インスリン数値がそれぞれ２３％と３０％減少した。血清レプチン数値も、乳酸菌を全く摂取させなかった対照群に比べて、ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させたネズミではそれぞれ２０％と４５％減少した。血清グルコース数値も、乳酸菌を全く摂取させていない対照群と一般の乳酸菌を摂取させたネズミの場合は１２２．１ｍｇ／ｄｌと１２３．４ｍｇ／ｄｌである一方、ＦＡＲＭ１とＦＡＲＭ２を摂取させたネズミではそれぞれ１０７．６ｍｇ／ｄｌと１０８．４ｍｇ／ｄｌ程度に減少したことが分かる。体重の増加とともに人体のレプチンとインスリンに対する感受性が減少し、これと同時に血清脂質プロファイルが悪化するが、その結果、レプチン、インスリン、グルコース、ＬＤＬコレステロール、総コレステロールの血中濃度が増加するようになる。この結果は、ＦＡＲＭ乳酸菌が体重増加を防止することによって血中脂質プロファイルを改善し、インスリンとレプチンの耐性を阻害するのに効果的であることを示す。また、ＦＡＲＭ乳酸菌が肥満治療剤として優れた性質を有していることを示す。
【００２１】
（自由脂肪酸の吸収能力が増加した乳酸菌の抗肥満治療剤としての可能性）
ＦＡＲＭをコロニー形成したネズミは、自由脂肪酸の摂取を減少させ、その結果、体重増加と内臓脂肪蓄積を防止する優れた特性を有しているので、自由脂肪酸摂取能が改善されたＦＡＲＭ乳酸菌の抗肥満治療剤としての可能性を実験した。ＦＡＲＭ２乳酸菌を利用してＥＭＳ（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ：エチレンメタン スルフォネート）で３次突然変異を誘導することによって、自由脂肪酸摂取能がさらに向上した乳酸菌株を見出した。見出した３次突然変異株ＦＡＲＭ３は、一般の乳酸菌より自由脂肪酸摂取能が５．０倍以上改善された菌株であって、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３と命名し、これを２００９年５月１９日付けで韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰで寄託した。本発明では、これを「ＦＡＲＭ３」と略称する。ＦＡＲＭ３で発酵させたヨーグルトを毎日３ｍｌずつネズミに４週間摂取させると、一般の乳酸菌を摂取させた対照群に比べて体重が１８％以上減少する結果を示した。このようなＦＡＲＭ３の体重減少程度は、現在医薬品として使用されているオルリスタットと類似した水準である。そして、オルリスタットと異なり、ＦＡＲＭ３の場合は、摂取時に体重の効果的な減少以外に脂肪便などの副作用を示さなかった。これは、ＦＡＲＭ３が安全かつ効果的な肥満治療剤として開発可能な医薬品素材であることを意味する。本発明では、乳酸菌ＦＡＲＭ３を用いて実験したが、本発明の技術思想がＦＡＲＭ３や乳酸菌に限定されることはない。肥満治療に関する本発明の技術思想は、哺乳類、特に、ヒトの胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物であればいずれにも適用可能であり、これは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００２２】
以下、具体的な実施例を通して本発明をより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されることはない。
【００２３】
（試薬）
試薬は、下記に示したもの以外は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製のものを購入して使用した。
【００２４】
［１―１４Ｃ］―パルミチン酸：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製
【００２５】
液体シンチレーションカクテル（ＬＳＣ）：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製
【００２６】
［カルボキシル―１４Ｃ］―トリオレイン：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製
【００２７】
ＭＲＡ（Ｍａｎ―Ｒｏｇｏｓａ―Ｓｈａｒｐｅ）：Ｄｉｆｃｏ社製
【００２８】
オルリスタット（ゼニカル）：Ｒｏｃｈｅ社製
【００２９】
殺菌可能な（ｓｔｅｒｉｌｉｚａｂｌｅ）３８４―ウェルプレート及び３８４―ピンレプリケーター：Ｎｕｎｃ社製
【００３０】
メンブレン半乾燥システム（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｍｉ―ｄｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）：Ｂｉｏ―Ｒａｄ社製
【００３１】
Ｘ―線フィルム：Ｋｏｄａｋ社製
【００３２】
Ｇｅｌ―Ｐｒｏアナライザーソフトウェア（ａｎａｌｙｚｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）：Ｍｅｄｉａ ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製
【００３３】
嫌気培養：ＢＢＬガスパック嫌気システム（Ｇａｓ―Ｐａｃｋ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ）の嫌気性ジャーで行われる。
【００３４】
ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ―Ｄａｗｌｅｙ）雄ネズミ：Ｄａｅ Ｈａｎ Ｂｉｏｌｉｎｋ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【００３５】
ＭＲＩイメージ：ブルカーバイオスペック４７／４０ ４．７―テスラ機器（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ ４７／４０ ４．７―Ｔｅｓｌａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｂｒｕｋｅｒ社製）から得てＩｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）で分析される。
【００３６】
血清（Ｓｅｒｕｍ）：それぞれラット／マウスＥＬＩＳＡキット（ＬＩＮＣＯ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、レプチンＥＬＩＳＡキット（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍ社製）、血糖測定器（Ａｃｃｕ―Ｃｈｅｋ社製）及びコレステロールＥＬＩＳＡキット（Ａｓａｎ Ｐｈａｒｍ．Ｃｏ製）で分析される。
【００３７】
（突然変異を通して脂肪酸吸収能が改善された乳酸菌の開発）
Ｌ．アシドフィラスＫＣＴＣ３１７９乳酸菌をＭＲＳ培地に接種し、ＢＢＬガスパック（Ｇａｓ―Ｐａｃｋ）によりｐＨ７．２、３７℃で嫌気培養した。自由脂肪酸吸収能が改善されたＦＡＲＭ菌株を得るための突然変異実験は、次のように行われた。Ｌ．アシドフィラスＫＣＴＣ３１７９乳酸菌を２４時間精製培養した後、液状培養液にＮＴＧ（Ｎ―ｍｅｔｈｙｌ―Ｎ―ｎｉｔｒｏ―Ｎ―ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。２５℃で３０分間培養した後、ＭＲＳブロスで３回洗浄し、ＭＲＳブロスに再び懸濁した。連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）後、処理された各細胞をＭＲＳ寒天プレートに置き、嫌気状態で３７℃、４８時間培養した後、５０μｌのＭＲＳブロスが入っている３８４―ウェルプレートに接種し、３７℃で１２時間嫌気培養した。培養が終了した後、ＭＲＳブロス培養液のみが入っている３８４―ウェルプレートと、０．１ｎＣｉ／ｍｌの１４Ｃ―パルミチン酸が含まれたＭＲＳブロス培養液が入っている３８４―ウェルプレートを３８４―ピンレプリケーターを用いて複製した。複製されたプレートは、パラフィルムで覆った後、３７℃でやわらく揺らしながら３０分間培養した後、１４Ｃと放射能標識された培養液を２μｌずつナイロンメンブレンにそれぞれ移した後、半乾燥システム（ｓｅｍｉ―ｄｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）で乾燥させた。乾燥した膜は、ＭＲＳブロスで３回洗浄し、付着している１４Ｃ―パルミチン酸を除去した後、−８０℃で３日間Ｘ線フィルムに露出させた。Ｘ線フィルムから得た放射能程度は、Ｇｅｌ―Ｐｒｏアナライザーソフトウェアで分析して信号の強いコロニーを選別し、これから最終的に脂肪酸吸収能が改善された乳酸菌株を探してＦＡＲＭ１（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｏｂｂｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｅ １）と命名した。次に、ＦＡＲＭ１に前記のような方法で４ＮＱＯ（４―ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ １―ｏｘｉｄｅ：４−ニトロキノリン １−オキシド）を処理してＦＡＲＭ２を得た後、前記と同じ方法でＦＡＲＭ２にＥＭＳ（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ：エチルメタン スルフォネート）を処理してＦＡＲＭ３を得た。
【００３８】
（インビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）脂肪酸吸収能評価）
見出された乳酸菌株の脂肪酸吸収能を評価するために、各乳酸菌株を放射能標識された１４Ｃパルミチン酸と共に培養した後、放射能程度を測定した。このために、各乳酸菌株をＭＲＳブロス２ｍｌに接種した後、培養して代数生長期に到逹すると遠心分離し、１ｎＣｉ／ｍｌの濃度で１４Ｃ―パルミチン酸が入っているＭＲＳ培地に接種した後、３７℃で１時間培養した。１４Ｃと標識された各細胞をＭＲＳブロスで３回洗浄した後、ＭＲＳブロス１ｍｌに懸濁し、そのうち０．２ｍｌを２ｍｌの液体シンチレーションカクテルが入っているシンチレーションバイアルに移した。混合物を１分間ボルテックスした後、液体シンチレーションスペクトロメーターを用いて１４Ｃ活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した。
【００３９】
（乳酸能評価）
各乳酸菌株をＭＲＳ培地により３７℃で嫌気培養して代数生長期に到逹すると、１ｍｌの細胞培養液を無菌状態の脱脂牛乳（１０％）とグルコース（２％）を含有した１００ｍｌに接種した後、３７℃で培養しながら２４時間の間隔でｐＨ変化を測定した。細胞生長曲線を測定するためには、４８時間発酵した後で作られたヨーグルト５ｍｌを１５ｍｌのコニカルチューブに移した後、ボルテックスをした。均質化された混合物１ｍｌをＰＢＳで希釈し、希釈液５０μｌをＭＲＳプレートに塗抹し、４８時間嫌気培養した後、コロニーの数を数えた。
【００４０】
（動物実験）
全ての動物実験は、動物管理及び利用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規定にしたがって行われた。体重が２００〜２２０ｇ程度であるＳＤ雄ネズミを二匹ずつ檻に入れ、最初の１週間は一般の飼料と水を自由に級餌した。実験期間の間は１２時間の間隔で昼と夜の照明を変え、温度は２２±１℃、湿度は４０〜５０％に一定に維持した。一週間後、ネズミたちを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、対照群（高脂肪飼料摂取群）、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭグループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）に分けた。この実験に使用された高脂肪飼料は、一般のネズミ飼料（複合炭水化物６０％、タンパク質２２％、脂肪３.５％、繊維素５％、粗灰分８％、カルシウム０.６％、リン１．２％）に豚脂を２０％添加した特殊飼料であって、組成は、複合炭水化物４８％、タンパク質１７.６％、脂肪２２.８％、繊維素４％、粗灰分６.４％、カルシウム０.４８％、リン０.９６％で構成されている。食餌実験のためのヨーグルトは、脱脂粉乳１０％、砂糖２％、１０９／ｍｌ以上の菌体濃度を有するＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ培養液１％である。実験期間の間、ネズミたちは、それぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、発酵ヨーグルト３ｍｌが口腔に直接給餌された。体重は、１２時間禁食した後、午前９時から１時の間に測定された。
【００４１】
＜１．胃腸管集落形成能＞
ネズミに各実験群によるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ発酵ヨーグルトを８週間級餌した後、各実験群から４匹のネズミを無作為に選び、エーテルで麻酔させた後、犠牲させた。ネズミから胃と小腸などの胃腸管組織を直ちに収去し、５０ｍｌのコニカルチューブに移した後、無菌食塩水で希釈した。次に、胃腸管組織の内容物を排出するために、ホモジナイザーを用いて均質化した後、乳酸菌選別寒天プレート（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇａｒ ｐｌａｔｅｓ）に塗抹し、４８時間の間嫌気培養した。乳酸菌選別培地で形成された乳酸菌コロニーの数を数え、胃腸管内の組織部位別の１グラム当たりのｌｏｇ１０ＣＦＵ（湿重量）で計算した。
【００４２】
＜２．ＦＡＲＭ乳酸菌の肥満誘導抑制効果＞
長い鎖構造を有しているトリグリセリドの一種であるトリオレインを用いてＦＡＲＭ乳酸菌の肥満誘導抑制効果に対する実験が行われた。［１４Ｃ］と放射能標識されたトリオレインをベンゼン溶液に作り、−７０℃で保管して使用した。［１４Ｃ］と放射能標識されたトリオレイン１μＣｉを放射能標識されていないトリオレインと混ぜた後、室温で窒素ガスを用いて溶媒を揮発させた。トリオレイン混合物を、乳酸菌を２２週間摂取させたネズミに体重１００ｇ当たり０.５ｍｍｏｌで級餌した後、１０時間の間２時間の間隔で心臓穿刺でネズミの血液サンプルを収去した。各血清から０．１ｍｌを１．８ｍｌのＬＳＣに添加した後、液体シンチレーションスペクトロメーターで１４Ｃ活性を測定した。ＦＡＲＭ乳酸菌の肥満誘導抑制は、各乳酸菌発酵ヨーグルトを摂取させたネズミでの脂肪酸摂取能の差による血清内放射能程度の差を測定することによって判断した。
【００４３】
＜３．内臓脂肪の磁気共鳴映像測定＞
内臓脂肪部位の体脂肪を磁気共鳴映像（ＭＲＩ）機器で分析するために、ブルカーバイオスペック４７／４０ ４．７―テスラ機器を使用した。実験に使用されたネズミは、ゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ）（２５ｍｇ／ｋｇ）とロンパン（ｒｏｍｐｕｎ）（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。映像を得るためにネズミたちを磁石板に位置させ、ボディコイルを送信機と受信機として使用して記録した。内臓脂肪と皮下脂肪部位を測定するために、第４〜第５の腰椎間で上から８ｃｍ、下から８ｃｍの部位をＴ１強調映像として得た。内臓脂肪と皮下脂肪部位はイメージＪプログラムで分析された。
【００４４】
＜４．血清生化学分析＞
実験ネズミたちの血液は、実験開始日と終了日である２２週後に収去され、生化学分析に使用された。血液採取前に全ての実験動物は節食し、エーテルで麻酔した状態で心臓穿刺で全ての血液を得た。血液を２，０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離して得た血清は、分析するまで７０℃で保管した。血清生化学分析のために、ラット／マウスＥＬＩＳＡキット（インスリン）、レプチンＥＬＩＳＡキット（レプチン）、血糖測定器、ＥＬＩＳＡキット（血清総コレステロール、ＨＤＬ―コレステロール、ＬＤＬ―コレステロール、トリグリセリド）などが使用された。
【００４５】
＜５．ＦＡＲＭ３乳酸菌の抗肥満効果＞
３ヶ月になったＳＤ雄ネズミは、８週間高脂肪を食餌し、平均体重が４２５ｇになるように肥満を誘導した。これらネズミたちを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭ３グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ３乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、オルリスタットグループ（高脂肪飼料にゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）（登録商標）を２００ｍｇ／ｋｇの食物として添加して摂取させた群）に分けた。その後、４週間、ネズミたちはそれぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、体重は、１２時間禁食した後、午前９時から１時の間に測定された。
【００４６】
＜６．統計処理＞
全てのデータは平均値±標準偏差に表示され、ＡＮＯＶＡ（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ：分散分析）テストによってｐ＜０．０５である場合に統計的に有意であると判断された。
【００４７】
（結果）
＜１．乳酸菌の脂肪酸吸収能及び乳酸菌がコロニー形成された宿主のカロリー摂取変化＞
図１は、乳酸菌の脂肪酸吸収能を測定した結果を示している。ラクトバチルス・アシドフィラスＫＣＴＣ ３１７９（「３１７９」と表示される。）乳酸菌をＮＴＧ（Ｎ―ｍｅｔｈｙｌ―Ｎ―ｎｉｔｒｏ―Ｎ―ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で突然変異させて見出されたＦＡＲＭ１乳酸菌は、脂肪酸吸収能が増加していた。ＦＡＲＭ１乳酸菌を４ＮＱＯ（４―ｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ １―ｏｘｉｄｅ：４−ニトロキノリン １−オキシド）で２次突然変異させて得たＦＡＲＭ２は、ＦＡＲＭ１より改善された脂肪酸吸収能を有していた。外部から脂肪酸を吸収する能力の差を測定するために、１ｎＣｉ／ｍｌの濃度で１４Ｃ放射能標識されたパルミチン酸と乳酸菌を１時間培養した後、乳酸菌の放射能程度を液体シンチレーションスペクトロメーターで測定し、これは標準偏差（ｎ＝４）に表示された。
【００４８】
図２は、乳酸菌がコロニー形成された宿主でのカロリー摂取変化を測定した結果を示している。ＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主でカロリー摂取の減少が確認された。ＳＤネズミに８週間ＦＡＲＭ乳酸菌又は一般の乳酸菌Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ ３１７９を給餌し、胃腸管に乳酸菌をコロニー形成した後、１４Ｃ―標識されたトリオレインを摂取させ、血液を採取して血清内放射能程度を測定することによって宿主のカロリー摂取変化を測定した。
【００４９】
図１及び図２の結果から、ＦＡＲＭ乳酸菌の脂肪酸吸収能とＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主の胃腸管での脂肪吸収が反比例することが分かる。
【００５０】
＜２．乳酸能＞
各乳酸菌株は、無菌状態のグルコース（２％）を含有した脱脂牛乳（１０％）１００ｍｌに接種し、３７℃でヨーグルトに発酵させた。ヨーグルトに発酵される過程で乳酸菌の乳酸能を測定するために、ｐＨ変化を２４時間後、４８時間後、７２時間後に測定した。１０個の試料の測定値は平均値±標準偏差に表示された。結果は、次の表１に示す通りである。
【００５１】
表１
１０個の試料の測定値は平均値±標準偏差
【００５２】
＜３．胃腸管内の集落形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）能力＞
ネズミに各実験群によるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＫＣＴＣ３１７９又はＦＡＲＭ）発酵ヨーグルトを８週間給餌した後、胃と小腸などの胃腸管組織を収去し、胃腸管内の組織部位別の１グラム当たりのｌｏｇ１０ＣＦＵ（湿重量）を得た。対照群は乳酸菌無処理群で、５個の試料の測定値は平均値±標準偏差に表示された。結果は、次の表２に示す通りである。
【００５３】
表２
５個の試料の測定値は平均値±標準偏差
【００５４】
＜４．食餌で肥満を誘導する間におけるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９、ＦＡＲＭ１、ＦＡＲＭ２の胃腸管内の集落形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）能力＞
ネズミに各実験群によるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＫＣＴＣ３１７９又はＦＡＲＭ）発酵ヨーグルトを４週間給餌した後、胃と小腸などの胃腸管組織を収去し、胃腸管内の組織部位別の１グラム当たりのｌｏｇ１０ＣＦＵ（湿重量）を得た。対照群は乳酸菌無処理群で、５個の試料の測定値は平均値±標準偏差に表示された。結果は、次の表３に示す通りである。
【００５５】
表３
５個の試料の測定値は平均値±標準偏差
【００５６】
＜５．高脂肪食餌で誘導された肥満に対するＦＡＲＭのカロリー摂取減少の効果＞
結果は、図３〜図５に示す通りである。図３は、実験群の体重変化を測定した結果を示している。体重が２００〜２２０ｇ程度の３ヶ月になったＳＤ雄ネズミを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、対照群（高脂肪飼料摂取群）、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭグループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）に分けた。その後、２２週間、ネズミたちはそれぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、体重変化は平均値±標準偏差に表示された。
【００５７】
図４は、実験群の内臓脂肪を磁気共鳴映像装置（ＭＲＩ）で測定して分析し、映像分析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｊ、ＵＳＡ）で分析した結果を示している。内臓脂肪量の変化は平均値±標準偏差に表示された。
【００５８】
図５は、２２週間の高脂肪食餌群とＦＡＲＭ乳酸菌摂取群の内臓脂肪蓄積イメージを示している。
【００５９】
＜６．一般の乳酸菌ＫＣＴＣ ３１７９とＦＡＲＭ乳酸菌給餌後の血清数値の比較結果＞
結果は、図６〜図８に示す通りである。体重が２００〜２２０ｇ程度の３ヶ月になったＳＤ雄ネズミを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、対照群（高脂肪飼料摂取群）、３１７９グループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭグループ（高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）に分けた。実験開始日及び終了日に採取された血液から得た血清数値を分析した結果は、標準偏差に表示された。図６は、血中脂質濃度の変化を示したもので、ＴＧはトリグリセリド、ＴＣは総コレステロール、ＨＤＬは高比重リポタンパクコレステロール、ＬＤＬは低比重リポタンパクコレステロールを示す。図７は、血中インスリンとレプチン濃度の変化を示したもので、図８は血糖変化を示している。
【００６０】
＜７．食餌で誘導された肥満に対するＦＡＲＭ３の抗肥満効果＞
結果は、図９及び図１０に示す通りである。図９は、ＦＡＲＭ３乳酸菌のインビトロ脂肪酸吸収能を３１７９乳酸菌と比較したものである。ＦＡＲＭ２乳酸菌をＥＭＳ（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ：エチルメタン スルフォネート）で３次突然変異させて得たＦＡＲＭ３は、ＦＡＲＭ２より改善された脂肪酸吸収能を有する。外部から脂肪酸を吸収する能力の差を測定するために、１ｎＣｉ／ｍｌの濃度で１４Ｃと放射能標識されたパルミチン酸と乳酸菌を１時間培養した後、乳酸菌の放射能程度を液体シンチレーションスペクトロメーターで測定し、これは標準偏差（ｎ＝４）に表示された。
【００６１】
図１０は、ＦＡＲＭ乳酸菌がコロニー形成された宿主でのカロリー摂取の減少を示す結果を示している。ＳＤネズミに８週間ＦＡＲＭ乳酸菌又は一般の乳酸菌Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９を給餌し、胃腸管に乳酸菌をコロニー形成した後、１４Ｃ―標識されたトリオレインを摂取させ、血液を採取して血清内放射能程度を測定することによって宿主のカロリー摂取変化を測定した。まず、３ヶ月になったＳＤ雄ネズミは、８週間高脂肪を食餌し、平均体重が４２５ｇになるように肥満を誘導した。
【００６２】
これらネズミたちを一つのグループ当たり１４匹になるように無作為に分離し、３１７９グループ（○、高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＫＣＴＣ３１７９乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、ＦＡＲＭ３グループ（●、高脂肪飼料とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＡＲＭ３乳酸菌発酵ヨーグルト摂取群）、オルリスタットグループ（△、高脂肪飼料にゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）（登録商標）を２００ｍｇ／ｋｇの食物として添加して摂取させた群）に分けた。その後、４週間、ネズミたちはそれぞれに割り当てられた食餌を自由に摂取し、体重変化は平均値±標準偏差に表示された。
【００６３】
（翻訳文）
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
原寄託に対する受託証
下記の国際寄託機関によって規則第７．１条の規定によって発行された。
受信：ＪＩＮＩＳ
大韓民国 全羅北道 完州郡 鳳東邑 デゥン山里 ９４８―９（〒５６５―９０２）
【００６４】
（翻訳文）
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
原寄託に対する受託証
下記の国際寄託機関によって規則第７．１条の規定によって発行された。
受信：ＪＩＮＩＳ
大韓民国 全羅北道 完州郡 鳳東邑 デゥン山里 ９４８―９（〒５６５―９０２）
【００６５】
（翻訳文）
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
原寄託に対する受託証
下記の国際寄託機関によって規則第７．１条の規定によって発行された。
受信：ＪＩＮＩＳ
大韓民国 全羅北道 完州郡 鳳東邑 デゥン山里 ９４８―９（〒５６５―９０２）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を有効成分として含有する、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療のための薬学的組成物。
【請求項２】
前記微生物は、ヒトの腸内細菌叢を構成する微生物又はヒトの腸管から由来した微生物である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記微生物は乳酸菌である、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記微生物は、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）から選択された何れか一つである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある乳酸菌を含む、肥満の予防及び改善のための機能性食品。
【請求項６】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）から選択された何れか一つである、請求項５に記載の機能性食品。
【請求項７】
前記食品はヨーグルトである、請求項５又は６に記載の機能性食品。
【請求項８】
自由脂肪酸吸収能があるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）。
【請求項９】
自由脂肪酸吸収能があるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）。
【請求項１０】
自由脂肪酸吸収能があるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）。
【請求項１１】
哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を投与し、体内での自由脂肪酸吸収を減少させることを含む、肥満と肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防及び治療方法。
【請求項１２】
前記微生物は、ヒトの腸内細菌叢を構成する微生物又はヒトの腸管から由来した微生物である、請求項１１に記載の予防及び治療方法。
【請求項１３】
前記微生物は乳酸菌である、請求項１１又は１２に記載の予防及び治療方法。
【請求項１４】
前記微生物は、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）から選択された何れか一つである、請求項１３に記載の予防及び治療方法。
【請求項１】
哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を有効成分として含有する、肥満及び肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防と治療のための薬学的組成物。
【請求項２】
前記微生物は、ヒトの腸内細菌叢を構成する微生物又はヒトの腸管から由来した微生物である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記微生物は乳酸菌である、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記微生物は、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）から選択された何れか一つである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある乳酸菌を含む、肥満の予防及び改善のための機能性食品。
【請求項６】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）から選択された何れか一つである、請求項５に記載の機能性食品。
【請求項７】
前記食品はヨーグルトである、請求項５又は６に記載の機能性食品。
【請求項８】
自由脂肪酸吸収能があるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）。
【請求項９】
自由脂肪酸吸収能があるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）。
【請求項１０】
自由脂肪酸吸収能があるラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）。
【請求項１１】
哺乳類の胃腸管内で棲息可能で、かつ、自由脂肪酸吸収能がある微生物を投与し、体内での自由脂肪酸吸収を減少させることを含む、肥満と肥満によって引き起こされた代謝性疾患の予防及び治療方法。
【請求項１２】
前記微生物は、ヒトの腸内細菌叢を構成する微生物又はヒトの腸管から由来した微生物である、請求項１１に記載の予防及び治療方法。
【請求項１３】
前記微生物は乳酸菌である、請求項１１又は１２に記載の予防及び治療方法。
【請求項１４】
前記微生物は、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ１（ＫＣＴＣ １１５１３ＢＰ）、ラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ２（ＫＣＴＣ １１５１４ＢＰ）及びラクトバチルス・アシドフィラスＦＡＲＭ３（ＫＣＴＣ １１５１５ＢＰ）から選択された何れか一つである、請求項１３に記載の予防及び治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５２０２９２（Ｐ２０１２−５２０２９２Ａ）
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５３９２７（Ｐ２０１１−５５３９２７）
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３０３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０４２４２
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５１１２２１０６８）ジニス バイオファーマサティカルズ カンパニー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＮＩＳ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３０３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０４２４２
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５１１２２１０６８）ジニス バイオファーマサティカルズ カンパニー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＮＩＳ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．
【Ｆターム（参考）】
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