微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法
【課題】培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法の提供。
【解決手段】微生物を前培養する前培養工程と、前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程と、前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程とを含む微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
【解決手段】微生物を前培養する前培養工程と、前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程と、前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程とを含む微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物から産生されるバイオマスには有用なものが多く、盛んに研究が行われている。そのため微生物の成長過程をモニターする必要性があるが、微生物の多くは、細胞外マトリックスのような細胞外物質を放出して増殖するに伴い微生物同士が凝集してしまい、該微生物が培養基材上に存在する場合は、微生物及びその細胞外マトリクスにより微生物凝集膜が形成されるため、該微生物凝集膜中の個々の微生物をモニターすることは困難である。
【0003】
このような微生物凝集膜中の個々の微生物をモニターする方法としては、例えば、湿潤状態の微生物凝集膜を乾燥固化させることで微生物凝集膜中の微生物量を測定する方法、クロロフィルを有する微生物においては、そのクロロフィル量を測定することによりモニターする方法などが挙げられる(例えば、非特許文献1参照)。
しかし、これらの方法は、微生物凝集膜自体の質量などを測定することはできるものの、微生物凝集膜中に存在する微生物の細胞数を計測することはできず、また、微生物が産生する細胞外物質の放出量が、培養条件や微生物の生育段階によって異なることから、細胞外物質の質量と微生物凝集膜中の微生物の細胞数とは必ずしも一致しないため、個々の微生物についてモニターすることができない点で問題である。
【0004】
また、事前に微生物の凝集を防止するために、培養槽に超音波を印加しながら微生物を培養する方法が提案されている(特許文献1参照)。
しかし、この方法は、培養中の微生物の凝集を防ぐ方法であるため、既に微生物凝集膜を形成している該凝集膜中の微生物をモニターする方法には適用できない。また、ある程度の液体培地量が必要であること、細胞へのダメージが大きく細胞が破砕してしまうことがあること、完全に分散できない場合があること、などの点からもこの方法を応用することは困難である。
【0005】
更に、これらの微生物凝集膜自体又は微生物が放出する細胞外物質の質量を測定する方法は、実験系においては、微生物凝集膜中に存在する種々の培地等に含まれる各種塩なども含めた質量として算出されるため、純粋な微生物の質量ではない点においても問題である。特に、海水中に存在する微生物を用いる場合は、塩濃度の高い培地を用いるため、塩による影響が大きく現れてしまい、正確にモニターすることができないといった問題がある。
塩による影響を解消するために微生物凝集膜を低イオン強度の溶液で洗浄する等の方法を行うことも考え得るが、微生物凝集膜は、ある程度の厚みを有する微生物の集合体であるがゆえに、その内部に存在する塩などの濃度を低下させることは非常に困難である。また、低イオン強度の溶液で洗浄することは、微生物に対する浸透圧の影響から、微生物が破裂や収縮が生じ、微生物形状の消失により正確な微生物凝集膜量を測定することができないなどの種々の弊害がある。
【0006】
したがって、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法の提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開平7−298869号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Katsuta Abe et al., World J. Microbiol. Biotechnol, 2003, 19, 325−328
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、微生物を前培養し、前記前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取し、これを一定面積の培養基材上で培養して、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させ、前記微生物凝集膜を振動させて分散させることにより、前記微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができること、また、前記分散された微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測することにより、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができることを知見し、本発明の完成に至った。
【0011】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
<1> 微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法であって、
前記微生物を前培養する前培養工程と、
前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、
前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程と、
前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、
前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程と、
を含むことを特徴とする、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<2> 分散工程における振動の回数が、次式で表される合計振動数で1,160回〜10,000回である前記<1>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
合計振動数(回)=1分間当たりの振動数(回)×振動時間(分間)
<3> 分散工程における振動の形態が、上下方向、左右方向、及び前後方向の少なくとも1形態である前記<1>から<2>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<4> 分散工程が、容器に充填した微生物凝集膜を振動させる工程であり、該容器の内容積に対する前記微生物凝集膜の容積比率が15容量%〜75容積%である前記<1>から<3>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<5> 分散工程が、微生物凝集膜に消泡剤を添加して行われる前記<1>から<4>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<6> 分散工程が、複数回行われる前記<1>から<5>のいずれかに記載の微生物細胞数の計測方法である。
<7> 微生物が微細藻類である前記<1>から<6>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<8> 微生物がバイオマスを産生する微生物である前記<1>から<7>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<9> バイオマスを産生する微生物が、珪藻類、黄緑藻類、及び緑藻類の少なくともいずれかである前記<8>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<10> 黄緑藻類が、Botryococcus属である前記<9>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<11> 緑藻類が、Haematococcus属である前記<9>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図1は、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程で使用する振動装置の外観図の一例を示す概略図である。
【図2】図2は、図1の振動装置の容器ホルダーと駆動部とを示した斜視図の一例である。
【図3】図3は、振動装置に使用する密閉容器に微生物を充填する様子を示した斜視図の一例である。
【図4A】図4Aは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図4B】図4Bは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図4C】図4Cは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図5】図5は、実施例1の微生物凝集膜形成工程においてナイロンフィルム上にフネケイソウが凝集膜を形成した様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図6】図6は、実施例1の分散工程後のナイロンフィルム上の様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図7】図7は、実施例1の分散工程においてナイロンフィルム上の凝集膜から培地中に分散したフネケイソウの数を計測する様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図8】図8は、実施例2の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の数を計測する様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図9A】図9Aは、実施例3の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。破線部及び実践部は、破砕した細胞を示す。
【図9B】図9Bは、実施例3の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の様子を光学顕微鏡(40倍率)で観察し、図9Aの実線部を拡大した図である。
【図10】図10は、実施例3の微生物凝集膜形成工程においてポリスチレンフィルム上にボトリオコッカスが凝集膜を形成した様子を光学顕微鏡(40倍率)で観察した図である。
【図11】図11は、実施例3の分散工程においてポリスチレンフィルム上の凝集膜から培地中に分散したボトリオコッカスの数を計測する様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図12A】図12Aは、比較例1の珪藻の凝集膜の超音波処理後細胞の様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。破線部及び実践部は、破砕した細胞を示す。
【図12B】図12Bは、比較例1の珪藻の凝集膜の超音波処理後細胞の様子を光学顕微鏡(40倍率)で観察し、図12Aの実線部を拡大した図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
(微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法)
本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法は、前培養工程と、採取工程と、微生物凝集膜形成工程と、分散工程と、計測工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【0015】
<前培養工程>
前記前培養工程は、微生物を前培養する工程である。
【0016】
−微生物−
本発明において微生物としては、人の肉眼では、その個々の存在が識別できないような微小な生物を指し、微生物凝集膜を形成する微生物であれば、特に制限はなく、原核生物及び真核生物のいずれであってもよい。
なお、微生物凝集膜を形成することによって、人の肉眼で微生物の集合体が識別可能になる場合でも、集合体構造を崩して個々の微生物にすることによって、人の肉眼では識別することができない場合は、本発明における微生物とする。
また、個々の微生物の状態によるが、細胞数(例えば、微細藻類の藻体数)が増加することによって、色の変化でその存在を知ることが可能となるものもあるが、そのような場合でも、個々の微生物を人の肉眼によって観察することはできないことから、本発明でいうところの微生物に含むものとする。
【0017】
前記原核生物としては、細胞核を有さない生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真性細菌、古細菌などが挙げられる。
前記真核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藻類、原生生物、菌類、粘菌、ワムシなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記微生物としてはバイオマスを産生する微生物が好ましく、微細藻類が特に好ましい。
【0018】
前記「微細藻類」とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上で生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものの総称であり、例えば、シアノバクテリア等の原核生物、単細胞生物又は多細胞生物の海藻類等の真核生物などが挙げられる。
【0019】
前記微細藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記微細藻類としては、緑色植物門が好ましく、バイオマスを産生する点で、珪藻類、黄緑藻類、緑藻類がより好ましく、ボトリオコッカス(Botryococcus)属、ヘマトコッカス(Haematococcus)属が更に好ましい。
【0020】
本発明において、「バイオマス」とは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源などが挙げられる。また、前記バイオマスには、生物が産生する、多糖、炭化水素化合物、トリグリセリド等のオイルを含むものとする。
【0021】
前記微生物を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などが挙げられる。
【0022】
−前培養−
前記微生物を前培養する方法としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養法、振盪培養法、静置若しくは振盪しながら二酸化炭素や空気をバブリングさせて培養液を流動させながら培養する方法などが挙げられる。
前記微生物は、基本的には凝集する性質を有するものであるため、前培養することにより微生物凝集体を形成することがある。本発明において、「微生物凝集体」とは、複数個の微生物が集合した構造体のことをいい、その微生物の構造体は、複数種の微生物から構成されていてもよく、単一種の微生物から構成されていてもよい。更に、微生物同士が直接隣接していてもよく、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して凝集していてもよい。また、群体といわれているものも、本発明では、凝集のことを意味するものとする。
【0023】
前記微生物の前培養に用いる培地としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができる。例えば、前記微生物が前記微細藻類である場合、その前培養に用いる培地としては、例えば、無機物及び水から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記前培養に用いる培地のpHとしては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、5〜9が好ましく、6〜8がより好ましい。前記pHが、5未満又は9を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0024】
前記前培養における培養温度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0℃〜100℃が好ましく、15℃〜40℃がより好ましい。前記培養温度が、0℃未満又は100℃を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0025】
前記前培養を行う期間としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1日間〜300日間が好ましく、2日間〜30日間がより好ましい。前記培養期間が、1日間未満であると、前記微生物の細胞数を十分に得ることができないことがあり、300日間を超えると、栄養分の不足により、微生物が死滅することがある。
【0026】
前記前培養における二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0.001%〜50%が好ましく、1%〜10%がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、0.001%未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、50%を超えると、pHの低下により、前記微生物が育成できないことがある。
前記二酸化炭素濃度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養環境中を密閉系にして公知のセンサーで測定する方法、ガスクロマトグラフや分光器等の分析機器で測定する方法、アルカリ吸収法により測定する方法などが挙げられる。
【0027】
前記前培養における照度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1ルクス〜100万ルクスが好ましく、1,000ルクス〜10万ルクスがより好ましい。前記照度が、1ルクス未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、100万ルクスを超えると、光障害により、前記微生物の増殖速度が低下したり、死滅したりすることがある。
前記照度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の照度計を用いて測定する方法などが挙げられる。
【0028】
<採取工程>
前記採取工程は、前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する工程である。
【0029】
前記一定量を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を分散させた後、ピペットにより該微生物を採取する方法などが挙げられる。
【0030】
前記微生物凝集体を分散させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を含む培地をピペッティングにより分散させる方法、振動により分散させる方法、超音波により分散させる方法などが挙げられる。これらの中でも、前記分散させる方法としては、振動により分散させる方法が、微生物が破砕されることがなく分散性がよいため、所望量を採取できる点で好ましい。
なお、前記分散の際に、前記微生物凝集体は、採取したそのまま用いられてもよく、前記微生物凝集体を濃縮したものを用いてもよく、前記微生物凝集体を濃縮したものを新しい培地や水等の溶液で適宜希釈して用いられてもよいが、前記微生物凝集体を濃縮したものを前記溶液で適希釈して用いられることが、前記微生物の破砕を防止することができ、効率よく分散させることができる点で好ましい。
前記濃縮の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記前培養後の培養液を静置することにより前記微生物凝集体を沈殿させ、該沈殿により濃縮された微生物凝集体を含む培地をピペットなどで採取する方法などが挙げられる。
【0031】
前記採取工程において、前記微生物凝集体を分散させることにより、前記微生物の細胞数を計測することができ、一定量の微生物を採取することができる。
前記微生物の量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を分散させた前記微生物を、光学顕微鏡、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の各種顕微鏡で観察して直接計測する方法、血球計数盤上で計測する方法、光学顕微鏡で撮影した写真からソフトウエアを用いて算出する方法、フローサイトメーターで測定する方法、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておくことにより、吸光光度計で測定した測定値より算出する方法、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておくことにより、濁度計で測定した濁度から算出する方法、予め乾燥重量と細胞数との相関関係を求めておくことにより、該乾燥重量から算出する方法、予め蛍光光度計によってクロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておくことにより、クロロフィルの蛍光量から算出する方法などが挙げられる。
【0032】
<微生物凝集膜形成工程>
前記微生物凝集膜形成工程は、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる工程である。
【0033】
−培養基材−
本発明において、前記「培養基材」とは、前記微生物が付着でき、一定面積を有する基材をいう。
前記培養基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス(ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ほうけい酸ガラスなど)、ナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース、ポリプロピレン、ポリイミド、フッ素樹脂、アクリル樹脂などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
【0034】
前記培養基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、板状、球状、半球状、不定形、糸状、繊維状、不織布状、布状、織物状、編物状、寒天状などが挙げられる。
前記培養基材が板状の場合、その厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、0.001mm〜1,000mmが好ましく、0.01mm〜10mmがより好ましい。
前記培養基材が球状又は半球状の場合、その粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、0.001mm〜1,000mmが好ましく、0.01mm〜10mmがより好ましい。
【0035】
ここで、「培養基材上」とは、培養時に前記微生物を含む培地に接しており、前記微生物が前記培養基材に付着して増殖することができる前記培養基材表面をいう。
例えば、前記培養基材表面の全体が培地に接している場合は、前記培養基材表面の全体を培養基材上とする。
また、例えば、前記培養基材が板状であり、該板状の培養基材の一方の面が、例えば、培養容器の内部の底面に積置され、培地と接触していない場合は、前記一方の面を除くその他の面を培養基材上といい、前記板状の培養基材の全面が培地に接している場合は、前記板状の培養基材表面の全面を培養基材上という。
【0036】
また、「一定面積」とは、前記培養基材上の面積をいい、前記培養基材の形状や培養形態などに応じて適宜選択することができるが、1mm2〜1m2が好ましく、1cm2〜0.5m2がより好ましく、1cm2〜0.1m2が特に好ましい。前記面積は、1mm2未満であると、十分な量の前記微生物凝集膜を形成させることができないことがある。
なお、前記一定面積は、大規模培養を行う目的で1m2を超える面積であってもよいが、その場合であっても10,000m2以下であることが好ましく、1,000m2以下であることがより好ましい。前記一定面積が、10,000m2を超えると、ハンドリングが困難となることがある。このような大規模培養を行う場合、後述する分散工程及び計測工程には、前記一定面積のうちの一部の面積を切り出して、若しくは、一部の面積の前記培養基材上に付着した前記微生物を剥離して用いることが好ましい。前記一部の面積としては、特に制限はなく、前記一定面積の範囲内で適宜選択することができる。
前記一定面積は、前記培養基材が複数個同時に用いる場合は、複数個の培養基材の合計表面積をいう。
【0037】
前記培養基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記基材の表面が、平滑であってもよく、凹凸を有するものであってもよい。
【0038】
−培養方法−
前記微生物を前記培養基材上で培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を含む培地を充填した培養容器内に前記培養基材を浸漬して培養する方法(以下、「第1の培養形態」と称することがある。)、前記培養基材上に前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を含む培地を前記培養基材上に補充し空気中湿潤状態で培養する方法(以下、「第2の培養形態」と称することがある。)などが挙げられる。
【0039】
ここで、前記「一定量」とは、特に制限はなく、前記培養形態や前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができる。
【0040】
例えば、前記培養形態が、前記第1の培養形態である場合、前記一定量としては、前記微生物の種類、前記培養容器の大きさ、前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができるが、前記培養容器中の培地における前記採取工程において採取した微生物の濃度としては、1×103細胞/mL〜1×107細胞/mLが好ましく、1×104細胞/mL〜1×106細胞/mLがより好ましい。前記微生物の濃度が、1×103細胞/mL未満であると、前記培養基材上に前記微生物凝集膜を形成できないことや、前記微生物凝集膜の形成に長時間を要することなどがあり、1×107細胞/mLを超えると、前記微生物凝集膜が厚くなりすぎて後述する計測工程における計測が非効率となることや、バイオマスの生産コストが増加することがある。
なお、前記培養基材が球状、半球状、不定形である場合は、その培養形態は、前記第1の培養形態で振盪培養することが、前記培養基材表面の全面に前記微生物を付着させて培養することができる点で好ましい。
【0041】
また、例えば、前記培養形態が、前記第2の培養形態である場合、前記培養基材上に前記一定量の微生物を補充する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記一定量の微生物を含む培地をピペット等で前記培養基材に滴下する方法、前記一定量の微生物を含む培地に前記培養基材を含浸させてから引き上げる方法、前記一定量の微生物を含む培地を前記培養基材上にポンプを用いて供給する方法などが挙げられる。
【0042】
ここで、「空気中湿潤状態」とは、前記培養基材上の微生物凝集膜が乾かない状態であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、空気中の湿度が、前記微生物凝集膜が乾かない程度であれば、前記培養基材上に補充した前記微生物をそのままの環境で培養することができる。また、例えば、前記微生物凝集膜が乾いてしまう環境である場合は、必要に応じて、前記微生物を含まない培地などを適宜補充する方法などが挙げられる。
前記微生物を含まない培地などの溶液を補充する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物を含まない溶液をピペット等で前記培養基材に滴下する方法、前記微生物を含まない溶液に前記培養基材を含浸させてから引き上げる方法、前記培養基材上にポンプを用いて前記微生物を含まない溶液を少しずつ供給する方法などが挙げられる。また、湿潤箱内で前記微生物を含む培地を補充した前記培養基材を培養する方法を用いてもよい。
【0043】
このとき、前記一定量としては、前記微生物の種類、前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができるが、前記培養基材上への補充に用いる培地における、前記採取工程において採取した微生物の濃度としては、1×103細胞/mL〜1×107細胞/mLが好ましく、1×104細胞/mL〜1×106細胞/mLがより好ましい。前記微生物の濃度が、1×103細胞/mL未満であると、前記培養基材上に前記微生物凝集膜を形成できないことや、前記微生物凝集膜の形成に長時間を要することなどがあり、1×107細胞/mL未満を超えると、前記微生物凝集膜が厚くなりすぎて後述する計測工程における計測が非効率となることや、バイオマスの生産コストが増加することがある。
【0044】
前記採取工程において採取した前記微生物を前記培養基材上で培養する方法としては、前記微生物を前記培養基材上に付着させることができれば、特に制限はなく、微生物の種類、培養形態などに応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養法、振盪培養法、静置若しくは振盪しながら二酸化炭素や空気をバブリングさせて培養液を流動させながら培養する方法などが挙げられる。
例えば、前記培養基材が、ガラス等の割れ易い材質である場合は、培養液を流動させることなく静置培養することが好ましい。
また、例えば、前記培養基材が球状、半球状、又は不定形である場合は、静置培養すると、該培養基材のいずれの面が培養容器の内面や該培養基材同士で接触しているか判断することが難しく、後述する計測工程における計測が困難となるため、振盪培養が好ましい。
【0045】
前記培養に用いる培地としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができる。例えば、前記微生物が前記微細藻類である場合、その培養に用いる培地としては、例えば、無機物及び水から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記培養に用いる培地のpHとしては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、5〜9が好ましく、6〜8がより好ましい。前記pHが、5未満又は9を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0046】
前記培養における培養温度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0℃〜100℃が好ましく、15℃〜40℃がより好ましい。前記培養温度が、0℃未満又は100℃を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0047】
前記培養を行う期間としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1日間〜300日間が好ましく、2日間〜30日間がより好ましい。前記培養期間が、1日間未満であると、前記微生物の細胞数を十分に得ることができないことがあり、300日間を超えると、栄養分の不足により、微生物が死滅することがある。
【0048】
前記培養における二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0.001%〜50%が好ましく、1%〜10%がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、0.001%未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、50%を超えると、pHの低下により、前記微生物が育成できないことがある。
前記二酸化炭素濃度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養環境中を密閉系にして公知のセンサーで測定する方法、ガスクロマトグラフや分光器等の分析機器で測定する方法、アルカリ吸収法により測定する方法などが挙げられる。
【0049】
前記培養における照度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1ルクス〜100万ルクスが好ましく、1,000ルクス〜10万ルクスがより好ましい。前記照度が、1ルクス未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、100万ルクスを超えると、光障害により、前記微生物の増殖速度が低下したり、死滅したりすることがある。
前記照度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の照度計を用いて測定する方法などが挙げられる。
【0050】
−微生物凝集膜−
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着して形成された複数個の微生物が集合した膜であり、その微生物の構造体は、複数種の微生物から構成されていてもよく、単一種の微生物から構成されていてもよい。更に、微生物同士が直接隣接していてもよく、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して膜を形成していてもよい。更に、前記微生物凝集膜は、前記微生物が前記培養基材上に形成した一層の膜であってもよく、多層の膜であってもよい。また、本発明の微生物凝集膜とは、いわゆるバイオフィルムと呼ばれるものも含まれる。前記バイオフィルムとは、一般に、物質の状態が異なる界面上に形成される微生物から構成されたフィルム状の構造物のことをいい、本発明では、固体と液体、若しくは固体と気体の界面上に形成させるフィルム状の微生物集合体のことをいうものとする。また、本発明での前記微生物凝集膜には、“バイオフィルムの基礎と制御、株式会社エヌ・ティー・エス、2008年2月出版”に記載されているバイオフィルムを含むものとする。
【0051】
前記微生物凝集膜の平均膜厚としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、1μm〜10cmが好ましく、10μm〜1cmがより好ましく、10μm〜0.5cmが特に好ましい。前記平均膜厚が、1μm未満であると、前記微生物凝集膜が十分に形成されていないことがあり、10cmを超えると、後述する計測工程における計測が非効率になることや、ハンドリング時や培養時に希望しない微生物凝集膜の剥離が起こることがある。
前記平均膜厚とは、前記微生物凝集膜における10点以上の厚みの平均をいい、20点以上の平均膜厚であることが好ましく、30点以上の平均膜厚であることがより好ましい。前記平均値をとる点の数は、前記一定面積の大きさが大きくなるほど、多くの点でとることが、精度が高くなる点で好ましい。
前記微生物凝集膜の平均膜厚を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、偏光回析法(エリプソメトリー法)、走査型トンネル顕微鏡(STM)で測定する方法、公知の膜厚測定装置で測定する方法などが挙げられる。
【0052】
<分散工程>
前記分散工程は、前記微生物凝集膜を振動させて分散させる工程である。
ここで、本発明において、前記微生物凝集膜を「分散させる」とは、前記微生物凝集膜中の凝集した細胞を、後述する計測工程で該細胞の数を数えられる程度に分散させることをいう。細胞の数が数えられる程度とは、後述する計測工程における計測方法により、適宜選択できるが、数個の塊程度にバラバラにされることが好ましく、1つ1つの細胞にバラバラにされることが特に好ましい。
【0053】
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着したまま前記培養基材と共に前記分散工程に用いてもよく、前記培養基材上から回収してから前記分散工程に用いてもよい。このとき、前記培養基材の面積が大きい場合は、前記培養基材の一部を分離して分散工程に用いてもよい。
なお、前記培養基材と共に前記分散工程に用いる場合は、前記微生物凝集膜形成工程が、前記第1の培養形態で行われる場合、前記培養容器内で、前記培養基材上に付着していない微生物が混入しないように行う必要がある。
これらの方法は、前記培養基材の種類などに応じて適宜選択することができる。
前記回収する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養基材上から前記微生物凝集膜を剥離できるような薬剤(例えば、酵素など)を用いた化学的処理方法を施すことにより回収する方法、セルスクレーバー等を用いた物理的処理方法により回収する方法などが挙げられる。
【0054】
例えば、前記培養基材がガラスなどの割れやすく比重の重い材質からなる場合は、前記培養基材をそのまま分散工程に用いると、割れた培養基材の破断面により振動に用いる容器は破壊されるなど安全上問題があり、後述する計測工程に影響を及ぼすことがあるため、前記培養基材上から回収する方法を用いることが好ましい。
また、前記培養基材が球状、半球状、不定形である場合は、用いる培養基材の粒径に応じて適宜選択できるが、前記培養基材の数が多い場合は、前記回収する方法は操作が煩雑であり、またその粒径が小さい場合は回収することが困難となる観点から、前記培養基材と共に前記分散工程に用いることが好ましい。更に、前記培養基材上に凹凸がある場合は、前記回収する方法では凹部の微生物を回収することが困難であるため、前記培養基材をそのまま分散工程に用いることが好ましい。
【0055】
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着したまま又は前記回収したものを、そのまま前記分散工程に用いてもよく、培地や水等の溶液で適宜希釈して用いてもよいが、希釈して用いることが、前記微生物の破砕を防止することができ、効率よく分散させることができる点で好ましい。以下、希釈した微生物を含む溶液を「微生物凝集膜希釈液」と称することがある。
前記微生物凝集膜希釈液における前記微生物の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記微生物凝集膜希釈液は、振動を行う前に、ピペッティングなどを行ってもよい。
【0056】
また、前記分散工程において、前記振動により前記微生物凝集膜希釈液を振動させる際に、前記微生物凝集膜希釈液中の前記微生物凝集膜が高濃度の場合や、種々の代謝物を細胞外に放出する微生物の場合には、振動により気泡が発生し、前記微生物凝集膜の分散性が著しく低下することがある。この様な場合には、前記微生物凝集膜希釈液に消泡剤を添加することが好ましい。
前記消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記消泡剤の、前記微生物凝集膜希釈液への添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0057】
前記振動させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズ式細胞破砕装置(例えば、株式会社トミー精工製のMS−100)、ビーズ式ホモジナイザー(例えば、BioSpec Product社のBSP−3110BX)等の市販の装置を用いる方法などが挙げられる。
これらの装置を用いて振動を行う場合は、ビーズを用いないことが好ましいが、前記微生物の種類などに応じて、該微生物の分散性が悪い場合は、適宜ビーズを用いることもできる。
【0058】
前記振動させる条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微生物凝集膜中の微生物を破砕させることなく分散性を向上させる観点から、1分間当たりの振動数と振動時間(分間)とを組み合わせて決めることが好ましい(以下、「合計振動数」と称することがある。)。例えば、次式により合計振動数を算出することができる。
合計振動数(回)=1分間当たりの振動数(回)×振動時間(分間)
本発明において、振動とは、一の位置から他の位置に移動し、前記一の位置に戻ることをいい、例えば、振動が左右方向である場合は、左から右へ移動し左に戻ること、振動が上下方向である場合は、上から下へ移動し上に戻ること、即ち、1往復を1振動とする。なお、振動が回転の場合は、1回転を1振動とし、1分間当たりの振動数はrpmで表すことができる。即ち、振動数と、回転数とは同じことを意味するものとする。
【0059】
前記合計振動数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、160回〜50,000回が好ましく、1,160回〜10,000回がより好ましく、1,200回〜5,500回が更に好ましい。前記合計振動数が、160回未満であると、分散性が低下することがあり、50,000回を超えると、前記微生物が破砕することや、温度が上昇して前記微生物が失活又は死滅することがある。
【0060】
即ち、振動数が高い(例えば、5,000回)場合には、短時間(例えば、5秒間)で振動を行うことが好ましく、このときの合計振動数は417回となる。
反対に、振動数が低い(例えば、3,500回)場合には、振動時間を長時間(例えば、20秒間以上)で振動を行うことが好ましく、このときの合計振動数は1,167回となる。
【0061】
したがって、前記所望の合計振動数を得るためには、前記振動の条件としては、150回〜50,000回で5秒間〜300秒間行うことが好ましく、3,500回〜10,000回で20秒間〜1分間行うことがより好ましく、4,000回〜6,000回で20秒間〜60秒間行うことが更に好ましい。
【0062】
前記分散工程を行う回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微生物凝集膜の温度の上昇を防ぐことができ、前記微生物の失活又は死滅を防ぐことができる点で、複数回行うことが好ましい。
なお、複数回の振動を行う場合は、一回の振動が、前記好ましい合計振動数の範囲内となることが好ましい。
また、複数回振動させる場合の各回の間は、1秒間〜60分間あけることが好ましく、3秒間〜1分間がより好ましい。各回の間が、1秒間未満であると、前記微生物が失活又は死滅することがあり、60分間を超えると、非効率である。前記各回の間は、前記前培養の条件と同様の条件に置くことが好ましい。
【0063】
前記振動の振動形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上下方向、左右方向、前後方向などが挙げられる。これらは、1形態単独で行ってもよく、2形態以上を組み合わせて行ってもよい。これらの中でも、3形態全てを組み合わせて8の字に振動させることが特に好ましい(図4C参照)。
【0064】
なお、前記微生物凝集膜を振動させる場合は、該微生物凝集膜又は微生物凝集膜希釈液を密閉容器に入れて行うことが好ましい。前記密閉容器としては、特に制限はなく、振動に用いる装置の種類などに応じて適宜選択することができる。
【0065】
前記密閉容器の内容積に対する前記微生物凝集膜希釈液の容積比率(微生物凝集膜希釈液の容積/密閉容器の内容積×100%)としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、15容量%〜75容積%が好ましく、20容量%〜60容量%がより好ましい。前記容積比率が、15容量%未満であると、分散性が大幅に低下することがあり、75容量%を超えると、前記微生物凝集膜が十分に振動できず分散性が低下することがある。
【0066】
以下に、図1〜3を用いて、前記分散工程の一形態について説明するが、本発明の微生物細胞数の計測方法における分散工程は、この形態に限られるものではない。
図1の振動装置10は、前記分散工程に用いられる装置の一例の概略図であり、装置本体12と蓋部材14とで構成される。
図2は、装置本体12の内部の一例を示す概略図であり、振動を行う円板状の密閉容器ホルダー16が配置され、駆動軸18を介して振動駆動部20に支持される。密閉容器ホルダー16の周縁部には、蓋22A付き密閉容器22(図3参照)を着脱自在に保持する複数のチャック部24が設けられる。
【0067】
図3に示すように、蓋22A付き密閉容器22は、試験管形状に形成され、微生物27及び前記微生物凝集膜希釈液26中の前記微生物27を除くその他の成分25が充填された後、蓋22Aにより密閉できるように構成されている。
【0068】
図1に示すように、装置本体12の正面には、ON−OFFスイッチ28、密閉容器ホルダー16を介して密閉容器22を振動する際の振動数を設定する振動数ダイヤル30及び振動時間を設定するタイマーダイヤル32が設けられる。更には密閉容器22を振動させる振動方向の形態設定を行う切り換えスイッチ34等が設けられる。
【0069】
図4A〜Cに示すように、微生物凝集膜希釈液26が充填された密閉容器22を振動させる振動形態としては、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも1形態であるが、例えば、図4Aに示すように、上下方向と左右方向との組み合わせ、図4Bに示すように、左右方向と前後方向との組み合わせを採用することが好ましい。また、図4Cに示すように、上下しながら8の字を描くように密閉容器22が振動する特殊な振動形態が特に好ましい。
【0070】
このように、本発明の微生物細胞数の計測方法は、従来のように超音波振動で微生物自体を振動させることがないため、前記微生物を破砕させることがなく、かつ、前記微生物凝集膜中の前記微生物を1つ1つの細胞に分散させることができる。
【0071】
なお、本発明において、「破砕する」とは、前記微生物凝集膜中の全微生物細胞数に対する破砕した微生物細胞数の割合(破砕した微生物細胞数/全微生物細胞数×100%)が、30%未満であることをいい、好ましくは、20%未満であり、より好ましくは10%未満である。
前記微生物が破砕したか否かの確認は、例えば、顕微鏡で観察することにより確認することができる。
【0072】
<計測工程>
前記計測工程は、前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する工程である。
なお、前記計測工程は、例えば、装置などにより前記分散工程と同時に行われてもよい。
【0073】
前記計測する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記分散された微生物を含む溶液を、光学顕微鏡、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の各種顕微鏡で観察して直接計測する方法、血球計数盤上で計測する方法、フローサイトメーターで測定する方法、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておくことにより、吸光光度計で測定した測定値より算出する方法、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておくことにより、濁度計で測定した濁度から算出する方法、予め乾燥重量と細胞数との相関関係を求めておくことにより、該乾燥重量から算出する方法、予め蛍光光度計によってクロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておくことにより、クロロフィルの蛍光量から算出する方法などが挙げられる。
また、前記計測する方法として、光学顕微鏡で撮影した写真からソフトウエアを用いて算出する方法を用いることもできる。従来、前記微生物凝集膜中の1つ1つの微生物を分散させることができなかったため、計測に前記ソフトウエアを用いた場合、個々の微生物の認識能力が人間の目と比較して極めて低く、その精度が悪いことから、使用に耐えるものではなかった。しかし、本発明の微生物細胞数の計測方法によれば、前記微生物凝集膜中微生物を好適に分散させることができるため、画像認識ソフトウエアの認識能力を最大限に生かすことができる。更に、自動で前記微生物の細胞数を計測することができることから、人間が手動で計測するのと比較して、早く簡便に計測でき、人間の手間の省力化ができると共に、用いるソフトウエアの種類によっては、前記微生物の細胞の大きさの分布等の微生物に関する情報も同時に得ることが可能となる点で有利である。
【0074】
<その他の工程>
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物を自然界より採取する場合、前記微生物を自然界から採取後に純化する純化工程、前記計測工程において細胞を計測する前に染色する染色工程などが挙げられる。
【0075】
−純化工程−
自然界から微生物を採取する場合、採取した微生物は多種類の微生物の混合物であることが多い。このような場合に、目的の微生物を単一種の微生物として得るためには、純化工程を行うことが好ましい。
前記純化する方法としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、自然界から採取してきた微生物を寒天ゲル上に展開し、常法で培養して増殖させた後、得られたコロニーを採取し、採取したコロニーが単一種の微生物から構成されているかどうかを確認し、得られたコロニーが複数種の微生物から構成されている場合には、もう一度寒天培地上で展開して、単一種の微生物が得られるまで繰り返す方法などが挙げられる。
また、前記寒天培地に塗布する前に、遠心分離処理や多孔質膜による濾過処理を行ってもよい。例えば、微細藻類とバクテリアとでは大きさが異なるため、前処理工程の後に多孔質膜の使用によって分離したり、遠心により比重差を利用して分離したりすることにより、純化がより簡便にできる点で好ましい。
前記純化工程により、所望の微生物が純化されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、微生物の形態や色を観察する方法などが挙げられる。
【0076】
−染色工程−
前記染色工程としては、前記計測する方法などに応じて適宜選択することができるが、光学顕微鏡などにより目視で計測する際には、予め染色することが、細胞を認識しやすくなる点で好ましい。このような染色に用いる色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリパンブルー等の公知の色素を用いることができる。
また、前記計測する方法が、フローサイトメーターで測定する方法である場合は、公知の蛍光色素で染色する必要がある。
【0077】
<用途>
前記微生物細胞数の計測方法は、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を正確に計測することができ、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができるため、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発に好適に利用可能である。
【実施例】
【0078】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0079】
(実施例1)
<前培養工程>
フネケイソウ(NIES−176、国立環境研究所より入手)を、滅菌したC培地 200mLを入れた500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)で、温度20℃、照度2,000ルクスの条件下で、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS−20RL、株式会社サンキ精機製)を用いて、100rpmにて20日間前培養した。この前培養により増殖したフネケイソウを光学顕微鏡で観察したところ、フネケイソウが培地中で凝集体を形成していることが確認された。
なお、前記C培地は、硝酸カルシウム四水和物 150mg、硝酸カリウム 100mg、β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物 50mg、硫酸マグネシウム七水和物 40mg、ビタミンB12 0.1μg、ビオチン 0.1μg、チアミン塩酸 10μg、トリス 500mgに、以下の組成で調製したPIV metals 3mLを添加し、蒸留水で1Lとして溶解後、pH7.5に調製した。
前記PIV metalsは、塩化鉄六水和物 98mg、塩化マンガン四水和物 18mg、硫酸亜鉛七水和物 11mg、塩化コバルト六水和物 2mg、モリブデン酸ナトリウムニ水和物 1.25mg、EDTAナトリウム二水和物 500mgを水 500mLに溶解した。
【0080】
<採取工程>
前記前培養したフネケイソウの凝集体を含む培養液を0.5mL採取し、2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、フネケイソウの凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の10μLを血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に滴下し、光学顕微鏡下でフネケイソウの数を計測した結果、前培養工程中のフネケイソウの微生物濃度は、5×104個/mLであった。
【0081】
<微生物凝集膜形成工程>
前記採取工程で得られたフネケイソウを、滅菌したC培地で1×103個/mLに調製したものを500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)に200mL入れ、フネケイソウが培地中に均一になるように攪拌した。次いで、この三角フラスコの中に、0.7cm×1.4cmのナイロンフィルムを入れ、前培養と同様の条件で1ヶ月間振盪培養した。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、ナイロンフィルムの両面であり、1.96cm2である。
1ヵ月後、ナイロンフィルムを三角フラスコから取り出し、光学顕微鏡(10倍率)で観察したところ、ナイロンフィルム上にフネケイソウが密集して付着しフネケイソウの凝集膜が形成されていることが観察された。結果を図5に示す。なお、このとき、フネケイソウが高度に凝集していたため、該凝集膜中の細胞数を計測することはできなかった。
【0082】
<分散工程>
フネケイソウが凝集膜を形成したナイロンフィルムを、C培地が0.5mL入った2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、フネケイソウの凝集膜を分散させた凝集膜分散液を得た。
分散工程終了後のナイロンフィルムを光学顕微鏡(10倍率)で観察したところ、ナイロンフィルム上にはフネケイソウはほとんど認められず、この振動処理により効率よくナイロンフィルムからフネケイソウを分離することができた。結果を図6に示す。
【0083】
<計測工程>
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に10μL滴下し、光学顕微鏡(10倍率)下で観察したところ、フネケイソウの凝集膜から個々のフネケイソウの細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図7に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中のフネケイソウの細胞数は、7.7×105個/mLであった。
これより、凝集膜分散液が0.5mLであり、ナイロンフィルムの面積は、1.96cm2であったことから、該ナイロンフィルムにおけるフネケイソウの付着量は、表裏を考慮すると1.96×105個/cm2であった。
【0084】
(実施例2)
<前培養工程>
自然海水から採取した珪藻を人工海水(マリンアート スーパーフォーミュラ SF−1、冨田製薬株式会社製)を38g/L含むIMK培地(ダイゴIMK培地、日本製薬株式会社)のアガロースゲル上で培養し、得られたコロニーをピックアップした。これを、光学顕微鏡で観察したところ、珪藻以外の微生物が混入してないことが確認でき、珪藻を純化することができた。なお、顕微鏡観察により、微生物の形態、及び着色が茶色であることを観察することにより、珪藻であると判断した。
【0085】
純化した珪藻を、前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地200mLを入れた500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)で、20℃、照度2,000ルクスの条件下で、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS−20RL、株式会社サンキ精機製)を用いて、100rpmにて20日間前培養した。この前培養により増殖した珪藻を光学顕微鏡で観察したところ、珪藻が培地中で凝集体を形成していることが確認された。
【0086】
<採取工程>
前記前培養後、珪藻を含む三角フラスコを0.5時間静置しながら放置することにより、珪藻の比重が前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地よりも重いことを利用して珪藻を自然沈降させた。次いで、三角フラスコ底部に自然沈降した珪藻を、ピペットを用いて2mL吸い取り、この全量を5mL容のホモジナイズ用チューブ(TM−655S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該チューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数4,200回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させた。なお、振幅操作は3回行い、振幅操作間の間に1分間の非振動時間を入れた。この振動を、同様の操作で3回行うことにより、珪藻の凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の10μLを血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に滴下し、光学顕微鏡下で珪藻の数を計測した結果、2.35×107個/mLであった。
【0087】
<微生物凝集膜形成工程>
前記採取工程で得られた珪藻を、前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地で2×104個/mLに調製したものを100mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)に20mLに入れ、珪藻が培地中に均一になるように攪拌した。10cmのプラスチック製シャーレ(アズノール滅菌シャーレ、アズワン株式会社製)の内部に、7.6cm×2.6cmのスライドグラス(白スライドグラス、アズワン株式会社製)を置き、前記調製した珪藻を20mL添加し、温度23℃、照度2,000ルクスの条件下で、10日間静置培養を行った。なお、珪藻の凝集膜を形成させたスライドグラスは40枚作製した。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、スライドグラスの片面であり、19.76cm2であった。
【0088】
<分散工程>
10日間培養後、2枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地中に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻を、セルスクレーバーを用いて剥離し、7mLの前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地に入れた。次いで、1mLのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を10回ピペッティングした。ピペッティング後、光学顕微鏡で観察したところ、珪藻の凝集膜のほとんどは分散されておらず、凝集の形態をとったままであった。
この珪藻の凝集膜を含む培地を0.5mL用いての2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、珪藻の凝集膜を分散させた実施例2の凝集膜分散液を得た。
【0089】
<計測工程>
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に10μL滴下し、光学顕微鏡(10倍率)下で観察したところ、珪藻の凝集膜から個々の珪藻の細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図8に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中の珪藻の細胞数は、2枚のスライドグラスの平均値で、1.2×106個/cm2であった。
【0090】
(実施例3)
実施例2において、分散工程を以下の分散方法に変えたこと以外は、実施例2と同様の方法で微生物細胞数の計測を行った。
【0091】
実施例2の微生物凝集膜形成工程において、10日間培養後、2枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻を、セルスクレーバーを用いて剥離し、7mLの前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に入れた。次いで、1mLのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を10回ピペッティングした後、0.5mLの珪藻の凝集膜を含む培地を2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、更に直径 0.5mmのジルコニアビーズを約0.1mL入れ、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、珪藻の凝集膜を分散させた実施例3の凝集膜分散液を得た。
【0092】
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤を用いて、光学顕微鏡(10倍率)下で観察し、細胞数の計測を行った。観察した結果を図9A及び図9Bに示す。珪藻の細胞が破砕しているものがいくつか認められたが、破砕した細胞と、生細胞とを観察により区別することができるため、生細胞を計測することができた。
即ち、凝集膜分散液中の珪藻の細胞数は、2枚のスライドグラスの平均値で、1.0×106個/cm2であった。
【0093】
(実施例4)
<前培養工程>
ボトリオコッカス(NIES−2199、国立環境研究所より入手)を、滅菌した2×CHU13培地 200mLを入れた500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)で、温度20℃、照度2,000ルクスの条件下で、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS−20RL、株式会社サンキ精機製)を用いて、100rpmにて20日間前培養した。この前培養により増殖したボトリオコッカスを光学顕微鏡で観察したところ、ボトリオコッカスが培地中で凝集体を形成していることが確認された。
なお、2×CHU13培地の組成は、K. Yamaguchi et al., Agric. Biol. Chem., 51 (2), 493−498, 1987を参照し、以下の組成とした。即ち、2×CHU13培地は、硝酸カリウム 400 mg、リン酸水素二カリウム 80mg、硫酸マグネシウム七水和物 200mg、塩化カルシウム二水和物 107mg、クエン酸鉄 20mg、クエン酸 100mg、塩化コバルト 0.02mg、ホウ酸 5.72mg、塩化マンガン四水和物 3.62mg、硫酸亜鉛七水和物 0.44mg、硫酸銅五水和物 0.16mg、モリブデン酸ナトリウム 0.084mgを蒸留水 1Lに溶解し、0.072N 硫酸によりpH7.5に調製した。
【0094】
<採取工程>
前記前培養後、ボトリオコッカスを含む三角フラスコを1時間静置しながら放置することにより、ボトリオコッカスを自然沈降させた。次いで、三角フラスコ底部に自然沈降したボトリオコッカスを、ピペットを用いて2mL吸い取り、5mL容のホモジナイズ用チューブ(TM−655S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該チューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させて、ボトリオコッカスの凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の10μLを血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に滴下し、光学顕微鏡下で珪藻の数を計測した結果、2.0×106個/mLであった。
【0095】
<微生物凝集膜形成工程>
前記採取工程で得られたボトリオコッカスを、滅菌した2×CHU13培地で2×106個/mLに調製したものを100mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)に20mLに入れ、ボトリオコッカスが培地中に均一になるように攪拌した。消毒用エタノールに30分間浸漬後、クリーンベンチ内で乾燥させた、直径1cmのポリスチレンフィルムを、24穴プレート(微生物培養プレート、アズワン株式会社製)の内部に置き、前記調製したボトリオコッカスを2mL/ウエル添加し、温度23℃、照度2,000ルクスの条件下で、7日間静置培養を行った。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、ポリスチレンフィルムの片面であり、0.79cm2である。
培養後のボトリオコッカスが付着したポリスチレンフィルムの様子を光学顕微鏡(40倍)で観察した結果を図10に示す。なお、このとき、ボトリオコッカスが高度の凝集しているため、該凝集膜中の細胞数を計測することはできなかった。
【0096】
<分散工程>
7日間培養後、24穴プレートからポリスチレンフィルムを取り出し、滅菌済みの2×CHU13培地に浸漬して洗浄することで、ポリスチレンフィルムに非付着のボトリオコッカスを洗浄除去した。次いで、ポリスチレンフィルムを2×CHU13培地が2mL入ったホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−655S滅菌付、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、ボトリオコッカスの凝集膜を分散させた実施例4の凝集膜分散液を得た。
【0097】
<計測工程>
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に10μL滴下し、光学顕微鏡(10倍率)下で観察したところ、ボトリオコッカスの凝集膜から個々のボトリオコッカスの細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図11に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中のボトリオコッカスの細胞数は、10.6×106個/cm2であった。
【0098】
(比較例1)
実施例2において、分散工程を以下の分散方法に変えたこと以外は、実施例2と同様の方法で微生物細胞数の計測を行った。
【0099】
実施例2の微生物凝集膜形成工程において、10日間培養後、2枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻をセルスクレーバーを用いて剥離し、7mLの前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に入れた。次いで、1mLのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を10回ピペッティングした後、0.5mLの珪藻の凝集膜を含む培地を2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、超音波洗浄機(USD−4R、アズワン株式会社)にセットした。次いで、珪藻の凝集膜を含む培地に対して28kHzで5分間超音波を印加し、珪藻の凝集膜を分散させた比較例1の凝集膜分散液を得た。
【0100】
得られた凝集膜分散液を光学顕微鏡(10倍率)で観察した結果を図12A及び図12Bに示す。その結果、珪藻の細胞が破砕しているものが多く認められ、細胞数を計測することができなかった。
【0101】
実施例1〜4及び比較例1の計測工程で凝集膜分散液を光学顕微鏡にて観察し、分散性を下記評価基準に基づいて評価した。また、破砕した微生物細胞の割合を下記式により算出し、細胞破砕を下記評価基準に基づいて評価した。実施例1〜4及び比較例1、並びに試験例1の結果をまとめて表1に示す。
破砕した微生物細胞の割合(%)=破砕した微生物細胞数/全微生物細胞数×100%
[分散性の評価基準]
○ : 個々の分散されており顕微鏡にて容易に計測できる
△ : 数個細胞からなる塊が存在するものの計測できる
× : 微生物細胞が大きく凝集しており計測できない
[細胞破砕の評価]
◎ : 破砕した細胞が10%未満
○ : 破砕した細胞が20%未満
△ : 破砕した細胞が30%未満
× : 破砕した細胞が30%以上
【0102】
【表1】
【0103】
(試験例1)
実施例2及び3で計測工程に使用しなかった38枚のスライドグラスから、実施例2及び3の分散工程と同様の方法で珪藻を分散させた凝集膜分散液を得た。次いで、実施例2及び3と同様の方法で、スライドグラス38枚の珪藻の細胞数をそれぞれ数えた。その結果、スライドグラス38枚の合計の珪藻の細胞数は、9×108個であった。
また、実施例4と同様にプラスチック製シャーレ(アズノール滅菌シャーレ、アズワン株式会社製)にポリスチレンフィルム(直径8cm)を入れた容器を12枚作成し、実施例4と同様の方法でボトリオコッカスからなる微生物凝集膜を作製した。実施例4と同様の方法で、ポリスチレンフィルムを2枚のボトリオコッカスの細胞数をそれぞれ数えた。その結果、ポリスチレンフィルムを10枚の合計のボトリオコッカスの細胞数は、6.23×109個であった。
【0104】
上記得られた珪藻(実施例1及び2)を、卓上遠心機(チビタンR、アズワン株式会社製)を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、珪藻からなる沈殿に、1/10濃度の人工海水(マリンアート スーパーフォーミュラ SF−1、冨田製薬株式会社製)を38g/L含むIMK培地(ダイゴIMK培地、日本製薬株式会社)を1mL添加し、卓上攪拌機(ボルテックスミキサー、アズワン株式会社製)を用いて1分間の攪拌処理を行った。これを、卓上遠心機を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離しすることにより、珪藻の細胞表面を洗浄した。この洗浄は2回行った。次いで、マイクロチューブを100℃のオーブン中で加熱することで溶媒を除去し、乾燥珪藻の藻体を得た。乾燥珪藻の藻体の質量は、空のマイクロチューブの重さとの差を測定することで得た。
【0105】
上記得られたボトリオコッカス(実施例4)は、前記珪藻の処理において、珪藻をボトリオコッカスに代え、人工海水を38g/L含むIMK培地を2×CHU13培地に代えたこと以外は、前記珪藻の処理と同様の方法により乾燥ボトリオコッカスの藻体の質量を測定した。
【0106】
次に、乾燥珪藻又は乾燥ボトリオコッカスの藻体を15mLの遠沈管に移し、そこへ2mLの5質量%塩酸−メタノール溶液を添加し、100℃で1時間反応を行った。この反応液にヘキサン1.5mL及び水0.5mLを添加した後、卓上遠心機を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離した。上清を分取し、純水1mLを加え、よく攪拌した後、卓上遠心機を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離した。上層のヘキサン層を分取し、溶媒をエバポレーションにより除去した後、予め質量を測定しておいた空の遠沈管の質量との差から、珪藻又はボトリオコッカスが細胞内に産生したオイル含有量を測定した。結果を表2に示す。
【0107】
【表2】
【0108】
表1の結果より、前記微生物細胞数の計測方法は、微生物凝集膜中の微生物を破砕させることなく簡便な操作で分散させることができ、正確に細胞数を計測することができることがわかった。また、これにより微生物が産生するバイオマスを、細胞1個あたりの量として測定することができることもわかった。これより、前記微生物細胞数の計測方法によれば、例えば、微生物から産生されたバイオマス量が増加した場合、その増加が、微生物の細胞数が増えたことによるものなのか、あるいは、微生物の1細胞から産生されるバイオマス量が増加したのかをモニターすることができる。したがって、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発などに好適に利用可能である。
【0109】
本実施例の微生物細胞数の計測方法により、微細藻類が産生するバイオマスについて、細胞1個あたりの産生量を正確に、かつ簡便に測定できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0110】
本発明の微生物細胞数の計測方法は、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を正確に計測することができ、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができるため、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発に好適に利用可能である。
【符号の説明】
【0111】
10 振動装置
12 装置本体
14 蓋部材
16 密閉容器ホルダー
18 駆動軸
20 振動駆動部
22 密閉容器
22A 蓋
24 チャック部
25 その他の成分
26 微生物凝集膜希釈液
27 微生物
28 ON−OFFスイッチ
30 振動数ダイヤル
32 タイマーダイヤル
34 切り換えスイッチ
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物から産生されるバイオマスには有用なものが多く、盛んに研究が行われている。そのため微生物の成長過程をモニターする必要性があるが、微生物の多くは、細胞外マトリックスのような細胞外物質を放出して増殖するに伴い微生物同士が凝集してしまい、該微生物が培養基材上に存在する場合は、微生物及びその細胞外マトリクスにより微生物凝集膜が形成されるため、該微生物凝集膜中の個々の微生物をモニターすることは困難である。
【0003】
このような微生物凝集膜中の個々の微生物をモニターする方法としては、例えば、湿潤状態の微生物凝集膜を乾燥固化させることで微生物凝集膜中の微生物量を測定する方法、クロロフィルを有する微生物においては、そのクロロフィル量を測定することによりモニターする方法などが挙げられる(例えば、非特許文献1参照)。
しかし、これらの方法は、微生物凝集膜自体の質量などを測定することはできるものの、微生物凝集膜中に存在する微生物の細胞数を計測することはできず、また、微生物が産生する細胞外物質の放出量が、培養条件や微生物の生育段階によって異なることから、細胞外物質の質量と微生物凝集膜中の微生物の細胞数とは必ずしも一致しないため、個々の微生物についてモニターすることができない点で問題である。
【0004】
また、事前に微生物の凝集を防止するために、培養槽に超音波を印加しながら微生物を培養する方法が提案されている(特許文献1参照)。
しかし、この方法は、培養中の微生物の凝集を防ぐ方法であるため、既に微生物凝集膜を形成している該凝集膜中の微生物をモニターする方法には適用できない。また、ある程度の液体培地量が必要であること、細胞へのダメージが大きく細胞が破砕してしまうことがあること、完全に分散できない場合があること、などの点からもこの方法を応用することは困難である。
【0005】
更に、これらの微生物凝集膜自体又は微生物が放出する細胞外物質の質量を測定する方法は、実験系においては、微生物凝集膜中に存在する種々の培地等に含まれる各種塩なども含めた質量として算出されるため、純粋な微生物の質量ではない点においても問題である。特に、海水中に存在する微生物を用いる場合は、塩濃度の高い培地を用いるため、塩による影響が大きく現れてしまい、正確にモニターすることができないといった問題がある。
塩による影響を解消するために微生物凝集膜を低イオン強度の溶液で洗浄する等の方法を行うことも考え得るが、微生物凝集膜は、ある程度の厚みを有する微生物の集合体であるがゆえに、その内部に存在する塩などの濃度を低下させることは非常に困難である。また、低イオン強度の溶液で洗浄することは、微生物に対する浸透圧の影響から、微生物が破裂や収縮が生じ、微生物形状の消失により正確な微生物凝集膜量を測定することができないなどの種々の弊害がある。
【0006】
したがって、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法の提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開平7−298869号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Katsuta Abe et al., World J. Microbiol. Biotechnol, 2003, 19, 325−328
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、微生物を前培養し、前記前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取し、これを一定面積の培養基材上で培養して、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させ、前記微生物凝集膜を振動させて分散させることにより、前記微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができること、また、前記分散された微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測することにより、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができることを知見し、本発明の完成に至った。
【0011】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
<1> 微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法であって、
前記微生物を前培養する前培養工程と、
前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、
前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程と、
前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、
前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程と、
を含むことを特徴とする、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<2> 分散工程における振動の回数が、次式で表される合計振動数で1,160回〜10,000回である前記<1>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
合計振動数(回)=1分間当たりの振動数(回)×振動時間(分間)
<3> 分散工程における振動の形態が、上下方向、左右方向、及び前後方向の少なくとも1形態である前記<1>から<2>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<4> 分散工程が、容器に充填した微生物凝集膜を振動させる工程であり、該容器の内容積に対する前記微生物凝集膜の容積比率が15容量%〜75容積%である前記<1>から<3>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<5> 分散工程が、微生物凝集膜に消泡剤を添加して行われる前記<1>から<4>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<6> 分散工程が、複数回行われる前記<1>から<5>のいずれかに記載の微生物細胞数の計測方法である。
<7> 微生物が微細藻類である前記<1>から<6>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<8> 微生物がバイオマスを産生する微生物である前記<1>から<7>のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<9> バイオマスを産生する微生物が、珪藻類、黄緑藻類、及び緑藻類の少なくともいずれかである前記<8>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<10> 黄緑藻類が、Botryococcus属である前記<9>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
<11> 緑藻類が、Haematococcus属である前記<9>に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図1は、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程で使用する振動装置の外観図の一例を示す概略図である。
【図2】図2は、図1の振動装置の容器ホルダーと駆動部とを示した斜視図の一例である。
【図3】図3は、振動装置に使用する密閉容器に微生物を充填する様子を示した斜視図の一例である。
【図4A】図4Aは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図4B】図4Bは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図4C】図4Cは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図5】図5は、実施例1の微生物凝集膜形成工程においてナイロンフィルム上にフネケイソウが凝集膜を形成した様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図6】図6は、実施例1の分散工程後のナイロンフィルム上の様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図7】図7は、実施例1の分散工程においてナイロンフィルム上の凝集膜から培地中に分散したフネケイソウの数を計測する様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図8】図8は、実施例2の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の数を計測する様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図9A】図9Aは、実施例3の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。破線部及び実践部は、破砕した細胞を示す。
【図9B】図9Bは、実施例3の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の様子を光学顕微鏡(40倍率)で観察し、図9Aの実線部を拡大した図である。
【図10】図10は、実施例3の微生物凝集膜形成工程においてポリスチレンフィルム上にボトリオコッカスが凝集膜を形成した様子を光学顕微鏡(40倍率)で観察した図である。
【図11】図11は、実施例3の分散工程においてポリスチレンフィルム上の凝集膜から培地中に分散したボトリオコッカスの数を計測する様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。
【図12A】図12Aは、比較例1の珪藻の凝集膜の超音波処理後細胞の様子を光学顕微鏡(10倍率)で観察した図である。破線部及び実践部は、破砕した細胞を示す。
【図12B】図12Bは、比較例1の珪藻の凝集膜の超音波処理後細胞の様子を光学顕微鏡(40倍率)で観察し、図12Aの実線部を拡大した図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
(微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法)
本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法は、前培養工程と、採取工程と、微生物凝集膜形成工程と、分散工程と、計測工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【0015】
<前培養工程>
前記前培養工程は、微生物を前培養する工程である。
【0016】
−微生物−
本発明において微生物としては、人の肉眼では、その個々の存在が識別できないような微小な生物を指し、微生物凝集膜を形成する微生物であれば、特に制限はなく、原核生物及び真核生物のいずれであってもよい。
なお、微生物凝集膜を形成することによって、人の肉眼で微生物の集合体が識別可能になる場合でも、集合体構造を崩して個々の微生物にすることによって、人の肉眼では識別することができない場合は、本発明における微生物とする。
また、個々の微生物の状態によるが、細胞数(例えば、微細藻類の藻体数)が増加することによって、色の変化でその存在を知ることが可能となるものもあるが、そのような場合でも、個々の微生物を人の肉眼によって観察することはできないことから、本発明でいうところの微生物に含むものとする。
【0017】
前記原核生物としては、細胞核を有さない生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真性細菌、古細菌などが挙げられる。
前記真核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藻類、原生生物、菌類、粘菌、ワムシなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記微生物としてはバイオマスを産生する微生物が好ましく、微細藻類が特に好ましい。
【0018】
前記「微細藻類」とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上で生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものの総称であり、例えば、シアノバクテリア等の原核生物、単細胞生物又は多細胞生物の海藻類等の真核生物などが挙げられる。
【0019】
前記微細藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記微細藻類としては、緑色植物門が好ましく、バイオマスを産生する点で、珪藻類、黄緑藻類、緑藻類がより好ましく、ボトリオコッカス(Botryococcus)属、ヘマトコッカス(Haematococcus)属が更に好ましい。
【0020】
本発明において、「バイオマス」とは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源などが挙げられる。また、前記バイオマスには、生物が産生する、多糖、炭化水素化合物、トリグリセリド等のオイルを含むものとする。
【0021】
前記微生物を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などが挙げられる。
【0022】
−前培養−
前記微生物を前培養する方法としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養法、振盪培養法、静置若しくは振盪しながら二酸化炭素や空気をバブリングさせて培養液を流動させながら培養する方法などが挙げられる。
前記微生物は、基本的には凝集する性質を有するものであるため、前培養することにより微生物凝集体を形成することがある。本発明において、「微生物凝集体」とは、複数個の微生物が集合した構造体のことをいい、その微生物の構造体は、複数種の微生物から構成されていてもよく、単一種の微生物から構成されていてもよい。更に、微生物同士が直接隣接していてもよく、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して凝集していてもよい。また、群体といわれているものも、本発明では、凝集のことを意味するものとする。
【0023】
前記微生物の前培養に用いる培地としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができる。例えば、前記微生物が前記微細藻類である場合、その前培養に用いる培地としては、例えば、無機物及び水から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記前培養に用いる培地のpHとしては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、5〜9が好ましく、6〜8がより好ましい。前記pHが、5未満又は9を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0024】
前記前培養における培養温度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0℃〜100℃が好ましく、15℃〜40℃がより好ましい。前記培養温度が、0℃未満又は100℃を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0025】
前記前培養を行う期間としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1日間〜300日間が好ましく、2日間〜30日間がより好ましい。前記培養期間が、1日間未満であると、前記微生物の細胞数を十分に得ることができないことがあり、300日間を超えると、栄養分の不足により、微生物が死滅することがある。
【0026】
前記前培養における二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0.001%〜50%が好ましく、1%〜10%がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、0.001%未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、50%を超えると、pHの低下により、前記微生物が育成できないことがある。
前記二酸化炭素濃度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養環境中を密閉系にして公知のセンサーで測定する方法、ガスクロマトグラフや分光器等の分析機器で測定する方法、アルカリ吸収法により測定する方法などが挙げられる。
【0027】
前記前培養における照度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1ルクス〜100万ルクスが好ましく、1,000ルクス〜10万ルクスがより好ましい。前記照度が、1ルクス未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、100万ルクスを超えると、光障害により、前記微生物の増殖速度が低下したり、死滅したりすることがある。
前記照度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の照度計を用いて測定する方法などが挙げられる。
【0028】
<採取工程>
前記採取工程は、前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する工程である。
【0029】
前記一定量を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を分散させた後、ピペットにより該微生物を採取する方法などが挙げられる。
【0030】
前記微生物凝集体を分散させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を含む培地をピペッティングにより分散させる方法、振動により分散させる方法、超音波により分散させる方法などが挙げられる。これらの中でも、前記分散させる方法としては、振動により分散させる方法が、微生物が破砕されることがなく分散性がよいため、所望量を採取できる点で好ましい。
なお、前記分散の際に、前記微生物凝集体は、採取したそのまま用いられてもよく、前記微生物凝集体を濃縮したものを用いてもよく、前記微生物凝集体を濃縮したものを新しい培地や水等の溶液で適宜希釈して用いられてもよいが、前記微生物凝集体を濃縮したものを前記溶液で適希釈して用いられることが、前記微生物の破砕を防止することができ、効率よく分散させることができる点で好ましい。
前記濃縮の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記前培養後の培養液を静置することにより前記微生物凝集体を沈殿させ、該沈殿により濃縮された微生物凝集体を含む培地をピペットなどで採取する方法などが挙げられる。
【0031】
前記採取工程において、前記微生物凝集体を分散させることにより、前記微生物の細胞数を計測することができ、一定量の微生物を採取することができる。
前記微生物の量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を分散させた前記微生物を、光学顕微鏡、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の各種顕微鏡で観察して直接計測する方法、血球計数盤上で計測する方法、光学顕微鏡で撮影した写真からソフトウエアを用いて算出する方法、フローサイトメーターで測定する方法、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておくことにより、吸光光度計で測定した測定値より算出する方法、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておくことにより、濁度計で測定した濁度から算出する方法、予め乾燥重量と細胞数との相関関係を求めておくことにより、該乾燥重量から算出する方法、予め蛍光光度計によってクロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておくことにより、クロロフィルの蛍光量から算出する方法などが挙げられる。
【0032】
<微生物凝集膜形成工程>
前記微生物凝集膜形成工程は、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる工程である。
【0033】
−培養基材−
本発明において、前記「培養基材」とは、前記微生物が付着でき、一定面積を有する基材をいう。
前記培養基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス(ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ほうけい酸ガラスなど)、ナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース、ポリプロピレン、ポリイミド、フッ素樹脂、アクリル樹脂などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
【0034】
前記培養基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、板状、球状、半球状、不定形、糸状、繊維状、不織布状、布状、織物状、編物状、寒天状などが挙げられる。
前記培養基材が板状の場合、その厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、0.001mm〜1,000mmが好ましく、0.01mm〜10mmがより好ましい。
前記培養基材が球状又は半球状の場合、その粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、0.001mm〜1,000mmが好ましく、0.01mm〜10mmがより好ましい。
【0035】
ここで、「培養基材上」とは、培養時に前記微生物を含む培地に接しており、前記微生物が前記培養基材に付着して増殖することができる前記培養基材表面をいう。
例えば、前記培養基材表面の全体が培地に接している場合は、前記培養基材表面の全体を培養基材上とする。
また、例えば、前記培養基材が板状であり、該板状の培養基材の一方の面が、例えば、培養容器の内部の底面に積置され、培地と接触していない場合は、前記一方の面を除くその他の面を培養基材上といい、前記板状の培養基材の全面が培地に接している場合は、前記板状の培養基材表面の全面を培養基材上という。
【0036】
また、「一定面積」とは、前記培養基材上の面積をいい、前記培養基材の形状や培養形態などに応じて適宜選択することができるが、1mm2〜1m2が好ましく、1cm2〜0.5m2がより好ましく、1cm2〜0.1m2が特に好ましい。前記面積は、1mm2未満であると、十分な量の前記微生物凝集膜を形成させることができないことがある。
なお、前記一定面積は、大規模培養を行う目的で1m2を超える面積であってもよいが、その場合であっても10,000m2以下であることが好ましく、1,000m2以下であることがより好ましい。前記一定面積が、10,000m2を超えると、ハンドリングが困難となることがある。このような大規模培養を行う場合、後述する分散工程及び計測工程には、前記一定面積のうちの一部の面積を切り出して、若しくは、一部の面積の前記培養基材上に付着した前記微生物を剥離して用いることが好ましい。前記一部の面積としては、特に制限はなく、前記一定面積の範囲内で適宜選択することができる。
前記一定面積は、前記培養基材が複数個同時に用いる場合は、複数個の培養基材の合計表面積をいう。
【0037】
前記培養基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記基材の表面が、平滑であってもよく、凹凸を有するものであってもよい。
【0038】
−培養方法−
前記微生物を前記培養基材上で培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を含む培地を充填した培養容器内に前記培養基材を浸漬して培養する方法(以下、「第1の培養形態」と称することがある。)、前記培養基材上に前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を含む培地を前記培養基材上に補充し空気中湿潤状態で培養する方法(以下、「第2の培養形態」と称することがある。)などが挙げられる。
【0039】
ここで、前記「一定量」とは、特に制限はなく、前記培養形態や前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができる。
【0040】
例えば、前記培養形態が、前記第1の培養形態である場合、前記一定量としては、前記微生物の種類、前記培養容器の大きさ、前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができるが、前記培養容器中の培地における前記採取工程において採取した微生物の濃度としては、1×103細胞/mL〜1×107細胞/mLが好ましく、1×104細胞/mL〜1×106細胞/mLがより好ましい。前記微生物の濃度が、1×103細胞/mL未満であると、前記培養基材上に前記微生物凝集膜を形成できないことや、前記微生物凝集膜の形成に長時間を要することなどがあり、1×107細胞/mLを超えると、前記微生物凝集膜が厚くなりすぎて後述する計測工程における計測が非効率となることや、バイオマスの生産コストが増加することがある。
なお、前記培養基材が球状、半球状、不定形である場合は、その培養形態は、前記第1の培養形態で振盪培養することが、前記培養基材表面の全面に前記微生物を付着させて培養することができる点で好ましい。
【0041】
また、例えば、前記培養形態が、前記第2の培養形態である場合、前記培養基材上に前記一定量の微生物を補充する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記一定量の微生物を含む培地をピペット等で前記培養基材に滴下する方法、前記一定量の微生物を含む培地に前記培養基材を含浸させてから引き上げる方法、前記一定量の微生物を含む培地を前記培養基材上にポンプを用いて供給する方法などが挙げられる。
【0042】
ここで、「空気中湿潤状態」とは、前記培養基材上の微生物凝集膜が乾かない状態であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、空気中の湿度が、前記微生物凝集膜が乾かない程度であれば、前記培養基材上に補充した前記微生物をそのままの環境で培養することができる。また、例えば、前記微生物凝集膜が乾いてしまう環境である場合は、必要に応じて、前記微生物を含まない培地などを適宜補充する方法などが挙げられる。
前記微生物を含まない培地などの溶液を補充する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物を含まない溶液をピペット等で前記培養基材に滴下する方法、前記微生物を含まない溶液に前記培養基材を含浸させてから引き上げる方法、前記培養基材上にポンプを用いて前記微生物を含まない溶液を少しずつ供給する方法などが挙げられる。また、湿潤箱内で前記微生物を含む培地を補充した前記培養基材を培養する方法を用いてもよい。
【0043】
このとき、前記一定量としては、前記微生物の種類、前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができるが、前記培養基材上への補充に用いる培地における、前記採取工程において採取した微生物の濃度としては、1×103細胞/mL〜1×107細胞/mLが好ましく、1×104細胞/mL〜1×106細胞/mLがより好ましい。前記微生物の濃度が、1×103細胞/mL未満であると、前記培養基材上に前記微生物凝集膜を形成できないことや、前記微生物凝集膜の形成に長時間を要することなどがあり、1×107細胞/mL未満を超えると、前記微生物凝集膜が厚くなりすぎて後述する計測工程における計測が非効率となることや、バイオマスの生産コストが増加することがある。
【0044】
前記採取工程において採取した前記微生物を前記培養基材上で培養する方法としては、前記微生物を前記培養基材上に付着させることができれば、特に制限はなく、微生物の種類、培養形態などに応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養法、振盪培養法、静置若しくは振盪しながら二酸化炭素や空気をバブリングさせて培養液を流動させながら培養する方法などが挙げられる。
例えば、前記培養基材が、ガラス等の割れ易い材質である場合は、培養液を流動させることなく静置培養することが好ましい。
また、例えば、前記培養基材が球状、半球状、又は不定形である場合は、静置培養すると、該培養基材のいずれの面が培養容器の内面や該培養基材同士で接触しているか判断することが難しく、後述する計測工程における計測が困難となるため、振盪培養が好ましい。
【0045】
前記培養に用いる培地としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができる。例えば、前記微生物が前記微細藻類である場合、その培養に用いる培地としては、例えば、無機物及び水から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記培養に用いる培地のpHとしては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、5〜9が好ましく、6〜8がより好ましい。前記pHが、5未満又は9を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0046】
前記培養における培養温度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0℃〜100℃が好ましく、15℃〜40℃がより好ましい。前記培養温度が、0℃未満又は100℃を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【0047】
前記培養を行う期間としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1日間〜300日間が好ましく、2日間〜30日間がより好ましい。前記培養期間が、1日間未満であると、前記微生物の細胞数を十分に得ることができないことがあり、300日間を超えると、栄養分の不足により、微生物が死滅することがある。
【0048】
前記培養における二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、0.001%〜50%が好ましく、1%〜10%がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、0.001%未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、50%を超えると、pHの低下により、前記微生物が育成できないことがある。
前記二酸化炭素濃度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養環境中を密閉系にして公知のセンサーで測定する方法、ガスクロマトグラフや分光器等の分析機器で測定する方法、アルカリ吸収法により測定する方法などが挙げられる。
【0049】
前記培養における照度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、1ルクス〜100万ルクスが好ましく、1,000ルクス〜10万ルクスがより好ましい。前記照度が、1ルクス未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、100万ルクスを超えると、光障害により、前記微生物の増殖速度が低下したり、死滅したりすることがある。
前記照度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の照度計を用いて測定する方法などが挙げられる。
【0050】
−微生物凝集膜−
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着して形成された複数個の微生物が集合した膜であり、その微生物の構造体は、複数種の微生物から構成されていてもよく、単一種の微生物から構成されていてもよい。更に、微生物同士が直接隣接していてもよく、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して膜を形成していてもよい。更に、前記微生物凝集膜は、前記微生物が前記培養基材上に形成した一層の膜であってもよく、多層の膜であってもよい。また、本発明の微生物凝集膜とは、いわゆるバイオフィルムと呼ばれるものも含まれる。前記バイオフィルムとは、一般に、物質の状態が異なる界面上に形成される微生物から構成されたフィルム状の構造物のことをいい、本発明では、固体と液体、若しくは固体と気体の界面上に形成させるフィルム状の微生物集合体のことをいうものとする。また、本発明での前記微生物凝集膜には、“バイオフィルムの基礎と制御、株式会社エヌ・ティー・エス、2008年2月出版”に記載されているバイオフィルムを含むものとする。
【0051】
前記微生物凝集膜の平均膜厚としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、1μm〜10cmが好ましく、10μm〜1cmがより好ましく、10μm〜0.5cmが特に好ましい。前記平均膜厚が、1μm未満であると、前記微生物凝集膜が十分に形成されていないことがあり、10cmを超えると、後述する計測工程における計測が非効率になることや、ハンドリング時や培養時に希望しない微生物凝集膜の剥離が起こることがある。
前記平均膜厚とは、前記微生物凝集膜における10点以上の厚みの平均をいい、20点以上の平均膜厚であることが好ましく、30点以上の平均膜厚であることがより好ましい。前記平均値をとる点の数は、前記一定面積の大きさが大きくなるほど、多くの点でとることが、精度が高くなる点で好ましい。
前記微生物凝集膜の平均膜厚を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、偏光回析法(エリプソメトリー法)、走査型トンネル顕微鏡(STM)で測定する方法、公知の膜厚測定装置で測定する方法などが挙げられる。
【0052】
<分散工程>
前記分散工程は、前記微生物凝集膜を振動させて分散させる工程である。
ここで、本発明において、前記微生物凝集膜を「分散させる」とは、前記微生物凝集膜中の凝集した細胞を、後述する計測工程で該細胞の数を数えられる程度に分散させることをいう。細胞の数が数えられる程度とは、後述する計測工程における計測方法により、適宜選択できるが、数個の塊程度にバラバラにされることが好ましく、1つ1つの細胞にバラバラにされることが特に好ましい。
【0053】
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着したまま前記培養基材と共に前記分散工程に用いてもよく、前記培養基材上から回収してから前記分散工程に用いてもよい。このとき、前記培養基材の面積が大きい場合は、前記培養基材の一部を分離して分散工程に用いてもよい。
なお、前記培養基材と共に前記分散工程に用いる場合は、前記微生物凝集膜形成工程が、前記第1の培養形態で行われる場合、前記培養容器内で、前記培養基材上に付着していない微生物が混入しないように行う必要がある。
これらの方法は、前記培養基材の種類などに応じて適宜選択することができる。
前記回収する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養基材上から前記微生物凝集膜を剥離できるような薬剤(例えば、酵素など)を用いた化学的処理方法を施すことにより回収する方法、セルスクレーバー等を用いた物理的処理方法により回収する方法などが挙げられる。
【0054】
例えば、前記培養基材がガラスなどの割れやすく比重の重い材質からなる場合は、前記培養基材をそのまま分散工程に用いると、割れた培養基材の破断面により振動に用いる容器は破壊されるなど安全上問題があり、後述する計測工程に影響を及ぼすことがあるため、前記培養基材上から回収する方法を用いることが好ましい。
また、前記培養基材が球状、半球状、不定形である場合は、用いる培養基材の粒径に応じて適宜選択できるが、前記培養基材の数が多い場合は、前記回収する方法は操作が煩雑であり、またその粒径が小さい場合は回収することが困難となる観点から、前記培養基材と共に前記分散工程に用いることが好ましい。更に、前記培養基材上に凹凸がある場合は、前記回収する方法では凹部の微生物を回収することが困難であるため、前記培養基材をそのまま分散工程に用いることが好ましい。
【0055】
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着したまま又は前記回収したものを、そのまま前記分散工程に用いてもよく、培地や水等の溶液で適宜希釈して用いてもよいが、希釈して用いることが、前記微生物の破砕を防止することができ、効率よく分散させることができる点で好ましい。以下、希釈した微生物を含む溶液を「微生物凝集膜希釈液」と称することがある。
前記微生物凝集膜希釈液における前記微生物の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記微生物凝集膜希釈液は、振動を行う前に、ピペッティングなどを行ってもよい。
【0056】
また、前記分散工程において、前記振動により前記微生物凝集膜希釈液を振動させる際に、前記微生物凝集膜希釈液中の前記微生物凝集膜が高濃度の場合や、種々の代謝物を細胞外に放出する微生物の場合には、振動により気泡が発生し、前記微生物凝集膜の分散性が著しく低下することがある。この様な場合には、前記微生物凝集膜希釈液に消泡剤を添加することが好ましい。
前記消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記消泡剤の、前記微生物凝集膜希釈液への添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0057】
前記振動させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズ式細胞破砕装置(例えば、株式会社トミー精工製のMS−100)、ビーズ式ホモジナイザー(例えば、BioSpec Product社のBSP−3110BX)等の市販の装置を用いる方法などが挙げられる。
これらの装置を用いて振動を行う場合は、ビーズを用いないことが好ましいが、前記微生物の種類などに応じて、該微生物の分散性が悪い場合は、適宜ビーズを用いることもできる。
【0058】
前記振動させる条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微生物凝集膜中の微生物を破砕させることなく分散性を向上させる観点から、1分間当たりの振動数と振動時間(分間)とを組み合わせて決めることが好ましい(以下、「合計振動数」と称することがある。)。例えば、次式により合計振動数を算出することができる。
合計振動数(回)=1分間当たりの振動数(回)×振動時間(分間)
本発明において、振動とは、一の位置から他の位置に移動し、前記一の位置に戻ることをいい、例えば、振動が左右方向である場合は、左から右へ移動し左に戻ること、振動が上下方向である場合は、上から下へ移動し上に戻ること、即ち、1往復を1振動とする。なお、振動が回転の場合は、1回転を1振動とし、1分間当たりの振動数はrpmで表すことができる。即ち、振動数と、回転数とは同じことを意味するものとする。
【0059】
前記合計振動数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、160回〜50,000回が好ましく、1,160回〜10,000回がより好ましく、1,200回〜5,500回が更に好ましい。前記合計振動数が、160回未満であると、分散性が低下することがあり、50,000回を超えると、前記微生物が破砕することや、温度が上昇して前記微生物が失活又は死滅することがある。
【0060】
即ち、振動数が高い(例えば、5,000回)場合には、短時間(例えば、5秒間)で振動を行うことが好ましく、このときの合計振動数は417回となる。
反対に、振動数が低い(例えば、3,500回)場合には、振動時間を長時間(例えば、20秒間以上)で振動を行うことが好ましく、このときの合計振動数は1,167回となる。
【0061】
したがって、前記所望の合計振動数を得るためには、前記振動の条件としては、150回〜50,000回で5秒間〜300秒間行うことが好ましく、3,500回〜10,000回で20秒間〜1分間行うことがより好ましく、4,000回〜6,000回で20秒間〜60秒間行うことが更に好ましい。
【0062】
前記分散工程を行う回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微生物凝集膜の温度の上昇を防ぐことができ、前記微生物の失活又は死滅を防ぐことができる点で、複数回行うことが好ましい。
なお、複数回の振動を行う場合は、一回の振動が、前記好ましい合計振動数の範囲内となることが好ましい。
また、複数回振動させる場合の各回の間は、1秒間〜60分間あけることが好ましく、3秒間〜1分間がより好ましい。各回の間が、1秒間未満であると、前記微生物が失活又は死滅することがあり、60分間を超えると、非効率である。前記各回の間は、前記前培養の条件と同様の条件に置くことが好ましい。
【0063】
前記振動の振動形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上下方向、左右方向、前後方向などが挙げられる。これらは、1形態単独で行ってもよく、2形態以上を組み合わせて行ってもよい。これらの中でも、3形態全てを組み合わせて8の字に振動させることが特に好ましい(図4C参照)。
【0064】
なお、前記微生物凝集膜を振動させる場合は、該微生物凝集膜又は微生物凝集膜希釈液を密閉容器に入れて行うことが好ましい。前記密閉容器としては、特に制限はなく、振動に用いる装置の種類などに応じて適宜選択することができる。
【0065】
前記密閉容器の内容積に対する前記微生物凝集膜希釈液の容積比率(微生物凝集膜希釈液の容積/密閉容器の内容積×100%)としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、15容量%〜75容積%が好ましく、20容量%〜60容量%がより好ましい。前記容積比率が、15容量%未満であると、分散性が大幅に低下することがあり、75容量%を超えると、前記微生物凝集膜が十分に振動できず分散性が低下することがある。
【0066】
以下に、図1〜3を用いて、前記分散工程の一形態について説明するが、本発明の微生物細胞数の計測方法における分散工程は、この形態に限られるものではない。
図1の振動装置10は、前記分散工程に用いられる装置の一例の概略図であり、装置本体12と蓋部材14とで構成される。
図2は、装置本体12の内部の一例を示す概略図であり、振動を行う円板状の密閉容器ホルダー16が配置され、駆動軸18を介して振動駆動部20に支持される。密閉容器ホルダー16の周縁部には、蓋22A付き密閉容器22(図3参照)を着脱自在に保持する複数のチャック部24が設けられる。
【0067】
図3に示すように、蓋22A付き密閉容器22は、試験管形状に形成され、微生物27及び前記微生物凝集膜希釈液26中の前記微生物27を除くその他の成分25が充填された後、蓋22Aにより密閉できるように構成されている。
【0068】
図1に示すように、装置本体12の正面には、ON−OFFスイッチ28、密閉容器ホルダー16を介して密閉容器22を振動する際の振動数を設定する振動数ダイヤル30及び振動時間を設定するタイマーダイヤル32が設けられる。更には密閉容器22を振動させる振動方向の形態設定を行う切り換えスイッチ34等が設けられる。
【0069】
図4A〜Cに示すように、微生物凝集膜希釈液26が充填された密閉容器22を振動させる振動形態としては、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも1形態であるが、例えば、図4Aに示すように、上下方向と左右方向との組み合わせ、図4Bに示すように、左右方向と前後方向との組み合わせを採用することが好ましい。また、図4Cに示すように、上下しながら8の字を描くように密閉容器22が振動する特殊な振動形態が特に好ましい。
【0070】
このように、本発明の微生物細胞数の計測方法は、従来のように超音波振動で微生物自体を振動させることがないため、前記微生物を破砕させることがなく、かつ、前記微生物凝集膜中の前記微生物を1つ1つの細胞に分散させることができる。
【0071】
なお、本発明において、「破砕する」とは、前記微生物凝集膜中の全微生物細胞数に対する破砕した微生物細胞数の割合(破砕した微生物細胞数/全微生物細胞数×100%)が、30%未満であることをいい、好ましくは、20%未満であり、より好ましくは10%未満である。
前記微生物が破砕したか否かの確認は、例えば、顕微鏡で観察することにより確認することができる。
【0072】
<計測工程>
前記計測工程は、前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する工程である。
なお、前記計測工程は、例えば、装置などにより前記分散工程と同時に行われてもよい。
【0073】
前記計測する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記分散された微生物を含む溶液を、光学顕微鏡、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の各種顕微鏡で観察して直接計測する方法、血球計数盤上で計測する方法、フローサイトメーターで測定する方法、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておくことにより、吸光光度計で測定した測定値より算出する方法、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておくことにより、濁度計で測定した濁度から算出する方法、予め乾燥重量と細胞数との相関関係を求めておくことにより、該乾燥重量から算出する方法、予め蛍光光度計によってクロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておくことにより、クロロフィルの蛍光量から算出する方法などが挙げられる。
また、前記計測する方法として、光学顕微鏡で撮影した写真からソフトウエアを用いて算出する方法を用いることもできる。従来、前記微生物凝集膜中の1つ1つの微生物を分散させることができなかったため、計測に前記ソフトウエアを用いた場合、個々の微生物の認識能力が人間の目と比較して極めて低く、その精度が悪いことから、使用に耐えるものではなかった。しかし、本発明の微生物細胞数の計測方法によれば、前記微生物凝集膜中微生物を好適に分散させることができるため、画像認識ソフトウエアの認識能力を最大限に生かすことができる。更に、自動で前記微生物の細胞数を計測することができることから、人間が手動で計測するのと比較して、早く簡便に計測でき、人間の手間の省力化ができると共に、用いるソフトウエアの種類によっては、前記微生物の細胞の大きさの分布等の微生物に関する情報も同時に得ることが可能となる点で有利である。
【0074】
<その他の工程>
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物を自然界より採取する場合、前記微生物を自然界から採取後に純化する純化工程、前記計測工程において細胞を計測する前に染色する染色工程などが挙げられる。
【0075】
−純化工程−
自然界から微生物を採取する場合、採取した微生物は多種類の微生物の混合物であることが多い。このような場合に、目的の微生物を単一種の微生物として得るためには、純化工程を行うことが好ましい。
前記純化する方法としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、自然界から採取してきた微生物を寒天ゲル上に展開し、常法で培養して増殖させた後、得られたコロニーを採取し、採取したコロニーが単一種の微生物から構成されているかどうかを確認し、得られたコロニーが複数種の微生物から構成されている場合には、もう一度寒天培地上で展開して、単一種の微生物が得られるまで繰り返す方法などが挙げられる。
また、前記寒天培地に塗布する前に、遠心分離処理や多孔質膜による濾過処理を行ってもよい。例えば、微細藻類とバクテリアとでは大きさが異なるため、前処理工程の後に多孔質膜の使用によって分離したり、遠心により比重差を利用して分離したりすることにより、純化がより簡便にできる点で好ましい。
前記純化工程により、所望の微生物が純化されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、微生物の形態や色を観察する方法などが挙げられる。
【0076】
−染色工程−
前記染色工程としては、前記計測する方法などに応じて適宜選択することができるが、光学顕微鏡などにより目視で計測する際には、予め染色することが、細胞を認識しやすくなる点で好ましい。このような染色に用いる色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリパンブルー等の公知の色素を用いることができる。
また、前記計測する方法が、フローサイトメーターで測定する方法である場合は、公知の蛍光色素で染色する必要がある。
【0077】
<用途>
前記微生物細胞数の計測方法は、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を正確に計測することができ、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができるため、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発に好適に利用可能である。
【実施例】
【0078】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0079】
(実施例1)
<前培養工程>
フネケイソウ(NIES−176、国立環境研究所より入手)を、滅菌したC培地 200mLを入れた500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)で、温度20℃、照度2,000ルクスの条件下で、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS−20RL、株式会社サンキ精機製)を用いて、100rpmにて20日間前培養した。この前培養により増殖したフネケイソウを光学顕微鏡で観察したところ、フネケイソウが培地中で凝集体を形成していることが確認された。
なお、前記C培地は、硝酸カルシウム四水和物 150mg、硝酸カリウム 100mg、β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物 50mg、硫酸マグネシウム七水和物 40mg、ビタミンB12 0.1μg、ビオチン 0.1μg、チアミン塩酸 10μg、トリス 500mgに、以下の組成で調製したPIV metals 3mLを添加し、蒸留水で1Lとして溶解後、pH7.5に調製した。
前記PIV metalsは、塩化鉄六水和物 98mg、塩化マンガン四水和物 18mg、硫酸亜鉛七水和物 11mg、塩化コバルト六水和物 2mg、モリブデン酸ナトリウムニ水和物 1.25mg、EDTAナトリウム二水和物 500mgを水 500mLに溶解した。
【0080】
<採取工程>
前記前培養したフネケイソウの凝集体を含む培養液を0.5mL採取し、2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、フネケイソウの凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の10μLを血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に滴下し、光学顕微鏡下でフネケイソウの数を計測した結果、前培養工程中のフネケイソウの微生物濃度は、5×104個/mLであった。
【0081】
<微生物凝集膜形成工程>
前記採取工程で得られたフネケイソウを、滅菌したC培地で1×103個/mLに調製したものを500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)に200mL入れ、フネケイソウが培地中に均一になるように攪拌した。次いで、この三角フラスコの中に、0.7cm×1.4cmのナイロンフィルムを入れ、前培養と同様の条件で1ヶ月間振盪培養した。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、ナイロンフィルムの両面であり、1.96cm2である。
1ヵ月後、ナイロンフィルムを三角フラスコから取り出し、光学顕微鏡(10倍率)で観察したところ、ナイロンフィルム上にフネケイソウが密集して付着しフネケイソウの凝集膜が形成されていることが観察された。結果を図5に示す。なお、このとき、フネケイソウが高度に凝集していたため、該凝集膜中の細胞数を計測することはできなかった。
【0082】
<分散工程>
フネケイソウが凝集膜を形成したナイロンフィルムを、C培地が0.5mL入った2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、フネケイソウの凝集膜を分散させた凝集膜分散液を得た。
分散工程終了後のナイロンフィルムを光学顕微鏡(10倍率)で観察したところ、ナイロンフィルム上にはフネケイソウはほとんど認められず、この振動処理により効率よくナイロンフィルムからフネケイソウを分離することができた。結果を図6に示す。
【0083】
<計測工程>
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に10μL滴下し、光学顕微鏡(10倍率)下で観察したところ、フネケイソウの凝集膜から個々のフネケイソウの細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図7に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中のフネケイソウの細胞数は、7.7×105個/mLであった。
これより、凝集膜分散液が0.5mLであり、ナイロンフィルムの面積は、1.96cm2であったことから、該ナイロンフィルムにおけるフネケイソウの付着量は、表裏を考慮すると1.96×105個/cm2であった。
【0084】
(実施例2)
<前培養工程>
自然海水から採取した珪藻を人工海水(マリンアート スーパーフォーミュラ SF−1、冨田製薬株式会社製)を38g/L含むIMK培地(ダイゴIMK培地、日本製薬株式会社)のアガロースゲル上で培養し、得られたコロニーをピックアップした。これを、光学顕微鏡で観察したところ、珪藻以外の微生物が混入してないことが確認でき、珪藻を純化することができた。なお、顕微鏡観察により、微生物の形態、及び着色が茶色であることを観察することにより、珪藻であると判断した。
【0085】
純化した珪藻を、前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地200mLを入れた500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)で、20℃、照度2,000ルクスの条件下で、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS−20RL、株式会社サンキ精機製)を用いて、100rpmにて20日間前培養した。この前培養により増殖した珪藻を光学顕微鏡で観察したところ、珪藻が培地中で凝集体を形成していることが確認された。
【0086】
<採取工程>
前記前培養後、珪藻を含む三角フラスコを0.5時間静置しながら放置することにより、珪藻の比重が前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地よりも重いことを利用して珪藻を自然沈降させた。次いで、三角フラスコ底部に自然沈降した珪藻を、ピペットを用いて2mL吸い取り、この全量を5mL容のホモジナイズ用チューブ(TM−655S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該チューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数4,200回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させた。なお、振幅操作は3回行い、振幅操作間の間に1分間の非振動時間を入れた。この振動を、同様の操作で3回行うことにより、珪藻の凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の10μLを血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に滴下し、光学顕微鏡下で珪藻の数を計測した結果、2.35×107個/mLであった。
【0087】
<微生物凝集膜形成工程>
前記採取工程で得られた珪藻を、前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地で2×104個/mLに調製したものを100mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)に20mLに入れ、珪藻が培地中に均一になるように攪拌した。10cmのプラスチック製シャーレ(アズノール滅菌シャーレ、アズワン株式会社製)の内部に、7.6cm×2.6cmのスライドグラス(白スライドグラス、アズワン株式会社製)を置き、前記調製した珪藻を20mL添加し、温度23℃、照度2,000ルクスの条件下で、10日間静置培養を行った。なお、珪藻の凝集膜を形成させたスライドグラスは40枚作製した。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、スライドグラスの片面であり、19.76cm2であった。
【0088】
<分散工程>
10日間培養後、2枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地中に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻を、セルスクレーバーを用いて剥離し、7mLの前記滅菌した人工海水を38g/L含むIMK培地に入れた。次いで、1mLのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を10回ピペッティングした。ピペッティング後、光学顕微鏡で観察したところ、珪藻の凝集膜のほとんどは分散されておらず、凝集の形態をとったままであった。
この珪藻の凝集膜を含む培地を0.5mL用いての2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、珪藻の凝集膜を分散させた実施例2の凝集膜分散液を得た。
【0089】
<計測工程>
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に10μL滴下し、光学顕微鏡(10倍率)下で観察したところ、珪藻の凝集膜から個々の珪藻の細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図8に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中の珪藻の細胞数は、2枚のスライドグラスの平均値で、1.2×106個/cm2であった。
【0090】
(実施例3)
実施例2において、分散工程を以下の分散方法に変えたこと以外は、実施例2と同様の方法で微生物細胞数の計測を行った。
【0091】
実施例2の微生物凝集膜形成工程において、10日間培養後、2枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻を、セルスクレーバーを用いて剥離し、7mLの前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に入れた。次いで、1mLのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を10回ピペッティングした後、0.5mLの珪藻の凝集膜を含む培地を2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、更に直径 0.5mmのジルコニアビーズを約0.1mL入れ、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、珪藻の凝集膜を分散させた実施例3の凝集膜分散液を得た。
【0092】
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤を用いて、光学顕微鏡(10倍率)下で観察し、細胞数の計測を行った。観察した結果を図9A及び図9Bに示す。珪藻の細胞が破砕しているものがいくつか認められたが、破砕した細胞と、生細胞とを観察により区別することができるため、生細胞を計測することができた。
即ち、凝集膜分散液中の珪藻の細胞数は、2枚のスライドグラスの平均値で、1.0×106個/cm2であった。
【0093】
(実施例4)
<前培養工程>
ボトリオコッカス(NIES−2199、国立環境研究所より入手)を、滅菌した2×CHU13培地 200mLを入れた500mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)で、温度20℃、照度2,000ルクスの条件下で、振盪培養機(Incubator Shaker Model RGS−20RL、株式会社サンキ精機製)を用いて、100rpmにて20日間前培養した。この前培養により増殖したボトリオコッカスを光学顕微鏡で観察したところ、ボトリオコッカスが培地中で凝集体を形成していることが確認された。
なお、2×CHU13培地の組成は、K. Yamaguchi et al., Agric. Biol. Chem., 51 (2), 493−498, 1987を参照し、以下の組成とした。即ち、2×CHU13培地は、硝酸カリウム 400 mg、リン酸水素二カリウム 80mg、硫酸マグネシウム七水和物 200mg、塩化カルシウム二水和物 107mg、クエン酸鉄 20mg、クエン酸 100mg、塩化コバルト 0.02mg、ホウ酸 5.72mg、塩化マンガン四水和物 3.62mg、硫酸亜鉛七水和物 0.44mg、硫酸銅五水和物 0.16mg、モリブデン酸ナトリウム 0.084mgを蒸留水 1Lに溶解し、0.072N 硫酸によりpH7.5に調製した。
【0094】
<採取工程>
前記前培養後、ボトリオコッカスを含む三角フラスコを1時間静置しながら放置することにより、ボトリオコッカスを自然沈降させた。次いで、三角フラスコ底部に自然沈降したボトリオコッカスを、ピペットを用いて2mL吸い取り、5mL容のホモジナイズ用チューブ(TM−655S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、該チューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置(Micro Smash MS−100、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させて、ボトリオコッカスの凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の10μLを血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に滴下し、光学顕微鏡下で珪藻の数を計測した結果、2.0×106個/mLであった。
【0095】
<微生物凝集膜形成工程>
前記採取工程で得られたボトリオコッカスを、滅菌した2×CHU13培地で2×106個/mLに調製したものを100mL容のガラス製三角フラスコ(6−017−05、アズワン株式会製)に20mLに入れ、ボトリオコッカスが培地中に均一になるように攪拌した。消毒用エタノールに30分間浸漬後、クリーンベンチ内で乾燥させた、直径1cmのポリスチレンフィルムを、24穴プレート(微生物培養プレート、アズワン株式会社製)の内部に置き、前記調製したボトリオコッカスを2mL/ウエル添加し、温度23℃、照度2,000ルクスの条件下で、7日間静置培養を行った。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、ポリスチレンフィルムの片面であり、0.79cm2である。
培養後のボトリオコッカスが付着したポリスチレンフィルムの様子を光学顕微鏡(40倍)で観察した結果を図10に示す。なお、このとき、ボトリオコッカスが高度の凝集しているため、該凝集膜中の細胞数を計測することはできなかった。
【0096】
<分散工程>
7日間培養後、24穴プレートからポリスチレンフィルムを取り出し、滅菌済みの2×CHU13培地に浸漬して洗浄することで、ポリスチレンフィルムに非付着のボトリオコッカスを洗浄除去した。次いで、ポリスチレンフィルムを2×CHU13培地が2mL入ったホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−655S滅菌付、株式会社トミー精工製)にセットし、1分間当たりの振動数5,500回にて20秒間、図4Cの振動形態で振動させ、ボトリオコッカスの凝集膜を分散させた実施例4の凝集膜分散液を得た。
【0097】
<計測工程>
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤(カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製)上に10μL滴下し、光学顕微鏡(10倍率)下で観察したところ、ボトリオコッカスの凝集膜から個々のボトリオコッカスの細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図11に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中のボトリオコッカスの細胞数は、10.6×106個/cm2であった。
【0098】
(比較例1)
実施例2において、分散工程を以下の分散方法に変えたこと以外は、実施例2と同様の方法で微生物細胞数の計測を行った。
【0099】
実施例2の微生物凝集膜形成工程において、10日間培養後、2枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻をセルスクレーバーを用いて剥離し、7mLの前記滅菌した人工海水38g/Lを含むIMK培地に入れた。次いで、1mLのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を10回ピペッティングした後、0.5mLの珪藻の凝集膜を含む培地を2mL容のホモジナイズ用マイクロチューブ(TM−626S滅菌付、株式会社トミー精工製)に入れ、超音波洗浄機(USD−4R、アズワン株式会社)にセットした。次いで、珪藻の凝集膜を含む培地に対して28kHzで5分間超音波を印加し、珪藻の凝集膜を分散させた比較例1の凝集膜分散液を得た。
【0100】
得られた凝集膜分散液を光学顕微鏡(10倍率)で観察した結果を図12A及び図12Bに示す。その結果、珪藻の細胞が破砕しているものが多く認められ、細胞数を計測することができなかった。
【0101】
実施例1〜4及び比較例1の計測工程で凝集膜分散液を光学顕微鏡にて観察し、分散性を下記評価基準に基づいて評価した。また、破砕した微生物細胞の割合を下記式により算出し、細胞破砕を下記評価基準に基づいて評価した。実施例1〜4及び比較例1、並びに試験例1の結果をまとめて表1に示す。
破砕した微生物細胞の割合(%)=破砕した微生物細胞数/全微生物細胞数×100%
[分散性の評価基準]
○ : 個々の分散されており顕微鏡にて容易に計測できる
△ : 数個細胞からなる塊が存在するものの計測できる
× : 微生物細胞が大きく凝集しており計測できない
[細胞破砕の評価]
◎ : 破砕した細胞が10%未満
○ : 破砕した細胞が20%未満
△ : 破砕した細胞が30%未満
× : 破砕した細胞が30%以上
【0102】
【表1】
【0103】
(試験例1)
実施例2及び3で計測工程に使用しなかった38枚のスライドグラスから、実施例2及び3の分散工程と同様の方法で珪藻を分散させた凝集膜分散液を得た。次いで、実施例2及び3と同様の方法で、スライドグラス38枚の珪藻の細胞数をそれぞれ数えた。その結果、スライドグラス38枚の合計の珪藻の細胞数は、9×108個であった。
また、実施例4と同様にプラスチック製シャーレ(アズノール滅菌シャーレ、アズワン株式会社製)にポリスチレンフィルム(直径8cm)を入れた容器を12枚作成し、実施例4と同様の方法でボトリオコッカスからなる微生物凝集膜を作製した。実施例4と同様の方法で、ポリスチレンフィルムを2枚のボトリオコッカスの細胞数をそれぞれ数えた。その結果、ポリスチレンフィルムを10枚の合計のボトリオコッカスの細胞数は、6.23×109個であった。
【0104】
上記得られた珪藻(実施例1及び2)を、卓上遠心機(チビタンR、アズワン株式会社製)を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、珪藻からなる沈殿に、1/10濃度の人工海水(マリンアート スーパーフォーミュラ SF−1、冨田製薬株式会社製)を38g/L含むIMK培地(ダイゴIMK培地、日本製薬株式会社)を1mL添加し、卓上攪拌機(ボルテックスミキサー、アズワン株式会社製)を用いて1分間の攪拌処理を行った。これを、卓上遠心機を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離しすることにより、珪藻の細胞表面を洗浄した。この洗浄は2回行った。次いで、マイクロチューブを100℃のオーブン中で加熱することで溶媒を除去し、乾燥珪藻の藻体を得た。乾燥珪藻の藻体の質量は、空のマイクロチューブの重さとの差を測定することで得た。
【0105】
上記得られたボトリオコッカス(実施例4)は、前記珪藻の処理において、珪藻をボトリオコッカスに代え、人工海水を38g/L含むIMK培地を2×CHU13培地に代えたこと以外は、前記珪藻の処理と同様の方法により乾燥ボトリオコッカスの藻体の質量を測定した。
【0106】
次に、乾燥珪藻又は乾燥ボトリオコッカスの藻体を15mLの遠沈管に移し、そこへ2mLの5質量%塩酸−メタノール溶液を添加し、100℃で1時間反応を行った。この反応液にヘキサン1.5mL及び水0.5mLを添加した後、卓上遠心機を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離した。上清を分取し、純水1mLを加え、よく攪拌した後、卓上遠心機を用いて6,200rpm(2,000G)で1分間遠心分離した。上層のヘキサン層を分取し、溶媒をエバポレーションにより除去した後、予め質量を測定しておいた空の遠沈管の質量との差から、珪藻又はボトリオコッカスが細胞内に産生したオイル含有量を測定した。結果を表2に示す。
【0107】
【表2】
【0108】
表1の結果より、前記微生物細胞数の計測方法は、微生物凝集膜中の微生物を破砕させることなく簡便な操作で分散させることができ、正確に細胞数を計測することができることがわかった。また、これにより微生物が産生するバイオマスを、細胞1個あたりの量として測定することができることもわかった。これより、前記微生物細胞数の計測方法によれば、例えば、微生物から産生されたバイオマス量が増加した場合、その増加が、微生物の細胞数が増えたことによるものなのか、あるいは、微生物の1細胞から産生されるバイオマス量が増加したのかをモニターすることができる。したがって、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発などに好適に利用可能である。
【0109】
本実施例の微生物細胞数の計測方法により、微細藻類が産生するバイオマスについて、細胞1個あたりの産生量を正確に、かつ簡便に測定できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0110】
本発明の微生物細胞数の計測方法は、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を正確に計測することができ、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができるため、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発に好適に利用可能である。
【符号の説明】
【0111】
10 振動装置
12 装置本体
14 蓋部材
16 密閉容器ホルダー
18 駆動軸
20 振動駆動部
22 密閉容器
22A 蓋
24 チャック部
25 その他の成分
26 微生物凝集膜希釈液
27 微生物
28 ON−OFFスイッチ
30 振動数ダイヤル
32 タイマーダイヤル
34 切り換えスイッチ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法であって、
前記微生物を前培養する前培養工程と、
前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、
前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程と、
前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、
前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程と、
を含むことを特徴とする、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項2】
分散工程における振動の回数が、次式で表される合計振動数で1,160回〜10,000回である請求項1に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
合計振動数(回)=1分間当たりの振動数(回)×振動時間(分間)
【請求項3】
分散工程における振動の振動形態が、上下方向、左右方向、及び前後方向の少なくとも1形態である請求項1から2のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項4】
分散工程が、容器に充填した微生物凝集膜を振動させる工程であり、該容器の内容積に対する前記微生物凝集膜の容積比率が15容量%〜75容積%である請求項1から3のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項5】
分散工程が、微生物凝集膜に消泡剤を添加して行われる請求項1から4のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項6】
分散工程が、複数回行われる請求項1から5のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項7】
微生物が微細藻類である請求項1から6のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項8】
微生物がバイオマスを産生する微生物である請求項1から7のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項9】
バイオマスを産生する微生物が、珪藻類、黄緑藻類、及び緑藻類の少なくともいずれかである請求項8に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項1】
微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法であって、
前記微生物を前培養する前培養工程と、
前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、
前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程と、
前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、
前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程と、
を含むことを特徴とする、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項2】
分散工程における振動の回数が、次式で表される合計振動数で1,160回〜10,000回である請求項1に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
合計振動数(回)=1分間当たりの振動数(回)×振動時間(分間)
【請求項3】
分散工程における振動の振動形態が、上下方向、左右方向、及び前後方向の少なくとも1形態である請求項1から2のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項4】
分散工程が、容器に充填した微生物凝集膜を振動させる工程であり、該容器の内容積に対する前記微生物凝集膜の容積比率が15容量%〜75容積%である請求項1から3のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項5】
分散工程が、微生物凝集膜に消泡剤を添加して行われる請求項1から4のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項6】
分散工程が、複数回行われる請求項1から5のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項7】
微生物が微細藻類である請求項1から6のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項8】
微生物がバイオマスを産生する微生物である請求項1から7のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項9】
バイオマスを産生する微生物が、珪藻類、黄緑藻類、及び緑藻類の少なくともいずれかである請求項8に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【公開番号】特開2011−211972(P2011−211972A)
【公開日】平成23年10月27日(2011.10.27)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−83760(P2010−83760)
【出願日】平成22年3月31日(2010.3.31)
【出願人】(306037311)富士フイルム株式会社 (25,513)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成23年10月27日(2011.10.27)
【国際特許分類】
【出願日】平成22年3月31日(2010.3.31)
【出願人】(306037311)富士フイルム株式会社 (25,513)
【Fターム(参考)】
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