微生物濃縮プロセス及びその際に使用するための濃縮剤
検出又は検定のために微生物を捕捉又は濃縮するプロセスは、（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、（１）少なくとも１つの無機濃縮剤を少なくとも１つのカチオン含有塩溶液と接触させて、無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（２）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を乾燥させることと、を含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を準備することと、（ｃ）少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか、又はそれによって捕捉されるように、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を試料と接触させることと、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００９年１２月２２日に出願された、米国仮出願第６１／２８９，２１３号の優先権を主張し、その内容を本明細書に参考として組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、微生物が検出又は検査に対して生存可能な状態を保つように、微生物を捕捉又は濃縮するための方法に関するものである。他の態様において、本発明は、このような濃縮プロセスを実行する際に使用するための濃縮剤を調製する方法（並びに、結果として得られる濃縮剤及び結果として得られる濃縮剤を含む診断キット）にもまた関するものである。
【背景技術】
【０００３】
微生物汚染により生じる食品媒介疾患及び院内感染は、世界中の無数の場所で懸案となっている。したがって、存在する微生物の素性及び／又は量を決定するために、さまざまな医療、食品、環境、又はその他の試料中における、細菌又は他の微生物の存在を検定することがしばしば望ましく、あるいは必要である。
【０００４】
例えば、細菌ＤＮＡ又は細菌ＲＮＡを検定して、たとえ他の細菌種の存在においても特定の細菌種の存在又は不在を評価することができる。しかしながら、特定の細菌の存在を検出する能力は、少なくとも部分的に、分析される試料中の細菌の濃度に依存する。細菌試料は、検出に適切な濃度の確保に試料中の細菌の数を増加させるために播種され又は培養されるが、この培養工程はしばしば時間がかかり、評価結果を顕著に遅らせることがある。
【０００５】
試料中の細菌を濃縮することで、培養時間を短縮することができ、培養工程の必要性を排除することすら可能になる。このように、菌株に特異的な抗体を使用することによって（例えば、抗体をコーティングした磁性粒子又は非磁性粒子の形態で）、特定の細菌株を分離する（及びこれにより濃縮する）ための方法が開発されている。しかしながらこのような方法は高価であり、少なくとも一部の診断用途に望まれるよりも依然としてやや遅い傾向がある。
【０００６】
菌株特異的でない濃縮方法も使用されている（例えば、試料中に存在する微生物のより総合的な評価を得るため）。混合した微生物群を濃縮した後、所望ならば、菌株特異的なプローブを用いることによって特定の菌株の存在を判定することができる。
【０００７】
微生物の非特異的な濃縮又は捕捉は、炭水化物とレクチンタンパク質との相互作用に基づいた方法によって達成されている。これまでに非特異的捕捉装置としてキトサンをコーティングした支持体が使用され、微生物の栄養素の役目を果たす物質（例えば、炭水化物、ビタミン、鉄キレート化合物、及びシデロホア）が、微生物の非特異的捕捉を提供するための配位子として有用であることも記述されてきた。
【０００８】
さまざまな無機材料（例えばヒドロキシアパタイト及び金属水酸化物）が、細菌を非特異的に結合し濃縮するために使用されてきた。非特異的な捕捉のためには、無機結合剤の使用及び／又は不使用の、物理的な濃縮方法（例えば濾過、クロマトグラフィー、遠心分離、及び重力沈降）も利用されている。このような非特異的な濃縮方法は、速度、費用（少なくとも一部のものは高価な装置、材料、及び／又は訓練を受けた技術者が必要になる）、試料要件（例えば、試料の性質及び／又は量の制限）、空間的要件、使用の容易さ（少なくとも一部のものは複雑な複数の工程のプロセスを必要とする）、現場使用の適合性、及び／又は高価さの点において様々に異なっている。
【０００９】
非特異的な濃縮方法の少なくとも幾つか（例えば、無機結合剤を利用する方法の少なくとも幾つか）は、微生物結合を強化するための添加剤としてのカチオン含有吸着緩衝液の使用を伴っている。このような緩衝液は、典型的に、液体形態で（例えば、塩水溶液の形態で）使用されている。このような緩衝液の現場での使用は、菌液の移送及び取扱い、又は滅菌状態下における緩衝液の乾燥塩からの現場での再構成のどちらかを必要とするため、吸着緩衝液の現場での使用に対する好適性は、幾らか制限されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このように、本発明者らは、病原微生物を迅速に検出するための方法に対する切迫したニーズがあると認識している。このようなプロセスは、好ましくは迅速なだけでなく、コストが低く、簡単であり（複雑な機器又は手順の必要がない）、及び／又は様々な条件下で有効である（例えば、様々なタイプの試料マトリックスで使用でき、細菌の量が変わっても、及び試料の量が変わっても、使用できる）。
【００１１】
簡単に言えば、１つの態様では、本発明は、微生物が１つ以上の株の検出又は検定の目的で生存可能な状態を保つように、試料中に存在する微生物株（例えば細菌、真菌、酵母、原生動物、ウイルス（非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む）、及び細菌内生胞子）を、非特異的に濃縮する方法を提供する。本方法は、（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、（１）少なくとも１つの無機濃縮剤（好ましくは、粒子無機濃縮剤）を少なくとも１つのカチオン含有塩溶液（好ましくは、水性）と接触させて（好ましくは洗浄することによって）、無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（２）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を（好ましくは、２５℃より高い温度に加熱することによって）乾燥させることと、を含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を（好ましくは流体の形態で）準備することと、（ｃ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と（好ましくは、混合することによって）接触させることであって、それにより少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか、又はそれによって捕捉されることと、を含む。カチオン含有塩溶液は、好ましくは、少なくとも１つの多価カチオン（より好ましくは、少なくとも１つの二価カチオン、最も好ましくは、二価カルシウムカチオン、二価マグネシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの二価カチオン）を含む。
【００１２】
好ましくは、濃縮プロセスは、少なくとも１つの結合された微生物株の存在を検出すること（例えば、培養による方法、顕微鏡／画像手法、遺伝子学的方法、生物発光による方法、又は免疫学的検出方法）、及び／又は結果として得られた微生物結合された濃縮剤を凝離すること（好ましくは、重力沈殿により）を更に含む。このプロセスは所望により、得られた凝離濃縮剤を試料から分離することを更に含む。
【００１３】
本発明の濃縮プロセスは、特定の微生物株を標的とするものではない。むしろ、比較的安価な非特異的な無機濃縮剤の捕捉効率又は結合効率は、驚くべきことに、薬剤を吸着緩衝液と接触させ、次いで乾燥させる、簡単な表面処理方法によって強化され得ることが発見された。結果として得られる吸着緩衝液改質無機濃縮剤は、さまざまな微生物を捕捉することにおいて、それらの未処理の対応物よりも少なくとも幾らかは効率的であり、調製後は、滅菌液緩衝溶液の移送及び／又は取扱いの必要性、あるいは滅菌状態下における緩衝溶液の現場での再構築の必要性なく、現場で（現地で）使用され得る。吸着緩衝液改質無機濃縮剤を使用して、１つ以上の微生物株（好ましくは、１つ以上の細菌株）をより容易、かつ迅速に検定することができるように、試料（例えば、食品試料）中に存在する微生物株を、非株特異的な方法で濃縮することができる。
【００１４】
本発明の濃縮プロセスは比較的簡単かつ低コストであり（複雑な装置又は高価な株特異性物質を必要としない）、比較的迅速であり得る（好ましい実施形態は、濃縮剤のない対応する対照試料に比べ、試料中に存在する微生物の少なくとも約７０パーセント（より好ましくは少なくとも約８０パーセント、最も好ましくは少なくとも約９０パーセント）を約３０分以内に捕捉する）。加えて、この方法は、さまざまな微生物（グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方などの病原体を含む）及びさまざまな試料（さまざまな試料マトリックスを含み、しかも少なくとも一部の従来技術とは違って、微生物含有量が少ない試料及び／又は大量の試料であっても）に有効であり得る。よって、本発明の方法の少なくともいくつかの実施形態は、さまざまな状況下で病原微生物を迅速に検出するための低コストで単純な方法に対する、上述のような緊迫したニーズに対応することができる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液（塩又は塩溶液）を用いて、少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理して（例えば、物理蒸着（ＰＶＤ）を含む本明細書に記載の方法を含む、２つの物質の間に接触をもたらす任意のさまざまな既知の方法又は今後開発される方法によって接触させることによって）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、少なくとも１つのカチオンの原子（カチオン原子の合計は、例えば、以下の表４を参照のこと）とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤の比率よりも大きい（好ましくは少なくとも約５０パーセント大きく、より好ましくは少なくとも約７５パーセント大きく、更により好ましくは少なくとも約１００パーセント大きく、最も好ましくは少なくとも約２００パーセント又は３００パーセント大きい）表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤（好ましくは、実質的に乾燥又は無溶媒の形態で）を準備することを含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を準備することと、（ｃ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤を試料と接触させることであって、それにより少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか、又はそれによって捕捉されることと、を含む、好ましい濃縮プロセスを提供する。有用な物理蒸着（ＰＶＤ）技術は、（例えば、珪藻土上の金属付着に関して）以下に記載されるものを含む。
【００１６】
更に他の態様において、本発明は、それぞれの場合において、調製プロセスが微生物含有試料の実質的な非存在下において実行される（つまり、無機濃縮剤と少なくとも１つの微生物株を含む試料を接触させるより前、したがって無機濃縮剤が本質的に少なくとも１つの無機材料からなる）という条件で、吸着緩衝液改質無機濃縮剤が（ａ）少なくとも１つの無機濃縮剤（好ましくは、微粒子無機濃縮剤）と少なくとも１つのカチオン含有塩溶液（好ましくは、水性）を（好ましくは、洗浄することによって）接触させて、無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（ｂ）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を（好ましくは、２５℃よりも高い温度に熱することによって）乾燥させることと、を含むプロセスによって調製されるか、あるいは、吸着緩衝液改質無機濃縮剤が、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液（塩又は塩溶液）を用いて、少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理して（例えば、物理蒸着（ＰＶＤ）を含む本明細書に記載の方法を含む、２つの物質の間に接触をもたらす任意のさまざまな既知の方法又は今後開発される方法によって接触させることによって）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、少なくとも１つのカチオンの原子（カチオン原子の合計は、例えば以下の表４を参照のこと）とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤の比率よりも大きい（好ましくは少なくとも約５０パーセント大きく、より好ましくは少なくとも約７５パーセント大きく、更により好ましくは少なくとも約１００パーセント大きく、最も好ましくは少なくとも約２００パーセント又は３００パーセント大きい）表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤（好ましくは、実質的に乾燥又は無溶媒の形態で）を準備することを含むプロセスによって調製される、本発明の濃縮プロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製のための２つのプロセス（加えて、それによって調製された改質薬剤及びその改質薬剤を含む診断キット）を提供する。有用な物理蒸着（ＰＶＤ）技術は、（例えば、珪藻土上の金属付着に関して）以下に記載されるものを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の「発明を実施するための形態」では、種々の組の数値範囲（例えば、特定の部分における炭素原子の数、又は特定の成分の量など）が記載され、各組内では、範囲の任意の下限を範囲の任意の上限と対にすることができる。同様に、このような数値範囲は、範囲内に含まれる全ての数を含むことを意味する（例えば１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「及び／又は」は、１つ若しくは全ての列挙した要素、又は２つ以上の列挙した要素のいずれかの組み合わせを意味する。
【００１９】
用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同一又は異なる条件下において、他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００２０】
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が説明文及び特許請求の範囲において現れる場合、限定的な意味を有するものではない。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。そのため、例えば、「１つの（ａ）」標的微生物を含有する疑いがある液体試料は、液体試料が「１つ以上の」標的微生物を含み得ることを意味すると解釈することができる。
【００２２】
上記「課題を解決するための手段」の節は、全ての実施形態又は本発明の全ての実施を説明しようとするものではない。以下の「発明を実施するための形態」が実施形態をより具体的に例示する。「発明を実施するための形態」にわたり、複数の実施例の一覧を通してガイダンスが提供されており、それら実施例は様々な組合せで用いられ得る。いずれの場合にも、記載した一覧は、代表的な群としてのみ役立つものであり、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
【００２３】
用語の定義
本特許出願で使用される場合：
「濃縮剤」は、微生物を結合する材料又は組成物（好ましくは少なくとも約６０パーセント、より好ましくは少なくとも約７０パーセント、更により好ましくは少なくとも約８０パーセント、最も好ましくは少なくとも約９０パーセントの微生物捕捉又は結合効率を有する）を意味する。
「培養デバイス」は、細胞分裂を少なくとも１回生じさせ得る条件下において、微生物を増殖させるために使用することができる、装置を意味する（好ましくは培養デバイスは、偶発的汚染の可能性を低減するか最小化するハウジング及び／又は微生物の増殖を支持する栄養素供給源を含む）。
「検出」とは、これによりその微生物が存在すると判定させる、微生物の少なくとも構成要素の同定を意味する。
「一般的検出」とは、標的微生物に由来するＤＮＡ又はＲＮＡなどの一般的物質の構成要素の同定を意味する。
「免疫学的検出」とは、標的微生物に由来するタンパク質又はプロテオグリカンなどの抗原性物質の同定を意味する。
「微生物」は、分析又は検出に好適な遺伝物質を有する何らかの細胞又は粒子を意味する（例えば、細菌、酵母、ウイルス、及び細菌内生胞子が挙げられる）。
「微生物株」は、検出方法により識別可能な微生物（例えば、異なる属、属内の異なる種、又は種内の異なる隔離体の微生物）の特定のタイプを意味する。
「試料」は、（例えば分析のために）採取される物質又は材料を意味する。
「試料マトリックス」は、試料の微生物以外の試料の構成成分を意味する。
「標的微生物」とは、検出したい微生物を意味する。
【００２４】
無機濃縮剤
全般
本発明のプロセスを実行する際に使用するために好適な濃縮剤は、微生物を結合することができる無機材料又は組成物を含む。好ましくは、無機濃縮剤は、対応する濃縮剤不含の対照試料と比較して、試料中に存在する微生物の少なくとも約６０パーセント（より好ましくは少なくとも約７０パーセント、更により好ましくは少なくとも約８０パーセント、最も好ましくは少なくとも約９０パーセント）を捕捉又は結合することができる。
【００２５】
好ましい無機材料としては、金属酸化物、金属ケイ酸塩（例えば、ケイ酸マグネシウム）、金属アルミノケイ酸塩、シリカ、金属炭酸塩（例えば、炭酸カルシウム）、金属リン酸塩（例えば、ヒドロキシアパタイト）、珪藻土、金属酸化物改質珪藻土、表面改質珪藻土等、及びこれらの組み合わせから選択される材料が挙げられる。望まれる場合には、このような無機材料のコーティングを担持する粒子（例えば、無機表面コーティングを持つ磁気コアを備える粒子）が、使用されてもよい。
【００２６】
好ましい無機材料には、シリコン含有無機材料（例えば、金属ケイ酸塩、金属アルミノケイ酸塩、シリカ、珪藻土、表面改質珪藻土等、及びこれらの組み合わせ）及びこれらの組み合わせが挙げられる。より好ましい無機材料には、金属ケイ酸塩、金属アルミノケイ酸塩、シリカ、珪藻土、金属酸化物改質珪藻土、金改質珪藻土、又は白金改質珪藻土、及びこれらの組み合わせが含まれる。金属酸化物改質（好ましくは、二酸化チタン改質、又は酸化第二鉄改質）珪藻土、金属アルミノケイ酸塩、非晶質金属ケイ酸塩（好ましくは非晶質ケイ酸マグネシウム、より好ましくは非晶質の長球化ケイ酸マグネシウム）、及びこれらの組み合わせは、更により好ましい（非晶質金属ケイ酸塩及びこれらの組み合わせがより好ましく、非晶質の長球化ケイ酸マグネシウムが最も好ましい）。
【００２７】
好ましくは、無機濃縮剤は、粒子形態であり、より好ましくは微小粒子を含む。好ましくは粒子は約１マイクロメートル（より好ましくは約２マイクロメートル、更により好ましくは約３マイクロメートル、最も好ましくは約４マイクロメートル）〜約１００マイクロメートル（より好ましくは約５０マイクロメートル、更により好ましくは約２５マイクロメートル、最も好ましくは約２０マイクロメートル）の範囲の粒径を有し、ここで任意の下限を範囲の任意の上限と組み合わせることができる。
【００２８】
上記の濃縮剤を使用した濃縮又は捕捉は一般的に特定の株、種、又は微生物のタイプに対して特異的ではなく、よって、試料内の微生物の全体的な個体群の濃縮を提供する。次に、株特異的精査を伴う任意の既知の光学的検出方法を用いて、捕捉された微生物群の中から、微生物の具体的な株を検出することができる。
【００２９】
無機材料は、水系に分散又は懸濁されると、その物質及び水系のｐＨに特徴的な表面電荷を示す。物質−水の界面の両側の電位は「ゼータ電位」と呼ばれ、電気泳動における移動度から（すなわち、水系中に置かれた帯電電極間を物質の粒子が移動する速度から）計算することができる。好ましくは無機濃縮剤は、約７のｐＨにおいて負のゼータ電位を有する。
【００３０】
金属ケイ酸塩
本発明のプロセスの実施に用いるのに好適な金属ケイ酸塩濃縮剤としては、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄、チタン、及び同様物など（好ましくはマグネシウム、亜鉛、鉄、及びチタン；より好ましくはマグネシウム）、及びこれらの組み合わせなどの金属の非晶質ケイ酸塩が挙げられる。好ましいのは、少なくとも部分溶融した粒子形状（より好ましくは、非晶質、球体化された金属ケイ酸塩、最も好ましくは、非晶質、球体化されたケイ酸マグネシウム）の非晶質金属ケイ酸塩である。金属ケイ酸塩は既知であり、既知の方法によって化学的に合成するか、又は天然に生じる未加工鉱石の採鉱及び処理によって入手することができる。
【００３１】
金属ケイ酸塩の非晶質の少なくとも部分溶融した粒子形状は、比較的小さい供給粒子（例えば、約２５マイクロメートルまでの平均粒子サイズ）を、概ね回転楕円体又は球の形状の粒子（すなわち、真に又は実質的に円及び楕円の形状及び任意の他の丸い又は曲がった形状を含む、概ね丸く、鋭利な角又は縁を含まない、拡大された二次元像を有する粒子）を作製するための制御された条件下で融解又は軟化させる既知の方法のいずれによっても作製可能である。このような方法には微粒化、ファイアポリッシュ、直接溶融などが挙げられる。好ましい方法は、固体フィード粒子の直接溶融又はファイアポリッシュにより、少なくとも部分的に溶融した、実質的にガラス状粒子が形成される、火焔溶融（例えば、記述が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，０４５，９１３号（Ｃａｓｔｌｅ）に述べられている方法におけるような）である。最も好ましくは、不規則形状をした供給粒子の実質的な部分（例えば、約１５〜約９９容積パーセント、好ましくは、約５０〜約９９容積パーセント、より好ましくは、約７５〜約９９容積パーセント、最も好ましくは、約９０〜約９９容積パーセント）を概ね回転楕円体又は球体の粒子に変換することにより、このような方法を使用して、非晶質の球体化された金属ケイ酸塩を製造することができる。
【００３２】
ある非晶質金属ケイ酸塩は市販されている。例えば、非晶質の長球化されたケイ酸マグネシウムは、化粧品処方の使用のために市販されている（例えば、３Ｍ（商標）コスメティック・ミクロスフェアズＣＭ−１１１（ミネソタ州セントポール市の３Ｍ社から販売））。
【００３３】
非晶質金属ケイ酸塩濃縮剤は更に、金属（例えば鉄又はチタン）酸化物、結晶質金属ケイ酸塩、他の結晶質材料、及び同様物などを含む、他の材料を含み得る。しかしながら、濃縮剤は、好ましくは本質的に結晶質シリカを含まない。
【００３４】
本発明のプロセスの実施に用いるのに好適な特に好ましい濃縮剤としては、非晶質金属ケイ酸塩を含み、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定したケイ素原子に対する金属原子の比が約０．５以下（好ましくは約０．４以下、より好ましくは約０．３以下、最も好ましくは約０．２以下）である表面組成を有する、濃縮剤が挙げられる。このような濃縮剤としては、米国特許仮出願番号第６０／９７７，１８０号（３Ｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載の濃縮剤が挙げられ、濃縮剤及びその調製方法についての記載は、参考として本明細書に組み込まれる。
【００３５】
好ましくは、この特に好ましい濃度剤の表面組成はまた、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定されるものとして少なくとも平均約１０原子パーセントの炭素を含む（より好ましくは少なくとも平均約１２原子パーセントの炭素を含み、最も好ましくは少なくとも平均約１４原子パーセントの炭素を含む）。ＸＰＳは、試料表面の最も外側のほぼ３〜１０ナノメートル（ｎｍ）の元素組成を定量することができ、水素及びヘリウムを除いて周期率表中の全ての元素に感度のある手法である。ＸＰＳは、大多数の元素に対して０．１〜１原子パーセント濃度範囲の検出限界を持つ定量的な手法である。ＸＰＳの好ましい表面組成評価条件には、受光立体角±１０度で試料表面に対して測定される取り出し角９０度が含まれ得る。
【００３６】
このような好ましい金属ケイ酸塩濃縮剤は、例えば、普通のタルクなどの一般的な金属ケイ酸塩よりも負のゼータ電位を有する。それにもかかわらず、濃縮剤は、その表面が一般に負帯電である傾向がある、細菌などの微生物の濃縮においてタルクよりも驚くほど有効である。好ましくは、濃縮剤はｐＨが約７で負のゼータ電位を有する（より好ましくは、ｐＨが約７でスモルコウスキーゼータ電位が約−９ミリボルト〜約−２５ミリボルトの範囲、更に好ましくは、ｐＨが約７でスモルコウスキーゼータ電位が約−１０ミリボルト〜約−２０ミリボルトの範囲、最も好ましくは、ｐＨが約７でスモルコウスキーゼータ電位が約−１１ミリボルト〜約−１５ミリボルトの範囲である）。
【００３７】
表面改質珪藻土
本発明の方法を実施する際に使用するために好適な表面改質珪藻土濃縮剤には、金属酸化物（好ましくは、二酸化チタン又は酸化第二鉄）、微細ナノスケール金若しくは白金又はこれらの組み合わせを含む表面改質剤を含む表面処理剤を、その表面の少なくとも一部の上に担持する珪藻土を含むものが含まれる。このような濃縮剤としては、米国特許仮出願番号第６０／９７７，２００号（３Ｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載の濃縮剤が挙げられ、濃縮剤及びその調製方法についての記載は、参考として本明細書に組み込まれる。表面処理は好ましくは、酸化第二鉄、酸化亜鉛、酸化アルミニウムなど、及びこれらの組み合わせから選択される金属酸化物（より好ましくは酸化第二鉄）を更に含む。金などの貴金属は、抗菌特性を呈することが知られているにもかかわらず、本発明の方法において使用される金含有濃縮剤は、微生物の濃縮に有効なだけでなく、検出又は分析の目的に微生物を生存可能な状態に保つことができる。
【００３８】
有用な表面改質剤としては、微細ナノスケール金、微細ナノスケール白金、少なくとも１つの金属酸化物（好ましくは、二酸化チタン、酸化第二鉄、又はこれらの組み合わせ）と組み合わせた微細ナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも１つの他の金属酸化物（すなわち二酸化チタン以外）と組み合わせた酸化第二鉄、など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい表面改質剤としては、微細ナノスケール金、微細ナノスケール白金、少なくとも酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細ナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、酸化第二鉄、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００３９】
より好ましい表面改質剤としては、微細ナノスケール金、微細ナノスケール白金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細ナノスケール金、二酸化チタン、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、酸化第二鉄、及びこれらの組み合わせが含まれる（更に好ましくは、微細ナノスケール金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細ナノスケール金、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、二酸化チタン、酸化第二鉄、及びこれらの組み合わせが含まれる）。酸化第二鉄、二酸化チタン、及びこれらの組み合わせが最も好ましい。
【００４０】
表面改質珪藻土濃縮剤のうち少なくともいくつかは、未処理の珪藻土に比べて少なくともある程度、正であるゼータ電位を有し、この濃縮剤は、細菌などの微生物の濃縮について、未処理の珪藻土よりも驚くべきほど顕著に有効であり得、このような濃縮剤の表面は一般に負に帯電している傾向にある。好ましくは、濃縮剤はｐＨが約７で負のゼータ電位を有する（より好ましくは、ｐＨが約７でゼータ電位が約−５ミリボルト〜約−２０ミリボルトの範囲、更に好ましくは、ｐＨが約７でゼータ電位が約−８ミリボルト〜約−１９ミリボルトの範囲、最も好ましくは、ｐＨが約７でゼータ電位が約−１０ミリボルト〜約−１８ミリボルトの範囲である）。
【００４１】
微細ナノスケール金又は白金を含む、表面改質珪藻土濃縮剤は、物理蒸着（所望により、酸化雰囲気中での物理蒸着）によって珪藻土に金又は白金を堆積することにより調製することができる。本明細書で使用するとき、用語「微細ナノスケール金又は白金」は、サイズで５ナノメートル（ｎｍ）以下の寸法を有する金又は白金の物体（例えば、粒子又は原子クラスタ）を意味する。好ましくは、堆積した金又は白金の少なくとも一部は、最大約１０ｎｍ（１０ｎｍ以下）（より好ましくは、最大約５ｎｍ、更により好ましくは最大約３ｎｍ）の範囲の平均サイズの寸法（例えば、粒子の直径又は原子クラスタの直径）を有する。
【００４２】
最も好ましい実施形態において、金の少なくとも一部分は、超ナノスケールである（すなわち、０．５ｎｍ未満のサイズの少なくとも２つの寸法、１．５ｎｍ未満のサイズの全ての寸法を有する）。個別の金又は白金のナノ粒子のサイズは、当該技術分野において周知であるように、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析によって定量することができる。
【００４３】
珪藻土（又はキーゼルグール）は、海生微生物類である珪藻の残存物から生じた、天然のシリカ材料である。このように、これは天然資源から取得可能であり、市販もされている（例えば、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ，Ａ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から）。珪藻土粒子は、一般に、対称な立方体、円筒形、球形、プレート状、矩形の箱形などの形態の、小さな開放網状構造を含む。これらの粒子の孔構造は、一般に、非常に均一であり得る。
【００４４】
珪藻土は、原材料として、粉砕した材料として、又は精製及び所望により粉砕した粒子として使用することができる。好ましくは、珪藻土は、直径約１マイクロメートル〜約５０マイクロメートル（より好ましくは約３マイクロメートル〜約１０マイクロメートル）の範囲にある寸法の粉砕粒子形状である。
【００４５】
珪藻土は、場合によっては、使用前に加熱処理を行い、有機残留物の痕跡を除去することができる。加熱処理を使用する場合は、高温になるほど好ましくない結晶シリカが高比率に生じ得るため、加熱処理は５００℃以下で行うことが望ましい。
【００４６】
珪藻土上に供給される金又は白金の量は、広い範囲で変えることができる。金及び白金は高価であるため、望ましい濃縮活性を達成するのに妥当な必要とされる量を超えては使用しないことが望ましい。更に、ナノスケール金又は白金は、ＰＶＤを使用して堆積する際、非常に易動性であることがあるため、金又は白金を使用しすぎると、金又は白金の少なくとも一部が融合してより大きな塊になることにより、活性が低下することがある。
【００４７】
これらの理由から、珪藻土上の金又は白金の重量の装填量は、珪藻土と金との合計重量を基準として、好ましくは約０．００５（より好ましくは０．０５）〜約１０重量パーセント、より好ましくは約０．００５（更に好ましくは０．０５）〜約５重量パーセント、及び更に好ましくは約０．００５（最も好ましくは０．０５）〜約２．５重量パーセントである。
【００４８】
金及び白金をＰＶＤ法（例えばスパッタリング）により堆積して、支持体表面に濃縮活性を有する微細ナノスケール粒子又は原子クラスタを形成することができる。金属は、他の酸化状態が存在する場合もあるが、主に元素の形で堆積すると考えられる。
【００４９】
金及び／又は白金に加えて、同じ珪藻土支持体上に１つ以上の他の金属を供給することもでき、及び／又は、金及び／又は白金を含む支持体と別の支持体とを混合して供給することもできる。このような他の金属の例としては、銀、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、銅、イリジウム及び同等物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。使用する場合には、これらの他の金属を、使用される金又は白金の供給源ターゲットと同一又は異なるターゲット供給源から支持体上に共堆積させることができる。あるいは、このような金属を、金及び／又は白金の堆積の前又は後のいずれかにおいて、支持体上に供給することができる。有利には、活性化のための熱処理を必要とする他の金属を、金及び／又は白金の堆積前に支持体に適用し、熱処理することもできる。
【００５０】
物理蒸着は、金属含有供給源又は金属含有ターゲットから支持媒体への金属の物理的な移動を指す。物理気相堆積は、さまざまな異なる方法で実施可能である。代表的な方法としては、スパッタ堆積法（好ましい方法）、蒸着法、及び陰極アーク堆積法が挙げられる。ＰＶＤ法の性状は得られる活性に影響を与え得るが、これら又は他のＰＶＤアプローチのいずれかを、本発明の方法の実施に使用する濃縮剤の作製で使用することができる。ＰＶＤは、この目的で現在使用されている装置又は今後開発される装置のいずれかのタイプを使用することにより行うことができる。
【００５１】
物理気相堆積法は、支持体表面の適切な処理が確実に行われるように、好ましくは、処理対象の支持体媒質が充分に混合された状態（例えば、混転、流動化、粉砕、又は同等の処理）で実施される。ＰＶＤによる堆積の粒子混転方法は、米国特許第４，６１８，５２５号（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら）に記述されており、この記述は参照により本明細書に組み込まれる。微細粒子又は微細粒子凝集塊（例えば、平均直径が約１０マイクロメートル未満）にＰＶＤを実施する際、支持体媒体は、好ましくは、ＰＶＤ工程の少なくとも一部の間に、混合及び微粉砕の両方が行われる（例えば、ある程度まで摩砕又はミル掛けされる）。
【００５２】
物理気相堆積法は、本質的には、非常に広い範囲にわたって、任意の所望の温度で実施可能である。しかしながら、金属を比較的低い温度（例えば、約１５０℃未満、好ましくは約５０℃未満、より好ましくは室温（例えば約２０℃〜約２７℃）以下））で堆積する場合、堆積した金属はより高い活性を有することができる（おそらくは、移動性と融合性がより損なわれる及び／又はより低いため）。外周条件下で運転すると、堆積時の加熱又は冷却が不要となり、有効かつ経済的であるため、一般的に好ましい可能性がある。
【００５３】
物理蒸着は、不活性スパッタリングガス雰囲気中（例えば、アルゴン、ヘリウム、キセノン、ラドン、又はこれら２つ以上の混合物（好ましくはアルゴン））で実施することができ、場合によっては、物理蒸着は酸化雰囲気中で実施可能である。好ましくは、酸化雰囲気は、少なくとも１つの酸素含有ガスを含む（より好ましくは、酸素含有ガスは、酸素、水、過酸化水素、オゾン、及びこれらの組み合わせから選択され、更により好ましくは、酸素含有ガスは、酸素、水、及びこれらの組み合わせから選択され、最も好ましくは酸素である）。酸化雰囲気は、アルゴン、ヘリウム、キセノン、ラドン、又はこれらの２つ以上の混合物（好ましくはアルゴン）などの不活性スパッタリングガスを更に含む。ＰＶＤ処理中の真空槽内の総気体圧力（全てのガス）は、約１ｍＴｏｒｒ（０．１３Ｐａ）〜約２５ｍＴｏｒｒ（３．３３Ｐａ）（好ましくは約５ｍＴｏｒｒ（０．６７Ｐａ）〜約１５ｍＴｏｒｒ（２．００Ｐａ））である。酸化雰囲気は、真空槽内の全てのガスの総重量を基準にして、約０．０５重量パーセント〜約６０重量パーセントの酸素含有ガス（好ましくは、約０．１重量パーセント〜約５０重量パーセント、より好ましくは約０．５重量パーセント〜約２５重量パーセント）を含み得る。
【００５４】
これにより結晶シリカの含有量が増加し得るが、珪藻土支持媒体は、場合によっては、金属堆積の前に焼成可能である。金及び白金は、ＰＶＤで堆積するとすぐに活性になるため、他の一部の方法による堆積とは違って、一般に金属堆積後に加熱処理の必要がない。ただし、このような加熱処理又は焼成は、活性を高めるために所望される場合には実行できる。
【００５５】
一般に、熱処理は、支持体を、任意の好適な大気中、例えば、空気、不活性雰囲気（窒素、二酸化炭素、アルゴンなど）、還元性雰囲気（水素など）、及び同等物の中で、約１２５℃〜約１０００℃の範囲の温度で、約１秒間〜約４０時間、好ましくは約１分間〜約６時間の加熱を伴い得る。使用される具体的な熱条件は、支持体の性質を含むさまざまな要素に依存し得る。
【００５６】
一般に、熱処理は、支持体の構成要素が分解するか、劣化するか、又は過度の熱により損傷する温度よりも下の温度で実施可能である。支持体の性状、金属の量などの要素に依存して、触媒活性は、系を高すぎる温度で熱処理すると、ある程度低下する可能性がある。
【００５７】
金属酸化物を含む、表面改質珪藻土濃縮剤は、加水分解可能な金属酸化物前駆体化合物の加水分解によって、珪藻土上に金属酸化物を堆積させることにより調製される。適切な金属酸化物前駆体化合物としては、加水分解して金属酸化物を生成できるような金属錯体及び金属塩が挙げられる。有用な金属錯体としては、アルコキシド配位子、配位子としての過酸化水素、カルボン酸機能配位子など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。有用な金属塩としては、金属の硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン化物、炭酸塩、シュウ酸塩、水酸化物など及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５８】
過酸化水素又はカルボン酸機能配位子の金属塩又は金属錯体を使用する場合、化学的手段又は熱的手段によって加水分解を引き起こすことができる。化学的に引き起こされる加水分解においては、金属塩は、溶液の形態で、珪藻土の分散液に導入することができ、得られる混合物のｐＨは、珪藻土上に金属の水酸化物錯体として金属塩が沈殿するまで、塩基溶液を加えることによって上げることができる。適切な塩基としては、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物及び炭酸塩、アンモニウム及びアルキルアンモニウムの水酸化物又は炭酸塩など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。金属塩溶液及び塩基溶液は、通常、約０．１〜約２Ｍの濃度であり得る。
【００５９】
好ましくは、珪藻土への金属塩の添加は、珪藻土分散液を撹拌（好ましくは激しく撹拌）しながら実施される。金属塩溶液及び塩基溶液は、珪藻土分散液に別々に（いずれの順番でも）又は同時に導入可能であって、得られる珪藻土の表面に金属水酸化物錯体を生じる実質的に好ましく均一な反応をもたらす。反応混合物は、場合によっては、反応中に加熱して、反応の速度を加速することができる。一般に、添加される塩基の量は、金属のモル数に、金属塩又は金属錯体の非オキソ及び非ヒドロキソ対イオン数を掛けたものに等しくなり得る。
【００６０】
あるいは、チタン又は鉄の塩を使用する場合、金属塩を加熱して加水分解を起こさせて、金属水酸化物錯体を形成し、珪藻土の表面と反応させることができる。この場合、金属塩溶液を一般に、珪藻土の分散液（好ましくは撹拌した分散液）に加え、十分に高温（例えば約５０℃を上回る温度）に加熱して、金属塩の加水分解を促進することができる。好ましくは、温度は約７５℃〜１００℃であり、ただし反応がオートクレーブ装置内で実施される場合はより高い温度を使用することができる。
【００６１】
金属アルコキシド錯体を使用する場合、金属錯体に加水分解を起こさせ、アルコール溶液中で金属アルコキシドの部分的加水分解により金属の水酸化物錯体を形成させることができる。珪藻土の存在における金属アルコキシド溶液の加水分解により、珪藻土の表面に金属水酸化物種を堆積させることができる。
【００６２】
あるいは、珪藻土の存在において気相の金属アルコキシドと水とを反応させることによって、金属アルコキシドを加水分解して、珪藻土の表面に堆積させることができる。この場合、珪藻土を、例えば流動床反応器又は回転ドラム反応器などのいずれかの中で堆積中に撹拌することができる。
【００６３】
珪藻土の存在における金属酸化物前駆体化合物の上記の加水分解の後、得られる表面処理された珪藻土を、沈降又は濾過、又はその他の既知の方法によって分離することができる。分離した生成物を水で洗浄することによって精製し、これを乾燥させることができる（例えば５０℃〜１５０℃）。
【００６４】
表面処理された珪藻土は通常、乾燥後に機能できるが、所望により、空気中で約２５０℃〜６５０℃に加熱して焼成することにより、機能の損失なしに揮発性の副生成物を除去することができる。この焼成工程は、金属酸化物前駆体化合物として金属アルコキシドを利用した場合に望ましいことがある。
【００６５】
一般に、鉄の金属酸化物前駆体化合物を用い、得られる表面処理には、ナノ粒子の酸化鉄が含まれる。珪藻土に対する酸化鉄の重量比が約０．０８である場合には、Ｘ線回折（ＸＲＤ）では、酸化鉄材質の存在がはっきりと示されない。むしろ、３．８０、３．６８、及び２．９４Åで更なるＸ線反射が観察される。この材料のＴＥＭ評価は、球形ナノ粒子状酸化鉄材料により比較的不均一にコーティングされている珪藻土表面を示す。酸化鉄材料の結晶子の大きさは約２０ｎｍ未満であり、結晶の大部分は直径が１０ｎｍ未満である。珪藻土表面上のこれらの球形結晶の充填は、外観的に密であり、珪藻土の表面がこれら結晶の存在により粗化されているのが見られる。
【００６６】
一般に、チタンの金属酸化物前駆体化合物と共に、得られる表面処理は、ナノ粒子チタニアを含む。珪藻土に二酸化チタンを堆積させた場合、約３５０℃で焼成した後に得られた生成物のＸＲＤでは、アナターゼチタニアの小さな結晶の存在を示すことができる。チタン／珪藻土の比が比較的低い場合、又はチタン及び鉄の酸化物前駆体の混合物を使用する場合、Ｘ線分析によっては、一般に、アナターゼの証拠は観察されない。
【００６７】
チタニアは強力な光酸化触媒として知られており、本発明のチタニア改質珪藻土濃縮剤は、分析用の微生物濃縮に使用することができ、更に所望により、光活性化可能剤として使用することにより、残留する微生物を殺菌し、不要な有機不純物を除去することができる。このように、チタニア改質された珪藻土は、分析のための生体材料を単離することと、次いで再使用のために光化学的にクリーニングすることの両方ができる。これらの材料は、微生物の除去と共に抗菌効果が望ましい場合、濾過用途で使用することもできる。
【００６８】
吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製
吸着緩衝液改質無機濃縮剤は、（ａ）上述の無機濃縮剤の少なくとも１つを少なくとも１つのカチオン含有塩溶液（好ましくは、水性）と接触させて、無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（ｂ）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を乾燥させることと、を含むプロセスを含む方法によって調製することができる。カチオン含有塩溶液として使用するために好適な吸着緩衝溶液には、少なくとも１つの一価又は多価カチオン（好ましくは少なくとも１つの多価カチオン、より好ましくは少なくとも１つの二価カチオン、最も好ましくは二価カルシウムカチオン、二価マグネシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの二価カチオン）を含むものが含まれる。カチオンは、好ましくは金属カチオンであるが、他のカチオン（例えば、アンモニウム）もまた有用であり得る。
【００６９】
例えば、有用な吸着緩衝液は、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２）、塩化ランタン（ＬａＣｌ３）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）等、及びこれらの組み合わせ等の塩を含むことができる。吸着緩衝溶液は、１つ以上の塩を、塩を溶解するために十分に極性のある１つ以上の溶媒と混合することによって調製されてもよい。好ましくは、溶媒は水である。溶媒中の塩の溶解は、必要に応じて、加熱によって、及び／又は攪拌若しくはかき混ぜによって、促進することができる。溶解後、結果として得られた溶液は、（好ましくはフィルタ滅菌によって、より好ましくは約０．２２マイクロメートルの孔径を有する標準的な微生物学的フィルタを使用したフィルタ滅菌によって）滅菌されてもよい。
【００７０】
（溶媒中の）塩の濃度は、塩及び溶媒の性質によって、並びに無機濃縮剤の捕捉強化の望ましいレベルによって、１リットル当たり約１０ミリモル（ｍＭ／Ｌ）まで（好ましくは、約０．１ｍＭ／Ｌ〜約５ｍＭ／Ｌ）が典型的である濃度で、広い範囲にわたって変化し得る。塩溶液のｐＨは、約６．０〜約７．５の範囲に及び得るが、約６．５〜約７．５（より好ましくは約６．８〜約７．３、より好ましくは、約７．２）の比較的中性のｐＨ値が好ましい。
【００７１】
好ましい吸着緩衝液は、マグネシウムカチオン（Ｍｇ＋＋）、カルシウムカチオン（Ｃａ＋＋）、ナトリウムカチオン（Ｎａ＋）、カリウムカチオン（Ｋ＋）、第一鉄カチオン（Ｆｅ＋＋）、ランタンカチオン（Ｌａ＋＋＋）、アルミニウムカチオン（Ａｌ＋＋＋）、及びこれらの組み合わせ（より好ましくは、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのカチオン、更により好ましくはマグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、カリウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのカチオン、最も好ましくは、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのカチオン）から選択される少なくとも１つのカチオンを含む。本発明のプロセスに使用するために特に好ましい吸着緩衝溶液は、水１リットル当たり５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含み、７．２のｐＨを有する。
【００７２】
上で参照された、無機濃縮剤を吸着緩衝液と接触させる工程は、以下で濃縮剤と試料を接触させることに関する節に記載されるものを含む、２つの物質の間に接触をもたらす任意のさまざまな既知又は今後開発される方法によって実行され得る。接触の際に使用される吸着緩衝液の量は、無機濃縮剤の性質及び量、並びに捕捉強化の望ましい度合いによって、広く変化し得る。吸着緩衝溶液の量は、概して、無機濃縮剤の少なくとも一部分（例えば、露出面の少なくとも一部分）を湿らせるために十分であり得る。好ましくは、無機濃縮剤の実質的に全ての露出面が湿っている（例えば、最大捕捉強化が望ましい場合）。
【００７３】
無機濃縮剤を吸着緩衝液と接触させることは、好ましくは、その薬剤を緩衝溶液で少なくとも一度（好ましくは少なくとも二度、より好ましくは少なくとも三度）洗浄することによって実行される。例えば、無機濃縮剤のこのような洗浄は、無機濃縮剤の実質的に全ての露出面を湿らすために効果的であり得、薬剤を好ましい容器（例えば、試験管）内の緩衝溶液に薬剤を浸漬することによって実行され得る。薬剤は、望まれる場合は、緩衝液に接触する前に不純物を除去するために、事前洗浄されてもよい（例えば、水で洗い流すことによって）。
【００７４】
例えば、多量の緩衝液の中に少なくとも１回、粒子無機濃縮剤を通過させることによって（例えば、約１０分間にわたって重力沈殿に依存することによって）、洗浄を効果的にすることができる。緩衝液との接触は、混合によって（例えば、撹拌、振盪、又は揺動プラットフォームによって）強化することができ、これにより無機濃縮剤の粒子が緩衝液の大部分を通って繰り返し通過又は沈殿することができる。混合は、渦動（１分又は２分間最高速度で）等の急速なものであってもよく、あるいは、粒子無機濃縮剤と緩衝液の混合を「上下転倒」させるプロセスで穏やかに混転して（例えば、試験管又は他のタイプの反応容器を支えるよう構成された装置を用い、その試験管又は容器を「上下転倒」させるプロセスでゆっくりと回転させて）達成することができる。所望により、無機濃縮剤は、望むだけの時間（例えば、混合後約５分の間）緩衝液内に浸ることが可能であってもよい。
【００７５】
したがって、無機濃縮剤の洗浄を実行することにおいて、混合（例えば、攪拌、揺動、又はかき混ぜ）及び／又は浸すことは、任意的であるが、濃縮剤との緩衝液接触を増加させるためには好ましい。１つ以上の添加剤（例えば、界面活性剤又は湿潤剤、分散剤等）は、望まれる場合、（例えば、薬剤の分散及び／又は湿潤を助けるために）無機濃縮剤と緩衝液との混合に含まれてもよい。
【００７６】
接触又は洗浄工程の後、無機濃縮剤は、好ましくは凝離され（例えば、重力沈殿又は遠心分離あるいは濾過によって、好ましくは遠心分離によって）、及び／又は緩衝液から分離され（例えば、結果として得られる上澄みを注ぎ出す又は吸い上げることによる除去又は分離によって、プロセスを実施するのに使用した容器又は管の底に、無機濃縮剤を残すことができる）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤は、次いで周辺温度（例えば、約２３℃）又は高温（例えば、オーブンを使用して）のどちらかで乾燥させることができる。好ましくは、乾燥は約２５℃より高い温度（より好ましくは少なくとも約５０℃、更により好ましくは少なくとも約７０℃、最も好ましくは少なくとも約８０℃）で実行される。乾燥時間の期間は、例えば、利用される乾燥温度及び少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤の量（例えば、約１グラムの少なくとも部分的に湿った薬剤は室温で約４８時間以上で乾燥することができ、約５グラムの少なくとも部分的に湿った薬剤は約８０℃で約５又は６時間で乾燥することができる）によって、広く変化し得る。
【００７７】
試料
本発明の濃縮方法は、医療、環境、食品、飼料、臨床、及び検査室試料、及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、さまざまなタイプの試料に適用することができる。医療又は獣医試料としては、例えば、臨床診断のために検査される生物源（例えばヒト又は動物）から得た細胞、組織、又は流体を挙げることができる。環境試料は、例えば、医療機関又は獣医機関、産業用設備、土壌、水源、食品調理領域（食品接触及び非接触領域）、検査室、又はバイオテロリズムの対象になり得る領域から得たものであり得る。食品の加工、取扱い、及び調理領域の試料は、細菌病原菌による食品供給汚染に関する懸念が特にしばしばあるためより好適である。
【００７８】
液体の形態で得られる試料、又は液体中の固体の分散液又は懸濁液の形態で得られる試料は、直接使用することができ、あるいは濃縮して（例えば遠心分離により）又は希釈して（例えば緩衝（ｐＨ調整された）溶液の追加により）使用することができる。固体又は半固体の試料は、直接使用するか、あるいは例えば、所望であれば、流動体媒質（例えば緩衝液）で洗浄若しくはすすぎ、又は流動体媒質中に懸濁若しくは分散させることにより抽出することができ得る。試料は表面から（例えばスワブによる拭き取り又はすすぎにより）採取することができる。好ましくは、試料は流体の形態で使用される（例えば、液体、気体、又は液体中若しくは気体中の固体若しくは液体の分散物若しくは懸濁物）。
【００７９】
本発明の方法を実施する際に使用できる試料の例としては、食品（例えば、生鮮農産物又はそのまま食べる昼食若しくは「調理された」食肉）、飲料（例えばジュース又は炭酸飲料）、水（飲料水を含む）、並びに生物学的流動体（例えば全血、又は血漿、血小板の豊富な血液分画、血小板濃縮物、圧縮した赤血球などの血液構成成分、細胞調製物（例えば細胞分散液、骨髄吸引物、又は脊椎骨髄）、細胞懸濁液、尿、唾液、及びその他の体液、骨髄、肺水、脳液、外傷滲出物、外傷生検試料、眼内液、脊髄液など）が挙げられ、また溶解緩衝液の使用などの手順を使用して形成することができる細胞可溶化物などの溶解調製物が含まれる。好ましい試料としては、食品、飲料、水、生体液、及びこれらの組み合わせ（食品、飲料、水、及びこれらの組み合わせがより好ましく、水が更により好ましく、水が最も好ましい）が含まれる。
【００８０】
試料の容積は、特定の用途に応じて異なり得る。例えば、本発明のプロセスが診断又は研究用途に仕様される場合、試料の量は通常、マイクロリットルの範囲であり得る（例えば１０μＬ以上）。方法が食品病原体試験検査又は飲料水安全性試験のために使用される場合、試料の量は通常、ミリリットル〜リットルの範囲であり得る（例えば１００ミリリットル〜３リットル）。例えばバイオ処理又は製剤処方などの産業用途においては、この量は何万リットルであることがある。
【００８１】
本発明の方法は、濃縮状態の試料から微生物を分離し、更に、使用される検出手順を阻害し得る試料マトリックス構成成分から微生物を分離することができる。これらすべての場合において、本発明の方法は、他の微生物濃縮方法に追加して、又はその代わりに、使用することができる。よって、所望により、追加の濃縮が望ましい場合には、本発明の方法実施の前又は後に試料からの培養を行うことができる。
【００８２】
接触
本発明の方法は、２つの物質の間に接触をもたらす、さまざまな既知の方法又は今後開発される方法のいずれによっても実施可能である。例えば、吸着緩衝液改質（又は処理）濃縮剤は、試料に添加されてもよく、又は試料が濃縮剤に添加されてもよい。濃縮剤でコーティングしたディップスティックを試料溶液に浸すことができ、濃縮剤を含有するフィルムの上に試料溶液を注ぐことができ、濃縮剤を含む試験管又はウェルに試料溶液を注ぐことができ、又は、濃縮剤でコーティングされたフィルタ（例えば、織布のフィルタ）に試料溶液を通すことができる。
【００８３】
しかしながら好ましくは、濃縮剤及び試料は、様々な任意の容器内に合わせて入れられる（任意の追加順序を用いて）（所望により、しかしながら好ましくは、キャップ付き、閉鎖、又は密閉された容器であり、より好ましくは、キャップ付きの試験管、瓶、又は広口瓶である）。本発明の方法を実施する際の使用に好適な容器は、特定の試料によって決められ、量及び性質により大きく異なり得る。例えば、容器は１０マイクロリットル容器（例えば試験管）などの小さいものであり得、又は１００ミリリットルから３リットル容器（例えば三角フラスコ又はポリプロピレン製広口瓶）などの大きいものであり得る。容器、濃縮剤、及び試料に直接接触するその他の器具又は添加剤は、使用前に滅菌することができ（例えば、制御された熱、エチレンオキシドガス、又は放射線によって）、これにより検出エラーを起こし得る試料の汚染を低減又は防ぐことができる。特定の試料の微生物を捕捉又は濃縮するための、検出を成功させるのに十分な濃縮剤の量は、場合によって異なり（例えば、濃縮剤の性質及び形態並びに試料の量に依存する）、当業者によって容易に決定できる。例えば、一部の用途については、試料ミリリットル当たり、１０ミリグラムの濃縮剤が有用であり得る。
【００８４】
望ましい場合は、試料の中に少なくとも１回、粒子濃縮剤を通過させることによって（例えば、約１０分間にわたって重力沈殿に依存することによって）、接触を効果的にすることができる。接触は、混合によって（例えば撹拌、振盪、又は揺動プラットフォームによって）強化することができ、これにより濃縮剤の粒子が試料の大部分を通って繰り返し通過又は沈殿することができる。マイクロリットルの桁の少量（典型的には０．５マイクロリットル未満）の場合、混合は、例えば米国特許第５，２３８，８１２号（Ｃｏｕｌｔｅｒら）（この記述は参考として本明細書に組み込まれる）に記述されているように、渦動又は「転動（nutation）」などの急速なものであり得る。０．５ミリリットル以上の桁の、より大量（典型的には０．５ミリリットル〜３リットル）の場合、混合は、例えば米国特許第５，５７６，１８５号（Ｃｏｕｌｔｅｒら）（この記述は参考として本明細書に組み込まれる）に記述されているように、粒子状濃縮剤及び試料を「上下転倒」させるプロセスで穏やかに混転することにより達成できる。このような混転は、例えば、試験管又は他のタイプの反応容器を支えるよう構成された装置を用い、その試験管又は容器を「上下転倒」させるプロセスでゆっくりと回転させて達成することができる。接触は、望むだけの時間、実施することができる（例えば、試料量が約１００ミリリットル以下の場合、最高約６０分間の接触が有用であり得、好ましくは、約１５秒〜約１０分又はそれ以上、より好ましくは、約１５秒〜約５分の接触が有用であり得る）。
【００８５】
よって、本発明のプロセスの実施において、混合（例えば攪拌、揺動、又はかき混ぜ）及び／又は培養（例えば周囲温度で）は随意ではあるが、濃縮剤との接触で微生物を増加させるために好ましい。好ましい接触方法には、生物含有試料（好ましくは流動体）を粒子濃縮剤と混合すること（例えば、約１５秒〜約５分）と、培養すること（例えば、約３分〜約６０分）との両方が含まれる。必要に応じて、１つ以上の添加剤（例えば、溶解試薬、生物発光検定試薬、核酸捕捉試薬（例えば磁性ビーズ）、微生物用培地、緩衝液（例えば、固形試料の湿潤のため）、微生物染色試薬、洗浄用緩衝液（例えば、結合していない物質を洗い流すため）、溶出試薬（例えば血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００非イオン系界面活性剤（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手可能）、機械的磨耗／溶出試薬（例えばガラスビーズ）、吸着緩衝液（例えば吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製にしようされものと同一の緩衝液、又は異なる緩衝液）、及び同様物）が、濃縮剤及び試料の組み合わせに含まれ得る。好ましくは、試料の接触工程は、濃縮剤と試料の組み合わせにおける添加剤としての吸着緩衝液の包含なしに実行される。
【００８６】
望ましい場合は、濃縮剤（単独で、又は例えば抗菌剤と組み合わせて、及び／又は液体形態（例えば水又は油）、固体形態（例えば布、ポリマー、紙、又は無機固体）、ゲル形態、クリーム形態、フォーム形態、又はペースト形態の担体物質と組み合わせて）は、非多孔質又は多孔質、固体、微生物に汚染されているか又は微生物に汚染可能な材質又は表面に対して、塗布又はすりつけることができる（例えば「クリーニング」剤として使用する）。結合剤、安定剤、界面活性剤、又はその他の特性変性剤も望ましい場合は利用することができる。
【００８７】
このような使用のために、濃縮剤は織布又は不織布に塗布することができ、更に紙、ティッシュペーパー、綿棒などの使い捨て可能な表面、及び様々な吸収性及び非吸収性材質に塗布することができる。例えば、濃縮剤は布又は紙の担体物質に組み込み、「クリーニング」ワイプとして使用することができる。濃縮剤は、例えば住居、保育所、工場、病院などにおいて、玩具、装置、医療機器、作業台表面などを洗浄するために、固体表面に（例えば、担体物質を含むワイプ又はペーストので）適用することができる。洗浄又はその他の目的に使用する場合、試料は同時に採取することができ、望ましい場合は単一の工程で濃縮剤に接触し得る。
【００８８】
凝離及び／又は分離
所望により、しかしながら好ましくは、本発明のプロセスは、得られた微生物結合の濃縮剤の凝離を更に含む。好ましくはこのような凝離は、少なくとも部分的に、重力沈殿（重力沈降；例えば、約５分間〜約３０分間にわたって）に依存することによって達成することができる。しかしながらいくつかの場合において、凝離を促進すること（例えば遠心分子又は濾過によって）又は任意の凝離方法の組み合わせを使用することが望ましいことがある。
【００８９】
本発明のプロセスは、所望により、得られた微生物結合の濃縮剤と試料の分離を更に含む。液体試料の場合は、凝離の結果生じた上澄みの除去又は分離が伴い得る。上澄みの分離は、当該技術分野において周知の数多くの方法によって実施することができる（例えば、上澄みを注ぎ出し又は吸い上げることによって、プロセスを実施するのに使用した容器又は管の底に、微生物結合の濃縮剤を残すことができる）。所望により、結合した微生物は、必要に応じて、（例えば、ウシ血清アルブミン溶液又は肉抽出物溶液を使用することによって化学的に、あるいは緩やかな音波処理によって物理的に）濃縮剤から溶出又は分離され得る。
【００９０】
本発明の方法は、手動により（例えばバッチ単位による方法で）実施することができ、又は（例えば、連続的又は準連続的処理を実現して）自動化することができる。
【００９１】
検出
本発明のプロセスを用いて、さまざまな微生物を濃縮すること、及び、所望により、しかしながら好ましくは、検出することができ、これには、例えば、細菌、真菌類、酵母、原生動物、ウイルス（非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む）、細菌内生胞子（例えばバチルス（炭疽菌、セレウス菌、及び枯草菌を含む）及びクロストリジウム（ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、及びウェルシュ菌））、並びに同様物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる（好ましくは、細菌、酵母、真菌類、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、更に好ましくは、細菌、酵母、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、更により好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、非エンベロープ型ウイルス（例えば、ノロウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、及びこれらの組み合わせ）、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、最も好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌及びこれらの組み合わせである。この方法は、病原体の検出における有用性を有し、これは食品安全性又は医療、環境、若しくはテロ対策の理由から非常に重要であり得る。この方法は、病原菌（例えばグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方）、並びにさまざまな酵母、カビ、及びマイコプラズマ（及びこれらの任意の組み合わせ）の検出に特に有用であり得る。
【００９２】
検出される標的微生物の属には、リステリア属、大腸菌属、サルモネラ属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、ヘリコバクター属、マイコバクテリウム属、シゲラ属、ブドウ球菌属、腸球菌属、バチルス属、ナイセリア属、シゲラ属、連鎖球菌属、ビブリオ属、エルシニア属、ボルデテラ属、ボレリア属、シュードモナス属、サッカロミケス属、カンジダ属、及び同様物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。試料には複数の微生物株が含まれることがあり、任意の株を、他の株と独立に検出することができる。検出の標的となり得る具体的な微生物には、大腸菌、腸炎エルシニア菌、エルシニア仮性結核菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・バルニフィカス菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌、サッカロマイセス・セレヴィシエ、カンジダ・アルビカンス、ブドウ球菌エンテロトキシン亜種、セレウス菌、炭疽菌、バチルス・アトロファエウス、枯草菌、ウェルシュ菌、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、エンテロバクター・サカザキ、緑膿菌など、並びにこれらの組み合わせ（好ましくは、黄色ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス（リステリア・イノキュアがサロゲートである）、大腸菌、緑膿菌、及びこれらの組み合わせ）が含まれる。
【００９３】
濃縮剤によって捕捉又は結合した（例えば吸着によって）微生物は、現在知られている、又は今後開発される任意の望ましい方法によって本質的に検出することができる。このような方法には、例えば、培養による方法（時間が許す場合は好ましいことがある）、顕微鏡（例えば透過光型顕微鏡又はエピ蛍光顕微鏡（蛍光染料で標識した微生物を可視化するのに使用できる））、及びその他の画像手法、免疫学的検出方法、及び遺伝子学的検出方法が挙げられる。微生物群捕捉後の検出プロセスには、洗浄して試料マトリックス成分を除去すること、又は染色することなどを含み得る。
【００９４】
免疫学的検出は、標的生物に由来する抗原物質の検出であり、これは一般的に、細菌又はウイルス粒子の表面にあるマーカーとして作用する生物学的分子（例えばタンパク質又はプロテオグリカン）である。抗原物質の検出は、通常、抗体によるものであることができる。抗体は、例えばファージディスプレイなどの方法によって選択されたポリペプチド、又はスクリーニング方法から得られたアプタマーである。
【００９５】
免疫学的検出方法は周知であり、例えば免疫沈降及び酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。抗体結合は、さまざまな方法で検出することができる（例えば、一次抗体又は二次抗体のいずれかを、蛍光染料により、量子ドットで、又は化学発光若しくは着色基質を生成できる酵素により標識し、プレートリーダー又はラテラルフロー装置のいずれかを用いる）。
【００９６】
検出はまた、遺伝子学的検定法（例えば核酸のハイブリダイゼーション又はプライマーを用いた増幅）によって実行することができ、これがしばしば好ましい方法である。捕捉又は結合された微生物は溶解され、検定に利用できる遺伝子学的物質を供給する。溶解方法は周知であり、これには例えば、音波処理、浸透性ショック、高温処理（例えば約５０℃〜約１００℃）、及びリゾチーム、グルコラーゼ、チモラーゼ（zymolose）、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、及びウイルスエンドリシン（enolysins）などの酵素と共にインキュベーションすることが挙げられる。
【００９７】
一般的に使用されている遺伝子学的検出検定法の多くは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、具体的な微生物の核酸を検出する。遺伝子学的検出方法に使用される条件の厳密性は、検出される核酸配列の変異レベルに相関する。塩濃度及び温度の条件が非常に厳しいと、標的の正確な核酸配列の検出が制限され得る。このように、標的核酸配列に小さな変異を有する微生物株は、非常に厳しい遺伝子学的検定法を使用して区別することができる。遺伝子学的検出は、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて行われ、ここにおいて一本鎖核酸プローブが微生物の変性核酸にハイブリッド化して、プローブ鎖を含む二本鎖核酸が生成される。当業者は、ゲル電気泳動、細管式電気泳動、又はその他の分離方法の後でハイブリッドを検出するための、放射性、蛍光、及び化学発光標識などのプローブ標識について熟知するであろう。
【００９８】
特に有用な遺伝子学的検出方法は、プライマーを用いた増幅に基づくものである。プライマーを用いた核酸増幅方法には、例えば、熱サイクル方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））、並びに等温方法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（及びこれらの組み合わせ、好ましくはＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。増幅された生成物を検出する方法は、例えばゲル電気泳動分離及び臭化エチジウム染色、並びに生成物中に組み込んだ蛍光標識又は放射性標識の検出が含まれ、これらに限定されない。増幅生成物の検出前に分離工程を必要としない方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ又はホモジニアス検出法）も使用することができる。
【００９９】
生物発光検出法は周知であり、例えば、記述が参考として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２２，８６８号（Ｆａｎら）に記述されているものを含むアデノシン（adensosine）三リン酸（ＡＴＰ）検出方法が挙げられる。他の発光に基づく検出方法も使用することができる。
【０１００】
本発明の方法は株特異性ではないため、同じ試料内で、複数の微生物株を検定のための標的にすることができる、一般的な捕捉システムを提供する。例えば、食品試料の汚染について検定を行う場合、同じ試料内でリステリア・モノサイトゲネス、大腸菌、及びサルモネラの全部について試験を行うことが望ましいことがあり得る。捕捉工程を１回行い、次に例えば、これら微生物株それぞれの、異なる核酸配列を増幅するための固有プライマーを使用して、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ検定を行うことができる。したがって、それぞれの株について別々の試料取扱い及び作製手順を行う必要性を回避することができる。
【０１０１】
診断キット
本発明のプロセスを実施する際に使用するための診断キットは、（ａ）上述の吸着緩衝液改質無機濃縮剤（好ましくは粒子）、（ｂ）試験容器（好ましくは滅菌試験容器）、及び（ｃ）本発明のプロセス実施における濃縮剤使用のための説明書を含む。好ましくは、この診断キットは更に、微生物培養媒体又は培地、溶解試薬、緩衝液、生物発光検出検定構成要素（例えば照度計、溶解試薬、ルシフェラーゼ酵素、酵素基質、反応緩衝液、その他同様物）、遺伝子学的検出検定構成要素、及びこれらの組み合わせから選択された１つ以上の構成要素を含む。好ましい溶解試薬は、緩衝液中に供給された溶解酵素であり、好ましい遺伝子学的検出検定構成要素には、標的微生物に固有の１つ以上のプライマーが含まれる。
【０１０２】
例えば、本発明の診断キットの好ましい実施形態には、粒子吸着緩衝液改質無機濃縮剤（例えば、ガラス製又はポリプロピレン製バイアルなどの滅菌使い捨て可能な容器入り）に、本発明のプロセスの実施における前記薬剤使用のための説明書（例えば、濃縮剤と、分析する流動体試薬とを混合し、この濃縮剤を重力によって沈殿させ、得られた上澄みを除去し、濃縮剤に結合した少なくとも１種類の標的微生物株の存在を検出すること）を組み合わせたものが含まれる。濃縮剤は、所望により、汚染を防ぐために、破って開けるタイプの密閉パウチに収容／アリコート化されてもよい。濃縮剤は、粉末状であってもよい。好ましくは、診断キットは、（より好ましくは、１つ以上の破って開けるタイプの密閉パウチに収容された）粒子吸着緩衝液改質無機濃縮剤の予め計量されたアリコート（例えば、試料量に基づく）を含む。
【実施例】
【０１０３】
本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に、本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。以下の実施例内の全ての部分、割合、比率などは、特に記載がない限り、重量によるものとする。微生物培養物をＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。用いた溶媒及びその他の試薬は、特に記載がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手した。
【０１０４】
表面改質珪藻土粒子状濃縮剤の調製
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ａ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から、白色粉末のキーゼルグール（珪藻土）（３２５メッシュ；粒径が全て４４マイクロメートル未満）を購入した。この材料はＸ線回折（ＸＲＤ）によって、α−クリストバライト及び石英と共に非晶質シリカを含むことが示された。
【０１０５】
２つの異なる表面改質剤（すなわち二酸化チタン及び酸化第二鉄）を含む粒子状濃縮剤を、下記の方法により珪藻土を表面処理することにより調製した。
【０１０６】
二酸化チタンの堆積
２０．０ｇのＴｉＯ（ＳＯ４）・２Ｈ２Ｏ（Ｎｏａｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ））を８０．０ｇの脱イオン水に撹拌しながら溶解させることにより、２０重量パーセントのオキシ硫酸チタン（ＩＶ）二水和物溶液を作製した。５０．０ｇのこの溶液を脱イオン水１７５ｍＬと混合し、二酸化チタン前駆体化合物溶液を形成した。５０．０ｇの珪藻土を大きなビーカー中で急速に撹拌しながら５００ｍＬの脱イオン水に分散させることにより、珪藻土の分散液を作製した。この珪藻土分散液を約８０℃に加熱した後、急速に撹拌しながら約１時間かけて二酸化チタン前駆体化合物溶液を滴下して加えた。添加後、ビーカーを時計皿で覆い、内容物を加熱して２０分間沸騰させた。水酸化アンモニウム溶液をビーカーに加え、内容物のｐＨを約９にした。洗浄水のｐＨが中性になるまで沈降／デカンテーションにより、得られた生成物を洗浄した。生成物を濾過によって分離し、１００℃で一晩乾燥させた。
【０１０７】
乾燥生成物の一部を磁器るつぼに入れ、加熱速度毎分約３℃で室温から３５０℃まで加熱することによって焼成し、３５０℃で１時間保持した。
【０１０８】
酸化鉄の堆積
１７５ｍＬの脱イオン水に溶解した２０．０ｇのＦｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．））を硫酸チタニル溶液に置き換えたことを除いて、本質的に上記の二酸化チタン堆積法を用いて、酸化鉄を珪藻土の上に堆積させた。更なる試験のため、得られた酸化鉄改変珪藻土の一部を同様に３５０℃で焼成した。
【０１０９】
材料
１８メガオーム水：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）グラジエント脱イオンシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販）を用いて１８メガオームの滅菌脱イオン水を得た。
３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（乾燥、再水和可能培地を備える平板状フィルム型培養デバイス）は３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から得た。
３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群計測プレート（少なくとも１つの発酵性栄養素を含む平板状フィルム型培養デバイス）は３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から得た。
吸着緩衝液：１８メガオームの水１リットルに、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を（磁気撹拌で）混合し、次いで０．２２マイクロメートルのナイロン製フィルタ膜を持つＶＷＲ（商標）真空濾過システム（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から得た）を通過させることによりその溶液をフィルタ滅菌することによって作製したｐＨ ７．２を有するカチオン含有塩溶液。
１００倍吸着緩衝液：（１）１００ｍＬの１８メガオーム水に、５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むフィルタ滅菌（本質的に上述のように）した溶液と、（２）１００ｍＬの１８メガオーム水に、１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含むフィルタ滅菌（本質的に上述のように）した溶液とを等量で混合することによって作製したｐＨ ７．２を有するカチオン含有塩溶液（全ての溶液は磁気撹拌で調製した）。
３０〜５０マイクロメートルの範囲の寸法を有するアミン官能化（アミン官能オルガノシランを用いた反応からの有機コーティング）ガラスビーズは、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から入手した。
ＣＭ−１１１：非晶質の長球化ケイ酸マグネシウム（固形球形として成型済みの微小球、粒子密度２．３ｇ／立方センチメートル、表面積３．３ｍ２／ｇ、粒径：９０パーセントが約１１マイクロメートル未満、５０パーセントが約５マイクロメートル未満、１０パーセントが約２マイクロメートル未満、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から販売の３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ＣＭ−１１１）として入手した。
Ｆｅ−ＤＥ：本質的に上記のように、珪藻土上に酸化第二鉄を堆積させた。
Ｔｉ−ＤＥ：本質的に上記のように、珪藻土上に二酸化チタンを堆積させた。
Ｗ−２１０：アルカリアルミノケイ酸塩セラミック（固形球形として成型済みの微小球、粒子密度２．４ｇ／立方センチメートル、表面積５ｍ２／立法センチメートル、粒径：９５パーセントが約１２マイクロメートル未満、９０パーセントが約９マイクロメートル未満、５０パーセントが約３マイクロメートル未満、１０パーセントが約１マイクロメートル未満、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から販売の３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ Ｗ−２１０）として入手した。
【０１１０】
実施例１〜４及び比較例Ｃ−１〜Ｃ−６
吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製
ＣＭ−１１１粉末の５グラムのアリコートを２つの部分に分割し、その部分を２つの５０ｍＬのポリプロピレン製遠心管に設置し、ＶＷＲアナログボルテックスミキサー（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））上で１分間に１４，０００回転（ｒｐｍ；最高速度）で１０秒間渦動することによって、５０ｍＬの１８メガオーム滅菌水に懸濁／分散した。結果として得られた懸濁液を、次いで３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））、ペレット状のＣＭ−１１１を得た。各ペレットを、次いで５０ｍＬの１８メガオーム水に再懸濁し、本質的に上述のように処理することによって、再度洗浄した。ＣＭ−１１１を事前洗浄するこの工程を、５０ｍＬの１８メガオーム水での合計三度の洗浄にわたり、再度実行した。次に、結果として得られた事前洗浄したＣＭ−１１１ペレットを、本質的に上述のように渦動することによって５０ｍＬ量の吸着緩衝液に分散し、次いで、本質的に上述のように遠心分離し、ペレット状のＣＭ−１１１を得た。ＣＭ−１１１を５０ｍＬの吸着緩衝液で洗浄するこの工程を、三度行った。最終洗浄後、結果として得られた上澄みを処分し、結果として得られた少なくとも部分的に湿ったペレットを、滅菌ガラスのペトリ皿（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に設置した。少なくとも部分的に湿ったペレットを、（ＳｃｉＧｅｎｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手可能なＲｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｏｄｅｌ ４００ハイブリダイゼーションインキュベーターを使用して）８０℃で５〜６時間にわたり乾燥させた（実施例１）。結果として得られた乾燥粉末（吸着緩衝液改質無機濃縮剤）を室温（約２３℃）で保管した。
【０１１１】
以下の他の無機濃縮剤を、１００ミリグラム量で、本質的に同一のプロセス（１００ｍｇの薬剤を５０ｍＬの１８メガオーム水中で三度洗浄し、次いで５０ｍＬの吸着緩衝液中で三度洗浄する）を使用して処理した；Ｔｉ−ＤＥ（実施例２）、Ｆｅ−ＤＥ（実施例３）、アミン官能化ガラスビーズ（比較例Ｃ−６）、及びＷ−２１０（実施例４）。対応する未処理の薬剤を比較のために保持した；未処理ＣＭ−１１１（比較例Ｃ−１）、未処理Ｔｉ−ＤＥ（比較例Ｃ−２）、未処理Ｆｅ−ＤＥ（比較例Ｃ−３）、未処理アミン官能化ガラスビーズ（比較例Ｃ−４）、及び未処理Ｗ−２１０（比較例Ｃ−５）。
【０１１２】
微生物含有試料の濃縮
Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ平板培地（４重量パーセント（ｗｔ％）のＤｉｆｃｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））から、白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）のＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ５１８１３）一晩画線培養物を用いて、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（Ｖｉｔｅｋ ＤＥＮＳＩＣＨＥＫ，ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）の、３ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液（ｐＨ ７．２，ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）溶液を作製した。この標準はおよそ１０８コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）に相当する。連続希釈を、フィルタ滅菌（本質的に上述のように）した脱イオン１８メガオーム水で行った。１０５ＣＦＵ／ｍＬ希釈から、１５ｍＬのフィルタ滅菌１８メガオーム水で更に１０００倍希釈を実行し、最終濃度約１００ＣＦＵ／ｍＬを得た。粒子無機濃縮剤（処理済（実施例１〜５）及び未処理（比較例Ｃ−１〜Ｃ−５））を、５ｍＬのポリプロピレン製チューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に計量し、１００ＣＦＵ／ｍＬの試験試料の１．０ｍＬ量中の１０ｍｇの濃縮剤を使用して、細菌捕捉を試験した。次いでチューブにキャップをし、室温（２３℃）にて約１分にわたって手動で振盪することによって、それらの内容物を混合した。
【０１１３】
混合後、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）揺動プラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｉｏｗａ）１４サイクル／分）で、チューブを１５分にわたってインキュベートした。インキュベート後、チューブをベンチトップに１０分間置いて粒子濃縮剤を沈殿させた。沈殿後、１ｍＬの結果として得られた上澄みを、ピペットを使用して除去し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））上に播種した。沈殿したペレットを１．０ｍＬの水で再懸濁し、同様に播種した。
【０１１４】
最初の１０５ＣＦＵ／ｍＬ希釈（粒子濃縮剤なし）からの１０００倍希釈を、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））上に対照として播種した。粒子濃縮剤（試料接触を有しない）もまた、滅菌対照として播種した。結果として得られたプレートを、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした（ＶＷＲ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ．ＰＡ））。
【０１１５】
製造業者の説明書にしたがって、このプレートを、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（ＰＰＲ、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ）、自動光学的検出システム）を使用して分析し、コロニー計数を得た。次式を使用して結果を算出した。
捕捉効率＝（濃縮剤上のコロニー数）／（対照中の全コロニー数）×１００
【０１１６】
結果（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）を以下の表１に示す。表１及び続く表内の濃縮剤の記述、「ＡＢ洗浄済」は、濃縮剤が吸着緩衝液で処理されていることを示すために使用する。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
比較例Ｃ−７〜Ｃ−１０
別個の１００ｍｇアリコートの粉末（無機濃縮剤Ｔｉ−ＤＥ（比較例Ｃ−７）、Ｆｅ−ＤＥ（比較例Ｃ−８）、Ｗ−２１０（比較例Ｃ−９）、及びＣＭ−１１１（比較例Ｃ−１０））を、最終スピン／洗浄工程後に、結果として得られた少なくとも部分的に湿った粉末を乾燥させずに、１ｍＬ吸着緩衝液にペレットを再懸濁することによって湿ったペレットとして使用したことを除いて、本質的に上述の実施例１〜４のように処理した。１ｍＬのスパイク水中の〜１００ＣＦＵの大腸菌を用いた捕捉効率試験を、本質的に実施例１〜４に記載のように実行した。結果（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）を、以下の表２に示す。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
実施例５及び比較例Ｃ−１１
別個のＣＭ−１１１ペレットを、本質的に実施例１にあるように処理したが、ペレットを８０℃で乾燥させる替わりに、吸着緩衝液に再懸濁し、結果として得られたスラリーを室温（約２３℃）で４８時間乾燥させた（実施例５）。１．１ｍＬのスパイク水中のおおよそ１００ＣＦＵの大腸菌を用いた捕捉効率試験を、本質的に実施例１〜４に記載のように実行した。結果（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）を、以下の表３に示す。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
室温乾燥実験に使用したＣＭ−１１１ロットの未処理アリコートを、表面組成物判定のために保持した（比較例Ｃ−１１）。
【０１２３】
元素の表面化学分析（ＥＳＣＡ）による表面組成物判定
吸着緩衝液処理済み及び未処理（比較）濃縮剤の表面組成物を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ、ＥＳＣＡとしても既知）によって分析した。粉末のアリコートを、アルミホイル上で、感圧性接着剤両面テープに押し付けた。圧縮窒素ガスを吹き付けることにより、過剰の粉末をそれぞれの試料表面から除去した。
【０１２４】
単色Ａｌ−Ｋα Ｘ線励起源（１４８７ｅＶ）と、一定パスエネルギーモードで動作する半球形電子エネルギーアナライザーを有する、クレイトスＡＸＩＸウルトラ（Kratos AXIS Ulta）（商標）ＤＬＤスペクトロメーター（クレイトス・アナリティカル社（Kratos Analytical））、英国マンチェスター市）を用いてスペクトルデータを取得した。試料表面に対して測定して９０度のテイクオフ角度で±１０度の受け取りの立体角により出射光電子を検出した。低エネルギー電子フラッドガンを使用して、表面帯電を最少化した。アノードに対して１４０ワット電力及び２×１０−８Ｔｏｒｒ（２．６７μＰａ）チャンバー圧力を用いて、測定を行った。
【０１２５】
約３００マイクロメートル×約７００マイクロメートルの寸法のそれぞれの濃縮剤アリコートの表面積を、それぞれのデータ点に対して分析した。それぞれのアリコートの３つの面積を分析し、平均して、報告された平均の原子パーセント値を得た。データ処理は標準のビジョン２（Vision 2）（商標）（クレイトス・アナリティカル社（KratosAnalytical）、英国マンチェスター市）を使用して実施された。実施例１〜５並びに比較例Ｃ−１〜Ｃ−６及びＣ−１１に対してデータが収集された。結果（元素が濃縮剤の表面上に、ＸＰＳによって検出可能なレベルで存在し、報告された数字は３つのデータ点にわたって平均化される）を以下の表４に示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
実施例６及び比較例Ｃ１２〜Ｃ−１３
分離したＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ５１８１３）のコロニーを、画線プレートから５ｍＬのＢＢＬ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に接種し、３７℃で１８〜２０時間にわたってインキュベートした。〜１０９コロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物を、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液（ｐＨ ７．２、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に希釈した。１０２細菌／ｍＬ希釈からの１０００倍希釈を１００ｍＬの飲料水で実行し、最終濃度０．１ＣＦＵ／ｍＬ（合計１０ＣＦＵ）を有する大腸菌スパイク水を得た。比較例Ｃ−１２について、１００ｍｇの未処理／対照ＣＭ−１１１を、１００ｍＬの大腸菌スパイク水を含有する、２５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。比較例Ｃ−１３について、１００ｍｇの未処理／対照ＣＭ−１１１を、１００ｍＬの大腸菌スパイク水及び１．１ｍＬの１００倍吸着緩衝液を含有する、２５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。実施例６については、本質的に実施例１にあるように吸着緩衝液改質された１００ｍｇのＣＭ−１１１を、１００ｍＬの大腸菌スパイク水を含有する、２５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。チューブにキャップをし、次いでＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）揺動プラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｉｏｗａ）１４サイクル／分）上で、室温（２３℃）で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを３０分間研究室のベンチに立てておき、ＣＭ−１１１粒子を沈殿させた。
【０１２８】
ＣＭ−１１１取り出し工程において、結果として得られた上澄みの８０ｍＬ量を、ピペッティングにより処分し、沈殿した粒子を含有する残りの２０ｍＬを、チューブからピペットで取り出し、５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製チューブ（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に移し、２０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））で５分間遠沈させ、ペレットを得た。ペレットを、１ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液に再懸濁し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群計測プレートに接種した。〜１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（粒子濃縮剤なし）から１ｍＬ量を、対照として正副２枚の３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。結果として得られたプレートを、製造業者の説明書にしたがって更に処理し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））を使用して分析した。結果（２つのデータ点にわたって平均化したもの）を表５に示す。
【０１２９】
【表５】
・＊〜２０パーセントの標準偏差
・＊＊〜１０パーセントの標準偏差
【０１３０】
実施例７及び比較例Ｃ−１４〜Ｃ−１６
分離したＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ５１８１３）のコロニーを、画線プレートから５ｍＬのＢＢＬ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に接種し、３７℃で１８〜２０時間にわたってインキュベートした。〜１０９コロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物を、フィルタ滅菌１８メガオーム水で希釈した。１０６細菌／ｍＬ希釈からの１０００倍希釈を、１０ｍＬのフィルタ滅菌１８メガオーム水で実行し、最終濃度〜１０３細菌／ｍＬ（合計〜１０４ＣＦＵ）を有する大腸菌スパイク水を得た。実施例７について、１０ｍｇの吸着緩衝液改質（本質的に実施例１のように）されたＣＭ−１１１を、１０ｍＬの大腸菌スパイク水を有する５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。チューブにキャップをし、次いでＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）揺動プラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｉｏｗａ）１４サイクル／分）上で、室温（２３℃）で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））で５分間チューブを遠心分離し、ＣＭ−１１１粒子を沈殿させ、ＣＭ−１１１ペレットを形成した。
【０１３１】
１００マイクロリットルの未スパイク水（１チューブ）及び１００マイクロリットルの大腸菌スパイク水（２チューブ、それぞれ異なる希釈から）を含有する対照チューブを、ＣＭ−１１１濃縮剤なしで、それぞれキャップをして同様にインキュベートした（比較例Ｃ−１４（未スパイク）、Ｃ−１５（希釈番号１：１００マイクロリットルの１０３ＣＦＵ／ｍＬ希釈）、及びＣ−１６（希釈番号２：１００マイクロリットルの１０５ＣＦＵ／ｍＬ希釈））。播種対照として、吸着緩衝液改質（本質的に実施例１にあるように）されたＣＭ−１１１ペレット（捕捉した細菌あり）を、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレートに播種した。結果として得られたプレートを、製造業者の説明書にしたがって、更に処理し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ．，ＭＮ））を使用して分析した。この播種対照の結果は、比較例Ｃ−１５に対して１．９×１０３ＣＦＵ／ｍＬの濃縮を示した。ＣＭ−１１１播種対照は、捕捉効率１００パーセントを表した。
【０１３２】
ＣＭ−１１１ペレットを、１００マイクロリットルの１８メガオーム水に再懸濁し、１．５ｍＬの滅菌ポリプロピレン製微量遠心管（ＰＬＡＳＴＩＢＲＡＮＤ（商標）、ＢＲＡＮＤ ＧＭＢＨ＋ＣＯ（Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に移した。１００マイクロリットルの量のＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）ＡＴＰ検定試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を、各チューブ（対照チューブ含む）に添加し、ＶＷＲアナログボルテックスミキサー（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））で１５秒間１４，０００ｒｐｍ（最高速度）で混合した。生物発光（対照チューブ及びＣＭ−１１１ペレット含有チューブ）を、ベンチトップ照度計（ＦＢ−１２単一チューブ照度計、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ））を使用して（相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で）測定した。結果（２つのデータ点からの平均値）を以下の表６にまとめる。
【０１３３】
【表６】
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位
【０１３４】
実施例８〜１２及び比較例Ｃ−１７〜Ｃ−２２
白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）の黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）一晩培養物を用いて、０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（〜１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当）を作製し、本質的に上述のように調製した１０ｍｇのさまざまな異なる粒子濃縮剤を用いて試験した。さまざまな粒子濃縮剤（１０ｍｇ）を、本質的に実施例１〜４にあるように、１．１ｍＬの水試料からの〜１００ＣＦＵの捕捉について試験し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。〜１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（粒子濃縮剤なし）から１ｍＬ量を、対照として正副２枚の３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ．，ＭＮ））を使用して、プレートを分析した。
【０１３５】
黄色ブドウ球菌に対する捕捉データを、以下の表７に示す（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差を示す）。微生物のコロニーと濃縮剤の色が類似している（プレートリーダーに対して殆どコントラストをもたらさない）場合には、結果は上澄み液を基準とし、下記の式を用いて濃縮剤による微生物のパーセント捕捉率により報告された。
上澄み液中のＣＦＵ／ｍＬパーセンテージ＝（播種された上澄みからのコロニー数）／（播種された未処理の対照試料からのコロニー数）×１００
捕捉効率又はパーセント捕捉率＝１００−上澄み液中のＣＦＵ／ｍＬパーセンテージ
【０１３６】
上澄み液を基準とした上述の等式から計算した捕捉効率は、表７の「試験方法」に「上澄み」と標示する。濃縮剤を基準とした捕捉効率は、実施例１〜４に既定の等式に基づいたものであり、表７の「試験方法」に「剤」として標示する。
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
実施例１３〜１６及び比較例Ｃ−２３〜Ｃ−２６
Ｔｙｒｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ平板培地（製造業者の説明書にしたがって調製された、４重量パーセントのＤｉｆｃｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））から、白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）の緑膿菌（ＡＴＣＣ １５４４２）一晩培養物を用いて、０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（〜１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当）を作製し、本質的に上述のように調製した１０ｍｇのさまざまな異なる粒子濃縮剤を用いて試験した。さまざまな粒子濃縮剤（１０ｍｇ）を、本質的に実施例１〜４に記載のように、１．０ｍＬ水試料からの〜１００ＣＦＵの捕捉について試験し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））上に播種した。最初の１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（濃縮剤なし）からの１ｍＬ量を、対照として正副２枚の３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。結果として得られたプレートを、３７℃で約２４時間インキュベートし、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（ＰＰＲ、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ））を使用して分析した。粒子薬剤の捕捉効率は、実施例１〜４に記載の式を使用することによって判定する。緑膿菌に対する捕捉データを、以下の表８に示す（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）。
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
実施例１７〜２１及び比較例Ｃ−２７〜Ｃ−３２
Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ平板培地（５パーセントのＢｌｏｏｄ Ａｇａｒ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ））から、白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）のリステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ ３３０９０）一晩培養物を用いて、０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（〜１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当）を作製し、本質的に上述のように調製した１０ｍｇのさまざまな異なる粒子濃縮剤を用いて試験した。粒子濃縮剤（１０ｍｇ）を本質的に実施例１〜４に記載のように１．０ｍＬの水試料からの〜１００ＣＦＵの捕捉について試験した。１０分の沈殿後、結果とて得られた１ｍＬの上澄みを、別個の５ｍＬ滅菌チューブに取り除いた。結果として得られた濃縮剤のペレットを、１００マイクロリットルの１８メガオーム水に再懸濁し、ＭＯＸプレート（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｐｌａｔｅｓ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ））に散布することによって播種した。上澄みからの１００マイクロリットル量もまた、同様に播種した。最初の〜１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（濃縮剤なし）からの１０倍希釈を、対照として正副２枚に播種した。手集計によりコロニー計数を得、実施例１〜４において上述の式を使用して、粒子濃縮剤の捕捉効率を判定した。リステリア・イノキュアに対する捕捉データを、以下の表９に示す（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）。
【０１４１】
【表９】
【０１４２】
本明細書で引用した特許、特許文献、及び公報に含有される参照された記述内容は、その全体が、それぞれ個別に組み込まれているかのように、参照として組み込まれる。本発明に対する様々な予見できない修正及び変更が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかとなるであろう。本発明は、本明細書に記載した例示的な実施形態及び実施例によって過度に限定されるものではなく、またかかる実施例及び実施形態は、一例として表されているだけであり、但し、本発明の範囲は、以下のように本明細書に記載した請求項によってのみ限定されることを意図するものと理解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００９年１２月２２日に出願された、米国仮出願第６１／２８９，２１３号の優先権を主張し、その内容を本明細書に参考として組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、微生物が検出又は検査に対して生存可能な状態を保つように、微生物を捕捉又は濃縮するための方法に関するものである。他の態様において、本発明は、このような濃縮プロセスを実行する際に使用するための濃縮剤を調製する方法（並びに、結果として得られる濃縮剤及び結果として得られる濃縮剤を含む診断キット）にもまた関するものである。
【背景技術】
【０００３】
微生物汚染により生じる食品媒介疾患及び院内感染は、世界中の無数の場所で懸案となっている。したがって、存在する微生物の素性及び／又は量を決定するために、さまざまな医療、食品、環境、又はその他の試料中における、細菌又は他の微生物の存在を検定することがしばしば望ましく、あるいは必要である。
【０００４】
例えば、細菌ＤＮＡ又は細菌ＲＮＡを検定して、たとえ他の細菌種の存在においても特定の細菌種の存在又は不在を評価することができる。しかしながら、特定の細菌の存在を検出する能力は、少なくとも部分的に、分析される試料中の細菌の濃度に依存する。細菌試料は、検出に適切な濃度の確保に試料中の細菌の数を増加させるために播種され又は培養されるが、この培養工程はしばしば時間がかかり、評価結果を顕著に遅らせることがある。
【０００５】
試料中の細菌を濃縮することで、培養時間を短縮することができ、培養工程の必要性を排除することすら可能になる。このように、菌株に特異的な抗体を使用することによって（例えば、抗体をコーティングした磁性粒子又は非磁性粒子の形態で）、特定の細菌株を分離する（及びこれにより濃縮する）ための方法が開発されている。しかしながらこのような方法は高価であり、少なくとも一部の診断用途に望まれるよりも依然としてやや遅い傾向がある。
【０００６】
菌株特異的でない濃縮方法も使用されている（例えば、試料中に存在する微生物のより総合的な評価を得るため）。混合した微生物群を濃縮した後、所望ならば、菌株特異的なプローブを用いることによって特定の菌株の存在を判定することができる。
【０００７】
微生物の非特異的な濃縮又は捕捉は、炭水化物とレクチンタンパク質との相互作用に基づいた方法によって達成されている。これまでに非特異的捕捉装置としてキトサンをコーティングした支持体が使用され、微生物の栄養素の役目を果たす物質（例えば、炭水化物、ビタミン、鉄キレート化合物、及びシデロホア）が、微生物の非特異的捕捉を提供するための配位子として有用であることも記述されてきた。
【０００８】
さまざまな無機材料（例えばヒドロキシアパタイト及び金属水酸化物）が、細菌を非特異的に結合し濃縮するために使用されてきた。非特異的な捕捉のためには、無機結合剤の使用及び／又は不使用の、物理的な濃縮方法（例えば濾過、クロマトグラフィー、遠心分離、及び重力沈降）も利用されている。このような非特異的な濃縮方法は、速度、費用（少なくとも一部のものは高価な装置、材料、及び／又は訓練を受けた技術者が必要になる）、試料要件（例えば、試料の性質及び／又は量の制限）、空間的要件、使用の容易さ（少なくとも一部のものは複雑な複数の工程のプロセスを必要とする）、現場使用の適合性、及び／又は高価さの点において様々に異なっている。
【０００９】
非特異的な濃縮方法の少なくとも幾つか（例えば、無機結合剤を利用する方法の少なくとも幾つか）は、微生物結合を強化するための添加剤としてのカチオン含有吸着緩衝液の使用を伴っている。このような緩衝液は、典型的に、液体形態で（例えば、塩水溶液の形態で）使用されている。このような緩衝液の現場での使用は、菌液の移送及び取扱い、又は滅菌状態下における緩衝液の乾燥塩からの現場での再構成のどちらかを必要とするため、吸着緩衝液の現場での使用に対する好適性は、幾らか制限されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このように、本発明者らは、病原微生物を迅速に検出するための方法に対する切迫したニーズがあると認識している。このようなプロセスは、好ましくは迅速なだけでなく、コストが低く、簡単であり（複雑な機器又は手順の必要がない）、及び／又は様々な条件下で有効である（例えば、様々なタイプの試料マトリックスで使用でき、細菌の量が変わっても、及び試料の量が変わっても、使用できる）。
【００１１】
簡単に言えば、１つの態様では、本発明は、微生物が１つ以上の株の検出又は検定の目的で生存可能な状態を保つように、試料中に存在する微生物株（例えば細菌、真菌、酵母、原生動物、ウイルス（非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む）、及び細菌内生胞子）を、非特異的に濃縮する方法を提供する。本方法は、（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、（１）少なくとも１つの無機濃縮剤（好ましくは、粒子無機濃縮剤）を少なくとも１つのカチオン含有塩溶液（好ましくは、水性）と接触させて（好ましくは洗浄することによって）、無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（２）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を（好ましくは、２５℃より高い温度に加熱することによって）乾燥させることと、を含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を（好ましくは流体の形態で）準備することと、（ｃ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と（好ましくは、混合することによって）接触させることであって、それにより少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか、又はそれによって捕捉されることと、を含む。カチオン含有塩溶液は、好ましくは、少なくとも１つの多価カチオン（より好ましくは、少なくとも１つの二価カチオン、最も好ましくは、二価カルシウムカチオン、二価マグネシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの二価カチオン）を含む。
【００１２】
好ましくは、濃縮プロセスは、少なくとも１つの結合された微生物株の存在を検出すること（例えば、培養による方法、顕微鏡／画像手法、遺伝子学的方法、生物発光による方法、又は免疫学的検出方法）、及び／又は結果として得られた微生物結合された濃縮剤を凝離すること（好ましくは、重力沈殿により）を更に含む。このプロセスは所望により、得られた凝離濃縮剤を試料から分離することを更に含む。
【００１３】
本発明の濃縮プロセスは、特定の微生物株を標的とするものではない。むしろ、比較的安価な非特異的な無機濃縮剤の捕捉効率又は結合効率は、驚くべきことに、薬剤を吸着緩衝液と接触させ、次いで乾燥させる、簡単な表面処理方法によって強化され得ることが発見された。結果として得られる吸着緩衝液改質無機濃縮剤は、さまざまな微生物を捕捉することにおいて、それらの未処理の対応物よりも少なくとも幾らかは効率的であり、調製後は、滅菌液緩衝溶液の移送及び／又は取扱いの必要性、あるいは滅菌状態下における緩衝溶液の現場での再構築の必要性なく、現場で（現地で）使用され得る。吸着緩衝液改質無機濃縮剤を使用して、１つ以上の微生物株（好ましくは、１つ以上の細菌株）をより容易、かつ迅速に検定することができるように、試料（例えば、食品試料）中に存在する微生物株を、非株特異的な方法で濃縮することができる。
【００１４】
本発明の濃縮プロセスは比較的簡単かつ低コストであり（複雑な装置又は高価な株特異性物質を必要としない）、比較的迅速であり得る（好ましい実施形態は、濃縮剤のない対応する対照試料に比べ、試料中に存在する微生物の少なくとも約７０パーセント（より好ましくは少なくとも約８０パーセント、最も好ましくは少なくとも約９０パーセント）を約３０分以内に捕捉する）。加えて、この方法は、さまざまな微生物（グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方などの病原体を含む）及びさまざまな試料（さまざまな試料マトリックスを含み、しかも少なくとも一部の従来技術とは違って、微生物含有量が少ない試料及び／又は大量の試料であっても）に有効であり得る。よって、本発明の方法の少なくともいくつかの実施形態は、さまざまな状況下で病原微生物を迅速に検出するための低コストで単純な方法に対する、上述のような緊迫したニーズに対応することができる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液（塩又は塩溶液）を用いて、少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理して（例えば、物理蒸着（ＰＶＤ）を含む本明細書に記載の方法を含む、２つの物質の間に接触をもたらす任意のさまざまな既知の方法又は今後開発される方法によって接触させることによって）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、少なくとも１つのカチオンの原子（カチオン原子の合計は、例えば、以下の表４を参照のこと）とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤の比率よりも大きい（好ましくは少なくとも約５０パーセント大きく、より好ましくは少なくとも約７５パーセント大きく、更により好ましくは少なくとも約１００パーセント大きく、最も好ましくは少なくとも約２００パーセント又は３００パーセント大きい）表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤（好ましくは、実質的に乾燥又は無溶媒の形態で）を準備することを含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を準備することと、（ｃ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤を試料と接触させることであって、それにより少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか、又はそれによって捕捉されることと、を含む、好ましい濃縮プロセスを提供する。有用な物理蒸着（ＰＶＤ）技術は、（例えば、珪藻土上の金属付着に関して）以下に記載されるものを含む。
【００１６】
更に他の態様において、本発明は、それぞれの場合において、調製プロセスが微生物含有試料の実質的な非存在下において実行される（つまり、無機濃縮剤と少なくとも１つの微生物株を含む試料を接触させるより前、したがって無機濃縮剤が本質的に少なくとも１つの無機材料からなる）という条件で、吸着緩衝液改質無機濃縮剤が（ａ）少なくとも１つの無機濃縮剤（好ましくは、微粒子無機濃縮剤）と少なくとも１つのカチオン含有塩溶液（好ましくは、水性）を（好ましくは、洗浄することによって）接触させて、無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（ｂ）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を（好ましくは、２５℃よりも高い温度に熱することによって）乾燥させることと、を含むプロセスによって調製されるか、あるいは、吸着緩衝液改質無機濃縮剤が、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液（塩又は塩溶液）を用いて、少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理して（例えば、物理蒸着（ＰＶＤ）を含む本明細書に記載の方法を含む、２つの物質の間に接触をもたらす任意のさまざまな既知の方法又は今後開発される方法によって接触させることによって）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、少なくとも１つのカチオンの原子（カチオン原子の合計は、例えば以下の表４を参照のこと）とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤の比率よりも大きい（好ましくは少なくとも約５０パーセント大きく、より好ましくは少なくとも約７５パーセント大きく、更により好ましくは少なくとも約１００パーセント大きく、最も好ましくは少なくとも約２００パーセント又は３００パーセント大きい）表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤（好ましくは、実質的に乾燥又は無溶媒の形態で）を準備することを含むプロセスによって調製される、本発明の濃縮プロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製のための２つのプロセス（加えて、それによって調製された改質薬剤及びその改質薬剤を含む診断キット）を提供する。有用な物理蒸着（ＰＶＤ）技術は、（例えば、珪藻土上の金属付着に関して）以下に記載されるものを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の「発明を実施するための形態」では、種々の組の数値範囲（例えば、特定の部分における炭素原子の数、又は特定の成分の量など）が記載され、各組内では、範囲の任意の下限を範囲の任意の上限と対にすることができる。同様に、このような数値範囲は、範囲内に含まれる全ての数を含むことを意味する（例えば１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「及び／又は」は、１つ若しくは全ての列挙した要素、又は２つ以上の列挙した要素のいずれかの組み合わせを意味する。
【００１９】
用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同一又は異なる条件下において、他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００２０】
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が説明文及び特許請求の範囲において現れる場合、限定的な意味を有するものではない。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。そのため、例えば、「１つの（ａ）」標的微生物を含有する疑いがある液体試料は、液体試料が「１つ以上の」標的微生物を含み得ることを意味すると解釈することができる。
【００２２】
上記「課題を解決するための手段」の節は、全ての実施形態又は本発明の全ての実施を説明しようとするものではない。以下の「発明を実施するための形態」が実施形態をより具体的に例示する。「発明を実施するための形態」にわたり、複数の実施例の一覧を通してガイダンスが提供されており、それら実施例は様々な組合せで用いられ得る。いずれの場合にも、記載した一覧は、代表的な群としてのみ役立つものであり、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
【００２３】
用語の定義
本特許出願で使用される場合：
「濃縮剤」は、微生物を結合する材料又は組成物（好ましくは少なくとも約６０パーセント、より好ましくは少なくとも約７０パーセント、更により好ましくは少なくとも約８０パーセント、最も好ましくは少なくとも約９０パーセントの微生物捕捉又は結合効率を有する）を意味する。
「培養デバイス」は、細胞分裂を少なくとも１回生じさせ得る条件下において、微生物を増殖させるために使用することができる、装置を意味する（好ましくは培養デバイスは、偶発的汚染の可能性を低減するか最小化するハウジング及び／又は微生物の増殖を支持する栄養素供給源を含む）。
「検出」とは、これによりその微生物が存在すると判定させる、微生物の少なくとも構成要素の同定を意味する。
「一般的検出」とは、標的微生物に由来するＤＮＡ又はＲＮＡなどの一般的物質の構成要素の同定を意味する。
「免疫学的検出」とは、標的微生物に由来するタンパク質又はプロテオグリカンなどの抗原性物質の同定を意味する。
「微生物」は、分析又は検出に好適な遺伝物質を有する何らかの細胞又は粒子を意味する（例えば、細菌、酵母、ウイルス、及び細菌内生胞子が挙げられる）。
「微生物株」は、検出方法により識別可能な微生物（例えば、異なる属、属内の異なる種、又は種内の異なる隔離体の微生物）の特定のタイプを意味する。
「試料」は、（例えば分析のために）採取される物質又は材料を意味する。
「試料マトリックス」は、試料の微生物以外の試料の構成成分を意味する。
「標的微生物」とは、検出したい微生物を意味する。
【００２４】
無機濃縮剤
全般
本発明のプロセスを実行する際に使用するために好適な濃縮剤は、微生物を結合することができる無機材料又は組成物を含む。好ましくは、無機濃縮剤は、対応する濃縮剤不含の対照試料と比較して、試料中に存在する微生物の少なくとも約６０パーセント（より好ましくは少なくとも約７０パーセント、更により好ましくは少なくとも約８０パーセント、最も好ましくは少なくとも約９０パーセント）を捕捉又は結合することができる。
【００２５】
好ましい無機材料としては、金属酸化物、金属ケイ酸塩（例えば、ケイ酸マグネシウム）、金属アルミノケイ酸塩、シリカ、金属炭酸塩（例えば、炭酸カルシウム）、金属リン酸塩（例えば、ヒドロキシアパタイト）、珪藻土、金属酸化物改質珪藻土、表面改質珪藻土等、及びこれらの組み合わせから選択される材料が挙げられる。望まれる場合には、このような無機材料のコーティングを担持する粒子（例えば、無機表面コーティングを持つ磁気コアを備える粒子）が、使用されてもよい。
【００２６】
好ましい無機材料には、シリコン含有無機材料（例えば、金属ケイ酸塩、金属アルミノケイ酸塩、シリカ、珪藻土、表面改質珪藻土等、及びこれらの組み合わせ）及びこれらの組み合わせが挙げられる。より好ましい無機材料には、金属ケイ酸塩、金属アルミノケイ酸塩、シリカ、珪藻土、金属酸化物改質珪藻土、金改質珪藻土、又は白金改質珪藻土、及びこれらの組み合わせが含まれる。金属酸化物改質（好ましくは、二酸化チタン改質、又は酸化第二鉄改質）珪藻土、金属アルミノケイ酸塩、非晶質金属ケイ酸塩（好ましくは非晶質ケイ酸マグネシウム、より好ましくは非晶質の長球化ケイ酸マグネシウム）、及びこれらの組み合わせは、更により好ましい（非晶質金属ケイ酸塩及びこれらの組み合わせがより好ましく、非晶質の長球化ケイ酸マグネシウムが最も好ましい）。
【００２７】
好ましくは、無機濃縮剤は、粒子形態であり、より好ましくは微小粒子を含む。好ましくは粒子は約１マイクロメートル（より好ましくは約２マイクロメートル、更により好ましくは約３マイクロメートル、最も好ましくは約４マイクロメートル）〜約１００マイクロメートル（より好ましくは約５０マイクロメートル、更により好ましくは約２５マイクロメートル、最も好ましくは約２０マイクロメートル）の範囲の粒径を有し、ここで任意の下限を範囲の任意の上限と組み合わせることができる。
【００２８】
上記の濃縮剤を使用した濃縮又は捕捉は一般的に特定の株、種、又は微生物のタイプに対して特異的ではなく、よって、試料内の微生物の全体的な個体群の濃縮を提供する。次に、株特異的精査を伴う任意の既知の光学的検出方法を用いて、捕捉された微生物群の中から、微生物の具体的な株を検出することができる。
【００２９】
無機材料は、水系に分散又は懸濁されると、その物質及び水系のｐＨに特徴的な表面電荷を示す。物質−水の界面の両側の電位は「ゼータ電位」と呼ばれ、電気泳動における移動度から（すなわち、水系中に置かれた帯電電極間を物質の粒子が移動する速度から）計算することができる。好ましくは無機濃縮剤は、約７のｐＨにおいて負のゼータ電位を有する。
【００３０】
金属ケイ酸塩
本発明のプロセスの実施に用いるのに好適な金属ケイ酸塩濃縮剤としては、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄、チタン、及び同様物など（好ましくはマグネシウム、亜鉛、鉄、及びチタン；より好ましくはマグネシウム）、及びこれらの組み合わせなどの金属の非晶質ケイ酸塩が挙げられる。好ましいのは、少なくとも部分溶融した粒子形状（より好ましくは、非晶質、球体化された金属ケイ酸塩、最も好ましくは、非晶質、球体化されたケイ酸マグネシウム）の非晶質金属ケイ酸塩である。金属ケイ酸塩は既知であり、既知の方法によって化学的に合成するか、又は天然に生じる未加工鉱石の採鉱及び処理によって入手することができる。
【００３１】
金属ケイ酸塩の非晶質の少なくとも部分溶融した粒子形状は、比較的小さい供給粒子（例えば、約２５マイクロメートルまでの平均粒子サイズ）を、概ね回転楕円体又は球の形状の粒子（すなわち、真に又は実質的に円及び楕円の形状及び任意の他の丸い又は曲がった形状を含む、概ね丸く、鋭利な角又は縁を含まない、拡大された二次元像を有する粒子）を作製するための制御された条件下で融解又は軟化させる既知の方法のいずれによっても作製可能である。このような方法には微粒化、ファイアポリッシュ、直接溶融などが挙げられる。好ましい方法は、固体フィード粒子の直接溶融又はファイアポリッシュにより、少なくとも部分的に溶融した、実質的にガラス状粒子が形成される、火焔溶融（例えば、記述が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，０４５，９１３号（Ｃａｓｔｌｅ）に述べられている方法におけるような）である。最も好ましくは、不規則形状をした供給粒子の実質的な部分（例えば、約１５〜約９９容積パーセント、好ましくは、約５０〜約９９容積パーセント、より好ましくは、約７５〜約９９容積パーセント、最も好ましくは、約９０〜約９９容積パーセント）を概ね回転楕円体又は球体の粒子に変換することにより、このような方法を使用して、非晶質の球体化された金属ケイ酸塩を製造することができる。
【００３２】
ある非晶質金属ケイ酸塩は市販されている。例えば、非晶質の長球化されたケイ酸マグネシウムは、化粧品処方の使用のために市販されている（例えば、３Ｍ（商標）コスメティック・ミクロスフェアズＣＭ−１１１（ミネソタ州セントポール市の３Ｍ社から販売））。
【００３３】
非晶質金属ケイ酸塩濃縮剤は更に、金属（例えば鉄又はチタン）酸化物、結晶質金属ケイ酸塩、他の結晶質材料、及び同様物などを含む、他の材料を含み得る。しかしながら、濃縮剤は、好ましくは本質的に結晶質シリカを含まない。
【００３４】
本発明のプロセスの実施に用いるのに好適な特に好ましい濃縮剤としては、非晶質金属ケイ酸塩を含み、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定したケイ素原子に対する金属原子の比が約０．５以下（好ましくは約０．４以下、より好ましくは約０．３以下、最も好ましくは約０．２以下）である表面組成を有する、濃縮剤が挙げられる。このような濃縮剤としては、米国特許仮出願番号第６０／９７７，１８０号（３Ｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載の濃縮剤が挙げられ、濃縮剤及びその調製方法についての記載は、参考として本明細書に組み込まれる。
【００３５】
好ましくは、この特に好ましい濃度剤の表面組成はまた、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定されるものとして少なくとも平均約１０原子パーセントの炭素を含む（より好ましくは少なくとも平均約１２原子パーセントの炭素を含み、最も好ましくは少なくとも平均約１４原子パーセントの炭素を含む）。ＸＰＳは、試料表面の最も外側のほぼ３〜１０ナノメートル（ｎｍ）の元素組成を定量することができ、水素及びヘリウムを除いて周期率表中の全ての元素に感度のある手法である。ＸＰＳは、大多数の元素に対して０．１〜１原子パーセント濃度範囲の検出限界を持つ定量的な手法である。ＸＰＳの好ましい表面組成評価条件には、受光立体角±１０度で試料表面に対して測定される取り出し角９０度が含まれ得る。
【００３６】
このような好ましい金属ケイ酸塩濃縮剤は、例えば、普通のタルクなどの一般的な金属ケイ酸塩よりも負のゼータ電位を有する。それにもかかわらず、濃縮剤は、その表面が一般に負帯電である傾向がある、細菌などの微生物の濃縮においてタルクよりも驚くほど有効である。好ましくは、濃縮剤はｐＨが約７で負のゼータ電位を有する（より好ましくは、ｐＨが約７でスモルコウスキーゼータ電位が約−９ミリボルト〜約−２５ミリボルトの範囲、更に好ましくは、ｐＨが約７でスモルコウスキーゼータ電位が約−１０ミリボルト〜約−２０ミリボルトの範囲、最も好ましくは、ｐＨが約７でスモルコウスキーゼータ電位が約−１１ミリボルト〜約−１５ミリボルトの範囲である）。
【００３７】
表面改質珪藻土
本発明の方法を実施する際に使用するために好適な表面改質珪藻土濃縮剤には、金属酸化物（好ましくは、二酸化チタン又は酸化第二鉄）、微細ナノスケール金若しくは白金又はこれらの組み合わせを含む表面改質剤を含む表面処理剤を、その表面の少なくとも一部の上に担持する珪藻土を含むものが含まれる。このような濃縮剤としては、米国特許仮出願番号第６０／９７７，２００号（３Ｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載の濃縮剤が挙げられ、濃縮剤及びその調製方法についての記載は、参考として本明細書に組み込まれる。表面処理は好ましくは、酸化第二鉄、酸化亜鉛、酸化アルミニウムなど、及びこれらの組み合わせから選択される金属酸化物（より好ましくは酸化第二鉄）を更に含む。金などの貴金属は、抗菌特性を呈することが知られているにもかかわらず、本発明の方法において使用される金含有濃縮剤は、微生物の濃縮に有効なだけでなく、検出又は分析の目的に微生物を生存可能な状態に保つことができる。
【００３８】
有用な表面改質剤としては、微細ナノスケール金、微細ナノスケール白金、少なくとも１つの金属酸化物（好ましくは、二酸化チタン、酸化第二鉄、又はこれらの組み合わせ）と組み合わせた微細ナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも１つの他の金属酸化物（すなわち二酸化チタン以外）と組み合わせた酸化第二鉄、など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい表面改質剤としては、微細ナノスケール金、微細ナノスケール白金、少なくとも酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細ナノスケール金、二酸化チタン、少なくとも酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、酸化第二鉄、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００３９】
より好ましい表面改質剤としては、微細ナノスケール金、微細ナノスケール白金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細ナノスケール金、二酸化チタン、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、酸化第二鉄、及びこれらの組み合わせが含まれる（更に好ましくは、微細ナノスケール金、酸化第二鉄又は二酸化チタンと組み合わせた微細ナノスケール金、酸化第二鉄と組み合わせた二酸化チタン、二酸化チタン、酸化第二鉄、及びこれらの組み合わせが含まれる）。酸化第二鉄、二酸化チタン、及びこれらの組み合わせが最も好ましい。
【００４０】
表面改質珪藻土濃縮剤のうち少なくともいくつかは、未処理の珪藻土に比べて少なくともある程度、正であるゼータ電位を有し、この濃縮剤は、細菌などの微生物の濃縮について、未処理の珪藻土よりも驚くべきほど顕著に有効であり得、このような濃縮剤の表面は一般に負に帯電している傾向にある。好ましくは、濃縮剤はｐＨが約７で負のゼータ電位を有する（より好ましくは、ｐＨが約７でゼータ電位が約−５ミリボルト〜約−２０ミリボルトの範囲、更に好ましくは、ｐＨが約７でゼータ電位が約−８ミリボルト〜約−１９ミリボルトの範囲、最も好ましくは、ｐＨが約７でゼータ電位が約−１０ミリボルト〜約−１８ミリボルトの範囲である）。
【００４１】
微細ナノスケール金又は白金を含む、表面改質珪藻土濃縮剤は、物理蒸着（所望により、酸化雰囲気中での物理蒸着）によって珪藻土に金又は白金を堆積することにより調製することができる。本明細書で使用するとき、用語「微細ナノスケール金又は白金」は、サイズで５ナノメートル（ｎｍ）以下の寸法を有する金又は白金の物体（例えば、粒子又は原子クラスタ）を意味する。好ましくは、堆積した金又は白金の少なくとも一部は、最大約１０ｎｍ（１０ｎｍ以下）（より好ましくは、最大約５ｎｍ、更により好ましくは最大約３ｎｍ）の範囲の平均サイズの寸法（例えば、粒子の直径又は原子クラスタの直径）を有する。
【００４２】
最も好ましい実施形態において、金の少なくとも一部分は、超ナノスケールである（すなわち、０．５ｎｍ未満のサイズの少なくとも２つの寸法、１．５ｎｍ未満のサイズの全ての寸法を有する）。個別の金又は白金のナノ粒子のサイズは、当該技術分野において周知であるように、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析によって定量することができる。
【００４３】
珪藻土（又はキーゼルグール）は、海生微生物類である珪藻の残存物から生じた、天然のシリカ材料である。このように、これは天然資源から取得可能であり、市販もされている（例えば、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ，Ａ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から）。珪藻土粒子は、一般に、対称な立方体、円筒形、球形、プレート状、矩形の箱形などの形態の、小さな開放網状構造を含む。これらの粒子の孔構造は、一般に、非常に均一であり得る。
【００４４】
珪藻土は、原材料として、粉砕した材料として、又は精製及び所望により粉砕した粒子として使用することができる。好ましくは、珪藻土は、直径約１マイクロメートル〜約５０マイクロメートル（より好ましくは約３マイクロメートル〜約１０マイクロメートル）の範囲にある寸法の粉砕粒子形状である。
【００４５】
珪藻土は、場合によっては、使用前に加熱処理を行い、有機残留物の痕跡を除去することができる。加熱処理を使用する場合は、高温になるほど好ましくない結晶シリカが高比率に生じ得るため、加熱処理は５００℃以下で行うことが望ましい。
【００４６】
珪藻土上に供給される金又は白金の量は、広い範囲で変えることができる。金及び白金は高価であるため、望ましい濃縮活性を達成するのに妥当な必要とされる量を超えては使用しないことが望ましい。更に、ナノスケール金又は白金は、ＰＶＤを使用して堆積する際、非常に易動性であることがあるため、金又は白金を使用しすぎると、金又は白金の少なくとも一部が融合してより大きな塊になることにより、活性が低下することがある。
【００４７】
これらの理由から、珪藻土上の金又は白金の重量の装填量は、珪藻土と金との合計重量を基準として、好ましくは約０．００５（より好ましくは０．０５）〜約１０重量パーセント、より好ましくは約０．００５（更に好ましくは０．０５）〜約５重量パーセント、及び更に好ましくは約０．００５（最も好ましくは０．０５）〜約２．５重量パーセントである。
【００４８】
金及び白金をＰＶＤ法（例えばスパッタリング）により堆積して、支持体表面に濃縮活性を有する微細ナノスケール粒子又は原子クラスタを形成することができる。金属は、他の酸化状態が存在する場合もあるが、主に元素の形で堆積すると考えられる。
【００４９】
金及び／又は白金に加えて、同じ珪藻土支持体上に１つ以上の他の金属を供給することもでき、及び／又は、金及び／又は白金を含む支持体と別の支持体とを混合して供給することもできる。このような他の金属の例としては、銀、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム、銅、イリジウム及び同等物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。使用する場合には、これらの他の金属を、使用される金又は白金の供給源ターゲットと同一又は異なるターゲット供給源から支持体上に共堆積させることができる。あるいは、このような金属を、金及び／又は白金の堆積の前又は後のいずれかにおいて、支持体上に供給することができる。有利には、活性化のための熱処理を必要とする他の金属を、金及び／又は白金の堆積前に支持体に適用し、熱処理することもできる。
【００５０】
物理蒸着は、金属含有供給源又は金属含有ターゲットから支持媒体への金属の物理的な移動を指す。物理気相堆積は、さまざまな異なる方法で実施可能である。代表的な方法としては、スパッタ堆積法（好ましい方法）、蒸着法、及び陰極アーク堆積法が挙げられる。ＰＶＤ法の性状は得られる活性に影響を与え得るが、これら又は他のＰＶＤアプローチのいずれかを、本発明の方法の実施に使用する濃縮剤の作製で使用することができる。ＰＶＤは、この目的で現在使用されている装置又は今後開発される装置のいずれかのタイプを使用することにより行うことができる。
【００５１】
物理気相堆積法は、支持体表面の適切な処理が確実に行われるように、好ましくは、処理対象の支持体媒質が充分に混合された状態（例えば、混転、流動化、粉砕、又は同等の処理）で実施される。ＰＶＤによる堆積の粒子混転方法は、米国特許第４，６１８，５２５号（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら）に記述されており、この記述は参照により本明細書に組み込まれる。微細粒子又は微細粒子凝集塊（例えば、平均直径が約１０マイクロメートル未満）にＰＶＤを実施する際、支持体媒体は、好ましくは、ＰＶＤ工程の少なくとも一部の間に、混合及び微粉砕の両方が行われる（例えば、ある程度まで摩砕又はミル掛けされる）。
【００５２】
物理気相堆積法は、本質的には、非常に広い範囲にわたって、任意の所望の温度で実施可能である。しかしながら、金属を比較的低い温度（例えば、約１５０℃未満、好ましくは約５０℃未満、より好ましくは室温（例えば約２０℃〜約２７℃）以下））で堆積する場合、堆積した金属はより高い活性を有することができる（おそらくは、移動性と融合性がより損なわれる及び／又はより低いため）。外周条件下で運転すると、堆積時の加熱又は冷却が不要となり、有効かつ経済的であるため、一般的に好ましい可能性がある。
【００５３】
物理蒸着は、不活性スパッタリングガス雰囲気中（例えば、アルゴン、ヘリウム、キセノン、ラドン、又はこれら２つ以上の混合物（好ましくはアルゴン））で実施することができ、場合によっては、物理蒸着は酸化雰囲気中で実施可能である。好ましくは、酸化雰囲気は、少なくとも１つの酸素含有ガスを含む（より好ましくは、酸素含有ガスは、酸素、水、過酸化水素、オゾン、及びこれらの組み合わせから選択され、更により好ましくは、酸素含有ガスは、酸素、水、及びこれらの組み合わせから選択され、最も好ましくは酸素である）。酸化雰囲気は、アルゴン、ヘリウム、キセノン、ラドン、又はこれらの２つ以上の混合物（好ましくはアルゴン）などの不活性スパッタリングガスを更に含む。ＰＶＤ処理中の真空槽内の総気体圧力（全てのガス）は、約１ｍＴｏｒｒ（０．１３Ｐａ）〜約２５ｍＴｏｒｒ（３．３３Ｐａ）（好ましくは約５ｍＴｏｒｒ（０．６７Ｐａ）〜約１５ｍＴｏｒｒ（２．００Ｐａ））である。酸化雰囲気は、真空槽内の全てのガスの総重量を基準にして、約０．０５重量パーセント〜約６０重量パーセントの酸素含有ガス（好ましくは、約０．１重量パーセント〜約５０重量パーセント、より好ましくは約０．５重量パーセント〜約２５重量パーセント）を含み得る。
【００５４】
これにより結晶シリカの含有量が増加し得るが、珪藻土支持媒体は、場合によっては、金属堆積の前に焼成可能である。金及び白金は、ＰＶＤで堆積するとすぐに活性になるため、他の一部の方法による堆積とは違って、一般に金属堆積後に加熱処理の必要がない。ただし、このような加熱処理又は焼成は、活性を高めるために所望される場合には実行できる。
【００５５】
一般に、熱処理は、支持体を、任意の好適な大気中、例えば、空気、不活性雰囲気（窒素、二酸化炭素、アルゴンなど）、還元性雰囲気（水素など）、及び同等物の中で、約１２５℃〜約１０００℃の範囲の温度で、約１秒間〜約４０時間、好ましくは約１分間〜約６時間の加熱を伴い得る。使用される具体的な熱条件は、支持体の性質を含むさまざまな要素に依存し得る。
【００５６】
一般に、熱処理は、支持体の構成要素が分解するか、劣化するか、又は過度の熱により損傷する温度よりも下の温度で実施可能である。支持体の性状、金属の量などの要素に依存して、触媒活性は、系を高すぎる温度で熱処理すると、ある程度低下する可能性がある。
【００５７】
金属酸化物を含む、表面改質珪藻土濃縮剤は、加水分解可能な金属酸化物前駆体化合物の加水分解によって、珪藻土上に金属酸化物を堆積させることにより調製される。適切な金属酸化物前駆体化合物としては、加水分解して金属酸化物を生成できるような金属錯体及び金属塩が挙げられる。有用な金属錯体としては、アルコキシド配位子、配位子としての過酸化水素、カルボン酸機能配位子など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。有用な金属塩としては、金属の硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン化物、炭酸塩、シュウ酸塩、水酸化物など及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５８】
過酸化水素又はカルボン酸機能配位子の金属塩又は金属錯体を使用する場合、化学的手段又は熱的手段によって加水分解を引き起こすことができる。化学的に引き起こされる加水分解においては、金属塩は、溶液の形態で、珪藻土の分散液に導入することができ、得られる混合物のｐＨは、珪藻土上に金属の水酸化物錯体として金属塩が沈殿するまで、塩基溶液を加えることによって上げることができる。適切な塩基としては、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物及び炭酸塩、アンモニウム及びアルキルアンモニウムの水酸化物又は炭酸塩など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。金属塩溶液及び塩基溶液は、通常、約０．１〜約２Ｍの濃度であり得る。
【００５９】
好ましくは、珪藻土への金属塩の添加は、珪藻土分散液を撹拌（好ましくは激しく撹拌）しながら実施される。金属塩溶液及び塩基溶液は、珪藻土分散液に別々に（いずれの順番でも）又は同時に導入可能であって、得られる珪藻土の表面に金属水酸化物錯体を生じる実質的に好ましく均一な反応をもたらす。反応混合物は、場合によっては、反応中に加熱して、反応の速度を加速することができる。一般に、添加される塩基の量は、金属のモル数に、金属塩又は金属錯体の非オキソ及び非ヒドロキソ対イオン数を掛けたものに等しくなり得る。
【００６０】
あるいは、チタン又は鉄の塩を使用する場合、金属塩を加熱して加水分解を起こさせて、金属水酸化物錯体を形成し、珪藻土の表面と反応させることができる。この場合、金属塩溶液を一般に、珪藻土の分散液（好ましくは撹拌した分散液）に加え、十分に高温（例えば約５０℃を上回る温度）に加熱して、金属塩の加水分解を促進することができる。好ましくは、温度は約７５℃〜１００℃であり、ただし反応がオートクレーブ装置内で実施される場合はより高い温度を使用することができる。
【００６１】
金属アルコキシド錯体を使用する場合、金属錯体に加水分解を起こさせ、アルコール溶液中で金属アルコキシドの部分的加水分解により金属の水酸化物錯体を形成させることができる。珪藻土の存在における金属アルコキシド溶液の加水分解により、珪藻土の表面に金属水酸化物種を堆積させることができる。
【００６２】
あるいは、珪藻土の存在において気相の金属アルコキシドと水とを反応させることによって、金属アルコキシドを加水分解して、珪藻土の表面に堆積させることができる。この場合、珪藻土を、例えば流動床反応器又は回転ドラム反応器などのいずれかの中で堆積中に撹拌することができる。
【００６３】
珪藻土の存在における金属酸化物前駆体化合物の上記の加水分解の後、得られる表面処理された珪藻土を、沈降又は濾過、又はその他の既知の方法によって分離することができる。分離した生成物を水で洗浄することによって精製し、これを乾燥させることができる（例えば５０℃〜１５０℃）。
【００６４】
表面処理された珪藻土は通常、乾燥後に機能できるが、所望により、空気中で約２５０℃〜６５０℃に加熱して焼成することにより、機能の損失なしに揮発性の副生成物を除去することができる。この焼成工程は、金属酸化物前駆体化合物として金属アルコキシドを利用した場合に望ましいことがある。
【００６５】
一般に、鉄の金属酸化物前駆体化合物を用い、得られる表面処理には、ナノ粒子の酸化鉄が含まれる。珪藻土に対する酸化鉄の重量比が約０．０８である場合には、Ｘ線回折（ＸＲＤ）では、酸化鉄材質の存在がはっきりと示されない。むしろ、３．８０、３．６８、及び２．９４Åで更なるＸ線反射が観察される。この材料のＴＥＭ評価は、球形ナノ粒子状酸化鉄材料により比較的不均一にコーティングされている珪藻土表面を示す。酸化鉄材料の結晶子の大きさは約２０ｎｍ未満であり、結晶の大部分は直径が１０ｎｍ未満である。珪藻土表面上のこれらの球形結晶の充填は、外観的に密であり、珪藻土の表面がこれら結晶の存在により粗化されているのが見られる。
【００６６】
一般に、チタンの金属酸化物前駆体化合物と共に、得られる表面処理は、ナノ粒子チタニアを含む。珪藻土に二酸化チタンを堆積させた場合、約３５０℃で焼成した後に得られた生成物のＸＲＤでは、アナターゼチタニアの小さな結晶の存在を示すことができる。チタン／珪藻土の比が比較的低い場合、又はチタン及び鉄の酸化物前駆体の混合物を使用する場合、Ｘ線分析によっては、一般に、アナターゼの証拠は観察されない。
【００６７】
チタニアは強力な光酸化触媒として知られており、本発明のチタニア改質珪藻土濃縮剤は、分析用の微生物濃縮に使用することができ、更に所望により、光活性化可能剤として使用することにより、残留する微生物を殺菌し、不要な有機不純物を除去することができる。このように、チタニア改質された珪藻土は、分析のための生体材料を単離することと、次いで再使用のために光化学的にクリーニングすることの両方ができる。これらの材料は、微生物の除去と共に抗菌効果が望ましい場合、濾過用途で使用することもできる。
【００６８】
吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製
吸着緩衝液改質無機濃縮剤は、（ａ）上述の無機濃縮剤の少なくとも１つを少なくとも１つのカチオン含有塩溶液（好ましくは、水性）と接触させて、無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（ｂ）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を乾燥させることと、を含むプロセスを含む方法によって調製することができる。カチオン含有塩溶液として使用するために好適な吸着緩衝溶液には、少なくとも１つの一価又は多価カチオン（好ましくは少なくとも１つの多価カチオン、より好ましくは少なくとも１つの二価カチオン、最も好ましくは二価カルシウムカチオン、二価マグネシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの二価カチオン）を含むものが含まれる。カチオンは、好ましくは金属カチオンであるが、他のカチオン（例えば、アンモニウム）もまた有用であり得る。
【００６９】
例えば、有用な吸着緩衝液は、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２）、塩化ランタン（ＬａＣｌ３）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）等、及びこれらの組み合わせ等の塩を含むことができる。吸着緩衝溶液は、１つ以上の塩を、塩を溶解するために十分に極性のある１つ以上の溶媒と混合することによって調製されてもよい。好ましくは、溶媒は水である。溶媒中の塩の溶解は、必要に応じて、加熱によって、及び／又は攪拌若しくはかき混ぜによって、促進することができる。溶解後、結果として得られた溶液は、（好ましくはフィルタ滅菌によって、より好ましくは約０．２２マイクロメートルの孔径を有する標準的な微生物学的フィルタを使用したフィルタ滅菌によって）滅菌されてもよい。
【００７０】
（溶媒中の）塩の濃度は、塩及び溶媒の性質によって、並びに無機濃縮剤の捕捉強化の望ましいレベルによって、１リットル当たり約１０ミリモル（ｍＭ／Ｌ）まで（好ましくは、約０．１ｍＭ／Ｌ〜約５ｍＭ／Ｌ）が典型的である濃度で、広い範囲にわたって変化し得る。塩溶液のｐＨは、約６．０〜約７．５の範囲に及び得るが、約６．５〜約７．５（より好ましくは約６．８〜約７．３、より好ましくは、約７．２）の比較的中性のｐＨ値が好ましい。
【００７１】
好ましい吸着緩衝液は、マグネシウムカチオン（Ｍｇ＋＋）、カルシウムカチオン（Ｃａ＋＋）、ナトリウムカチオン（Ｎａ＋）、カリウムカチオン（Ｋ＋）、第一鉄カチオン（Ｆｅ＋＋）、ランタンカチオン（Ｌａ＋＋＋）、アルミニウムカチオン（Ａｌ＋＋＋）、及びこれらの組み合わせ（より好ましくは、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのカチオン、更により好ましくはマグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、カリウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのカチオン、最も好ましくは、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのカチオン）から選択される少なくとも１つのカチオンを含む。本発明のプロセスに使用するために特に好ましい吸着緩衝溶液は、水１リットル当たり５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含み、７．２のｐＨを有する。
【００７２】
上で参照された、無機濃縮剤を吸着緩衝液と接触させる工程は、以下で濃縮剤と試料を接触させることに関する節に記載されるものを含む、２つの物質の間に接触をもたらす任意のさまざまな既知又は今後開発される方法によって実行され得る。接触の際に使用される吸着緩衝液の量は、無機濃縮剤の性質及び量、並びに捕捉強化の望ましい度合いによって、広く変化し得る。吸着緩衝溶液の量は、概して、無機濃縮剤の少なくとも一部分（例えば、露出面の少なくとも一部分）を湿らせるために十分であり得る。好ましくは、無機濃縮剤の実質的に全ての露出面が湿っている（例えば、最大捕捉強化が望ましい場合）。
【００７３】
無機濃縮剤を吸着緩衝液と接触させることは、好ましくは、その薬剤を緩衝溶液で少なくとも一度（好ましくは少なくとも二度、より好ましくは少なくとも三度）洗浄することによって実行される。例えば、無機濃縮剤のこのような洗浄は、無機濃縮剤の実質的に全ての露出面を湿らすために効果的であり得、薬剤を好ましい容器（例えば、試験管）内の緩衝溶液に薬剤を浸漬することによって実行され得る。薬剤は、望まれる場合は、緩衝液に接触する前に不純物を除去するために、事前洗浄されてもよい（例えば、水で洗い流すことによって）。
【００７４】
例えば、多量の緩衝液の中に少なくとも１回、粒子無機濃縮剤を通過させることによって（例えば、約１０分間にわたって重力沈殿に依存することによって）、洗浄を効果的にすることができる。緩衝液との接触は、混合によって（例えば、撹拌、振盪、又は揺動プラットフォームによって）強化することができ、これにより無機濃縮剤の粒子が緩衝液の大部分を通って繰り返し通過又は沈殿することができる。混合は、渦動（１分又は２分間最高速度で）等の急速なものであってもよく、あるいは、粒子無機濃縮剤と緩衝液の混合を「上下転倒」させるプロセスで穏やかに混転して（例えば、試験管又は他のタイプの反応容器を支えるよう構成された装置を用い、その試験管又は容器を「上下転倒」させるプロセスでゆっくりと回転させて）達成することができる。所望により、無機濃縮剤は、望むだけの時間（例えば、混合後約５分の間）緩衝液内に浸ることが可能であってもよい。
【００７５】
したがって、無機濃縮剤の洗浄を実行することにおいて、混合（例えば、攪拌、揺動、又はかき混ぜ）及び／又は浸すことは、任意的であるが、濃縮剤との緩衝液接触を増加させるためには好ましい。１つ以上の添加剤（例えば、界面活性剤又は湿潤剤、分散剤等）は、望まれる場合、（例えば、薬剤の分散及び／又は湿潤を助けるために）無機濃縮剤と緩衝液との混合に含まれてもよい。
【００７６】
接触又は洗浄工程の後、無機濃縮剤は、好ましくは凝離され（例えば、重力沈殿又は遠心分離あるいは濾過によって、好ましくは遠心分離によって）、及び／又は緩衝液から分離され（例えば、結果として得られる上澄みを注ぎ出す又は吸い上げることによる除去又は分離によって、プロセスを実施するのに使用した容器又は管の底に、無機濃縮剤を残すことができる）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤は、次いで周辺温度（例えば、約２３℃）又は高温（例えば、オーブンを使用して）のどちらかで乾燥させることができる。好ましくは、乾燥は約２５℃より高い温度（より好ましくは少なくとも約５０℃、更により好ましくは少なくとも約７０℃、最も好ましくは少なくとも約８０℃）で実行される。乾燥時間の期間は、例えば、利用される乾燥温度及び少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤の量（例えば、約１グラムの少なくとも部分的に湿った薬剤は室温で約４８時間以上で乾燥することができ、約５グラムの少なくとも部分的に湿った薬剤は約８０℃で約５又は６時間で乾燥することができる）によって、広く変化し得る。
【００７７】
試料
本発明の濃縮方法は、医療、環境、食品、飼料、臨床、及び検査室試料、及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、さまざまなタイプの試料に適用することができる。医療又は獣医試料としては、例えば、臨床診断のために検査される生物源（例えばヒト又は動物）から得た細胞、組織、又は流体を挙げることができる。環境試料は、例えば、医療機関又は獣医機関、産業用設備、土壌、水源、食品調理領域（食品接触及び非接触領域）、検査室、又はバイオテロリズムの対象になり得る領域から得たものであり得る。食品の加工、取扱い、及び調理領域の試料は、細菌病原菌による食品供給汚染に関する懸念が特にしばしばあるためより好適である。
【００７８】
液体の形態で得られる試料、又は液体中の固体の分散液又は懸濁液の形態で得られる試料は、直接使用することができ、あるいは濃縮して（例えば遠心分離により）又は希釈して（例えば緩衝（ｐＨ調整された）溶液の追加により）使用することができる。固体又は半固体の試料は、直接使用するか、あるいは例えば、所望であれば、流動体媒質（例えば緩衝液）で洗浄若しくはすすぎ、又は流動体媒質中に懸濁若しくは分散させることにより抽出することができ得る。試料は表面から（例えばスワブによる拭き取り又はすすぎにより）採取することができる。好ましくは、試料は流体の形態で使用される（例えば、液体、気体、又は液体中若しくは気体中の固体若しくは液体の分散物若しくは懸濁物）。
【００７９】
本発明の方法を実施する際に使用できる試料の例としては、食品（例えば、生鮮農産物又はそのまま食べる昼食若しくは「調理された」食肉）、飲料（例えばジュース又は炭酸飲料）、水（飲料水を含む）、並びに生物学的流動体（例えば全血、又は血漿、血小板の豊富な血液分画、血小板濃縮物、圧縮した赤血球などの血液構成成分、細胞調製物（例えば細胞分散液、骨髄吸引物、又は脊椎骨髄）、細胞懸濁液、尿、唾液、及びその他の体液、骨髄、肺水、脳液、外傷滲出物、外傷生検試料、眼内液、脊髄液など）が挙げられ、また溶解緩衝液の使用などの手順を使用して形成することができる細胞可溶化物などの溶解調製物が含まれる。好ましい試料としては、食品、飲料、水、生体液、及びこれらの組み合わせ（食品、飲料、水、及びこれらの組み合わせがより好ましく、水が更により好ましく、水が最も好ましい）が含まれる。
【００８０】
試料の容積は、特定の用途に応じて異なり得る。例えば、本発明のプロセスが診断又は研究用途に仕様される場合、試料の量は通常、マイクロリットルの範囲であり得る（例えば１０μＬ以上）。方法が食品病原体試験検査又は飲料水安全性試験のために使用される場合、試料の量は通常、ミリリットル〜リットルの範囲であり得る（例えば１００ミリリットル〜３リットル）。例えばバイオ処理又は製剤処方などの産業用途においては、この量は何万リットルであることがある。
【００８１】
本発明の方法は、濃縮状態の試料から微生物を分離し、更に、使用される検出手順を阻害し得る試料マトリックス構成成分から微生物を分離することができる。これらすべての場合において、本発明の方法は、他の微生物濃縮方法に追加して、又はその代わりに、使用することができる。よって、所望により、追加の濃縮が望ましい場合には、本発明の方法実施の前又は後に試料からの培養を行うことができる。
【００８２】
接触
本発明の方法は、２つの物質の間に接触をもたらす、さまざまな既知の方法又は今後開発される方法のいずれによっても実施可能である。例えば、吸着緩衝液改質（又は処理）濃縮剤は、試料に添加されてもよく、又は試料が濃縮剤に添加されてもよい。濃縮剤でコーティングしたディップスティックを試料溶液に浸すことができ、濃縮剤を含有するフィルムの上に試料溶液を注ぐことができ、濃縮剤を含む試験管又はウェルに試料溶液を注ぐことができ、又は、濃縮剤でコーティングされたフィルタ（例えば、織布のフィルタ）に試料溶液を通すことができる。
【００８３】
しかしながら好ましくは、濃縮剤及び試料は、様々な任意の容器内に合わせて入れられる（任意の追加順序を用いて）（所望により、しかしながら好ましくは、キャップ付き、閉鎖、又は密閉された容器であり、より好ましくは、キャップ付きの試験管、瓶、又は広口瓶である）。本発明の方法を実施する際の使用に好適な容器は、特定の試料によって決められ、量及び性質により大きく異なり得る。例えば、容器は１０マイクロリットル容器（例えば試験管）などの小さいものであり得、又は１００ミリリットルから３リットル容器（例えば三角フラスコ又はポリプロピレン製広口瓶）などの大きいものであり得る。容器、濃縮剤、及び試料に直接接触するその他の器具又は添加剤は、使用前に滅菌することができ（例えば、制御された熱、エチレンオキシドガス、又は放射線によって）、これにより検出エラーを起こし得る試料の汚染を低減又は防ぐことができる。特定の試料の微生物を捕捉又は濃縮するための、検出を成功させるのに十分な濃縮剤の量は、場合によって異なり（例えば、濃縮剤の性質及び形態並びに試料の量に依存する）、当業者によって容易に決定できる。例えば、一部の用途については、試料ミリリットル当たり、１０ミリグラムの濃縮剤が有用であり得る。
【００８４】
望ましい場合は、試料の中に少なくとも１回、粒子濃縮剤を通過させることによって（例えば、約１０分間にわたって重力沈殿に依存することによって）、接触を効果的にすることができる。接触は、混合によって（例えば撹拌、振盪、又は揺動プラットフォームによって）強化することができ、これにより濃縮剤の粒子が試料の大部分を通って繰り返し通過又は沈殿することができる。マイクロリットルの桁の少量（典型的には０．５マイクロリットル未満）の場合、混合は、例えば米国特許第５，２３８，８１２号（Ｃｏｕｌｔｅｒら）（この記述は参考として本明細書に組み込まれる）に記述されているように、渦動又は「転動（nutation）」などの急速なものであり得る。０．５ミリリットル以上の桁の、より大量（典型的には０．５ミリリットル〜３リットル）の場合、混合は、例えば米国特許第５，５７６，１８５号（Ｃｏｕｌｔｅｒら）（この記述は参考として本明細書に組み込まれる）に記述されているように、粒子状濃縮剤及び試料を「上下転倒」させるプロセスで穏やかに混転することにより達成できる。このような混転は、例えば、試験管又は他のタイプの反応容器を支えるよう構成された装置を用い、その試験管又は容器を「上下転倒」させるプロセスでゆっくりと回転させて達成することができる。接触は、望むだけの時間、実施することができる（例えば、試料量が約１００ミリリットル以下の場合、最高約６０分間の接触が有用であり得、好ましくは、約１５秒〜約１０分又はそれ以上、より好ましくは、約１５秒〜約５分の接触が有用であり得る）。
【００８５】
よって、本発明のプロセスの実施において、混合（例えば攪拌、揺動、又はかき混ぜ）及び／又は培養（例えば周囲温度で）は随意ではあるが、濃縮剤との接触で微生物を増加させるために好ましい。好ましい接触方法には、生物含有試料（好ましくは流動体）を粒子濃縮剤と混合すること（例えば、約１５秒〜約５分）と、培養すること（例えば、約３分〜約６０分）との両方が含まれる。必要に応じて、１つ以上の添加剤（例えば、溶解試薬、生物発光検定試薬、核酸捕捉試薬（例えば磁性ビーズ）、微生物用培地、緩衝液（例えば、固形試料の湿潤のため）、微生物染色試薬、洗浄用緩衝液（例えば、結合していない物質を洗い流すため）、溶出試薬（例えば血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００非イオン系界面活性剤（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手可能）、機械的磨耗／溶出試薬（例えばガラスビーズ）、吸着緩衝液（例えば吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製にしようされものと同一の緩衝液、又は異なる緩衝液）、及び同様物）が、濃縮剤及び試料の組み合わせに含まれ得る。好ましくは、試料の接触工程は、濃縮剤と試料の組み合わせにおける添加剤としての吸着緩衝液の包含なしに実行される。
【００８６】
望ましい場合は、濃縮剤（単独で、又は例えば抗菌剤と組み合わせて、及び／又は液体形態（例えば水又は油）、固体形態（例えば布、ポリマー、紙、又は無機固体）、ゲル形態、クリーム形態、フォーム形態、又はペースト形態の担体物質と組み合わせて）は、非多孔質又は多孔質、固体、微生物に汚染されているか又は微生物に汚染可能な材質又は表面に対して、塗布又はすりつけることができる（例えば「クリーニング」剤として使用する）。結合剤、安定剤、界面活性剤、又はその他の特性変性剤も望ましい場合は利用することができる。
【００８７】
このような使用のために、濃縮剤は織布又は不織布に塗布することができ、更に紙、ティッシュペーパー、綿棒などの使い捨て可能な表面、及び様々な吸収性及び非吸収性材質に塗布することができる。例えば、濃縮剤は布又は紙の担体物質に組み込み、「クリーニング」ワイプとして使用することができる。濃縮剤は、例えば住居、保育所、工場、病院などにおいて、玩具、装置、医療機器、作業台表面などを洗浄するために、固体表面に（例えば、担体物質を含むワイプ又はペーストので）適用することができる。洗浄又はその他の目的に使用する場合、試料は同時に採取することができ、望ましい場合は単一の工程で濃縮剤に接触し得る。
【００８８】
凝離及び／又は分離
所望により、しかしながら好ましくは、本発明のプロセスは、得られた微生物結合の濃縮剤の凝離を更に含む。好ましくはこのような凝離は、少なくとも部分的に、重力沈殿（重力沈降；例えば、約５分間〜約３０分間にわたって）に依存することによって達成することができる。しかしながらいくつかの場合において、凝離を促進すること（例えば遠心分子又は濾過によって）又は任意の凝離方法の組み合わせを使用することが望ましいことがある。
【００８９】
本発明のプロセスは、所望により、得られた微生物結合の濃縮剤と試料の分離を更に含む。液体試料の場合は、凝離の結果生じた上澄みの除去又は分離が伴い得る。上澄みの分離は、当該技術分野において周知の数多くの方法によって実施することができる（例えば、上澄みを注ぎ出し又は吸い上げることによって、プロセスを実施するのに使用した容器又は管の底に、微生物結合の濃縮剤を残すことができる）。所望により、結合した微生物は、必要に応じて、（例えば、ウシ血清アルブミン溶液又は肉抽出物溶液を使用することによって化学的に、あるいは緩やかな音波処理によって物理的に）濃縮剤から溶出又は分離され得る。
【００９０】
本発明の方法は、手動により（例えばバッチ単位による方法で）実施することができ、又は（例えば、連続的又は準連続的処理を実現して）自動化することができる。
【００９１】
検出
本発明のプロセスを用いて、さまざまな微生物を濃縮すること、及び、所望により、しかしながら好ましくは、検出することができ、これには、例えば、細菌、真菌類、酵母、原生動物、ウイルス（非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む）、細菌内生胞子（例えばバチルス（炭疽菌、セレウス菌、及び枯草菌を含む）及びクロストリジウム（ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、及びウェルシュ菌））、並びに同様物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる（好ましくは、細菌、酵母、真菌類、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、更に好ましくは、細菌、酵母、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、更により好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、非エンベロープ型ウイルス（例えば、ノロウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、及びこれらの組み合わせ）、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、最も好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌及びこれらの組み合わせである。この方法は、病原体の検出における有用性を有し、これは食品安全性又は医療、環境、若しくはテロ対策の理由から非常に重要であり得る。この方法は、病原菌（例えばグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方）、並びにさまざまな酵母、カビ、及びマイコプラズマ（及びこれらの任意の組み合わせ）の検出に特に有用であり得る。
【００９２】
検出される標的微生物の属には、リステリア属、大腸菌属、サルモネラ属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、ヘリコバクター属、マイコバクテリウム属、シゲラ属、ブドウ球菌属、腸球菌属、バチルス属、ナイセリア属、シゲラ属、連鎖球菌属、ビブリオ属、エルシニア属、ボルデテラ属、ボレリア属、シュードモナス属、サッカロミケス属、カンジダ属、及び同様物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。試料には複数の微生物株が含まれることがあり、任意の株を、他の株と独立に検出することができる。検出の標的となり得る具体的な微生物には、大腸菌、腸炎エルシニア菌、エルシニア仮性結核菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・バルニフィカス菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌、サッカロマイセス・セレヴィシエ、カンジダ・アルビカンス、ブドウ球菌エンテロトキシン亜種、セレウス菌、炭疽菌、バチルス・アトロファエウス、枯草菌、ウェルシュ菌、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、エンテロバクター・サカザキ、緑膿菌など、並びにこれらの組み合わせ（好ましくは、黄色ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス（リステリア・イノキュアがサロゲートである）、大腸菌、緑膿菌、及びこれらの組み合わせ）が含まれる。
【００９３】
濃縮剤によって捕捉又は結合した（例えば吸着によって）微生物は、現在知られている、又は今後開発される任意の望ましい方法によって本質的に検出することができる。このような方法には、例えば、培養による方法（時間が許す場合は好ましいことがある）、顕微鏡（例えば透過光型顕微鏡又はエピ蛍光顕微鏡（蛍光染料で標識した微生物を可視化するのに使用できる））、及びその他の画像手法、免疫学的検出方法、及び遺伝子学的検出方法が挙げられる。微生物群捕捉後の検出プロセスには、洗浄して試料マトリックス成分を除去すること、又は染色することなどを含み得る。
【００９４】
免疫学的検出は、標的生物に由来する抗原物質の検出であり、これは一般的に、細菌又はウイルス粒子の表面にあるマーカーとして作用する生物学的分子（例えばタンパク質又はプロテオグリカン）である。抗原物質の検出は、通常、抗体によるものであることができる。抗体は、例えばファージディスプレイなどの方法によって選択されたポリペプチド、又はスクリーニング方法から得られたアプタマーである。
【００９５】
免疫学的検出方法は周知であり、例えば免疫沈降及び酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。抗体結合は、さまざまな方法で検出することができる（例えば、一次抗体又は二次抗体のいずれかを、蛍光染料により、量子ドットで、又は化学発光若しくは着色基質を生成できる酵素により標識し、プレートリーダー又はラテラルフロー装置のいずれかを用いる）。
【００９６】
検出はまた、遺伝子学的検定法（例えば核酸のハイブリダイゼーション又はプライマーを用いた増幅）によって実行することができ、これがしばしば好ましい方法である。捕捉又は結合された微生物は溶解され、検定に利用できる遺伝子学的物質を供給する。溶解方法は周知であり、これには例えば、音波処理、浸透性ショック、高温処理（例えば約５０℃〜約１００℃）、及びリゾチーム、グルコラーゼ、チモラーゼ（zymolose）、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、及びウイルスエンドリシン（enolysins）などの酵素と共にインキュベーションすることが挙げられる。
【００９７】
一般的に使用されている遺伝子学的検出検定法の多くは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、具体的な微生物の核酸を検出する。遺伝子学的検出方法に使用される条件の厳密性は、検出される核酸配列の変異レベルに相関する。塩濃度及び温度の条件が非常に厳しいと、標的の正確な核酸配列の検出が制限され得る。このように、標的核酸配列に小さな変異を有する微生物株は、非常に厳しい遺伝子学的検定法を使用して区別することができる。遺伝子学的検出は、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて行われ、ここにおいて一本鎖核酸プローブが微生物の変性核酸にハイブリッド化して、プローブ鎖を含む二本鎖核酸が生成される。当業者は、ゲル電気泳動、細管式電気泳動、又はその他の分離方法の後でハイブリッドを検出するための、放射性、蛍光、及び化学発光標識などのプローブ標識について熟知するであろう。
【００９８】
特に有用な遺伝子学的検出方法は、プライマーを用いた増幅に基づくものである。プライマーを用いた核酸増幅方法には、例えば、熱サイクル方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））、並びに等温方法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（及びこれらの組み合わせ、好ましくはＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。増幅された生成物を検出する方法は、例えばゲル電気泳動分離及び臭化エチジウム染色、並びに生成物中に組み込んだ蛍光標識又は放射性標識の検出が含まれ、これらに限定されない。増幅生成物の検出前に分離工程を必要としない方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ又はホモジニアス検出法）も使用することができる。
【００９９】
生物発光検出法は周知であり、例えば、記述が参考として本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２２，８６８号（Ｆａｎら）に記述されているものを含むアデノシン（adensosine）三リン酸（ＡＴＰ）検出方法が挙げられる。他の発光に基づく検出方法も使用することができる。
【０１００】
本発明の方法は株特異性ではないため、同じ試料内で、複数の微生物株を検定のための標的にすることができる、一般的な捕捉システムを提供する。例えば、食品試料の汚染について検定を行う場合、同じ試料内でリステリア・モノサイトゲネス、大腸菌、及びサルモネラの全部について試験を行うことが望ましいことがあり得る。捕捉工程を１回行い、次に例えば、これら微生物株それぞれの、異なる核酸配列を増幅するための固有プライマーを使用して、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ検定を行うことができる。したがって、それぞれの株について別々の試料取扱い及び作製手順を行う必要性を回避することができる。
【０１０１】
診断キット
本発明のプロセスを実施する際に使用するための診断キットは、（ａ）上述の吸着緩衝液改質無機濃縮剤（好ましくは粒子）、（ｂ）試験容器（好ましくは滅菌試験容器）、及び（ｃ）本発明のプロセス実施における濃縮剤使用のための説明書を含む。好ましくは、この診断キットは更に、微生物培養媒体又は培地、溶解試薬、緩衝液、生物発光検出検定構成要素（例えば照度計、溶解試薬、ルシフェラーゼ酵素、酵素基質、反応緩衝液、その他同様物）、遺伝子学的検出検定構成要素、及びこれらの組み合わせから選択された１つ以上の構成要素を含む。好ましい溶解試薬は、緩衝液中に供給された溶解酵素であり、好ましい遺伝子学的検出検定構成要素には、標的微生物に固有の１つ以上のプライマーが含まれる。
【０１０２】
例えば、本発明の診断キットの好ましい実施形態には、粒子吸着緩衝液改質無機濃縮剤（例えば、ガラス製又はポリプロピレン製バイアルなどの滅菌使い捨て可能な容器入り）に、本発明のプロセスの実施における前記薬剤使用のための説明書（例えば、濃縮剤と、分析する流動体試薬とを混合し、この濃縮剤を重力によって沈殿させ、得られた上澄みを除去し、濃縮剤に結合した少なくとも１種類の標的微生物株の存在を検出すること）を組み合わせたものが含まれる。濃縮剤は、所望により、汚染を防ぐために、破って開けるタイプの密閉パウチに収容／アリコート化されてもよい。濃縮剤は、粉末状であってもよい。好ましくは、診断キットは、（より好ましくは、１つ以上の破って開けるタイプの密閉パウチに収容された）粒子吸着緩衝液改質無機濃縮剤の予め計量されたアリコート（例えば、試料量に基づく）を含む。
【実施例】
【０１０３】
本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に、本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。以下の実施例内の全ての部分、割合、比率などは、特に記載がない限り、重量によるものとする。微生物培養物をＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。用いた溶媒及びその他の試薬は、特に記載がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手した。
【０１０４】
表面改質珪藻土粒子状濃縮剤の調製
Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ａ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から、白色粉末のキーゼルグール（珪藻土）（３２５メッシュ；粒径が全て４４マイクロメートル未満）を購入した。この材料はＸ線回折（ＸＲＤ）によって、α−クリストバライト及び石英と共に非晶質シリカを含むことが示された。
【０１０５】
２つの異なる表面改質剤（すなわち二酸化チタン及び酸化第二鉄）を含む粒子状濃縮剤を、下記の方法により珪藻土を表面処理することにより調製した。
【０１０６】
二酸化チタンの堆積
２０．０ｇのＴｉＯ（ＳＯ４）・２Ｈ２Ｏ（Ｎｏａｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ））を８０．０ｇの脱イオン水に撹拌しながら溶解させることにより、２０重量パーセントのオキシ硫酸チタン（ＩＶ）二水和物溶液を作製した。５０．０ｇのこの溶液を脱イオン水１７５ｍＬと混合し、二酸化チタン前駆体化合物溶液を形成した。５０．０ｇの珪藻土を大きなビーカー中で急速に撹拌しながら５００ｍＬの脱イオン水に分散させることにより、珪藻土の分散液を作製した。この珪藻土分散液を約８０℃に加熱した後、急速に撹拌しながら約１時間かけて二酸化チタン前駆体化合物溶液を滴下して加えた。添加後、ビーカーを時計皿で覆い、内容物を加熱して２０分間沸騰させた。水酸化アンモニウム溶液をビーカーに加え、内容物のｐＨを約９にした。洗浄水のｐＨが中性になるまで沈降／デカンテーションにより、得られた生成物を洗浄した。生成物を濾過によって分離し、１００℃で一晩乾燥させた。
【０１０７】
乾燥生成物の一部を磁器るつぼに入れ、加熱速度毎分約３℃で室温から３５０℃まで加熱することによって焼成し、３５０℃で１時間保持した。
【０１０８】
酸化鉄の堆積
１７５ｍＬの脱イオン水に溶解した２０．０ｇのＦｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．））を硫酸チタニル溶液に置き換えたことを除いて、本質的に上記の二酸化チタン堆積法を用いて、酸化鉄を珪藻土の上に堆積させた。更なる試験のため、得られた酸化鉄改変珪藻土の一部を同様に３５０℃で焼成した。
【０１０９】
材料
１８メガオーム水：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）グラジエント脱イオンシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販）を用いて１８メガオームの滅菌脱イオン水を得た。
３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（乾燥、再水和可能培地を備える平板状フィルム型培養デバイス）は３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から得た。
３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群計測プレート（少なくとも１つの発酵性栄養素を含む平板状フィルム型培養デバイス）は３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から得た。
吸着緩衝液：１８メガオームの水１リットルに、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を（磁気撹拌で）混合し、次いで０．２２マイクロメートルのナイロン製フィルタ膜を持つＶＷＲ（商標）真空濾過システム（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から得た）を通過させることによりその溶液をフィルタ滅菌することによって作製したｐＨ ７．２を有するカチオン含有塩溶液。
１００倍吸着緩衝液：（１）１００ｍＬの１８メガオーム水に、５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むフィルタ滅菌（本質的に上述のように）した溶液と、（２）１００ｍＬの１８メガオーム水に、１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含むフィルタ滅菌（本質的に上述のように）した溶液とを等量で混合することによって作製したｐＨ ７．２を有するカチオン含有塩溶液（全ての溶液は磁気撹拌で調製した）。
３０〜５０マイクロメートルの範囲の寸法を有するアミン官能化（アミン官能オルガノシランを用いた反応からの有機コーティング）ガラスビーズは、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から入手した。
ＣＭ−１１１：非晶質の長球化ケイ酸マグネシウム（固形球形として成型済みの微小球、粒子密度２．３ｇ／立方センチメートル、表面積３．３ｍ２／ｇ、粒径：９０パーセントが約１１マイクロメートル未満、５０パーセントが約５マイクロメートル未満、１０パーセントが約２マイクロメートル未満、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から販売の３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ＣＭ−１１１）として入手した。
Ｆｅ−ＤＥ：本質的に上記のように、珪藻土上に酸化第二鉄を堆積させた。
Ｔｉ−ＤＥ：本質的に上記のように、珪藻土上に二酸化チタンを堆積させた。
Ｗ−２１０：アルカリアルミノケイ酸塩セラミック（固形球形として成型済みの微小球、粒子密度２．４ｇ／立方センチメートル、表面積５ｍ２／立法センチメートル、粒径：９５パーセントが約１２マイクロメートル未満、９０パーセントが約９マイクロメートル未満、５０パーセントが約３マイクロメートル未満、１０パーセントが約１マイクロメートル未満、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から販売の３Ｍ（商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ Ｗ−２１０）として入手した。
【０１１０】
実施例１〜４及び比較例Ｃ−１〜Ｃ−６
吸着緩衝液改質無機濃縮剤の調製
ＣＭ−１１１粉末の５グラムのアリコートを２つの部分に分割し、その部分を２つの５０ｍＬのポリプロピレン製遠心管に設置し、ＶＷＲアナログボルテックスミキサー（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））上で１分間に１４，０００回転（ｒｐｍ；最高速度）で１０秒間渦動することによって、５０ｍＬの１８メガオーム滅菌水に懸濁／分散した。結果として得られた懸濁液を、次いで３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））、ペレット状のＣＭ−１１１を得た。各ペレットを、次いで５０ｍＬの１８メガオーム水に再懸濁し、本質的に上述のように処理することによって、再度洗浄した。ＣＭ−１１１を事前洗浄するこの工程を、５０ｍＬの１８メガオーム水での合計三度の洗浄にわたり、再度実行した。次に、結果として得られた事前洗浄したＣＭ−１１１ペレットを、本質的に上述のように渦動することによって５０ｍＬ量の吸着緩衝液に分散し、次いで、本質的に上述のように遠心分離し、ペレット状のＣＭ−１１１を得た。ＣＭ−１１１を５０ｍＬの吸着緩衝液で洗浄するこの工程を、三度行った。最終洗浄後、結果として得られた上澄みを処分し、結果として得られた少なくとも部分的に湿ったペレットを、滅菌ガラスのペトリ皿（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に設置した。少なくとも部分的に湿ったペレットを、（ＳｃｉＧｅｎｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手可能なＲｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｏｄｅｌ ４００ハイブリダイゼーションインキュベーターを使用して）８０℃で５〜６時間にわたり乾燥させた（実施例１）。結果として得られた乾燥粉末（吸着緩衝液改質無機濃縮剤）を室温（約２３℃）で保管した。
【０１１１】
以下の他の無機濃縮剤を、１００ミリグラム量で、本質的に同一のプロセス（１００ｍｇの薬剤を５０ｍＬの１８メガオーム水中で三度洗浄し、次いで５０ｍＬの吸着緩衝液中で三度洗浄する）を使用して処理した；Ｔｉ−ＤＥ（実施例２）、Ｆｅ−ＤＥ（実施例３）、アミン官能化ガラスビーズ（比較例Ｃ−６）、及びＷ−２１０（実施例４）。対応する未処理の薬剤を比較のために保持した；未処理ＣＭ−１１１（比較例Ｃ−１）、未処理Ｔｉ−ＤＥ（比較例Ｃ−２）、未処理Ｆｅ−ＤＥ（比較例Ｃ−３）、未処理アミン官能化ガラスビーズ（比較例Ｃ−４）、及び未処理Ｗ−２１０（比較例Ｃ−５）。
【０１１２】
微生物含有試料の濃縮
Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ平板培地（４重量パーセント（ｗｔ％）のＤｉｆｃｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））から、白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）のＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ５１８１３）一晩画線培養物を用いて、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（Ｖｉｔｅｋ ＤＥＮＳＩＣＨＥＫ，ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）の、３ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液（ｐＨ ７．２，ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）溶液を作製した。この標準はおよそ１０８コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）に相当する。連続希釈を、フィルタ滅菌（本質的に上述のように）した脱イオン１８メガオーム水で行った。１０５ＣＦＵ／ｍＬ希釈から、１５ｍＬのフィルタ滅菌１８メガオーム水で更に１０００倍希釈を実行し、最終濃度約１００ＣＦＵ／ｍＬを得た。粒子無機濃縮剤（処理済（実施例１〜５）及び未処理（比較例Ｃ−１〜Ｃ−５））を、５ｍＬのポリプロピレン製チューブ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に計量し、１００ＣＦＵ／ｍＬの試験試料の１．０ｍＬ量中の１０ｍｇの濃縮剤を使用して、細菌捕捉を試験した。次いでチューブにキャップをし、室温（２３℃）にて約１分にわたって手動で振盪することによって、それらの内容物を混合した。
【０１１３】
混合後、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）揺動プラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｉｏｗａ）１４サイクル／分）で、チューブを１５分にわたってインキュベートした。インキュベート後、チューブをベンチトップに１０分間置いて粒子濃縮剤を沈殿させた。沈殿後、１ｍＬの結果として得られた上澄みを、ピペットを使用して除去し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））上に播種した。沈殿したペレットを１．０ｍＬの水で再懸濁し、同様に播種した。
【０１１４】
最初の１０５ＣＦＵ／ｍＬ希釈（粒子濃縮剤なし）からの１０００倍希釈を、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））上に対照として播種した。粒子濃縮剤（試料接触を有しない）もまた、滅菌対照として播種した。結果として得られたプレートを、３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした（ＶＷＲ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｉｎｇ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ．ＰＡ））。
【０１１５】
製造業者の説明書にしたがって、このプレートを、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（ＰＰＲ、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ）、自動光学的検出システム）を使用して分析し、コロニー計数を得た。次式を使用して結果を算出した。
捕捉効率＝（濃縮剤上のコロニー数）／（対照中の全コロニー数）×１００
【０１１６】
結果（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）を以下の表１に示す。表１及び続く表内の濃縮剤の記述、「ＡＢ洗浄済」は、濃縮剤が吸着緩衝液で処理されていることを示すために使用する。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
比較例Ｃ−７〜Ｃ−１０
別個の１００ｍｇアリコートの粉末（無機濃縮剤Ｔｉ−ＤＥ（比較例Ｃ−７）、Ｆｅ−ＤＥ（比較例Ｃ−８）、Ｗ−２１０（比較例Ｃ−９）、及びＣＭ−１１１（比較例Ｃ−１０））を、最終スピン／洗浄工程後に、結果として得られた少なくとも部分的に湿った粉末を乾燥させずに、１ｍＬ吸着緩衝液にペレットを再懸濁することによって湿ったペレットとして使用したことを除いて、本質的に上述の実施例１〜４のように処理した。１ｍＬのスパイク水中の〜１００ＣＦＵの大腸菌を用いた捕捉効率試験を、本質的に実施例１〜４に記載のように実行した。結果（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）を、以下の表２に示す。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
実施例５及び比較例Ｃ−１１
別個のＣＭ−１１１ペレットを、本質的に実施例１にあるように処理したが、ペレットを８０℃で乾燥させる替わりに、吸着緩衝液に再懸濁し、結果として得られたスラリーを室温（約２３℃）で４８時間乾燥させた（実施例５）。１．１ｍＬのスパイク水中のおおよそ１００ＣＦＵの大腸菌を用いた捕捉効率試験を、本質的に実施例１〜４に記載のように実行した。結果（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）を、以下の表３に示す。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
室温乾燥実験に使用したＣＭ−１１１ロットの未処理アリコートを、表面組成物判定のために保持した（比較例Ｃ−１１）。
【０１２３】
元素の表面化学分析（ＥＳＣＡ）による表面組成物判定
吸着緩衝液処理済み及び未処理（比較）濃縮剤の表面組成物を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ、ＥＳＣＡとしても既知）によって分析した。粉末のアリコートを、アルミホイル上で、感圧性接着剤両面テープに押し付けた。圧縮窒素ガスを吹き付けることにより、過剰の粉末をそれぞれの試料表面から除去した。
【０１２４】
単色Ａｌ−Ｋα Ｘ線励起源（１４８７ｅＶ）と、一定パスエネルギーモードで動作する半球形電子エネルギーアナライザーを有する、クレイトスＡＸＩＸウルトラ（Kratos AXIS Ulta）（商標）ＤＬＤスペクトロメーター（クレイトス・アナリティカル社（Kratos Analytical））、英国マンチェスター市）を用いてスペクトルデータを取得した。試料表面に対して測定して９０度のテイクオフ角度で±１０度の受け取りの立体角により出射光電子を検出した。低エネルギー電子フラッドガンを使用して、表面帯電を最少化した。アノードに対して１４０ワット電力及び２×１０−８Ｔｏｒｒ（２．６７μＰａ）チャンバー圧力を用いて、測定を行った。
【０１２５】
約３００マイクロメートル×約７００マイクロメートルの寸法のそれぞれの濃縮剤アリコートの表面積を、それぞれのデータ点に対して分析した。それぞれのアリコートの３つの面積を分析し、平均して、報告された平均の原子パーセント値を得た。データ処理は標準のビジョン２（Vision 2）（商標）（クレイトス・アナリティカル社（KratosAnalytical）、英国マンチェスター市）を使用して実施された。実施例１〜５並びに比較例Ｃ−１〜Ｃ−６及びＣ−１１に対してデータが収集された。結果（元素が濃縮剤の表面上に、ＸＰＳによって検出可能なレベルで存在し、報告された数字は３つのデータ点にわたって平均化される）を以下の表４に示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
実施例６及び比較例Ｃ１２〜Ｃ−１３
分離したＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ５１８１３）のコロニーを、画線プレートから５ｍＬのＢＢＬ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に接種し、３７℃で１８〜２０時間にわたってインキュベートした。〜１０９コロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物を、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液（ｐＨ ７．２、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に希釈した。１０２細菌／ｍＬ希釈からの１０００倍希釈を１００ｍＬの飲料水で実行し、最終濃度０．１ＣＦＵ／ｍＬ（合計１０ＣＦＵ）を有する大腸菌スパイク水を得た。比較例Ｃ−１２について、１００ｍｇの未処理／対照ＣＭ−１１１を、１００ｍＬの大腸菌スパイク水を含有する、２５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。比較例Ｃ−１３について、１００ｍｇの未処理／対照ＣＭ−１１１を、１００ｍＬの大腸菌スパイク水及び１．１ｍＬの１００倍吸着緩衝液を含有する、２５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。実施例６については、本質的に実施例１にあるように吸着緩衝液改質された１００ｍｇのＣＭ−１１１を、１００ｍＬの大腸菌スパイク水を含有する、２５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。チューブにキャップをし、次いでＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）揺動プラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｉｏｗａ）１４サイクル／分）上で、室温（２３℃）で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを３０分間研究室のベンチに立てておき、ＣＭ−１１１粒子を沈殿させた。
【０１２８】
ＣＭ−１１１取り出し工程において、結果として得られた上澄みの８０ｍＬ量を、ピペッティングにより処分し、沈殿した粒子を含有する残りの２０ｍＬを、チューブからピペットで取り出し、５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製チューブ（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に移し、２０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））で５分間遠沈させ、ペレットを得た。ペレットを、１ｍＬのＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液に再懸濁し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群計測プレートに接種した。〜１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（粒子濃縮剤なし）から１ｍＬ量を、対照として正副２枚の３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。結果として得られたプレートを、製造業者の説明書にしたがって更に処理し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））を使用して分析した。結果（２つのデータ点にわたって平均化したもの）を表５に示す。
【０１２９】
【表５】
・＊〜２０パーセントの標準偏差
・＊＊〜１０パーセントの標準偏差
【０１３０】
実施例７及び比較例Ｃ−１４〜Ｃ−１６
分離したＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ５１８１３）のコロニーを、画線プレートから５ｍＬのＢＢＬ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）に接種し、３７℃で１８〜２０時間にわたってインキュベートした。〜１０９コロニー形成単位／ｍＬのこの一晩培養物を、フィルタ滅菌１８メガオーム水で希釈した。１０６細菌／ｍＬ希釈からの１０００倍希釈を、１０ｍＬのフィルタ滅菌１８メガオーム水で実行し、最終濃度〜１０３細菌／ｍＬ（合計〜１０４ＣＦＵ）を有する大腸菌スパイク水を得た。実施例７について、１０ｍｇの吸着緩衝液改質（本質的に実施例１のように）されたＣＭ−１１１を、１０ｍＬの大腸菌スパイク水を有する５０ｍＬの滅菌ポリプロピレン製円錐底遠心管（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））に添加した。チューブにキャップをし、次いでＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｖａｒｉ Ｍｉｘ（商標）揺動プラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｉｏｗａ）１４サイクル／分）上で、室温（２３℃）で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４、ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））で５分間チューブを遠心分離し、ＣＭ−１１１粒子を沈殿させ、ＣＭ−１１１ペレットを形成した。
【０１３１】
１００マイクロリットルの未スパイク水（１チューブ）及び１００マイクロリットルの大腸菌スパイク水（２チューブ、それぞれ異なる希釈から）を含有する対照チューブを、ＣＭ−１１１濃縮剤なしで、それぞれキャップをして同様にインキュベートした（比較例Ｃ−１４（未スパイク）、Ｃ−１５（希釈番号１：１００マイクロリットルの１０３ＣＦＵ／ｍＬ希釈）、及びＣ−１６（希釈番号２：１００マイクロリットルの１０５ＣＦＵ／ｍＬ希釈））。播種対照として、吸着緩衝液改質（本質的に実施例１にあるように）されたＣＭ−１１１ペレット（捕捉した細菌あり）を、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレートに播種した。結果として得られたプレートを、製造業者の説明書にしたがって、更に処理し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ．，ＭＮ））を使用して分析した。この播種対照の結果は、比較例Ｃ−１５に対して１．９×１０３ＣＦＵ／ｍＬの濃縮を示した。ＣＭ−１１１播種対照は、捕捉効率１００パーセントを表した。
【０１３２】
ＣＭ−１１１ペレットを、１００マイクロリットルの１８メガオーム水に再懸濁し、１．５ｍＬの滅菌ポリプロピレン製微量遠心管（ＰＬＡＳＴＩＢＲＡＮＤ（商標）、ＢＲＡＮＤ ＧＭＢＨ＋ＣＯ（Ｗｅｒｔｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に移した。１００マイクロリットルの量のＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）ＡＴＰ検定試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を、各チューブ（対照チューブ含む）に添加し、ＶＷＲアナログボルテックスミキサー（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））で１５秒間１４，０００ｒｐｍ（最高速度）で混合した。生物発光（対照チューブ及びＣＭ−１１１ペレット含有チューブ）を、ベンチトップ照度計（ＦＢ−１２単一チューブ照度計、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ））を使用して（相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で）測定した。結果（２つのデータ点からの平均値）を以下の表６にまとめる。
【０１３３】
【表６】
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位
【０１３４】
実施例８〜１２及び比較例Ｃ−１７〜Ｃ−２２
白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）の黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ６５３８）一晩培養物を用いて、０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（〜１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当）を作製し、本質的に上述のように調製した１０ｍｇのさまざまな異なる粒子濃縮剤を用いて試験した。さまざまな粒子濃縮剤（１０ｍｇ）を、本質的に実施例１〜４にあるように、１．１ｍＬの水試料からの〜１００ＣＦＵの捕捉について試験し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。〜１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（粒子濃縮剤なし）から１ｍＬ量を、対照として正副２枚の３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ．，ＭＮ））を使用して、プレートを分析した。
【０１３５】
黄色ブドウ球菌に対する捕捉データを、以下の表７に示す（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差を示す）。微生物のコロニーと濃縮剤の色が類似している（プレートリーダーに対して殆どコントラストをもたらさない）場合には、結果は上澄み液を基準とし、下記の式を用いて濃縮剤による微生物のパーセント捕捉率により報告された。
上澄み液中のＣＦＵ／ｍＬパーセンテージ＝（播種された上澄みからのコロニー数）／（播種された未処理の対照試料からのコロニー数）×１００
捕捉効率又はパーセント捕捉率＝１００−上澄み液中のＣＦＵ／ｍＬパーセンテージ
【０１３６】
上澄み液を基準とした上述の等式から計算した捕捉効率は、表７の「試験方法」に「上澄み」と標示する。濃縮剤を基準とした捕捉効率は、実施例１〜４に既定の等式に基づいたものであり、表７の「試験方法」に「剤」として標示する。
【０１３７】
【表７】
【０１３８】
実施例１３〜１６及び比較例Ｃ−２３〜Ｃ−２６
Ｔｙｒｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ平板培地（製造業者の説明書にしたがって調製された、４重量パーセントのＤｉｆｃｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））から、白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）の緑膿菌（ＡＴＣＣ １５４４２）一晩培養物を用いて、０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（〜１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当）を作製し、本質的に上述のように調製した１０ｍｇのさまざまな異なる粒子濃縮剤を用いて試験した。さまざまな粒子濃縮剤（１０ｍｇ）を、本質的に実施例１〜４に記載のように、１．０ｍＬ水試料からの〜１００ＣＦＵの捕捉について試験し、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））上に播種した。最初の１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（濃縮剤なし）からの１ｍＬ量を、対照として正副２枚の３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）好気性菌計測プレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））に播種した。結果として得られたプレートを、３７℃で約２４時間インキュベートし、３Ｍ（商標）Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（商標）プレートリーダー（ＰＰＲ、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ））を使用して分析した。粒子薬剤の捕捉効率は、実施例１〜４に記載の式を使用することによって判定する。緑膿菌に対する捕捉データを、以下の表８に示す（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）。
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
実施例１７〜２１及び比較例Ｃ−２７〜Ｃ−３２
Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ平板培地（５パーセントのＢｌｏｏｄ Ａｇａｒ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ））から、白金耳量（標準的な４ミリメートルの細菌接種用ループ）のリステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ ３３０９０）一晩培養物を用いて、０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ標準（〜１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当）を作製し、本質的に上述のように調製した１０ｍｇのさまざまな異なる粒子濃縮剤を用いて試験した。粒子濃縮剤（１０ｍｇ）を本質的に実施例１〜４に記載のように１．０ｍＬの水試料からの〜１００ＣＦＵの捕捉について試験した。１０分の沈殿後、結果とて得られた１ｍＬの上澄みを、別個の５ｍＬ滅菌チューブに取り除いた。結果として得られた濃縮剤のペレットを、１００マイクロリットルの１８メガオーム水に再懸濁し、ＭＯＸプレート（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｐｌａｔｅｓ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ，ＣＡ））に散布することによって播種した。上澄みからの１００マイクロリットル量もまた、同様に播種した。最初の〜１０２ＣＦＵ／ｍＬ希釈（濃縮剤なし）からの１０倍希釈を、対照として正副２枚に播種した。手集計によりコロニー計数を得、実施例１〜４において上述の式を使用して、粒子濃縮剤の捕捉効率を判定した。リステリア・イノキュアに対する捕捉データを、以下の表９に示す（２つのデータ点に対する平均値及び標準偏差）。
【０１４１】
【表９】
【０１４２】
本明細書で引用した特許、特許文献、及び公報に含有される参照された記述内容は、その全体が、それぞれ個別に組み込まれているかのように、参照として組み込まれる。本発明に対する様々な予見できない修正及び変更が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかとなるであろう。本発明は、本明細書に記載した例示的な実施形態及び実施例によって過度に限定されるものではなく、またかかる実施例及び実施形態は、一例として表されているだけであり、但し、本発明の範囲は、以下のように本明細書に記載した請求項によってのみ限定されることを意図するものと理解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、（１）少なくとも１つの無機濃縮剤を少なくとも１つのカチオン含有塩溶液と接触させ、前記無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（２）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を乾燥させることと、を含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を準備することと、（ｃ）前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と接触させることであって、それにより前記少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか又はそれによって捕捉されること、とを含む、プロセス。
【請求項２】
前記無機濃縮剤が、粒子濃縮剤である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記無機濃縮剤が、シリコン含有無機材料、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記シリコン含有無機材料が、金属酸化物改質珪藻土、金属アルミノケイ酸塩、非晶質金属ケイ酸塩、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記無機濃縮剤が、非晶質金属ケイ酸塩、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記無機濃縮剤が、非晶質の長球化ケイ酸マグネシウムである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記カチオン含有塩溶液が、水性である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記カチオン含有塩溶液が、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、第一鉄カチオン、ランタンカチオン、アルミニウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つのカチオンを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記カチオン含有塩溶液が、少なくとも１つの多価カチオンを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記多価カチオンが、二価カチオンである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記二価カチオンが、二価カルシウムカチオン、二価マグネシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記カチオン含有塩溶液が、水１リットル当たり、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含み、ｐＨ ７．２を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記無機濃縮剤を前記カチオン含有塩溶液と前記接触させるが、洗浄によって実行される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記乾燥させることが、前記少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を約２５℃よりも高い温度に加熱することによって実行される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記試料が流体の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物株が、細菌、真菌、酵母、原生動物、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と前記接触させることが、前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と混合することによって実行される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記プロセスが、結果として得られる微生物結合した吸着緩衝液改質無機濃縮剤を凝離することと、その結果得られる凝離された微生物結合した吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料から分離することと、及び／又は少なくとも１つの結合した微生物株の存在を検出することと、を更に含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液を用いて、少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理して、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、前記少なくとも１つのカチオンの原子とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤の比率よりも大きい表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤を準備することを含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を提供することと、（ｃ）前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と接触させることであって、前記少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか、又はそれによって捕捉されることと、を含む、プロセス。
【請求項２０】
請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤を調製するためのプロセスであって、前記調製プロセスが微生物含有試料の実質的な非存在下において実行されるという条件で、前記調製プロセスが、（ａ）少なくとも１つの無機濃縮剤を、少なくとも１つのカチオン含有塩溶液と接触させて、前記無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（ｂ）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を乾燥させることと、を含む、プロセス。
【請求項２１】
請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤を調製するためのプロセスであって、前記調製プロセスが微生物含有試料の実質的な非存在下において実行されるという条件で、前記調製プロセスが、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液を用いて少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理し、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、前記少なくとも１つのカチオンの原子とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤のものよりも大きい表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤を準備することを含む、プロセス。
【請求項２２】
前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤が、請求項２０に記載のプロセスによって調製される、請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤。
【請求項２３】
前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤が、請求項２１に記載のプロセスによって調製される、請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤。
【請求項２４】
（ａ）請求項２２に記載の吸着緩衝液改質無機濃縮剤と、（ｂ）試験容器と、（ｃ）請求項１に記載のプロセスを実行する際の前記濃縮剤の使用のための説明書と、を含む、キット。
【請求項２５】
（ａ）請求項２３に記載の吸着緩衝液改質無機濃縮剤と、（ｂ）試験容器と、（ｃ）請求項１に記載のプロセスを実行する際の前記濃縮剤の使用のための説明書と、を含む、キット。
【請求項１】
（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、（１）少なくとも１つの無機濃縮剤を少なくとも１つのカチオン含有塩溶液と接触させ、前記無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（２）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を乾燥させることと、を含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を準備することと、（ｃ）前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と接触させることであって、それにより前記少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか又はそれによって捕捉されること、とを含む、プロセス。
【請求項２】
前記無機濃縮剤が、粒子濃縮剤である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記無機濃縮剤が、シリコン含有無機材料、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記シリコン含有無機材料が、金属酸化物改質珪藻土、金属アルミノケイ酸塩、非晶質金属ケイ酸塩、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記無機濃縮剤が、非晶質金属ケイ酸塩、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記無機濃縮剤が、非晶質の長球化ケイ酸マグネシウムである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記カチオン含有塩溶液が、水性である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記カチオン含有塩溶液が、マグネシウムカチオン、カルシウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、第一鉄カチオン、ランタンカチオン、アルミニウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つのカチオンを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記カチオン含有塩溶液が、少なくとも１つの多価カチオンを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記多価カチオンが、二価カチオンである、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記二価カチオンが、二価カルシウムカチオン、二価マグネシウムカチオン、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記カチオン含有塩溶液が、水１リットル当たり、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含み、ｐＨ ７．２を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記無機濃縮剤を前記カチオン含有塩溶液と前記接触させるが、洗浄によって実行される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記乾燥させることが、前記少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を約２５℃よりも高い温度に加熱することによって実行される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記試料が流体の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物株が、細菌、真菌、酵母、原生動物、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と前記接触させることが、前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と混合することによって実行される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記プロセスが、結果として得られる微生物結合した吸着緩衝液改質無機濃縮剤を凝離することと、その結果得られる凝離された微生物結合した吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料から分離することと、及び／又は少なくとも１つの結合した微生物株の存在を検出することと、を更に含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
（ａ）吸着緩衝液改質無機濃縮剤であって、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液を用いて、少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理して、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、前記少なくとも１つのカチオンの原子とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤の比率よりも大きい表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤を準備することを含むプロセスによって調製される、吸着緩衝液改質無機濃縮剤を準備することと、（ｂ）少なくとも１つの微生物株を含む試料を提供することと、（ｃ）前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤を前記試料と接触させることであって、前記少なくとも１つの微生物株の少なくとも一部分が、前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤に結合されるか、又はそれによって捕捉されることと、を含む、プロセス。
【請求項２０】
請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤を調製するためのプロセスであって、前記調製プロセスが微生物含有試料の実質的な非存在下において実行されるという条件で、前記調製プロセスが、（ａ）少なくとも１つの無機濃縮剤を、少なくとも１つのカチオン含有塩溶液と接触させて、前記無機濃縮剤の少なくとも一部分を湿らせることと、（ｂ）結果として得られる少なくとも部分的に湿った無機濃縮剤を乾燥させることと、を含む、プロセス。
【請求項２１】
請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤を調製するためのプロセスであって、前記調製プロセスが微生物含有試料の実質的な非存在下において実行されるという条件で、前記調製プロセスが、少なくとも１つのカチオンを含む少なくとも１つの吸着緩衝液を用いて少なくとも１つのシリコン含有無機濃縮剤を処理し、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって判定される、前記少なくとも１つのカチオンの原子とシリコンの原子との比率が、対応する未処理のシリコン含有無機濃縮剤のものよりも大きい表面組成物を有するシリコン含有無機濃縮剤を準備することを含む、プロセス。
【請求項２２】
前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤が、請求項２０に記載のプロセスによって調製される、請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤。
【請求項２３】
前記吸着緩衝液改質無機濃縮剤が、請求項２１に記載のプロセスによって調製される、請求項１に記載のプロセスを実行する際に使用するための吸着緩衝液改質無機濃縮剤。
【請求項２４】
（ａ）請求項２２に記載の吸着緩衝液改質無機濃縮剤と、（ｂ）試験容器と、（ｃ）請求項１に記載のプロセスを実行する際の前記濃縮剤の使用のための説明書と、を含む、キット。
【請求項２５】
（ａ）請求項２３に記載の吸着緩衝液改質無機濃縮剤と、（ｂ）試験容器と、（ｃ）請求項１に記載のプロセスを実行する際の前記濃縮剤の使用のための説明書と、を含む、キット。
【公表番号】特表２０１３−５１４８１０（Ｐ２０１３−５１４８１０Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６０７３（Ｐ２０１２−５４６０７３）
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０９４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７９０３８
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０９４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７９０３８
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
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