微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法
【課題】微生物細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を高める。
【解決手段】培養対象微生物を含む培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い、培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにした。
【解決手段】培養対象微生物を含む培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い、培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、微生物体の反応素過程において必ず使用されるエネルギー物質であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と生物細胞内の酸化還元酵素に関わり且つ細胞内で最も多い補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）について、これらの単位時間当たりの生産量を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在様々な分野で利用されている微生物は自然界に存在する全微生物の僅か１％に満たないと言われている。そこで、残り９９％の膨大な微生物資源を有効利用すべく、新たな概念に基づいて微生物の培養技術が各種開発されつつある。
【０００３】
例えば、特許文献１には、培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続して培養対象微生物に供給することにより培養対象微生物を選択的に培養する方法が開示されている。具体的には、六価クロムを溶解させてクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって増殖し難い環境とした培養液中で、六価クロムに対して還元活性を有するShewanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacter等のクロム還元菌を選択的に集積培養し、その際に、培養液中に流した電気により、クロム還元菌によって還元されて生成された三価クロムを酸化して六価クロムに再生しながら培養を行うようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−５５１３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の培養方法は、培養対象微生物の生育に必要な物質が還元されて減少するような状況下になければ適用しても効果が得られない。また、培養開始からある一定期間は培養対象微生物の生育に必要な物質が十分に存在している状態であることから、培養開始からある程度の培養期間が経過してその物質の量が大きく減少し始めるまでは微生物の十分な増殖効果は得られない。
【０００６】
ところで、微生物の生育や代謝といった機能は、アデノシン三リン酸（以下、単にＡＴＰと呼ぶこともある）により支えられていることが知られている。即ち、ＡＴＰは微生物体の反応素過程において必ず使用されるエネルギー物質である。また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、単にＮＡＤＨと呼ぶこともある）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、単にＮＡＤＰＨと呼ぶこともある）は微生物細胞内の酸化還元酵素に関わる細胞内で最も多い補酵素であり、１分子のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから３分子のＡＴＰが酸化的リン酸反応により合成されることも知られている。
【０００７】
このように、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、微生物の生育や代謝を担う極めて重要なエネルギー物質である。したがって、これらのエネルギー物質の微生物細胞内の単位時間当たりの生産量を高めることができれば、微生物全般に対し、その生育の活性化や機能の向上が図れるものと考えられる。
【０００８】
そこで、本発明は、微生物細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を高めることのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は硫酸還元菌を培養対象微生物として各種検討を積み重ねた。その結果、硫酸還元菌を培養する際の培養環境の電位を硫酸還元菌の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における硫酸還元菌の対数増殖期開始時までの期間において行うことによって、硫酸還元菌の細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上できることを知見するに至った。そしてこの結果から、微生物全般について、微生物細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上できる可能性が導かれ、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、請求項１に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法は、培養対象微生物を含む培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い、培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにしている。
【００１１】
ここで、請求項２に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法のように、至適電位の制御を培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行うことが好ましい。この場合には、培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量をより確実に向上させることができる。
【００１２】
尚、本明細書において、至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間とは、至適電位において培養対象微生物を培養したときの最終到達菌体密度と初期菌体密度（培養環境に植菌された菌体の密度）の差を２で割ることにより算出される菌体密度に到達するまでに必要な培養期間を意味している。
【００１３】
次に、請求項３に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法は、硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．６Ｖ以下に制御するとともに、電位の制御を少なくとも培養開始時からこの電位における硫酸還元菌の対数増殖期開始時までの期間において行い、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにしている。
【００１４】
ここで、請求項４に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法のように、電位の制御を培養開始時からこの電位における硫酸還元菌の対数増殖期中点までの期間において行うことが好ましい。この場合には、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量をより確実に向上させることができる。
【００１５】
次に、請求項５に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法は、硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．７Ｖに制御するとともに、電位の制御を少なくとも培養開始時から２４時間行い、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにしている。
【００１６】
ここで、請求項６に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法のように、電位の制御を培養開始時から３５時間行うことが好ましい。この場合には、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量をより確実に向上させることができる。
【発明の効果】
【００１７】
請求項１及び請求項２に記載の発明によれば、微生物の生育や代謝を担う極めて重要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させることができる。したがって、微生物全般に対して、増殖速度の向上と微生物の機能の向上を図ることができる。
【００１８】
請求項３〜請求項６に記載の発明によれば、硫酸還元菌の生育や代謝を担う極めて重要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させることができる。したがって、硫酸還元菌の増殖速度の向上と硫酸還元能の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の方法の実施に使用する装置の構成の一例を示す断面図である。
【図２】本発明の方法の実施に使用する装置の構成の他の例を示す断面図である。
【図３】本発明の方法の実施に使用する装置の構成のさらに他の例を示す断面図である。
【図４】図３に示す装置のより具体的な構成を示す断面図である。
【図５】硫酸還元菌の増殖とＡＴＰ濃度の経時変化を示す図である。
【図６】硫酸還元菌の細胞１個体当たりのＡＴＰ生産量の経時変化を示す図である。
【図７】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無によるＡＥＣ値の差異を示す図である。
【図８】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無によるＮＡＤ＋及びＮＡＤＨの濃度の差異を示す図である。
【図９】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無によるＮＡＤＰ＋及びＮＡＤＰＨの濃度の差異を示す図である。
【図１０】実施例において定量対象とした遺伝子の硫酸還元菌体内での機能を示す模式図である。
【図１１】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無による遺伝子転写量の解析結果を示す図である。
【図１２】通電の有無による乳酸分解速度の違いを示す図である。
【図１３】通電の有無による硫酸還元速度の違いを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２１】
本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法の実施形態の一例として微生物培養装置１を用いた場合について図１に基づいて説明する。本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法は、培養対象微生物２を含む培養環境４に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養環境４の電位を培養対象微生物２の至適電位に制御し、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期開始時までの期間において行うようにしている。これにより、培養対象微生物２の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることができる。
【００２２】
図１において、培養容器５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８とに仕切られている。培養槽７には培養液４ａが収容され、対極槽８には電解液４ｂが収容されている。培養槽７の培養液４ａには作用極９及び参照電極１１が浸漬され、対極槽８の電解液４ｂには対極１０が浸漬される。作用極９、対極１０及び参照電極１１は３電極式の電位制御装置（ポテンシオスタット）１２に結線され、培養液４ａに浸漬されている作用極９の電位を厳密に制御可能としている。
【００２３】
ここで、培養槽７の培養液４ａには、酸化還元物質３がさらに添加される。酸化還元物質３としては、培養液４ａに浸漬されている作用極９において可逆的に酸化還元反応を生じ得る物質であって、尚かつ培養対象微生物２に対して毒性を呈しない物質であればよい。具体的には、例えば土壌成分として一般的な鉄イオンが挙げられる。鉄イオンは以下に示す化学反応式１により酸化体と還元体に可逆的に変化する物質である。
Ｆｅ（III） ＋ ｅ− ＝ Ｆｅ（II） ・・・・・（化学反応式１）
【００２４】
尚、鉄イオンを培養液４ａ中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させることが好ましい。キレート剤としては、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができるが、鉄イオンを配位させうるキレート剤であれば、上記のキレート剤には限定されない。
【００２５】
また、酸化還元物質３として、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲン等を用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により酸化体と還元体に可逆的に変化する。特に、キノン化合物は土壌成分の一つとして知られている物質であることから、土壌そのものを培養液４ａに添加することで、土壌に含まれている酸化還元物質３により培養液４ａの電位を制御できる場合がある。但し、酸化還元物質３は上記した物質に限定されるものではない。
【００２６】
尚、酸化還元物質３の添加量は、培養液４ａの電位を制御しうる量であれば特に限定されないが、培養液４ａの酸化還元物質３の濃度を０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることが好適である。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満とすると培養液４ａの電位の制御を十分に行うことができない可能性があり、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると培養液４ａに完全に溶解しなかったり、微生物の生育阻害を生じる可能性がある。
【００２７】
ここで、電子受容体物質１３を培養液４ａに添加してもよい。電子受容体物質１３としては、培養対象微生物２の呼吸源となる物質であれば特に限定されない。例示すると、ＰＣＥ脱塩素微生物に対してテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、ＤＣＥ脱塩素微生物に対してジクロロエチレン（ＤＣＥ）、ＶＣ脱塩素微生物に対して塩化ビニル、硝酸還元菌に対して硝酸イオン、硫酸還元菌に対して硫酸イオン、メタン生成菌に対して二酸化炭素、クロロベンゼン脱塩素微生物に対してクロロベンゼン、クロロフェノール脱塩素微生物に対してクロロフェノール、クロム還元菌に対してクロムイオン、キノン還元菌に対してキノン、水銀還元菌に対して水銀イオン、カドミウム還元菌に対してカドミウムイオン、鉄還元菌に対して鉄イオンが挙げられる。
【００２８】
培養液４ａの電位（酸化還元電位）は、数式１に示すネルンストの式により表される。
Ｅ＝Ｅ０＋ＲＴ／ｎＦ×ｌｎ（Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ）・・・・・（数式１）
【００２９】
数式１において、Ｅは溶液（培養液４ａ）の酸化還元電位、Ｅ０は酸化還元物質３の標準酸化還元電位、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｎは反応電子数、Ｆはファラデー定数、Ｃｏｘは酸化体の濃度、Ｃｒｅｄは還元体の濃度である。つまり、培養液４ａに含まれる酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４ａ自体の酸化還元電位を制御することができる。尚、酸化還元物質３が培養液４ａの酸化還元電位を決定する要素であり、培養液４ａの組成は酸化還元電位にほとんど影響を与えることがない。
【００３０】
３極式の電位制御装置１２では、作用極９と参照電極１１の電位差を測定し、測定した電位差が設定電位Ｖに達するように作用極９と対極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極には一切電流が流れないようにしている。このようにして作用極９の電位を設定電位Ｖに制御し続けることによって、酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御し続けることができる。したがって、例えば培養液７に投入された微生物が酸化還元物質３を酸化あるいは還元することによりＣｏｘ／Ｃｒｅｄ（酸化体と還元体の濃度比）が変化した場合でも、所定のＣｏｘ／Ｃｒｅｄに制御して、培養液４ａの酸化還元電位を一定値に維持することができる。尚、培養液４ａの酸化還元電位は、作用極９の設定電位Ｖに相当する。
【００３１】
ここで、作用極９の設定電位Ｖは、参照電極１１に対する作用極９の電位に相当することから、参照電極１１の種類によってその値が変化する。本明細書における設定電位Ｖは、標準水素電極に対して＋０．２２Ｖを示す銀・塩化銀電極電位に対する値としているが、参照電極１１の種類は銀・塩化銀電極に限られるものではない。
【００３２】
培養容器５を二層に区画しているイオン交換膜６は、酸化還元物質３を対極槽８側に透過させることなく、イオンのみを透過させて、培養槽７と対極槽８との間でイオン交換膜６を介してイオン電流を伝達させるものである。例えば、イオン交換膜６を一価の陽イオンのみを透過する膜とし、酸化還元物質３を鉄イオン（二価及び三価）とすれば、酸化還元物質３を培養槽７の培養液４ａに留めたままで、培養液４ａ及び電解液４ｂのイオン（水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン）などの一価の陽イオンがイオン交換膜６を通過して、培養槽７と対極槽８との間でイオン電流を伝達させることができる。その結果、培養液４ａの酸化還元電位が所定の値に長期間維持されることになる。ここで、対極槽８に収容する電解液４ｂについては、イオン交換膜６を透過しうるイオンを組成に有していれば特に限定されるものではない。尚、電解液４ｂとして培養液４ａを用いてもよい。
【００３３】
培養対象微生物２の至適電位は、以下に説明する微生物の増殖評価試験から導き出すことができる。即ち、電位以外の培養条件を全て揃え、電位をある範囲内、例えば−１．０Ｖ〜＋１．０Ｖの範囲内で各種条件振りして培養実験を行う。また、通電しない（電位制御を行わない）場合についても同様に培養実験を行う。そして、対数増殖期の開始時を判断可能な期間で培養を行い、対数増殖期の開始時が通電しない場合と比較して早まった場合、その電位を培養対象微生物２の至適電位と判断することができる。
【００３４】
例えば硫酸還元菌の場合、至適電位は銀・塩化銀電極電位基準で−０．６Ｖ以下であり、より好適には−０．６Ｖ〜−０．９Ｖであり、さらに好適には−０．７Ｖである。−０．９Ｖよりも小さくすると、対極１０からの水素発生量が増加しすぎて酸化還元電位の制御が正確に行えなくなる虞がある。
【００３５】
至適電位の制御は、少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期開始時までの期間において行うことが好ましい。この期間に至適電位の制御を行うことによって、培養対象微生物２の細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が得られる。ここで、至適電位の制御は、培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期中点までの期間において行うことがより好ましい。この場合には、培養対象微生物２の細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果がより確実に得られる。尚、培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期中点までの期間を超えて至適電位の制御を行っても、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果は殆ど得られなくなる。
【００３６】
培養対象微生物２を硫酸還元菌とする場合には、上記至適範囲の電位に制御し、この至適範囲に電位を制御した際の硫酸還元菌の増殖曲線を調べておく。そして、得られた増殖曲線から、対数増殖期開始時と対数増殖期中点を求めることにより、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が得られる電位制御期間を導き出すことができる。
【００３７】
例えば硫酸還元菌を培養対象微生物２とした場合において、至適電位を−０．７Ｖとすると、対数増殖期開始時は培養開始時から２４時間となり、対数増殖期中点は培養開始時から３５時間となる。したがって、電位の制御は少なくとも培養開始時から２４時間行うことが好ましいことになり、培養開始時から３５時間行うことがより好ましいことになる。本願発明者等の実験によれば、実際にこの期間においてＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果が得られることが確認されている。、また、培養開始時から３５時間を超えて至適電位の制御を行っても、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果は殆ど得られなくなることも本願発明者等の実験により確認されている。
【００３８】
尚、本発明によれば、エネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果に加えて、呼吸や複製・分裂に関与する遺伝子の転写活性化効果及び呼吸酵素群での電子移動反応の活性化効果が得られることが確認された。即ち、本発明によれば、培養対象微生物２のエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させることによって、細胞内における利用可能なエネルギー量が多くなり、その結果として、呼吸や複製・分裂に関与する遺伝子の転写活性化効果及び呼吸酵素群での電子移動反応の活性化効果が得られるものと考えられる。また、エネルギー生産と呼吸は酸化的リン酸化経路において密接に関連していることから、電位制御によって呼吸酵素群が活性化したり、さらには電位制御によって呼吸に関与する遺伝子が活性化した結果として呼吸酵素群が活性化したりすることにより、エネルギー物質の単位時間当たりの生産量が向上することも考えられる。つまり、本発明によれば、これらの効果も相俟ってエネルギー物質の生産効率が極めて優れたものになると考えられる。
【００３９】
以上、本発明によれば、微生物の細胞内の種々の反応の根幹をなすエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上させる効果が得られることから、細胞内の利用可能エネルギーを高めることができる。したがって、これらのエネルギー物質を利用した微生物反応によりバイオプロセスを実施する場合に、微生物の機能を早期に向上させてバイオプロセスを早期に安定に立ち上げることが可能になる。また、環境中において休眠している微生物の細胞内の利用可能エネルギーを高めて、その増殖に関与する細胞内反応を活性化させることにより、難培養微生物を増殖することが可能になるものと考えられる。
【００４０】
また、本発明と特開２００６−５５１３４号公報に記載された発明とを組み合わせることで、優れた効果が発揮される場合がある。特開２００６−５５１３４号公報に記載された発明は、培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続して培養対象微生物に供給することにより培養対象微生物を選択的に培養する方法である。しかしながら、上記の通り、この方法によると、培養開始からある一定期間は培養対象微生物の生育に必要な物質が十分に存在している状態であることから、培養開始からある程度の培養期間が経過してその物質の量が大きく減少し始めるまでは微生物の十分な増殖効果は得られない。そこで、本発明の方法により、至適電位の制御を、少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い
、より好ましくは培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行い、培養対象微生物の細胞内のＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させて、その増殖及び呼吸能を早期に誘導させ、その後に培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続して培養対象微生物に供給することにより、微生物の培養及び維持を長期にわたり行うことができる。即ち、本発明による培養対象微生物の細胞内のＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果によって付随的に培養対象微生物に必要な物質が還元されて減少してしまうが、本発明の方法を実施した後に、培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続することで、長期にわたって培養対象微生物の増殖及び維持することができる。
【００４１】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００４２】
例えば、上述の実施形態では、培養対象微生物２を培養液４ａに添加するようにしていたが、培養対象微生物２を担体上に担持して本発明を実施するようにしてもよい。具体的には、作用極９を微生物を担持し得る導電性担体、例えば炭素電極、好適には多孔性炭素電極とし、導電性担体に培養対象微生物２を予め担持させ、導電性担体の電位を培養対象微生物２の至適電位に制御するようにして培養環境４の電位を制御するようにしてもよい。あるいは、培養液４ａに添加した培養対象微生物２を、電位を制御して培養する過程で徐々に導電性担体に担持させるようにしてもよい。いずれの場合においても、本発明と同様の効果が得られる。
【００４３】
また、図２に示すように、上述の実施形態で用いた微生物培養装置１とは別の微生物培養装置１ａを用いるようにしてもよい。即ち、培養容器５をイオン交換膜６により培養槽７と対極槽８に仕切ることなくイオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造の容器とし、作用極９は培養容器５内に配置されると共に対極１０は培養容器５の外側に配置され、培養容器５に培養液４ａが収容されると共に作用極９が培養液４ａに浸され、培養容器５のイオン交換膜６は培養容器５に培養液４が収容されたときに少なくともその一部が培養液４ａと接触しうる位置に備えられ、イオン交換膜６の培養液４ａとの接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対極１０が接触して配置されているものとしている。尚、図２では、培養容器５の培養液４ａの液面よりも下部に開口部５ａが設けられ、開口部５ａがイオン交換膜６で塞がれ、培養容器５の外側のイオン交換膜６の表面の少なくとも一部に対極１０が接触して配置されているものとしている。また、培養容器５内の培養液４ａの液面よりも上部の空間に滞留するガス状物質を回収するガス回収手段１５と、培養容器５内の培養液４を採取する培養液採取手段１６とを備えるものとしている。
【００４４】
図２に示す微生物培養装置１ａを用いることで、対極１０から発生するガスによる培養対象微生物２の生育状態への悪影響を排除しながら、培養容器５内で発生したガス状物質（培養対象微生物２が生産したガス状物質や微生物が生産した揮発性物質が揮発して生じたガス成分）を培養容器５の外の漏洩することなく、ガス回収手段１５から回収しながら、本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法を実施することができる。したがって、培養対象微生物２の細胞内においてエネルギー物質（ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量が向上したことにより奏される微生物反応の促進効果によって、培養対象微生物２によるガス状物質等の生産が促進された場合にも、生産されたガス状物質等を無駄なく回収することができる。尚、対極１０は多孔質体とすることが好適である。この場合には、イオン交換膜６と対極１０との接触面で発生したガスを接触面とは反対側の面に通過させやすくなる。また、対極１０を多孔質体とし、イオン交換膜６を塗布形成するための薬剤、例えばナフィオン分散液を用いてイオン交換膜６を貼り付けることで、ナフィオン分散液の多孔質体の孔への侵入によりイオン交換膜６と対極１０との接触面積を増大させて電気化学反応をより進行させやすくすることができ、好適である。
【００４５】
さらに、図３に示すように、上述の実施形態で用いた微生物培養装置１とはさらに別の微生物培養装置１ｂを用いるようにしてもよい。即ち、イオン交換膜６によって仕切られ且つ開放された二つの槽（培養槽７と対極槽８）と、培養槽７を、対極槽８から発生するガスが培養槽７へ侵入するのを防ぐ密閉構造（図３では、培養槽７の上方開放部をガス不透過膜またはガス不透過部材２４により塞いでいる）とするようにしてもよい。この場合にも図２に示す微生物培養装置１ａと同様に、対極１０から発生するガスによる培養対象微生物２の生育状態への悪影響を排除しながら、培養容器５内で発生したガス状物質（培養対象微生物２が生産したガス状物質や微生物が生産した揮発性物質が揮発して生じたガス成分）を培養容器５の外の漏洩することなく回収しながら、本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法を実施することができる。
【００４６】
より具体的には、図４に示すように、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、容器２０に収容可能な密閉構造の小容器２１を対極槽８とし、小容器２１は少なくとも一部にイオン交換膜６を備えると共にガス（対極槽から発生するガス）を容器２０の外に排出するガス排出管２２を備えるものとする。そして、培養槽７内の培養液４ａの液面よりも上部の空間に滞留するガス状物質を回収するガス回収手段１５と、培養槽７の培養液４ａを採取する培養液採取手段１６とを備えるものとしている。尚、培養槽７としての密閉構造の容器２０は、対極槽８としての密閉構造の小容器２１を収容可能な大きさの容器であり、形状は特に限定されない。容器の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過性の膜材をヒートシール等により袋状に形成した容器を培養槽７として用いるようにしてもよい。また、対極槽８としての密閉構造の小容器２１は、培養槽７としての容器２０に収容可能な大きさの容器であり、少なくとも一部にイオン交換膜６を備えるものとしている。尚、図４では、小容器２１全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としているが、小容器２１はこの形態に限定されるものではない。例えば、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成してもよいし、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成してもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分は容器２０と同様の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えばガス不透過性の膜材により構成し、小容器２１からのガス（対極槽８から発生するガス）が容器２０の内部に漏洩しないようにしてもよい。尚、容器２０に小容器２１を収容することで、容器２０に収容されている培養液４ａに小容器２１が浸され、小容器２１の少なくとも一部に備えられているイオン交換膜６と培養液４ａとが接触する。したがって、培養液４ａに浸されている作用極９と、電解液４ａに浸されている対極１０との間に電位差を与えた際に、作用極９と対極１０との間でイオン電流が発生し、培養液４ａの酸化還元電位を制御することが可能となる。
【００４７】
尚、図２〜図４に示す微生物培養装置では、培養槽７内の培養液４ａの液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガス状物質を培養槽７の外（電気培養装置の外）へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５により、培養槽７内のガス状物質を回収するようにしている。しかしながら、ガスの回収方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガス状物質を回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がるので、ガス状物質の回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽７の密閉状態が維持される。
【００４８】
さらに、本実施形態では、培養槽７内の培養液４ａの液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４ａを培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液採取手段１６により、培養槽７内から培養液４ａを採取するようにしている。しかしながら、培養液４ａの採取方法は、この方法に限定されるものではなく、上記と同様、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液４ａを採取するようにしてもよい。または両端が開口された管をの一端の注射器に接続し、他端を培養液４ａに浸けて、管を介して培養液４ａを採取するようにしてもよい。
【００４９】
また、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６とは別に、培養液４ａに物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４ａに物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、微生物２に必要な栄養源や、微生物２が目的の物質を生産するのに必要な物質、微生物２の増殖や代謝に伴い変動する培養液４ａの状態を一定の状態に維持するための中和剤、培養液４ａそのもの等を必要に応じて添加することができる。また、培養環境を嫌気性や好気性に維持するためにガスを供給することもできる。しかしながら、培養液に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６を培養液４ａに物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４ａに物質を添加・供給するようにしてもよい。
【００５０】
尚、図１に示す微生物培養装置１は、培養環境を嫌気性や好気性に制御する際に、微生物培養装置１の培養容器５を密閉性のあるボックスに収容する必要があることから、培養環境の管理（ｐＨ調整や物質供給等）が非常に煩雑である。また、微生物２の培養を行った後に再度別の微生物２を培養する場合には、ボックスも滅菌処理する必要があった。これに対し、図２に示す微生物培養装置１ａによれば、培養容器５内に供給したガス等が培養容器５の外に漏洩することが無い。また、図３及び図４に示す微生物培養装置１ｂによれば、培養槽７内に供給したガス等が培養槽７の外に漏洩することが無い。したがって、培養環境を嫌気性や好気性に制御しやすく、図１に示す微生物培養装置１のように培養容器５をボックスに収容することなく、培養環境をそのまま管理することができる。したがって、培養容器５をボックスに収容していた従来法と比較して培養環境の管理が容易になると共に、再度培養を行う際にボックスを滅菌する手間を省くことも可能となる。
【実施例】
【００５１】
本発明の実施例を以下に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１）
硫酸還元菌であるDeslfovibrio desulfuricans NBRC13699を培養対象微生物として各種実験を行った。
【００５３】
＜実験装置＞
図１に示す培養装置を使用した。具体的には、培養容器５は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）６で仕切った二槽式とし、一方を培養槽７、他方を対極槽８とした。培養槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の作用極９と、銀・塩化銀参照電極１１（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。対極槽８には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の対極１０を設置した。これら３本の電極９,１０,１１は電位制御装置（扶桑製作所、ＰＯＴＥＮＴＩＯ／ＧＡＬＶＡＮＯＳＴＡＴ ｍｏｄｅｌ １１０）１２に結線して、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能とした。また、培養に際しては、培養容器５をアクリル製の嫌気ボックス内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０℃に設定した恒温槽内に設置した。嫌気ボックス１４には、常時窒素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。尚、以降の実施例に示す電位は、全て銀・塩化銀電極電位基準の電位である。
【００５４】
対極槽８に収容する電解液４ｂは以下のようにして得た。即ち、ＮＨ４Ｃｌ；１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した液体をオートクレーブ滅菌処理して得た。
【００５５】
また、培養槽７に収容する培養液４ａは、電解液４ｂに乳酸ナトリウム；２．８ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物；０．６２５ｇ、酵母エキスを１．０ｇ、酸化還元物質３としてＡＱＤＳ（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸二ナトリウム）を０．４２ｇ添加し、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌して得た。尚、硫酸還元菌は乳酸を炭素源として生育可能な微生物であるが、硫酸還元菌の生育に必要な微量元素を補填するために酵母エキスを添加した。また、培養液４ａには、硫酸還元菌を添加（植菌）し、初期菌体密度を１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。菌体密度は光学顕微鏡で硫酸還元菌を計数した結果から求めた。
【００５６】
＜実験結果＞
（１）硫酸還元菌の増殖及びエネルギー物質の経時変化
電位を−０．７Ｖに制御し続けたまま培養した場合と通電を行わずに培養した場合とで、硫酸還元菌の増殖の経時変化と微生物細胞内の主要なエネルギー物質であるＡＴＰの濃度の経時変化にどのような違いが現れるのかを確認する実験を行った。
【００５７】
一定の培養期間毎に培養液４ａを採取し、菌体密度とＡＴＰ濃度の定量を行った。菌体密度は光学顕微鏡で硫酸還元菌を計数した結果から求めた。ＡＴＰ濃度の定量は、ルシフェール２５０プラス及びルミテスターＣ−１００Ｎ（キッコーマン）を用い、キット付属のプロトコールに従って実施した。
【００５８】
実験結果を図５に示す。図５において、◆は電位を−０．７Ｖに制御した場合における菌体密度を示し、■は通電しなかった場合における菌体密度を示し、▲は電位を−０．７Ｖに制御した場合におけるＡＴＰ濃度を示し、×は通電しなかった場合におけるＡＴＰ濃度を示している。
【００５９】
図５に示される実験結果から、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、対数増殖期の開始時を１０時間程度早められることが明らかとなった。また、ＡＴＰ濃度についても、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、早期に高められることが明らかとなった。一方で、培養開始から３５時間経過した後は、ＡＴＰ濃度に変化が見られなくなった。
【００６０】
次に、図５の実験結果について、ＡＴＰ濃度を細胞１個体当たりに換算した実験結果、つまり、硫酸還元菌の細胞１個体当たりのＡＴＰ生産量の経時変化を図６に示す。図６に示される結果から、少なくとも培養開始から２４時間電位の制御を行うことで、硫酸還元菌の細胞１個体当たりのＡＴＰ生産量を十分に向上できることが明らかとなった。硫酸還元菌において、尚、電位を−０．７Ｖに制御しながら硫酸還元菌を培養したときの培養開始から２４時間経過時は、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養したときの硫酸還元菌の対数増殖期開始時（対数増殖期の立ち上がり）に該当する。したがって、この結果から硫酸還元菌に限らず微生物全般について、培養対象微生物の培養の際に、培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御し、且つ至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時まで行うことで、微生物細胞内におけるＡＴＰの単位時間当たりの生産量を向上できることが導かれた。
【００６１】
ここで、細胞の状態を知るためには、細胞が実際に利用できるエネルギー量の指標であるアデニル酸エネルギー充填率（adenylate energy charge、以下、ＡＥＣ値と呼ぶ）による評価が有効である。そこで、以下の式によりＡＥＣ値を求めた。
（AEC値）＝([ATP]+0.5[ADP])/([AMP]+[ADP]+[ATP]）
【００６２】
また、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）はピルベートキナーゼによる以下の反応Ａを利用してＡＴＰに変換してから定量し、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）は以下の反応Ａ及びmyoキナーゼによる以下の反応Ｂの組み合わせによりＡＴＰに変換してから定量した。
（反応Ａ）； ＡＤＰ＋phosphoenolpyruvate→ＡＴＰ＋pyruvate
（反応Ｂ）； ＡＭＰ＋ＡＴＰ→２ＡＤＰ
【００６３】
尚、ＡＥＣ値は、対数増殖期初期及び対数増殖期中点において求めた。対数増殖期中点は、以下の式により算出される対数増殖期中点の菌体密度から求めた。また、対数増殖期初期は、増殖開始（対数増殖期開始時（立ち上がり時））から対数増殖期中点までの期間とした。
（対数増殖期中点の菌体密度）＝（（最終到達菌体密度）−（初期菌体密度））／２
【００６４】
本実験では、対数増殖期中点は培養開始から３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、培養開始から４５時間（通電なし）であり（菌体密度２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、対数増殖期中点のＡＥＣ値はこのときの培養液のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの定量分析結果から求めた。また、対数増殖期初期は２４〜３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、３５〜４５時間（通電なし）であり、ＡＥＣ値はこの期間において菌体密度が８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるとき（培養から３０時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、培養から４２時間（通電なし））の培養液のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの定量分析結果から求めた。
【００６５】
実験結果を図７に示す。棒グラフの上の数値は通電なしの場合を１００とした場合のＡＥＣ値の相対値である。図７に示される結果から、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、対数増殖期初期におけるＡＥＣ値を通電しないときのおよそ３倍に増加できることが明らかとなった。これに対し、対数増殖期中点では、通電の有無によってはＡＥＣ値が殆ど変化しなかった。
【００６６】
これらの結果から、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、対数増殖期初期において、通電しない場合よりも酸化的リン酸化を促進させることができることがわかった。つまり、電位を−０．７Ｖに制御することにより、対数増殖期初期における菌体１個体当たりの単位時間当たりのＡＴＰ生産量を増加させやすくできることがわかった。一方で、対数増殖期中点においては、電位制御が酸化的リン酸化に影響を与えないこともわかった。
【００６７】
次に、対数増殖期初期と対数増殖期中点において、微生物細胞内の主要なエネルギー物質であるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの濃度の通電の有無による違いについて検討した。
【００６８】
尚、ＡＥＣ値を求めた場合と同様、対数増殖期中点は培養開始から３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、培養開始から４５時間（通電なし）とした（菌体密度２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。また、対数増殖期初期は２４〜３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、３５〜４５時間（通電なし）とし、この期間において菌体密度が８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるときの培養液をＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの定量分析に供した。
【００６９】
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの定量は、それぞれNAD/NADH Quantification kit及びNADP/NADPH Quantification kit（Biovision Inc, US）を用いて実施した。詳細には、一定期間培養した後に回収した硫酸還元菌の細胞を超音波破砕機により破砕し、破砕液を遠心分離操作により分離して上清液を測定に供した。
【００７０】
実験結果を図８及び図９に示す。尚、図８がＮＡＤＨ（さらにＮＡＤ＋）の定量分析結果を示す図であり、図９がＮＡＤＰＨ（さらにはＮＡＤＰ＋）の定量分析結果を示す図である。これらの結果から、電位を−０．７Ｖに制御することで、対数増殖期初期におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを通電しないときよりも増加できることが明らかとなった。これに対し、対数増殖期中点では、通電の有無によってはＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨが殆ど変化しなかった。尚、ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋については、いずれの場合も殆ど変化が見られなかった。
【００７１】
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、細胞内の酸化還元酵素に関わる細胞内で最も多い補酵素であり、ＡＴＰの合成原料となる分子である（１分子のＮＡＤ（Ｐ）Ｈから３分子のＡＴＰが酸化的リン酸化反応で合成される）。ここで、細胞内ＡＴＰの生産に関する上記実験では、少なくとも培養開始から２４時間まで電位を−０．７Ｖに制御することで、硫酸還元菌の細胞内ＡＴＰの単位時間当たりの生産量の向上効果が得られることが確認されたことから、ＡＴＰの合成原料であるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨについても、少なくとも培養開始から２４時間まで電位を−０．７Ｖに制御することで、細胞内生産量を向上できるものと考えられる。また、上記の実験結果から、培養開始時から対数培養期初期における菌体密度が８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに到達するまでの期間（培養開始時から３０時間）まで電位を−０．７Ｖに制御し続けることで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を確実に向上させることができ、培養開始時から対数培養期中点まで−０．７Ｖに制御し続けることで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量をさらに確実に向上させることができることがわかった。そして、このことから、微生物全般に関し、培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行うことで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が得られ、至適電位の制御を培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行うことで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が確実に得られることが導かれた。
【００７２】
（２）遺伝子転写分析
上記（１）の実験における対数増殖期初期の遺伝子転写活性と対数増殖期中点の遺伝子転写活性について通電の有無による違いを検討した。
【００７３】
上記（１）の実験において、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行った場合と通電を行わずに培養を行った場合について、対数増殖期初期（菌体密度：８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の菌体と対数増殖期中点（菌体密度：２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の菌体を回収した。回収した菌体はＲＮＡ精製を行うまでRNA later(Ambion, USA）に浸し、−２０℃で保存した。
【００７４】
上記保存された菌体から全ＲＮＡを抽出・精製した。具体的には、Ribopure-Bacteria kit (Ambion, USA)を用いて精製を行った後、Turbo DNase-free (Ambion, USA) で処理することで混在するゲノムDNAを除去し、精製RNAを得た。精製度は分光光度計（A260/A280）及び電気泳動にて検証した。
【００７５】
次に、精製ＲＮＡの１００ｎｇについて、Transcriptor（Roche, Switzerland）を用いてランダムヘキサマーをプライマーとして逆転写反応を行い、cDNAを調製した。このcDNAを鋳型として、Light cycler ST300（Roche, Switzerland）を用いたリアルタイムPCRにより、16S rRNA遺伝子およびporA, hydA, cytc3, dsrA, gyrA遺伝子の定量を行った。この定量値が各遺伝子の転写量を反映する値である。解析対象とした遺伝子および使用したプライマーの塩基配列を表１に示す。また、使用したプライマーの塩基配列を配列表に示す。尚、プライマーは各種機能遺伝子の配列を基にprimer3 plus programによりデザインした。リアルタイムPCR反応はLight Cycler Fast start DNA Master SYBR GreenIを用い、表２に示す反応条件にて行った。増幅断片の融解曲線分析において目的遺伝子断片の単一ピークのみが得られた試料のみ解析を進めた。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
ここで、本実施例において定量対象とした遺伝子の硫酸還元菌内における機能について図１０に基づいて説明する。porAは乳酸分解に関与する遺伝子である（図１０の（ａ））。hydA及びcytc3は電子伝達に関与する遺伝子である（図１０の（ｂ））。dsrAは硫酸還元に関与する遺伝子である（図１０の（ｃ））。そして、gyrAは複製及び分裂に関与する遺伝子である（図１０の（ｄ））。
【００７９】
各種遺伝子の発現量は測定値を16S rRNA遺伝子量を基準に標準化し、各細胞あたりの発現量として相対評価した。転写量の相対比較はSecond derivative maximum法により算出したCt値 (Crossing time) を用いた比較Ct法により行った。
【００８０】
実験結果を図１１に示す。尚、図１１では、通電なしの場合の遺伝子転写量を１（図１１中の点線）とし、電位を−０．７Ｖに制御した場合の遺伝子転写量をその相対値として示した。つまり、遺伝子転写量が１より大きければ、電位を−０．７Ｖに制御することにより遺伝子転写が活性化していることになる。図１１に示される結果から、対数増殖期初期において、porA以外の遺伝子の転写が活性化していることが確認された。上記の通り、対数増殖期初期においては、細胞内の主要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量が向上することが確認されたことから、細胞内における利用可能エネルギー量が向上したことで、主に呼吸に関与する遺伝子であるhydA、cytc3及びdsrA、複製・分裂に関与する遺伝子であるgyrAの転写が活性化されたものと考えられる。つまり、この結果から、微生物全般に関して、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を増加させることによって、呼吸に関与する遺伝子や複製・分裂に関与する遺伝子を活性化させ、生育の活性化（増殖の促進）を図りつつ、その機能を向上させる効果が得られるものと考えられる。また、エネルギー生産と呼吸は酸化的リン酸化経路において密接に関連していることから、電位制御によって呼吸に関与する遺伝子が活性化した結果として呼吸酵素群が活性化することにより、エネルギー物質の単位時間当たりの生産量が向上することも考えられることから、この効果も相俟ってエネルギー物質の生産効率が極めて優れたものになると考えられる。
【００８１】
（３）乳酸分解速度と硫酸還元速度の分析
硫酸還元菌の主要な反応である乳酸分解と硫酸還元について、培養開始時の乳酸濃度及び硫酸濃度の定量分析結果と、対数増殖期初期における乳酸濃度及び硫酸濃度を定量分析結果とに基づき、培養開始時から対数増殖期初期にかけての乳酸分解速度及び硫酸還元速度を求め、通電の有無（通電した場合は電位を−０．７Ｖに制御）による乳酸分解速度及び硫酸還元速度の違いについて検討した。
【００８２】
硫酸イオン濃度及び乳酸イオン濃度はイオンクロマトアナライザ（ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製）により測定した。
【００８３】
結果を図１２及び図１３に示す。図１２が通電の有無による乳酸分解速度の違いを示す図であり、図１３が通電の有無による硫酸還元速度の違いを示す図である。尚、図１２及び図１３ともに、棒グラフの上に、通電なしの場合の速度を１００とした場合に対する通電ありの場合の速度を掲載した。これらの結果から、乳酸分解速度及び硫酸還元速度ともに通電ありの場合に向上した。上記の通り、対数増殖期初期においては、細胞内の主要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量が向上することが確認されたことから、細胞内における利用可能エネルギー量が向上したことで、乳酸分解反応と硫酸還元反応が促進されたものと考えられる。つまり、この結果から、微生物全般に関して、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を増加させることによって、微生物の呼吸にかかる機能を向上させて、微生物による有用物質等の生産速度の促進や、環境汚染物質の分解速度の促進を図ることが可能になるものと考えられる。また、エネルギー生産と呼吸は酸化的リン酸化経路において密接に関連していることから、電位制御によって呼吸酵素群が活性化することにより、エネルギー物質の単位時間当たりの生産量が向上することも考えられることから、この効果も相俟ってエネルギー物質の生産効率が極めて優れたものになると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、微生物体の反応素過程において必ず使用されるエネルギー物質であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と生物細胞内の酸化還元酵素に関わり且つ細胞内で最も多い補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）について、これらの単位時間当たりの生産量を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在様々な分野で利用されている微生物は自然界に存在する全微生物の僅か１％に満たないと言われている。そこで、残り９９％の膨大な微生物資源を有効利用すべく、新たな概念に基づいて微生物の培養技術が各種開発されつつある。
【０００３】
例えば、特許文献１には、培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続して培養対象微生物に供給することにより培養対象微生物を選択的に培養する方法が開示されている。具体的には、六価クロムを溶解させてクロム還元菌以外の雑多な微生物にとって増殖し難い環境とした培養液中で、六価クロムに対して還元活性を有するShewanella、Pseudomonas、Sulfate reducing bacteria、Arthrobacter、Bacillus、Aerococcus、Micrococcus、Aeromonas、Thermoanaerobacter、Cellulomonas、Geobacter、Streptomyces、Escherichia、Enterobacter等のクロム還元菌を選択的に集積培養し、その際に、培養液中に流した電気により、クロム還元菌によって還元されて生成された三価クロムを酸化して六価クロムに再生しながら培養を行うようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−５５１３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の培養方法は、培養対象微生物の生育に必要な物質が還元されて減少するような状況下になければ適用しても効果が得られない。また、培養開始からある一定期間は培養対象微生物の生育に必要な物質が十分に存在している状態であることから、培養開始からある程度の培養期間が経過してその物質の量が大きく減少し始めるまでは微生物の十分な増殖効果は得られない。
【０００６】
ところで、微生物の生育や代謝といった機能は、アデノシン三リン酸（以下、単にＡＴＰと呼ぶこともある）により支えられていることが知られている。即ち、ＡＴＰは微生物体の反応素過程において必ず使用されるエネルギー物質である。また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、単にＮＡＤＨと呼ぶこともある）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、単にＮＡＤＰＨと呼ぶこともある）は微生物細胞内の酸化還元酵素に関わる細胞内で最も多い補酵素であり、１分子のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから３分子のＡＴＰが酸化的リン酸反応により合成されることも知られている。
【０００７】
このように、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、微生物の生育や代謝を担う極めて重要なエネルギー物質である。したがって、これらのエネルギー物質の微生物細胞内の単位時間当たりの生産量を高めることができれば、微生物全般に対し、その生育の活性化や機能の向上が図れるものと考えられる。
【０００８】
そこで、本発明は、微生物細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を高めることのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は硫酸還元菌を培養対象微生物として各種検討を積み重ねた。その結果、硫酸還元菌を培養する際の培養環境の電位を硫酸還元菌の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における硫酸還元菌の対数増殖期開始時までの期間において行うことによって、硫酸還元菌の細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上できることを知見するに至った。そしてこの結果から、微生物全般について、微生物細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上できる可能性が導かれ、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、請求項１に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法は、培養対象微生物を含む培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い、培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにしている。
【００１１】
ここで、請求項２に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法のように、至適電位の制御を培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行うことが好ましい。この場合には、培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量をより確実に向上させることができる。
【００１２】
尚、本明細書において、至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間とは、至適電位において培養対象微生物を培養したときの最終到達菌体密度と初期菌体密度（培養環境に植菌された菌体の密度）の差を２で割ることにより算出される菌体密度に到達するまでに必要な培養期間を意味している。
【００１３】
次に、請求項３に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法は、硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．６Ｖ以下に制御するとともに、電位の制御を少なくとも培養開始時からこの電位における硫酸還元菌の対数増殖期開始時までの期間において行い、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにしている。
【００１４】
ここで、請求項４に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法のように、電位の制御を培養開始時からこの電位における硫酸還元菌の対数増殖期中点までの期間において行うことが好ましい。この場合には、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量をより確実に向上させることができる。
【００１５】
次に、請求項５に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法は、硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．７Ｖに制御するとともに、電位の制御を少なくとも培養開始時から２４時間行い、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させるようにしている。
【００１６】
ここで、請求項６に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法のように、電位の制御を培養開始時から３５時間行うことが好ましい。この場合には、硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量をより確実に向上させることができる。
【発明の効果】
【００１７】
請求項１及び請求項２に記載の発明によれば、微生物の生育や代謝を担う極めて重要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させることができる。したがって、微生物全般に対して、増殖速度の向上と微生物の機能の向上を図ることができる。
【００１８】
請求項３〜請求項６に記載の発明によれば、硫酸還元菌の生育や代謝を担う極めて重要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させることができる。したがって、硫酸還元菌の増殖速度の向上と硫酸還元能の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の方法の実施に使用する装置の構成の一例を示す断面図である。
【図２】本発明の方法の実施に使用する装置の構成の他の例を示す断面図である。
【図３】本発明の方法の実施に使用する装置の構成のさらに他の例を示す断面図である。
【図４】図３に示す装置のより具体的な構成を示す断面図である。
【図５】硫酸還元菌の増殖とＡＴＰ濃度の経時変化を示す図である。
【図６】硫酸還元菌の細胞１個体当たりのＡＴＰ生産量の経時変化を示す図である。
【図７】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無によるＡＥＣ値の差異を示す図である。
【図８】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無によるＮＡＤ＋及びＮＡＤＨの濃度の差異を示す図である。
【図９】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無によるＮＡＤＰ＋及びＮＡＤＰＨの濃度の差異を示す図である。
【図１０】実施例において定量対象とした遺伝子の硫酸還元菌体内での機能を示す模式図である。
【図１１】対数増殖期初期と対数増殖期中点における通電の有無による遺伝子転写量の解析結果を示す図である。
【図１２】通電の有無による乳酸分解速度の違いを示す図である。
【図１３】通電の有無による硫酸還元速度の違いを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２１】
本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法の実施形態の一例として微生物培養装置１を用いた場合について図１に基づいて説明する。本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法は、培養対象微生物２を含む培養環境４に電極を浸漬し、この電極に電位を印加して培養環境４の電位を培養対象微生物２の至適電位に制御し、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期開始時までの期間において行うようにしている。これにより、培養対象微生物２の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることができる。
【００２２】
図１において、培養容器５はイオン交換膜６によって培養槽７と対極槽８とに仕切られている。培養槽７には培養液４ａが収容され、対極槽８には電解液４ｂが収容されている。培養槽７の培養液４ａには作用極９及び参照電極１１が浸漬され、対極槽８の電解液４ｂには対極１０が浸漬される。作用極９、対極１０及び参照電極１１は３電極式の電位制御装置（ポテンシオスタット）１２に結線され、培養液４ａに浸漬されている作用極９の電位を厳密に制御可能としている。
【００２３】
ここで、培養槽７の培養液４ａには、酸化還元物質３がさらに添加される。酸化還元物質３としては、培養液４ａに浸漬されている作用極９において可逆的に酸化還元反応を生じ得る物質であって、尚かつ培養対象微生物２に対して毒性を呈しない物質であればよい。具体的には、例えば土壌成分として一般的な鉄イオンが挙げられる。鉄イオンは以下に示す化学反応式１により酸化体と還元体に可逆的に変化する物質である。
Ｆｅ（III） ＋ ｅ− ＝ Ｆｅ（II） ・・・・・（化学反応式１）
【００２４】
尚、鉄イオンを培養液４ａ中で安定に存在させるためには、鉄イオンをキレート剤に配位させることが好ましい。キレート剤としては、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができるが、鉄イオンを配位させうるキレート剤であれば、上記のキレート剤には限定されない。
【００２５】
また、酸化還元物質３として、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、メチルビオロゲン等を用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により酸化体と還元体に可逆的に変化する。特に、キノン化合物は土壌成分の一つとして知られている物質であることから、土壌そのものを培養液４ａに添加することで、土壌に含まれている酸化還元物質３により培養液４ａの電位を制御できる場合がある。但し、酸化還元物質３は上記した物質に限定されるものではない。
【００２６】
尚、酸化還元物質３の添加量は、培養液４ａの電位を制御しうる量であれば特に限定されないが、培養液４ａの酸化還元物質３の濃度を０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとすることが好適である。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満とすると培養液４ａの電位の制御を十分に行うことができない可能性があり、１００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると培養液４ａに完全に溶解しなかったり、微生物の生育阻害を生じる可能性がある。
【００２７】
ここで、電子受容体物質１３を培養液４ａに添加してもよい。電子受容体物質１３としては、培養対象微生物２の呼吸源となる物質であれば特に限定されない。例示すると、ＰＣＥ脱塩素微生物に対してテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、ＤＣＥ脱塩素微生物に対してジクロロエチレン（ＤＣＥ）、ＶＣ脱塩素微生物に対して塩化ビニル、硝酸還元菌に対して硝酸イオン、硫酸還元菌に対して硫酸イオン、メタン生成菌に対して二酸化炭素、クロロベンゼン脱塩素微生物に対してクロロベンゼン、クロロフェノール脱塩素微生物に対してクロロフェノール、クロム還元菌に対してクロムイオン、キノン還元菌に対してキノン、水銀還元菌に対して水銀イオン、カドミウム還元菌に対してカドミウムイオン、鉄還元菌に対して鉄イオンが挙げられる。
【００２８】
培養液４ａの電位（酸化還元電位）は、数式１に示すネルンストの式により表される。
Ｅ＝Ｅ０＋ＲＴ／ｎＦ×ｌｎ（Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ）・・・・・（数式１）
【００２９】
数式１において、Ｅは溶液（培養液４ａ）の酸化還元電位、Ｅ０は酸化還元物質３の標準酸化還元電位、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｎは反応電子数、Ｆはファラデー定数、Ｃｏｘは酸化体の濃度、Ｃｒｅｄは還元体の濃度である。つまり、培養液４ａに含まれる酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御することにより、培養液４ａ自体の酸化還元電位を制御することができる。尚、酸化還元物質３が培養液４ａの酸化還元電位を決定する要素であり、培養液４ａの組成は酸化還元電位にほとんど影響を与えることがない。
【００３０】
３極式の電位制御装置１２では、作用極９と参照電極１１の電位差を測定し、測定した電位差が設定電位Ｖに達するように作用極９と対極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極には一切電流が流れないようにしている。このようにして作用極９の電位を設定電位Ｖに制御し続けることによって、酸化還元物質３の酸化体の濃度と還元体の濃度の比を一定に制御し続けることができる。したがって、例えば培養液７に投入された微生物が酸化還元物質３を酸化あるいは還元することによりＣｏｘ／Ｃｒｅｄ（酸化体と還元体の濃度比）が変化した場合でも、所定のＣｏｘ／Ｃｒｅｄに制御して、培養液４ａの酸化還元電位を一定値に維持することができる。尚、培養液４ａの酸化還元電位は、作用極９の設定電位Ｖに相当する。
【００３１】
ここで、作用極９の設定電位Ｖは、参照電極１１に対する作用極９の電位に相当することから、参照電極１１の種類によってその値が変化する。本明細書における設定電位Ｖは、標準水素電極に対して＋０．２２Ｖを示す銀・塩化銀電極電位に対する値としているが、参照電極１１の種類は銀・塩化銀電極に限られるものではない。
【００３２】
培養容器５を二層に区画しているイオン交換膜６は、酸化還元物質３を対極槽８側に透過させることなく、イオンのみを透過させて、培養槽７と対極槽８との間でイオン交換膜６を介してイオン電流を伝達させるものである。例えば、イオン交換膜６を一価の陽イオンのみを透過する膜とし、酸化還元物質３を鉄イオン（二価及び三価）とすれば、酸化還元物質３を培養槽７の培養液４ａに留めたままで、培養液４ａ及び電解液４ｂのイオン（水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン）などの一価の陽イオンがイオン交換膜６を通過して、培養槽７と対極槽８との間でイオン電流を伝達させることができる。その結果、培養液４ａの酸化還元電位が所定の値に長期間維持されることになる。ここで、対極槽８に収容する電解液４ｂについては、イオン交換膜６を透過しうるイオンを組成に有していれば特に限定されるものではない。尚、電解液４ｂとして培養液４ａを用いてもよい。
【００３３】
培養対象微生物２の至適電位は、以下に説明する微生物の増殖評価試験から導き出すことができる。即ち、電位以外の培養条件を全て揃え、電位をある範囲内、例えば−１．０Ｖ〜＋１．０Ｖの範囲内で各種条件振りして培養実験を行う。また、通電しない（電位制御を行わない）場合についても同様に培養実験を行う。そして、対数増殖期の開始時を判断可能な期間で培養を行い、対数増殖期の開始時が通電しない場合と比較して早まった場合、その電位を培養対象微生物２の至適電位と判断することができる。
【００３４】
例えば硫酸還元菌の場合、至適電位は銀・塩化銀電極電位基準で−０．６Ｖ以下であり、より好適には−０．６Ｖ〜−０．９Ｖであり、さらに好適には−０．７Ｖである。−０．９Ｖよりも小さくすると、対極１０からの水素発生量が増加しすぎて酸化還元電位の制御が正確に行えなくなる虞がある。
【００３５】
至適電位の制御は、少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期開始時までの期間において行うことが好ましい。この期間に至適電位の制御を行うことによって、培養対象微生物２の細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が得られる。ここで、至適電位の制御は、培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期中点までの期間において行うことがより好ましい。この場合には、培養対象微生物２の細胞内におけるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果がより確実に得られる。尚、培養開始時から至適電位における培養対象微生物２の対数増殖期中点までの期間を超えて至適電位の制御を行っても、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果は殆ど得られなくなる。
【００３６】
培養対象微生物２を硫酸還元菌とする場合には、上記至適範囲の電位に制御し、この至適範囲に電位を制御した際の硫酸還元菌の増殖曲線を調べておく。そして、得られた増殖曲線から、対数増殖期開始時と対数増殖期中点を求めることにより、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が得られる電位制御期間を導き出すことができる。
【００３７】
例えば硫酸還元菌を培養対象微生物２とした場合において、至適電位を−０．７Ｖとすると、対数増殖期開始時は培養開始時から２４時間となり、対数増殖期中点は培養開始時から３５時間となる。したがって、電位の制御は少なくとも培養開始時から２４時間行うことが好ましいことになり、培養開始時から３５時間行うことがより好ましいことになる。本願発明者等の実験によれば、実際にこの期間においてＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果が得られることが確認されている。、また、培養開始時から３５時間を超えて至適電位の制御を行っても、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果は殆ど得られなくなることも本願発明者等の実験により確認されている。
【００３８】
尚、本発明によれば、エネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果に加えて、呼吸や複製・分裂に関与する遺伝子の転写活性化効果及び呼吸酵素群での電子移動反応の活性化効果が得られることが確認された。即ち、本発明によれば、培養対象微生物２のエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させることによって、細胞内における利用可能なエネルギー量が多くなり、その結果として、呼吸や複製・分裂に関与する遺伝子の転写活性化効果及び呼吸酵素群での電子移動反応の活性化効果が得られるものと考えられる。また、エネルギー生産と呼吸は酸化的リン酸化経路において密接に関連していることから、電位制御によって呼吸酵素群が活性化したり、さらには電位制御によって呼吸に関与する遺伝子が活性化した結果として呼吸酵素群が活性化したりすることにより、エネルギー物質の単位時間当たりの生産量が向上することも考えられる。つまり、本発明によれば、これらの効果も相俟ってエネルギー物質の生産効率が極めて優れたものになると考えられる。
【００３９】
以上、本発明によれば、微生物の細胞内の種々の反応の根幹をなすエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上させる効果が得られることから、細胞内の利用可能エネルギーを高めることができる。したがって、これらのエネルギー物質を利用した微生物反応によりバイオプロセスを実施する場合に、微生物の機能を早期に向上させてバイオプロセスを早期に安定に立ち上げることが可能になる。また、環境中において休眠している微生物の細胞内の利用可能エネルギーを高めて、その増殖に関与する細胞内反応を活性化させることにより、難培養微生物を増殖することが可能になるものと考えられる。
【００４０】
また、本発明と特開２００６−５５１３４号公報に記載された発明とを組み合わせることで、優れた効果が発揮される場合がある。特開２００６−５５１３４号公報に記載された発明は、培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続して培養対象微生物に供給することにより培養対象微生物を選択的に培養する方法である。しかしながら、上記の通り、この方法によると、培養開始からある一定期間は培養対象微生物の生育に必要な物質が十分に存在している状態であることから、培養開始からある程度の培養期間が経過してその物質の量が大きく減少し始めるまでは微生物の十分な増殖効果は得られない。そこで、本発明の方法により、至適電位の制御を、少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い
、より好ましくは培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行い、培養対象微生物の細胞内のＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させて、その増殖及び呼吸能を早期に誘導させ、その後に培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続して培養対象微生物に供給することにより、微生物の培養及び維持を長期にわたり行うことができる。即ち、本発明による培養対象微生物の細胞内のＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量の向上効果によって付随的に培養対象微生物に必要な物質が還元されて減少してしまうが、本発明の方法を実施した後に、培養対象微生物によって還元された物質を電気的に酸化し再生させ、これを継続することで、長期にわたって培養対象微生物の増殖及び維持することができる。
【００４１】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００４２】
例えば、上述の実施形態では、培養対象微生物２を培養液４ａに添加するようにしていたが、培養対象微生物２を担体上に担持して本発明を実施するようにしてもよい。具体的には、作用極９を微生物を担持し得る導電性担体、例えば炭素電極、好適には多孔性炭素電極とし、導電性担体に培養対象微生物２を予め担持させ、導電性担体の電位を培養対象微生物２の至適電位に制御するようにして培養環境４の電位を制御するようにしてもよい。あるいは、培養液４ａに添加した培養対象微生物２を、電位を制御して培養する過程で徐々に導電性担体に担持させるようにしてもよい。いずれの場合においても、本発明と同様の効果が得られる。
【００４３】
また、図２に示すように、上述の実施形態で用いた微生物培養装置１とは別の微生物培養装置１ａを用いるようにしてもよい。即ち、培養容器５をイオン交換膜６により培養槽７と対極槽８に仕切ることなくイオン交換膜６を少なくとも一部に備える密閉構造の容器とし、作用極９は培養容器５内に配置されると共に対極１０は培養容器５の外側に配置され、培養容器５に培養液４ａが収容されると共に作用極９が培養液４ａに浸され、培養容器５のイオン交換膜６は培養容器５に培養液４が収容されたときに少なくともその一部が培養液４ａと接触しうる位置に備えられ、イオン交換膜６の培養液４ａとの接触面とは反対側の面の少なくとも一部に対極１０が接触して配置されているものとしている。尚、図２では、培養容器５の培養液４ａの液面よりも下部に開口部５ａが設けられ、開口部５ａがイオン交換膜６で塞がれ、培養容器５の外側のイオン交換膜６の表面の少なくとも一部に対極１０が接触して配置されているものとしている。また、培養容器５内の培養液４ａの液面よりも上部の空間に滞留するガス状物質を回収するガス回収手段１５と、培養容器５内の培養液４を採取する培養液採取手段１６とを備えるものとしている。
【００４４】
図２に示す微生物培養装置１ａを用いることで、対極１０から発生するガスによる培養対象微生物２の生育状態への悪影響を排除しながら、培養容器５内で発生したガス状物質（培養対象微生物２が生産したガス状物質や微生物が生産した揮発性物質が揮発して生じたガス成分）を培養容器５の外の漏洩することなく、ガス回収手段１５から回収しながら、本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法を実施することができる。したがって、培養対象微生物２の細胞内においてエネルギー物質（ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量が向上したことにより奏される微生物反応の促進効果によって、培養対象微生物２によるガス状物質等の生産が促進された場合にも、生産されたガス状物質等を無駄なく回収することができる。尚、対極１０は多孔質体とすることが好適である。この場合には、イオン交換膜６と対極１０との接触面で発生したガスを接触面とは反対側の面に通過させやすくなる。また、対極１０を多孔質体とし、イオン交換膜６を塗布形成するための薬剤、例えばナフィオン分散液を用いてイオン交換膜６を貼り付けることで、ナフィオン分散液の多孔質体の孔への侵入によりイオン交換膜６と対極１０との接触面積を増大させて電気化学反応をより進行させやすくすることができ、好適である。
【００４５】
さらに、図３に示すように、上述の実施形態で用いた微生物培養装置１とはさらに別の微生物培養装置１ｂを用いるようにしてもよい。即ち、イオン交換膜６によって仕切られ且つ開放された二つの槽（培養槽７と対極槽８）と、培養槽７を、対極槽８から発生するガスが培養槽７へ侵入するのを防ぐ密閉構造（図３では、培養槽７の上方開放部をガス不透過膜またはガス不透過部材２４により塞いでいる）とするようにしてもよい。この場合にも図２に示す微生物培養装置１ａと同様に、対極１０から発生するガスによる培養対象微生物２の生育状態への悪影響を排除しながら、培養容器５内で発生したガス状物質（培養対象微生物２が生産したガス状物質や微生物が生産した揮発性物質が揮発して生じたガス成分）を培養容器５の外の漏洩することなく回収しながら、本発明の微生物細胞内のエネルギー物質の生産制御方法を実施することができる。
【００４６】
より具体的には、図４に示すように、密閉構造の容器２０を培養槽７とし、容器２０に収容可能な密閉構造の小容器２１を対極槽８とし、小容器２１は少なくとも一部にイオン交換膜６を備えると共にガス（対極槽から発生するガス）を容器２０の外に排出するガス排出管２２を備えるものとする。そして、培養槽７内の培養液４ａの液面よりも上部の空間に滞留するガス状物質を回収するガス回収手段１５と、培養槽７の培養液４ａを採取する培養液採取手段１６とを備えるものとしている。尚、培養槽７としての密閉構造の容器２０は、対極槽８としての密閉構造の小容器２１を収容可能な大きさの容器であり、形状は特に限定されない。容器の材質としては、例えば、ガラス、プラスチック、絶縁処理を施した金属、コンクリート等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、ガス不透過性の膜材をヒートシール等により袋状に形成した容器を培養槽７として用いるようにしてもよい。また、対極槽８としての密閉構造の小容器２１は、培養槽７としての容器２０に収容可能な大きさの容器であり、少なくとも一部にイオン交換膜６を備えるものとしている。尚、図４では、小容器２１全体をイオン交換膜６で形成した袋状の容器としているが、小容器２１はこの形態に限定されるものではない。例えば、袋状の容器の片面だけをイオン交換膜６で構成してもよいし、一つの面のさらに一部分をイオン交換膜６のみで構成してもよい。部分的にイオン交換膜６を用いる場合には、その他の部分は容器２０と同様の上記材質で構成してもよいし、イオン交換膜６以外の膜材、例えばガス不透過性の膜材により構成し、小容器２１からのガス（対極槽８から発生するガス）が容器２０の内部に漏洩しないようにしてもよい。尚、容器２０に小容器２１を収容することで、容器２０に収容されている培養液４ａに小容器２１が浸され、小容器２１の少なくとも一部に備えられているイオン交換膜６と培養液４ａとが接触する。したがって、培養液４ａに浸されている作用極９と、電解液４ａに浸されている対極１０との間に電位差を与えた際に、作用極９と対極１０との間でイオン電流が発生し、培養液４ａの酸化還元電位を制御することが可能となる。
【００４７】
尚、図２〜図４に示す微生物培養装置では、培養槽７内の培養液４ａの液面よりも上部の空間（ヘッドスペース）に滞留するガス状物質を培養槽７の外（電気培養装置の外）へ導くガス排出管１５ａを備え、このガス排出管１５ａをバルブ１５ｂにより開閉可能としたガス回収手段１５により、培養槽７内のガス状物質を回収するようにしている。しかしながら、ガスの回収方法は、この方法に限定されるものではない。例えば、培養槽７の上部に開口部を設けて合成ゴム等（例えばシリコーンゴム）の弾性材料でこの開口部を塞ぎ、開口部を塞ぐ弾性材料に注射器の注射針を刺してヘッドスペースからガス状物質を回収するようにしてもよい。合成ゴム等の弾性材料は、注射針を引き抜くと孔が塞がるので、ガス状物質の回収を行わないときには、注射針を引き抜いておいても、培養槽７の密閉状態が維持される。
【００４８】
さらに、本実施形態では、培養槽７内の培養液４ａの液面よりも下部に、培養槽７内の培養液４ａを培養槽７の外に導く培養液排出管１６ａを備え、この培養液排出管１６ａをバルブ１６ｂにより開閉可能とした培養液採取手段１６により、培養槽７内から培養液４ａを採取するようにしている。しかしながら、培養液４ａの採取方法は、この方法に限定されるものではなく、上記と同様、培養槽７に開口部を設けて合成ゴム等の弾性材料で塞ぎ、注射器の注射針を刺して培養液４ａを採取するようにしてもよい。または両端が開口された管をの一端の注射器に接続し、他端を培養液４ａに浸けて、管を介して培養液４ａを採取するようにしてもよい。
【００４９】
また、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６とは別に、培養液４ａに物質を添加・供給する手段を設けるようにしてもよい。具体的には、培養槽７の外部から培養液４ａに物質を添加・供給することのできる開閉可能な物質導入管を備えるようにしてもよい。この場合には、微生物２に必要な栄養源や、微生物２が目的の物質を生産するのに必要な物質、微生物２の増殖や代謝に伴い変動する培養液４ａの状態を一定の状態に維持するための中和剤、培養液４ａそのもの等を必要に応じて添加することができる。また、培養環境を嫌気性や好気性に維持するためにガスを供給することもできる。しかしながら、培養液に物質を添加・供給する手段は必ずしも備える必要はなく、ガス回収手段１５や培養液採取手段１６を培養液４ａに物質を添加・供給する手段として併用するようにしてもよい。また、上記のように注射器の注射針を弾性材料に差し込んで培養液４ａに物質を添加・供給するようにしてもよい。
【００５０】
尚、図１に示す微生物培養装置１は、培養環境を嫌気性や好気性に制御する際に、微生物培養装置１の培養容器５を密閉性のあるボックスに収容する必要があることから、培養環境の管理（ｐＨ調整や物質供給等）が非常に煩雑である。また、微生物２の培養を行った後に再度別の微生物２を培養する場合には、ボックスも滅菌処理する必要があった。これに対し、図２に示す微生物培養装置１ａによれば、培養容器５内に供給したガス等が培養容器５の外に漏洩することが無い。また、図３及び図４に示す微生物培養装置１ｂによれば、培養槽７内に供給したガス等が培養槽７の外に漏洩することが無い。したがって、培養環境を嫌気性や好気性に制御しやすく、図１に示す微生物培養装置１のように培養容器５をボックスに収容することなく、培養環境をそのまま管理することができる。したがって、培養容器５をボックスに収容していた従来法と比較して培養環境の管理が容易になると共に、再度培養を行う際にボックスを滅菌する手間を省くことも可能となる。
【実施例】
【００５１】
本発明の実施例を以下に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１）
硫酸還元菌であるDeslfovibrio desulfuricans NBRC13699を培養対象微生物として各種実験を行った。
【００５３】
＜実験装置＞
図１に示す培養装置を使用した。具体的には、培養容器５は外径７５ｍｍ、高さ９０ｍｍのガラス製深底シャーレの内側を、一価の陽イオン透過性の交換膜（旭化成、Ｋ−１９２）６で仕切った二槽式とし、一方を培養槽７、他方を対極槽８とした。培養槽７には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の作用極９と、銀・塩化銀参照電極１１（ＨＳ−２０５Ｃ、東亜ＤＫＫ社）を設置した。対極槽８には炭素板（４０ｍｍ×７０ｍｍ、４ｍｍ厚）の対極１０を設置した。これら３本の電極９,１０,１１は電位制御装置（扶桑製作所、ＰＯＴＥＮＴＩＯ／ＧＡＬＶＡＮＯＳＴＡＴ ｍｏｄｅｌ １１０）１２に結線して、培養槽７内の作用極９の電位を厳密に設定可能とした。また、培養に際しては、培養容器５をアクリル製の嫌気ボックス内に封入し、さらに嫌気ボックス全体を３０℃に設定した恒温槽内に設置した。嫌気ボックス１４には、常時窒素ガスを注入し（０．２Ｌ／ｍｉｎ）、嫌気雰囲気を維持した。尚、以降の実施例に示す電位は、全て銀・塩化銀電極電位基準の電位である。
【００５４】
対極槽８に収容する電解液４ｂは以下のようにして得た。即ち、ＮＨ４Ｃｌ；１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４；０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｇ、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調整した液体をオートクレーブ滅菌処理して得た。
【００５５】
また、培養槽７に収容する培養液４ａは、電解液４ｂに乳酸ナトリウム；２．８ｇ、クエン酸三ナトリウム二水和物；０．６２５ｇ、酵母エキスを１．０ｇ、酸化還元物質３としてＡＱＤＳ（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸二ナトリウム）を０．４２ｇ添加し、フィルター（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によりろ過除菌して得た。尚、硫酸還元菌は乳酸を炭素源として生育可能な微生物であるが、硫酸還元菌の生育に必要な微量元素を補填するために酵母エキスを添加した。また、培養液４ａには、硫酸還元菌を添加（植菌）し、初期菌体密度を１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。菌体密度は光学顕微鏡で硫酸還元菌を計数した結果から求めた。
【００５６】
＜実験結果＞
（１）硫酸還元菌の増殖及びエネルギー物質の経時変化
電位を−０．７Ｖに制御し続けたまま培養した場合と通電を行わずに培養した場合とで、硫酸還元菌の増殖の経時変化と微生物細胞内の主要なエネルギー物質であるＡＴＰの濃度の経時変化にどのような違いが現れるのかを確認する実験を行った。
【００５７】
一定の培養期間毎に培養液４ａを採取し、菌体密度とＡＴＰ濃度の定量を行った。菌体密度は光学顕微鏡で硫酸還元菌を計数した結果から求めた。ＡＴＰ濃度の定量は、ルシフェール２５０プラス及びルミテスターＣ−１００Ｎ（キッコーマン）を用い、キット付属のプロトコールに従って実施した。
【００５８】
実験結果を図５に示す。図５において、◆は電位を−０．７Ｖに制御した場合における菌体密度を示し、■は通電しなかった場合における菌体密度を示し、▲は電位を−０．７Ｖに制御した場合におけるＡＴＰ濃度を示し、×は通電しなかった場合におけるＡＴＰ濃度を示している。
【００５９】
図５に示される実験結果から、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、対数増殖期の開始時を１０時間程度早められることが明らかとなった。また、ＡＴＰ濃度についても、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、早期に高められることが明らかとなった。一方で、培養開始から３５時間経過した後は、ＡＴＰ濃度に変化が見られなくなった。
【００６０】
次に、図５の実験結果について、ＡＴＰ濃度を細胞１個体当たりに換算した実験結果、つまり、硫酸還元菌の細胞１個体当たりのＡＴＰ生産量の経時変化を図６に示す。図６に示される結果から、少なくとも培養開始から２４時間電位の制御を行うことで、硫酸還元菌の細胞１個体当たりのＡＴＰ生産量を十分に向上できることが明らかとなった。硫酸還元菌において、尚、電位を−０．７Ｖに制御しながら硫酸還元菌を培養したときの培養開始から２４時間経過時は、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養したときの硫酸還元菌の対数増殖期開始時（対数増殖期の立ち上がり）に該当する。したがって、この結果から硫酸還元菌に限らず微生物全般について、培養対象微生物の培養の際に、培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御し、且つ至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時まで行うことで、微生物細胞内におけるＡＴＰの単位時間当たりの生産量を向上できることが導かれた。
【００６１】
ここで、細胞の状態を知るためには、細胞が実際に利用できるエネルギー量の指標であるアデニル酸エネルギー充填率（adenylate energy charge、以下、ＡＥＣ値と呼ぶ）による評価が有効である。そこで、以下の式によりＡＥＣ値を求めた。
（AEC値）＝([ATP]+0.5[ADP])/([AMP]+[ADP]+[ATP]）
【００６２】
また、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）はピルベートキナーゼによる以下の反応Ａを利用してＡＴＰに変換してから定量し、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）は以下の反応Ａ及びmyoキナーゼによる以下の反応Ｂの組み合わせによりＡＴＰに変換してから定量した。
（反応Ａ）； ＡＤＰ＋phosphoenolpyruvate→ＡＴＰ＋pyruvate
（反応Ｂ）； ＡＭＰ＋ＡＴＰ→２ＡＤＰ
【００６３】
尚、ＡＥＣ値は、対数増殖期初期及び対数増殖期中点において求めた。対数増殖期中点は、以下の式により算出される対数増殖期中点の菌体密度から求めた。また、対数増殖期初期は、増殖開始（対数増殖期開始時（立ち上がり時））から対数増殖期中点までの期間とした。
（対数増殖期中点の菌体密度）＝（（最終到達菌体密度）−（初期菌体密度））／２
【００６４】
本実験では、対数増殖期中点は培養開始から３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、培養開始から４５時間（通電なし）であり（菌体密度２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、対数増殖期中点のＡＥＣ値はこのときの培養液のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの定量分析結果から求めた。また、対数増殖期初期は２４〜３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、３５〜４５時間（通電なし）であり、ＡＥＣ値はこの期間において菌体密度が８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるとき（培養から３０時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、培養から４２時間（通電なし））の培養液のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの定量分析結果から求めた。
【００６５】
実験結果を図７に示す。棒グラフの上の数値は通電なしの場合を１００とした場合のＡＥＣ値の相対値である。図７に示される結果から、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、対数増殖期初期におけるＡＥＣ値を通電しないときのおよそ３倍に増加できることが明らかとなった。これに対し、対数増殖期中点では、通電の有無によってはＡＥＣ値が殆ど変化しなかった。
【００６６】
これらの結果から、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行うことで、対数増殖期初期において、通電しない場合よりも酸化的リン酸化を促進させることができることがわかった。つまり、電位を−０．７Ｖに制御することにより、対数増殖期初期における菌体１個体当たりの単位時間当たりのＡＴＰ生産量を増加させやすくできることがわかった。一方で、対数増殖期中点においては、電位制御が酸化的リン酸化に影響を与えないこともわかった。
【００６７】
次に、対数増殖期初期と対数増殖期中点において、微生物細胞内の主要なエネルギー物質であるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの濃度の通電の有無による違いについて検討した。
【００６８】
尚、ＡＥＣ値を求めた場合と同様、対数増殖期中点は培養開始から３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、培養開始から４５時間（通電なし）とした（菌体密度２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。また、対数増殖期初期は２４〜３５時間（電位を−０．７Ｖに制御時）、３５〜４５時間（通電なし）とし、この期間において菌体密度が８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるときの培養液をＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの定量分析に供した。
【００６９】
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの定量は、それぞれNAD/NADH Quantification kit及びNADP/NADPH Quantification kit（Biovision Inc, US）を用いて実施した。詳細には、一定期間培養した後に回収した硫酸還元菌の細胞を超音波破砕機により破砕し、破砕液を遠心分離操作により分離して上清液を測定に供した。
【００７０】
実験結果を図８及び図９に示す。尚、図８がＮＡＤＨ（さらにＮＡＤ＋）の定量分析結果を示す図であり、図９がＮＡＤＰＨ（さらにはＮＡＤＰ＋）の定量分析結果を示す図である。これらの結果から、電位を−０．７Ｖに制御することで、対数増殖期初期におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを通電しないときよりも増加できることが明らかとなった。これに対し、対数増殖期中点では、通電の有無によってはＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨが殆ど変化しなかった。尚、ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋については、いずれの場合も殆ど変化が見られなかった。
【００７１】
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、細胞内の酸化還元酵素に関わる細胞内で最も多い補酵素であり、ＡＴＰの合成原料となる分子である（１分子のＮＡＤ（Ｐ）Ｈから３分子のＡＴＰが酸化的リン酸化反応で合成される）。ここで、細胞内ＡＴＰの生産に関する上記実験では、少なくとも培養開始から２４時間まで電位を−０．７Ｖに制御することで、硫酸還元菌の細胞内ＡＴＰの単位時間当たりの生産量の向上効果が得られることが確認されたことから、ＡＴＰの合成原料であるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨについても、少なくとも培養開始から２４時間まで電位を−０．７Ｖに制御することで、細胞内生産量を向上できるものと考えられる。また、上記の実験結果から、培養開始時から対数培養期初期における菌体密度が８．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに到達するまでの期間（培養開始時から３０時間）まで電位を−０．７Ｖに制御し続けることで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を確実に向上させることができ、培養開始時から対数培養期中点まで−０．７Ｖに制御し続けることで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量をさらに確実に向上させることができることがわかった。そして、このことから、微生物全般に関し、培養環境の電位を培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、至適電位の制御を少なくとも培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行うことで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が得られ、至適電位の制御を培養開始時から至適電位における培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行うことで、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を向上させる効果が確実に得られることが導かれた。
【００７２】
（２）遺伝子転写分析
上記（１）の実験における対数増殖期初期の遺伝子転写活性と対数増殖期中点の遺伝子転写活性について通電の有無による違いを検討した。
【００７３】
上記（１）の実験において、電位を−０．７Ｖに制御しながら培養を行った場合と通電を行わずに培養を行った場合について、対数増殖期初期（菌体密度：８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の菌体と対数増殖期中点（菌体密度：２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の菌体を回収した。回収した菌体はＲＮＡ精製を行うまでRNA later(Ambion, USA）に浸し、−２０℃で保存した。
【００７４】
上記保存された菌体から全ＲＮＡを抽出・精製した。具体的には、Ribopure-Bacteria kit (Ambion, USA)を用いて精製を行った後、Turbo DNase-free (Ambion, USA) で処理することで混在するゲノムDNAを除去し、精製RNAを得た。精製度は分光光度計（A260/A280）及び電気泳動にて検証した。
【００７５】
次に、精製ＲＮＡの１００ｎｇについて、Transcriptor（Roche, Switzerland）を用いてランダムヘキサマーをプライマーとして逆転写反応を行い、cDNAを調製した。このcDNAを鋳型として、Light cycler ST300（Roche, Switzerland）を用いたリアルタイムPCRにより、16S rRNA遺伝子およびporA, hydA, cytc3, dsrA, gyrA遺伝子の定量を行った。この定量値が各遺伝子の転写量を反映する値である。解析対象とした遺伝子および使用したプライマーの塩基配列を表１に示す。また、使用したプライマーの塩基配列を配列表に示す。尚、プライマーは各種機能遺伝子の配列を基にprimer3 plus programによりデザインした。リアルタイムPCR反応はLight Cycler Fast start DNA Master SYBR GreenIを用い、表２に示す反応条件にて行った。増幅断片の融解曲線分析において目的遺伝子断片の単一ピークのみが得られた試料のみ解析を進めた。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
ここで、本実施例において定量対象とした遺伝子の硫酸還元菌内における機能について図１０に基づいて説明する。porAは乳酸分解に関与する遺伝子である（図１０の（ａ））。hydA及びcytc3は電子伝達に関与する遺伝子である（図１０の（ｂ））。dsrAは硫酸還元に関与する遺伝子である（図１０の（ｃ））。そして、gyrAは複製及び分裂に関与する遺伝子である（図１０の（ｄ））。
【００７９】
各種遺伝子の発現量は測定値を16S rRNA遺伝子量を基準に標準化し、各細胞あたりの発現量として相対評価した。転写量の相対比較はSecond derivative maximum法により算出したCt値 (Crossing time) を用いた比較Ct法により行った。
【００８０】
実験結果を図１１に示す。尚、図１１では、通電なしの場合の遺伝子転写量を１（図１１中の点線）とし、電位を−０．７Ｖに制御した場合の遺伝子転写量をその相対値として示した。つまり、遺伝子転写量が１より大きければ、電位を−０．７Ｖに制御することにより遺伝子転写が活性化していることになる。図１１に示される結果から、対数増殖期初期において、porA以外の遺伝子の転写が活性化していることが確認された。上記の通り、対数増殖期初期においては、細胞内の主要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量が向上することが確認されたことから、細胞内における利用可能エネルギー量が向上したことで、主に呼吸に関与する遺伝子であるhydA、cytc3及びdsrA、複製・分裂に関与する遺伝子であるgyrAの転写が活性化されたものと考えられる。つまり、この結果から、微生物全般に関して、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を増加させることによって、呼吸に関与する遺伝子や複製・分裂に関与する遺伝子を活性化させ、生育の活性化（増殖の促進）を図りつつ、その機能を向上させる効果が得られるものと考えられる。また、エネルギー生産と呼吸は酸化的リン酸化経路において密接に関連していることから、電位制御によって呼吸に関与する遺伝子が活性化した結果として呼吸酵素群が活性化することにより、エネルギー物質の単位時間当たりの生産量が向上することも考えられることから、この効果も相俟ってエネルギー物質の生産効率が極めて優れたものになると考えられる。
【００８１】
（３）乳酸分解速度と硫酸還元速度の分析
硫酸還元菌の主要な反応である乳酸分解と硫酸還元について、培養開始時の乳酸濃度及び硫酸濃度の定量分析結果と、対数増殖期初期における乳酸濃度及び硫酸濃度を定量分析結果とに基づき、培養開始時から対数増殖期初期にかけての乳酸分解速度及び硫酸還元速度を求め、通電の有無（通電した場合は電位を−０．７Ｖに制御）による乳酸分解速度及び硫酸還元速度の違いについて検討した。
【００８２】
硫酸イオン濃度及び乳酸イオン濃度はイオンクロマトアナライザ（ＩＣＳ-１５００、ＤＩＯＮＥＸ製）により測定した。
【００８３】
結果を図１２及び図１３に示す。図１２が通電の有無による乳酸分解速度の違いを示す図であり、図１３が通電の有無による硫酸還元速度の違いを示す図である。尚、図１２及び図１３ともに、棒グラフの上に、通電なしの場合の速度を１００とした場合に対する通電ありの場合の速度を掲載した。これらの結果から、乳酸分解速度及び硫酸還元速度ともに通電ありの場合に向上した。上記の通り、対数増殖期初期においては、細胞内の主要なエネルギー物質であるＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量が向上することが確認されたことから、細胞内における利用可能エネルギー量が向上したことで、乳酸分解反応と硫酸還元反応が促進されたものと考えられる。つまり、この結果から、微生物全般に関して、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの単位時間当たりの生産量を増加させることによって、微生物の呼吸にかかる機能を向上させて、微生物による有用物質等の生産速度の促進や、環境汚染物質の分解速度の促進を図ることが可能になるものと考えられる。また、エネルギー生産と呼吸は酸化的リン酸化経路において密接に関連していることから、電位制御によって呼吸酵素群が活性化することにより、エネルギー物質の単位時間当たりの生産量が向上することも考えられることから、この効果も相俟ってエネルギー物質の生産効率が極めて優れたものになると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養対象微生物を含む培養環境の電位を前記培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、前記至適電位の制御を少なくとも培養開始時から前記至適電位における前記培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い、前記培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることを特徴とする微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項２】
前記至適電位の制御を培養開始時から前記至適電位における前記培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行う請求項１に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項３】
硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．６Ｖ以下に制御するとともに、前記電位の制御を少なくとも培養開始時から前記電位における前記硫酸還元菌の対数増殖期開始時までの期間において行い、前記硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることを特徴とする微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項４】
前記電位の制御を培養開始時から前記電位における前記硫酸還元菌の対数増殖期中点までの期間において行う請求項３に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項５】
硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．７Ｖに制御するとともに、前記電位の制御を少なくとも培養開始時から２４時間行い、前記硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることを特徴とする微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項６】
前記電位の制御を培養開始時から３５時間行う請求項５に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項１】
培養対象微生物を含む培養環境の電位を前記培養対象微生物の至適電位に制御するとともに、前記至適電位の制御を少なくとも培養開始時から前記至適電位における前記培養対象微生物の対数増殖期開始時までの期間において行い、前記培養対象微生物の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることを特徴とする微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項２】
前記至適電位の制御を培養開始時から前記至適電位における前記培養対象微生物の対数増殖期中点までの期間において行う請求項１に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項３】
硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．６Ｖ以下に制御するとともに、前記電位の制御を少なくとも培養開始時から前記電位における前記硫酸還元菌の対数増殖期開始時までの期間において行い、前記硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることを特徴とする微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項４】
前記電位の制御を培養開始時から前記電位における前記硫酸還元菌の対数増殖期中点までの期間において行う請求項３に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項５】
硫酸還元菌を含む培養環境の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．７Ｖに制御するとともに、前記電位の制御を少なくとも培養開始時から２４時間行い、前記硫酸還元菌の細胞内におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の単位時間当たりの生産量を向上させることを特徴とする微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【請求項６】
前記電位の制御を培養開始時から３５時間行う請求項５に記載の微生物細胞内におけるエネルギー物質の生産制御方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−２６３８４８（Ｐ２０１０−２６３８４８Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１９０８０（Ｐ２００９−１１９０８０）
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「大会講演要旨集■２００９年度（平成２１年度）大会［福岡］■」に発表
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「大会講演要旨集■２００９年度（平成２１年度）大会［福岡］■」に発表
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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