微生物熱量計を用いた菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地
【課題】様々な食品中の菌数を測定することができる微生物熱量計を用いた菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地を提供すること。
【解決手段】微生物熱量計を用いた食品中の菌数を測定する方法であって、測定に使用する塊状の寒天培地を測定用容器中に投入し所定の温度に平衡化する工程と、前記寒天培地に流動性を有する試料を添加する工程と、試料が添加された寒天培地を一定温度で保持しながら発生する熱量を測定する工程と、を有することを特徴とする、微生物熱量計を用いた菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地によって解決する。
【解決手段】微生物熱量計を用いた食品中の菌数を測定する方法であって、測定に使用する塊状の寒天培地を測定用容器中に投入し所定の温度に平衡化する工程と、前記寒天培地に流動性を有する試料を添加する工程と、試料が添加された寒天培地を一定温度で保持しながら発生する熱量を測定する工程と、を有することを特徴とする、微生物熱量計を用いた菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地によって解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物熱量計を用いた食品中の菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品中の菌数は、その食品の衛生度の指標となる。そのため、食品業においては、製品の微生物学的な品質を保証するため、製品だけではなく、製品の原材料や製造過程で調製される中間原料など、食品中の菌数を迅速に測定することが極めて重要である。
【０００３】
従来、菌数の測定は、平板寒天培養法によって行われる。すなわち、段階的に希釈した試料を寒天培地に塗抹あるいは混釈培養し、１〜２日後に寒天培地上に出現したコロニーを計数することで菌数を算出する。しかし、平板寒天培養法は、コロニーが出現するまでに長時間を必要とするため、食品中の菌数を迅速に測定することができない。また、試料や培地の調製にコストや労力を費やすという欠点もある。
【０００４】
このような背景から、迅速に食品中の菌数を測定する方法の一つとして、微生物熱量計を用いた菌数の測定方法が開発されている。すなわち、微生物が増殖する際に放出する代謝熱を熱量計で測定し、所定の熱量計出力値に達する時間と食品中の初期菌数との相関性に基づき食品中の菌数を測定するものである。例えば、佐藤らは、豚肉片を微生物熱量計の測定用容器に直接収めて測定する方法（直接法）と豚肉片の乳剤を液体培地に添加して測定用容器内で静置培養する方法（間接法）を検討し、直接法及びトリプトソイブイヨン（ＴＳＢ)液体培地を用いた間接法によって豚肉中の一般生菌数を測定できることを報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】佐藤善博ら、「獣医畜産新報」、１９９０、４３（１２）、ｐ．７６８−７７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物熱量計を用いた菌数の測定方法における直接法では、検体となる食品を微生物熱量計の測定用容器に直接収め、該食品中に存在する微生物の増殖に伴う代謝熱を測定することで該食品中の菌数を算出する。しかし、水分活性の低い食品や微生物の生育が定常期に達している発酵食品などは、その食品中では増殖することができないために該食品中の菌数を測定することができないといった問題がある。
【０００７】
一方、液体培地を用いた間接法では、該食品の乳剤を液体培地中に添加し、該食品中に存在する微生物の増殖に伴う代謝熱を測定することで該食品中の菌数を算出する。しかし、納豆などの好気性細菌が優勢な食品では、液体培地中の溶存酸素濃度が低く、微生物熱量計に静置条件下で設置した液体培地中では増殖することができないために該食品中の菌数を測定することができないといった問題がある。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、様々な食品中の菌数を測定することができる微生物熱量計を用いた菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、所定の形状の寒天培地を用いることで、水分活性の低い食品や微生物の生育が定常期に達している発酵食品、好気性細菌が優勢な食品など、様々な食品中の菌数を微生物熱量計によって迅速で正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、測定に使用する塊状の寒天培地を測定用容器中に投入し所定の温度に平衡化する工程と、前記寒天培地に流動性を有する試料を添加する工程と、試料が添加された寒天培地を一定温度で保持しながら発生する熱量を測定する工程と、を有することを特徴とする、微生物熱量計を用いた菌数の測定方法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、微生物熱量計による菌数の測定に用いる寒天培地であって、寒天培地が、塊状である、微生物熱量計用寒天培地を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る微生物熱量計を用いた食品中の菌数の測定方法によれば、迅速で正確に様々な食品中の菌数を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本実施形態に係る菌数の測定方法を説明した図である。
【図２】本実施形態に係る寒天培地の形状の一例を示した図である。
【図３】菌数が異なる各種納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図４】熱量計出力値１５０μＶに達する時間と各種濃度の納豆菌懸濁液の初期菌数との相関関係を示す図である。
【図５】測定に使用した円柱状寒天培地を示す図である。
【図６】異なる粒径の円柱状寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図７】異なる粒数の円柱状乾燥ブイヨン寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図８】異なる培地成分濃度の円柱状乾燥ブイヨン寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図９】異なる寒天濃度の円柱状乾燥ブイヨン寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１０】希釈段数が異なるホタテ抽出液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１１】熱量計出力値１００μＶに達する時間とホタテ抽出液の希釈段数との相関関係を示す図である。
【図１２】一般生菌数が異なる豚挽肉乳剤の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１３】熱量計出力値１００μＶに達する時間と各種濃度の豚挽肉乳剤の初期一般生菌数との相関関係を示す図である。
【図１４】大腸菌群数が異なる豚挽肉乳剤の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１５】熱量計出力値１００μＶに達する時間と各種濃度の豚挽肉乳剤の初期大腸菌群数との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態における微生物熱量計を用いた食品中の菌数の測定方法について説明する。図１は、本実施形態に係る菌数の測定方法を説明するための図である。
【００１５】
本実施形態における微生物熱量計は、従来から知られている微生物熱量計を用いることができる。
【００１６】
本実施形態において、微生物熱量計に用いる測定用容器を滅菌し、これに滅菌した塊状の寒天培地を無菌的に投入し、恒温器中で所定の温度に平衡化する（Ｓ１）。次いで、この平衡化した測定用容器内の寒天培地上に菌数の測定に用いる流動性を有する試料を速やかに添加する（Ｓ２）。なお、寒天培地を投入した該測定用容器および微生物熱量計内の温度を事前に所定の温度に平衡化することによって測定開始直後の微生物熱量計の熱量計出力値を安定させることができ、これにより、微生物の増殖に伴う代謝熱の熱量を正確に測定することができる。
【００１７】
前記寒天培地は、対象となる微生物が増殖できれば特に限定されず、例えば、乾燥ブイヨン寒天培地、普通寒天培地、標準寒天培地、デソキシコレート寒天培地などを挙げることができる。
【００１８】
前記寒天培地の形状は、微生物熱量計に用いる測定用容器内に入れることができる塊状であれば特に限定されないが、表面積の広さ及び成型加工性の観点から、図２に示す球形１０、回転楕円体形１２、円柱形２０、楕円柱形２２、多角柱形３０〜３４、星形多角柱形４０及び４２、星型多面形５０及び５２、円錐形６０、楕円錐形６２、円錐台形７０、楕円錐台形７２、多角錐形８０〜８４又は多角錐台形９０〜９４が好ましい。また、これら形状の寒天培地を単独又は複数混合して用いることができる。
【００１９】
前記寒天培地の成型方法は、測定に使用する寒天培地を所望の形状に成型することができれば特に限定されないが、成型加工性の観点から、平板寒天培地を調製した後、該平板寒天培地から所望の形状の型を用いて型抜きする方法及び所望の形状の型に寒天培地を流し込み成型する方法が好ましい。
【００２０】
前記寒天培地の寒天濃度は、寒天濃度が低い場合には成型した寒天培地が容易に崩れてしまい、一方で、寒天濃度が高い場合には成型時の型に寒天が粘着して取り出す際に寒天培地が壊れてしまうため、寒天培地の形状維持の観点から、２．５〜５．０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００２１】
前記寒天培地の総表面積は、総表面積が広い場合にはこぼれることなく寒天表面上に添加することが可能な食品乳剤の量が多くなり、結果としてバイアル中の総菌数を増やすことができるため、好気性細菌が十分に増殖できる観点から、１６ｃｍ２以上が好ましく、２４ｃｍ２以上がより好ましい。
【００２２】
前記塊状の寒天培地は、一定空間内における寒天培地の表面積を確保するため、１個当たりの寒天培地の体積が小さすぎる場合では寒天培地間の接触面積が増加して全寒天培地の露出している総表面が減少すること、全寒天培地の総体積が大きすぎる場合では酸素供給を行うヘッドスペースが減少すること、および実用性の観点から、１個当たりの体積が０．４〜０．９ｃｍ３で、５〜１０個を測定用容器に投入することが好ましい。
【００２３】
本実施形態において、試料が固形状の食品の場合には、該食品をストマッカー処理やホモジナイズ処理等によって流動状に調製したものを用いる。一方、液状の食品や飲料等は、そのまま使用することができる。
【００２４】
前記流動性を有する試料を、測定用容器内の寒天培地に添加し密封した後（Ｓ２）、試料が寒天培地表面全体に塗布されるように測定用容器を軽く振ることで寒天培地と試料とを十分に接触させ、これを微生物熱量計内で一定温度に保持する（Ｓ３）。これにより、試料中の微生物が寒天培地上で増殖を開始し、該微生物の増殖に伴う代謝熱の熱量を連続的に測定する（Ｓ４）。
【００２５】
また、菌数を算出するにあたっては、あらかじめ平板寒天培養法によって測定した菌数が既知の流動性を有する試料を用いて同様の方法で熱量を測定し、初期菌数と所定の熱量計出力値に達する時間との関係を示す検量線を作成することで、菌数が未知の試料について、所定の熱量計出力値に達する時間から該試料の初期菌数を算出する（Ｓ５）。
【００２６】
次に、本発明の実施形態における微生物熱量計用寒天培地について説明する。
【００２７】
本実施形態における寒天培地の種類は、対象となる微生物が増殖できれば特に限定されず、例えば、乾燥ブイヨン寒天培地、普通寒天培地、標準寒天培地、デソキシコレート寒天培地などを挙げることができる。
【００２８】
前記寒天培地の形状は、微生物熱量計に用いる測定用容器（バイアル）内に入れることができる塊状であれば特に限定されないが、表面積の広さ及び成型加工性の観点から、図２に示す球形１０、回転楕円体形１２、円柱形２０、楕円柱形２２、多角柱形３０〜３４、星形多角柱形４０及び４２、星型多面形５０及び５２、円錐形６０、楕円錐形６２、円錐台形７０、楕円錐台形７２、多角錐形８０〜８４又は多角錐台形９０から９４が好ましい。
【００２９】
前記寒天培地の寒天濃度は、寒天濃度が低い場合には成型した寒天培地が容易に崩れてしまい、一方で、寒天濃度が高い場合には成型時の型に寒天が粘着して取り出す際に寒天培地が壊れてしまうため、寒天培地の形状維持の観点から、２．５〜５．０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００３０】
前記寒天培地の総表面積は、総表面積が広い場合にはこぼれることなく寒天表面上に添加することが可能な食品乳剤の量が多くなり、結果としてバイアル中の総菌数を増やすことができるため、好気性細菌が十分に増殖できる観点から、１６ｃｍ２以上が好ましく、２４ｃｍ２以上がより好ましい。
【００３１】
前記寒天培地の成型方法は、測定に使用する寒天培地を所望の形状に成型することができれば特に限定されないが、成型加工性の観点から、平板寒天培地を調製した後、該平板寒天培地から所望の形状の型を用いて型抜きする方法及び所望の形状の型に寒天培地を流し込み成型する方法が好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００３３】
１．納豆菌の菌数
試料として、納豆菌粉末（成瀬発酵化学研究所社製）２５ｍｇを０．１％ペプトン水１０ｍＬに懸濁した納豆菌懸濁液を用いた。また、調製した納豆菌懸濁液を原液として段階的に０．１％ペプトン水で１０倍、１００倍及び１０００倍に希釈することで各種納豆菌懸濁希釈液を調製した。なお、納豆菌懸濁液希釈中の菌数を常法に従って標準寒天培地を用いた平板培養法によって測定したところ、原液中の菌数は４．３８×１０４ＣＦＵ／３００μＬであった。希釈倍率より算出することで、１０倍希釈液中は４．３８×１０３ＣＦＵ／３００μＬ、１００倍希釈液中は４．３８×１０２ＣＦＵ／３００μＬ、１０００倍希釈液中は４．３８×１０１ＣＦＵ／３００μＬとした。
【００３４】
微生物熱量計（Ａｎｔａｒｅｓ０２０４ＦＰ型；けいはんな文化学術協会微生物計測システム研究所製）の平衡化は、３５℃で２４時間保持することで行った。
【００３５】
測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。なお、調製した円柱状寒天培地を図５に示した。
【００３６】
前記円柱状寒天培地１０粒を空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量を測定することで熱量計出力値が１５０μＶに到達するまでの時間を調べた。また、その結果を図３に示した。
【００３７】
図３に示すように、全ての場合において、熱量計出力曲線は左右対称に近い形を示し、菌の増殖に伴う代謝熱を良好に測定することができた。また、熱量計出力値が１５０μＶに到達するまでの時間は、納豆菌原液では７．４時間、１０倍希釈液では９．０時間、１００倍希釈液では１０．６時間、１０００倍希釈液では１１．７時間と、初期菌数が多い試料ほど短時間であった。さらに、初期菌数と１５０μＶに達するまでの時間との相関関係を調べたところ、Ｒ２＝０．９９２９と高い相関性が認められた（図４）。
【００３８】
このように、好気性細菌である納豆菌の菌数について、円柱状寒天培地を用いた微生物熱量計によって迅速かつ正確に測定できることが判明した。
【００３９】
２．培地の種類及び粒径について
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の種類及び粒径の影響について、以下の検討を行った。
【００４０】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、普通寒天培地の場合では、普通寒天培地（日水製薬社製）１．７５ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）０．５ｇ（寒天終濃度２．５％（ｗ／ｖ））を純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。一方、乾燥ブイヨン寒天培地の場合では、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）１．５ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これら寒天培地をそれぞれ無菌的にシャーレ内に入れて、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径８ｍｍ、１０ｍｍ又は１２ｍｍのパンチャーでそれぞれ型抜きすることで各種円柱状寒天培地を調製した。
【００４１】
上記各種円柱状寒天培地の総重量、総表面積及び総体積がそれぞれ出来るだけ同様となるように、直径が８ｍｍの場合は１０粒、直径が１０ｍｍの場合は７粒、直径が１２ｍｍの場合は５粒を空の測定用容器（バイアル）にそれぞれ入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行った（図６）。また、１バイアル中の各種寒天培地の総表面積を表１に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁液（原液）を用いた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
図６に示すように、乾燥ブイヨン寒天培地を用いた場合には、普通寒天培地を用いた場合と比べて短時間で発熱が開始したが、最大出力値は普通寒天培地の方が高い値を示した。一方、普通寒天培地及び乾燥ブイヨン寒天培地ともに、それぞれ円柱の直径が異なる寒天培地を用いても同様の熱量計出力曲線を得ることができた。
【００４４】
このように、乾燥ブイヨン寒天培地又は普通寒天培地のどちらを用いても熱量を十分に測定することができた。また、試験した範囲内において、寒天培地の粒径の違いによる熱量計出力曲線の差異はなかった。
【００４５】
３．培地の表面積及び体積について
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の表面積及び体積の影響について、以下の検討を行った。
【００４６】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）１．５ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００４７】
上記円柱状寒天培地２粒、４粒、６粒、８粒又は１０粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行うとともに、内径３０ｍｍ、高さ６５ｍｍの測定用容器（バイアル）内に調製した該培地の平板寒天培地（培地量として５ｍｌ又は２０ｍｌ添加）についても同様に熱量の測定を行った（図７）。また、１バイアル中の寒天培地の総表面積を表２に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁原液を用いた。
【００４８】
【表２】
【００４９】
総表面積及び総体積について、図７に示すように、測定用容器（バイアル）に入れる円柱状寒天培地の粒数が４〜１０粒（総表面積１６．４〜４１．０ｃｍ２：総体積２．５〜６．３ｃｍ３）の場合、平板寒天培地（表面積７．１ｃｍ２：総体積５．０及び２０．０ｃｍ３）の場合と比べて熱量計出力値が高い値を示した。また、円柱状寒天培地の粒数が２粒（培地の総表面積８．２ｃｍ２：総体積１．３ｃｍ３）の場合では、平板寒天培地を用いた場合と同様の経過を示した。
【００５０】
４．培地濃度
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の培地濃度の影響について、以下の検討を行った。
【００５１】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）０．３７５ｇ、０．７５ｇ、１．５ｇ又は３．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地をそれぞれ調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００５２】
上記各種円柱状寒天培地７粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行った。また、その結果を図８に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁原液を用いた。
【００５３】
図８に示すように、純水５０ｍＬに対する乾燥ブイヨン粉末（日水製薬社製）の添加量が１．５ｇ及び３．０ｇの場合に最も短時間で発熱を開始した。また、乾燥ブイヨン粉末（日水製薬社製）の添加量が多いほど、すなわち、培地成分量が多いほど最大出力値が高い値を示した。
【００５４】
５．寒天濃度
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の寒天濃度の影響について、以下の検討を行った。
【００５５】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇ、１．７５ｇ又は２．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地をそれぞれ調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。なお、細菌用粉末寒天（日水製薬社製）０．７５ｇ添加の場合では、以下に示す円柱状寒天培地に試料を接種した後、円柱状寒天培地全体に行き渡らせるために軽く振ることで円柱状寒天培地が崩れてしまったので、試験に用いることができなかった。
【００５６】
上記各種円柱状寒天培地７粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行った。また、その結果を図９に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁原液を用いた。
【００５７】
図９に示すように、全ての場合において、発熱を開始する時期が同じであったが、寒天濃度が高くなるほど最大出力値が高くなる傾向を示した。
【００５８】
６．乾燥ホタテ貝柱抽出液の発熱測定
試料の調製は、乾燥ホタテ１粒（６．７７ｇ）を滅菌水１０ｍＬに加え、常温で１日間保持することで行った。また、調製したホタテ抽出原液を段階的に０．１％ペプトン水で１０倍、１００倍及び１０００倍希釈することで各種ホタテ抽出希釈液を調製した。
【００５９】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地をそれぞれ調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００６０】
上記円柱状寒天培地１０粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、前記試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量を測定することで熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間を調べた。また、その結果を図１０に示した。
【００６１】
図１０に示すように、熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間は、ホタテ抽出原液では２．９時間、１０倍希釈液では４．８時間、１００倍希釈液では６．７時間、１０００倍希釈液では８．８時間と、初期一般生菌数が多い試料ほど短時間で発熱を開始した。また、希釈段数と１００μＶに達するまでの時間との相関性を調べたところ、Ｒ２＝０．９９８８と高い相関性が認められた（図１１）。
【００６２】
実際に乾燥ホタテ貝柱の一般生菌数推定を行うためには、無菌的にミキサー等で粉砕した後、希釈水を添加したものを熱量計に供する必要があるが、乾燥ホタテのような水分活性の低いサンプルであっても、微生物熱量計による円柱状寒天培地を用いた一般生菌数の測定方法によってその一般生菌数を迅速かつ正確に測定することが可能と考えられる。
【００６３】
７．豚挽肉中の一般生菌数及び大腸菌群数
試料として、２０℃で一晩放置することで増菌させた市販豚挽肉２５ｇを滅菌した０．１％ペプトン水２２５ｍＬに添加した後、ストマッカー処理して調製した豚挽肉乳剤を用いた。また、該豚挽肉乳剤を原液として段階的に滅菌した０．１％ペプトン水で１０倍、１００倍、１０００倍及び１００００倍に希釈することで各種豚挽肉乳剤希釈液を調製した。なお、これら豚挽肉中の一般生菌数及び大腸菌群数を常法に従って平板培養法によって測定した。すなわち、標準寒天培地を用いて測定した豚挽肉乳剤原液中の一般生菌数は、５．７×１０７ＣＦＵ／ｇで、１０倍希釈液中は５．７×１０６ＣＦＵ／ｇ、１００倍希釈液中は５．７×１０５ＣＦＵ／ｇ、１０００倍希釈液中は５．７×１０４ＣＦＵ／ｇ、１００００倍希釈液中は５．７×１０３ＣＦＵ／ｇであった。一方、デソキシコレート培地を用いて測定した豚挽肉乳剤原液中の大腸菌群数は、（１．７５×１０８ＣＦＵ／ｇ）で、１０倍希釈液中は（１．７５×１０７ＣＦＵ／ｇ）、１００倍希釈液中は（１．７５×１０６ＣＦＵ／ｇ）、１０００倍希釈液中は（１．７５×１０５ＣＦＵ／ｇ）、１００００倍希釈液中は（１．７５×１０４ＣＦＵ／ｇ）であった。
【００６４】
微生物熱量計（Ａｎｔａｒｅｓ０２０４ＦＰ型；けいはんな文化学術協会微生物計測システム研究所製）の平衡化は、３５℃で２４時間保持することで行った。
【００６５】
測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、一般生菌数を測定する場合、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。一方、大腸菌群数を測定する場合、デソキシコレート寒天培地（日水製薬社製）２．２５ｇを純水５０ｍＬに加えて加熱溶解した後、これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００６６】
前記の各種円柱状寒天培地１０粒を空の測定用容器（バイアル）にそれぞれ入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量を測定することで熱量計出力値が１００μＶに到達するまでの時間を調べた（図１２及び１４）。
【００６７】
豚挽肉中の一般生菌数について、図１２に示すように、熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間は、豚挽肉乳剤原液では４．６時間、１０倍希釈液では５．９時間、１００倍希釈液では７．２時間、１０００倍希釈液では１０．０時間、１０００倍希釈液では１２．４時間と、初期一般生菌数が多い試料ほど短時間で発熱を開始した。また、初期一般生菌数と１００μＶに達するまでの時間との相関性を調べたところ、Ｒ２＝０．９６９９と高い相関性が認められた（図１３）。
【００６８】
一方、豚挽肉中の大腸菌群数について、豚挽肉中にはデソキシコレート寒天培地中で生育可能な大腸菌群以外の微生物は認められなかったため、微生物熱量計における発熱は大腸菌群によるものと考えられ、図１４に示すように、熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間は、豚挽肉乳剤原液では６．３時間、１０倍希釈液では８．１時間、１００倍希釈液では１０．０時間、１０００倍希釈液では１２．３時間、１０００倍希釈液では１６．１時間と、初期大腸菌群数が多い試料ほど短時間で発熱を開始した。また、初期大腸菌群数と１００μＶに達するまでの時間との相関性を調べたところ、Ｒ２＝０．９７１７と高い相関性が認められた（図１５）。
【００６９】
このように、豚挽肉中の一般生菌数及び大腸菌群数について、測定に使用する円柱状寒天培地を選択することで、目的に適う菌数を微生物熱量計によって迅速かつ正確に測定できることが判明した。
【符号の説明】
【００７０】
１０…球形寒天培地
１２…回転楕円体形寒天培地
２０…円柱形寒天培地
２２…楕円柱形寒天培地
３０…三角柱形（多角柱形）寒天培地
３２…四角柱形（多角柱形）寒天培地
３４…六角柱形（多角柱形）寒天培地
４０…星型五角柱形（星型多角柱形）寒天培地
４２…星型六角柱形（星型多角柱形）寒天培地
５０…星型正十二面体形（星型多面体形）寒天培地
５２…六十面体形（星型多面体形）寒天培地
６０…円錐形寒天培地
６２…楕円錐形寒天培地
７０…円錐台形寒天培地
７２…楕円錐台形寒天培地
８０…三角錐形（多角錐形）寒天培地
８２…四角錐形（多角錐形）寒天培地
８４…六角錐形（多角錐形）寒天培地
９０…三角錐台形（多角錐台形）寒天培地
９２…四角錐台形（多角錐台形）寒天培地
９４…六角錐台形（多角錐台形）寒天培地
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物熱量計を用いた食品中の菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品中の菌数は、その食品の衛生度の指標となる。そのため、食品業においては、製品の微生物学的な品質を保証するため、製品だけではなく、製品の原材料や製造過程で調製される中間原料など、食品中の菌数を迅速に測定することが極めて重要である。
【０００３】
従来、菌数の測定は、平板寒天培養法によって行われる。すなわち、段階的に希釈した試料を寒天培地に塗抹あるいは混釈培養し、１〜２日後に寒天培地上に出現したコロニーを計数することで菌数を算出する。しかし、平板寒天培養法は、コロニーが出現するまでに長時間を必要とするため、食品中の菌数を迅速に測定することができない。また、試料や培地の調製にコストや労力を費やすという欠点もある。
【０００４】
このような背景から、迅速に食品中の菌数を測定する方法の一つとして、微生物熱量計を用いた菌数の測定方法が開発されている。すなわち、微生物が増殖する際に放出する代謝熱を熱量計で測定し、所定の熱量計出力値に達する時間と食品中の初期菌数との相関性に基づき食品中の菌数を測定するものである。例えば、佐藤らは、豚肉片を微生物熱量計の測定用容器に直接収めて測定する方法（直接法）と豚肉片の乳剤を液体培地に添加して測定用容器内で静置培養する方法（間接法）を検討し、直接法及びトリプトソイブイヨン（ＴＳＢ)液体培地を用いた間接法によって豚肉中の一般生菌数を測定できることを報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】佐藤善博ら、「獣医畜産新報」、１９９０、４３（１２）、ｐ．７６８−７７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物熱量計を用いた菌数の測定方法における直接法では、検体となる食品を微生物熱量計の測定用容器に直接収め、該食品中に存在する微生物の増殖に伴う代謝熱を測定することで該食品中の菌数を算出する。しかし、水分活性の低い食品や微生物の生育が定常期に達している発酵食品などは、その食品中では増殖することができないために該食品中の菌数を測定することができないといった問題がある。
【０００７】
一方、液体培地を用いた間接法では、該食品の乳剤を液体培地中に添加し、該食品中に存在する微生物の増殖に伴う代謝熱を測定することで該食品中の菌数を算出する。しかし、納豆などの好気性細菌が優勢な食品では、液体培地中の溶存酸素濃度が低く、微生物熱量計に静置条件下で設置した液体培地中では増殖することができないために該食品中の菌数を測定することができないといった問題がある。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、様々な食品中の菌数を測定することができる微生物熱量計を用いた菌数の測定方法及び該測定方法に用いる寒天培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、所定の形状の寒天培地を用いることで、水分活性の低い食品や微生物の生育が定常期に達している発酵食品、好気性細菌が優勢な食品など、様々な食品中の菌数を微生物熱量計によって迅速で正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、測定に使用する塊状の寒天培地を測定用容器中に投入し所定の温度に平衡化する工程と、前記寒天培地に流動性を有する試料を添加する工程と、試料が添加された寒天培地を一定温度で保持しながら発生する熱量を測定する工程と、を有することを特徴とする、微生物熱量計を用いた菌数の測定方法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、微生物熱量計による菌数の測定に用いる寒天培地であって、寒天培地が、塊状である、微生物熱量計用寒天培地を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る微生物熱量計を用いた食品中の菌数の測定方法によれば、迅速で正確に様々な食品中の菌数を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本実施形態に係る菌数の測定方法を説明した図である。
【図２】本実施形態に係る寒天培地の形状の一例を示した図である。
【図３】菌数が異なる各種納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図４】熱量計出力値１５０μＶに達する時間と各種濃度の納豆菌懸濁液の初期菌数との相関関係を示す図である。
【図５】測定に使用した円柱状寒天培地を示す図である。
【図６】異なる粒径の円柱状寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図７】異なる粒数の円柱状乾燥ブイヨン寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図８】異なる培地成分濃度の円柱状乾燥ブイヨン寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図９】異なる寒天濃度の円柱状乾燥ブイヨン寒天培地を用いた納豆菌懸濁液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１０】希釈段数が異なるホタテ抽出液の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１１】熱量計出力値１００μＶに達する時間とホタテ抽出液の希釈段数との相関関係を示す図である。
【図１２】一般生菌数が異なる豚挽肉乳剤の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１３】熱量計出力値１００μＶに達する時間と各種濃度の豚挽肉乳剤の初期一般生菌数との相関関係を示す図である。
【図１４】大腸菌群数が異なる豚挽肉乳剤の熱量計出力曲線を示す図である。
【図１５】熱量計出力値１００μＶに達する時間と各種濃度の豚挽肉乳剤の初期大腸菌群数との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態における微生物熱量計を用いた食品中の菌数の測定方法について説明する。図１は、本実施形態に係る菌数の測定方法を説明するための図である。
【００１５】
本実施形態における微生物熱量計は、従来から知られている微生物熱量計を用いることができる。
【００１６】
本実施形態において、微生物熱量計に用いる測定用容器を滅菌し、これに滅菌した塊状の寒天培地を無菌的に投入し、恒温器中で所定の温度に平衡化する（Ｓ１）。次いで、この平衡化した測定用容器内の寒天培地上に菌数の測定に用いる流動性を有する試料を速やかに添加する（Ｓ２）。なお、寒天培地を投入した該測定用容器および微生物熱量計内の温度を事前に所定の温度に平衡化することによって測定開始直後の微生物熱量計の熱量計出力値を安定させることができ、これにより、微生物の増殖に伴う代謝熱の熱量を正確に測定することができる。
【００１７】
前記寒天培地は、対象となる微生物が増殖できれば特に限定されず、例えば、乾燥ブイヨン寒天培地、普通寒天培地、標準寒天培地、デソキシコレート寒天培地などを挙げることができる。
【００１８】
前記寒天培地の形状は、微生物熱量計に用いる測定用容器内に入れることができる塊状であれば特に限定されないが、表面積の広さ及び成型加工性の観点から、図２に示す球形１０、回転楕円体形１２、円柱形２０、楕円柱形２２、多角柱形３０〜３４、星形多角柱形４０及び４２、星型多面形５０及び５２、円錐形６０、楕円錐形６２、円錐台形７０、楕円錐台形７２、多角錐形８０〜８４又は多角錐台形９０〜９４が好ましい。また、これら形状の寒天培地を単独又は複数混合して用いることができる。
【００１９】
前記寒天培地の成型方法は、測定に使用する寒天培地を所望の形状に成型することができれば特に限定されないが、成型加工性の観点から、平板寒天培地を調製した後、該平板寒天培地から所望の形状の型を用いて型抜きする方法及び所望の形状の型に寒天培地を流し込み成型する方法が好ましい。
【００２０】
前記寒天培地の寒天濃度は、寒天濃度が低い場合には成型した寒天培地が容易に崩れてしまい、一方で、寒天濃度が高い場合には成型時の型に寒天が粘着して取り出す際に寒天培地が壊れてしまうため、寒天培地の形状維持の観点から、２．５〜５．０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００２１】
前記寒天培地の総表面積は、総表面積が広い場合にはこぼれることなく寒天表面上に添加することが可能な食品乳剤の量が多くなり、結果としてバイアル中の総菌数を増やすことができるため、好気性細菌が十分に増殖できる観点から、１６ｃｍ２以上が好ましく、２４ｃｍ２以上がより好ましい。
【００２２】
前記塊状の寒天培地は、一定空間内における寒天培地の表面積を確保するため、１個当たりの寒天培地の体積が小さすぎる場合では寒天培地間の接触面積が増加して全寒天培地の露出している総表面が減少すること、全寒天培地の総体積が大きすぎる場合では酸素供給を行うヘッドスペースが減少すること、および実用性の観点から、１個当たりの体積が０．４〜０．９ｃｍ３で、５〜１０個を測定用容器に投入することが好ましい。
【００２３】
本実施形態において、試料が固形状の食品の場合には、該食品をストマッカー処理やホモジナイズ処理等によって流動状に調製したものを用いる。一方、液状の食品や飲料等は、そのまま使用することができる。
【００２４】
前記流動性を有する試料を、測定用容器内の寒天培地に添加し密封した後（Ｓ２）、試料が寒天培地表面全体に塗布されるように測定用容器を軽く振ることで寒天培地と試料とを十分に接触させ、これを微生物熱量計内で一定温度に保持する（Ｓ３）。これにより、試料中の微生物が寒天培地上で増殖を開始し、該微生物の増殖に伴う代謝熱の熱量を連続的に測定する（Ｓ４）。
【００２５】
また、菌数を算出するにあたっては、あらかじめ平板寒天培養法によって測定した菌数が既知の流動性を有する試料を用いて同様の方法で熱量を測定し、初期菌数と所定の熱量計出力値に達する時間との関係を示す検量線を作成することで、菌数が未知の試料について、所定の熱量計出力値に達する時間から該試料の初期菌数を算出する（Ｓ５）。
【００２６】
次に、本発明の実施形態における微生物熱量計用寒天培地について説明する。
【００２７】
本実施形態における寒天培地の種類は、対象となる微生物が増殖できれば特に限定されず、例えば、乾燥ブイヨン寒天培地、普通寒天培地、標準寒天培地、デソキシコレート寒天培地などを挙げることができる。
【００２８】
前記寒天培地の形状は、微生物熱量計に用いる測定用容器（バイアル）内に入れることができる塊状であれば特に限定されないが、表面積の広さ及び成型加工性の観点から、図２に示す球形１０、回転楕円体形１２、円柱形２０、楕円柱形２２、多角柱形３０〜３４、星形多角柱形４０及び４２、星型多面形５０及び５２、円錐形６０、楕円錐形６２、円錐台形７０、楕円錐台形７２、多角錐形８０〜８４又は多角錐台形９０から９４が好ましい。
【００２９】
前記寒天培地の寒天濃度は、寒天濃度が低い場合には成型した寒天培地が容易に崩れてしまい、一方で、寒天濃度が高い場合には成型時の型に寒天が粘着して取り出す際に寒天培地が壊れてしまうため、寒天培地の形状維持の観点から、２．５〜５．０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００３０】
前記寒天培地の総表面積は、総表面積が広い場合にはこぼれることなく寒天表面上に添加することが可能な食品乳剤の量が多くなり、結果としてバイアル中の総菌数を増やすことができるため、好気性細菌が十分に増殖できる観点から、１６ｃｍ２以上が好ましく、２４ｃｍ２以上がより好ましい。
【００３１】
前記寒天培地の成型方法は、測定に使用する寒天培地を所望の形状に成型することができれば特に限定されないが、成型加工性の観点から、平板寒天培地を調製した後、該平板寒天培地から所望の形状の型を用いて型抜きする方法及び所望の形状の型に寒天培地を流し込み成型する方法が好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００３３】
１．納豆菌の菌数
試料として、納豆菌粉末（成瀬発酵化学研究所社製）２５ｍｇを０．１％ペプトン水１０ｍＬに懸濁した納豆菌懸濁液を用いた。また、調製した納豆菌懸濁液を原液として段階的に０．１％ペプトン水で１０倍、１００倍及び１０００倍に希釈することで各種納豆菌懸濁希釈液を調製した。なお、納豆菌懸濁液希釈中の菌数を常法に従って標準寒天培地を用いた平板培養法によって測定したところ、原液中の菌数は４．３８×１０４ＣＦＵ／３００μＬであった。希釈倍率より算出することで、１０倍希釈液中は４．３８×１０３ＣＦＵ／３００μＬ、１００倍希釈液中は４．３８×１０２ＣＦＵ／３００μＬ、１０００倍希釈液中は４．３８×１０１ＣＦＵ／３００μＬとした。
【００３４】
微生物熱量計（Ａｎｔａｒｅｓ０２０４ＦＰ型；けいはんな文化学術協会微生物計測システム研究所製）の平衡化は、３５℃で２４時間保持することで行った。
【００３５】
測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。なお、調製した円柱状寒天培地を図５に示した。
【００３６】
前記円柱状寒天培地１０粒を空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量を測定することで熱量計出力値が１５０μＶに到達するまでの時間を調べた。また、その結果を図３に示した。
【００３７】
図３に示すように、全ての場合において、熱量計出力曲線は左右対称に近い形を示し、菌の増殖に伴う代謝熱を良好に測定することができた。また、熱量計出力値が１５０μＶに到達するまでの時間は、納豆菌原液では７．４時間、１０倍希釈液では９．０時間、１００倍希釈液では１０．６時間、１０００倍希釈液では１１．７時間と、初期菌数が多い試料ほど短時間であった。さらに、初期菌数と１５０μＶに達するまでの時間との相関関係を調べたところ、Ｒ２＝０．９９２９と高い相関性が認められた（図４）。
【００３８】
このように、好気性細菌である納豆菌の菌数について、円柱状寒天培地を用いた微生物熱量計によって迅速かつ正確に測定できることが判明した。
【００３９】
２．培地の種類及び粒径について
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の種類及び粒径の影響について、以下の検討を行った。
【００４０】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、普通寒天培地の場合では、普通寒天培地（日水製薬社製）１．７５ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）０．５ｇ（寒天終濃度２．５％（ｗ／ｖ））を純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。一方、乾燥ブイヨン寒天培地の場合では、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）１．５ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これら寒天培地をそれぞれ無菌的にシャーレ内に入れて、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径８ｍｍ、１０ｍｍ又は１２ｍｍのパンチャーでそれぞれ型抜きすることで各種円柱状寒天培地を調製した。
【００４１】
上記各種円柱状寒天培地の総重量、総表面積及び総体積がそれぞれ出来るだけ同様となるように、直径が８ｍｍの場合は１０粒、直径が１０ｍｍの場合は７粒、直径が１２ｍｍの場合は５粒を空の測定用容器（バイアル）にそれぞれ入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行った（図６）。また、１バイアル中の各種寒天培地の総表面積を表１に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁液（原液）を用いた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
図６に示すように、乾燥ブイヨン寒天培地を用いた場合には、普通寒天培地を用いた場合と比べて短時間で発熱が開始したが、最大出力値は普通寒天培地の方が高い値を示した。一方、普通寒天培地及び乾燥ブイヨン寒天培地ともに、それぞれ円柱の直径が異なる寒天培地を用いても同様の熱量計出力曲線を得ることができた。
【００４４】
このように、乾燥ブイヨン寒天培地又は普通寒天培地のどちらを用いても熱量を十分に測定することができた。また、試験した範囲内において、寒天培地の粒径の違いによる熱量計出力曲線の差異はなかった。
【００４５】
３．培地の表面積及び体積について
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の表面積及び体積の影響について、以下の検討を行った。
【００４６】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）１．５ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００４７】
上記円柱状寒天培地２粒、４粒、６粒、８粒又は１０粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行うとともに、内径３０ｍｍ、高さ６５ｍｍの測定用容器（バイアル）内に調製した該培地の平板寒天培地（培地量として５ｍｌ又は２０ｍｌ添加）についても同様に熱量の測定を行った（図７）。また、１バイアル中の寒天培地の総表面積を表２に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁原液を用いた。
【００４８】
【表２】
【００４９】
総表面積及び総体積について、図７に示すように、測定用容器（バイアル）に入れる円柱状寒天培地の粒数が４〜１０粒（総表面積１６．４〜４１．０ｃｍ２：総体積２．５〜６．３ｃｍ３）の場合、平板寒天培地（表面積７．１ｃｍ２：総体積５．０及び２０．０ｃｍ３）の場合と比べて熱量計出力値が高い値を示した。また、円柱状寒天培地の粒数が２粒（培地の総表面積８．２ｃｍ２：総体積１．３ｃｍ３）の場合では、平板寒天培地を用いた場合と同様の経過を示した。
【００５０】
４．培地濃度
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の培地濃度の影響について、以下の検討を行った。
【００５１】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）０．３７５ｇ、０．７５ｇ、１．５ｇ又は３．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地をそれぞれ調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００５２】
上記各種円柱状寒天培地７粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行った。また、その結果を図８に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁原液を用いた。
【００５３】
図８に示すように、純水５０ｍＬに対する乾燥ブイヨン粉末（日水製薬社製）の添加量が１．５ｇ及び３．０ｇの場合に最も短時間で発熱を開始した。また、乾燥ブイヨン粉末（日水製薬社製）の添加量が多いほど、すなわち、培地成分量が多いほど最大出力値が高い値を示した。
【００５４】
５．寒天濃度
熱量計出力曲線に及ぼす寒天培地の寒天濃度の影響について、以下の検討を行った。
【００５５】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．２５ｇ、１．７５ｇ又は２．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地をそれぞれ調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。なお、細菌用粉末寒天（日水製薬社製）０．７５ｇ添加の場合では、以下に示す円柱状寒天培地に試料を接種した後、円柱状寒天培地全体に行き渡らせるために軽く振ることで円柱状寒天培地が崩れてしまったので、試験に用いることができなかった。
【００５６】
上記各種円柱状寒天培地７粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量の測定を行った。また、その結果を図９に示した。なお、試料は上記１．の納豆菌懸濁原液を用いた。
【００５７】
図９に示すように、全ての場合において、発熱を開始する時期が同じであったが、寒天濃度が高くなるほど最大出力値が高くなる傾向を示した。
【００５８】
６．乾燥ホタテ貝柱抽出液の発熱測定
試料の調製は、乾燥ホタテ１粒（６．７７ｇ）を滅菌水１０ｍＬに加え、常温で１日間保持することで行った。また、調製したホタテ抽出原液を段階的に０．１％ペプトン水で１０倍、１００倍及び１０００倍希釈することで各種ホタテ抽出希釈液を調製した。
【００５９】
微生物熱量計の平衡化は、上記１．と同様に行った。また、測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の各種寒天培地をそれぞれ調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００６０】
上記円柱状寒天培地１０粒をそれぞれ空の測定用容器（バイアル）に入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、前記試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量を測定することで熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間を調べた。また、その結果を図１０に示した。
【００６１】
図１０に示すように、熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間は、ホタテ抽出原液では２．９時間、１０倍希釈液では４．８時間、１００倍希釈液では６．７時間、１０００倍希釈液では８．８時間と、初期一般生菌数が多い試料ほど短時間で発熱を開始した。また、希釈段数と１００μＶに達するまでの時間との相関性を調べたところ、Ｒ２＝０．９９８８と高い相関性が認められた（図１１）。
【００６２】
実際に乾燥ホタテ貝柱の一般生菌数推定を行うためには、無菌的にミキサー等で粉砕した後、希釈水を添加したものを熱量計に供する必要があるが、乾燥ホタテのような水分活性の低いサンプルであっても、微生物熱量計による円柱状寒天培地を用いた一般生菌数の測定方法によってその一般生菌数を迅速かつ正確に測定することが可能と考えられる。
【００６３】
７．豚挽肉中の一般生菌数及び大腸菌群数
試料として、２０℃で一晩放置することで増菌させた市販豚挽肉２５ｇを滅菌した０．１％ペプトン水２２５ｍＬに添加した後、ストマッカー処理して調製した豚挽肉乳剤を用いた。また、該豚挽肉乳剤を原液として段階的に滅菌した０．１％ペプトン水で１０倍、１００倍、１０００倍及び１００００倍に希釈することで各種豚挽肉乳剤希釈液を調製した。なお、これら豚挽肉中の一般生菌数及び大腸菌群数を常法に従って平板培養法によって測定した。すなわち、標準寒天培地を用いて測定した豚挽肉乳剤原液中の一般生菌数は、５．７×１０７ＣＦＵ／ｇで、１０倍希釈液中は５．７×１０６ＣＦＵ／ｇ、１００倍希釈液中は５．７×１０５ＣＦＵ／ｇ、１０００倍希釈液中は５．７×１０４ＣＦＵ／ｇ、１００００倍希釈液中は５．７×１０３ＣＦＵ／ｇであった。一方、デソキシコレート培地を用いて測定した豚挽肉乳剤原液中の大腸菌群数は、（１．７５×１０８ＣＦＵ／ｇ）で、１０倍希釈液中は（１．７５×１０７ＣＦＵ／ｇ）、１００倍希釈液中は（１．７５×１０６ＣＦＵ／ｇ）、１０００倍希釈液中は（１．７５×１０５ＣＦＵ／ｇ）、１００００倍希釈液中は（１．７５×１０４ＣＦＵ／ｇ）であった。
【００６４】
微生物熱量計（Ａｎｔａｒｅｓ０２０４ＦＰ型；けいはんな文化学術協会微生物計測システム研究所製）の平衡化は、３５℃で２４時間保持することで行った。
【００６５】
測定に使用する寒天培地の調製は、以下のように行った。すなわち、一般生菌数を測定する場合、乾燥ブイヨン（日水製薬社製）２．０ｇ及び細菌用粉末寒天（日水製薬社製）１．５ｇを純水５０ｍＬに加えてオートクレーブ滅菌した。これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。一方、大腸菌群数を測定する場合、デソキシコレート寒天培地（日水製薬社製）２．２５ｇを純水５０ｍＬに加えて加熱溶解した後、これを無菌的にシャーレ内に入れ、厚さ８ｍｍの平板状の寒天培地を調製し、あらかじめ滅菌した直径１０ｍｍのパンチャーで型抜きすることで円柱状寒天培地（直径１０ｍｍ、高さ８ｍｍ）を調製した。
【００６６】
前記の各種円柱状寒天培地１０粒を空の測定用容器（バイアル）にそれぞれ入れ密封条件下で２〜３時間、３５℃で平衡化した後、試料３００μＬを接種し、軽く振って試料を円柱状寒天培地全体に行き渡らせた後、微生物熱量計に設置し、設置３０分間後から熱量を測定することで熱量計出力値が１００μＶに到達するまでの時間を調べた（図１２及び１４）。
【００６７】
豚挽肉中の一般生菌数について、図１２に示すように、熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間は、豚挽肉乳剤原液では４．６時間、１０倍希釈液では５．９時間、１００倍希釈液では７．２時間、１０００倍希釈液では１０．０時間、１０００倍希釈液では１２．４時間と、初期一般生菌数が多い試料ほど短時間で発熱を開始した。また、初期一般生菌数と１００μＶに達するまでの時間との相関性を調べたところ、Ｒ２＝０．９６９９と高い相関性が認められた（図１３）。
【００６８】
一方、豚挽肉中の大腸菌群数について、豚挽肉中にはデソキシコレート寒天培地中で生育可能な大腸菌群以外の微生物は認められなかったため、微生物熱量計における発熱は大腸菌群によるものと考えられ、図１４に示すように、熱量計の出力値が１００μＶに到達する時間は、豚挽肉乳剤原液では６．３時間、１０倍希釈液では８．１時間、１００倍希釈液では１０．０時間、１０００倍希釈液では１２．３時間、１０００倍希釈液では１６．１時間と、初期大腸菌群数が多い試料ほど短時間で発熱を開始した。また、初期大腸菌群数と１００μＶに達するまでの時間との相関性を調べたところ、Ｒ２＝０．９７１７と高い相関性が認められた（図１５）。
【００６９】
このように、豚挽肉中の一般生菌数及び大腸菌群数について、測定に使用する円柱状寒天培地を選択することで、目的に適う菌数を微生物熱量計によって迅速かつ正確に測定できることが判明した。
【符号の説明】
【００７０】
１０…球形寒天培地
１２…回転楕円体形寒天培地
２０…円柱形寒天培地
２２…楕円柱形寒天培地
３０…三角柱形（多角柱形）寒天培地
３２…四角柱形（多角柱形）寒天培地
３４…六角柱形（多角柱形）寒天培地
４０…星型五角柱形（星型多角柱形）寒天培地
４２…星型六角柱形（星型多角柱形）寒天培地
５０…星型正十二面体形（星型多面体形）寒天培地
５２…六十面体形（星型多面体形）寒天培地
６０…円錐形寒天培地
６２…楕円錐形寒天培地
７０…円錐台形寒天培地
７２…楕円錐台形寒天培地
８０…三角錐形（多角錐形）寒天培地
８２…四角錐形（多角錐形）寒天培地
８４…六角錐形（多角錐形）寒天培地
９０…三角錐台形（多角錐台形）寒天培地
９２…四角錐台形（多角錐台形）寒天培地
９４…六角錐台形（多角錐台形）寒天培地
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物熱量計を用いた食品中の菌数を測定する方法であって、
測定に使用する塊状の寒天培地を測定用容器中に投入し所定の温度に平衡化する工程と、
前記寒天培地に流動性を有する試料を添加する工程と、
試料が添加された寒天培地を一定温度で保持しながら発生する熱量を測定する工程と、
を有することを特徴とする、
微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項２】
前記塊状の寒天培地を複数個投入することを特徴とする、
請求項１に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項３】
前記寒天培地が、球形、回転楕円体形、円柱形、楕円柱形、多角柱形、星形多角柱形、星型多面形、円錐形、楕円錐形、円錐台形、楕円錐台形、多角錐形、多角錐台形からなる群から選ばれる１種又は２種以上からなることを特徴とする、
請求項１又は２に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項４】
前記寒天培地の総表面積が、１６ｃｍ２以上であることを特徴とする、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項５】
前記寒天培地の寒天濃度が、２．５％（ｗ/ｖ）〜５．０％（ｗ/ｖ）であることを特徴とする、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項６】
前記流動性を有する試料が、食品を均質化処理したもの、食品を水抽出処理したもの、液状の食品、飲料のいずれか１種であることを特徴とする、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項７】
微生物熱量計による菌数の測定に用いられる寒天培地であって、
寒天培地が、塊状に形成された、
微生物熱量計用寒天培地。
【請求項８】
前記寒天培地が、球形、回転楕円体形、円柱形、楕円柱形、多角柱形、星形多角柱形、星型多面形、円錐形、楕円錐形、円錐台形、楕円錐台形、多角錐形、多角錐台形のいずれかの形状である、
請求項７に記載の微生物熱量計用寒天培地。
【請求項９】
前記寒天培地の総表面積が、１６ｃｍ２以上である、
請求項７又は８に記載の微生物熱量計用寒天培地。
【請求項１０】
前記寒天培地の寒天濃度が、２．５％（ｗ/ｖ）〜５．０％（ｗ/ｖ）である、
請求項７〜９のいずれか１項に記載の微生物熱量計用寒天培地。
【請求項１】
微生物熱量計を用いた食品中の菌数を測定する方法であって、
測定に使用する塊状の寒天培地を測定用容器中に投入し所定の温度に平衡化する工程と、
前記寒天培地に流動性を有する試料を添加する工程と、
試料が添加された寒天培地を一定温度で保持しながら発生する熱量を測定する工程と、
を有することを特徴とする、
微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項２】
前記塊状の寒天培地を複数個投入することを特徴とする、
請求項１に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項３】
前記寒天培地が、球形、回転楕円体形、円柱形、楕円柱形、多角柱形、星形多角柱形、星型多面形、円錐形、楕円錐形、円錐台形、楕円錐台形、多角錐形、多角錐台形からなる群から選ばれる１種又は２種以上からなることを特徴とする、
請求項１又は２に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項４】
前記寒天培地の総表面積が、１６ｃｍ２以上であることを特徴とする、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項５】
前記寒天培地の寒天濃度が、２．５％（ｗ/ｖ）〜５．０％（ｗ/ｖ）であることを特徴とする、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項６】
前記流動性を有する試料が、食品を均質化処理したもの、食品を水抽出処理したもの、液状の食品、飲料のいずれか１種であることを特徴とする、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物熱量計を用いた菌数の測定方法。
【請求項７】
微生物熱量計による菌数の測定に用いられる寒天培地であって、
寒天培地が、塊状に形成された、
微生物熱量計用寒天培地。
【請求項８】
前記寒天培地が、球形、回転楕円体形、円柱形、楕円柱形、多角柱形、星形多角柱形、星型多面形、円錐形、楕円錐形、円錐台形、楕円錐台形、多角錐形、多角錐台形のいずれかの形状である、
請求項７に記載の微生物熱量計用寒天培地。
【請求項９】
前記寒天培地の総表面積が、１６ｃｍ２以上である、
請求項７又は８に記載の微生物熱量計用寒天培地。
【請求項１０】
前記寒天培地の寒天濃度が、２．５％（ｗ/ｖ）〜５．０％（ｗ/ｖ）である、
請求項７〜９のいずれか１項に記載の微生物熱量計用寒天培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−２２３１８１（Ｐ２０１２−２２３１８１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【公開請求】
【出願番号】特願２０１１−２７６３９４（Ｐ２０１１−２７６３９４）
【出願日】平成２３年１２月１６日（２０１１．１２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本食品保蔵科学会 日本食品保蔵科学会第６０回大会講演要旨集 ２０１１年６月１８日
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７６３９４（Ｐ２０１１−２７６３９４）
【出願日】平成２３年１２月１６日（２０１１．１２．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本食品保蔵科学会 日本食品保蔵科学会第６０回大会講演要旨集 ２０１１年６月１８日
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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