微生物検出装置、検出方法、及びそれに用いられる試料容器
【課題】多量のサンプル中に含まれる少数の微生物を迅速・高精度・高感度・簡便に検出・定量する。
【解決手段】上層の第一層１１６を親水性メンブレンフィルターとして、その下に、湿潤剤を用いずにかつ陰圧を生じさせることで水溶液のろ過が可能な疎水性メンブレンフィルター１１７を第二層として有する二層構造メンブレンフィルター１０１を底部に備えた試料容器１０２を用い、吸引部１０５により生じる陰圧によって、多量のサンプル水溶液をろ過し、サンプル水溶液中の微生物を親水性メンブレンフィルターで捕捉する。また陰圧から常圧にした後、微生物溶解液を加えて、一定時間微生物溶解液を疎水性メンブレンフィルター上で保持する。その後、発光試薬１１４の入った反応容器１１３に分注して、発光を検出することで微生物を検出する。
【解決手段】上層の第一層１１６を親水性メンブレンフィルターとして、その下に、湿潤剤を用いずにかつ陰圧を生じさせることで水溶液のろ過が可能な疎水性メンブレンフィルター１１７を第二層として有する二層構造メンブレンフィルター１０１を底部に備えた試料容器１０２を用い、吸引部１０５により生じる陰圧によって、多量のサンプル水溶液をろ過し、サンプル水溶液中の微生物を親水性メンブレンフィルターで捕捉する。また陰圧から常圧にした後、微生物溶解液を加えて、一定時間微生物溶解液を疎水性メンブレンフィルター上で保持する。その後、発光試薬１１４の入った反応容器１１３に分注して、発光を検出することで微生物を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出装置、検出方法、及びそれに用いられる試料容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の検出や微生物数の定量は、製薬工場や食品工場、再生医療施設などにおいて、製品への微生物汚染を未然に防ぐ安全衛生管理として実施されている。特に微生物数の定量は、日本薬局方の規定により、製薬工場において製品や原料に対して実施されると共に、製薬工場内の空気や壁表面、作業者手袋表面などで実施されている。また微生物数の定量は、食品工場においてもＨＡＣＣＰ（Hazard Analysis and Critical Control Point）の導入により、食品工場自体や作業行程の検査として、食品と共に壁表面や床面、まな板表面や包丁表面などの調理器具においても実施されている。
【０００３】
微生物数の定量方法は培養法が一般的である。培養法は、サンプルが液体の場合、直接サンプルを寒天平板培地に塗り、またサンプルが液体以外の場合、微生物を洗い出した液体を培地に塗り、培地上で微生物を培養し、１個の微生物が１個のコロニーを形成することを利用して、形成したコロニー数を数える微生物数の定量方法である。
【０００４】
また、メンブレンフィルターを使用して微生物数を定量するメンブレンフィルター（Membrane Filter, ＭＦ）法も一般的である。ＭＦ法は、サンプルをメンブレンフィルターでろ過して微生物を捕捉し、微生物を捕捉したメンブレンフィルターを平板寒天培地上に置いて培養し、コロニー数を数えて定量する方法である。また培養しない場合は、微生物を捕捉したメンブレンフィルター上に、微生物内からアデノシン三リン酸（Adenosine Triphosphate, ＡＴＰ）を抽出するＡＴＰ抽出試薬と、ルシフェラーゼとルシフェリンを含む発光試薬を霧状に噴霧することで、ＡＴＰがルシフェラーゼとルシフェリンと反応して生じる発光輝点をＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラで撮り微生物数を定量する方法がある（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特願平９−３１７７９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の培養法は、微生物を含むサンプルを寒天平板培地上に塗るため、サンプル量は約１ｍＬが上限となる課題がある。従って、サンプル量が多く微生物数が少ない場合は定量が困難である。また、定量結果を得るまで２４〜７２時間の培養を必要とする課題がある。その結果、製薬や食品、生細胞等の搬出の段階で定量結果を待たなければならず、安全性や効率性、経済性おいて大きな損失が生じるため、微生物数の定量に要する時間短縮が求められている。
【０００７】
また従来のＭＦ法は、微生物を捕捉したメンブレンフィルターと培地間に空気が入るなどして完全に密着しないと、培地の栄養分が微生物まで行き渡りにくく、微生物の増殖速度が一定にならないことでコロニーの大きさがばらつき、定量精度が低下する課題がある。またＭＦ法は、メンブレンフィルターに捕捉した微生物へＡＴＰ抽出試薬を噴霧するが、噴霧した抽出試薬がメンブレンフィルターに染み込んだサンプルや緩衝液によって希釈されたり、抽出液量に対し微生物の細胞壁が強固であったりすると、抽出効率が減少し、定量感度が低下する。
【０００８】
本発明は、多量のサンプル中に含まれる少数の微生物を迅速・高精度・高感度・簡便に検出・定量するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
我々は、多量のサンプル中に含まれる少数の微生物を迅速・高精度・高感度・簡便に検出して定量する装置と方法を提供するため、微生物を含むサンプルをメンブレンフィルターでろ過し、十分量の微生物溶解液で微生物を溶解し、微生物由来の生体物質を指標に、発光反応もしくは蛍光反応で検出する装置と方法の開発を試みた。その過程においてまず、以下の課題を見出した。
【００１０】
微生物を含むサンプルを多孔性親水性メンブレンフィルターでろ過すると、微生物の直径がメンブレンフィルターの孔径よりも明らかに大きい場合、微生物はメンブレンフィルター表面に捕捉されるが、微生物の直径がメンブレンフィルターの孔径に近い場合、微生物はメンブレンフィルターの中に入り込むことで捕捉されることがわかった。微生物がメンブレンフィルター内に捕捉された状態で、メンブレンフィルター上に微生物溶解試薬（例：ＡＴＰ抽出試薬）を加えると、微生物はメンブレンフィルター内で溶解され、抽出した生体物質（例：ＡＴＰ）の多くはメンブレンフィルター内に留まることがわかった。このような状態で、抽出したＡＴＰをＡＴＰ抽出試薬と共にメンブレンフィルター上から生物発光試薬（例：ルシフェラーゼ・ルシフェリン）の入った容器に移して発光測定を試みると、メンブレンフィルター内に留まったＡＴＰは損失となって発光量が減少するため、定量性は低下することがわかった。
【００１１】
そこで、親水性メンブレンフィルター上に抽出試薬を加えて一定時間静置もしくは攪拌することで、ＡＴＰをメンブレンフィルター内から遊離させる方法も試みた。しかし、その場合には、ＡＴＰがメンブレンフィルター内から遊離する前にＡＴＰが抽出試薬共々、メンブレンフィルター下に染み落ちてしまい、遊離が困難となることがわかった。
【００１２】
また、ＡＴＰ抽出試薬がメンブレンフィルターから染み落ちないように、親水性メンブレンフィルターの代わりに、水溶液に対し非浸透の疎水性メンブレンフィルターを用いる方法を試みた。まず、疎水性メンブレンフィルターで微生物を含むサンプル水溶液をろ過する場合、湿潤剤（例：メチルアルコールやエチルアルコールなどのアルコール類やジエチルエーテルなどのエーテル類）を疎水性メンブレンフィルターに染み込ませなければならない。しかし、湿潤剤は微生物を溶解したり損傷させたりし、また湿潤剤がろ過中にメンブレンフィルターから溶出すると、ろ過性能が悪くなる。従って、疎水性メンブレンフィルターに湿潤剤を染み込ませてろ過する手法は、微生物の検出・定量及び微生物の生死判別には困難なことがわかった。
【００１３】
本発明は、このような我々が見出した課題と従来の課題を解決するものである。我々は、疎水性メンブレンフィルターであっても、孔径の大きさによって、メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせることで、湿潤剤を用いずにサンプル水溶液をろ過でき、また疎水性メンブレンフィルター下が常圧の場合、抽出試薬がメンブレンフィルター下に染み落ちないことを見出した。疎水性メンブレンフィルターによる水溶液のろ過は、孔径がある一定の大きさ以上で可能であり、ある微生物の大きさがその孔径より小さいと、その微生物の捕捉は困難となる。そこで、疎水性メンブレンフィルター上に微生物を捕捉するための微小孔径かつ多孔性の親水性メンブレンフィルターを設けることで、多量の水溶液のろ過が可能で、また微生物の捕捉が可能で、加えて微生物溶解液の保持が可能な、二層構造メンブレンフィルターを開発した。
【００１４】
本発明の微生物検出装置は、上層の第一層を親水性メンブレンフィルターとして、その下に、湿潤剤を用いずにかつ陰圧を生じさせることで水溶液のろ過が可能な疎水性メンブレンフィルターを第二層として有する二層構造メンブレンフィルターを底部に備えた試料容器を用い、試料容器の二層構造メンブレンフィルターの下に吸引部を設けた構成を有する。二層構造のメンブレンフィルターの第一層の親水性メンブレンフィルターは微生物を捕捉する役割をし、第二層の疎水性メンブレンフィルターは試薬を保持する役割をする。
【００１５】
そして本発明によれば、吸引部により生じる陰圧によって、第一層親水性メンブレンフィルターと第二層疎水性メンブレンフィルターを通じた多量のサンプル水溶液のろ過が可能であり、サンプル水溶液中の微生物を溶解させたり損傷させたりすることなく第一層親水性メンブレンフィルターで捕捉できる。また陰圧から常圧にした後、微生物溶解液を加えて、一定時間微生物溶解液をメンブレンフィルター下から染み落とすこと無く、第二層疎水性メンブレンフィルター上で保持することが可能となる。そして本発明によれば、第一層親水性メンブレンフィルターに捕捉した微生物の溶解が可能であり、かつ、第一層親水性メンブレンフィルター内の微生物由来生体物質を、第一層親水性メンブレンフィルター上に遊離することが可能である。
【００１６】
第一層親水性メンブレンフィルターの孔径は０．０５μｍ〜０．６５μｍが好ましく、第二層疎水性メンブレンフィルターの孔径は０．８μｍ〜８０μｍが好ましい。第一層親水性メンブレンフィルターの孔径を０．０５μｍ〜０．６５μｍとすることで、第一層親水性メンブレンフィルターに微生物を確実に捕捉することができ、第二層疎水性メンブレンフィルターの孔径を０．８μｍ〜８０μｍとすることで、湿潤剤を用いずかつ陰圧を生じさせることでサンプル水溶液のろ過を可能にし、かつ陰圧から常圧にすることで、微生物溶解液を疎水性メンブレンフィルター上に保持することが可能になる。
【００１７】
本発明の微生物検出方法は、サンプル水溶液中に微生物外の生体物質を分解する第一試薬を加えることで微生物外の生体物質を分解し、サンプル水溶液を二層構造メンブレンフィルターで吸引ろ過することにより、微生物を第一層親水性メンブレンフィルターに捕捉すると共にサンプル水溶液中に含まれる第一試薬や異物を除去する。その後、微生物内生体物質を抽出する第二試薬を加えて、第二層疎水性メンブレンフィルター上で保持することで、微生物から生体物質を抽出し、かつ、第一層親水性メンブレンフィルター内から生体物質を遊離し、遊離した生体物質と反応する第三試薬を作用させることで微生物を定量測定する。ここで、第二試薬としては、疎水性メンブレンフィルターを湿潤することのない試薬を用いる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、多量のサンプル水溶液のろ過が容易であり、微生物の溶解が確実にでき、微生物から抽出した生体物質をメンブレンフィルターから容易に溶離できる微生物検出装置と微生物検出方法を提供する。また、培養することなく、微生物の生死判別と生細胞の定量を、熟練を要することなく高感度で高精度、迅速、簡便に定量できる微生物検出装置及び微生物検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図２】微生物検出の処理手順を示すフロー図。
【図３】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図４】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図５】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図６】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図７】容器底部への二層構造メンブレンフィルターの取り付け方の例を示す図。
【図８】容器底部への二層構造メンブレンフィルターの取り付け方の例を示す図。
【図９】本発明による二層構造メンブレンフィルターを用いた検出方法の途中工程を示す模式図。
【図１０】単層親水性メンブレンフィルターを用いた検出方法の途中工程を示す模式図。
【図１１】吸引ろ過の説明図。
【図１２】二層構造メンブレンフィルター用いた際の横軸を大腸菌数とＡＴＰ数の関係を示す図。
【図１３】各種条件で検出されたＡＴＰ数を示す図。
【図１４Ａ】二層構造メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力測定実験の説明図。
【図１４Ｂ】単層親水性メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力測定実験の説明図。
【図１５】二層構造メンブレンフィルター内のＡＴＰ分子の溶離実験の説明図。
【図１６】単層親水性メンブレンフィルター内のＡＴＰ分子の溶離実験の説明図。
【図１７】単層親水性メンブレンフィルター上に残っている微生物溶解液と、染み落ちた微生物溶解液の発光量の経時変化を示す図。
【図１８】二層構造メンブレンフィルター上の微生物溶解液の発光量の経時変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明の実施の形態を、図面を用いて説明する。だだし、以下の説明は本発明を何ら限定するものではない。
［実施例１］
（微生物の検出装置と方法）
図１は、本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図である。微生物検出装置は、二層構造メンブレンフィルター１０１を底部に備える容器１０２と、試薬供給部１０３、試薬供給用配管１０４、吸引部１０５、洗浄液供給部１０６、洗浄液供給用配管１０７、加熱部１０８、アーム１０９、分注部１１０、分注用配管１１１、検出部１１２、反応容器１１３、入力・制御部１１４を有する。入力・制御部１１４は装置各部の動作を統括制御する。容器１０２は装置に対して着脱自在である。また、反応容器１１３には発光試薬１１５が入っている。
【００２１】
二層構造メンブレンフィルター１０１は、上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６であり、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７である。第一層親水性メンブレンフィルター１１６は、微生物を確実に捕捉するため孔径が０．０５μｍ 〜０．６５μｍとする。また厚みが７μｍ〜２００μｍとし、もちろんこの厚みより薄くても厚くても構わないが、しかしこれより薄いとメンブレンフィルターの機械的な強度が弱くなり、ろ過中にメンブレンフィルターが破断することが予想され、これより厚いとメンブレンフィルター中に多くの溶液が残り、この後に追加する各種試薬が希釈されることが予想される。従って厚みは７μｍ〜２００μｍが好ましい。第二層疎水性メンブレンフィルター１１７は、水溶液を確実にろ過するため、孔径を０．８μｍ〜１８０μｍとする。また厚みが７μｍ〜８００μｍとし、もちろんこの厚みより薄くても厚くても構わないが、しかしこれより薄いとメンブレンフィルターの機械的な強度が弱くなり、ろ過中にメンブレンフィルターが破断することが予想され、これより厚いと吸引ろ過に時間がかかることが予想される。従って厚みは７μｍ〜８００μｍが好ましい。
【００２２】
図２は、図１に示した微生物検出装置による微生物検出の処理手順を示すフロー図である。なお、図３〜６は、本発明の微生物検出装置の別の形態であり、ともに説明する。
【００２３】
装置に、二層構造メンブレンフィルター１０１を底部に備える容器１０２を設置し、最初に入力・制御部１１４に、サンプルの粘性の高低や芽胞状態枯草菌の測定可否の初期値を入力し、微生物検出を開始する（Ｓ２０１）。容器１０２に測定対象微生物を含むサンプル水溶液を入れる（Ｓ２０２）。入力・制御部１１４は、ステップ２０３の判定でサンプル水溶液の粘性が高いと判定された場合、速やかなろ過を促すため加熱部１０８を駆動してサンプル水溶液を加熱する（Ｓ２０４）。ステップ２０１で入力されたサンプルの粘性が低い場合には、加熱工程を省略してステップ２０５に進む。
【００２４】
次に、試薬供給部１０３から試薬供給用配管１０４を通じて、微生物外生体物質分解試薬を、容器２０１内のサンプル水溶液に供給する（Ｓ２０５）。微生物外生体物質分解試薬としては、例えばＡＴＰ分解酵素、又はＤＮＡ（DeoxyriboNucleic Acid）分解酵素やＲＮＡ（RiboNucleic Acid）分解酵素が用いられる。
【００２５】
なお、図３に示すように、微生物検出装置が試薬供給部の代わりに各種の試薬３０１を収容した試薬槽３０２を備えている場合、分注部１１０が分注用配管１１１を通じて試薬槽３０２内の微生物外生体物質分解試薬をサンプル水溶液へ分注するように構成してもよい。図１に示した試薬供給部１０３を有する装置は、１日に多数のサンプルを測定する用途に適し、図３に示した試薬槽を備える装置は、少数のサンプルを測定する用途に適している。
【００２６】
次に、吸引部１０５によって陰圧を生じさせることで、二層構造メンブレンフィルター１０１を通して容器１０２内のサンプル水溶液をろ過する。この時、水溶液中の微生物は第一層親水性メンブレンフィルターに捕捉され、生体物質分解試薬や残存生体物質は廃液部１１８に流入して除かれる。その後、二層構造メンブレンフィルター１０１を洗浄する目的で、洗浄液供給部１０６から洗浄液を供給する（Ｓ２０６）。また、サンプル水溶液の粘性が高い場合、粘性を下げる目的で、洗浄液供給部１０６から洗浄液供給用配管１０７を通じて洗浄液を加えてもよい。同様に粘性を下げる目的で、加熱部１０８によって洗浄液を加熱してサンプル水溶液に加えてもよい。
【００２７】
次にステップ２０７の判定で、測定対象微生物が芽胞もしくは胞子を形成していると判断された場合、ろ過後、試薬供給部１０３から栄養型細胞変換試薬を加える（Ｓ２０８）。栄養型細胞変換試薬として用いられるのは、例えばアラニンやグルコース、リン酸の組み合わせであるが、液体培地を用いてもよい。なお図３のように、微生物検出装置が各種試薬槽３０２を備えている場合、分注部１１０によって試薬槽３０２内の栄養型細胞変換試薬をサンプル水溶液へ分注する。また、栄養型細胞変換を促すため加熱部１０８によって栄養型細胞変換試薬を加熱してもよい（Ｓ２０９）。また、栄養型細胞変換試薬を除く目的で、ろ過してもよい（Ｓ２１０）。ステップ２０７の判定がＮｏの場合、ステップ２０８からステップ２１０の処理を省略してステップ２１１に進む。
【００２８】
次に、試薬供給部１０３から微生物溶解液を加えて、微生物溶解液を二層構造メンブレンフィルター１０１上に保持する（Ｓ２１１）。微生物溶解液としては、例えば塩化ベンザルコニウムやトリクロロ酢酸、トリス緩衝液が用いられる。図３のように、微生物検出装置が各種試薬槽３０２を備えている場合には、分注部１１０によって試薬槽３０２内の微生物溶解液をサンプル水溶液へ分注する。
【００２９】
次に、容器１０２の二層構造メンブレンフィルター１０１上の微生物溶解液を分注部１１０の分注用配管１１１を通じて吸引し、アーム１０９を駆動して分注用配管１１１を検出部１１２の反応容器１１３上に移動し、微生物溶解液を反応容器１１３に移す（Ｓ２１２）。反応容器１１３内には発光試薬１１５が納められており、発光試薬１１５は微生物溶解液中に含まれる生体物質（例えばＡＴＰ、ルミノール、アルカリホスファターゼ）と反応して発光を生じる。発光試薬１１５は、例えばルシフェラーゼ・ルシフェリンである。なおペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼの基質を用いてもよい。その場合には、動物細胞の検出も可能になる。
【００３０】
なお、図４や図５に示す例のように、微生物検出装置が容器１０２の側面や下部に検出部１１２を備えている場合、試薬供給部１０３によって発光試薬を容器１０２の二層構造メンブレンフィルター１０１上に直接供給して、発光を生じさせてもよい。図５に示す微生物検出装置の例の場合、二層構造メンブレンフィルター１０１が底部全面ではなく一部領域に装着され、底部に透明領域が設けられている容器を用いる。検出部１１２は、その容器底部の透明領域に対向して配置され、容器内の溶液中の発光反応によって生じる発光を検出する。また、図６の装置例のように、微生物検出装置が励起光照射部６０１を備えている場合、発光試薬を用いなることなく、励起光照射部６０１から励起光を生体物質（例えばＤＮＡやＲＮＡ、ＮＡＤ、Nicotinamide Adenine Dinucleotide）に照射することで蛍光を生じさせてもよい。
【００３１】
生じた発光や蛍光は検出部１１２によって検出され（Ｓ２１３）、検出された発光量や蛍光量から微生物数が算出され（Ｓ２１４）、微生物検出が終了する。
【００３２】
なお、図２に示す処理工程において、ステップ２０７からステップ２１０の処理を省略して、ステップ２０６からステップ２１１に進み、ステップ２１３において発光測定すると、サンプル中に含まれる栄養型細胞数を検出することができる。また、ステップ２０６の後、ステップ２０８からステップ２１４の処理を経ることで非栄養型細胞数を検出することができる。このように、ステップ２０８からステップ２１０を省略した処理を実行して栄養型細胞数を検出した後、ステップ２０８に戻ってステップ２１４まで処理を反復することにより、サンプルに含まれる栄養型細胞数と非栄養型細胞数を区別して検出することができる。
【００３３】
［実施例２］
（微生物検出実験１：大腸菌）
本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器と、従来の親水性メンブレンフィルターを備える容器による大腸菌の検出感度を比較した。
【００３４】
二種類のメンブレンフィルターつき容器を用意した。１つは、底部に二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２であり、他の一つは底部に親水性メンブレンフィルターのみを備える容器である。
【００３５】
図７により、容器底部への二層構造メンブレンフィルターの取り付け方の例を説明する。二層構造メンブレンフィルター１０１は、上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、親水性メンブレンフィルターは、DuraporeメンブレンフィルターやIsopreメンブレンフィルター（日本ミリポア）でもよい。疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、疎水性メンブレンフィルターは、ポリプロピレンプレフィルター、孔径３０μｍ（日本ミリポア）でもよい。また材質がナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、疎水性であるポリビニリデンフロライド、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリアミド、ガラスファイバーで、孔径が０．８μｍ〜８０μｍのメンブレンフィルター、もしくはメッシュ構造でピッチサイズが１μｍ〜５９μｍであってもよい。
【００３６】
図７（ａ）に示すように、加工した親水性メンブレンフィルター１１６と疎水性メンブレンフィルター１１７を重ね、容器１０２の底部８０１に設けた装着部に装着し、環状の蓋８０２でフィルターの周縁部押さえ、図７（ｂ）に示すように、ネジ８０３で締める事で組み立てを完了した。なお、フィルターの固定はネジ式の蓋によって行ってもよい。例えば、図８（ａ）に示すように、加工した親水性メンブレンフィルター１１６と疎水性メンブレンフィルター１１７を重ね、容器１０２のネジ様溝を持つ底部９０１とネジ様溝を持つ環状の蓋９０２の間に挟み込み、図８（ｂ）に示すように、底部９０１と蓋９０２で締めることで組み立てもよい。なお、第一層親水性メンブレンフィルターと第二層疎水性メンブレンフィルターの間には隙間があってもよい。
【００３７】
親水性メンブレンフィルターのみを備える容器は、容器の構造は同じであるが、図１０（ａ）に略示するように、二層構造メンブレンフィルターの代わりに単層親水性メンブレンフィルター１００１を装着した容器１００２である。単層親水性メンブレンフィルター１００１には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００３８】
図９は本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器を用いた検出方法の途中工程を示す模式図、図１０は単層親水性メンブレンフィルターを備える容器を用いた検出方法の途中工程を示す模式図である。
【００３９】
測定対象微生物として大腸菌を用いた。大腸菌数が２０〜２０００個／１０ｍＬとなるように、大腸菌７０１をリン酸バッファーｐＨ７．４（インビトロジェン）に懸濁し、大腸菌懸濁液７０２を作製した。
【００４０】
図９（ａ）及び図１０（ａ）に示すように、まず二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター１００１上にそれぞれ大腸菌懸濁液７０２を１０ｍＬ加えた。次に、微生物外生体物質除去試薬であるルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ消去液を１０μＬ加えた。続いて、図１１（ａ）に示すように、吸引部１０５の吸引口１１０１を二層メンブレンフィルター下に接続し、図１１（ｂ）に示すように陰圧を生じさせ、大腸菌懸濁液とＡＴＰ消去液をろ過した。なお単層親水性メンブレンフィルターにおいても同様に大腸菌懸濁液とＡＴＰ消去液をろ過した。図９（ｂ）及び図１０（ｂ）は、ろ過後の状態を示している。ろ過後、微生物溶解液７０３であるルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ抽出液を２００μＬ加えて、図９（ｃ）及び図１０（ｃ）に示すように、大腸菌７０１からＡＴＰ分子７０４を抽出した。
【００４１】
静置している間、図１０（ｄ）に示すように、単層親水性メンブレンフィルター１００１下部から微生物溶解液１００３が染み落ちてきた。一方、二層構造メンブレンフィルター１０１では、図９（ｄ）に示すように、変化が観察されなかった。
【００４２】
二層構造メンブレンフィルター１０１と単層親水性メンブレンフィルター１００１上に残った微生物溶解液７０３を、分注部１１０を用いて検出部１１２上に設置された反応容器１１３内にあるルシフェールＨＳセット付属の発光試薬１１５に１０μＬ分注した。発光量をＡＴＰ数に算出した。なお二層構造メンブレンフィルター１０１について、図１２に示すように、縦軸をＡＴＰ数、横軸を大腸菌数とした図を作成した。
【００４３】
二層構造メンブレンフィルターを備える容器を用いた場合、ＡＴＰ数と大腸菌数は定量的な直線関係 (y＝１．４３１５ｘ−７．９８２３) を示し、大腸菌１個あたりＡＴＰ分子数は平均１．４amolを示したが、単層親水性メンブレンフィルターを備える容器を用いた場合、大腸菌１００個未満ではＡＴＰ分子を検出することができず、大腸菌１００個でＡＴＰ分子数は１amolを示し、二層構造メンブレンフィルター１０１は単層親水性メンブレンフィルター１００１に比べて約１００倍の値を示した。
【００４４】
この結果は、単層親水性メンブレンフィルターを備える容器では微生物溶解液を単層親水性メンブレンフィルター上に保持できないため、微生物溶解液１００３が単層親水性メンブレンフィルター下に染み落ちると共に、大腸菌由来ＡＴＰ分子１００４も落ちてしまい、その結果、単層親水性メンブレンフィルター１００１上の微生物溶解液に大腸菌由来ＡＴＰ分子１００４が溶離しなかったためと考えられる（図１０（ｄ））。
【００４５】
その一方で、二層構造メンブレンフィルターを備える容器では、二層構造メンブレンフィルター１０１上に微生物溶解液７０３が保持できるため、微生物溶解液７０３が大腸菌由来ＡＴＰ分子７０４と共に二層構造メンブレンフィルター１０１下に染み落ちることがない。また、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内で大腸菌から抽出されたＡＴＰ分子７０４は時間と共に二層構造メンブレンフィルター１０１上の微生物溶解液に溶離される（図９（ｄ））。
【００４６】
本発明の微生物検出装置は、大腸菌１個を高感度、高精度、迅速、簡便に計測できた。なお、大腸菌群やブドウ球菌などの細菌、サッカロミケス・ケレウィシエなどの酵母、アスペルギルス・ニガーなどの真菌に対しても同様の効果が得られる。
【００４７】
［実施例３］
（微生物検出実験２：芽胞状態枯草菌）
本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器と、従来の親水性メンブレンフィルターを備える容器による芽胞状態枯草菌の検出感度を比較した。
【００４８】
二種類のメンブレンフィルターつき容器を用意した。１つは、二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２、他の一つは親水性メンブレンフィルターのみを備える容器である。容器の構造及び容器への二層構造メンブレンフィルター及び単層親水性メンブレンフィルターの取り付け構造は、図７及び図８にて説明したとおりである。
【００４９】
二層構造メンブレンフィルター１０１は、上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、親水性メンブレンフィルターは、DuraporeメンブレンフィルターやIsopreメンブレンフィルター（日本ミリポア）でもよい。疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、疎水性メンブレンフィルターは、ポリプロピレンプレフィルター、孔径３０μｍ（日本ミリポア）でもよい。また材質がナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、疎水性であるポリビニリデンフロライド、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリアミド、ガラスファイバーで、孔径が０．８μｍ〜８０μｍのメンブレンフィルター、もしくはメッシュ構造でピッチサイズが１μｍ〜５９μｍであってもよい。
【００５０】
親水性メンブレンフィルターのみを備える容器に装着した単層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００５１】
測定対象微生物として芽胞状態の枯草菌を用いた。枯草菌を１０％ｗ／ｖゼラチン溶液＋リン酸バッファー（ｐＨ７．４）（インビトロジェン）に懸濁して、枯草菌数２０００個／１０ｍＬとする粘性の高い枯草菌懸濁溶液を調製した。栄養型細胞変換試薬として、１００ｍＭアラニン＋１００ｍＭグルコース＋リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いた。微生物外生体物質除去試薬には、ルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ消去液を用いた。微生物溶解液には、ルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ抽出液を用いた。
【００５２】
測定には図３に示した微生物検出装置を用いた。本実施例では、入力・制御部１１４の入力用にタッチパネルディスプレイを用いた。なお、入力・制御部１１４はラップトップコンピューターや、デスクトップコンピューター、もしくは入力用ボタンとディスプレイ、入出力用（USB Universal Serial Bus）メモリの組み合わせなどを用いてもよい。
【００５３】
まず、枯草菌懸濁液は、ゼラチンを含むことから粘性が高い。また枯草菌懸濁液は、芽胞を形成した菌を含むため、入力・制御部１１４を用いて、枯草菌懸濁液の粘性が高いこと、芽胞を形成した菌を含むことを入力した。続いて微生物検出の開始を指示した。装置は、図２に示した処理手順に従って検出処理を実行する。
【００５４】
二層構造メンブレンフィルター上と単層親水性メンブレンフィルター上に、枯草菌懸濁液をそれぞれ１０ｍＬ加えた（Ｓ２０２）。入力・制御部１１４は、入力情報からステップ２０３の判定で枯草菌懸濁液は粘性が高いと判定し、加熱部１０８を用いて枯草菌懸濁液を４０℃で加熱して粘性を下げた（Ｓ２０４）。
【００５５】
枯草菌懸濁液にＡＴＰ消去液を１０μＬ加えて（Ｓ２０５）、枯草菌懸濁液とＡＴＰ消去液を、吸引部１０５が生じる陰圧により二層構造メンブレンフィルター１０１と単層親水性メンブレンフィルターでそれぞれろ過した（Ｓ２０６）。
【００５６】
ろ過後、入力・制御部１１４は、入力された情報からステップ２０７の判定で芽胞形成菌が含まれていると判定し、芽胞状態から栄養型細胞に変換するため、栄養型細胞変換試薬１ｍＬを二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター上にそれぞれ加えた（Ｓ２０８）。加熱部１０８により栄養型細胞変換試薬を４０℃もしくは４５℃で約１時間加熱し、芽胞状態から栄養型細胞への変換を促した（Ｓ２０９）。１時間後、単層親水性メンブレンフィルターでは、栄養型細胞変換試薬が単層親水性メンブレンフィルター下に染み落ちていたが、二層構造メンブレンフィルター１０１では栄養型細胞変換試薬が保持されていたため、これを再びろ過した（Ｓ２１０）。
【００５７】
続いてＡＴＰ抽出試薬を２００μＬ加えて１０分間静置した（Ｓ２１１）。静置している間、単層親水性メンブレンフィルター下からＡＴＰ抽出液が染み落ちたが、二層構造メンブレンフィルター１０１においては変化が観察されなかった。二層構造メンブレンフィルター１０１と単層親水性メンブレンフィルター上に残ったＡＴＰ抽出液１０μＬを、分注部１１０によって、検出部１１２上に設置された反応容器１１３内にある発光試薬１１５へ分注した（Ｓ２１２）。検出部１１２は、生じた発光を検出し（Ｓ２１３）、入力・制御部１１４は発光量からＡＴＰ数を算出した（Ｓ２１４）。
【００５８】
ＡＴＰ数の検出結果を図１３に示す。単層親水性メンブレンフィルターでは枯草菌１００個当たりＡＴＰ数は約１０amolであったが、二層構造メンブレンフィルター１０１では約２００amolと見積もられ、約２０倍の値を示した。この結果は、単層親水性メンブレンフィルターではＡＴＰ抽出液を単層親水性メンブレンフィルター上に保持できないため、ＡＴＰ抽出液が単層親水性メンブレンフィルター下に染み落ちると共に枯草菌由来ＡＴＰ分子も落ちてしまい、その結果、単層親水性メンブレンフィルター上に枯草菌由来ＡＴＰ分子が溶離しなかったと考えられる。一方、二層構造メンブレンフィルター１０１では、ＡＴＰ抽出液を二層構造メンブレンフィルター１０１上に保持できるため、ＡＴＰ抽出液が枯草菌由来ＡＴＰと共に二層構造メンブレンフィルター１０１下に染み落ちない。また、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内の枯草菌由来ＡＴＰ分子は、時間と共に二層構造メンブレンフィルター１１０上に溶離されたと考えられる。
【００５９】
なお、加熱部１０８で栄養型細胞変換試薬を加熱しない場合（図１３、２５℃、室温）は、枯草菌１００個当たりのＡＴＰ数は約１０amolであった。
以上のように、本発明の微生物検出装置は、枯草菌を高感度、高精度、迅速、簡便に計測できた。
【００６０】
本発明は種々の実験の積み重ねによって完成されたものである。以下に、本発明の基礎となった実験について説明する。
［実験例１］
（水溶液の保持と陰圧で水溶液のろ過が可能な疎水性メンブレンフィルターの調査）
水溶液を保持でき、かつ陰圧でろ過が可能な、疎水性メンブレンフィルターの有無を調べた。
【００６１】
調べた疎水性メンブレンフィルターの孔径とピッチサイズ、材質を表１に示す。実験に用いた水溶液は、超純水とリン酸緩衝液、微生物溶解液である。リン酸緩衝液は、５０ｍＭリン酸／ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．４である。微生物溶解液は０．２％塩化ベンザルコニウム＋２５ｍＭトリシン緩衝液ｐＨ１２である。
【表１】
【００６２】
各疎水性メンブレンフィルター上に各水溶液を滴下して、水溶液の保持能を調べた（表１）。その結果、すべての材質において水溶液を保持し、染み落ちることがなかった。
【００６３】
また各水溶液に対して各疎水性メンブレンフィルターの陰圧によるろ過の可否について調べた（表１）。その結果、疎水性メンブレンフィルターは、孔径が０．８μｍ〜８０μｍで、常圧では水溶液に対し非浸透で、陰圧にすると水溶液のろ過が可能であった。孔径が０．６μｍ以下になると陰圧によるろ過は困難となり、孔径０．４５μｍではろ過はできなかった。加えて、メッシュ構造の疎水性メンブレンフィルターは、ピッチサイズ１μｍ〜５９μｍで水溶液を保持し、また陰圧でろ過可能であった。
【００６４】
また孔径が０．８μｍ〜８０μｍ又はピッチサイズ１μｍ〜５９μｍの疎水性メンブレンフィルターの上に孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍの親水性メンブレンフィルターをのせた二層構造メンブレンフィルターを作製し、二層構造メンブレンフィルター上に水溶液を加えてろ過を試みたところ、二層構造メンブレンフィルターでも水溶液のろ過は可能であった。
【００６５】
［実験例２］
（二層構造メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力の測定実験）
二層構造メンブレンフィルターと単層親水性メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力を比較するため、二種類のメンブレンフィルターを底部に備えた容器を用意した。
【００６６】
１つは、二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２である（図１４Ａ（ａ））。二層構造メンブレンフィルター１０１は上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。第一層親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用した。
【００６７】
もう１つは、親水性メンブレンフィルターのみで構成される単層親水性メンブレンフィルター１００１を備える容器１００２である（図１４Ｂ（ａ））。単層親水性メンブレンフィルター１００１には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００６８】
二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター１００１上にそれぞれ微生物溶解液７０３として、０．２％塩化ベンザルコニウム＋２５ｍＭトリシン緩衝液ｐＨ１２を２００μＬ加えて１０分間静置した。５分間、１０分間の静置後、二層構造メンブレンフィルター１０１で変化は観察されなかったが（図１４Ａ（ｂ）（ｃ））、単層親水性メンブレンフィルター１００１では、静置時間と共に単層親水性メンブレンフィルター１００１下から微生物溶解液１００３が染み落ちた（図１４Ｂ（ｂ）（ｃ））。
【００６９】
単層親水性メンブレンフィルター１００１から染み落ちる微生物溶解液１００３の量を測定するため、染み落ちる微生物溶解液１００３を採取して重量の測定を試みた。微生物溶解液７０３を加えてから４分後、１０ｍｇの微生物溶解液１００３が染み落ちた。６分後、８分後に測定したところ、１５ｍｇ、２０ｍｇの微生物溶解液１００３が染み落ちた。合計４５ｍｇ分、微生物溶解液１００３が染み落ちることがわかった。
【００７０】
一方、二層構造メンブレンフィルター１０１下からは微生物溶解液が染み落ちなかった。代わりに二層構造メンブレンフィルター１０１上に微生物溶解液７０３を加えた直後（図１４Ａ（ａ））と１０分静置後（図１４Ａ（ｃ））で、二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２、微生物溶解液７０３の合計重量をそれぞれ測定し、その差を算出した。差は１ｍｇとなり、ほぼ重量に変化が無いことがわかった。この結果は、微生物溶解液は二層構造メンブレンフィルターを備える容器１０２の中に保持されることを示している。
この結果から、二層構造メンブレンフィルターは、微生物溶解液をその上に保持できることがわかった。
【００７１】
［実験例３］
（メンブレンフィルター内のＡＴＰ溶離実験）
二層構造メンブレンフィルターと単層親水性メンブレンフィルター内のＡＴＰ分子の溶離量を比較するため、二種類のメンブレンフィルターを備える容器を用意した。１つは、底部に二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２である（図１５（ａ））。二層構造メンブレンフィルター１０１は上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。第一層親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００７２】
もう１つは、親水性メンブレンフィルターのみで構成される単層親水性メンブレンフィルター１００１を底部に備える容器１００２である（図１６（ａ））。単層親水性メンブレンフィルター１００１には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００７３】
ＡＴＰ溶液としてルシフェールＡＴＰ標準試薬（キッコーマン）を用いて２００００amol／１０μＬの濃度のＡＴＰ溶液を作製した。発光試薬１１５として、ＡＴＰ・ルシフェラーゼ・ルシフェリン反応を生じるルシフェールＨＳセット（キッコーマン）付属の発光試薬を用いた。
【００７４】
まず、二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター１００１上にそれぞれＡＴＰ溶液を１０μＬ加えて、第一層親水性メンブレンフィルター１１６と単層親水性メンブレンフィルター１００１内にＡＴＰ分子１５０１を染み込ませた（図１５（ａ）、図１６（ａ））。続いて、微生物溶解液７０３として、０．２％塩化ベンザルコニウム＋２５ｍＭトリシン緩衝液ｐＨ１２を２００μＬ加えた後、静置した（図１５（ｂ）、図１６（ｂ））。
【００７５】
静置している間、単層親水性メンブレンフィルター１００１下から微生物溶解液１００３が時間と共に染み落ちてきた（図１６（ｃ）（ｄ））。一方、二層構造メンブレンフィルター１０１では変化は観察されなかった（図１５（ｃ）（ｄ））。
【００７６】
単層親水性メンブレンフィルター１００１下から染み落ちる微生物溶解液１００３中のＡＴＰ分子１６０１の数と、単層親水性メンブレンフィルター１００１上に遊離した微生物溶解液７０３中のＡＴＰ分子１５０１の数（図１６（ｃ）（ｄ））を定量的に評価するため、単層親水性メンブレンフィルター１００１上に残っている微生物溶解液７０３と単層親水性メンブレンフィルター１００１下から染み落ちた微生物溶解液１００３をそれぞれ１０μＬ採取し、反応容器１１３中の発光試薬１１５に加えて、生じた発光反応を検出部１１２で検出した。
【００７７】
単層親水性メンブレンフィルター１００１上に微生物溶解液７０３を加えてから４分後、６分後、８分後に、染み落ちた微生物溶解液１００３の発光量は、約２００００ＣＰＳ（Countper Second）、２５０００ＣＰＳ、３００００ＣＰＳを示した（図１７）。染み落ちる前、単層親水性メンブレンフィルター１００１内にはＡＴＰ分子が２００００amol存在し、２００μＬの微生物溶解液７０３を単層親水性メンブレンフィルター１００１上に加えたことから、ＡＴＰ分子１５０１が理想的に微生物溶解液７０３中に拡散した場合、ＡＴＰ濃度は約１０００amol／１０μＬになる。なお１０００amol／１０μＬのＡＴＰ濃度の発光量を測定すると、発光量は約１００００ＣＰＳを示す。従って、単層親水性メンブレンフィルター１００１から染み落ちた微生物溶解液１００３中のＡＴＰ分子１６０１の数は、理想的にＡＴＰ分子１５０１が微生物溶解液７０３中に拡散した場合と比較して、２〜３倍多いことがわかった。
【００７８】
一方、単層親水性メンブレンフィルター１００１上に残った微生物溶解液７０３に含まれるＡＴＰ分子１５０１の数を発光測定したところ、１０分経過しても約５０００ＣＰＳが最高であった。染み落ちた微生物溶解液１００３を測定した時に比べて、１／４〜１／６の発光量であった（図１７）。この結果から、単層親水性メンブレンフィルター１００１内のＡＴＰ分子１５０１（図１６（ａ））は１／４〜１／６程度しか親水性メンブレンフィルター１００１上に遊離しないことがわかった（図１６（ｄ））。
【００７９】
一方、二層構造メンブレンフィルター１０１下から微生物溶解液７０３は染み落ちなかった。代わりに、微生物溶解液７０３を二層構造メンブレンフィルター１０１上に加えた直後と２〜２０分静置した後で、二層構造メンブレンフィルター１０１上の微生物溶解液７０３を１０μＬずつ採取して発光測定した。各静置時間において、発光量は約９８００ＣＰＳを示した（図１８）。この結果は、微生物溶解液７０３を二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２の中に保持することで、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内に染み込んだＡＴＰ分子１５０１（図１５（ａ））を二層構造メンブレンフィルター１０１上に溶離できていることを示している（図１５（ｄ））。
【００８０】
この結果から、二層構造メンブレンフィルター１０１上に微生物溶解液７０３を保持することで、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内からＡＴＰ分子１５０１を効率よく溶離できることがわかった。また、第一層親水性メンブレンフィルターの直径がより小さく、また厚さが薄いほど効率よく溶離できる。
【００８１】
［実験例４］
（湿潤剤を用いた場合の微生物計測実験）
二層構造メンブレンフィルターと、湿潤剤を染みこませることで水溶液がろ過できる疎水性メンブレンフィルターを用いた時の微生物検出感度を比較するため、四種類のメンブレンフィルターを備える容器を用意した。
【００８２】
（１）二層構造メンブレンフィルターを備える容器：
二層構造メンブレンフィルターは上層の第一層が親水性メンブレンフィルター、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルターで構成される。第一層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルターには孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８３】
（２）単層親水性メンブレンフィルターを備える容器：
単層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８４】
（３）第一層に親水性メンブレンフィルターと、第二層に湿潤剤を染みこませることで水溶液がろ過できる疎水性メンブレンフィルターで構成される要湿潤剤二層構造メンブレンフィルターを備える容器：
二枚重ねのメンブレンフィルターの第一層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層の疎水性メンブレンフィルターとして、孔径０．４５μｍの疎水性デュラポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８５】
（４）湿潤剤を染みこませることで水溶液がろ過できる疎水性メンブレンフィルターで構成される要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルターを備える容器：
単層の疎水性メンブレンフィルターとして孔径０．４５μｍの疎水性デュラポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８６】
測定対象微生物として大腸菌を用いた。大腸菌をリン酸バッファー（ｐＨ７．４）（インビトロジェン）に懸濁して、大腸菌数が１００個／１０ｍＬとなるように調製した。微生物外生体物質除去試薬として、ルシフェールＨＳセット（キッコーマン）付属のＡＴＰ消去液を用いた。微生物溶解液には、ルシフェールＨＳセット（キッコーマン）付属のＡＴＰ抽出液を用いた。
【００８７】
二層構造メンブレンフィルター上と、単層親水性メンブレンフィルター上、要湿潤剤二層構造メンブレンフィルター上、要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルター上にそれぞれ大腸菌懸濁液を１０ｍＬ加えた。また第一試薬として、ＡＴＰ消去液を１０μＬ加えた。
【００８８】
二層構造メンブレンフィルターと、単層親水性メンブレンフィルターは大腸菌懸濁液をろ過できた。しかし要湿潤剤二層構造メンブレンフィルターと要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルターは大腸菌懸濁液をろ過できなかったため、各疎水性メンブレンフィルターに湿潤剤であるメチルアルコールを染み込ませてろ過を可能にした。
【００８９】
ろ過後、第二試薬として、ＡＴＰ抽出液を２００μＬ加えた。二層構造メンブレンフィルター上と、単層親水性メンブレンフィルター上、要湿潤剤二層構造メンブレンフィルター上、要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルター上に残ったＡＴＰ抽出液１０μＬの発光測定をした。
【００９０】
二層構造メンブレンフィルターでは、大腸菌１００個からＡＴＰは１４０amolが検出された。一方、単層親水性メンブレンフィルターでは１０amol、要湿潤剤二層構造メンブレンフィルターと要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルターでは、１２amolが検出された。各メンブレンフィルターで検出されたＡＴＰ数は、二層構造メンブレンフィルターに比べて約１／１０以下に減少した。
【００９１】
この結果は、疎水性メンブレンフィルターに染み込ませた湿潤剤が、大腸菌を損傷ないし溶解したことにより、大腸菌由来ＡＴＰがろ過の間に流れ出てしまったためと考えられる。
【００９２】
湿潤剤を使って疎水性メンブレンフィルターでろ過する微生物検出方法は、微生物の検出感度と精度共を減少させる。一方、湿潤剤を使わない二層構造メンブレンフィルターは、微生物の検出感度と精度を向上した。
【符号の説明】
【００９３】
１０１ 二層構造メンブレンフィルター
１０２ 容器
１０３ 試薬供給部
１０５ 吸引部
１０６ 洗浄液供給部
１０８ 加熱部
１０９ アーム
１１０ 分注部
１１２ 検出部
１１３ 反応容器
１１４ 入力・制御部
１１５ 発光試薬
１１６ 親水性メンブレンフィルター
１１７ 疎水性メンブレンフィルター
１１８ 廃液部
３０１ 試薬
３０２ 試薬槽
６０１ 励起光照射部
７０１ 大腸菌
７０２ 大腸菌懸濁液
７０３ 微生物溶解液
７０４ 大腸菌由来ＡＴＰ分子
８０１ 容器の底部
８０２ 環状の蓋
８０３ ネジ
９０１ 容器のネジ様溝を持つ底部
９０２ ネジ様溝を持つ環状の蓋
１００１ 単層親水性メンブレンフィルター
１００２ 容器
１００３ 染み落ちた微生物溶解液
１００４ 染み落ちた大腸菌由来ＡＴＰ分子
１１０１ 吸引口
１５０１ ＡＴＰ分子
１６０１ 染み落ちたＡＴＰ分子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出装置、検出方法、及びそれに用いられる試料容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の検出や微生物数の定量は、製薬工場や食品工場、再生医療施設などにおいて、製品への微生物汚染を未然に防ぐ安全衛生管理として実施されている。特に微生物数の定量は、日本薬局方の規定により、製薬工場において製品や原料に対して実施されると共に、製薬工場内の空気や壁表面、作業者手袋表面などで実施されている。また微生物数の定量は、食品工場においてもＨＡＣＣＰ（Hazard Analysis and Critical Control Point）の導入により、食品工場自体や作業行程の検査として、食品と共に壁表面や床面、まな板表面や包丁表面などの調理器具においても実施されている。
【０００３】
微生物数の定量方法は培養法が一般的である。培養法は、サンプルが液体の場合、直接サンプルを寒天平板培地に塗り、またサンプルが液体以外の場合、微生物を洗い出した液体を培地に塗り、培地上で微生物を培養し、１個の微生物が１個のコロニーを形成することを利用して、形成したコロニー数を数える微生物数の定量方法である。
【０００４】
また、メンブレンフィルターを使用して微生物数を定量するメンブレンフィルター（Membrane Filter, ＭＦ）法も一般的である。ＭＦ法は、サンプルをメンブレンフィルターでろ過して微生物を捕捉し、微生物を捕捉したメンブレンフィルターを平板寒天培地上に置いて培養し、コロニー数を数えて定量する方法である。また培養しない場合は、微生物を捕捉したメンブレンフィルター上に、微生物内からアデノシン三リン酸（Adenosine Triphosphate, ＡＴＰ）を抽出するＡＴＰ抽出試薬と、ルシフェラーゼとルシフェリンを含む発光試薬を霧状に噴霧することで、ＡＴＰがルシフェラーゼとルシフェリンと反応して生じる発光輝点をＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラで撮り微生物数を定量する方法がある（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特願平９−３１７７９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の培養法は、微生物を含むサンプルを寒天平板培地上に塗るため、サンプル量は約１ｍＬが上限となる課題がある。従って、サンプル量が多く微生物数が少ない場合は定量が困難である。また、定量結果を得るまで２４〜７２時間の培養を必要とする課題がある。その結果、製薬や食品、生細胞等の搬出の段階で定量結果を待たなければならず、安全性や効率性、経済性おいて大きな損失が生じるため、微生物数の定量に要する時間短縮が求められている。
【０００７】
また従来のＭＦ法は、微生物を捕捉したメンブレンフィルターと培地間に空気が入るなどして完全に密着しないと、培地の栄養分が微生物まで行き渡りにくく、微生物の増殖速度が一定にならないことでコロニーの大きさがばらつき、定量精度が低下する課題がある。またＭＦ法は、メンブレンフィルターに捕捉した微生物へＡＴＰ抽出試薬を噴霧するが、噴霧した抽出試薬がメンブレンフィルターに染み込んだサンプルや緩衝液によって希釈されたり、抽出液量に対し微生物の細胞壁が強固であったりすると、抽出効率が減少し、定量感度が低下する。
【０００８】
本発明は、多量のサンプル中に含まれる少数の微生物を迅速・高精度・高感度・簡便に検出・定量するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
我々は、多量のサンプル中に含まれる少数の微生物を迅速・高精度・高感度・簡便に検出して定量する装置と方法を提供するため、微生物を含むサンプルをメンブレンフィルターでろ過し、十分量の微生物溶解液で微生物を溶解し、微生物由来の生体物質を指標に、発光反応もしくは蛍光反応で検出する装置と方法の開発を試みた。その過程においてまず、以下の課題を見出した。
【００１０】
微生物を含むサンプルを多孔性親水性メンブレンフィルターでろ過すると、微生物の直径がメンブレンフィルターの孔径よりも明らかに大きい場合、微生物はメンブレンフィルター表面に捕捉されるが、微生物の直径がメンブレンフィルターの孔径に近い場合、微生物はメンブレンフィルターの中に入り込むことで捕捉されることがわかった。微生物がメンブレンフィルター内に捕捉された状態で、メンブレンフィルター上に微生物溶解試薬（例：ＡＴＰ抽出試薬）を加えると、微生物はメンブレンフィルター内で溶解され、抽出した生体物質（例：ＡＴＰ）の多くはメンブレンフィルター内に留まることがわかった。このような状態で、抽出したＡＴＰをＡＴＰ抽出試薬と共にメンブレンフィルター上から生物発光試薬（例：ルシフェラーゼ・ルシフェリン）の入った容器に移して発光測定を試みると、メンブレンフィルター内に留まったＡＴＰは損失となって発光量が減少するため、定量性は低下することがわかった。
【００１１】
そこで、親水性メンブレンフィルター上に抽出試薬を加えて一定時間静置もしくは攪拌することで、ＡＴＰをメンブレンフィルター内から遊離させる方法も試みた。しかし、その場合には、ＡＴＰがメンブレンフィルター内から遊離する前にＡＴＰが抽出試薬共々、メンブレンフィルター下に染み落ちてしまい、遊離が困難となることがわかった。
【００１２】
また、ＡＴＰ抽出試薬がメンブレンフィルターから染み落ちないように、親水性メンブレンフィルターの代わりに、水溶液に対し非浸透の疎水性メンブレンフィルターを用いる方法を試みた。まず、疎水性メンブレンフィルターで微生物を含むサンプル水溶液をろ過する場合、湿潤剤（例：メチルアルコールやエチルアルコールなどのアルコール類やジエチルエーテルなどのエーテル類）を疎水性メンブレンフィルターに染み込ませなければならない。しかし、湿潤剤は微生物を溶解したり損傷させたりし、また湿潤剤がろ過中にメンブレンフィルターから溶出すると、ろ過性能が悪くなる。従って、疎水性メンブレンフィルターに湿潤剤を染み込ませてろ過する手法は、微生物の検出・定量及び微生物の生死判別には困難なことがわかった。
【００１３】
本発明は、このような我々が見出した課題と従来の課題を解決するものである。我々は、疎水性メンブレンフィルターであっても、孔径の大きさによって、メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせることで、湿潤剤を用いずにサンプル水溶液をろ過でき、また疎水性メンブレンフィルター下が常圧の場合、抽出試薬がメンブレンフィルター下に染み落ちないことを見出した。疎水性メンブレンフィルターによる水溶液のろ過は、孔径がある一定の大きさ以上で可能であり、ある微生物の大きさがその孔径より小さいと、その微生物の捕捉は困難となる。そこで、疎水性メンブレンフィルター上に微生物を捕捉するための微小孔径かつ多孔性の親水性メンブレンフィルターを設けることで、多量の水溶液のろ過が可能で、また微生物の捕捉が可能で、加えて微生物溶解液の保持が可能な、二層構造メンブレンフィルターを開発した。
【００１４】
本発明の微生物検出装置は、上層の第一層を親水性メンブレンフィルターとして、その下に、湿潤剤を用いずにかつ陰圧を生じさせることで水溶液のろ過が可能な疎水性メンブレンフィルターを第二層として有する二層構造メンブレンフィルターを底部に備えた試料容器を用い、試料容器の二層構造メンブレンフィルターの下に吸引部を設けた構成を有する。二層構造のメンブレンフィルターの第一層の親水性メンブレンフィルターは微生物を捕捉する役割をし、第二層の疎水性メンブレンフィルターは試薬を保持する役割をする。
【００１５】
そして本発明によれば、吸引部により生じる陰圧によって、第一層親水性メンブレンフィルターと第二層疎水性メンブレンフィルターを通じた多量のサンプル水溶液のろ過が可能であり、サンプル水溶液中の微生物を溶解させたり損傷させたりすることなく第一層親水性メンブレンフィルターで捕捉できる。また陰圧から常圧にした後、微生物溶解液を加えて、一定時間微生物溶解液をメンブレンフィルター下から染み落とすこと無く、第二層疎水性メンブレンフィルター上で保持することが可能となる。そして本発明によれば、第一層親水性メンブレンフィルターに捕捉した微生物の溶解が可能であり、かつ、第一層親水性メンブレンフィルター内の微生物由来生体物質を、第一層親水性メンブレンフィルター上に遊離することが可能である。
【００１６】
第一層親水性メンブレンフィルターの孔径は０．０５μｍ〜０．６５μｍが好ましく、第二層疎水性メンブレンフィルターの孔径は０．８μｍ〜８０μｍが好ましい。第一層親水性メンブレンフィルターの孔径を０．０５μｍ〜０．６５μｍとすることで、第一層親水性メンブレンフィルターに微生物を確実に捕捉することができ、第二層疎水性メンブレンフィルターの孔径を０．８μｍ〜８０μｍとすることで、湿潤剤を用いずかつ陰圧を生じさせることでサンプル水溶液のろ過を可能にし、かつ陰圧から常圧にすることで、微生物溶解液を疎水性メンブレンフィルター上に保持することが可能になる。
【００１７】
本発明の微生物検出方法は、サンプル水溶液中に微生物外の生体物質を分解する第一試薬を加えることで微生物外の生体物質を分解し、サンプル水溶液を二層構造メンブレンフィルターで吸引ろ過することにより、微生物を第一層親水性メンブレンフィルターに捕捉すると共にサンプル水溶液中に含まれる第一試薬や異物を除去する。その後、微生物内生体物質を抽出する第二試薬を加えて、第二層疎水性メンブレンフィルター上で保持することで、微生物から生体物質を抽出し、かつ、第一層親水性メンブレンフィルター内から生体物質を遊離し、遊離した生体物質と反応する第三試薬を作用させることで微生物を定量測定する。ここで、第二試薬としては、疎水性メンブレンフィルターを湿潤することのない試薬を用いる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、多量のサンプル水溶液のろ過が容易であり、微生物の溶解が確実にでき、微生物から抽出した生体物質をメンブレンフィルターから容易に溶離できる微生物検出装置と微生物検出方法を提供する。また、培養することなく、微生物の生死判別と生細胞の定量を、熟練を要することなく高感度で高精度、迅速、簡便に定量できる微生物検出装置及び微生物検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図２】微生物検出の処理手順を示すフロー図。
【図３】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図４】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図５】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図６】本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図。
【図７】容器底部への二層構造メンブレンフィルターの取り付け方の例を示す図。
【図８】容器底部への二層構造メンブレンフィルターの取り付け方の例を示す図。
【図９】本発明による二層構造メンブレンフィルターを用いた検出方法の途中工程を示す模式図。
【図１０】単層親水性メンブレンフィルターを用いた検出方法の途中工程を示す模式図。
【図１１】吸引ろ過の説明図。
【図１２】二層構造メンブレンフィルター用いた際の横軸を大腸菌数とＡＴＰ数の関係を示す図。
【図１３】各種条件で検出されたＡＴＰ数を示す図。
【図１４Ａ】二層構造メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力測定実験の説明図。
【図１４Ｂ】単層親水性メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力測定実験の説明図。
【図１５】二層構造メンブレンフィルター内のＡＴＰ分子の溶離実験の説明図。
【図１６】単層親水性メンブレンフィルター内のＡＴＰ分子の溶離実験の説明図。
【図１７】単層親水性メンブレンフィルター上に残っている微生物溶解液と、染み落ちた微生物溶解液の発光量の経時変化を示す図。
【図１８】二層構造メンブレンフィルター上の微生物溶解液の発光量の経時変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明の実施の形態を、図面を用いて説明する。だだし、以下の説明は本発明を何ら限定するものではない。
［実施例１］
（微生物の検出装置と方法）
図１は、本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図である。微生物検出装置は、二層構造メンブレンフィルター１０１を底部に備える容器１０２と、試薬供給部１０３、試薬供給用配管１０４、吸引部１０５、洗浄液供給部１０６、洗浄液供給用配管１０７、加熱部１０８、アーム１０９、分注部１１０、分注用配管１１１、検出部１１２、反応容器１１３、入力・制御部１１４を有する。入力・制御部１１４は装置各部の動作を統括制御する。容器１０２は装置に対して着脱自在である。また、反応容器１１３には発光試薬１１５が入っている。
【００２１】
二層構造メンブレンフィルター１０１は、上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６であり、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７である。第一層親水性メンブレンフィルター１１６は、微生物を確実に捕捉するため孔径が０．０５μｍ 〜０．６５μｍとする。また厚みが７μｍ〜２００μｍとし、もちろんこの厚みより薄くても厚くても構わないが、しかしこれより薄いとメンブレンフィルターの機械的な強度が弱くなり、ろ過中にメンブレンフィルターが破断することが予想され、これより厚いとメンブレンフィルター中に多くの溶液が残り、この後に追加する各種試薬が希釈されることが予想される。従って厚みは７μｍ〜２００μｍが好ましい。第二層疎水性メンブレンフィルター１１７は、水溶液を確実にろ過するため、孔径を０．８μｍ〜１８０μｍとする。また厚みが７μｍ〜８００μｍとし、もちろんこの厚みより薄くても厚くても構わないが、しかしこれより薄いとメンブレンフィルターの機械的な強度が弱くなり、ろ過中にメンブレンフィルターが破断することが予想され、これより厚いと吸引ろ過に時間がかかることが予想される。従って厚みは７μｍ〜８００μｍが好ましい。
【００２２】
図２は、図１に示した微生物検出装置による微生物検出の処理手順を示すフロー図である。なお、図３〜６は、本発明の微生物検出装置の別の形態であり、ともに説明する。
【００２３】
装置に、二層構造メンブレンフィルター１０１を底部に備える容器１０２を設置し、最初に入力・制御部１１４に、サンプルの粘性の高低や芽胞状態枯草菌の測定可否の初期値を入力し、微生物検出を開始する（Ｓ２０１）。容器１０２に測定対象微生物を含むサンプル水溶液を入れる（Ｓ２０２）。入力・制御部１１４は、ステップ２０３の判定でサンプル水溶液の粘性が高いと判定された場合、速やかなろ過を促すため加熱部１０８を駆動してサンプル水溶液を加熱する（Ｓ２０４）。ステップ２０１で入力されたサンプルの粘性が低い場合には、加熱工程を省略してステップ２０５に進む。
【００２４】
次に、試薬供給部１０３から試薬供給用配管１０４を通じて、微生物外生体物質分解試薬を、容器２０１内のサンプル水溶液に供給する（Ｓ２０５）。微生物外生体物質分解試薬としては、例えばＡＴＰ分解酵素、又はＤＮＡ（DeoxyriboNucleic Acid）分解酵素やＲＮＡ（RiboNucleic Acid）分解酵素が用いられる。
【００２５】
なお、図３に示すように、微生物検出装置が試薬供給部の代わりに各種の試薬３０１を収容した試薬槽３０２を備えている場合、分注部１１０が分注用配管１１１を通じて試薬槽３０２内の微生物外生体物質分解試薬をサンプル水溶液へ分注するように構成してもよい。図１に示した試薬供給部１０３を有する装置は、１日に多数のサンプルを測定する用途に適し、図３に示した試薬槽を備える装置は、少数のサンプルを測定する用途に適している。
【００２６】
次に、吸引部１０５によって陰圧を生じさせることで、二層構造メンブレンフィルター１０１を通して容器１０２内のサンプル水溶液をろ過する。この時、水溶液中の微生物は第一層親水性メンブレンフィルターに捕捉され、生体物質分解試薬や残存生体物質は廃液部１１８に流入して除かれる。その後、二層構造メンブレンフィルター１０１を洗浄する目的で、洗浄液供給部１０６から洗浄液を供給する（Ｓ２０６）。また、サンプル水溶液の粘性が高い場合、粘性を下げる目的で、洗浄液供給部１０６から洗浄液供給用配管１０７を通じて洗浄液を加えてもよい。同様に粘性を下げる目的で、加熱部１０８によって洗浄液を加熱してサンプル水溶液に加えてもよい。
【００２７】
次にステップ２０７の判定で、測定対象微生物が芽胞もしくは胞子を形成していると判断された場合、ろ過後、試薬供給部１０３から栄養型細胞変換試薬を加える（Ｓ２０８）。栄養型細胞変換試薬として用いられるのは、例えばアラニンやグルコース、リン酸の組み合わせであるが、液体培地を用いてもよい。なお図３のように、微生物検出装置が各種試薬槽３０２を備えている場合、分注部１１０によって試薬槽３０２内の栄養型細胞変換試薬をサンプル水溶液へ分注する。また、栄養型細胞変換を促すため加熱部１０８によって栄養型細胞変換試薬を加熱してもよい（Ｓ２０９）。また、栄養型細胞変換試薬を除く目的で、ろ過してもよい（Ｓ２１０）。ステップ２０７の判定がＮｏの場合、ステップ２０８からステップ２１０の処理を省略してステップ２１１に進む。
【００２８】
次に、試薬供給部１０３から微生物溶解液を加えて、微生物溶解液を二層構造メンブレンフィルター１０１上に保持する（Ｓ２１１）。微生物溶解液としては、例えば塩化ベンザルコニウムやトリクロロ酢酸、トリス緩衝液が用いられる。図３のように、微生物検出装置が各種試薬槽３０２を備えている場合には、分注部１１０によって試薬槽３０２内の微生物溶解液をサンプル水溶液へ分注する。
【００２９】
次に、容器１０２の二層構造メンブレンフィルター１０１上の微生物溶解液を分注部１１０の分注用配管１１１を通じて吸引し、アーム１０９を駆動して分注用配管１１１を検出部１１２の反応容器１１３上に移動し、微生物溶解液を反応容器１１３に移す（Ｓ２１２）。反応容器１１３内には発光試薬１１５が納められており、発光試薬１１５は微生物溶解液中に含まれる生体物質（例えばＡＴＰ、ルミノール、アルカリホスファターゼ）と反応して発光を生じる。発光試薬１１５は、例えばルシフェラーゼ・ルシフェリンである。なおペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼの基質を用いてもよい。その場合には、動物細胞の検出も可能になる。
【００３０】
なお、図４や図５に示す例のように、微生物検出装置が容器１０２の側面や下部に検出部１１２を備えている場合、試薬供給部１０３によって発光試薬を容器１０２の二層構造メンブレンフィルター１０１上に直接供給して、発光を生じさせてもよい。図５に示す微生物検出装置の例の場合、二層構造メンブレンフィルター１０１が底部全面ではなく一部領域に装着され、底部に透明領域が設けられている容器を用いる。検出部１１２は、その容器底部の透明領域に対向して配置され、容器内の溶液中の発光反応によって生じる発光を検出する。また、図６の装置例のように、微生物検出装置が励起光照射部６０１を備えている場合、発光試薬を用いなることなく、励起光照射部６０１から励起光を生体物質（例えばＤＮＡやＲＮＡ、ＮＡＤ、Nicotinamide Adenine Dinucleotide）に照射することで蛍光を生じさせてもよい。
【００３１】
生じた発光や蛍光は検出部１１２によって検出され（Ｓ２１３）、検出された発光量や蛍光量から微生物数が算出され（Ｓ２１４）、微生物検出が終了する。
【００３２】
なお、図２に示す処理工程において、ステップ２０７からステップ２１０の処理を省略して、ステップ２０６からステップ２１１に進み、ステップ２１３において発光測定すると、サンプル中に含まれる栄養型細胞数を検出することができる。また、ステップ２０６の後、ステップ２０８からステップ２１４の処理を経ることで非栄養型細胞数を検出することができる。このように、ステップ２０８からステップ２１０を省略した処理を実行して栄養型細胞数を検出した後、ステップ２０８に戻ってステップ２１４まで処理を反復することにより、サンプルに含まれる栄養型細胞数と非栄養型細胞数を区別して検出することができる。
【００３３】
［実施例２］
（微生物検出実験１：大腸菌）
本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器と、従来の親水性メンブレンフィルターを備える容器による大腸菌の検出感度を比較した。
【００３４】
二種類のメンブレンフィルターつき容器を用意した。１つは、底部に二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２であり、他の一つは底部に親水性メンブレンフィルターのみを備える容器である。
【００３５】
図７により、容器底部への二層構造メンブレンフィルターの取り付け方の例を説明する。二層構造メンブレンフィルター１０１は、上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、親水性メンブレンフィルターは、DuraporeメンブレンフィルターやIsopreメンブレンフィルター（日本ミリポア）でもよい。疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、疎水性メンブレンフィルターは、ポリプロピレンプレフィルター、孔径３０μｍ（日本ミリポア）でもよい。また材質がナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、疎水性であるポリビニリデンフロライド、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリアミド、ガラスファイバーで、孔径が０．８μｍ〜８０μｍのメンブレンフィルター、もしくはメッシュ構造でピッチサイズが１μｍ〜５９μｍであってもよい。
【００３６】
図７（ａ）に示すように、加工した親水性メンブレンフィルター１１６と疎水性メンブレンフィルター１１７を重ね、容器１０２の底部８０１に設けた装着部に装着し、環状の蓋８０２でフィルターの周縁部押さえ、図７（ｂ）に示すように、ネジ８０３で締める事で組み立てを完了した。なお、フィルターの固定はネジ式の蓋によって行ってもよい。例えば、図８（ａ）に示すように、加工した親水性メンブレンフィルター１１６と疎水性メンブレンフィルター１１７を重ね、容器１０２のネジ様溝を持つ底部９０１とネジ様溝を持つ環状の蓋９０２の間に挟み込み、図８（ｂ）に示すように、底部９０１と蓋９０２で締めることで組み立てもよい。なお、第一層親水性メンブレンフィルターと第二層疎水性メンブレンフィルターの間には隙間があってもよい。
【００３７】
親水性メンブレンフィルターのみを備える容器は、容器の構造は同じであるが、図１０（ａ）に略示するように、二層構造メンブレンフィルターの代わりに単層親水性メンブレンフィルター１００１を装着した容器１００２である。単層親水性メンブレンフィルター１００１には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００３８】
図９は本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器を用いた検出方法の途中工程を示す模式図、図１０は単層親水性メンブレンフィルターを備える容器を用いた検出方法の途中工程を示す模式図である。
【００３９】
測定対象微生物として大腸菌を用いた。大腸菌数が２０〜２０００個／１０ｍＬとなるように、大腸菌７０１をリン酸バッファーｐＨ７．４（インビトロジェン）に懸濁し、大腸菌懸濁液７０２を作製した。
【００４０】
図９（ａ）及び図１０（ａ）に示すように、まず二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター１００１上にそれぞれ大腸菌懸濁液７０２を１０ｍＬ加えた。次に、微生物外生体物質除去試薬であるルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ消去液を１０μＬ加えた。続いて、図１１（ａ）に示すように、吸引部１０５の吸引口１１０１を二層メンブレンフィルター下に接続し、図１１（ｂ）に示すように陰圧を生じさせ、大腸菌懸濁液とＡＴＰ消去液をろ過した。なお単層親水性メンブレンフィルターにおいても同様に大腸菌懸濁液とＡＴＰ消去液をろ過した。図９（ｂ）及び図１０（ｂ）は、ろ過後の状態を示している。ろ過後、微生物溶解液７０３であるルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ抽出液を２００μＬ加えて、図９（ｃ）及び図１０（ｃ）に示すように、大腸菌７０１からＡＴＰ分子７０４を抽出した。
【００４１】
静置している間、図１０（ｄ）に示すように、単層親水性メンブレンフィルター１００１下部から微生物溶解液１００３が染み落ちてきた。一方、二層構造メンブレンフィルター１０１では、図９（ｄ）に示すように、変化が観察されなかった。
【００４２】
二層構造メンブレンフィルター１０１と単層親水性メンブレンフィルター１００１上に残った微生物溶解液７０３を、分注部１１０を用いて検出部１１２上に設置された反応容器１１３内にあるルシフェールＨＳセット付属の発光試薬１１５に１０μＬ分注した。発光量をＡＴＰ数に算出した。なお二層構造メンブレンフィルター１０１について、図１２に示すように、縦軸をＡＴＰ数、横軸を大腸菌数とした図を作成した。
【００４３】
二層構造メンブレンフィルターを備える容器を用いた場合、ＡＴＰ数と大腸菌数は定量的な直線関係 (y＝１．４３１５ｘ−７．９８２３) を示し、大腸菌１個あたりＡＴＰ分子数は平均１．４amolを示したが、単層親水性メンブレンフィルターを備える容器を用いた場合、大腸菌１００個未満ではＡＴＰ分子を検出することができず、大腸菌１００個でＡＴＰ分子数は１amolを示し、二層構造メンブレンフィルター１０１は単層親水性メンブレンフィルター１００１に比べて約１００倍の値を示した。
【００４４】
この結果は、単層親水性メンブレンフィルターを備える容器では微生物溶解液を単層親水性メンブレンフィルター上に保持できないため、微生物溶解液１００３が単層親水性メンブレンフィルター下に染み落ちると共に、大腸菌由来ＡＴＰ分子１００４も落ちてしまい、その結果、単層親水性メンブレンフィルター１００１上の微生物溶解液に大腸菌由来ＡＴＰ分子１００４が溶離しなかったためと考えられる（図１０（ｄ））。
【００４５】
その一方で、二層構造メンブレンフィルターを備える容器では、二層構造メンブレンフィルター１０１上に微生物溶解液７０３が保持できるため、微生物溶解液７０３が大腸菌由来ＡＴＰ分子７０４と共に二層構造メンブレンフィルター１０１下に染み落ちることがない。また、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内で大腸菌から抽出されたＡＴＰ分子７０４は時間と共に二層構造メンブレンフィルター１０１上の微生物溶解液に溶離される（図９（ｄ））。
【００４６】
本発明の微生物検出装置は、大腸菌１個を高感度、高精度、迅速、簡便に計測できた。なお、大腸菌群やブドウ球菌などの細菌、サッカロミケス・ケレウィシエなどの酵母、アスペルギルス・ニガーなどの真菌に対しても同様の効果が得られる。
【００４７】
［実施例３］
（微生物検出実験２：芽胞状態枯草菌）
本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器と、従来の親水性メンブレンフィルターを備える容器による芽胞状態枯草菌の検出感度を比較した。
【００４８】
二種類のメンブレンフィルターつき容器を用意した。１つは、二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２、他の一つは親水性メンブレンフィルターのみを備える容器である。容器の構造及び容器への二層構造メンブレンフィルター及び単層親水性メンブレンフィルターの取り付け構造は、図７及び図８にて説明したとおりである。
【００４９】
二層構造メンブレンフィルター１０１は、上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、親水性メンブレンフィルターは、DuraporeメンブレンフィルターやIsopreメンブレンフィルター（日本ミリポア）でもよい。疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。なお、疎水性メンブレンフィルターは、ポリプロピレンプレフィルター、孔径３０μｍ（日本ミリポア）でもよい。また材質がナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、疎水性であるポリビニリデンフロライド、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリアミド、ガラスファイバーで、孔径が０．８μｍ〜８０μｍのメンブレンフィルター、もしくはメッシュ構造でピッチサイズが１μｍ〜５９μｍであってもよい。
【００５０】
親水性メンブレンフィルターのみを備える容器に装着した単層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００５１】
測定対象微生物として芽胞状態の枯草菌を用いた。枯草菌を１０％ｗ／ｖゼラチン溶液＋リン酸バッファー（ｐＨ７．４）（インビトロジェン）に懸濁して、枯草菌数２０００個／１０ｍＬとする粘性の高い枯草菌懸濁溶液を調製した。栄養型細胞変換試薬として、１００ｍＭアラニン＋１００ｍＭグルコース＋リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いた。微生物外生体物質除去試薬には、ルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ消去液を用いた。微生物溶解液には、ルシフェールＨＳセット付属のＡＴＰ抽出液を用いた。
【００５２】
測定には図３に示した微生物検出装置を用いた。本実施例では、入力・制御部１１４の入力用にタッチパネルディスプレイを用いた。なお、入力・制御部１１４はラップトップコンピューターや、デスクトップコンピューター、もしくは入力用ボタンとディスプレイ、入出力用（USB Universal Serial Bus）メモリの組み合わせなどを用いてもよい。
【００５３】
まず、枯草菌懸濁液は、ゼラチンを含むことから粘性が高い。また枯草菌懸濁液は、芽胞を形成した菌を含むため、入力・制御部１１４を用いて、枯草菌懸濁液の粘性が高いこと、芽胞を形成した菌を含むことを入力した。続いて微生物検出の開始を指示した。装置は、図２に示した処理手順に従って検出処理を実行する。
【００５４】
二層構造メンブレンフィルター上と単層親水性メンブレンフィルター上に、枯草菌懸濁液をそれぞれ１０ｍＬ加えた（Ｓ２０２）。入力・制御部１１４は、入力情報からステップ２０３の判定で枯草菌懸濁液は粘性が高いと判定し、加熱部１０８を用いて枯草菌懸濁液を４０℃で加熱して粘性を下げた（Ｓ２０４）。
【００５５】
枯草菌懸濁液にＡＴＰ消去液を１０μＬ加えて（Ｓ２０５）、枯草菌懸濁液とＡＴＰ消去液を、吸引部１０５が生じる陰圧により二層構造メンブレンフィルター１０１と単層親水性メンブレンフィルターでそれぞれろ過した（Ｓ２０６）。
【００５６】
ろ過後、入力・制御部１１４は、入力された情報からステップ２０７の判定で芽胞形成菌が含まれていると判定し、芽胞状態から栄養型細胞に変換するため、栄養型細胞変換試薬１ｍＬを二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター上にそれぞれ加えた（Ｓ２０８）。加熱部１０８により栄養型細胞変換試薬を４０℃もしくは４５℃で約１時間加熱し、芽胞状態から栄養型細胞への変換を促した（Ｓ２０９）。１時間後、単層親水性メンブレンフィルターでは、栄養型細胞変換試薬が単層親水性メンブレンフィルター下に染み落ちていたが、二層構造メンブレンフィルター１０１では栄養型細胞変換試薬が保持されていたため、これを再びろ過した（Ｓ２１０）。
【００５７】
続いてＡＴＰ抽出試薬を２００μＬ加えて１０分間静置した（Ｓ２１１）。静置している間、単層親水性メンブレンフィルター下からＡＴＰ抽出液が染み落ちたが、二層構造メンブレンフィルター１０１においては変化が観察されなかった。二層構造メンブレンフィルター１０１と単層親水性メンブレンフィルター上に残ったＡＴＰ抽出液１０μＬを、分注部１１０によって、検出部１１２上に設置された反応容器１１３内にある発光試薬１１５へ分注した（Ｓ２１２）。検出部１１２は、生じた発光を検出し（Ｓ２１３）、入力・制御部１１４は発光量からＡＴＰ数を算出した（Ｓ２１４）。
【００５８】
ＡＴＰ数の検出結果を図１３に示す。単層親水性メンブレンフィルターでは枯草菌１００個当たりＡＴＰ数は約１０amolであったが、二層構造メンブレンフィルター１０１では約２００amolと見積もられ、約２０倍の値を示した。この結果は、単層親水性メンブレンフィルターではＡＴＰ抽出液を単層親水性メンブレンフィルター上に保持できないため、ＡＴＰ抽出液が単層親水性メンブレンフィルター下に染み落ちると共に枯草菌由来ＡＴＰ分子も落ちてしまい、その結果、単層親水性メンブレンフィルター上に枯草菌由来ＡＴＰ分子が溶離しなかったと考えられる。一方、二層構造メンブレンフィルター１０１では、ＡＴＰ抽出液を二層構造メンブレンフィルター１０１上に保持できるため、ＡＴＰ抽出液が枯草菌由来ＡＴＰと共に二層構造メンブレンフィルター１０１下に染み落ちない。また、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内の枯草菌由来ＡＴＰ分子は、時間と共に二層構造メンブレンフィルター１１０上に溶離されたと考えられる。
【００５９】
なお、加熱部１０８で栄養型細胞変換試薬を加熱しない場合（図１３、２５℃、室温）は、枯草菌１００個当たりのＡＴＰ数は約１０amolであった。
以上のように、本発明の微生物検出装置は、枯草菌を高感度、高精度、迅速、簡便に計測できた。
【００６０】
本発明は種々の実験の積み重ねによって完成されたものである。以下に、本発明の基礎となった実験について説明する。
［実験例１］
（水溶液の保持と陰圧で水溶液のろ過が可能な疎水性メンブレンフィルターの調査）
水溶液を保持でき、かつ陰圧でろ過が可能な、疎水性メンブレンフィルターの有無を調べた。
【００６１】
調べた疎水性メンブレンフィルターの孔径とピッチサイズ、材質を表１に示す。実験に用いた水溶液は、超純水とリン酸緩衝液、微生物溶解液である。リン酸緩衝液は、５０ｍＭリン酸／ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．４である。微生物溶解液は０．２％塩化ベンザルコニウム＋２５ｍＭトリシン緩衝液ｐＨ１２である。
【表１】
【００６２】
各疎水性メンブレンフィルター上に各水溶液を滴下して、水溶液の保持能を調べた（表１）。その結果、すべての材質において水溶液を保持し、染み落ちることがなかった。
【００６３】
また各水溶液に対して各疎水性メンブレンフィルターの陰圧によるろ過の可否について調べた（表１）。その結果、疎水性メンブレンフィルターは、孔径が０．８μｍ〜８０μｍで、常圧では水溶液に対し非浸透で、陰圧にすると水溶液のろ過が可能であった。孔径が０．６μｍ以下になると陰圧によるろ過は困難となり、孔径０．４５μｍではろ過はできなかった。加えて、メッシュ構造の疎水性メンブレンフィルターは、ピッチサイズ１μｍ〜５９μｍで水溶液を保持し、また陰圧でろ過可能であった。
【００６４】
また孔径が０．８μｍ〜８０μｍ又はピッチサイズ１μｍ〜５９μｍの疎水性メンブレンフィルターの上に孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍの親水性メンブレンフィルターをのせた二層構造メンブレンフィルターを作製し、二層構造メンブレンフィルター上に水溶液を加えてろ過を試みたところ、二層構造メンブレンフィルターでも水溶液のろ過は可能であった。
【００６５】
［実験例２］
（二層構造メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力の測定実験）
二層構造メンブレンフィルターと単層親水性メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力を比較するため、二種類のメンブレンフィルターを底部に備えた容器を用意した。
【００６６】
１つは、二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２である（図１４Ａ（ａ））。二層構造メンブレンフィルター１０１は上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。第一層親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用した。
【００６７】
もう１つは、親水性メンブレンフィルターのみで構成される単層親水性メンブレンフィルター１００１を備える容器１００２である（図１４Ｂ（ａ））。単層親水性メンブレンフィルター１００１には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００６８】
二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター１００１上にそれぞれ微生物溶解液７０３として、０．２％塩化ベンザルコニウム＋２５ｍＭトリシン緩衝液ｐＨ１２を２００μＬ加えて１０分間静置した。５分間、１０分間の静置後、二層構造メンブレンフィルター１０１で変化は観察されなかったが（図１４Ａ（ｂ）（ｃ））、単層親水性メンブレンフィルター１００１では、静置時間と共に単層親水性メンブレンフィルター１００１下から微生物溶解液１００３が染み落ちた（図１４Ｂ（ｂ）（ｃ））。
【００６９】
単層親水性メンブレンフィルター１００１から染み落ちる微生物溶解液１００３の量を測定するため、染み落ちる微生物溶解液１００３を採取して重量の測定を試みた。微生物溶解液７０３を加えてから４分後、１０ｍｇの微生物溶解液１００３が染み落ちた。６分後、８分後に測定したところ、１５ｍｇ、２０ｍｇの微生物溶解液１００３が染み落ちた。合計４５ｍｇ分、微生物溶解液１００３が染み落ちることがわかった。
【００７０】
一方、二層構造メンブレンフィルター１０１下からは微生物溶解液が染み落ちなかった。代わりに二層構造メンブレンフィルター１０１上に微生物溶解液７０３を加えた直後（図１４Ａ（ａ））と１０分静置後（図１４Ａ（ｃ））で、二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２、微生物溶解液７０３の合計重量をそれぞれ測定し、その差を算出した。差は１ｍｇとなり、ほぼ重量に変化が無いことがわかった。この結果は、微生物溶解液は二層構造メンブレンフィルターを備える容器１０２の中に保持されることを示している。
この結果から、二層構造メンブレンフィルターは、微生物溶解液をその上に保持できることがわかった。
【００７１】
［実験例３］
（メンブレンフィルター内のＡＴＰ溶離実験）
二層構造メンブレンフィルターと単層親水性メンブレンフィルター内のＡＴＰ分子の溶離量を比較するため、二種類のメンブレンフィルターを備える容器を用意した。１つは、底部に二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２である（図１５（ａ））。二層構造メンブレンフィルター１０１は上層の第一層が親水性メンブレンフィルター１１６、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター１１７で構成される。第一層親水性メンブレンフィルター１１６には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルター１１７には孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００７２】
もう１つは、親水性メンブレンフィルターのみで構成される単層親水性メンブレンフィルター１００１を底部に備える容器１００２である（図１６（ａ））。単層親水性メンブレンフィルター１００１には、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００７３】
ＡＴＰ溶液としてルシフェールＡＴＰ標準試薬（キッコーマン）を用いて２００００amol／１０μＬの濃度のＡＴＰ溶液を作製した。発光試薬１１５として、ＡＴＰ・ルシフェラーゼ・ルシフェリン反応を生じるルシフェールＨＳセット（キッコーマン）付属の発光試薬を用いた。
【００７４】
まず、二層構造メンブレンフィルター１０１上と単層親水性メンブレンフィルター１００１上にそれぞれＡＴＰ溶液を１０μＬ加えて、第一層親水性メンブレンフィルター１１６と単層親水性メンブレンフィルター１００１内にＡＴＰ分子１５０１を染み込ませた（図１５（ａ）、図１６（ａ））。続いて、微生物溶解液７０３として、０．２％塩化ベンザルコニウム＋２５ｍＭトリシン緩衝液ｐＨ１２を２００μＬ加えた後、静置した（図１５（ｂ）、図１６（ｂ））。
【００７５】
静置している間、単層親水性メンブレンフィルター１００１下から微生物溶解液１００３が時間と共に染み落ちてきた（図１６（ｃ）（ｄ））。一方、二層構造メンブレンフィルター１０１では変化は観察されなかった（図１５（ｃ）（ｄ））。
【００７６】
単層親水性メンブレンフィルター１００１下から染み落ちる微生物溶解液１００３中のＡＴＰ分子１６０１の数と、単層親水性メンブレンフィルター１００１上に遊離した微生物溶解液７０３中のＡＴＰ分子１５０１の数（図１６（ｃ）（ｄ））を定量的に評価するため、単層親水性メンブレンフィルター１００１上に残っている微生物溶解液７０３と単層親水性メンブレンフィルター１００１下から染み落ちた微生物溶解液１００３をそれぞれ１０μＬ採取し、反応容器１１３中の発光試薬１１５に加えて、生じた発光反応を検出部１１２で検出した。
【００７７】
単層親水性メンブレンフィルター１００１上に微生物溶解液７０３を加えてから４分後、６分後、８分後に、染み落ちた微生物溶解液１００３の発光量は、約２００００ＣＰＳ（Countper Second）、２５０００ＣＰＳ、３００００ＣＰＳを示した（図１７）。染み落ちる前、単層親水性メンブレンフィルター１００１内にはＡＴＰ分子が２００００amol存在し、２００μＬの微生物溶解液７０３を単層親水性メンブレンフィルター１００１上に加えたことから、ＡＴＰ分子１５０１が理想的に微生物溶解液７０３中に拡散した場合、ＡＴＰ濃度は約１０００amol／１０μＬになる。なお１０００amol／１０μＬのＡＴＰ濃度の発光量を測定すると、発光量は約１００００ＣＰＳを示す。従って、単層親水性メンブレンフィルター１００１から染み落ちた微生物溶解液１００３中のＡＴＰ分子１６０１の数は、理想的にＡＴＰ分子１５０１が微生物溶解液７０３中に拡散した場合と比較して、２〜３倍多いことがわかった。
【００７８】
一方、単層親水性メンブレンフィルター１００１上に残った微生物溶解液７０３に含まれるＡＴＰ分子１５０１の数を発光測定したところ、１０分経過しても約５０００ＣＰＳが最高であった。染み落ちた微生物溶解液１００３を測定した時に比べて、１／４〜１／６の発光量であった（図１７）。この結果から、単層親水性メンブレンフィルター１００１内のＡＴＰ分子１５０１（図１６（ａ））は１／４〜１／６程度しか親水性メンブレンフィルター１００１上に遊離しないことがわかった（図１６（ｄ））。
【００７９】
一方、二層構造メンブレンフィルター１０１下から微生物溶解液７０３は染み落ちなかった。代わりに、微生物溶解液７０３を二層構造メンブレンフィルター１０１上に加えた直後と２〜２０分静置した後で、二層構造メンブレンフィルター１０１上の微生物溶解液７０３を１０μＬずつ採取して発光測定した。各静置時間において、発光量は約９８００ＣＰＳを示した（図１８）。この結果は、微生物溶解液７０３を二層構造メンブレンフィルター１０１を備える容器１０２の中に保持することで、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内に染み込んだＡＴＰ分子１５０１（図１５（ａ））を二層構造メンブレンフィルター１０１上に溶離できていることを示している（図１５（ｄ））。
【００８０】
この結果から、二層構造メンブレンフィルター１０１上に微生物溶解液７０３を保持することで、第一層親水性メンブレンフィルター１１６内からＡＴＰ分子１５０１を効率よく溶離できることがわかった。また、第一層親水性メンブレンフィルターの直径がより小さく、また厚さが薄いほど効率よく溶離できる。
【００８１】
［実験例４］
（湿潤剤を用いた場合の微生物計測実験）
二層構造メンブレンフィルターと、湿潤剤を染みこませることで水溶液がろ過できる疎水性メンブレンフィルターを用いた時の微生物検出感度を比較するため、四種類のメンブレンフィルターを備える容器を用意した。
【００８２】
（１）二層構造メンブレンフィルターを備える容器：
二層構造メンブレンフィルターは上層の第一層が親水性メンブレンフィルター、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルターで構成される。第一層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルターには孔径１０μｍのマイテックスメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８３】
（２）単層親水性メンブレンフィルターを備える容器：
単層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８４】
（３）第一層に親水性メンブレンフィルターと、第二層に湿潤剤を染みこませることで水溶液がろ過できる疎水性メンブレンフィルターで構成される要湿潤剤二層構造メンブレンフィルターを備える容器：
二枚重ねのメンブレンフィルターの第一層親水性メンブレンフィルターには、孔径０．４５μｍ、厚さ１５０μｍ、空隙率７９％のＭＦ−ミリポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。第二層の疎水性メンブレンフィルターとして、孔径０．４５μｍの疎水性デュラポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８５】
（４）湿潤剤を染みこませることで水溶液がろ過できる疎水性メンブレンフィルターで構成される要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルターを備える容器：
単層の疎水性メンブレンフィルターとして孔径０．４５μｍの疎水性デュラポアメンブレンフィルター（日本ミリポア）を使用し、直径を０．５ｃｍに加工した。
【００８６】
測定対象微生物として大腸菌を用いた。大腸菌をリン酸バッファー（ｐＨ７．４）（インビトロジェン）に懸濁して、大腸菌数が１００個／１０ｍＬとなるように調製した。微生物外生体物質除去試薬として、ルシフェールＨＳセット（キッコーマン）付属のＡＴＰ消去液を用いた。微生物溶解液には、ルシフェールＨＳセット（キッコーマン）付属のＡＴＰ抽出液を用いた。
【００８７】
二層構造メンブレンフィルター上と、単層親水性メンブレンフィルター上、要湿潤剤二層構造メンブレンフィルター上、要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルター上にそれぞれ大腸菌懸濁液を１０ｍＬ加えた。また第一試薬として、ＡＴＰ消去液を１０μＬ加えた。
【００８８】
二層構造メンブレンフィルターと、単層親水性メンブレンフィルターは大腸菌懸濁液をろ過できた。しかし要湿潤剤二層構造メンブレンフィルターと要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルターは大腸菌懸濁液をろ過できなかったため、各疎水性メンブレンフィルターに湿潤剤であるメチルアルコールを染み込ませてろ過を可能にした。
【００８９】
ろ過後、第二試薬として、ＡＴＰ抽出液を２００μＬ加えた。二層構造メンブレンフィルター上と、単層親水性メンブレンフィルター上、要湿潤剤二層構造メンブレンフィルター上、要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルター上に残ったＡＴＰ抽出液１０μＬの発光測定をした。
【００９０】
二層構造メンブレンフィルターでは、大腸菌１００個からＡＴＰは１４０amolが検出された。一方、単層親水性メンブレンフィルターでは１０amol、要湿潤剤二層構造メンブレンフィルターと要湿潤剤単層疎水性メンブレンフィルターでは、１２amolが検出された。各メンブレンフィルターで検出されたＡＴＰ数は、二層構造メンブレンフィルターに比べて約１／１０以下に減少した。
【００９１】
この結果は、疎水性メンブレンフィルターに染み込ませた湿潤剤が、大腸菌を損傷ないし溶解したことにより、大腸菌由来ＡＴＰがろ過の間に流れ出てしまったためと考えられる。
【００９２】
湿潤剤を使って疎水性メンブレンフィルターでろ過する微生物検出方法は、微生物の検出感度と精度共を減少させる。一方、湿潤剤を使わない二層構造メンブレンフィルターは、微生物の検出感度と精度を向上した。
【符号の説明】
【００９３】
１０１ 二層構造メンブレンフィルター
１０２ 容器
１０３ 試薬供給部
１０５ 吸引部
１０６ 洗浄液供給部
１０８ 加熱部
１０９ アーム
１１０ 分注部
１１２ 検出部
１１３ 反応容器
１１４ 入力・制御部
１１５ 発光試薬
１１６ 親水性メンブレンフィルター
１１７ 疎水性メンブレンフィルター
１１８ 廃液部
３０１ 試薬
３０２ 試薬槽
６０１ 励起光照射部
７０１ 大腸菌
７０２ 大腸菌懸濁液
７０３ 微生物溶解液
７０４ 大腸菌由来ＡＴＰ分子
８０１ 容器の底部
８０２ 環状の蓋
８０３ ネジ
９０１ 容器のネジ様溝を持つ底部
９０２ ネジ様溝を持つ環状の蓋
１００１ 単層親水性メンブレンフィルター
１００２ 容器
１００３ 染み落ちた微生物溶解液
１００４ 染み落ちた大腸菌由来ＡＴＰ分子
１１０１ 吸引口
１５０１ ＡＴＰ分子
１６０１ 染み落ちたＡＴＰ分子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターと、
前記二層構造のメンブレンフィルターの周縁部を固定して底部に保持する容器と、
を備えることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項２】
請求項１記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターは微生物を捕捉し、前記疎水性メンブレンフィルターは試薬を保持する機能を有することを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項３】
請求項１又は２記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターの孔径は前記疎水性メンブレンフィルターの孔径より小さいことを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記疎水性メンブレンフィルターは、多孔性で孔径が０．８μｍ〜８０μｍのメンブレンフィルター、もしくはメッシュ構造でピッチサイズが１μｍ〜５９μｍであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記疎水性メンブレンフィルターは、厚みが７μｍ〜８００μｍのメンブレンフィルターであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍのメンブレンフィルターであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターは、厚みが７μｍ〜２００μｍのメンブレンフィルターであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項８】
上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターを底部に備える試料容器と、
前記二層構造メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせる吸引部と、
微生物外生体物質除去試薬と微生物溶解液を個別に前記試料容器に添加する試薬供給部と、
試料の発光を検出する検出部と、
装置各部の制御を行う制御部とを有し、
前記制御部は、前記試薬供給部を作動させて前記試料容器中の試料に微生物外生体物質除去試薬を添加したのち前記吸引部を作動させて前記試料容器中の溶液を前記二重構造メンブレンフィルターでろ過し、その後、前記試薬供給部を作動させて前記試料容器に前記微生物溶解液を添加する制御を行うことを特徴とする微生物検出装置。
【請求項９】
請求項８記載の微生物検出装置において、前記前記親水性メンブレンフィルターの孔径は前記疎水性メンブレンフィルターの孔径より小さいことを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１０】
請求項８記載の微生物検出装置において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍであり、前記疎水性メンブレンフィルターは孔径が０．８μｍ〜８０μｍであることを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の微生物検出装置において、前記試薬供給部は前記試料容器に発光試薬を添加し、前記検出部は、前記発光試薬が添加された試料容器中の溶液から発生する発光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の微生物検出装置において、分注部を備え、前記検出部は、前記分注部によって反応容器に分注された前記微生物溶解液が添加された試料溶液と発光試薬との反応によって生じる発光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の微生物検出装置において、励起光照射部を備え、前記検出部は、前記励起光照射部からの励起光照射によって試料から発生される蛍光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１４】
上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターを底部に備える試料容器に微生物を含む試料を添加する工程と、
微生物外生体物質除去試薬を添加する工程と、
前記二層メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせ、前記試料容器内の溶液をろ過する工程と、
前記微生物を溶解する試薬を添加し前記微生物から生体物質を抽出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の微生物検出方法において、更に、
前記生体物質と発光試薬とを反応させる工程と、
前記反応で生じた発光を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の微生物検出方法において、更に、
前記生体物質に励起光を照射する工程と、
前記励起光照射によって生じた蛍光を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項記載の微生物検出方法において、前記微生物を溶解する試薬は前記疎水性メンブレンフィルターを湿潤しない試薬であることを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項記載の微生物検出方法において、前記親水性メンブレンフィルターの孔径は前記疎水性メンブレンフィルターの孔径より小さいことを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれか１項記載の微生物検出方法において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍであり、前記疎水性メンブレンフィルターは孔径が０．８μｍ〜８０μｍであることを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか１項記載の微生物検出方法において、試料の粘性が高いとき、前記微生物外生体物質除去試薬を添加に先だって試料の加熱及び／又は洗浄液を供給する工程を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか１項記載の微生物検出方法において、測定対象微生物が非栄養型細胞を形成しているとき、前記ろ過の後、栄養型細胞変換試薬を添加する工程を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１】
上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターと、
前記二層構造のメンブレンフィルターの周縁部を固定して底部に保持する容器と、
を備えることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項２】
請求項１記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターは微生物を捕捉し、前記疎水性メンブレンフィルターは試薬を保持する機能を有することを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項３】
請求項１又は２記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターの孔径は前記疎水性メンブレンフィルターの孔径より小さいことを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記疎水性メンブレンフィルターは、多孔性で孔径が０．８μｍ〜８０μｍのメンブレンフィルター、もしくはメッシュ構造でピッチサイズが１μｍ〜５９μｍであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記疎水性メンブレンフィルターは、厚みが７μｍ〜８００μｍのメンブレンフィルターであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍのメンブレンフィルターであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の微生物検出処理用試料容器において、前記親水性メンブレンフィルターは、厚みが７μｍ〜２００μｍのメンブレンフィルターであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
【請求項８】
上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターを底部に備える試料容器と、
前記二層構造メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせる吸引部と、
微生物外生体物質除去試薬と微生物溶解液を個別に前記試料容器に添加する試薬供給部と、
試料の発光を検出する検出部と、
装置各部の制御を行う制御部とを有し、
前記制御部は、前記試薬供給部を作動させて前記試料容器中の試料に微生物外生体物質除去試薬を添加したのち前記吸引部を作動させて前記試料容器中の溶液を前記二重構造メンブレンフィルターでろ過し、その後、前記試薬供給部を作動させて前記試料容器に前記微生物溶解液を添加する制御を行うことを特徴とする微生物検出装置。
【請求項９】
請求項８記載の微生物検出装置において、前記前記親水性メンブレンフィルターの孔径は前記疎水性メンブレンフィルターの孔径より小さいことを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１０】
請求項８記載の微生物検出装置において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍであり、前記疎水性メンブレンフィルターは孔径が０．８μｍ〜８０μｍであることを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の微生物検出装置において、前記試薬供給部は前記試料容器に発光試薬を添加し、前記検出部は、前記発光試薬が添加された試料容器中の溶液から発生する発光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の微生物検出装置において、分注部を備え、前記検出部は、前記分注部によって反応容器に分注された前記微生物溶解液が添加された試料溶液と発光試薬との反応によって生じる発光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか１項記載の微生物検出装置において、励起光照射部を備え、前記検出部は、前記励起光照射部からの励起光照射によって試料から発生される蛍光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
【請求項１４】
上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターを底部に備える試料容器に微生物を含む試料を添加する工程と、
微生物外生体物質除去試薬を添加する工程と、
前記二層メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせ、前記試料容器内の溶液をろ過する工程と、
前記微生物を溶解する試薬を添加し前記微生物から生体物質を抽出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の微生物検出方法において、更に、
前記生体物質と発光試薬とを反応させる工程と、
前記反応で生じた発光を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の微生物検出方法において、更に、
前記生体物質に励起光を照射する工程と、
前記励起光照射によって生じた蛍光を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項記載の微生物検出方法において、前記微生物を溶解する試薬は前記疎水性メンブレンフィルターを湿潤しない試薬であることを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項記載の微生物検出方法において、前記親水性メンブレンフィルターの孔径は前記疎水性メンブレンフィルターの孔径より小さいことを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれか１項記載の微生物検出方法において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が０．０５μｍ〜０．６５μｍであり、前記疎水性メンブレンフィルターは孔径が０．８μｍ〜８０μｍであることを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか１項記載の微生物検出方法において、試料の粘性が高いとき、前記微生物外生体物質除去試薬を添加に先だって試料の加熱及び／又は洗浄液を供給する工程を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか１項記載の微生物検出方法において、測定対象微生物が非栄養型細胞を形成しているとき、前記ろ過の後、栄養型細胞変換試薬を添加する工程を有することを特徴とする微生物検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１０−１９３８３５（Ｐ２０１０−１９３８３５Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４４６４８（Ｐ２００９−４４６４８）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
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