微生物計測方法
【課題】
フローサイトメータにおける検出対象微生物の誤カウントを低減する。
【解決手段】
本発明では、蛍光色素が結合した物質を、検出対象試料に導入するステップと、検出対象試料をフィルターでろ過するステップと、フィルター上に捕捉された検出対象微生物を、洗浄液を用いて洗浄するステップと、フィルター上に捕捉された検出対象微生物を、ろ液側から分散液を注入することによって回収するステップと、蛍光微粒子計測機を用いて、回収した検出対象微生物を計測するステップとを含む、微生物計測方法を提供する。
フローサイトメータにおける検出対象微生物の誤カウントを低減する。
【解決手段】
本発明では、蛍光色素が結合した物質を、検出対象試料に導入するステップと、検出対象試料をフィルターでろ過するステップと、フィルター上に捕捉された検出対象微生物を、洗浄液を用いて洗浄するステップと、フィルター上に捕捉された検出対象微生物を、ろ液側から分散液を注入することによって回収するステップと、蛍光微粒子計測機を用いて、回収した検出対象微生物を計測するステップとを含む、微生物計測方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を計測する方法に関し、特に、河川及び湖沼等の環境水や上下水道の各処理プロセスの処理水等に存在する原虫、細菌、ウイルスといった水系感染性微生物を計測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には多種多様な化学物質が存在するため、水道原水となる河川や湖沼等の環境水も様々な化学物質で汚染されていると考えられる。しかし、このような水環境の水質問題の他にクリプトスポリジウム等の原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌等の細菌、ウイルス等による水系感染症の発生が大きな社会問題となっている。
【０００３】
これらの水系感染症の集団発生を防ぐためには水処理プロセスにおける原因微生物を高頻度にモニタリングすることが必要不可欠である。そして、そのモニタリングの結果を処理プロセスにフィードバックし、環境中に存在する水系感染性微生物を適切に除去、殺菌又は消毒する必要がある。しかし、試料中から微生物を効率よく検出する技術が確立されておらず、環境中にわずかにしか含まれていない病原微生物を検出するために高度な熟練と時間が必要とされている。
【０００４】
これに対して、例えば、特許文献１（特開平７−１４０１４８号公報）では、測定の高頻度化、自動化、省力化のために、検出対象微生物を選択的に蛍光標識し、試料をフローサイトメータに連続的に送液し、粒子の蛍光強度から検出対象微生物を検出する方法が開示されている。検出対象微生物を蛍光標識する手段には、検出対象微生物に選択的に結合し、かつ蛍光物質が結合した抗体が用いられる。フローサイトメータは、粒子の蛍光強度及び粒子の粒径を示す前方散乱光強度、粒子の内部構造を示す側方散乱光強度を測定する分析装置である。蛍光標識した検出対象微生物を検出するとき、検出対象微生物の蛍光強度及び粒径を示す前方散乱光強度の領域をあらかじめ設定しておき、測定した粒子がこの領域に含まれるときには検出対象微生物としてカウントすることによって測定できる。さらに、検出精度を高めるには前述の領域に加え、夾雑物特有の蛍光強度よりも小さいという判定基準を設定することが有効である。
【０００５】
しかしながら、環境水中には、地域の特性や降雨等の天候により大きく変動するが、ウイルス、細菌、線虫等の微生物や藻類、フミン酸等の土壌有機物、砂等の無機物といった夾雑物が大量に存在する。このような夾雑物に、前記抗体が非選択的に結合あるいは吸着し、検出対象微生物と同等の蛍光強度及び粒径を示す場合、フローサイトメータにおいて、このような夾雑物を検出対象微生物として誤ってカウントする恐れがある。特に、測定試料中の粒子（検出対象微生物及び夾雑物）の個数濃度が高くなると、より顕著に現れる恐れがある。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１４０１４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の問題点を鑑み、試料水に大量の夾雑物が混入しても、フローサイトメータにおける検出対象微生物の誤カウントを低減し、検出対象微生物を容易に高精度で検出、計数することができる微生物計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は、蛍光微粒子計測機を用いて検出対象微生物を計測する微生物計測方法を提供する。この微生物計測方法は、（ａ）蛍光色素が結合した物質を、前記検出対象試料に導入するステップであって、前記物質は、前記検出対象微生物に特異的に結合する、ステップと、（ｂ）前記検出対象試料をフィルターでろ過するステップと、（ｃ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、洗浄液を用いて洗浄するステップであって、前記洗浄液は、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、（ｄ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、ろ液側から分散液を注入することによって回収するステップであって、前記分散液は、塩濃度が低く、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、（ｅ）前記蛍光微粒子計測機を用いて、前記回収した検出対象微生物を計測するステップとを含む。
また、上記物質は、検出対象微生物に特異的に結合する抗体であることが好適である。
膜は、検出対象微生物の粒径よりも小さい孔径を有し、親水性かつ表面が平滑な平膜であることが好適である。
蛍光微粒子計測機は、フローサイトメトリ法を用いることが好適である。さらに、検出対象試料は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適であり、検出対象微生物及び／又は夾雑物を含むものである。
なお、本発明の微生物計測方法は、上記手順で行うことが好ましいが、上記手順に限定されるものではない。
【０００９】
本発明では、微生物計測装置として、多孔平膜を境に上空間、下空間を形成するフローセルと、上空間を電磁弁を介して検査対象水タンク内の検査対象水に連通させ、さらに上空間をポンプあるいはコンプレッサの吸引口、吐出口のいずれか一方を電磁弁の切り替えによって連通させ、さらに上空間を電磁弁を介して濃縮試料回収タンクに連通させてなり、下空間を、電磁弁を介して廃液タンクに連通させ、さらに下空間を電磁弁を介して洗浄液タンク内の洗浄液に連通させ、ポンプあるいはコンプレッサの吸引口を、電磁弁を介して廃液タンクに連通し、多孔平膜上に物理的撹拌手段が置かれた構成を備えたものを用いることが好適である。
【００１０】
多孔平膜が、樹脂の粒子を溶結着してなる板状フィルターにて支持されることが好適である。また、多孔平膜が、検出対象微生物の粒径よりも小さい孔径を有し、親水性かつ表面が平滑な平膜であることが好適である。
本発明で濃縮試料は、特願２００８−０６０７４７に開示された微生物濃縮方法を用いて調製されることが好適である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物計測方法により、検出対象試料に大量の夾雑物が混入しても、フローサイトメータにおける検出対象微生物の誤カウントを低減し、検出対象微生物を容易に高精度で検出、計測することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明に係る微生物計測方法及び装置の実施の形態について説明する。
図１に、本発明に係る微生物計測方法を実施する微生物濃縮装置に用いるろ過器１００についてその一実施の形態を示す。なお、本発明に係る微生物計測方法では、様々な微生物を計測することができる。本実施の形態では、その一例として、クリプトスポリジウムを計測する。
【００１３】
図１に示すように、本実施の形態に係るろ過器１００は、その本来の機能を果たすトラックエッチ膜１０１（以下、膜１０１）を備えている。膜１０１は、メッシュクロス１０２を支持体とし、膜固定パッキン１０３で固定されている。この全体をフローセル上部１０４とフォローセル下部１０５とで挟み込んでいる。これによって、膜１０１を介して試料水とろ液が分離できる構造となる。膜は、試料中のクリプトスポリジウムを捕捉するための親水性でかつ表面が平滑な平膜として孔径２あるいは３μｍのトラックエッチフィルター（ワットマン社、商品名ニュークレポアフィルターあるいはミリポア社、アイソポアメンブレンフィルター）を用いることが好適である。クリプトスポリジウムオーシストの粒径は４〜６μｍであり、またトラックエッチフィルターの孔径はプラス０％、マイナス１０％の精度を有するため、ほぼ１００％でクリプトスポリジウムを平膜上に捕捉することができる。
【００１４】
ろ過器１００内の圧力変化により、膜１０１が変形して伸びることがある。これによって、膜１０１の孔径が広がることがある。したがって、本実施の形態では、試料水の供給圧による膜１０１の変形を防ぐため、ろ液が流下でき、膜１０１の形状を保持できる支持体の上に膜１０１を固定する。支持体としてはメッシュクロス１０２を用いることができる。例えば、ポリプロピレン製の目開き３０メッシュクロス（ＮＢＣ社）を用いることができる。
【００１５】
フローセル上部１０４には、試料水供給口１１１と、試料回収口１１２、試料水から分離された微生物を含む懸濁液を空気圧により回収するための加圧及び／又は吸気口１１３とが設けられている。フローセル下部１０５には、ろ液排出口１１４と、洗浄水供給口１１５とが設けられている。試料水から分離された微生物を回収するため、試料回収口１１２は、下側に傾けた構造であることが望ましい。これにより、クリプトスポリジウムを含む液を試料回収口１１２に流下させ、効率よく回収することができる。
【００１６】
次に、図２及び図３を用いて、本発明に係る微生物計測方法の実施形態について説明する。図２は、本発明に係る微生物計測方法を実施する装置の実施の形態を示す。図３は、本発明に係る微生物計測方法を実施する装置の実施の形態についてその流れを示す。
【００１７】
本実施の形態の装置は、上記図１について説明したろ過器１００と、試料タンク２１１と、洗浄液タンク２１２と、分散液タンク２１３、廃液タンク２１４、試料回収タンク２１５と、ポンプ２０８、負圧圧力計２２１と、正圧圧力計２２２と、バルブ（２３１〜２３９）とを備える。ろ過器１００は、ラインＬ２１によって試料タンク２１１及び洗浄液タンク２１２と、ラインＬ２２によって洗浄液タンク２１２及び分散液タンク２１３と、ラインＬ２３によって廃液タンク２１４と、ラインＬ２４によって試料回収タンク２１５とそれぞれ接続されている。
図２の上記構成要素を初めとする装置構成要素の相互の関係は、引き続く図３についての説明で明らかとなる。
【００１８】
続いて、図３に従って、本発明に係る微生物計測方法の一実施の形態を説明する。
まず、試料水から分離、濃縮したクリプトスポリジウムを含む濃縮試料にクリプトスポリジウム標識抗体を添加する（ステップ３０１）。クリプトスポリジウム標識抗体は、例えば、イージーステインＦＩＴＣ（和光純薬）等を用いることが好適である。続いて、３７℃において３０分以上、あるいは室温において１時間以上で、クリプトスポリジウムを含む濃縮試料をその標識抗体と抗原抗体反応させる。
【００１９】
次に、バルブ２３１、２３４を開き試料供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ３０２）。廃液タンク２１４内は減圧され、ろ過器１００内も減圧されるため試料水はろ過器１００内に吸引される。ろ液は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１４内に排出される。ここで、廃液タンク２１４は耐圧性のものを使用することが望ましい。このとき、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計ＰＳ１で測定される。膜の破断圧力は、６９ｋＰａである。したがって、安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプの運転を制御する。これにより試料水は一定圧力でろ過される。また、例えば、試料中の鋭利な粒子が膜を傷つけて膜が破断した場合、４５〜５０ｋＰａに制御されていた吸引圧力が正圧側に急激に変化するため、この圧力変動をモニタすることで試料調整の運転中止を判断することができる。
【００２０】
試料水のろ過が終了したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３１、２３４を閉じ、バルブ２３５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ３０３）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００２１】
次に、洗浄液をろ過器１００内に通水し、ろ過器１００及び膜１０１上に捕捉された夾雑物を洗い流す。バルブ２３２、２３４を開き洗浄水供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０４）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器内も減圧されるため洗浄水タンク２１２の洗浄水はろ過器１００内に吸収される。洗浄水は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１４内に排出される。同様に、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計ＰＳ１で測定される。膜の破断圧力は６９ｋＰａであるので安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプ２０８の運転を制御する。
【００２２】
一定の洗浄時間が経過した後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３２、２３４を閉じ、バルブ２３５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０５）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。一定の洗浄時間は、廃液のｐＨが中性付近になるまでの時間を予め測定することによって決定される。
【００２３】
蛍光色素は、フルオレセントイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が好適である。ＦＩＴＣは、ｐＨ９〜１０で最も蛍光強度が高く、酸性になると蛍光強度が低下する。また、極性有機溶媒とカオトロピック試薬は反応性が高く、ＦＩＴＣを変性あるいは分解する恐れがある。このため、本発明では、洗浄液はｐＨ１０付近であり、極性有機溶媒とカオトロピック試薬を用いないことが好ましい。
【００２４】
上記洗浄液は、蛍光色素を分解しないものであり、蛍光色素と検出対象微生物との結合を解離せず、蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである必要がある。
すなわち、洗浄液は、弱アルカリ性であって、界面活性剤及び高濃度塩を含むものであることが最も好適である。
【００２５】
ここで、界面活性剤は、標識抗体の非特異結合を防ぐために用いられる。さらに、界面活性剤は、測定試料の微粒子の分散性を向上させるためにも用いられる。
採用することができる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤等を挙げることができる。具体的には、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソスビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ｎ−テトラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−４０）、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ））プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される少なくとも一を使用することが好ましいが、これに限定されない。
採用することができる塩としては、抗体の疎水的結合を弱める塩が好適である。例えば、ＮａＣｌ，ＭｇＣｌ２等を用いることが好ましい。濃度は、１Ｍ〜３Ｍの高濃度で含まれることが好ましい。
また、弱アルカリ性の数値範囲としては、ｐＨ９〜１０が好適である。
後の実施例で確認されるように、洗浄液として、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０及び２ＭのＮａＣｌを添加したものを使用することが好ましい。
【００２６】
次に、バルブ２３７、２３９を開き分散液供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０６）。これにより、膜１０１上に捕捉されていた検出対象微生物を、分散液中に分散させる。その後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３９、２３７を閉じ、バルブ２３８を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０７）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
採用することができる分散液は、塩濃度が低く、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである必要がある。組成は、上記洗浄液に対し、金属塩が含まれていないか、含まれていたとしても低濃度（数μｇ／Ｌまでの濃度、好適には検出限界以下）である必要がある。
採用することができる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤等を挙げることができる。具体的には、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソスビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ｎ−テトラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−４０）、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ））プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される少なくとも一を使用することが好ましいが、これに限定されない。
また、弱アルカリ性の数値範囲としては、ｐＨ９〜１０が好適である。
後の実施例で確認されるように、分散液として、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を添加したものを使用することが好ましい。
【００２７】
続いて、バルブ２３６、２３８を開き試料回収流路を形成し、バルブ２２２を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０８）。これにより、ろ過器の加圧及び／又は吸気口からエアが供給され、ろ過器１００は加圧され、ろ過器内に溜まったクリプトスポリジウムを含む溶液は、試料回収タンク２１５に圧送される。このとき試料回収口のチューブは膜１０１上の直上まで接近し、ろ過器１００も試料回収口側に傾いており、溶液が試料回収口に溜まっていることが望ましい。
【００２８】
クリプトスポリジウムを含む溶液を回収したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２２、２３８、２３６を閉じ、バルブ２３８を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０９）。大気開放した後、バルブを初期の状態に戻す。続いて、蛍光微粒子計測機を用いて、検出対象微生物を計測する（ステップ３１０）。
【実施例１】
【００２９】
本発明者らは、図１及び２に示した装置を用い、図３に示す手順に従って、蛍光標識したクリプトスポリジウムに対し、使用した分散液が蛍光強度に及ぼす影響について検証した。図４は、蛍光標識したクリプトスポリジウムを純水に懸濁し、フローサイトメトリ法を用いて蛍光微粒子計測したときの２次元プトットのグラフを示す。縦軸は、ＦＩＴＣの蛍光強度、横軸は前方散乱光強度である。また、図中の囲みは、蛍光標識したクリプトスポリジウムが分布する領域を示す。
【００３０】
図５は、蛍光標識したクリプトスポリジウムをｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、２ＭのＮａＣｌと、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を添加した洗浄液に懸濁させ、フローサイトメトリ法を用いる蛍光微粒子計測機によって計測したときの２次元プロットのグラフを示す。この結果、蛍光標識したクリプトスポリジウムの分布が大きく変動した。これは、洗浄液に添加しているＮａＣｌの影響によって屈折率が大きく変化し、フローサイトメトリ法を用いる蛍光微粒子計測機では、蛍光標識したクリプトスポリジウムの蛍光が散乱するためであると考えられる。
【００３１】
図６は、蛍光標識したクリプトスポリジウムを、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を添加した洗浄液に懸濁させ、フローサイトメトリ法を用いる蛍光微粒子計測機によって計測したときの２次元プトットのグラフを示す。この結果、蛍光標識したクリプトスポリジウムの分布は、図４に示した純水に懸濁したときの分布とほぼ同一となった。
【００３２】
以上の結果より、夾雑物に非選択的に結合あるいは吸着した標識抗体を洗い流す洗浄液は、弱アルカリ性であって、界面活性剤及び高濃度塩を含むものが好適であり、具体的組成として、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、２ＭのＮａＣｌ及び０．０１％のＴｗｅｅｎ８０９を添加した洗浄液が使用でき、一方、洗浄した微粒子を回収するための分散液の組成として、洗浄液からＮａＣｌを除いた、低塩濃度の組成が好ましいことがわかった。
【実施例２】
【００３３】
本発明者らは、図１及び２に示した装置を用い、図３に示す手順に従って、誤カウント低減の効果を検証した。
まず、３種類の河川原水Ａ〜Ｃについてクリプトスポリジウムを分離、濃縮した。続いて、この濃縮試料に対して、本発明の微生物計測方法を実施した。ここで、上記河川原水Ａ〜Ｃにはクリプトスポリジウムが混入していないことを、手分析（（社）日本水道協会（２００３年）『クリプトスポリジウム −解説と試験方法−』）によって確認している。したがって、蛍光微生物計測でのカウント値は０となる。
【００３４】
図７は、河川Ａの濃縮試料について蛍光標識後に洗浄を実施しないで蛍光微粒子計測機を用いて計測した２次元プロットのグラフを示す。図中の囲みに混入する粒子があり、これがクリプトスポリジウムとして誤カウントすることがわかる。
【００３５】
図８は、河川Ａの濃縮試料について蛍光標識後に洗浄を実施したときの蛍光微粒子計測機を用いて計測した２次元プロットのグラフを示す。図中の囲みに混入する粒子がなくなり、クリプトスポリジウムとして誤カウントする粒子が低減した。
【００３６】
図９は、３種類の河川原水１Ｌ中においてカウントされる誤カウントの低減効果を示す。本発明の微生物計測方法において、河川Ａ及び河川Ｂで誤カウントが０となり、河川Ｂでも誤カウントを１０倍以上低減することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係る微生物計測方法に用いる装置のろ過について一実施の形態を示す概略図である。
【図２】本発明に係る微生物計測方法を実施する装置について一実施の形態を示す構成図である。
【図３】本発明に係る微生物計測方法の実施を示すフローチャートである。
【図４】本発明に係る微生物計測方法を用いて、純水に懸濁した蛍光標識クリプトスポリジウムを計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図５】本発明に係る微生物計測方法を用いて、洗浄液に懸濁した蛍光標識クリプトスポリジウムを計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図６】本発明に係る微生物計測方法を用いて、分散液に懸濁した蛍光標識クリプトスポリジウムを計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図７】本発明に係る微生物計測方法を用いないで、試料を計測したときの２次元プロットで示したグラフある。
【図８】本発明に係る微生物計測方法を用いて、河川Ａの溶液を計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図９】本発明に係る微生物計測方法を用いて、河川Ａ〜Ｃの溶液を計測したときの誤カウント数を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３８】
１００ ろ過器
１０１ 膜
１０２ メッシュクロス
１０３ 膜固定パッキン
１０４ フローセル上部
１０５ フローセル下部
１０６ 磁石入り撹拌子
２０８ エアポンプ
２１１ 試料タンク
２１２ 洗浄水タンク
２１３ 分散液タンク
２１４ 廃液タンク
２１５ 試料回収タンク
２３１〜２３９ バルブ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を計測する方法に関し、特に、河川及び湖沼等の環境水や上下水道の各処理プロセスの処理水等に存在する原虫、細菌、ウイルスといった水系感染性微生物を計測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には多種多様な化学物質が存在するため、水道原水となる河川や湖沼等の環境水も様々な化学物質で汚染されていると考えられる。しかし、このような水環境の水質問題の他にクリプトスポリジウム等の原虫類、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７やレジオネラ菌等の細菌、ウイルス等による水系感染症の発生が大きな社会問題となっている。
【０００３】
これらの水系感染症の集団発生を防ぐためには水処理プロセスにおける原因微生物を高頻度にモニタリングすることが必要不可欠である。そして、そのモニタリングの結果を処理プロセスにフィードバックし、環境中に存在する水系感染性微生物を適切に除去、殺菌又は消毒する必要がある。しかし、試料中から微生物を効率よく検出する技術が確立されておらず、環境中にわずかにしか含まれていない病原微生物を検出するために高度な熟練と時間が必要とされている。
【０００４】
これに対して、例えば、特許文献１（特開平７−１４０１４８号公報）では、測定の高頻度化、自動化、省力化のために、検出対象微生物を選択的に蛍光標識し、試料をフローサイトメータに連続的に送液し、粒子の蛍光強度から検出対象微生物を検出する方法が開示されている。検出対象微生物を蛍光標識する手段には、検出対象微生物に選択的に結合し、かつ蛍光物質が結合した抗体が用いられる。フローサイトメータは、粒子の蛍光強度及び粒子の粒径を示す前方散乱光強度、粒子の内部構造を示す側方散乱光強度を測定する分析装置である。蛍光標識した検出対象微生物を検出するとき、検出対象微生物の蛍光強度及び粒径を示す前方散乱光強度の領域をあらかじめ設定しておき、測定した粒子がこの領域に含まれるときには検出対象微生物としてカウントすることによって測定できる。さらに、検出精度を高めるには前述の領域に加え、夾雑物特有の蛍光強度よりも小さいという判定基準を設定することが有効である。
【０００５】
しかしながら、環境水中には、地域の特性や降雨等の天候により大きく変動するが、ウイルス、細菌、線虫等の微生物や藻類、フミン酸等の土壌有機物、砂等の無機物といった夾雑物が大量に存在する。このような夾雑物に、前記抗体が非選択的に結合あるいは吸着し、検出対象微生物と同等の蛍光強度及び粒径を示す場合、フローサイトメータにおいて、このような夾雑物を検出対象微生物として誤ってカウントする恐れがある。特に、測定試料中の粒子（検出対象微生物及び夾雑物）の個数濃度が高くなると、より顕著に現れる恐れがある。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１４０１４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の問題点を鑑み、試料水に大量の夾雑物が混入しても、フローサイトメータにおける検出対象微生物の誤カウントを低減し、検出対象微生物を容易に高精度で検出、計数することができる微生物計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は、蛍光微粒子計測機を用いて検出対象微生物を計測する微生物計測方法を提供する。この微生物計測方法は、（ａ）蛍光色素が結合した物質を、前記検出対象試料に導入するステップであって、前記物質は、前記検出対象微生物に特異的に結合する、ステップと、（ｂ）前記検出対象試料をフィルターでろ過するステップと、（ｃ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、洗浄液を用いて洗浄するステップであって、前記洗浄液は、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、（ｄ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、ろ液側から分散液を注入することによって回収するステップであって、前記分散液は、塩濃度が低く、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、（ｅ）前記蛍光微粒子計測機を用いて、前記回収した検出対象微生物を計測するステップとを含む。
また、上記物質は、検出対象微生物に特異的に結合する抗体であることが好適である。
膜は、検出対象微生物の粒径よりも小さい孔径を有し、親水性かつ表面が平滑な平膜であることが好適である。
蛍光微粒子計測機は、フローサイトメトリ法を用いることが好適である。さらに、検出対象試料は、河川や湖沼等から採水されたものであることが好適であり、検出対象微生物及び／又は夾雑物を含むものである。
なお、本発明の微生物計測方法は、上記手順で行うことが好ましいが、上記手順に限定されるものではない。
【０００９】
本発明では、微生物計測装置として、多孔平膜を境に上空間、下空間を形成するフローセルと、上空間を電磁弁を介して検査対象水タンク内の検査対象水に連通させ、さらに上空間をポンプあるいはコンプレッサの吸引口、吐出口のいずれか一方を電磁弁の切り替えによって連通させ、さらに上空間を電磁弁を介して濃縮試料回収タンクに連通させてなり、下空間を、電磁弁を介して廃液タンクに連通させ、さらに下空間を電磁弁を介して洗浄液タンク内の洗浄液に連通させ、ポンプあるいはコンプレッサの吸引口を、電磁弁を介して廃液タンクに連通し、多孔平膜上に物理的撹拌手段が置かれた構成を備えたものを用いることが好適である。
【００１０】
多孔平膜が、樹脂の粒子を溶結着してなる板状フィルターにて支持されることが好適である。また、多孔平膜が、検出対象微生物の粒径よりも小さい孔径を有し、親水性かつ表面が平滑な平膜であることが好適である。
本発明で濃縮試料は、特願２００８−０６０７４７に開示された微生物濃縮方法を用いて調製されることが好適である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物計測方法により、検出対象試料に大量の夾雑物が混入しても、フローサイトメータにおける検出対象微生物の誤カウントを低減し、検出対象微生物を容易に高精度で検出、計測することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明に係る微生物計測方法及び装置の実施の形態について説明する。
図１に、本発明に係る微生物計測方法を実施する微生物濃縮装置に用いるろ過器１００についてその一実施の形態を示す。なお、本発明に係る微生物計測方法では、様々な微生物を計測することができる。本実施の形態では、その一例として、クリプトスポリジウムを計測する。
【００１３】
図１に示すように、本実施の形態に係るろ過器１００は、その本来の機能を果たすトラックエッチ膜１０１（以下、膜１０１）を備えている。膜１０１は、メッシュクロス１０２を支持体とし、膜固定パッキン１０３で固定されている。この全体をフローセル上部１０４とフォローセル下部１０５とで挟み込んでいる。これによって、膜１０１を介して試料水とろ液が分離できる構造となる。膜は、試料中のクリプトスポリジウムを捕捉するための親水性でかつ表面が平滑な平膜として孔径２あるいは３μｍのトラックエッチフィルター（ワットマン社、商品名ニュークレポアフィルターあるいはミリポア社、アイソポアメンブレンフィルター）を用いることが好適である。クリプトスポリジウムオーシストの粒径は４〜６μｍであり、またトラックエッチフィルターの孔径はプラス０％、マイナス１０％の精度を有するため、ほぼ１００％でクリプトスポリジウムを平膜上に捕捉することができる。
【００１４】
ろ過器１００内の圧力変化により、膜１０１が変形して伸びることがある。これによって、膜１０１の孔径が広がることがある。したがって、本実施の形態では、試料水の供給圧による膜１０１の変形を防ぐため、ろ液が流下でき、膜１０１の形状を保持できる支持体の上に膜１０１を固定する。支持体としてはメッシュクロス１０２を用いることができる。例えば、ポリプロピレン製の目開き３０メッシュクロス（ＮＢＣ社）を用いることができる。
【００１５】
フローセル上部１０４には、試料水供給口１１１と、試料回収口１１２、試料水から分離された微生物を含む懸濁液を空気圧により回収するための加圧及び／又は吸気口１１３とが設けられている。フローセル下部１０５には、ろ液排出口１１４と、洗浄水供給口１１５とが設けられている。試料水から分離された微生物を回収するため、試料回収口１１２は、下側に傾けた構造であることが望ましい。これにより、クリプトスポリジウムを含む液を試料回収口１１２に流下させ、効率よく回収することができる。
【００１６】
次に、図２及び図３を用いて、本発明に係る微生物計測方法の実施形態について説明する。図２は、本発明に係る微生物計測方法を実施する装置の実施の形態を示す。図３は、本発明に係る微生物計測方法を実施する装置の実施の形態についてその流れを示す。
【００１７】
本実施の形態の装置は、上記図１について説明したろ過器１００と、試料タンク２１１と、洗浄液タンク２１２と、分散液タンク２１３、廃液タンク２１４、試料回収タンク２１５と、ポンプ２０８、負圧圧力計２２１と、正圧圧力計２２２と、バルブ（２３１〜２３９）とを備える。ろ過器１００は、ラインＬ２１によって試料タンク２１１及び洗浄液タンク２１２と、ラインＬ２２によって洗浄液タンク２１２及び分散液タンク２１３と、ラインＬ２３によって廃液タンク２１４と、ラインＬ２４によって試料回収タンク２１５とそれぞれ接続されている。
図２の上記構成要素を初めとする装置構成要素の相互の関係は、引き続く図３についての説明で明らかとなる。
【００１８】
続いて、図３に従って、本発明に係る微生物計測方法の一実施の形態を説明する。
まず、試料水から分離、濃縮したクリプトスポリジウムを含む濃縮試料にクリプトスポリジウム標識抗体を添加する（ステップ３０１）。クリプトスポリジウム標識抗体は、例えば、イージーステインＦＩＴＣ（和光純薬）等を用いることが好適である。続いて、３７℃において３０分以上、あるいは室温において１時間以上で、クリプトスポリジウムを含む濃縮試料をその標識抗体と抗原抗体反応させる。
【００１９】
次に、バルブ２３１、２３４を開き試料供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動する（ステップ３０２）。廃液タンク２１４内は減圧され、ろ過器１００内も減圧されるため試料水はろ過器１００内に吸引される。ろ液は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１４内に排出される。ここで、廃液タンク２１４は耐圧性のものを使用することが望ましい。このとき、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計ＰＳ１で測定される。膜の破断圧力は、６９ｋＰａである。したがって、安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプの運転を制御する。これにより試料水は一定圧力でろ過される。また、例えば、試料中の鋭利な粒子が膜を傷つけて膜が破断した場合、４５〜５０ｋＰａに制御されていた吸引圧力が正圧側に急激に変化するため、この圧力変動をモニタすることで試料調整の運転中止を判断することができる。
【００２０】
試料水のろ過が終了したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３１、２３４を閉じ、バルブ２３５を開き、配管内を大気開放として残圧を除く（ステップ３０３）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
【００２１】
次に、洗浄液をろ過器１００内に通水し、ろ過器１００及び膜１０１上に捕捉された夾雑物を洗い流す。バルブ２３２、２３４を開き洗浄水供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０４）。廃液タンク２１３内は減圧され、ろ過器内も減圧されるため洗浄水タンク２１２の洗浄水はろ過器１００内に吸収される。洗浄水は膜１０１を透過し、ろ液排出口１１４から廃液タンク２１４内に排出される。同様に、エアポンプ２０８による吸引圧力は負圧圧力計ＰＳ１で測定される。膜の破断圧力は６９ｋＰａであるので安全をみて、吸引圧力が４５〜５０ｋＰａになるようにエアポンプ２０８の運転を制御する。
【００２２】
一定の洗浄時間が経過した後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３２、２３４を閉じ、バルブ２３５を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０５）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。一定の洗浄時間は、廃液のｐＨが中性付近になるまでの時間を予め測定することによって決定される。
【００２３】
蛍光色素は、フルオレセントイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が好適である。ＦＩＴＣは、ｐＨ９〜１０で最も蛍光強度が高く、酸性になると蛍光強度が低下する。また、極性有機溶媒とカオトロピック試薬は反応性が高く、ＦＩＴＣを変性あるいは分解する恐れがある。このため、本発明では、洗浄液はｐＨ１０付近であり、極性有機溶媒とカオトロピック試薬を用いないことが好ましい。
【００２４】
上記洗浄液は、蛍光色素を分解しないものであり、蛍光色素と検出対象微生物との結合を解離せず、蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである必要がある。
すなわち、洗浄液は、弱アルカリ性であって、界面活性剤及び高濃度塩を含むものであることが最も好適である。
【００２５】
ここで、界面活性剤は、標識抗体の非特異結合を防ぐために用いられる。さらに、界面活性剤は、測定試料の微粒子の分散性を向上させるためにも用いられる。
採用することができる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤等を挙げることができる。具体的には、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソスビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ｎ−テトラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−４０）、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ））プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される少なくとも一を使用することが好ましいが、これに限定されない。
採用することができる塩としては、抗体の疎水的結合を弱める塩が好適である。例えば、ＮａＣｌ，ＭｇＣｌ２等を用いることが好ましい。濃度は、１Ｍ〜３Ｍの高濃度で含まれることが好ましい。
また、弱アルカリ性の数値範囲としては、ｐＨ９〜１０が好適である。
後の実施例で確認されるように、洗浄液として、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０及び２ＭのＮａＣｌを添加したものを使用することが好ましい。
【００２６】
次に、バルブ２３７、２３９を開き分散液供給流路を形成し、バルブ２２１を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０６）。これにより、膜１０１上に捕捉されていた検出対象微生物を、分散液中に分散させる。その後、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２１、２３９、２３７を閉じ、バルブ２３８を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０７）。大気に開放した後、バルブを初期の状態に戻す。
採用することができる分散液は、塩濃度が低く、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである必要がある。組成は、上記洗浄液に対し、金属塩が含まれていないか、含まれていたとしても低濃度（数μｇ／Ｌまでの濃度、好適には検出限界以下）である必要がある。
採用することができる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤等を挙げることができる。具体的には、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソスビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ｎ−テトラデシル−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−４０）、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ））プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される少なくとも一を使用することが好ましいが、これに限定されない。
また、弱アルカリ性の数値範囲としては、ｐＨ９〜１０が好適である。
後の実施例で確認されるように、分散液として、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を添加したものを使用することが好ましい。
【００２７】
続いて、バルブ２３６、２３８を開き試料回収流路を形成し、バルブ２２２を開きエアポンプ２０８を作動させる（ステップ３０８）。これにより、ろ過器の加圧及び／又は吸気口からエアが供給され、ろ過器１００は加圧され、ろ過器内に溜まったクリプトスポリジウムを含む溶液は、試料回収タンク２１５に圧送される。このとき試料回収口のチューブは膜１０１上の直上まで接近し、ろ過器１００も試料回収口側に傾いており、溶液が試料回収口に溜まっていることが望ましい。
【００２８】
クリプトスポリジウムを含む溶液を回収したら、エアポンプ２０８を停止し、バルブ２２２、２３８、２３６を閉じ、バルブ２３８を開き、配管内を大気開放とし残圧を除く（ステップ３０９）。大気開放した後、バルブを初期の状態に戻す。続いて、蛍光微粒子計測機を用いて、検出対象微生物を計測する（ステップ３１０）。
【実施例１】
【００２９】
本発明者らは、図１及び２に示した装置を用い、図３に示す手順に従って、蛍光標識したクリプトスポリジウムに対し、使用した分散液が蛍光強度に及ぼす影響について検証した。図４は、蛍光標識したクリプトスポリジウムを純水に懸濁し、フローサイトメトリ法を用いて蛍光微粒子計測したときの２次元プトットのグラフを示す。縦軸は、ＦＩＴＣの蛍光強度、横軸は前方散乱光強度である。また、図中の囲みは、蛍光標識したクリプトスポリジウムが分布する領域を示す。
【００３０】
図５は、蛍光標識したクリプトスポリジウムをｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、２ＭのＮａＣｌと、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を添加した洗浄液に懸濁させ、フローサイトメトリ法を用いる蛍光微粒子計測機によって計測したときの２次元プロットのグラフを示す。この結果、蛍光標識したクリプトスポリジウムの分布が大きく変動した。これは、洗浄液に添加しているＮａＣｌの影響によって屈折率が大きく変化し、フローサイトメトリ法を用いる蛍光微粒子計測機では、蛍光標識したクリプトスポリジウムの蛍光が散乱するためであると考えられる。
【００３１】
図６は、蛍光標識したクリプトスポリジウムを、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を添加した洗浄液に懸濁させ、フローサイトメトリ法を用いる蛍光微粒子計測機によって計測したときの２次元プトットのグラフを示す。この結果、蛍光標識したクリプトスポリジウムの分布は、図４に示した純水に懸濁したときの分布とほぼ同一となった。
【００３２】
以上の結果より、夾雑物に非選択的に結合あるいは吸着した標識抗体を洗い流す洗浄液は、弱アルカリ性であって、界面活性剤及び高濃度塩を含むものが好適であり、具体的組成として、ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン緩衝液に、２ＭのＮａＣｌ及び０．０１％のＴｗｅｅｎ８０９を添加した洗浄液が使用でき、一方、洗浄した微粒子を回収するための分散液の組成として、洗浄液からＮａＣｌを除いた、低塩濃度の組成が好ましいことがわかった。
【実施例２】
【００３３】
本発明者らは、図１及び２に示した装置を用い、図３に示す手順に従って、誤カウント低減の効果を検証した。
まず、３種類の河川原水Ａ〜Ｃについてクリプトスポリジウムを分離、濃縮した。続いて、この濃縮試料に対して、本発明の微生物計測方法を実施した。ここで、上記河川原水Ａ〜Ｃにはクリプトスポリジウムが混入していないことを、手分析（（社）日本水道協会（２００３年）『クリプトスポリジウム −解説と試験方法−』）によって確認している。したがって、蛍光微生物計測でのカウント値は０となる。
【００３４】
図７は、河川Ａの濃縮試料について蛍光標識後に洗浄を実施しないで蛍光微粒子計測機を用いて計測した２次元プロットのグラフを示す。図中の囲みに混入する粒子があり、これがクリプトスポリジウムとして誤カウントすることがわかる。
【００３５】
図８は、河川Ａの濃縮試料について蛍光標識後に洗浄を実施したときの蛍光微粒子計測機を用いて計測した２次元プロットのグラフを示す。図中の囲みに混入する粒子がなくなり、クリプトスポリジウムとして誤カウントする粒子が低減した。
【００３６】
図９は、３種類の河川原水１Ｌ中においてカウントされる誤カウントの低減効果を示す。本発明の微生物計測方法において、河川Ａ及び河川Ｂで誤カウントが０となり、河川Ｂでも誤カウントを１０倍以上低減することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係る微生物計測方法に用いる装置のろ過について一実施の形態を示す概略図である。
【図２】本発明に係る微生物計測方法を実施する装置について一実施の形態を示す構成図である。
【図３】本発明に係る微生物計測方法の実施を示すフローチャートである。
【図４】本発明に係る微生物計測方法を用いて、純水に懸濁した蛍光標識クリプトスポリジウムを計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図５】本発明に係る微生物計測方法を用いて、洗浄液に懸濁した蛍光標識クリプトスポリジウムを計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図６】本発明に係る微生物計測方法を用いて、分散液に懸濁した蛍光標識クリプトスポリジウムを計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図７】本発明に係る微生物計測方法を用いないで、試料を計測したときの２次元プロットで示したグラフある。
【図８】本発明に係る微生物計測方法を用いて、河川Ａの溶液を計測したときの２次元プロットで示したグラフである。
【図９】本発明に係る微生物計測方法を用いて、河川Ａ〜Ｃの溶液を計測したときの誤カウント数を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３８】
１００ ろ過器
１０１ 膜
１０２ メッシュクロス
１０３ 膜固定パッキン
１０４ フローセル上部
１０５ フローセル下部
１０６ 磁石入り撹拌子
２０８ エアポンプ
２１１ 試料タンク
２１２ 洗浄水タンク
２１３ 分散液タンク
２１４ 廃液タンク
２１５ 試料回収タンク
２３１〜２３９ バルブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光微粒子計測機を用いて検出対象微生物を計測する微生物計測方法であって、
（ａ）蛍光色素が結合した物質を、検出対象試料に導入するステップであって、前記物質は、前記検出対象微生物に特異的に結合する、ステップと、
（ｂ）前記検出対象試料をフィルターでろ過するステップと、
（ｃ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、洗浄液を用いて洗浄するステップであって、前記洗浄液は、前記蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、
（ｄ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、ろ液側から分散液を注入することによって回収するステップであって、前記分散液は、塩濃度が低く、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、
（ｅ）前記蛍光微粒子計測機を用いて、前記回収した検出対象微生物を計測するステップと
を含む、微生物計測方法。
【請求項２】
前記フィルターが、前記検出対象微生物の粒径よりも小さい孔径を有することを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項３】
前記フィルターが、親水性かつ表面が平滑な平膜であることを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項４】
前記蛍光微粒子計測機が、フローサイトメトリ法を用いることを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項１】
蛍光微粒子計測機を用いて検出対象微生物を計測する微生物計測方法であって、
（ａ）蛍光色素が結合した物質を、検出対象試料に導入するステップであって、前記物質は、前記検出対象微生物に特異的に結合する、ステップと、
（ｂ）前記検出対象試料をフィルターでろ過するステップと、
（ｃ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、洗浄液を用いて洗浄するステップであって、前記洗浄液は、前記蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、
（ｄ）前記フィルター上に捕捉された前記検出対象微生物を、ろ液側から分散液を注入することによって回収するステップであって、前記分散液は、塩濃度が低く、蛍光色素を分解しないものであり、当該蛍光色素と前記検出対象微生物との結合を解離せず、当該蛍光色素と夾雑物との結合を解離するものである、ステップと、
（ｅ）前記蛍光微粒子計測機を用いて、前記回収した検出対象微生物を計測するステップと
を含む、微生物計測方法。
【請求項２】
前記フィルターが、前記検出対象微生物の粒径よりも小さい孔径を有することを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項３】
前記フィルターが、親水性かつ表面が平滑な平膜であることを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項４】
前記蛍光微粒子計測機が、フローサイトメトリ法を用いることを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−５４３３５（Ｐ２０１０−５４３３５Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１９４６３（Ｐ２００８−２１９４６３）
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０７２１４０８３）メタウォーター株式会社 (277)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０７２１４０８３）メタウォーター株式会社 (277)
【Ｆターム（参考）】
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