微生物検出方法
【課題】迅速かつ高感度に微生物を検出することができる微生物検出方法を提供する。
【解決手段】微生物を検出する方法は、上記液溜め部の中の少なくとも一種の微生物を含む液体を、メンブレンフィルタ１３０の下方から除去して、メンブレンフィルタ１３０上に微生物を濃縮する工程と、生理活性物質を含む液体培地を液溜め部に導入し、液体培地中に浮遊している微生物を培養する工程と、メンブレンフィルタ１３０の下方から液体培地を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に前記微生物を捕集する工程と、微生物の生死を判別する試薬を液溜め部に導入る工程と、チップ（センサーチップ１００）内の微生物を観察する工程と、を含む。
【解決手段】微生物を検出する方法は、上記液溜め部の中の少なくとも一種の微生物を含む液体を、メンブレンフィルタ１３０の下方から除去して、メンブレンフィルタ１３０上に微生物を濃縮する工程と、生理活性物質を含む液体培地を液溜め部に導入し、液体培地中に浮遊している微生物を培養する工程と、メンブレンフィルタ１３０の下方から液体培地を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に前記微生物を捕集する工程と、微生物の生死を判別する試薬を液溜め部に導入る工程と、チップ（センサーチップ１００）内の微生物を観察する工程と、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を検出する方法として、一般的に培養方法が用いられる。この培養方法では、たとえば２４時間培養を行うため、非常に時間がかかることが知られている。
【０００３】
特許文献１には、微生物を個別に検出する点が改善された微生物検出方法が記載されている。同文献によれば、微生物を検出表面上に結合させた状態で、当該微生物の増殖を行っている。これにより、微生物を個別に検出することができると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５２３８２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のように、上記文献記載の従来技術は、微生物を検出するまでに時間がかかっていた。そのため、迅速に、微生物を検出する方法が望まれている。
【０００６】
また、特許文献１のように、微生物の一部をある表面上に結合させた状態で培養すると、培養液と微生物とが接触してない部分があるので、培養速度が遅くなることがあった。さらに、表面近傍では液体中の組成濃度にバラツキが生じるため、たとえば、抗菌剤を添加した場合の微生物の増殖の結果については、再現性よく得ることが困難であった。加えて、振盪機構を備えていないため、菌種によっては培養が困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、
少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を溜める液溜め部と、
前記液溜め部の下面に設けられた開口部と、
前記開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタと、を有する検出部を備えるチップを準備し、
前記液溜め部の中の前記被検用の液体を、前記メンブレンフィルタの下方から除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を濃縮する工程と、
生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養する工程と、
前記メンブレンフィルタの下方から前記液体培地を除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を捕集する工程と、
前記微生物の生死を判別する試薬を前記液溜め部に導入する工程と、
前記チップ内の前記微生物を観察する工程と、を含む、微生物検出方法が提供される。
ただし、この工程は状況により順番が変更される場合もある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、迅速かつ高感度に微生物を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施の形態の微生物を検出する方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の実施の形態の薬剤感受性の検出方法を示す工程断面図である。
【図３】本発明の実施の形態の薬剤感受性の検出方法を示す工程断面図である。
【図４】本発明の実施の形態のセンサーチップを模式的に示す上面図である。
【図５】本発明の実施の形態のセンサーチップのＡ−Ａの模式断面図である。
【図６】本発明の実施の形態のセンサーチップのＢ−Ｂの模式断面図である。
【図７】本発明の実施の形態の濃縮装置を示す模式断面図である。
【図８】本発明の実施の形態の吸引機構を示す模式断面図である。
【図９】本発明の実施の形態の検出装置を示す模式断面図である。
【図１０】大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１１】抗生物質を添加した場合の大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１２】添加した抗生物質の濃度を比較したときの大腸菌の生菌数比を示す図である。
【図１３】大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１４】抗生物質を添加した場合の大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１５】抗生物質の添加の有無を比較したときの大腸菌の生菌数比を示す図である。
【図１６】検出部の蛍光観察の結果を示す図である。
【図１７】従来の方法（希釈法）によりＭＩＣを測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１１】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の実施の形態の微生物を検出する方法を示すフローチャートである。図５は、本実施の形態に係るセンサーチップ１００を示す模式断面図である。
本実施の形態の微生物を検出する方法は、まず、少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を溜める液溜め部と、液溜め部の下面に設けられた開口部と、前記開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタ１３０と、を有する検出部１４０を備えるチップ(センサーチップ１００)を準備する。そして、このチップ上で示す一連の工程を実施する。
また、本実施の形態の微生物を検出する方法は、以下の工程を含む。
工程（１）上記液溜め部の中の少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を、メンブレンフィルタ１３０の下方から除去して、メンブレンフィルタ１３０上に微生物を濃縮する工程（Ｓ１００、Ｓ１０２）。
工程（２）生理活性物質を含む液体培地を液溜め部に導入し、液体培地中に浮遊している微生物を培養する工程（Ｓ１０４）。
工程（３）メンブレンフィルタ１３０の下方から液体培地を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に培養後の微生物を捕集する工程（Ｓ１０６）。
工程（４）微生物の生死を判別する試薬を液溜め部に導入る工程（Ｓ１０８）。
工程（５）チップ（センサーチップ１００）内の微生物を観察する工程（Ｓ１１０）。
【００１２】
本実施の形態の微生物を検出する方法の概要について説明する。
本実施の形態の微生物を検出する方法においては、本方法の一連の工程を、センサーチップ１００上、特に検出部１４０で実施することができる（Ｓ１００からＳ１１０）。このため、本発明によれば、迅速に微生物を検出することができる。そして、本発明によれば、全体の検出時間を短縮することができる。
また、本実施の形態において、生理活性物質を含む液体培地中で微生物を培養する検出部１４０を、検出対象の検出部１４０とし、一方、生理活性物質を含まない液体培地中で微生物を培養する検出部１４０を、参照対象の検出部１４０とする。このとき、検出対象においては、生理活性物質の作用が強まり、一方、参照対象においては、微生物の増殖速度が早くなる。さらに、振盪培養を行うことで、このような効果を高めることができる。このため、本発明においては、検出対象と参照対象との生菌数比の違いが明瞭となり、高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。また、培養後、微生物を極めて微小な領域に捕集して微生物を蛍光観察し、計数するため、微生物の非常に大きな集団であるコロニーを観察する培養法や、試料の濁度を検出する従来法と比べて、極めて微量な微生物数の変化を検出することができる。このように、本発明においては、高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。
【００１３】
本実施の形態においては、生理活性物質としては、たとえば、抗生物質を用いることができる。また、微生物の生死を判別する試薬としては、たとえば、市販の蛍光染色試薬を用いることができる。抗生物質を用いた場合には、検出対象菌の薬剤感受性を調べることができる。ここで、本実施の形態において、微生物としては、細菌や菌類等が挙げられる。
【００１４】
次に、本実施の形態の微生物検出方法に用いる微生物検出システムについて説明する。
本実施の形態においては、一連の本工程をセンサーチップ１００上で実施するために、送液機構、吸引機構、振盪機構、恒温機構、洗浄機構、移動機構および検出機構を備える微生物検出システムを用いることができる。たとえば、本実施の形態では、図７および図９に示す濃縮装置１６０および検出装置１９０を含む微生物検出システムを使用する。
各工程に応じて、センサーチップ１００をセットした状態で、濃縮装置１６０および検出装置１９０を使用する。これにより、センサーチップ１００上で迅速に微生物を検出することができる。
【００１５】
まず、微生物検出システムの前提として、本実施の形態に係るセンサーチップ１００について説明する。
図４は、本実施の形態に係るセンサーチップ１００を示す。図５は、図４中のセンサーチップ１００のＡ−Ａの断面図を示す。図６は、図４中のセンサーチップ１００のＢ−Ｂの断面図を示す。
【００１６】
センサーチップ１００は、少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体（試料）を溜める液溜め部と、液溜め部の下面に設けられた開口部と、開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタ１３０と、を有する、検出部１４０を備えるチップ(センサーチップ１００)を準備する。１つのセンサーチップ１００には、複数の検出部１４０がアレイ状に配置されている。検出部１４０の数としては、特に限定されない。複数の検出部１４０が設けられているセンサーチップアレイを用いることにより、同一工程で、複数種類の抗生物質や複数の菌種について感受性を検出することができる。
【００１７】
センサーチップ１００は、たとえば樹脂製とすることができる。センサーチップ１００は、たとえばレーザ成形、射出成形等により得られる。センサーチップ１００平面方向の検出部１４０の形状は、特に限定されないが、たとえば円とすることができる。また、センサーチップ１００平面方向に対して垂直方向の検出部１４０の断面形状は、特に限定されないが、少なくとも一部がテーパ状とすることができる。検出部１４０の径(有効フィルタ径)は、特に限定されないが、たとえば０．１ｍｍ以上、５ｍｍ以下（通常のフィルタ径よりはるかに小さいため微小領域に微生物を捕集する）とすることができる。また、検出部１４０の高さは、蛍光観察時における、対物レンズの焦点距離の観点から決定する。
【００１８】
また、メンブレンフィルタ１３０の孔径は、特に限定されないが、たとえば０．１μｍ以上、１μｍ以下とする。さらに、メンブレンフィルタ１３０は、チタンなどの金属がコーティングされていてもよい。または、酸化アルミニウム製のフィルタを用いてもよい。これにより、メンブレンフィルタ１３０の自己発光を抑えて、検知の際のノイズを低減させることができる。
【００１９】
また、図５に示すように、センサーチップ１００は、液溜め用の筒部材（液溜め部）が設けられた上板１１０と、孔が設けられた下板１２０とを備える。メンブレンフィルタ１３０が間に挟まれるように、上板１１０と下板１２０とが接合されている。接合手段としては、たとえば、上板１１０の上面と下板１２０の下面とをクランプするクランプ手段、上板１１０と下板１２０とをネジ止めする手段等を用いることができる。または、射出成型したプラスチックを、溶剤で接着することもできる。その他、接合手段として、接着剤や超音波接合なども挙げられる。
【００２０】
ここで、クランプ手段の一例としては、図６に示すように、チップ台１５０内壁に溝部を設け、この溝部に、上板１１０および下板１２０の端部を挿入する。これにより、端部がクランプされ、上板１１０と下板１２０とが接合される。そのため、センサーチップ１００は、一体となった状態でチップ台１５０に載置されることになる。さらに、図６に示すように、センサーチップ１００平面方向に対して垂直方向から見たとき、上板１１０の開口部（筒部材の内孔）、メンブレンフィルタ１３０、下板１２０の孔およびチップ台１５０の開口部１５２が重なるように、配置されている。
【００２１】
次に、本実施の形態に係る濃縮装置１６０について説明する。図７(ａ)は、濃縮装置１６０を模式的に示す。図７(ｂ)は、図７(ａ)に示す濃縮装置１６０の一部を模式的に示す。図８は、吸引機構の一部を模式的に示す。
図７(ａ)に示すように、濃縮装置１６０は、培養機構１６４および吸引機構１６２を備える。培養機構１６４は、ヒータ１８０、フィン１７８、不図示の温度センサおよび振盪器１８２を備える。また、吸引機構１６２は、真空ポンプ１６６、廃液タンク１６８、送液ポンプ１７２、洗浄液タンク１７０、送液用チューブ１８４および廃液用チューブ１８６を備える。さらに、濃縮装置１６０は、培養液タンク１７４および蛍光試料タンク１７６を備えていてもよい。このような濃縮装置１６０は、１つの筐体中に設けられている。また、図７(ａ)に示すように、筐体中において、培養機構１６４と吸引機構１６２との間に、仕切り板２０８が設けられている。本実施の形態では、この仕切り板２０８上に培養機構１６４が設けられているが、この態様に限定されない。
【００２２】
図７(ａ)に示す吸引機構１６２においては、センサーチップ１００の液溜め部に導入された、試料、液体培地または蛍光試薬等の液体を、真空ポンプ１６６が吸引する。これらの液体は、不図示のポンプ等を用いて、洗浄液タンク１７０、培養液タンク１７４または蛍光試料タンク１７６等から検出部１４０に導入される。たとえば、送液ポンプ１７２は、洗浄液タンク１７０の中の洗浄液について送液用チューブ１８４を介して、液溜め部に導入する。洗浄液としては、たとえば生理食塩水やリン酸緩衝液などが挙げられる。この場合、送液用チューブ１８４に対して、振盪器１８２上のセンサーチップ１００の位置が移動する。これにより、送液用チューブ１８４は、複数の検出部１４０中に液体を導入する。また、液体はピペット等により、上記液体を液溜め部に導入されてもよい。
吸引された液体は、液溜め部中からメンブレンフィルタ１３０を通過して、チップ台１５０の開口部１５２から廃液用チューブ１８６を介して、廃液タンク１６８に排除される。
このようにして、溜め部の中の液体を、メンブレンフィルタ１３０の下方から吸引除去して、メンブレンフィルタ１３０上に培養された微生物を残すことができる。
【００２３】
また、吸引機構１６２は、図８に示すように、検出部１４０の下方に設けられ、液体を吸引する吸引プラグ１８８を備える。吸引機構１６２中の不図示の第１の制御部により、吸引プラグ１８８の圧力が制御されている。制御部は、吸引プラグ１８８の圧力を検出し、検出値に応じて、吸引プラグ１８８の圧力値をフィードバック補正する。このとき、図８（ａ）に示す例では、検出部１４０のそれぞれに吸引プラグ１８８が設けられている。吸引プラグ１８８は、互いに分離により検出部１４０中の液体を真空ポンプ１６６により個々に吸引する。また、図８（ｂ）に示す例では、複数の検出部１４０に対して１つの吸引プラグ１８８が設けられている。吸引プラグ１８８は、複数の検出部１４０中の液体を真空ポンプ１６６により同時に吸引する。または、スライド機構を用いてチップを移動させ各々の検出部について順次吸引する。
【００２４】
培養機構１６４においては、ヒータ１８０とフィン１７８とにより、培養温度を調節する。このとき、フィン１７８を用いない場合には、ヒータ１８０のオンオフのみで温度調節をすることができる。培養温度は、不図示の温度センサで測定しつつ、微生物の種類、抗生物質の種類等に応じて調節する。培養温度としては、たとえば、室温(２５℃程度)から４５℃程度とすることができる。ここで、培養機構１６４の制御温度は、たとえば室温(２５℃程度)から６０℃程度とすることができる。また、振盪器１８２は、センサーチップ１００が載置されているチップ台１５０を振盪する。たとえば、偏心モータによりチップ台１５０を振盪する。これらにより、センサーチップ１００の検出部１４０中の微生物を、恒温の条件下、液体培地中で振盪培養することができる。
このとき、図７(ｂ)に示す濃縮装置１６０において、開閉自在のカバー２１０および仕切り板２０８から構成される内部空間(密閉空間)中にセンサーチップ１００が設けられている。カバー２１０が開放すると、センサーチップ１００の上方が露出する。このため、センサーチップ１００の操作性が向上する。つまり、簡便かつ効率良く、センサーチップ１００の移動、センサーチップ１００の振盪、センサーチップ１００への液体の導入等を実施することができる。
【００２５】
このように、濃縮装置１６０は、センサーチップ１００上で微生物の濃縮、培養、洗浄、蛍光染色を実行する。つまり、濃縮装置１６０は、まず、検出部１４０のメンブレンフィルタ１３０上に微生物を濃縮し、続いて、この微生物を液体培地中で培養してメンブレンフィルタ１３０上に捕捉し、この後、微生物について洗浄および蛍光染色を実行する。
【００２６】
次に、本発明の実施の形態に係る検出装置１９０について説明する。図９は、検出装置１９０を模式的に示す。
検出装置１９０は、濃縮装置１６０により蛍光染色されたセンサーチップ１００上の検出部１４０中の微生物を蛍光観察する。また、検出装置１９０には、特に限定されず、たとえば汎用の蛍光顕微鏡を用いることができる。
検出装置１９０は、移動ステージ１９２、励起用光源１９４、励起光用光学フィルタ１９５（光源が多くの波長を含む白色光源である場合などは、励起フィルタを用いる必要がある）、対物レンズ１９６、ダイクロイックミラー１９８、放射光吸収光学フィルタ２００、結像レンズ２０２、検知機構２０４、ＰＣ２０６を備える。
移動ステージ１９２は、センサーチップ１００が載置されたチップ台１５０をＸ軸方向、Ｙ軸方向およびＺ軸方向（三次元方向）に自在に移動させることができる。これにより、対物レンズ１９６に対して、センサーチップ１００上の検出部１４０の位置および高さを調節する。
【００２７】
また、図９に示す検出装置１９０においては、励起用光源１９４は励起光を照射する。ダイクロイックミラー１９８は励起用光源１９４から照射された励起光を分光させる。対物レンズ１９６はこの分光した励起光を集光させる。続いて、集光した励起光がセンサーチップ１００上の検出部１４０に照射すると、微生物などが蛍光を発光する。そして、光学フィルタ２００は当該蛍光を上記対物レンズ１９６とダイクロイックミラー１９８とを経由して透過させる。結像レンズ２０２はこの透過した蛍光の光束を結像させる。検知機構２０４により、この結像が電子データに変換される。励起用光源１９４としては、ＬＥＤ等（その他レーザー）を用いることができる。また、検知機構２０４としては、ＣＣＤカメラ（電荷結合素子（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ））等（その他ＣＭＯＳ）を用いる。これにより、ＣＣＤカメラに接続したＰＣ２０６を用いた画像解析もすることができる。また、各検出部１４０中の微生物の生菌の発光を示す画像データが得られる。また、検知機構２０４として、ＣＣＤカメラに代えて、接眼レンズを用いてもよい。これにより、目視による観察を行うことができる。
【００２８】
次に、微生物検出システムを用いた本実施の形態の各工程について、以下説明する。
図２および図３は、本発明の実施形態の薬剤感受性の検出方法の手順を示す。
図２は、参照対象（ネガティブコントロール）の検出部１４０（第１の検出部）を表し、図３は、検出対象の検出部１４０（第２の検出部）を表す。また、図２では、抗生物質を含まない液体培地３１０を用い、一方、図３では、抗生物質を含む液体培地３２０を用いている。
【００２９】
［工程（１）］
まず、センサーチップ１００を用い、参照対象および検出対象の検出部１４０中の液溜め部に、試料３００（微生物を含む被検用の液体）を分けて導入する（Ｓ１００、図２（ａ）、図３（ａ））。
本工程では、参照対象と検出対象には、被検用の液体として、同じ試料３００を用いる。そのため、参照対象および検出対象の試料３００中の微生物の初期濃度はほぼ同一となる。また、前提として、試料３００は、後述の工程で添加する抗生物質により殺菌される、あるいは細菌の増殖が阻害される、対象菌３４０（微生物）を含むものとする。
【００３０】
試料３００は、あらゆる場所から採取してきた微生物を溶媒に拡散して得られる。採取場所は、たとえば、水、飲料、食品、畜産動物、植物、ベット等の生活環境、血液、皮膚、唾液、痰、創傷、胃内容物、尿または糞便等の人体等を挙げることができる。溶媒は、たとえば、生理食塩水やリン酸緩衝液等を用いることができる。また、試料３００には、通常の培養方法により、あらかじめ培養しておいた微生物を用いてもよい。
【００３１】
試料３００の微生物の初期濃度は、非常に低濃度でよい。例えば、初期濃度を、１個／ｍｌ以上程度から、１０Ｅ５個／ｍｌ以下程度とすることができる。
【００３２】
続いて、検出部１４０中の試料３００を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０を残す（Ｓ１０２、図２（ｂ）、図３（ｂ））。これにより、対象菌３４０の液体中の濃度が濃縮される。このとき、図７に示す吸引機構１６２を用いて、検出部１４０の下方から試料３００中の液体を吸引する。
【００３３】
［工程（２）］
続いて、参照対象の検出部１４０中に液体培地３１０を導入し、検出対象の検出部１４０中に抗生物質を含む液体培地３２０を導入する。そして、図７に示す培養機構１６４を用いて、各センサーチップ１００を振盪器１８２で振盪させ、各検出部１４０中の対象菌３４０を振盪培養する（Ｓ１０４、図２（ｃ）、図３（ｃ））。
このように、本培養工程では、検出部１４０中に導入された際に発生する液体培地の対流等の作用により、メンブレンフィルタ１３０上から離れ、液体培地中に微生物が浮遊する。本培養工程中、いずれかの微生物が液体培地中に浮遊している。さらに、振盪を行うことで、微生物を浮遊させるとともに、液体培地中の微生物の密度を均一にすることができる。このように浮遊している状態で培養することで、微生物の増殖速度を増加させたり、抗生物質の増殖阻害作用を強めたりできる。さらに、振盪培養を行うことで、微生物の増殖に必要な酸素、培地成分及び増殖阻害物質が効率よく微生物と接触するため、このような効果を高めることができ、また、微生物の増殖の結果については、再現性良く得ることができる。
【００３４】
ここで、参照対象の検出部１４０では、対象菌３４０が増殖する。図２（ｃ）に示すように、増殖した微生物を増殖菌３７０とする。一方、検出対象の検出部１４０では、抗生物質の殺菌作用により、対象菌３４０の増殖が阻害される。図３（ｃ）に示すように、増殖が阻害された微生物を増殖抑制菌３８０とする。
【００３５】
本実施の形態に係る抗生物質は、たとえば、ペニシリン系、セファム系、βラクタム系、アミノグリコシド系、ペプチド系、テトラサイクリン系、マクロライド系、ニューキノロン系、クロラムフェニコール系、アミノ配糖体系等を用いることができる。
液体培地としては、微生物の種類にもよるが、たとえばＬＢ培地やミュラーヒントン培地などを用いることができる。
培養時間は、微生物の種類にもよるが、特に限定されず、たとえば１５分以上、１８０分以下程度とすることができる。また、培養温度としては、微生物の種類および抗生物質の種類にもよるが、特に限定されず、３０℃以上、４５℃以下程度とすることができる。
【００３６】
［工程（３）］
続いて、参照対象の検出部１４０中の液体培地３１０を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０、増殖菌３７０を残す。また、検出対象の検出部１４０中の抗生物質を含む液体培地３２０を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０、増殖抑制菌３８０を残す（Ｓ１０６、図２（ｄ）、図３（ｄ））。このとき、図７に示す吸引機構１６２を用いて、検出部１４０の下方から液体培地３１０および抗生物質を含む液体培地３２０中の液体を吸引する。
このようにして、参照対象および検出対象のそれぞれのメンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０および増殖菌３７０、対象菌３４０および増殖抑制菌３８０が捕集される。また、死んだ細胞は、細胞膜が弱体化するため、吸引力を制御することで、死菌をばらばらにして、膜(メンブレンフィルタ１３０)を通過させることもできる。このような微生物の捕集工程により、微生物を含む液体培地のうち、微生物と液体培地等とを分け、この微生物(とくに生菌)を有意に微小な領域に集めることができる。
【００３７】
［工程（４）］
続いて、微生物の生死を判別する試薬（蛍光試薬３３０）を液溜め部に導入する（Ｓ１０８、図２（ｅ）、図３（ｅ））。蛍光試薬３３０としては、たとえば、生菌のみを蛍光染色する試薬が用いられる。
蛍光試薬３３０の導入量は、特に限定されず、微生物（対象菌３４０、増殖菌３７０、増殖抑制菌３８０）が蛍光試薬３３０と接触する量であればよい。
【００３８】
ここで、微生物の生死を判別する方法としては、これに限らず、例えば、市販の蛍光染色試薬を用いて生死菌の判別をする方法を用いることができる。生死菌を判別する方法には、（ａ）複合蛍光染色法、または（ｂ）生菌染色法と全菌染色法との組み合わせた方法などがある。
（ａ）に示す方法の場合、蛍光染色試薬として、生死菌で発光色の違う蛍光試薬が用いられる。具体的には、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のヨウ化プロビジウム色素を含む複合蛍光染色試薬を用いることができる。この他にも、死菌の標識として、ＹＯＹＯ−１、７ＡＤＤ、生菌の標識として、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ、ＬＤＳ７５１などを含む、蛍光染色試薬を用いることができる。
（ｂ）に示す方法の場合、ＤＡＰＩ染色法、ＥＢ染色法、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１染色法などの全菌染色法と、ＣＴＣ染色法、ＣＦＤＡ染色法などの生菌染色法とを組み合わせて用いることができる。例えば、ＤＡＰＩ染色法とＣＦＤＡ染色法との二重染色により、生死菌の判別をする。
【００３９】
［工程（５）］
続いて、蛍光観察する前に、各検出部１４０内部を洗浄する。洗浄するには、たとえば、検出部１４０に洗浄液を導入し、この洗浄液を吸収除去する。この後、センサーチップ１００を濃縮装置１６０から検出装置１９０に移動させる。そして、検出装置１９０を用い、センサーチップ１００の検出部１４０中の微生物を蛍光観察する（Ｓ１１０、図２（ｆ）、図３（ｆ））。本工程では、たとえば、光学倍率を掛けて、蛍光観察する。
蛍光試薬３３０は、たとえば生菌３５０のみ蛍光染色する。そのため、図２（ｆ）、図３（ｆ）に示すように、参照対象の検出部１４０においては、対象菌３４０および増殖菌３７０が生菌３５０として検出される。一方、検出対象の検出部１４０においては、増殖抑制菌３８０は死菌３６０であるため検出されず、対象菌３４０のみが生菌３５０として検出される。そして、微小領域に捕集した微生物数(たとえば生菌数)を計数して、参照対象の検出部１４０に対する、検出対象の検出部１４０の生菌数比を算出する。
【００４０】
ここで、本実施の形態の微生物検出方法により得られた、生菌数比について説明する。
本実施の形態においては、生菌数比は、微生物の感受性を示すパラメータである。
この生菌数比の定義を以下に示す。
（ｉ）生菌数比が１．０±α（対数換算）以内の場合は、検出対象の微生物は抗生物質に対して感受性を示さない基準とする(つまり、微生物に耐性が有る場合には、生菌数比は、ほぼ１かそれ以上になる)。
（ｉｉ）生菌数比が１．０−α（対数換算）より小さい範囲では、検出対象の微生物は抗生物質に対して感受性を示す基準とする。
ここで、αは、培養時間、培養温度および抗生物質の濃度等により決定する。αとしては、たとえば、０．５以下、さらには０．２以下と設定することができる。
【００４１】
生菌数比を算出する方法について説明する。本実施の形態において、生菌数比を算出するには、たとえば、（１）生菌数をカウントして生菌数比を算出してもよいし、（２）生菌を示す画像データの蛍光面積の比を換算して生菌数比を算出してもよい。
（１）生菌数から生菌数比を算出する方法について説明する。まず、１視野当たりの生菌数をカウントし、検出部１４０の開口面積（ろ過面積）／１視野あたりの面積を掛ける。つまり、次の式により、生菌数が算出される。生菌数＝（１視野当たりの生菌数の平均値）×（ろ過面積）／１視野あたりの面積。そして、第１の生菌数（参照対象の検出部１４０中の生菌数）に対する第２の生菌数（検出対象の検出部１４０中の生菌数）の生菌数比を算出する。
（２）蛍光面積の比を換算して生菌数比を算出する方法について説明する。まず、各検出部１４０の生菌３５０を示す蛍光画像データを得る。そして、１視野当たりの蛍光面積を算出し、検出部１４０の開口面積（ろ過面積）／１視野あたりの面積を掛ける。つまり、次の式により、蛍光面積が算出される。蛍光面積＝（１視野当たりの蛍光面積の平均値）×（ろ過面積）／１視野あたりの面積。そして、第１の蛍光面積（参照対象の検出部１４０中の蛍光面積）に対する第２の蛍光面積（検出対象の検出部１４０中の蛍光面積）の蛍光面積比を算出し、この蛍光面積比を換算して生菌数比とする。
【００４２】
以上のように、参照対象の検出部１４０に対する、検出対象の検出部１４０の生菌数比を算出することで、微生物の高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。
【００４３】
本実施の形態の効果を説明する。
本実施の形態の微生物検出方法においては、濃縮、培養、蛍光観察等の一連の工程を、センサーチップ１００上で実施することができる。このため、迅速に微生物を検出することができる。そのため、全体の検出時間を短縮することができる。
また、本実施の形態によれば、濃縮工程や微生物を微小領域に捕集し蛍光観察する工程を行っているので、その濃縮効果のために、微小な微生物数の変化を極めて正確に検出できる。
【００４４】
本実施の形態において、検出対象の検出部１４０では、抗生物質を含む液体培地中で微生物を振盪培養している。これにより、抗生物質の増殖阻害作用が強まり、参照対象の検出部１４０中の生菌数は減少する。そのため、検出対象の検出部１４０において、培養前と培養後との生菌数比の違いが明瞭となり、抗生物質に感受性を示す微生物を迅速に検出することができる。
さらに、参照対象の検出部１４０では、抗生物質を含まない液体培地中で微生物を振盪培養している。これにより、微生物の増殖速度が早くなり、参照対象の検出部１４０中の生菌数は増加する。そのため、培養後において、検出対象と参照対象との生菌数比の違いが明瞭となり、より高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。
【００４５】
このように、同じ試料（微生物を含む液体）を前提として、抗生物質を含まない条件下の第１の生菌数と抗生物質を含む条件下の第２の生菌数との生菌数比を算出することにより、微生物の抗生物質に対する感受性を高感度に検出することができる。
【００４６】
本実施の形態では、培養前に、メンブレンフィルタ１３０上に微生物を微小領域に濃縮している。このため、試料中の微生物の濃度が、非常に低濃度でも、微生物の感受性を検出することができる。さらには、本実施の形態の培養工程により、生菌数比の差が明瞭となり、高感度に微生物の感受性を検出することができる。そのため、試料中の微生物の濃度に依存せずに、微生物の感受性を検出できる。例えば、試料中の微生物の初期濃度が１０個／ｍｌ以上程度、さらには１個／ｍｌ以上程度から、検出装置１９０により、微生物を検出できる。
【００４７】
本実施の形態では、濃縮装置１６０および検出装置１９０を用いて、センサーチップ１００上で培養、濃縮、蛍光観察を統合して実施できる。そのため、本実施の形態においては、工程の簡便化、作業の効率化および汚染や感染の危険性の軽減を図ることができる。また、センサーチップ１００中で全ての工程について処理をすることができるため、汚染の恐れも少ない上、実験者の安全が図れる。
【００４８】
また、本実施の形態の薬剤感受性の検出方法では、抗生物質に接触した微生物を捕集し、この捕集した微生物の殺菌作用による生死を直接検出することで、微生物の薬剤感受性を迅速に検査することができる。培養法やＰＣＲ法等と比べると検査に要する試料の処理工程が少ないため、非常に簡単である。さらに、培養法を除くほかの検査方法と比べると使用する試薬が少ないため、ランニングコストを低く抑えることも可能である。また、この薬剤感受性の検出方法は、院内感染原因菌の検出、感染症診断および抗菌剤の迅速感受性試験等に応用することもできる。
【００４９】
（第２の実施の形態）
第２の実施の形態の微生物検出方法について、以下説明する。
第２の実施の形態の微生物検出方法は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する方法である。つまり、第１の実施の形態の微生物検出方法により得られた生菌数比を示すデータの結果から最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する。
【００５０】
本実施の形態の微生物検出方法は、第１の検出部および第２の検出部からなる第１の検出部群を、複数備えるチップ（センサーチップ１００）を用い、微生物を濃縮する工程において、第１の検出部および第２の検出部に同一の被検用の液体を分けて導入し、微生物を培養する工程において、第１の検出部群の間で液体培地中の生理活性物質（第１の抗生物質）の濃度を異ならせ、微生物を観察する工程において、生理活性物質（第１の抗生物質）の濃度に対応する、第１の生菌数に対する第２の生菌数の生菌数比を算出する工程を含む。
このとき、第１の検出部は、参照対象の検出部１４０を表し、第２の検出部は、検出対象の検出部１４０を表す。また、第１の生菌数は、第１の検出部中の生菌数を表し、第２の生菌数は、第２の検出部の生菌数を表す。
【００５１】
さらに、本実施の形態の微生物検出方法は、第３の検出部をさらに備えるチップ（センサーチップ１００）を用い、微生物を濃縮する工程において、第１の検出部、第２の検出部および第３の検出部に同一の被検用の液体を分けて導入し、微生物を培養する工程において、第３の検出部では、第２の検出部と異なる種類の生理活性物質（第２の抗生物質）を含む液体培地を液溜め部に導入し、液体培地中に浮遊している微生物を培養し、微生物を観察する工程において、さらに、第１の検出部内の微生物の第１の生菌数と第３の検出部内の微生物の第３の生菌数とを測定し、第１の生菌数に対する前記第３の生菌数の生菌数比を算出する工程を含む。
このとき、第３の検出部は、第２の検出部と異なる、検出対象の検出部１４０を表す。また、第３の生菌数は、第３の検出部中の生菌数を表す。また、第１の検出部、第２の検出部および第３の検出部から第２の検出部群が構成されている。
【００５２】
本実施の形態では、複数の検出部を備えるチップとして、図４に示す縦横の検出部１４０の数が３個×６個である、センサーチップ１００を用いることができる。
図４に示すＢ−Ｂ矢視方向の検出部１４０においては、抗生物質を含まない液体培地、第１の抗生物質を含む液体培地、第２の抗生物質を含む液体培地を順に導入する。また、図４に示すＡ−Ａ矢視方向の検出部１４０においては、第１の抗生物質の濃度および第２の抗生物質の濃度が６つの異なる濃度とする。
このようにして、２種類の第１の抗生物質および第２の抗生物質について、第１の濃度から第６の濃度（第１の濃度＞第６の濃度）までに対応する、複数個の生菌数のデータを得ることができる。
【００５３】
続いて、第１の実施の形態と同様にして、抗生物質を含まない条件下の第１の生菌数と第１の抗生物質を含む条件下の第２の生菌数との、第１の生菌数比を算出する。さらに、第１の濃度から第６の濃度に対応する第１の生菌数比を算出する。これらの生菌数比は、（試料中の微生物の初期濃度が同一の試料）を前提とする。
【００５４】
続いて、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出するには、得られた生菌数比を示すデータの結果から、第１の抗生物質に対する微生物の感受性の有無を判断する。
たとえば、第１の生菌数比のうち、第１の濃度から第４の濃度では、感受性を示す基準の値であり、他方、第５の濃度および第６の濃度では、感受性を示さない基準の値であるとする。この場合、第１の抗生物質に対する微生物の第１のＭＩＣは、第４の濃度と決定することができる。さらに、第４の濃度と第５の濃度との濃度間で、濃度をふって、第１の生菌数比を算出し、感受性の有無の結果から、より正確に第１のＭＩＣを算出することができる。
【００５５】
さらに、前述の第１の生菌数比にくわえ、抗生物質を含まない条件下の第１の生菌数と第２の抗生物質を含む条件下の第３の生菌数との、第２の生菌数比を算出する。さらに、第１の濃度から第６の濃度に対応する第２の生菌数比を算出する。この第２の生菌数比の結果から、第２の抗生物質に対する微生物の第２のＭＩＣを算出することができる。ここで、これらの生菌数比は、（試料中の微生物の初期濃度が同一の試料）を前提とする。
以上により、第２の実施の形態によれば、同時に２種類のＭＩＣを算出できる。つまり、第１の抗生物質に対する微生物の第１のＭＩＣおよび第２の抗生物質に対する微生物の第２のＭＩＣを算出することができる。
【００５６】
このように、複数の検出部１４０を備えるセンサーチップ１００を用いて、本実施の形態の微生物検出方法を実施することにより、抗生物質に対するＭＩＣを迅速かつ高感度に決定することができる。また、本実施の形態によれば、複数種類の抗生物質に対するＭＩＣを同時に検出することができる。
【００５７】
また、本実施の形態の薬剤感受性を調べる方法を利用すると、微生物の種類が未知の場合には、準備した試料について薬剤耐性菌の有無の判別をすることができるとともに、ＭＩＣを調べることもできる。微生物の種類が未知の場合であっても、複数種類の抗生物質の感受性反応や選択培地の使用により、未知の微生物の菌種を大まかに予想することもできる。一方、微生物の種類が既知の場合には、上述のとおり、抗生物質の薬剤感受性およびＭＩＣを調べることができる。
【００５８】
次に、本実施の形態の微生物検出方法により、得られたＭＩＣの結果から、生理活性物質（抗生物質）に対する微生物の耐性の有無を評価した、データを生成する。
まず、第２の実施の形態の微生物検出方法により、生菌数比を示すデータの結果から最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する。そして、生理活性物質（抗生物質）の最小発育阻止濃度が所定濃度以上である場合には、微生物が前記生理活性物質（抗生物質）に対して耐性を示すと判断する。このとき、生理活性物質（抗生物質）に対する微生物の耐性の有無を示すデータを生成する。
【００５９】
ここで、耐性を示すと判断するための、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の基準を以下の（１）、（２）に示す。
（１）ＭＩＣがＲ［μｇ／ｍｌ］以上である場合には、抗生物質に対して微生物が耐性ありと判断する。
（２）ＭＩＣがＲ［μｇ／ｍｌ］未満である場合には、抗生物質に対して微生物が耐性無しと判断する。
【００６０】
また、Ｒ［μｇ／ｍｌ］以上である場合に、耐性の度合について段階ごとに評価してもよい。たとえば、Ｒが１以上、１０未満［μｇ／ｍｌ］の場合には、低程度の耐性あり（ＬＲ（Ｌｏｗ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ））と評価し、Ｒが１０以上、２５未満［μｇ／ｍｌ］の場合には、中程度の耐性あり（ＭＲ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ））と評価し、Ｒが２５以上［μｇ／ｍｌ］の場合には、高程度の耐性あり（ＨＲ（Ｈｉｇｈｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ））と評価する。
【００６１】
さらに、本実施の形態においては、このような微生物の耐性の有無を示すデータから、微生物が耐性を示さない生理活性物質（抗生物質）を選択することができる。
なお、実際には、たとえ微生物が耐性を示したとしても、そのような抗生物質も使用する可能性がある。この場合には、本実施の形態においては、低程度の耐性から中程度の耐性を示す抗生物質を選択することができる。
【００６２】
以上のように、本実施の形態では、複数種類の抗生物質に対して、簡便かつ迅速に、微生物の感受性、ＭＩＣおよび耐性の有無についての検査結果が得られる。このため、臨床現場において、抗生物質投与の迅速かつ的確な判断が可能となる。そのため、術後感染症、敗血症、薬剤耐性菌（ＭＲＳＡ等）による院内感染等のリスクが軽減される。
【００６３】
このような医療環境の観点から、センサーチップ１００の検出部１４０の個数が多い方が好ましい。たとえば、たとえば、９２個（１２個（１１種類の抗生物質＋ネガティブコントロール）×８個（８種類の濃度））の検出部１４０を設けることにより、複数種類の抗生物質について、同時かつ迅速に感受性を高感度に検出することができる。
【００６４】
また、本実施の形態においては、液体培地中で微生物を振盪培養している。そのため、液体培地中の抗生物質の濃度が均一となる結果、検出対象中の微生物に対する抗生物質の効果が再現性よく得られる。このため、本実施の形態によれば、生菌数、生菌数比のバラツキが小さくなり、再現性よく微生物の感受性、ＭＩＣ等の結果が得られる。
【００６５】
一般的に、術後感染症や院内感染等に際し、培養法による薬剤感受性試験により適切な抗生物質が選択され、この抗生物質が患者に処置されている。ところが、培養法は通常１日以上かかるため、迅速に、抗生物質の選択を行うことが困難である。このため、迅速の観点から、多種類の抗生物質を用いると、新たな耐性菌の出現の原因となる上、副作用など患者への負担が大きくなる要因となる。
【００６６】
これに対して、本実施の形態においては、複数種類の抗生物質について、同時かつ迅速に感受性を高感度に検出することができる。そのため、薬剤耐性菌などによる院内感染が発生した場合も同様で、迅速に感受性試験を実施できる。また、外科手術後、患者は術後感染症の脅威に晒され、致命的な敗血症に至る場合においても、臨床医は最も効果的な抗生物質を可能な限り早く見つけて、処置をすることができる。また、本実施の形態の微生物検出方法は、臨床医が患者一人分の感受性試験を緊急に行いたいといった用途にも利用できる。
【００６７】
（第３の実施の形態）
本実施の形態の微生物検出方法を用いた、抗菌活性を示す物質のスクリーニング方法について説明する。この迅速スクリーニングは、製薬、あるいは、抗菌物質の作製などに利用できる。
第３の実施の形態では、生理活性物質としては、抗菌活性の有無が未確認の未知物質を用いる。未知物質としては、たとえば、放線菌の抽出液、既知の化合物、抗菌活性を示す化合物の誘導体、タンパク質等を挙げることができる。
【００６８】
第３の実施の形態の未知物質の抗菌活性を調べる方法は、以下の工程を含む。まず、少なくとも一種の既知の微生物を含む試料を複数の検出部１４０に導入する。続いて、微生物を培養する工程において、ネガティブコントロールとして液体培地のみの場合、ポジティブコントロールとして既知の抗生物質を含む液体培地の場合、検出対象として未知物質を含む液体培地の場合の３つの液体培地を、３つの各検出部１４０に導入して微生物を振盪培養する。続いて、ネガティブコントロールに対するポジティブコントロールの第３の生菌数比およびネガティブコントロールに対する検出対象の第４の生菌数比を算出する。
このとき、抗菌活性を示す基準を第３の生菌数比とする。そして、以下に示す基準により、未知物質の抗菌活性の有無を判断することができる。
（１）第４の生菌数比が、第３の生菌数比と同程度または第３の生菌数比以上の場合、未知物質は、抗菌活性あり。
（２）第４の生菌数比が、第３の生菌数比より小さい場合には、未知物質は、抗菌活性無し。
【００６９】
また、既知抗生物質と未知物質との間で得られた上記検出結果を比較して、未知物質の殺菌性を示すデータを生成する。これにより、既知微生物Ｄ１に対する既知抗生物質Ｒ１の殺菌作用Ｙ１と、同質の殺菌作用Ｙ１を有すると考えられる未知物質をスクリーニングすることができる。また、既知微生物Ｄ２が異なれば、既知抗生物質Ｒ１は殺菌作用Ｙ２となる場合がある。このときには、未知物質は同質の殺菌作用Ｙ２を有するものとしてスクリーニングされる。
【実施例】
【００７０】
本実施例は、本実施の形態の微生物の感受性および微生物のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）の検出ついての具体例を示す。
（実施例１）
実施例１では、図１０から図１２に示すように、微生物の感受性を検出するとともに、検出可能な微生物の濃度を測定した。
検出対象成分： 大腸菌
検出方法： 蛍光顕微鏡観察
蛍光染色： 複合蛍光染色試薬
また、実施例１では、図４に示すセンサーチップ１００、図７に示す濃縮装置１６０および図９に示す検出装置１９０を用いた。
生菌数測定： 生菌数＝（１視野当たりの生菌数の平均値）×（フィルタ面積）／（１視野の面積）
検出精度： 本発明のフィルタ法（個／ｍｌ）と混釈平板法（ＣＦＵ／ｍｌ）との相関係数は、０．９５。
液溜め容量： １ｍｌ
フィルタ径： ３ｍｍ
温度： ３７℃（±１℃）
対物レンズ： ×１０
【００７１】
まず、大腸菌の濃度が異なる６つの被検用の液体試料を準備する。そして、大腸菌の初期濃度が同じ被検用の液体試料を分けて、参照対象および検出対象のセンサーチップ１００の各検出部１４０に導入する。６種類の大腸菌の初期濃度に応じて、６セットの参照対象および検出対象を作製する。続いて、濃縮装置１６０の吸引機構１６２を用いて試料内の大腸菌を、メンブレンフィルタ１３０上に濃縮した。続いて、参照対象の検出部１４０には、液体培地８００μｌと生理食塩水１００μｌとを導入した。一方、検出対象の検出部１４０には、液体培地８００μｌと抗生物質（セファム系抗生物質製剤「パンスポリン」武田薬品工業社製、濃度：１０ｇ／Ｌ）１００μｌとを導入した。続いて、濃縮装置１６０の培養機構１６４を用い、培養温度３７℃で、培養時間の条件を０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎと変えて、センサーチップ１００中の大腸菌を振盪培養した。
続いて、吸引機構１６２を用いて、メンブレンフィルタ１３０上に大腸菌を捕捉した。続いて、各検出部１４０に、染色液（複合蛍光染色試薬）を導入した。
ここで、複合蛍光染色試薬として、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。複合蛍光染色試薬は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のヨウ化プロビジウム色素を含んでおり、これらは膜透過性に違いがある。ＳＹＴＯ９は生死菌両方の膜を透過し緑色に染色する。一方、ヨウ化プロビジウムは死菌のダメージを受けた膜のみを透過し赤色に染色する。また、両方の色素がバクテリア中に存在すると、ＳＹＴＯ９の蛍光は減衰する。従って、細菌が生存していれば、複合蛍光試薬は緑色に蛍光し、細菌が死亡しているなら、複合蛍光試薬は、赤色に蛍光する。分子化学反応に、１０分要した。
その後、吸引機構１６２を用い、洗浄液（ＰＢＳ）を導入して検出部１４０内部を洗浄した。この後、検出装置１９０を用い、センサーチップ１００の各検出部１４０について蛍光顕微鏡観察を行った。このとき、各検出部１４０の大腸菌の生菌数を算出し、その結果から、参照対象と検出対象との生菌数比を算出した。
【００７２】
図１０は、参照対象（抗生物質を含まない）の生菌数の時間変化を示す。横軸は、時間（ｍｉｎ）を表し、縦軸は、フィルタ法により測定した大腸菌の生菌数（対数）を表す。ここでは、大腸菌の初期濃度（試料中の濃度）は、混釈平板法により測定した場合では、黒丸が９．４×１０Ｅ４（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、黒三角が２．０×１０Ｅ４（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、黒菱形が３．５×１０Ｅ３（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、白丸が１．２×１０Ｅ３（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、白三角が６．２×１０Ｅ２（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、白四角が６．０×１０Ｅ１（ＣＦＵ／ｍｌ）を表す。
図１１は、検出対象（抗生物質を含む）の生菌数の時間変化を示す。図中の記号は、図１０と同じである。
図１２は、参照対象と検出対象との生菌数比の時間変化を示す。図中の縦軸が、生菌数比を表す以外は、図中の記号は、図１０と同じである。
【００７３】
このように、全ての初期濃度において、培養時間が３０ｍｉｎ程度で、生菌数比が１よりかなり小さくなっている。そのため、本発明の微生物検出方法によれば、試料の初期濃度が、少なくとも、１個／ｍｌから１０Ｅ５個／ｍｌ程度範囲で微生物の感受性を高感度に検出することができることが分かった。また、本発明の微生物検出方法によれば、培養時間が３０ｍｉｎから６０ｍｉｎ程度で、微生物の感受性を迅速に検出することができることが分かった。
【００７４】
（実施例２）
実施例２では、図１３から図１５に示すように、微生物のＭＩＣの検出を行った。
実施例２は、実施例１における試料の大腸菌の初期濃度を変化させた条件に代えて、抗生物質の濃度を変化させた条件にした以外、実施例１と同様に行った。
【００７５】
図１３は、参照対象（抗生物質を含まない）の生菌数の時間変化を示す。横軸は、時間（ｍｉｎ）を表し、縦軸は、フィルタ法により測定した大腸菌の生菌数（対数）を表す。ここでは、検出対象の抗生物質の濃度は、黒丸が１０Ｅ３（μｇ／ｍｌ）を表し、黒三角が１０Ｅ２（μｇ／ｍｌ）を表し、黒四角が１０Ｅ１（μｇ／ｍｌ）を表し、黒菱形が１０Ｅ０（μｇ／ｍｌ）を表し、白丸が１０Ｅ−１（μｇ／ｍｌ）を表し、白三角が１０Ｅ−２（μｇ／ｍｌ）を表す。
図１４は、検出対象（抗生物質を含む）の生菌数の時間変化を示す。図中の記号は、図１３と同じである。
図１５は、参照対象と検出対象との生菌数比の時間変化を示す。図中の縦軸が、生菌数比を表す以外は、図中の記号は、図１３と同じである。
また、図１６は、抗生物質の濃度が１０Ｅ１（μｇ／ｍｌ）である、参照対象および検出対象の検出部１４０中の観察結果を示す図である。
【００７６】
図１５の結果から、抗生物質の濃度が、１０Ｅ−１および１０Ｅ−２（μｇ／ｍｌ）の場合には、生菌数比は、ほぼ１である。一方、抗生物質の濃度が、１０Ｅ０（μｇ／ｍｌ）以上の場合には、生菌数比は、１よりかなり小さくなる。このため、パンスポリンに対する大腸菌のＭＩＣは、１０Ｅ０（μｇ／ｍｌ）以下程度であることがわかった。この範囲でさらに、抗生物質の濃度をふって、再度検出することにより、正確なＭＩＣを検出することがわかった。また、培養時間が３０ｍｉｎから６０ｍｉｎ程度で、生菌数比の差が顕著になるため、迅速に、微生物のＭＩＣを検出することができることが分かった。
【００７７】
（比較例）
従来の希釈法により、パンスポリンに対する大腸菌のＭＩＣを測定した。被検薬剤の２倍希釈系列についてＬＢ液体培地を用いて調整後、これに１０Ｅ５または１０Ｅ６(ｃｆｕ／ｍｌ)の菌(大腸菌)を接種し、３７℃一夜培養を行う。この後、菌の発育阻止が認められる薬剤(パンスポリン)の最小濃度をＭＩＣとした。
この結果を、図１７に示す。ＭＩＣは、一回目が３１０（ｎｇ／ｍｌ）、二回目が６３０（ｎｇ／ｍｌ）だった。この希釈法によるＭＩＣは、本発明による結果とほぼ同一となることが分かった。しかしながら、従来の希釈法では、試料の準備からＭＩＣを決定するまでに、１８間以上かかった。これに対して、本発明では、ＭＩＣを決定するまでに、試料の準備工程、蛍光観察工程の時間を加えても、１．５時間程度であった。
【００７８】
（参照例）
参照例では、実施例１の液体培地を用いて培養せず、試料中にパンスポリンを導入したのち、蛍光観察した。その結果、生菌数、生菌数比等の結果にばらつきが出た。また、感受性を示す生菌数比を得るために、試料中にパンスポリンを導入する時間が最低でも６０分以上必要となることが分かった。
これに対して、本発明に係る微生物検出方法は、液体培地を用いた培養工程を含むので、参照対象と検出対象との生菌数比の違いが明瞭になり、迅速かつ高感度に、微生物の感受性を検出することができた。
【００７９】
以上、図面を参照して本発明の実施の形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
たとえば、吸引機構１６２は、センサーチップ１００のメンブレンフィルタ１３０上の微生物が乾燥しないように、検出部１４０中の液体の水位を調節してもよい。また、吸引機構１６２は、微生物が乾燥しないように、所定間隔で液体(液体培地、試料、洗浄液等)を添加してもよい。
【００８０】
また、センサーチップ１００は、耐熱性を有する材料で構成されてもよい。これにより、センサーチップ１００についてオートクレーブ等を実施することにより、センサーチップ１００を繰り返し使用可能となる。なお、センサーチップ１００は、安全性の観点から、使い捨ててもよい。
【００８１】
また、メンブレンフィルタ１３０と下板１２０との間に、Ｏリング等を設けてもよい。これにより、液漏れ防止機能をさらに向上させることができる。または、メンブレンフィルタとチップ素材を直接、接着剤や超音波接合などで接合をしてもよい。また、図５に示すように、検出部１４０の断面形状は、テーパ状となっている。このため、検出部１４０の下面開口部分のメンブレンフィルタ１３０上に、微生物が効率良く捕集される。
【００８２】
また、本実施の形態に係る生理活性物質は、上述の抗生物質またはスクリーニング用試料等に限定されず、たとえば、ファージ等であってもよい。ファージに接触した微生物の溶菌による生菌数比を算出することにより、微生物の菌種を迅速に特定することができる。ファージを用いた特定菌の検出方法は、食品衛生検査、環境衛生分析および感染症診断等に応用することできる。
【符号の説明】
【００８３】
１００ センサーチップ
１１０ 上板
１２０ 下板
１３０ メンブレンフィルタ
１４０ 検出部
１５０ チップ台
１５２ 開口部
１６０ 濃縮装置
１６２ 吸引機構
１６４ 培養機構
１６６ 真空ポンプ
１６８ 廃液タンク
１７０ 洗浄液タンク
１７２ 送液ポンプ
１７４ 培養液タンク
１７６ 蛍光試料タンク
１７８ フィン
１８０ ヒータ
１８２ 振盪器
１８４ 送液用チューブ
１８６ 廃液用チューブ
１８８ 吸引プラグ
１９０ 検出装置
１９２ 移動ステージ
１９４ 励起用光源
１９５ 励起光用光学フィルタ
１９６ 対物レンズ
１９８ ダイクロイックミラー
２００ 光学フィルタ
２０２ 結像レンズ
２０４ 検知機構
２０６ ＰＣ
２０８ 仕切り板
２１０ カバー
３００ 試料
３１０ 抗生物質を含まない液体培地
３２０ 抗生物質を含む液体培地
３３０ 蛍光試薬
３４０ 対象菌
３５０ 生菌
３６０ 死菌
３７０ 増殖菌
３８０ 増殖抑制菌
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を検出する方法として、一般的に培養方法が用いられる。この培養方法では、たとえば２４時間培養を行うため、非常に時間がかかることが知られている。
【０００３】
特許文献１には、微生物を個別に検出する点が改善された微生物検出方法が記載されている。同文献によれば、微生物を検出表面上に結合させた状態で、当該微生物の増殖を行っている。これにより、微生物を個別に検出することができると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５２３８２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のように、上記文献記載の従来技術は、微生物を検出するまでに時間がかかっていた。そのため、迅速に、微生物を検出する方法が望まれている。
【０００６】
また、特許文献１のように、微生物の一部をある表面上に結合させた状態で培養すると、培養液と微生物とが接触してない部分があるので、培養速度が遅くなることがあった。さらに、表面近傍では液体中の組成濃度にバラツキが生じるため、たとえば、抗菌剤を添加した場合の微生物の増殖の結果については、再現性よく得ることが困難であった。加えて、振盪機構を備えていないため、菌種によっては培養が困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、
少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を溜める液溜め部と、
前記液溜め部の下面に設けられた開口部と、
前記開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタと、を有する検出部を備えるチップを準備し、
前記液溜め部の中の前記被検用の液体を、前記メンブレンフィルタの下方から除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を濃縮する工程と、
生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養する工程と、
前記メンブレンフィルタの下方から前記液体培地を除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を捕集する工程と、
前記微生物の生死を判別する試薬を前記液溜め部に導入する工程と、
前記チップ内の前記微生物を観察する工程と、を含む、微生物検出方法が提供される。
ただし、この工程は状況により順番が変更される場合もある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、迅速かつ高感度に微生物を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施の形態の微生物を検出する方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の実施の形態の薬剤感受性の検出方法を示す工程断面図である。
【図３】本発明の実施の形態の薬剤感受性の検出方法を示す工程断面図である。
【図４】本発明の実施の形態のセンサーチップを模式的に示す上面図である。
【図５】本発明の実施の形態のセンサーチップのＡ−Ａの模式断面図である。
【図６】本発明の実施の形態のセンサーチップのＢ−Ｂの模式断面図である。
【図７】本発明の実施の形態の濃縮装置を示す模式断面図である。
【図８】本発明の実施の形態の吸引機構を示す模式断面図である。
【図９】本発明の実施の形態の検出装置を示す模式断面図である。
【図１０】大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１１】抗生物質を添加した場合の大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１２】添加した抗生物質の濃度を比較したときの大腸菌の生菌数比を示す図である。
【図１３】大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１４】抗生物質を添加した場合の大腸菌の生菌数の時間変化を示す図である。
【図１５】抗生物質の添加の有無を比較したときの大腸菌の生菌数比を示す図である。
【図１６】検出部の蛍光観察の結果を示す図である。
【図１７】従来の方法（希釈法）によりＭＩＣを測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１１】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の実施の形態の微生物を検出する方法を示すフローチャートである。図５は、本実施の形態に係るセンサーチップ１００を示す模式断面図である。
本実施の形態の微生物を検出する方法は、まず、少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を溜める液溜め部と、液溜め部の下面に設けられた開口部と、前記開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタ１３０と、を有する検出部１４０を備えるチップ(センサーチップ１００)を準備する。そして、このチップ上で示す一連の工程を実施する。
また、本実施の形態の微生物を検出する方法は、以下の工程を含む。
工程（１）上記液溜め部の中の少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を、メンブレンフィルタ１３０の下方から除去して、メンブレンフィルタ１３０上に微生物を濃縮する工程（Ｓ１００、Ｓ１０２）。
工程（２）生理活性物質を含む液体培地を液溜め部に導入し、液体培地中に浮遊している微生物を培養する工程（Ｓ１０４）。
工程（３）メンブレンフィルタ１３０の下方から液体培地を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に培養後の微生物を捕集する工程（Ｓ１０６）。
工程（４）微生物の生死を判別する試薬を液溜め部に導入る工程（Ｓ１０８）。
工程（５）チップ（センサーチップ１００）内の微生物を観察する工程（Ｓ１１０）。
【００１２】
本実施の形態の微生物を検出する方法の概要について説明する。
本実施の形態の微生物を検出する方法においては、本方法の一連の工程を、センサーチップ１００上、特に検出部１４０で実施することができる（Ｓ１００からＳ１１０）。このため、本発明によれば、迅速に微生物を検出することができる。そして、本発明によれば、全体の検出時間を短縮することができる。
また、本実施の形態において、生理活性物質を含む液体培地中で微生物を培養する検出部１４０を、検出対象の検出部１４０とし、一方、生理活性物質を含まない液体培地中で微生物を培養する検出部１４０を、参照対象の検出部１４０とする。このとき、検出対象においては、生理活性物質の作用が強まり、一方、参照対象においては、微生物の増殖速度が早くなる。さらに、振盪培養を行うことで、このような効果を高めることができる。このため、本発明においては、検出対象と参照対象との生菌数比の違いが明瞭となり、高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。また、培養後、微生物を極めて微小な領域に捕集して微生物を蛍光観察し、計数するため、微生物の非常に大きな集団であるコロニーを観察する培養法や、試料の濁度を検出する従来法と比べて、極めて微量な微生物数の変化を検出することができる。このように、本発明においては、高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。
【００１３】
本実施の形態においては、生理活性物質としては、たとえば、抗生物質を用いることができる。また、微生物の生死を判別する試薬としては、たとえば、市販の蛍光染色試薬を用いることができる。抗生物質を用いた場合には、検出対象菌の薬剤感受性を調べることができる。ここで、本実施の形態において、微生物としては、細菌や菌類等が挙げられる。
【００１４】
次に、本実施の形態の微生物検出方法に用いる微生物検出システムについて説明する。
本実施の形態においては、一連の本工程をセンサーチップ１００上で実施するために、送液機構、吸引機構、振盪機構、恒温機構、洗浄機構、移動機構および検出機構を備える微生物検出システムを用いることができる。たとえば、本実施の形態では、図７および図９に示す濃縮装置１６０および検出装置１９０を含む微生物検出システムを使用する。
各工程に応じて、センサーチップ１００をセットした状態で、濃縮装置１６０および検出装置１９０を使用する。これにより、センサーチップ１００上で迅速に微生物を検出することができる。
【００１５】
まず、微生物検出システムの前提として、本実施の形態に係るセンサーチップ１００について説明する。
図４は、本実施の形態に係るセンサーチップ１００を示す。図５は、図４中のセンサーチップ１００のＡ−Ａの断面図を示す。図６は、図４中のセンサーチップ１００のＢ−Ｂの断面図を示す。
【００１６】
センサーチップ１００は、少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体（試料）を溜める液溜め部と、液溜め部の下面に設けられた開口部と、開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタ１３０と、を有する、検出部１４０を備えるチップ(センサーチップ１００)を準備する。１つのセンサーチップ１００には、複数の検出部１４０がアレイ状に配置されている。検出部１４０の数としては、特に限定されない。複数の検出部１４０が設けられているセンサーチップアレイを用いることにより、同一工程で、複数種類の抗生物質や複数の菌種について感受性を検出することができる。
【００１７】
センサーチップ１００は、たとえば樹脂製とすることができる。センサーチップ１００は、たとえばレーザ成形、射出成形等により得られる。センサーチップ１００平面方向の検出部１４０の形状は、特に限定されないが、たとえば円とすることができる。また、センサーチップ１００平面方向に対して垂直方向の検出部１４０の断面形状は、特に限定されないが、少なくとも一部がテーパ状とすることができる。検出部１４０の径(有効フィルタ径)は、特に限定されないが、たとえば０．１ｍｍ以上、５ｍｍ以下（通常のフィルタ径よりはるかに小さいため微小領域に微生物を捕集する）とすることができる。また、検出部１４０の高さは、蛍光観察時における、対物レンズの焦点距離の観点から決定する。
【００１８】
また、メンブレンフィルタ１３０の孔径は、特に限定されないが、たとえば０．１μｍ以上、１μｍ以下とする。さらに、メンブレンフィルタ１３０は、チタンなどの金属がコーティングされていてもよい。または、酸化アルミニウム製のフィルタを用いてもよい。これにより、メンブレンフィルタ１３０の自己発光を抑えて、検知の際のノイズを低減させることができる。
【００１９】
また、図５に示すように、センサーチップ１００は、液溜め用の筒部材（液溜め部）が設けられた上板１１０と、孔が設けられた下板１２０とを備える。メンブレンフィルタ１３０が間に挟まれるように、上板１１０と下板１２０とが接合されている。接合手段としては、たとえば、上板１１０の上面と下板１２０の下面とをクランプするクランプ手段、上板１１０と下板１２０とをネジ止めする手段等を用いることができる。または、射出成型したプラスチックを、溶剤で接着することもできる。その他、接合手段として、接着剤や超音波接合なども挙げられる。
【００２０】
ここで、クランプ手段の一例としては、図６に示すように、チップ台１５０内壁に溝部を設け、この溝部に、上板１１０および下板１２０の端部を挿入する。これにより、端部がクランプされ、上板１１０と下板１２０とが接合される。そのため、センサーチップ１００は、一体となった状態でチップ台１５０に載置されることになる。さらに、図６に示すように、センサーチップ１００平面方向に対して垂直方向から見たとき、上板１１０の開口部（筒部材の内孔）、メンブレンフィルタ１３０、下板１２０の孔およびチップ台１５０の開口部１５２が重なるように、配置されている。
【００２１】
次に、本実施の形態に係る濃縮装置１６０について説明する。図７(ａ)は、濃縮装置１６０を模式的に示す。図７(ｂ)は、図７(ａ)に示す濃縮装置１６０の一部を模式的に示す。図８は、吸引機構の一部を模式的に示す。
図７(ａ)に示すように、濃縮装置１６０は、培養機構１６４および吸引機構１６２を備える。培養機構１６４は、ヒータ１８０、フィン１７８、不図示の温度センサおよび振盪器１８２を備える。また、吸引機構１６２は、真空ポンプ１６６、廃液タンク１６８、送液ポンプ１７２、洗浄液タンク１７０、送液用チューブ１８４および廃液用チューブ１８６を備える。さらに、濃縮装置１６０は、培養液タンク１７４および蛍光試料タンク１７６を備えていてもよい。このような濃縮装置１６０は、１つの筐体中に設けられている。また、図７(ａ)に示すように、筐体中において、培養機構１６４と吸引機構１６２との間に、仕切り板２０８が設けられている。本実施の形態では、この仕切り板２０８上に培養機構１６４が設けられているが、この態様に限定されない。
【００２２】
図７(ａ)に示す吸引機構１６２においては、センサーチップ１００の液溜め部に導入された、試料、液体培地または蛍光試薬等の液体を、真空ポンプ１６６が吸引する。これらの液体は、不図示のポンプ等を用いて、洗浄液タンク１７０、培養液タンク１７４または蛍光試料タンク１７６等から検出部１４０に導入される。たとえば、送液ポンプ１７２は、洗浄液タンク１７０の中の洗浄液について送液用チューブ１８４を介して、液溜め部に導入する。洗浄液としては、たとえば生理食塩水やリン酸緩衝液などが挙げられる。この場合、送液用チューブ１８４に対して、振盪器１８２上のセンサーチップ１００の位置が移動する。これにより、送液用チューブ１８４は、複数の検出部１４０中に液体を導入する。また、液体はピペット等により、上記液体を液溜め部に導入されてもよい。
吸引された液体は、液溜め部中からメンブレンフィルタ１３０を通過して、チップ台１５０の開口部１５２から廃液用チューブ１８６を介して、廃液タンク１６８に排除される。
このようにして、溜め部の中の液体を、メンブレンフィルタ１３０の下方から吸引除去して、メンブレンフィルタ１３０上に培養された微生物を残すことができる。
【００２３】
また、吸引機構１６２は、図８に示すように、検出部１４０の下方に設けられ、液体を吸引する吸引プラグ１８８を備える。吸引機構１６２中の不図示の第１の制御部により、吸引プラグ１８８の圧力が制御されている。制御部は、吸引プラグ１８８の圧力を検出し、検出値に応じて、吸引プラグ１８８の圧力値をフィードバック補正する。このとき、図８（ａ）に示す例では、検出部１４０のそれぞれに吸引プラグ１８８が設けられている。吸引プラグ１８８は、互いに分離により検出部１４０中の液体を真空ポンプ１６６により個々に吸引する。また、図８（ｂ）に示す例では、複数の検出部１４０に対して１つの吸引プラグ１８８が設けられている。吸引プラグ１８８は、複数の検出部１４０中の液体を真空ポンプ１６６により同時に吸引する。または、スライド機構を用いてチップを移動させ各々の検出部について順次吸引する。
【００２４】
培養機構１６４においては、ヒータ１８０とフィン１７８とにより、培養温度を調節する。このとき、フィン１７８を用いない場合には、ヒータ１８０のオンオフのみで温度調節をすることができる。培養温度は、不図示の温度センサで測定しつつ、微生物の種類、抗生物質の種類等に応じて調節する。培養温度としては、たとえば、室温(２５℃程度)から４５℃程度とすることができる。ここで、培養機構１６４の制御温度は、たとえば室温(２５℃程度)から６０℃程度とすることができる。また、振盪器１８２は、センサーチップ１００が載置されているチップ台１５０を振盪する。たとえば、偏心モータによりチップ台１５０を振盪する。これらにより、センサーチップ１００の検出部１４０中の微生物を、恒温の条件下、液体培地中で振盪培養することができる。
このとき、図７(ｂ)に示す濃縮装置１６０において、開閉自在のカバー２１０および仕切り板２０８から構成される内部空間(密閉空間)中にセンサーチップ１００が設けられている。カバー２１０が開放すると、センサーチップ１００の上方が露出する。このため、センサーチップ１００の操作性が向上する。つまり、簡便かつ効率良く、センサーチップ１００の移動、センサーチップ１００の振盪、センサーチップ１００への液体の導入等を実施することができる。
【００２５】
このように、濃縮装置１６０は、センサーチップ１００上で微生物の濃縮、培養、洗浄、蛍光染色を実行する。つまり、濃縮装置１６０は、まず、検出部１４０のメンブレンフィルタ１３０上に微生物を濃縮し、続いて、この微生物を液体培地中で培養してメンブレンフィルタ１３０上に捕捉し、この後、微生物について洗浄および蛍光染色を実行する。
【００２６】
次に、本発明の実施の形態に係る検出装置１９０について説明する。図９は、検出装置１９０を模式的に示す。
検出装置１９０は、濃縮装置１６０により蛍光染色されたセンサーチップ１００上の検出部１４０中の微生物を蛍光観察する。また、検出装置１９０には、特に限定されず、たとえば汎用の蛍光顕微鏡を用いることができる。
検出装置１９０は、移動ステージ１９２、励起用光源１９４、励起光用光学フィルタ１９５（光源が多くの波長を含む白色光源である場合などは、励起フィルタを用いる必要がある）、対物レンズ１９６、ダイクロイックミラー１９８、放射光吸収光学フィルタ２００、結像レンズ２０２、検知機構２０４、ＰＣ２０６を備える。
移動ステージ１９２は、センサーチップ１００が載置されたチップ台１５０をＸ軸方向、Ｙ軸方向およびＺ軸方向（三次元方向）に自在に移動させることができる。これにより、対物レンズ１９６に対して、センサーチップ１００上の検出部１４０の位置および高さを調節する。
【００２７】
また、図９に示す検出装置１９０においては、励起用光源１９４は励起光を照射する。ダイクロイックミラー１９８は励起用光源１９４から照射された励起光を分光させる。対物レンズ１９６はこの分光した励起光を集光させる。続いて、集光した励起光がセンサーチップ１００上の検出部１４０に照射すると、微生物などが蛍光を発光する。そして、光学フィルタ２００は当該蛍光を上記対物レンズ１９６とダイクロイックミラー１９８とを経由して透過させる。結像レンズ２０２はこの透過した蛍光の光束を結像させる。検知機構２０４により、この結像が電子データに変換される。励起用光源１９４としては、ＬＥＤ等（その他レーザー）を用いることができる。また、検知機構２０４としては、ＣＣＤカメラ（電荷結合素子（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ））等（その他ＣＭＯＳ）を用いる。これにより、ＣＣＤカメラに接続したＰＣ２０６を用いた画像解析もすることができる。また、各検出部１４０中の微生物の生菌の発光を示す画像データが得られる。また、検知機構２０４として、ＣＣＤカメラに代えて、接眼レンズを用いてもよい。これにより、目視による観察を行うことができる。
【００２８】
次に、微生物検出システムを用いた本実施の形態の各工程について、以下説明する。
図２および図３は、本発明の実施形態の薬剤感受性の検出方法の手順を示す。
図２は、参照対象（ネガティブコントロール）の検出部１４０（第１の検出部）を表し、図３は、検出対象の検出部１４０（第２の検出部）を表す。また、図２では、抗生物質を含まない液体培地３１０を用い、一方、図３では、抗生物質を含む液体培地３２０を用いている。
【００２９】
［工程（１）］
まず、センサーチップ１００を用い、参照対象および検出対象の検出部１４０中の液溜め部に、試料３００（微生物を含む被検用の液体）を分けて導入する（Ｓ１００、図２（ａ）、図３（ａ））。
本工程では、参照対象と検出対象には、被検用の液体として、同じ試料３００を用いる。そのため、参照対象および検出対象の試料３００中の微生物の初期濃度はほぼ同一となる。また、前提として、試料３００は、後述の工程で添加する抗生物質により殺菌される、あるいは細菌の増殖が阻害される、対象菌３４０（微生物）を含むものとする。
【００３０】
試料３００は、あらゆる場所から採取してきた微生物を溶媒に拡散して得られる。採取場所は、たとえば、水、飲料、食品、畜産動物、植物、ベット等の生活環境、血液、皮膚、唾液、痰、創傷、胃内容物、尿または糞便等の人体等を挙げることができる。溶媒は、たとえば、生理食塩水やリン酸緩衝液等を用いることができる。また、試料３００には、通常の培養方法により、あらかじめ培養しておいた微生物を用いてもよい。
【００３１】
試料３００の微生物の初期濃度は、非常に低濃度でよい。例えば、初期濃度を、１個／ｍｌ以上程度から、１０Ｅ５個／ｍｌ以下程度とすることができる。
【００３２】
続いて、検出部１４０中の試料３００を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０を残す（Ｓ１０２、図２（ｂ）、図３（ｂ））。これにより、対象菌３４０の液体中の濃度が濃縮される。このとき、図７に示す吸引機構１６２を用いて、検出部１４０の下方から試料３００中の液体を吸引する。
【００３３】
［工程（２）］
続いて、参照対象の検出部１４０中に液体培地３１０を導入し、検出対象の検出部１４０中に抗生物質を含む液体培地３２０を導入する。そして、図７に示す培養機構１６４を用いて、各センサーチップ１００を振盪器１８２で振盪させ、各検出部１４０中の対象菌３４０を振盪培養する（Ｓ１０４、図２（ｃ）、図３（ｃ））。
このように、本培養工程では、検出部１４０中に導入された際に発生する液体培地の対流等の作用により、メンブレンフィルタ１３０上から離れ、液体培地中に微生物が浮遊する。本培養工程中、いずれかの微生物が液体培地中に浮遊している。さらに、振盪を行うことで、微生物を浮遊させるとともに、液体培地中の微生物の密度を均一にすることができる。このように浮遊している状態で培養することで、微生物の増殖速度を増加させたり、抗生物質の増殖阻害作用を強めたりできる。さらに、振盪培養を行うことで、微生物の増殖に必要な酸素、培地成分及び増殖阻害物質が効率よく微生物と接触するため、このような効果を高めることができ、また、微生物の増殖の結果については、再現性良く得ることができる。
【００３４】
ここで、参照対象の検出部１４０では、対象菌３４０が増殖する。図２（ｃ）に示すように、増殖した微生物を増殖菌３７０とする。一方、検出対象の検出部１４０では、抗生物質の殺菌作用により、対象菌３４０の増殖が阻害される。図３（ｃ）に示すように、増殖が阻害された微生物を増殖抑制菌３８０とする。
【００３５】
本実施の形態に係る抗生物質は、たとえば、ペニシリン系、セファム系、βラクタム系、アミノグリコシド系、ペプチド系、テトラサイクリン系、マクロライド系、ニューキノロン系、クロラムフェニコール系、アミノ配糖体系等を用いることができる。
液体培地としては、微生物の種類にもよるが、たとえばＬＢ培地やミュラーヒントン培地などを用いることができる。
培養時間は、微生物の種類にもよるが、特に限定されず、たとえば１５分以上、１８０分以下程度とすることができる。また、培養温度としては、微生物の種類および抗生物質の種類にもよるが、特に限定されず、３０℃以上、４５℃以下程度とすることができる。
【００３６】
［工程（３）］
続いて、参照対象の検出部１４０中の液体培地３１０を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０、増殖菌３７０を残す。また、検出対象の検出部１４０中の抗生物質を含む液体培地３２０を除去して、メンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０、増殖抑制菌３８０を残す（Ｓ１０６、図２（ｄ）、図３（ｄ））。このとき、図７に示す吸引機構１６２を用いて、検出部１４０の下方から液体培地３１０および抗生物質を含む液体培地３２０中の液体を吸引する。
このようにして、参照対象および検出対象のそれぞれのメンブレンフィルタ１３０上に対象菌３４０および増殖菌３７０、対象菌３４０および増殖抑制菌３８０が捕集される。また、死んだ細胞は、細胞膜が弱体化するため、吸引力を制御することで、死菌をばらばらにして、膜(メンブレンフィルタ１３０)を通過させることもできる。このような微生物の捕集工程により、微生物を含む液体培地のうち、微生物と液体培地等とを分け、この微生物(とくに生菌)を有意に微小な領域に集めることができる。
【００３７】
［工程（４）］
続いて、微生物の生死を判別する試薬（蛍光試薬３３０）を液溜め部に導入する（Ｓ１０８、図２（ｅ）、図３（ｅ））。蛍光試薬３３０としては、たとえば、生菌のみを蛍光染色する試薬が用いられる。
蛍光試薬３３０の導入量は、特に限定されず、微生物（対象菌３４０、増殖菌３７０、増殖抑制菌３８０）が蛍光試薬３３０と接触する量であればよい。
【００３８】
ここで、微生物の生死を判別する方法としては、これに限らず、例えば、市販の蛍光染色試薬を用いて生死菌の判別をする方法を用いることができる。生死菌を判別する方法には、（ａ）複合蛍光染色法、または（ｂ）生菌染色法と全菌染色法との組み合わせた方法などがある。
（ａ）に示す方法の場合、蛍光染色試薬として、生死菌で発光色の違う蛍光試薬が用いられる。具体的には、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のヨウ化プロビジウム色素を含む複合蛍光染色試薬を用いることができる。この他にも、死菌の標識として、ＹＯＹＯ−１、７ＡＤＤ、生菌の標識として、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ、ＬＤＳ７５１などを含む、蛍光染色試薬を用いることができる。
（ｂ）に示す方法の場合、ＤＡＰＩ染色法、ＥＢ染色法、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ１染色法などの全菌染色法と、ＣＴＣ染色法、ＣＦＤＡ染色法などの生菌染色法とを組み合わせて用いることができる。例えば、ＤＡＰＩ染色法とＣＦＤＡ染色法との二重染色により、生死菌の判別をする。
【００３９】
［工程（５）］
続いて、蛍光観察する前に、各検出部１４０内部を洗浄する。洗浄するには、たとえば、検出部１４０に洗浄液を導入し、この洗浄液を吸収除去する。この後、センサーチップ１００を濃縮装置１６０から検出装置１９０に移動させる。そして、検出装置１９０を用い、センサーチップ１００の検出部１４０中の微生物を蛍光観察する（Ｓ１１０、図２（ｆ）、図３（ｆ））。本工程では、たとえば、光学倍率を掛けて、蛍光観察する。
蛍光試薬３３０は、たとえば生菌３５０のみ蛍光染色する。そのため、図２（ｆ）、図３（ｆ）に示すように、参照対象の検出部１４０においては、対象菌３４０および増殖菌３７０が生菌３５０として検出される。一方、検出対象の検出部１４０においては、増殖抑制菌３８０は死菌３６０であるため検出されず、対象菌３４０のみが生菌３５０として検出される。そして、微小領域に捕集した微生物数(たとえば生菌数)を計数して、参照対象の検出部１４０に対する、検出対象の検出部１４０の生菌数比を算出する。
【００４０】
ここで、本実施の形態の微生物検出方法により得られた、生菌数比について説明する。
本実施の形態においては、生菌数比は、微生物の感受性を示すパラメータである。
この生菌数比の定義を以下に示す。
（ｉ）生菌数比が１．０±α（対数換算）以内の場合は、検出対象の微生物は抗生物質に対して感受性を示さない基準とする(つまり、微生物に耐性が有る場合には、生菌数比は、ほぼ１かそれ以上になる)。
（ｉｉ）生菌数比が１．０−α（対数換算）より小さい範囲では、検出対象の微生物は抗生物質に対して感受性を示す基準とする。
ここで、αは、培養時間、培養温度および抗生物質の濃度等により決定する。αとしては、たとえば、０．５以下、さらには０．２以下と設定することができる。
【００４１】
生菌数比を算出する方法について説明する。本実施の形態において、生菌数比を算出するには、たとえば、（１）生菌数をカウントして生菌数比を算出してもよいし、（２）生菌を示す画像データの蛍光面積の比を換算して生菌数比を算出してもよい。
（１）生菌数から生菌数比を算出する方法について説明する。まず、１視野当たりの生菌数をカウントし、検出部１４０の開口面積（ろ過面積）／１視野あたりの面積を掛ける。つまり、次の式により、生菌数が算出される。生菌数＝（１視野当たりの生菌数の平均値）×（ろ過面積）／１視野あたりの面積。そして、第１の生菌数（参照対象の検出部１４０中の生菌数）に対する第２の生菌数（検出対象の検出部１４０中の生菌数）の生菌数比を算出する。
（２）蛍光面積の比を換算して生菌数比を算出する方法について説明する。まず、各検出部１４０の生菌３５０を示す蛍光画像データを得る。そして、１視野当たりの蛍光面積を算出し、検出部１４０の開口面積（ろ過面積）／１視野あたりの面積を掛ける。つまり、次の式により、蛍光面積が算出される。蛍光面積＝（１視野当たりの蛍光面積の平均値）×（ろ過面積）／１視野あたりの面積。そして、第１の蛍光面積（参照対象の検出部１４０中の蛍光面積）に対する第２の蛍光面積（検出対象の検出部１４０中の蛍光面積）の蛍光面積比を算出し、この蛍光面積比を換算して生菌数比とする。
【００４２】
以上のように、参照対象の検出部１４０に対する、検出対象の検出部１４０の生菌数比を算出することで、微生物の高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。
【００４３】
本実施の形態の効果を説明する。
本実施の形態の微生物検出方法においては、濃縮、培養、蛍光観察等の一連の工程を、センサーチップ１００上で実施することができる。このため、迅速に微生物を検出することができる。そのため、全体の検出時間を短縮することができる。
また、本実施の形態によれば、濃縮工程や微生物を微小領域に捕集し蛍光観察する工程を行っているので、その濃縮効果のために、微小な微生物数の変化を極めて正確に検出できる。
【００４４】
本実施の形態において、検出対象の検出部１４０では、抗生物質を含む液体培地中で微生物を振盪培養している。これにより、抗生物質の増殖阻害作用が強まり、参照対象の検出部１４０中の生菌数は減少する。そのため、検出対象の検出部１４０において、培養前と培養後との生菌数比の違いが明瞭となり、抗生物質に感受性を示す微生物を迅速に検出することができる。
さらに、参照対象の検出部１４０では、抗生物質を含まない液体培地中で微生物を振盪培養している。これにより、微生物の増殖速度が早くなり、参照対象の検出部１４０中の生菌数は増加する。そのため、培養後において、検出対象と参照対象との生菌数比の違いが明瞭となり、より高感度かつ迅速に微生物の感受性を検出することができる。
【００４５】
このように、同じ試料（微生物を含む液体）を前提として、抗生物質を含まない条件下の第１の生菌数と抗生物質を含む条件下の第２の生菌数との生菌数比を算出することにより、微生物の抗生物質に対する感受性を高感度に検出することができる。
【００４６】
本実施の形態では、培養前に、メンブレンフィルタ１３０上に微生物を微小領域に濃縮している。このため、試料中の微生物の濃度が、非常に低濃度でも、微生物の感受性を検出することができる。さらには、本実施の形態の培養工程により、生菌数比の差が明瞭となり、高感度に微生物の感受性を検出することができる。そのため、試料中の微生物の濃度に依存せずに、微生物の感受性を検出できる。例えば、試料中の微生物の初期濃度が１０個／ｍｌ以上程度、さらには１個／ｍｌ以上程度から、検出装置１９０により、微生物を検出できる。
【００４７】
本実施の形態では、濃縮装置１６０および検出装置１９０を用いて、センサーチップ１００上で培養、濃縮、蛍光観察を統合して実施できる。そのため、本実施の形態においては、工程の簡便化、作業の効率化および汚染や感染の危険性の軽減を図ることができる。また、センサーチップ１００中で全ての工程について処理をすることができるため、汚染の恐れも少ない上、実験者の安全が図れる。
【００４８】
また、本実施の形態の薬剤感受性の検出方法では、抗生物質に接触した微生物を捕集し、この捕集した微生物の殺菌作用による生死を直接検出することで、微生物の薬剤感受性を迅速に検査することができる。培養法やＰＣＲ法等と比べると検査に要する試料の処理工程が少ないため、非常に簡単である。さらに、培養法を除くほかの検査方法と比べると使用する試薬が少ないため、ランニングコストを低く抑えることも可能である。また、この薬剤感受性の検出方法は、院内感染原因菌の検出、感染症診断および抗菌剤の迅速感受性試験等に応用することもできる。
【００４９】
（第２の実施の形態）
第２の実施の形態の微生物検出方法について、以下説明する。
第２の実施の形態の微生物検出方法は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する方法である。つまり、第１の実施の形態の微生物検出方法により得られた生菌数比を示すデータの結果から最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する。
【００５０】
本実施の形態の微生物検出方法は、第１の検出部および第２の検出部からなる第１の検出部群を、複数備えるチップ（センサーチップ１００）を用い、微生物を濃縮する工程において、第１の検出部および第２の検出部に同一の被検用の液体を分けて導入し、微生物を培養する工程において、第１の検出部群の間で液体培地中の生理活性物質（第１の抗生物質）の濃度を異ならせ、微生物を観察する工程において、生理活性物質（第１の抗生物質）の濃度に対応する、第１の生菌数に対する第２の生菌数の生菌数比を算出する工程を含む。
このとき、第１の検出部は、参照対象の検出部１４０を表し、第２の検出部は、検出対象の検出部１４０を表す。また、第１の生菌数は、第１の検出部中の生菌数を表し、第２の生菌数は、第２の検出部の生菌数を表す。
【００５１】
さらに、本実施の形態の微生物検出方法は、第３の検出部をさらに備えるチップ（センサーチップ１００）を用い、微生物を濃縮する工程において、第１の検出部、第２の検出部および第３の検出部に同一の被検用の液体を分けて導入し、微生物を培養する工程において、第３の検出部では、第２の検出部と異なる種類の生理活性物質（第２の抗生物質）を含む液体培地を液溜め部に導入し、液体培地中に浮遊している微生物を培養し、微生物を観察する工程において、さらに、第１の検出部内の微生物の第１の生菌数と第３の検出部内の微生物の第３の生菌数とを測定し、第１の生菌数に対する前記第３の生菌数の生菌数比を算出する工程を含む。
このとき、第３の検出部は、第２の検出部と異なる、検出対象の検出部１４０を表す。また、第３の生菌数は、第３の検出部中の生菌数を表す。また、第１の検出部、第２の検出部および第３の検出部から第２の検出部群が構成されている。
【００５２】
本実施の形態では、複数の検出部を備えるチップとして、図４に示す縦横の検出部１４０の数が３個×６個である、センサーチップ１００を用いることができる。
図４に示すＢ−Ｂ矢視方向の検出部１４０においては、抗生物質を含まない液体培地、第１の抗生物質を含む液体培地、第２の抗生物質を含む液体培地を順に導入する。また、図４に示すＡ−Ａ矢視方向の検出部１４０においては、第１の抗生物質の濃度および第２の抗生物質の濃度が６つの異なる濃度とする。
このようにして、２種類の第１の抗生物質および第２の抗生物質について、第１の濃度から第６の濃度（第１の濃度＞第６の濃度）までに対応する、複数個の生菌数のデータを得ることができる。
【００５３】
続いて、第１の実施の形態と同様にして、抗生物質を含まない条件下の第１の生菌数と第１の抗生物質を含む条件下の第２の生菌数との、第１の生菌数比を算出する。さらに、第１の濃度から第６の濃度に対応する第１の生菌数比を算出する。これらの生菌数比は、（試料中の微生物の初期濃度が同一の試料）を前提とする。
【００５４】
続いて、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出するには、得られた生菌数比を示すデータの結果から、第１の抗生物質に対する微生物の感受性の有無を判断する。
たとえば、第１の生菌数比のうち、第１の濃度から第４の濃度では、感受性を示す基準の値であり、他方、第５の濃度および第６の濃度では、感受性を示さない基準の値であるとする。この場合、第１の抗生物質に対する微生物の第１のＭＩＣは、第４の濃度と決定することができる。さらに、第４の濃度と第５の濃度との濃度間で、濃度をふって、第１の生菌数比を算出し、感受性の有無の結果から、より正確に第１のＭＩＣを算出することができる。
【００５５】
さらに、前述の第１の生菌数比にくわえ、抗生物質を含まない条件下の第１の生菌数と第２の抗生物質を含む条件下の第３の生菌数との、第２の生菌数比を算出する。さらに、第１の濃度から第６の濃度に対応する第２の生菌数比を算出する。この第２の生菌数比の結果から、第２の抗生物質に対する微生物の第２のＭＩＣを算出することができる。ここで、これらの生菌数比は、（試料中の微生物の初期濃度が同一の試料）を前提とする。
以上により、第２の実施の形態によれば、同時に２種類のＭＩＣを算出できる。つまり、第１の抗生物質に対する微生物の第１のＭＩＣおよび第２の抗生物質に対する微生物の第２のＭＩＣを算出することができる。
【００５６】
このように、複数の検出部１４０を備えるセンサーチップ１００を用いて、本実施の形態の微生物検出方法を実施することにより、抗生物質に対するＭＩＣを迅速かつ高感度に決定することができる。また、本実施の形態によれば、複数種類の抗生物質に対するＭＩＣを同時に検出することができる。
【００５７】
また、本実施の形態の薬剤感受性を調べる方法を利用すると、微生物の種類が未知の場合には、準備した試料について薬剤耐性菌の有無の判別をすることができるとともに、ＭＩＣを調べることもできる。微生物の種類が未知の場合であっても、複数種類の抗生物質の感受性反応や選択培地の使用により、未知の微生物の菌種を大まかに予想することもできる。一方、微生物の種類が既知の場合には、上述のとおり、抗生物質の薬剤感受性およびＭＩＣを調べることができる。
【００５８】
次に、本実施の形態の微生物検出方法により、得られたＭＩＣの結果から、生理活性物質（抗生物質）に対する微生物の耐性の有無を評価した、データを生成する。
まず、第２の実施の形態の微生物検出方法により、生菌数比を示すデータの結果から最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する。そして、生理活性物質（抗生物質）の最小発育阻止濃度が所定濃度以上である場合には、微生物が前記生理活性物質（抗生物質）に対して耐性を示すと判断する。このとき、生理活性物質（抗生物質）に対する微生物の耐性の有無を示すデータを生成する。
【００５９】
ここで、耐性を示すと判断するための、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の基準を以下の（１）、（２）に示す。
（１）ＭＩＣがＲ［μｇ／ｍｌ］以上である場合には、抗生物質に対して微生物が耐性ありと判断する。
（２）ＭＩＣがＲ［μｇ／ｍｌ］未満である場合には、抗生物質に対して微生物が耐性無しと判断する。
【００６０】
また、Ｒ［μｇ／ｍｌ］以上である場合に、耐性の度合について段階ごとに評価してもよい。たとえば、Ｒが１以上、１０未満［μｇ／ｍｌ］の場合には、低程度の耐性あり（ＬＲ（Ｌｏｗ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ））と評価し、Ｒが１０以上、２５未満［μｇ／ｍｌ］の場合には、中程度の耐性あり（ＭＲ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ））と評価し、Ｒが２５以上［μｇ／ｍｌ］の場合には、高程度の耐性あり（ＨＲ（Ｈｉｇｈｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ））と評価する。
【００６１】
さらに、本実施の形態においては、このような微生物の耐性の有無を示すデータから、微生物が耐性を示さない生理活性物質（抗生物質）を選択することができる。
なお、実際には、たとえ微生物が耐性を示したとしても、そのような抗生物質も使用する可能性がある。この場合には、本実施の形態においては、低程度の耐性から中程度の耐性を示す抗生物質を選択することができる。
【００６２】
以上のように、本実施の形態では、複数種類の抗生物質に対して、簡便かつ迅速に、微生物の感受性、ＭＩＣおよび耐性の有無についての検査結果が得られる。このため、臨床現場において、抗生物質投与の迅速かつ的確な判断が可能となる。そのため、術後感染症、敗血症、薬剤耐性菌（ＭＲＳＡ等）による院内感染等のリスクが軽減される。
【００６３】
このような医療環境の観点から、センサーチップ１００の検出部１４０の個数が多い方が好ましい。たとえば、たとえば、９２個（１２個（１１種類の抗生物質＋ネガティブコントロール）×８個（８種類の濃度））の検出部１４０を設けることにより、複数種類の抗生物質について、同時かつ迅速に感受性を高感度に検出することができる。
【００６４】
また、本実施の形態においては、液体培地中で微生物を振盪培養している。そのため、液体培地中の抗生物質の濃度が均一となる結果、検出対象中の微生物に対する抗生物質の効果が再現性よく得られる。このため、本実施の形態によれば、生菌数、生菌数比のバラツキが小さくなり、再現性よく微生物の感受性、ＭＩＣ等の結果が得られる。
【００６５】
一般的に、術後感染症や院内感染等に際し、培養法による薬剤感受性試験により適切な抗生物質が選択され、この抗生物質が患者に処置されている。ところが、培養法は通常１日以上かかるため、迅速に、抗生物質の選択を行うことが困難である。このため、迅速の観点から、多種類の抗生物質を用いると、新たな耐性菌の出現の原因となる上、副作用など患者への負担が大きくなる要因となる。
【００６６】
これに対して、本実施の形態においては、複数種類の抗生物質について、同時かつ迅速に感受性を高感度に検出することができる。そのため、薬剤耐性菌などによる院内感染が発生した場合も同様で、迅速に感受性試験を実施できる。また、外科手術後、患者は術後感染症の脅威に晒され、致命的な敗血症に至る場合においても、臨床医は最も効果的な抗生物質を可能な限り早く見つけて、処置をすることができる。また、本実施の形態の微生物検出方法は、臨床医が患者一人分の感受性試験を緊急に行いたいといった用途にも利用できる。
【００６７】
（第３の実施の形態）
本実施の形態の微生物検出方法を用いた、抗菌活性を示す物質のスクリーニング方法について説明する。この迅速スクリーニングは、製薬、あるいは、抗菌物質の作製などに利用できる。
第３の実施の形態では、生理活性物質としては、抗菌活性の有無が未確認の未知物質を用いる。未知物質としては、たとえば、放線菌の抽出液、既知の化合物、抗菌活性を示す化合物の誘導体、タンパク質等を挙げることができる。
【００６８】
第３の実施の形態の未知物質の抗菌活性を調べる方法は、以下の工程を含む。まず、少なくとも一種の既知の微生物を含む試料を複数の検出部１４０に導入する。続いて、微生物を培養する工程において、ネガティブコントロールとして液体培地のみの場合、ポジティブコントロールとして既知の抗生物質を含む液体培地の場合、検出対象として未知物質を含む液体培地の場合の３つの液体培地を、３つの各検出部１４０に導入して微生物を振盪培養する。続いて、ネガティブコントロールに対するポジティブコントロールの第３の生菌数比およびネガティブコントロールに対する検出対象の第４の生菌数比を算出する。
このとき、抗菌活性を示す基準を第３の生菌数比とする。そして、以下に示す基準により、未知物質の抗菌活性の有無を判断することができる。
（１）第４の生菌数比が、第３の生菌数比と同程度または第３の生菌数比以上の場合、未知物質は、抗菌活性あり。
（２）第４の生菌数比が、第３の生菌数比より小さい場合には、未知物質は、抗菌活性無し。
【００６９】
また、既知抗生物質と未知物質との間で得られた上記検出結果を比較して、未知物質の殺菌性を示すデータを生成する。これにより、既知微生物Ｄ１に対する既知抗生物質Ｒ１の殺菌作用Ｙ１と、同質の殺菌作用Ｙ１を有すると考えられる未知物質をスクリーニングすることができる。また、既知微生物Ｄ２が異なれば、既知抗生物質Ｒ１は殺菌作用Ｙ２となる場合がある。このときには、未知物質は同質の殺菌作用Ｙ２を有するものとしてスクリーニングされる。
【実施例】
【００７０】
本実施例は、本実施の形態の微生物の感受性および微生物のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）の検出ついての具体例を示す。
（実施例１）
実施例１では、図１０から図１２に示すように、微生物の感受性を検出するとともに、検出可能な微生物の濃度を測定した。
検出対象成分： 大腸菌
検出方法： 蛍光顕微鏡観察
蛍光染色： 複合蛍光染色試薬
また、実施例１では、図４に示すセンサーチップ１００、図７に示す濃縮装置１６０および図９に示す検出装置１９０を用いた。
生菌数測定： 生菌数＝（１視野当たりの生菌数の平均値）×（フィルタ面積）／（１視野の面積）
検出精度： 本発明のフィルタ法（個／ｍｌ）と混釈平板法（ＣＦＵ／ｍｌ）との相関係数は、０．９５。
液溜め容量： １ｍｌ
フィルタ径： ３ｍｍ
温度： ３７℃（±１℃）
対物レンズ： ×１０
【００７１】
まず、大腸菌の濃度が異なる６つの被検用の液体試料を準備する。そして、大腸菌の初期濃度が同じ被検用の液体試料を分けて、参照対象および検出対象のセンサーチップ１００の各検出部１４０に導入する。６種類の大腸菌の初期濃度に応じて、６セットの参照対象および検出対象を作製する。続いて、濃縮装置１６０の吸引機構１６２を用いて試料内の大腸菌を、メンブレンフィルタ１３０上に濃縮した。続いて、参照対象の検出部１４０には、液体培地８００μｌと生理食塩水１００μｌとを導入した。一方、検出対象の検出部１４０には、液体培地８００μｌと抗生物質（セファム系抗生物質製剤「パンスポリン」武田薬品工業社製、濃度：１０ｇ／Ｌ）１００μｌとを導入した。続いて、濃縮装置１６０の培養機構１６４を用い、培養温度３７℃で、培養時間の条件を０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎと変えて、センサーチップ１００中の大腸菌を振盪培養した。
続いて、吸引機構１６２を用いて、メンブレンフィルタ１３０上に大腸菌を捕捉した。続いて、各検出部１４０に、染色液（複合蛍光染色試薬）を導入した。
ここで、複合蛍光染色試薬として、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。複合蛍光染色試薬は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９色素と赤色蛍光のヨウ化プロビジウム色素を含んでおり、これらは膜透過性に違いがある。ＳＹＴＯ９は生死菌両方の膜を透過し緑色に染色する。一方、ヨウ化プロビジウムは死菌のダメージを受けた膜のみを透過し赤色に染色する。また、両方の色素がバクテリア中に存在すると、ＳＹＴＯ９の蛍光は減衰する。従って、細菌が生存していれば、複合蛍光試薬は緑色に蛍光し、細菌が死亡しているなら、複合蛍光試薬は、赤色に蛍光する。分子化学反応に、１０分要した。
その後、吸引機構１６２を用い、洗浄液（ＰＢＳ）を導入して検出部１４０内部を洗浄した。この後、検出装置１９０を用い、センサーチップ１００の各検出部１４０について蛍光顕微鏡観察を行った。このとき、各検出部１４０の大腸菌の生菌数を算出し、その結果から、参照対象と検出対象との生菌数比を算出した。
【００７２】
図１０は、参照対象（抗生物質を含まない）の生菌数の時間変化を示す。横軸は、時間（ｍｉｎ）を表し、縦軸は、フィルタ法により測定した大腸菌の生菌数（対数）を表す。ここでは、大腸菌の初期濃度（試料中の濃度）は、混釈平板法により測定した場合では、黒丸が９．４×１０Ｅ４（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、黒三角が２．０×１０Ｅ４（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、黒菱形が３．５×１０Ｅ３（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、白丸が１．２×１０Ｅ３（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、白三角が６．２×１０Ｅ２（ＣＦＵ／ｍｌ）を表し、白四角が６．０×１０Ｅ１（ＣＦＵ／ｍｌ）を表す。
図１１は、検出対象（抗生物質を含む）の生菌数の時間変化を示す。図中の記号は、図１０と同じである。
図１２は、参照対象と検出対象との生菌数比の時間変化を示す。図中の縦軸が、生菌数比を表す以外は、図中の記号は、図１０と同じである。
【００７３】
このように、全ての初期濃度において、培養時間が３０ｍｉｎ程度で、生菌数比が１よりかなり小さくなっている。そのため、本発明の微生物検出方法によれば、試料の初期濃度が、少なくとも、１個／ｍｌから１０Ｅ５個／ｍｌ程度範囲で微生物の感受性を高感度に検出することができることが分かった。また、本発明の微生物検出方法によれば、培養時間が３０ｍｉｎから６０ｍｉｎ程度で、微生物の感受性を迅速に検出することができることが分かった。
【００７４】
（実施例２）
実施例２では、図１３から図１５に示すように、微生物のＭＩＣの検出を行った。
実施例２は、実施例１における試料の大腸菌の初期濃度を変化させた条件に代えて、抗生物質の濃度を変化させた条件にした以外、実施例１と同様に行った。
【００７５】
図１３は、参照対象（抗生物質を含まない）の生菌数の時間変化を示す。横軸は、時間（ｍｉｎ）を表し、縦軸は、フィルタ法により測定した大腸菌の生菌数（対数）を表す。ここでは、検出対象の抗生物質の濃度は、黒丸が１０Ｅ３（μｇ／ｍｌ）を表し、黒三角が１０Ｅ２（μｇ／ｍｌ）を表し、黒四角が１０Ｅ１（μｇ／ｍｌ）を表し、黒菱形が１０Ｅ０（μｇ／ｍｌ）を表し、白丸が１０Ｅ−１（μｇ／ｍｌ）を表し、白三角が１０Ｅ−２（μｇ／ｍｌ）を表す。
図１４は、検出対象（抗生物質を含む）の生菌数の時間変化を示す。図中の記号は、図１３と同じである。
図１５は、参照対象と検出対象との生菌数比の時間変化を示す。図中の縦軸が、生菌数比を表す以外は、図中の記号は、図１３と同じである。
また、図１６は、抗生物質の濃度が１０Ｅ１（μｇ／ｍｌ）である、参照対象および検出対象の検出部１４０中の観察結果を示す図である。
【００７６】
図１５の結果から、抗生物質の濃度が、１０Ｅ−１および１０Ｅ−２（μｇ／ｍｌ）の場合には、生菌数比は、ほぼ１である。一方、抗生物質の濃度が、１０Ｅ０（μｇ／ｍｌ）以上の場合には、生菌数比は、１よりかなり小さくなる。このため、パンスポリンに対する大腸菌のＭＩＣは、１０Ｅ０（μｇ／ｍｌ）以下程度であることがわかった。この範囲でさらに、抗生物質の濃度をふって、再度検出することにより、正確なＭＩＣを検出することがわかった。また、培養時間が３０ｍｉｎから６０ｍｉｎ程度で、生菌数比の差が顕著になるため、迅速に、微生物のＭＩＣを検出することができることが分かった。
【００７７】
（比較例）
従来の希釈法により、パンスポリンに対する大腸菌のＭＩＣを測定した。被検薬剤の２倍希釈系列についてＬＢ液体培地を用いて調整後、これに１０Ｅ５または１０Ｅ６(ｃｆｕ／ｍｌ)の菌(大腸菌)を接種し、３７℃一夜培養を行う。この後、菌の発育阻止が認められる薬剤(パンスポリン)の最小濃度をＭＩＣとした。
この結果を、図１７に示す。ＭＩＣは、一回目が３１０（ｎｇ／ｍｌ）、二回目が６３０（ｎｇ／ｍｌ）だった。この希釈法によるＭＩＣは、本発明による結果とほぼ同一となることが分かった。しかしながら、従来の希釈法では、試料の準備からＭＩＣを決定するまでに、１８間以上かかった。これに対して、本発明では、ＭＩＣを決定するまでに、試料の準備工程、蛍光観察工程の時間を加えても、１．５時間程度であった。
【００７８】
（参照例）
参照例では、実施例１の液体培地を用いて培養せず、試料中にパンスポリンを導入したのち、蛍光観察した。その結果、生菌数、生菌数比等の結果にばらつきが出た。また、感受性を示す生菌数比を得るために、試料中にパンスポリンを導入する時間が最低でも６０分以上必要となることが分かった。
これに対して、本発明に係る微生物検出方法は、液体培地を用いた培養工程を含むので、参照対象と検出対象との生菌数比の違いが明瞭になり、迅速かつ高感度に、微生物の感受性を検出することができた。
【００７９】
以上、図面を参照して本発明の実施の形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
たとえば、吸引機構１６２は、センサーチップ１００のメンブレンフィルタ１３０上の微生物が乾燥しないように、検出部１４０中の液体の水位を調節してもよい。また、吸引機構１６２は、微生物が乾燥しないように、所定間隔で液体(液体培地、試料、洗浄液等)を添加してもよい。
【００８０】
また、センサーチップ１００は、耐熱性を有する材料で構成されてもよい。これにより、センサーチップ１００についてオートクレーブ等を実施することにより、センサーチップ１００を繰り返し使用可能となる。なお、センサーチップ１００は、安全性の観点から、使い捨ててもよい。
【００８１】
また、メンブレンフィルタ１３０と下板１２０との間に、Ｏリング等を設けてもよい。これにより、液漏れ防止機能をさらに向上させることができる。または、メンブレンフィルタとチップ素材を直接、接着剤や超音波接合などで接合をしてもよい。また、図５に示すように、検出部１４０の断面形状は、テーパ状となっている。このため、検出部１４０の下面開口部分のメンブレンフィルタ１３０上に、微生物が効率良く捕集される。
【００８２】
また、本実施の形態に係る生理活性物質は、上述の抗生物質またはスクリーニング用試料等に限定されず、たとえば、ファージ等であってもよい。ファージに接触した微生物の溶菌による生菌数比を算出することにより、微生物の菌種を迅速に特定することができる。ファージを用いた特定菌の検出方法は、食品衛生検査、環境衛生分析および感染症診断等に応用することできる。
【符号の説明】
【００８３】
１００ センサーチップ
１１０ 上板
１２０ 下板
１３０ メンブレンフィルタ
１４０ 検出部
１５０ チップ台
１５２ 開口部
１６０ 濃縮装置
１６２ 吸引機構
１６４ 培養機構
１６６ 真空ポンプ
１６８ 廃液タンク
１７０ 洗浄液タンク
１７２ 送液ポンプ
１７４ 培養液タンク
１７６ 蛍光試料タンク
１７８ フィン
１８０ ヒータ
１８２ 振盪器
１８４ 送液用チューブ
１８６ 廃液用チューブ
１８８ 吸引プラグ
１９０ 検出装置
１９２ 移動ステージ
１９４ 励起用光源
１９５ 励起光用光学フィルタ
１９６ 対物レンズ
１９８ ダイクロイックミラー
２００ 光学フィルタ
２０２ 結像レンズ
２０４ 検知機構
２０６ ＰＣ
２０８ 仕切り板
２１０ カバー
３００ 試料
３１０ 抗生物質を含まない液体培地
３２０ 抗生物質を含む液体培地
３３０ 蛍光試薬
３４０ 対象菌
３５０ 生菌
３６０ 死菌
３７０ 増殖菌
３８０ 増殖抑制菌
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を溜める液溜め部と、
前記液溜め部の下面に設けられた開口部と、
前記開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタと、を有する検出部を備えるチップを準備し、
前記液溜め部の中の前記被検用の液体を、前記メンブレンフィルタの下方から除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を濃縮する工程と、
生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養する工程と、
前記メンブレンフィルタの下方から前記液体培地を除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を捕集する工程と、
前記微生物の生死を判別する試薬を前記液溜め部に導入する工程と、
前記チップ内の前記微生物を観察する工程と、を含む、微生物検出方法。
【請求項２】
複数の前記検出部を備える前記チップを用いる、請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記微生物を濃縮する工程において、第１の前記検出部および第２の前記検出部に同一の前記被検用の液体を分けて導入し、
前記微生物を培養する工程において、第１の前記検出部では、前記生理活性物質を含まない液体培地を前記液溜め部に導入し、第２の前記検出部では、前記生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養し、
前記微生物を観察する工程において、第１の前記検出部内の前記微生物の第１の生菌数と前記２の検出部内の前記微生物の第２の生菌数とを算出する工程をさらに含む、請求項２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記生理活性物質が、抗生物質である、請求項１から３のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項５】
第１の前記検出部および第２の前記検出部からなる第１の検出部群を、複数備える前記チップを用い、
前記微生物を培養する工程において、前記第１の検出部群の間で前記液体培地中の前記生理活性物質の濃度を異ならせ、
前記微生物を観察する工程において、前記生理活性物質の濃度に応じて、前記第１の生菌数に対する前記第２の生菌数の生菌数比を算出する工程をさらに含む、請求項３または４に記載の微生物検出方法。
【請求項６】
第３の前記検出部をさらに備える前記チップを用い、
前記微生物を濃縮する工程において、第１の前記検出部、第２の前記検出部および第３の前記検出部に同一の前記被検用の液体を分けて導入し、
前記微生物を培養する工程において、第３の前記検出部では、第２の前記検出部と異なる種類の生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養し、
前記微生物を観察する工程において、第１の前記検出部内の前記微生物の第１の生菌数と前記第３の検出部内の前記微生物の第３の生菌数とを測定し、前記第１の生菌数に対する前記第３の生菌数の生菌数比を算出する工程をさらに含む、請求項３から５のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の微生物検出方法は、前記生菌数比を示すデータの結果から最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する方法であり、
前記生理活性物質の前記最小発育阻止濃度が所定濃度以上である場合には、前記微生物が前記生理活性物質に対して耐性を示すと判断するとともに、前記生理活性物質に対する前記微生物の耐性の有無を示すデータを生成する、微生物検出方法。
【請求項８】
前記生理活性物質に対する前記微生物の耐性の有無を示すデータから、前記微生物が耐性を示さない前記生理活性物質を選択する工程をさらに含む、請求項７に記載の微生物検出方法。
【請求項９】
前記微生物を培養する工程は、前記チップを振盪させた状態で、前記微生物を培養する、請求項１から８のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項１】
少なくとも一種の微生物を含む被検用の液体を溜める液溜め部と、
前記液溜め部の下面に設けられた開口部と、
前記開口部を覆うように設けられたメンブレンフィルタと、を有する検出部を備えるチップを準備し、
前記液溜め部の中の前記被検用の液体を、前記メンブレンフィルタの下方から除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を濃縮する工程と、
生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養する工程と、
前記メンブレンフィルタの下方から前記液体培地を除去して、前記メンブレンフィルタ上に前記微生物を捕集する工程と、
前記微生物の生死を判別する試薬を前記液溜め部に導入する工程と、
前記チップ内の前記微生物を観察する工程と、を含む、微生物検出方法。
【請求項２】
複数の前記検出部を備える前記チップを用いる、請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記微生物を濃縮する工程において、第１の前記検出部および第２の前記検出部に同一の前記被検用の液体を分けて導入し、
前記微生物を培養する工程において、第１の前記検出部では、前記生理活性物質を含まない液体培地を前記液溜め部に導入し、第２の前記検出部では、前記生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養し、
前記微生物を観察する工程において、第１の前記検出部内の前記微生物の第１の生菌数と前記２の検出部内の前記微生物の第２の生菌数とを算出する工程をさらに含む、請求項２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記生理活性物質が、抗生物質である、請求項１から３のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項５】
第１の前記検出部および第２の前記検出部からなる第１の検出部群を、複数備える前記チップを用い、
前記微生物を培養する工程において、前記第１の検出部群の間で前記液体培地中の前記生理活性物質の濃度を異ならせ、
前記微生物を観察する工程において、前記生理活性物質の濃度に応じて、前記第１の生菌数に対する前記第２の生菌数の生菌数比を算出する工程をさらに含む、請求項３または４に記載の微生物検出方法。
【請求項６】
第３の前記検出部をさらに備える前記チップを用い、
前記微生物を濃縮する工程において、第１の前記検出部、第２の前記検出部および第３の前記検出部に同一の前記被検用の液体を分けて導入し、
前記微生物を培養する工程において、第３の前記検出部では、第２の前記検出部と異なる種類の生理活性物質を含む液体培地を前記液溜め部に導入し、前記液体培地中に浮遊している前記微生物を培養し、
前記微生物を観察する工程において、第１の前記検出部内の前記微生物の第１の生菌数と前記第３の検出部内の前記微生物の第３の生菌数とを測定し、前記第１の生菌数に対する前記第３の生菌数の生菌数比を算出する工程をさらに含む、請求項３から５のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の微生物検出方法は、前記生菌数比を示すデータの結果から最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を算出する方法であり、
前記生理活性物質の前記最小発育阻止濃度が所定濃度以上である場合には、前記微生物が前記生理活性物質に対して耐性を示すと判断するとともに、前記生理活性物質に対する前記微生物の耐性の有無を示すデータを生成する、微生物検出方法。
【請求項８】
前記生理活性物質に対する前記微生物の耐性の有無を示すデータから、前記微生物が耐性を示さない前記生理活性物質を選択する工程をさらに含む、請求項７に記載の微生物検出方法。
【請求項９】
前記微生物を培養する工程は、前記チップを振盪させた状態で、前記微生物を培養する、請求項１から８のいずれかに記載の微生物検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１６】
【公開番号】特開２０１２−２３１６７８（Ｐ２０１２−２３１６７８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１０７５９（Ｐ２００９−２１０７５９）
【出願日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【出願人】（５０６０２７９４１）株式会社ＥＳＰＩＮＥＸ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【出願人】（５０６０２７９４１）株式会社ＥＳＰＩＮＥＸ (6)
【Ｆターム（参考）】
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