微細藻類細胞内成分の抽出方法
【課題】微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できる微細藻類細胞内成分の抽出方法の提供。
【解決手段】フィルター１上に紙パルプ層２を形成する紙パルプ層形成工程と、少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整するゼータ電位調整工程と、前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を調整した微細藻類懸濁液３を吐出して前記微細藻類を回収する回収工程と、前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する抽出工程と、を含む微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【解決手段】フィルター１上に紙パルプ層２を形成する紙パルプ層形成工程と、少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整するゼータ電位調整工程と、前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を調整した微細藻類懸濁液３を吐出して前記微細藻類を回収する回収工程と、前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する抽出工程と、を含む微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類細胞内成分の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油の枯渇や二酸化炭素の増加による地球温暖化などが問題となっており、石油資源の代替原料としてバイオマスから産生されるバイオディーゼルが注目されている。バイオマス原料としては、菜種油、パーム油、オリーブ油、ひまわり油、大豆油等の植物油が利用されているが、これらの原料を用いたバイオディーゼルの生産量を増加させると、食料や飼料の供給に影響を及ぼすことが懸念される。そのため、これらの植物に代わる石油資源の代替原料として、微細藻類が注目されている。
【０００３】
微細藻類は、単細胞を単位生命体とし、葉緑素（クロロフィル）を有し、光合成によって大気中の二酸化炭素を固定化し酸素を産生する。海洋だけでなく、湖、池、川等の淡水系にも繁殖し、その種類は１０万種類におよぶ。微細藻類は、物質生産量が陸上植物と比較して多く、その種類によっては、陸上植物より光合成能力が高いものや、脂肪酸を蓄積するものなどがあるため、バイオディーゼルの生産を容易に行うことができる。また、微細藻類は、バイオディーゼルの原料として用いた場合であっても、食料や飼料と競合する問題がなく、植物と比較して単位面積当たりの生産性が高く、植物栽培に適さない土地でも利用でき、二酸化炭素固定への寄与率が高いなど、多くの利点を有する。
【０００４】
更に、微細藻類が産生する成分としては、脂肪酸の他にも種々の生理活性物質を産生することが知られており、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料などへの応用が期待されている。例えば、ヘマトコッカス ラキュストリスは、アスタキサンチンを産生する。このアスタキサンチンは、ビタミンＥの約１，０００倍、β−カロテンの約４０倍の抗酸化作用を有することが知られている。そのため、動脈硬化、糖尿病、炎症、皮膚の老化等の防止作用や、免疫賦活化、抗ストレス、美白などの種々の効果が期待されている。また、ナンノクロロプシス オキュラータは、脂肪酸を産生するが、この中でもエイコサペンタエン酸は、ガンの予防作用、中性脂肪やコレステロールの低減作用などが知られている。
【０００５】
このような種々の機能を有する微細藻類を回収する方法としては、フィルター濾過する方法や、遠心分離による方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、フィルター濾過では単細胞の微細藻類を回収することができず、糸状性や群体性等の限られた種類の微細藻類しか回収できないため、回収率が悪い点で問題であった。また、遠心分離を行うためにはエネルギーが必要となるため、省エネルギーの観点から好ましくない。
紙パルプに藻を添加して抄紙を行った藻マルチングシートも提案されているが、該マルチングシートにおけるクロレラの回収率は７０％程度であり、その回収率は十分満足できるものではなかった（特許文献１参照）。
【０００６】
したがって、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できる微細藻類細胞内成分の抽出方法が求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−３４６７５７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｏｌｉｎａ Ｇｒｉｍａ Ｅ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ， ２００３， Ｊａｎ；２０（７−８）， ４９１−５１５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できる微細藻類細胞内成分の抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、フィルター上に紙パルプ層を形成した後、前記紙パルプ層に、ゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整した微細藻類懸濁液を吐出することにより、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に、前記微細藻類を含有する紙パルプシートをそのまま抽出に用いることができるため、前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ フィルター上に紙パルプ層を形成する紙パルプ層形成工程と、
少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整するゼータ電位調整工程と、
前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を調整した微細藻類懸濁液を吐出して前記微細藻類を回収する回収工程と、
前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜２＞ 抽出工程が、微細藻類含有紙パルプシートと、抽出溶剤とを接触させて微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する工程である前記＜１＞に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜３＞ 紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の絶乾質量が１０ｇ／ｍ２〜１５０ｇ／ｍ２の紙パルプ層を形成する工程である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜４＞ 紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の含有量が０．５質量％〜２０質量％の紙パルプ層を形成する工程である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜５＞ ゼータ電位調整工程が、微細藻類懸濁液に多価カチオン及びアニオン性基を有する高分子化合物を添加することにより、前記微細藻類懸濁液のゼータ電位を調整する工程である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜６＞ フィルターが、抄紙ワイヤーである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜７＞ 微細藻類が、ヘマトコッカス ラキュストリス及びナンノクロロプシス オキュラータの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
である。
＜８＞ 前記＜７＞に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法により得られることを特徴とするアスタキサンチンである。
＜９＞ 前記＜７＞に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法により得られることを特徴とするエイコサペンタエン酸である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できる微細藻類細胞内成分の抽出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の微細藻類細胞内成分の抽出方法の一例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（微細藻類細胞内成分の抽出方法）
本発明の微細藻類細胞内成分の抽出方法は、紙パルプ層形成工程と、ゼータ電位調整工程と、回収工程と、抽出工程と、を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１５】
＜紙パルプ層形成工程＞
前記紙パルプ層形成工程は、フィルター上に紙パルプ層を形成する工程である。
【００１６】
＜＜フィルター＞＞
前記フィルターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抄紙ワイヤーが好ましい。前記抄紙ワイヤーとは、例えば、紙パルプ技術協会誌（２００５年２月号１６８頁）に記載された、紙を漉く際に最初に紙層形成を担う用具である。
【００１７】
前記フィルターの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエステル、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン等のプラスチック、ステンレス、ブロンズなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記材質は、荷重に対する伸びが少なく、剛性、形状安定性、耐疲労性、耐蝕性などが高い点で、プラスチックワイヤーが好ましい。
【００１８】
前記フィルターの構造は、平織りであってもよく、重織であってもよいが、平織〜４．５重織が好ましく、濾水性の高さの観点から、平織〜２．５重織がより好ましい。
前記フィルターの篩目開きとしても、特に制限はなく、前記フィルターの構造などに応じて適宜選択することができるが、濾水性の高さの観点から、０．３５５ｍｍ（４２メッシュ）〜０．０３８ｍｍ（４００メッシュ）が好ましい。
【００１９】
＜＜紙パルプ層＞＞
前記紙パルプ層は、後述するパルプ懸濁液により好適に形成することができる。
【００２０】
−パルプ懸濁液−
前記パルプ懸濁液は、少なくともパルプを含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００２１】
−−パルプ−−
前記パルプの原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、針葉樹や広葉樹等の木材、サトウキビバガス、草、藁、竹等の非木材などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記パルプを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記パルプ原料から製造する方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００２２】
前記パルプは、その製造方法から、メカニカルパルプ、サーモメカニカルパルプ、化学パルプの３種類に分けることができ、本発明における前記パルプは、これらのうちのいずれであってもよい。また、前記製造方法により得られたパルプに漂白処理を施したものであってもよい。
前記メカニカルパルプとは、物理的な力で前記パルプ原料を叩解することにより得られるパルプである。
前記サーモメカニカルパルプとは、前記パルプ原料を高温及び高圧条件下におき、リグニンを軟化させた状態で叩解することにより得られるパルプである。
前記化学パルプとは、前記パルプ原料に、亜硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等の化学薬品で化学的な処理を施し、リグニン等の不要成分を除去後、叩解することにより得られるパルプである。
また、前記パルプは、前記パルプ原料から製造したバージンパルプであってもよく、古紙等から再生した再生パルプであってもよい。
【００２３】
前記パルプのカナディアンフリーネスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２００ｍＬ〜５００ｍＬが好ましく、２５０ｍＬ〜４５０ｍＬがより好ましい。前記カナディアンフリーネスが２００ｍＬ未満であると、パルプ層自体の脱水不良となることがあり、５００ｍＬを超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００２４】
前記パルプ懸濁液における固形パルプ分の含有量としては、前記紙パルプ層において所望のパルプ含有量に調整することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
−−その他の成分−−
前記パルプ懸濁液における前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、乾燥紙力増強剤、湿潤紙力増強剤、撥水剤、濾水性向上剤、填量などが挙げられる。
前記紙パルプ層における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
−紙パルプ層の形成方法−
前記紙パルプ層を形成する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、抄紙機に前記フィルターを設置し、前記フィルター上に前記パルプ懸濁液を添加して濾過することにより、前記フィルター上に前記パルプ層を堆積させて形成する方法などが挙げられる。
前記抄紙機としては、特に制限はなく、公知の装置の中から適宜選択することができ、例えば、丸型シートマシーン（例えば、熊谷理機工業株式会社製）、ダイナミックシートフォーマー、長網抄紙機、ツインワイヤ抄紙機、円網抄紙機、円網短網コンビネーション抄紙機などが挙げられる。
【００２７】
前記紙パルプ層における固形パルプ分の絶乾質量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｇ／ｍ２〜１５０ｇ／ｍ２が好ましく、１５ｇ／ｍ２〜５０ｇ／ｍ２がより好ましい。前記絶乾質量が、１０ｇ／ｍ２未満であると、単細胞の微細藻類を回収することができないことがあり、１５０ｇ／ｍ２を超えると、微細藻回収効果効率に特段な変化はなくパルプの過剰使用となることがある。
【００２８】
前記パルプ懸濁液におけるパルプの絶乾質量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記紙パルプ層を乾燥させて秤量する方法などが挙げられる。
前記乾燥させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。
【００２９】
前記紙パルプ層における固形パルプの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５質量％〜２０質量％が好ましく、１質量％〜５質量％がより好ましい。前記固形パルプの含有量が、０．５質量％未満であると、前記単細胞の微細藻類を回収することができないことがあり、２０質量％を超えると、パルプ繊維分散性が低下し、微細藻類の回収率が低下することがある。
【００３０】
前記紙パルプ層の水分含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８５質量％〜９９質量％が好ましく、８５質量％〜９５質量％がより好ましい。前記水分含有量が、８５質量％未満であると、パルプ繊維分散性が低下し、微細藻類の回収率が低下することがあり、９５質量％を超えると、微細藻類の回収率が低下することがある。
前記水分含有量は、例えば、紙パルプ層全体を秤量した後、紙パルプ層を乾燥させて絶乾質量を秤量して、その差分を水分とすることで測定することができる。
【００３１】
前記紙パルプ層の水分含有量を調整する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、紙パルプ層の形成時に前記フィルター上に前記パルプ懸濁液を添加して濾過した後、吸引時間及び吸引圧を調整する方法などが挙げられる。
前記吸引時間としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、１分間〜１０分間が好ましく、２分間〜５分間がより好ましい。
前記吸引圧としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、３０ｋＰａ〜５００ｋＰａが好ましく、５０ｋＰａ〜２００ｋＰａがより好ましい。
【００３２】
＜ゼータ電位調整工程＞
前記ゼータ電位調整工程は、少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を調整する工程である。
【００３３】
＜＜微細藻類懸濁液＞＞
前記微細藻類懸濁液は、少なくとも微細藻類を含み、好ましくは、多価カチオン及びアニオン性基を有する高分子化合物を含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００３４】
−微細藻類−
本発明において微細藻類とは、陸上動物と同様に酸素発生を伴う光合成機能を有する単細胞、若しくは、単細胞に近い多細胞の藻類であり、器官として未分化の細胞を有する顕微鏡下の識別を要する小さな個体（１ミクロン〜数十ミクロン）の藻の総称である。前記微細藻類は、クロロフィル、フィコピリン、カロテノイド等の光合成色素を含有していることを特徴としている。
前記微細藻類の分類群としては、例えば、主に淡水に生息する車軸藻、緑藻、珪藻、黄緑藻、真正眼点藻、紅藻、藍藻や、主に海水に存在する緑藻、褐藻、珪藻、ハプト藻などが存在し、いずれも光合成機能を有するため、植物プランクトンとも称される。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記微細藻類細胞内成分の抽出方法は、前記単細胞の藻類であっても効率よく回収できる点で有利である。
【００３５】
以下に、前記微細藻類の具体的な例を挙げる。
藍藻綱（Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、クロオコックス目（Ｃｙｒｏｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）の、シネコキスチス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ダクチロコッコプシス属（Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ）、テトラペジア属（Ｔｅｔｒａｐｅｄｉａ）、クロオコックス属（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロキスチス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、アファノカプサ属（Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ）、グロエオカプサ属（Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ）、アファノテーケ属（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ）、ラブドゲルマ属（Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ）、グロエオケーテ属（Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ）、プソイドホロペジア属（Ｐｓｅｕｄｏｈｏｌｏｐｅｄｉａ）、メリスモペジウム属（Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉｕｍ）、ユウカプシス属（Ｅｕｃａｐｓｉｓ）、ゴンフェスフェリア属（Ｇｏｍｐｈｏｓｐｈａｅｒｉａ）、コエロスフェリウム属（Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ）、アイノゴノメ属（Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ）；カマエシフォン目（Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）の、カマエシフォン属（Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ）；プレウロカプサ目（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）のミクソサルシナ属（Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ）、ヒドロコックス属（Ｈｙｄｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クセノコックス属（Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プレウロカプサ属（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ）；ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）の、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、ホモエオスリックス属（Ｈｏｍｏｅｏｔｈｒｉｘ）、ジコスリックス属（Ｄｉｃｈｏｔｈｒｉｘ）、カロスリックス属（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）、グロエオトリキア属（Ｇｌｏｅｏｔｒｉｃｈｉａ）、ヒゲモ属（Ｒｉｖｕｌａｒｉａ）、イサクチス属（Ｉｓａｃｔｉｓ）、プレクトネマ属（Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ）、トリポスリックス属（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）、スキトネマ属（Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ）、スキトネマトプシス属（Ｓｃｙｔｏｎｅｍａｔｏｐｓｉｓ）、ヒドロコリーネ属（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｙｎｅ）、ミクロケト属（Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅ）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ）、アファニゾメノン属（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アウロシラ属（Ａｕｌｏｓｉｒａ）、ノジュラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、アナベノプシス属（Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ）、キリンドロスペルマム属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）；ユレモ目（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）の、ボルジア属（Ｂｏｒｚｊａ）、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ユレモ属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）、フォルミジウム属（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）、リングピア属（Ｌｙｎｇｂｙａ）、シンプロカ属（Ｓｙｍｐｌｏｃａ）、ムラサキクダモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｓｉｐｈｏｎ）、ダシグロエア属（Ｄａｓｙｇｌｏｅａ）、シゾスリックス属（Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ）、ミクロコレウス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ）；スチゴネマ目（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）の、フィツシェレラ属（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ）、スチゴネマ属（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ）、タルポフィラ属（Ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌａ）、ハパロシフォン属（Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ）、ウエステレロプシス属（Ｗｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓ）、ノストコプシス属（Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ）、イデユアイミドリ属（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ）などが挙げられる。
【００３６】
灰青藻綱（Ｇｌａｕｃｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、グラウコスフェラ目（Ｇｌａｕｃｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ）のスクヤペルタ属（Ｓｋｕｊａｐｅｌｔａ）などが挙げられる。
【００３７】
紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、チノリモ目（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉａｌｅｓ）の、ポルフィリディウム属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、チノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、イデユコゴメ属（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ロドソルス属（Ｒｈｏｄｏｓｏｒｕｓ）、ロデラ属（Ｒｈｏｄｅｌｌａ）、ディクソニエラ属（Ｄｉｘｏｎｉｅｌｌａ）などが挙げられる。
【００３８】
黄色鞭毛藻綱（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、リゾクリシス目（Ｒｈｉｚｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）のラギニオン属（Ｌａｇｙｎｉｏｎ）；ヒカリモ目（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ）の、クリソスフェラ属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、ヒカリモ属（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）、ヘテロクロムリナ属（Ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）、クリソコックス属（Ｃｈｒｙｓｏｃｏｃｃｕｓ）、コドモナス属（Ｃｏｄｏｍｏｎａｓ）、クリソカプサ属（Ｃｈｒｙｓｏｃａｐｓａ）、ミズオ属（Ｈｙｄｒｕｒｕｓ）；オクロモナス目（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、オクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）０、ディディモクリシス属（Ｄｉｄｙｍｏｃｈｒｙｓｉｓ）、シンクリプタ属（Ｓｙｎｃｈｒｙｐｔａ）、ウログレナ属（Ｕｒｏｇｌｅｎａ）、ウログレノプシス属（Ｕｒｏｇｌｅｎｏｐｓｉｓ）、シノブリオン属（Ｄｉｎｏｂｒｙｏｎ）、ヒアロブリオン属（Ｈｙａｂｒｙｏｎ）、マロモナス属（Ｍａｌｌｏｍｏｎａｓ）、シヌラ属（Ｓｙｎｕｒａ）、クリソスフェラ属（Ｃｈｙｓｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、パラフィソモナス属（Ｐａｒａｐｈｙｓｏｍｏｎａｓ）；ディクチオカ目（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａｌｅｓ）のディクチオカ属（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａ）などが挙げられる。
【００３９】
黄緑色藻綱（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、リゾクロリス目（Ｒｈｉｚｏｃｈｌｏｒｉｄａｌｅｓ）のスチピトコックス属（Ｓｔｉｐｉｔｏｃｏｃｃｕｓ）；ミショコックス目（Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃａｌｅｓ）の、ボツリジオプシス属（Ｂｏｔｒｙｄｉｏｐｓｉｓ）、クロロクロステル属（Ｃｈｌｏｒｏｃｌｏｓｔｅｒ）、エリプソイドン属（Ｅ１ｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、モノドス属（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、クロロボツリス属（Ｃｈｉｏｒｏｂｏｔｒｙｓ）、ミショコックス属（Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、カラシオプシス属（Ｃｈａｒａｃｉｏｐｓｉｓ）、オフィオキチウム属（Ｏｐｈｉｏｃｙｔｉｕｍ）などが挙げられる。
【００４０】
渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ギムノジニウム目（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉａｌｅｓ）の、アンフィジニウム属（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ）、ギムノジニウム属（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）、ギロジニウム属（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）；ペリジニウム目（Ｐｅｒｉｄｉｎｉａｌｅｓ）の、へミジニウム属（Ｈｅｍｉｄｉｎｉｕｍ）、グレンジニウム属（Ｇｌｅｎｏｄｉｎｉｕｍ）、ジプロプサリス属（Ｄｉｐｌｏｐｓａｌｉｓ）、ペリジニウム属（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）、ケラチウム属（Ｃｅｒａｔｉｕｍ）、ヘテロカプサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ）、プロトペリジニウム属（Ｐｒｏｔｏｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）；ジノコックス目（Ｄｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）の、チストジニウム属（Ｃｙｓｔｏｄｉｎｉｕｍ）、テトラジニウム属（Ｔｅｔｒａｄｉｎｉｕｍ）；プロロケントルム目（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｌｅｓ）のプロロケントルム属（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ）；ディノフィシス目（Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉａｌｅｓ）の、ディノフィシス属（Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ）、オウニトケルクス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｃｅｒｃｕｓ）などが挙げられる。
【００４１】
褐色鞭毛藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、クリプトモナス目（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、クリプトモナス属（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、キロモナス属（Ｃｈｉｌｏｍｏｎａｓ）、へミセルミス属（Ｈｅｍｉｓｅｌｍｉｓ）、ロドモナス属（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）などが挙げられる。
【００４２】
ラフィド藻綱（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ラフィドモナス目（Ｒａｐｈｉｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、バクオラリア属（Ｖａｃｕｏｌａｒｉａ）、ゴニオストマム属（Ｇｏｎｙｏｓｔｏｍｕｍ）、メロトリキア属（Ｍｅｒｏｔｒｉｃｈｉａ）、シャットネラ属（Ｃｈａｔｔｏｎｅｌｌａ）などが挙げられる。
【００４３】
ミドリムシ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎａｌｅｓ）の、ミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、レポシンクリス属（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ファクス属（Ｐｈａｃｕｓ）アスタシア属（Ａｓｔａｓｉａ）、キクリジオプシス属（Ｃｙｃｌｉｄｉｏｐｓｉｓ）、トラケロモナス属（Ｔｒａｃｈｅｌｏｍｏｎａｓ）、ジスチグマ属（Ｄｉｓｔｉｇｍａ）、ペラネマ属（Ｐｅｒａｎｅｍａ）、アニソネマ属（Ａｎｉｓｏｎｅｍａ）；コラキウム目（Ｃｏｌａｃｉａｌｅｓ）のコラキウム属（Ｃｏｌａｃｉｕｍ）；ユートレプティア目（Ｅｕｔｒｅｐｔｉａｌｅｓ）のユートレプティア属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉａ）などが挙げられる。
【００４４】
緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、オオヒゲマワリ目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）の、へマトコックス属（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カルテリア属（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クロロゴニウム属（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、ロボモナス属（Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、デュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、ゴニウム属（Ｇｏｎｉｕｍ）、プレオドリナ属（Ｐｌｅｏｄｏｒｉｎａ）、オオヒゲマワリ属（Ｖｏｌｖｏｘ）、パンドリナ属（Ｐａｎｄｏｒｉｎａ）、ユウドリナ属（Ｅｕｄｏｒｉｎａ）；ヨツメモ目（Ｔｅｔｒａｓｐｏｒａｌｅｓ）の、アステロコックス属（Ａｓｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パルモジクチオン属（Ｐａｌｍｏｄｉｃｔｙｏｎ）、グロエオキスチス属（Ｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ）、アスケナシエラ属（Ａｓｋｅｎａｓｙｅｌｌａ）、スファエロキスチス属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｙｓｔｉｓ）、ヨツメモ属（Ｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）；ヒビミドロ目（Ｕｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）のスチココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）；クロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）の、デスマトラクツム属（Ｄｅｓｍａｔｒａｃｔｕｍ）、ブラクテアコックス属（Ｂｒａｃｔｅａｃｏｃｃｕｓ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、ゴレンキニア属（Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａ）、キルヒネリエラ属（Ｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）；ホシミドロ目（Ｚｙｇｎｅｍａｔａｌｅｓ）の、ネトリウム属（Ｎｅｔｒｉｕｍ）、ペニウム属（Ｐｅｎｉｕｍ）、ミカヅキモ属（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）、コウガイチリモ属（Ｐｌｅｕｒｏｔａｅｎｉｕｍ）、ツヅミモ属（Ｃｏｓｍａｒｉｕｍ）などが挙げられる。
【００４５】
プラシノ藻綱（Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、マミエラ目（Ｍａｍｉｅｌｌａｌｅｓ）の、プラシノコックス属（Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロモナス属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）；プセウドスコウルフィエルディア目（Ｐｓｅｕｄｏｓｃｏｕｒｆｉｅｌｄｉａｌｅｓ）のネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）；ピラミモナス目（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、プテロスペルマ属（Ｐｔｅｒｏｓｐｅｒｍａ）、ハロスファエラ属（Ｈａｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）；クロロデンドロン目（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）のテトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）などが挙げられる。
【００４６】
珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、円心目（Ｃｅｎｔｒａｌｅｓ）の、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、デトニューラ属（Ｄｅｔｏｎｕｌａ）、ミニディスクス属（Ｍｉｎｉｄｉｓｃｕｓ）、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、キートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）；羽状目（Ｐｅｎｎａｌｅｓ）のディメレグラムマ属（Ｄｉｍｅｒｅｇｒａｍｍａ）、ナビキュラ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ニッチア属（Ｎｏｔｚｓｃｈｉａ）などが挙げられる。
【００４７】
真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ユースティグマトス目（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔａｌｅｓ）のナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）などが挙げられる。
【００４８】
ハプト藻綱（Ｈａｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、イソクリシス目（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）の、プリュウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｉｓｉｓ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉｎｉａｎｉａ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ゲフィロカプサ属（Ｇｅｐｈｙｒｏｃａｐｓａ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、クリソティラ属（Ｃｈｒｙｓｏｔｙｌａ）、ヒメノモナス属（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、オクロスファエラ属（Ｏｃｈｒｏｓｐｈａｅｒａ）；プリムネシウム目（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｄａｌｅｓ）の、プリムネシウム属（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ）、クリソクロムリナ属（Ｃｈｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）、フェオキィスティス属（Ｐｈａｅｏｃｙｓｔｉｓ）；円石藻目（Ｃｏｃｃｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ）の、カリプトロスファエラ属（Ｃａｌｙｐｔｒｏｓｐｈａｅｒａ）、ブラルードスファエラ属（Ｂｒａａｒｕｄｓｐｈａｅｒａ）、アノプロソレニア属（Ａｎｏｐｌｏｓｏｌｅｎｉａ）、カルキオソレニア属（Ｃａｌｃｉｏｓｏｌｅｎｉａ）、カルキディスクス属（Ｃａｌｃｉｄｉｃｕｓ）、コッコリトゥス属（Ｃｏｃｃｏｌｉｔｈｕｓ）、オオリトトゥス属（Ｏｏｌｉｔｈｏｔｕｓ）、ウンビリコスファエラ属（Ｕｍｂｉｌｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、へリコスファエラ属（Ｈｅｌｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、ポンスファエラ属（Ｐｏｎｔｏｓｐｈａｅｒａ）、アカントイカ属（Ａｃａｎｔｈｏｉｃａ）、アルギロスファエラ属（Ａｌｇｉｒｏｓｐｈａｅｒａ）、ディスコスファエラ属（Ｄｉｓｃｏｓｐｈａｅｒａ）、ラブドスファエラ属（Ｒｈａｂｄｏｓｐｈａｅｒａ）、カネオスファエラ属（Ｃａｎｅｏｓｐｈａｅｒａ）、コロノスファエラ属（Ｃｏｒｏｎｏｓｐｈａｅｒａ）、シラコスファエラ属（Ｓｙｒａｃｏｓｐｈａｅｒａ）、ドイツランディア属（Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄｉａ）、ウンベロスフェラ属（Ｕｍｂｅｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ミカエルサルシア属（Ｍｉｃｈａｅｌｓａｒｓｉａ）、オフィアスター属（Ｏｐｈｉａｓｔｅｒ）；パブロバ目（Ｐａｖｌｏｖａｌｅｓ）のパブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）などが挙げられる。
【００４９】
ユーグレナ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ユーグレナ目（Ｅｕｇｌｅｎａｌｅｓ）のユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）などが挙げられる。
【００５０】
前記微細藻類を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などが挙げられる。
【００５１】
前記微細藻類を培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、振盪培養、静置培養などが挙げられる。これらの中でも、前記微細藻類は好気性であることから振盪培養が好ましい。
【００５２】
前記微細藻類の培養に用いる培地としては、藻類を培養できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無機物から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記培地のｐＨとしては、特に制限はなく、微細藻類の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００５３】
前記培養の温度、時間、炭酸ガス濃度、及び照度としても、特に制限はなく、微細藻類の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００５４】
前記微細藻類懸濁液における前記微細藻類の絶乾質量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類懸濁液を乾燥させて秤量する方法などが挙げられる。
前記乾燥させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。これらの中でも、前記乾燥方法は、加熱乾燥法が好ましく、オーブンを用いることがより好ましい。
前記オーブンで乾燥させる場合、その温度及び時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０℃〜１２０℃で２時間〜１２時間乾燥させることが好ましい。
なお、前記絶乾質量を測定する際に、前記微細藻類懸濁液は、予め濾過することが、培養液に溶解した各種塩分などを除去できる点で好ましい。
【００５５】
−多価カチオン−
前記微細藻類懸濁液は、更に多価カチオンを含むことが、前記微細藻類を好適に凝集させることができ、前記微細藻類の回収率が向上する点で好ましい。
前記多価カチオンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋等の金属イオンなどが挙げられる。
前記微細藻類懸濁液において、前記金属イオンを発生させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類懸濁液に、硫酸アルミニウム水溶液、ポリ塩化アルミニウム水溶液、塩化第二鉄水溶液、ポリ硫酸第二鉄水溶液、硫酸第一鉄水溶液等の金属を含む水溶液を添加する方法などが挙げられる。これらの中でも、前記水溶液は、硝酸アルミニウム水溶液が好ましい。また、例えば、ジメチルジアリルアンモニウムクロライド（ＤＭＤＡＡ）、アルキルアミン・エピクロルヒドリン縮合物等の分子内に多数のカチオンを有する高分子電解質を添加する方法なども挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５６】
前記微細藻類懸濁液における、前記金属を含む水溶液又は前記高分子電解質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微細藻類懸濁液中の前記微細藻類の絶乾質量１００部に対して、０．１質量部〜３．５質量部が好ましく、１質量部〜２質量部がより好ましい。前記金属を含む水溶液又は前記高分子電解質の含有量が、０．１質量部未満又は３．５質量部超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００５７】
−アニオン性基を有する高分子化合物−
前記微細藻類懸濁液は、更にアニオン性基を有する高分子化合物を含むことが、前記微細藻類を好適に凝集させることができ、前記微細藻類の回収率が向上する点で好ましい。
前記アニオン性基を有する高分子化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＭＮＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、カルボキシメチルセルロース及びそのナトリウム塩、カルボキシ変性ポリビニルアルコールなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記アニオン性基を有する高分子化合物は、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＭＮＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）が好ましい。
【００５８】
前記微細藻類懸濁液における、前記アニオン性基を有する高分子化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微細藻類懸濁液中の前記微細藻類の絶乾質量１００部に対して、０．０５質量部〜０．５質量部が好ましく、０．０５質量部〜０．１質量部がより好ましい。前記アニオン性基を有する高分子化合物の含有量が、０．０５質量部未満又は０．５質量部を超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００５９】
−その他の成分−
前記微細藻類懸濁液における前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、前記多価カチオン及び前記アニオン性基を有する高分子化合物を除くゼータ電位調整剤などが挙げられる。
前記ゼータ電位調整剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルボキシメチルセルロース及びそのナトリウム塩、カルボキシ変性ポリビニルアルコールなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記微細藻類懸濁液における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６０】
＜＜ゼータ電位の調整＞＞
前記微細藻類懸濁液のゼータ電位は、−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整されるが、−１０ｍＶ〜＋１０ｍＶに調整されることが好ましく、−５ｍＶ〜＋５ｍＶに調整されることがより好ましい。前記ゼータ電位が、−１５ｍＶ未満又は＋１５ｍＶを超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００６１】
前記ゼータ電位を調整する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記多価カチオンやアニオン性基を有する高分子化合物を前記微細藻類懸濁液に添加し、これらの添加量などによって調整する方法が好ましい。
【００６２】
前記ゼータ電位を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のゼータ電位測定装置を用いて測定する方法などが挙げられる。前記ゼータ電位測定装置の具体的な例としては、ゼータ電位測定装置 ＺＥＥＣＯＭ ＺＣ２０００（株式会社マイクロテック・ニチオン社製）などが挙げられる。
【００６３】
＜回収工程＞
前記回収工程は、前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を所望の値に調整した微細藻類懸濁液を吐出して前記微細藻類を回収する工程である。なお、本発明において、回収とは、前記紙パルプ層に前記微細藻類が捕捉されることをいう。以下、微細藻類を回収した紙パルプ層を、「微細藻類含有紙パルプシート」と称することがある。
【００６４】
前記吐出方法としては、前記フィルター上に形成した前記紙パルプ層に前記微細藻類懸濁液を吐出することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、紙パルプ層上に前記微細藻類懸濁液を添加して濾過した後、吸引する方法などが挙げられる。
前記吸引時間としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、１分間〜１０分間が好ましく、２分間〜５分間がより好ましい。
前記吸引圧としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、３０ｋＰａ〜５００ｋＰａが好ましく、５０ｋＰａ〜２００ｋＰａがより好ましい。
これにより、前記微細藻類懸濁液が濾過され、前記微細藻類懸濁液中の液体成分と、細胞とを好適に分離することができ、前記紙パルプ層に前記微細藻類を回収することができる。
【００６５】
前記回収工程において、前記微細藻類懸濁液を添加する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記紙パルプ層における固形パルプの含有量１００質量部に対して、前記微細藻類の絶乾質量で、４００質量部以下が好ましく、３００質量部以下がより好ましい。前記添加量が、４００質量部を超えると、前記紙パルプ層に詰まりが生じ、前記微細藻類を効率よく回収できないことがある。
【００６６】
前記微細藻類の回収率は、以下のように算出することができる。
前記回収工程により得られた、微細藻類含有紙パルプシートを乾燥させた後に秤量する（以下、「微細藻類含有紙パルプシート乾燥質量」と称することがある。）。一方、前記微細藻類懸濁液を添加していない紙パルプ層も同様の方法で乾燥後に秤量する（以下、「紙パルプシート乾燥質量」と称することがある。）。これらの値を用いて、次式により算出することができる。
回収率（％）＝［（微細藻類含有紙パルプシート乾燥質量（ｇ））−（紙パルプシート乾燥質量（ｇ））］／［（微細藻類懸濁液添加量（Ｌ）×（微細藻類懸濁液中の細胞濃度（ｇ／Ｌ））］×１００
ここで、「微細藻類懸濁液中の細胞濃度」は、予め秤量したガラス繊維濾紙で、培養懸濁液を濾別後、乾燥させて、乾燥重量を測定し、濾別した培養液全量で除することにより算出することができる。
【００６７】
＜抽出工程＞
前記抽出工程は、前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する工程である。
前記抽出には、前記微細藻類含有紙パルプシートをそのまま用いることが、操作が簡便であり、抽出効率がよい点で好ましいが、前記微細藻類含有紙パルプシートから前記微細藻類を分離してから用いてもよい。
【００６８】
前記抽出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類含有紙パルプシートに抽出溶剤を作用させて抽出する方法などが挙げられる。
前記抽出溶剤としては、特に制限はなく、前記微細藻類の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００６９】
以下に、前記微細藻類が、アスタキサンチンを産生するヘマトコッカス ラキュストリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、及び脂肪酸を産生するナンノクロロプシス オキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ）である場合を例に、前記抽出工程について詳細に説明するが、本発明の前記微細藻類の種類及びその細胞内成分としては、これらに限られるものではない。
【００７０】
−アスタキサンチンの抽出−
例えば、前記微細藻類が、ヘマトコッカス ラキュストリスである場合、その細胞内にはアスタキサンチンが産生されることが知られている。
【００７１】
前記微細藻類からアスタキサンチンを抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類含有紙パルプシートを抽出溶剤と接触させる方法などが挙げられる。
【００７２】
抽出溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセトン、エタノール、イソアミルアルコール、ｎ−ヘキサンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、溶解度の点から抽出効率のよいアセトンあるいはアセトンを含む混合溶剤が好ましく、アセトン−クロロホルム混合溶剤がより好ましい。
【００７３】
前記抽出に用いる前記抽出溶剤の量としては、用いる微細藻類の種類や量などに応じて適宜選択することができるが、微細藻類の絶乾質量１００部に対して、２００質量部〜２,０００質量部が好ましい。
前記抽出温度及び時間としては、特に制限はなく、前記微細藻類の性状、用いる抽出溶剤の種類や量などに応じて適宜選択することができる。
【００７４】
前記アスタキサンチンを含む抽出溶剤から、前記微細藻類など固形物を除去した後、抽出溶剤を除去すると、アスタキサンチンを含むカロテノイド類（色素）を得ることができる。この色素を常法にて精製処理することにより、アスタキサンチンを得ることができる。
抽出溶剤の除去方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、温和な条件下でアスタキサンチンを含む抽出溶剤を加温処理し、抽出溶剤を蒸発する処理法などが挙げられる。
前記精製処理方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７５】
前記微細藻類から抽出されたアスタキサンチンは、食品添加剤、食材用色素、飼料用添加剤などとして有用である。具体的には、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料等として好適に使用可能である。また、アスタキサンチンを精製処理していないカロテノイド類を、上記用途に使用してもよい。更には、アスタキサンチンを細胞内に蓄積した微細藻類の破砕物を上記用途に使用してもよい。
【００７６】
−脂肪酸の抽出−
例えば、前記微細藻類が、ナンノクロロプシス オキュラータである場合、その細胞内には脂肪酸が産生されることが知られている。
【００７７】
前記微細藻類から脂肪酸を抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類含有紙パルプシートを抽出溶剤と接触させる方法などが挙げられる。
【００７８】
抽出溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等の有機溶媒；前記有機溶媒と塩酸との混合溶媒などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、メタノールが好ましく、５質量％塩酸を含むメタノールがより好ましい。
【００７９】
前記抽出に用いる前記抽出溶剤の量としては、用いる微細藻類の種類や量などに応じて適宜選択することができるが、微細藻類の絶乾質量１００部に対して、２００質量部〜２,０００質量部が好ましい。
前記抽出温度及び時間としては、特に制限はなく、前記微細藻類の性状、用いる抽出溶剤の種類や量などに応じて適宜選択することができる。
【００８０】
前記脂肪酸を含む抽出溶剤から、前記微細藻類など固形物を除去した後、抽出溶剤を除去すると、脂肪酸を得ることができる。
抽出溶剤の除去方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。
また、前記脂肪酸をクロマトグラフィー等の公知の方法で分離することにより、エイコサペンタエン酸を精製することもできる。
【００８１】
前記微細藻類から抽出された脂肪酸は、メタノールとのエステル交換反応等の公知の方法でメチルエステル化することで、ディーゼルとして利用可能であり、また前記脂肪酸から分離精製したエイコサペンタエン酸は、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料等として好適に使用可能である。また、脂肪酸を細胞内に蓄積した微細藻類の破砕物を上記用途に使用してもよい。
【００８２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィルター除去工程、プレス工程、乾燥工程、厚みプロファイル調整工程、水分プロファイル調整工程などが挙げられる。
【００８３】
＜＜フィルター除去工程＞＞
前記フィルター除去工程は、前記回収工程により得られた前記微細藻含有紙パルプシートから前記フィルターを取除く工程である。
前記フィルターを取り除く方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８４】
＜＜プレス工程＞＞
前記プレス工程は、前記微細藻類含有紙パルプシートをプレスして、該微細藻類含有紙パルプシートから搾水させる工程である。
前記プレスする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、毛布などの上に紙パルプシートを乗せて、ローラーの間を圧搾しながら通す方法などが挙げられる。
【００８５】
＜＜乾燥工程＞＞
前記微細藻類含有紙パルプシートを乾燥させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。これらの中でも、前記乾燥方法は、加熱乾燥法が好ましく、オーブンを用いることがより好ましい。
前記オーブンで乾燥させる場合、その温度及び時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０℃〜１２０℃で２時間〜１２時間乾燥させることが好ましい。
【００８６】
＜＜厚みプロファイル調整工程＞＞
前記厚みプロファイル調整工程は、前記微細藻含有紙パルプシートの厚みをプロファイルする工程である。
前記厚みを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、β線厚さ計、Ｘ線厚さ計等で測定する方法などが挙げられる。
【００８７】
＜＜水分プロファイル調整工程＞＞
前記水分プロファイル調整工程は、前記微細藻含有紙パルプシート、好ましくは、前記乾燥工程により乾燥された微細藻含有紙パルプシートの水分をプロファイルする工程である。
前記水分量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、近赤外線式水分計、マイクロ波式水分計等で測定する方法などが挙げられる。
前記微細藻含有紙パルプシートの水分をプロファイルすることで、例えば、前記乾燥工程における乾燥強度を微細藻含有紙パルプシートの幅方向で変え、微細藻含有紙パルプシートの幅方向の水分含有量を均一にすることができ、これにより前記微細藻含有紙パルプシートを抽出工程に用いるまで好適に搬送、保存でき、前記微細藻類細胞内成分の抽出効率が向上する点で好ましい。
【００８８】
＜用途＞
前記微細藻類細胞内成分の抽出方法は、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく回収でき、更に前記微細藻類を回収した紙パルプシートをそのまま抽出に用いることで、効率よく簡便に前記微細藻類の細胞内に含まれる成分を抽出することができる点で有利である。
なお、前記微細藻類細胞内成分の抽出方法の回収工程で回収された前記微細藻類懸濁液中の細胞、及び該細胞から抽出された細胞内成分も、本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００８９】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００９０】
（実施例１〜８、比較例１〜４）
＜パルプ懸濁液の調製＞
広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）と、針葉樹晒クラフトパルプ（ＮＢＫＰ）との質量比（ＬＢＫＰ／ＮＢＫＰ）が８０／２０からなる木材パルプ（ＬＢＫＰ： Ａｒａｃｒｕｚ社製、ＮＢＫＰ：Ｈａｒｍａｃ Ｐａｓｉｆｉｃ社製）を、ナイアガラビーター（熊谷理機工業株式会社製）で叩解し、カナディアンフリーネスが３００ｍＬのパルプ懸濁液を得た。
前記パルプ懸濁液をガラス繊維濾紙で濾別した後、ドライオーブンにて１１０℃で４時間乾燥させて秤量することにより固形パルプ分の含有量を求めたところ、１５ｇ／Ｌであった。
【００９１】
＜紙パルプ層の形成＞
丸型シートマシーン（熊谷理機工業株式会社製）に、２．５重織プラスチックワイヤー（ＬＬ−４０Ｅ、日本フイルコン株式会社製）を貼付したワイヤーを設置して、パルプ懸濁液を添加し、固形パルプ分の絶乾質量が、表１に示す坪量となるように、吸引時間及び吸引圧を調整することで、紙層水分を調整した。なお、坪量を５ｇ／ｍ２にする場合は、５０ｋＰａにて２分間、１０ｇ／ｍ２にする場合は、５０ｋＰａにて３分間、５０ｇ／ｍ２にする場合は１００ｋＰａにて３分間吸引した。
【００９２】
＜ヘマトコッカス ラキュストリスの培養＞
ヘマトコッカス ラキュストリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓ：ＮＩＥＳ−２１６４）を細胞濃度が０．０５ｇになるようにＳｏｒｏｋｉｎ−Ｋｒａｕｓｓ培地 １Ｌに接種し、２Ｌ容のガラス製扁平フラスコに入れ、２５℃、二酸化炭素濃度５％とした空気を通気して振盪培養した。通気量は、１００ｍＬ／分間とした。培養は、植物育成用蛍光燈（株式会社チヨダサイエンス製）を光源として照度を５,０００ルクスに設定し、連続光照射下で行った。細胞濃度が、１．０ｇ／Ｌ以上に達したところで培養を止めた（１４日間）。
前記Ｓｏｒｏｋｉｎ−Ｋｒａｕｓｓ培地は、蒸留水１，０００ｍＬに対して、硝酸カリウム １．２５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物 １．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １．２５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム ８４ｍｇ／Ｌ、及び硫酸鉄七水和物 ５０ｍｇ／Ｌを添加した。次いで、ほう酸 ２．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物 １．８１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物 ２２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水和物 ７９ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物 ４０ｍｇ／Ｌ、及びモリブデン酸ナトリウム二水和物 ２１ｍｇ／Ｌを含有する微量元素混合溶液１ｍＬを添加した後、ｐＨを６．８に調整した。
本培養後、光源を植物育成用蛍光燈から、ハロゲン光源（林時計工業株式会社製）に代えて、照度を３０，０００ルクスに設定し、３日間、連続照射下で、細胞のシスト化を行った。
【００９３】
＜微細藻類のゼータ電位の調整＞
前記培養後のヘマトコッカス ラキュストリスの培養液を、ガラス繊維濾紙（ＷｈａｔｍａｎグレードＧＦ／Ｄ）用いて濾過した後、ドライオーブンにて１１０℃で４時間乾燥させて秤量することにより、ヘマトコッカス ラキュストリス培養液中のヘマトコッカス ラキュストリスの絶乾質量を測定した。この測定値より、前記培養液中のヘマトコッカス ラキュストリスの細胞濃度を算出したところ、１ｇ／Ｌであった。
ヘマトコッカス ラキュストリスの乾燥質量１００部に対して、表１に示す割合で、硫酸アルミニウム水溶液又はジメチルジアリルアンモニウムクロライド（ＤＭＤＡＡ）を添加し、スターラー２５０ｒｐｍで１分間攪拌した。次いで、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）又はポリアクリル酸ナトリウム（ＰＭＮＡ）を、ヘマトコッカス ラキュストリスの乾燥質量１００部に対して、表１に示す割合で添加し、スターラー２５０ｒｐｍで１分間攪拌し、微細藻類懸濁液を調製した。
【００９４】
＜ゼータ電位の測定＞
微細藻類懸濁液のゼータ電位（Ｚｐ）を、ゼータ電位測定装置（ＺＥＥＣＯＭ ＺＣ２０００、株式会社マイクロテック・ニチオン社製）により、定法に従い測定した。結果を表１に示す。
【００９５】
＜回収方法＞
前記微細藻類懸濁液を、丸型シートマシーンのポンプで送液し、該丸型シートマシーンの吐出箱より吐出させ、前記紙パルプ層に添加し、微細藻類懸濁液を濾過することにより、ヘマトコッカス ラキュストリスを回収したヘマトコッカス ラキュストリス含有紙パルプシートを得た。微細藻類懸濁液の添加量としては、紙パルプ層の固形パルプ分１００質量部に対して、表１に示す割合で添加した。
【００９６】
（実施例９〜１２、比較例５〜６）
実施例１〜８及び比較例１〜４において、ヘマトコッカス ラキュストリスに代えて、下記方法で培養したナンノクロロプシス オキュラータを用いたこと以外は、実施例１〜８及び比較例１〜４と同様の方法で、パルプ懸濁液の調製、紙パルプ層の形成、微細藻類のゼータ電位の調整、ゼータ電位の測定、及び紙パルプ層への微細藻類の回収を行った。
【００９７】
＜ナンノクロロプシス オキュラータの培養＞
ナンノクロロプシス オキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ：ＮＩＥＳ−２１４６）を細胞濃度が０．０５ｇになるようにＧｕｉｌｌａｒｄ Ｆ培地 １Ｌに接種し、２Ｌ容のガラス製扁平フラスコに入れ、２５℃、二酸化炭素濃度５％とした空気を通気して振盪培養した。通気量は、１００ｍＬ／分間とした。培養は、植物育成用蛍光燈（株式会社チヨダサイエンス製）を光源として照度を２,０００ルクスに設定し、連続光照射下で行った。細胞濃度が、１．０ｇ／Ｌ以上に達したところで培養を止めた（８日間）。
前記Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｆ培地は、海水１，０００ｍＬに対して、硝酸ナトリウム ０．１５ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム ０．０１ｇ／Ｌ、珪酸ナトリウム九水和物 ０．０６ｇ／Ｌ、 Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．００９８ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物 ３６μｇ／Ｌ、硫酸銅五水和物 １９．６μｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物 ４４μｇ／Ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物 ２μｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水和物 １２．６μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２ １．０μｇ／Ｌ、ビオチン １．０μｇ／Ｌ、及びチアミン塩酸塩 ０．２ｍｇ／Ｌを添加した後、ｐＨを８に調整した。
前記培養液中のナンノクロロプシス オキュラータの細胞濃度を、ヘマトコッカス ラキュストリスと同様の方法で測定した結果、１ｇ／Ｌであった。
【００９８】
＜微細藻類回収率の評価＞
実施例１〜１２及び比較例１〜６において、微細藻類懸濁液を濾過した後、得られた微細藻類含有紙パルプシートを、ドライオーブンにて１１０℃で４時間乾燥させ、乾燥後の質量を測定した。また、微細藻類懸濁液を添加していない紙パルプ層を同様の操作で乾燥させ、乾燥後の質量を測定した。これらの値を用いて、次式により回収率を算出し、下記評価基準に基づき評価した。結果を表２に示す。なお、表１及び２において、「ＨＬ」は、ヘマトコッカス ラキュストリス、「ＮＯ」は、ナンノクロロプシス オキュラータを示す。
回収率（％）＝［（微細藻類含有紙パルプシート乾燥質量（ｇ））−（紙パルプシート乾燥質量（ｇ））］／［（微細藻類懸濁液添加量（Ｌ）×（微細藻類懸濁液中の細胞濃度（ｇ／Ｌ））］×１００
［評価基準］
◎ ：回収率が９５％以上
○ ：回収率が８０％超え９５％未満
△ ：回収率が６５％超え８０％以下
× ：回収率が６５％以下
【００９９】
（試験例１：ヘマトコッカス ラキュストリス産生アスタキサンチンの分析）
ヘマトコッカス ラキュストリスが細胞内に産生するアスタキサンチンは、従来、遠心分離後、フィルター濾過を行う２段階の分離工程を経た後、有機溶媒で抽出することにより得られていた（特開２００４−１２９５０４号公報参照）。
そこで、前記実施例１〜８及び比較例１〜４の方法で得られた細胞から抽出したアスタキサンチンの量と、前記従来の方法である遠心分離及び濾過後に抽出して得たアスタキサンチンの量とをそれぞれ測定して比較した。
【０１００】
＜遠心分離により回収した微細藻類からのアスタキサンチンの抽出（従来法）＞
実施例１〜８及び比較例１〜４と同様の方法で、ヘマトコッカス ラキュストリスを培養した。この培養液を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を取除いて藻体を回収し、ヘマトコッカス ラキュストリス藻乾燥質量１０部当り、１００質量部のアセトンを使用して抽出することにより、アスタキサンチン含有脂質を回収した。
【０１０１】
＜実施例１〜８及び比較例１〜４の方法で回収した微細藻類からのアスタキサンチンの抽出＞
実施例１〜８及び比較例１〜４の、ヘマトコッカス ラキュストリス含有紙パルプシートは、そのまま１０ｍｍ角に裁断した後、ヘマトコッカス ラキュストリス藻乾燥質量１０部当り、１００質量部のアセトンを使用して抽出し、アスタキサンチン含有脂質を回収した。
【０１０２】
＜アスタキサンチン濃度の測定＞
回収したアスタキサンチン含有脂質を含むアセトン溶液上清の吸光度（波長４８０ｎｍ及び７５０ｎｍ）を測定してカロテノイド濃度を求めた（“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｅａ Ｗａｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ” ｐ．１８５−２０６， Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｃｎａｎａｄａ （１９６８））。ヘマトコッカス ラキュストリスのシスト細胞中に蓄積されるカロテノイドの殆どは、アスタキサンチンであることが知られていることから（Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７１（５）：３３５−３３９ （１９９１））、得られたカロテノイド濃度をアスタキサンチン濃度として表した。
実施例１〜８及び比較例１〜４の成分抽出率は、実施例１〜８及び比較例１〜４で得られたアスタキサンチン濃度値を、前記従来の方法（遠心分離）で得られた濃度値で除した百分率で示した。結果を表２に示す。
【０１０３】
（試験例２：ナンノクロロプシス オキュラータ産生エイコサペンタエン酸の分析）
ナンノクロロプシス オキュラータが細胞内に産生する脂肪酸は、従来、遠心分離後、フィルター濾過を行う２段階の分離工程を経た後、有機溶媒で抽出することにより得られていた。
そこで、前記実施例９〜１２及び比較例５〜６の方法で得られた細胞から抽出した脂肪酸から分離したエイコサペンタエン酸の量、及び前記従来の方法である遠心分離及び濾過後に抽出して得た脂肪酸から分離したエイコサペンタエン酸の量をそれぞれ測定して比較した。
【０１０４】
＜遠心分離により回収した微細藻類からの脂肪酸の抽出（従来法）＞
実施例９〜１２及び比較例５〜６と同様の方法で、ナンノクロロプシス オキュラータを培養した。この培養液を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を取除いて藻体を回収し、ナンノクロロプシス オキュラータ藻乾燥質量１部当たり、１０質量部の５質量％塩酸を含むメタノール溶媒を添加し、９５℃で３時間還流して、脂肪酸をエステル交換した後、ヘキサン溶媒で脂肪酸メチルエステルを抽出した。
【０１０５】
＜実施例９〜１２及び比較例５〜６の方法で回収した微細藻類からの脂肪酸の抽出＞
実施例９〜１２及び比較例５〜６の、ナンノクロロプシス オキュラータ含有紙パルプシートは、そのまま１０ｍｍ角に裁断した後、ナンノクロロプシス オキュラータ藻乾燥 １部当たり、１０質量部の５質量％塩酸を含むメタノール溶媒を添加し、９５℃で３時間還流して、脂肪酸をエステル交換した後、ヘキサン溶媒で脂肪酸メチルエステルを抽出した。
【０１０６】
＜エイコサペンタエン酸濃度の測定＞
抽出した脂肪酸メチルエステルに含まれるエイコサペンタエン酸の濃度は、下記ガスクロマトグラフィー分析条件により定量した。
［ガスクロマトグラフィー測定条件］
装置 ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１４Ａ（株式会社島津製作所製）
検出器 ：ＦＩＤ
カラム ：ＤＢ−ＷＡＸ（アジレント・テクノロジー社製）
キャリアーガス：ヘリウム
流速 ：１ｍＬ／分間
カラム温度 ：１７０℃〜２１０℃（１．５℃／分間）
内部標準物質 ：トリコサン酸メチルエステル（ＳＩＧＭＡ社製）
実施例９〜１２及び比較例５〜６の成分抽出率は、実施例９〜１２及び比較例５〜６で得られたエイコサペンタエン酸濃度値を、前記従来の方法（遠心分離）で得られた濃度値で除した百分率で示した。結果を表２に示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
表２より、前記実施例の方法で回収された微細藻類から従来法（遠心分離）と同等又はそれ以上の量のアスタキサンチン及びエイコサペンタエン酸を得ることができた。従来の遠心分離の方法では、操作の過程で微細藻類のロスが出ることがあったが、前記実施例の方法では、微細藻類含有紙パルプシートをそのまま抽出に用いるため、紙パルプ層に回収した微細藻類の全てから効率よく細胞内成分を抽出できることがわかった。更に、前記実施例の方法では、従来の方法より少ない工程で簡便であり、かつ省エネルギーで分離できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
前記微細藻類細胞内成分の抽出方法は、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく回収でき、更に前記微細藻類を回収した紙パルプシートをそのまま抽出に用いることで、効率よく簡便に前記微細藻類の細胞内に含まれる成分を抽出することができるため、石油資源の代替原料としてのバイオディーゼルの製造や、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料などに好適に利用可能である。
【符号の説明】
【０１１１】
１ フィルター
２ 紙パルプ層
３ 微細藻類懸濁液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類細胞内成分の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油の枯渇や二酸化炭素の増加による地球温暖化などが問題となっており、石油資源の代替原料としてバイオマスから産生されるバイオディーゼルが注目されている。バイオマス原料としては、菜種油、パーム油、オリーブ油、ひまわり油、大豆油等の植物油が利用されているが、これらの原料を用いたバイオディーゼルの生産量を増加させると、食料や飼料の供給に影響を及ぼすことが懸念される。そのため、これらの植物に代わる石油資源の代替原料として、微細藻類が注目されている。
【０００３】
微細藻類は、単細胞を単位生命体とし、葉緑素（クロロフィル）を有し、光合成によって大気中の二酸化炭素を固定化し酸素を産生する。海洋だけでなく、湖、池、川等の淡水系にも繁殖し、その種類は１０万種類におよぶ。微細藻類は、物質生産量が陸上植物と比較して多く、その種類によっては、陸上植物より光合成能力が高いものや、脂肪酸を蓄積するものなどがあるため、バイオディーゼルの生産を容易に行うことができる。また、微細藻類は、バイオディーゼルの原料として用いた場合であっても、食料や飼料と競合する問題がなく、植物と比較して単位面積当たりの生産性が高く、植物栽培に適さない土地でも利用でき、二酸化炭素固定への寄与率が高いなど、多くの利点を有する。
【０００４】
更に、微細藻類が産生する成分としては、脂肪酸の他にも種々の生理活性物質を産生することが知られており、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料などへの応用が期待されている。例えば、ヘマトコッカス ラキュストリスは、アスタキサンチンを産生する。このアスタキサンチンは、ビタミンＥの約１，０００倍、β−カロテンの約４０倍の抗酸化作用を有することが知られている。そのため、動脈硬化、糖尿病、炎症、皮膚の老化等の防止作用や、免疫賦活化、抗ストレス、美白などの種々の効果が期待されている。また、ナンノクロロプシス オキュラータは、脂肪酸を産生するが、この中でもエイコサペンタエン酸は、ガンの予防作用、中性脂肪やコレステロールの低減作用などが知られている。
【０００５】
このような種々の機能を有する微細藻類を回収する方法としては、フィルター濾過する方法や、遠心分離による方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、フィルター濾過では単細胞の微細藻類を回収することができず、糸状性や群体性等の限られた種類の微細藻類しか回収できないため、回収率が悪い点で問題であった。また、遠心分離を行うためにはエネルギーが必要となるため、省エネルギーの観点から好ましくない。
紙パルプに藻を添加して抄紙を行った藻マルチングシートも提案されているが、該マルチングシートにおけるクロレラの回収率は７０％程度であり、その回収率は十分満足できるものではなかった（特許文献１参照）。
【０００６】
したがって、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できる微細藻類細胞内成分の抽出方法が求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−３４６７５７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｏｌｉｎａ Ｇｒｉｍａ Ｅ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ， ２００３， Ｊａｎ；２０（７−８）， ４９１−５１５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できる微細藻類細胞内成分の抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、フィルター上に紙パルプ層を形成した後、前記紙パルプ層に、ゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整した微細藻類懸濁液を吐出することにより、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に、前記微細藻類を含有する紙パルプシートをそのまま抽出に用いることができるため、前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ フィルター上に紙パルプ層を形成する紙パルプ層形成工程と、
少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整するゼータ電位調整工程と、
前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を調整した微細藻類懸濁液を吐出して前記微細藻類を回収する回収工程と、
前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜２＞ 抽出工程が、微細藻類含有紙パルプシートと、抽出溶剤とを接触させて微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する工程である前記＜１＞に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜３＞ 紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の絶乾質量が１０ｇ／ｍ２〜１５０ｇ／ｍ２の紙パルプ層を形成する工程である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜４＞ 紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の含有量が０．５質量％〜２０質量％の紙パルプ層を形成する工程である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜５＞ ゼータ電位調整工程が、微細藻類懸濁液に多価カチオン及びアニオン性基を有する高分子化合物を添加することにより、前記微細藻類懸濁液のゼータ電位を調整する工程である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜６＞ フィルターが、抄紙ワイヤーである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
＜７＞ 微細藻類が、ヘマトコッカス ラキュストリス及びナンノクロロプシス オキュラータの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法である。
である。
＜８＞ 前記＜７＞に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法により得られることを特徴とするアスタキサンチンである。
＜９＞ 前記＜７＞に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法により得られることを特徴とするエイコサペンタエン酸である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく微細藻類を回収でき、更に前記微細藻類が細胞内に産生する成分を効率よく簡便に抽出できる微細藻類細胞内成分の抽出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の微細藻類細胞内成分の抽出方法の一例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（微細藻類細胞内成分の抽出方法）
本発明の微細藻類細胞内成分の抽出方法は、紙パルプ層形成工程と、ゼータ電位調整工程と、回収工程と、抽出工程と、を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１５】
＜紙パルプ層形成工程＞
前記紙パルプ層形成工程は、フィルター上に紙パルプ層を形成する工程である。
【００１６】
＜＜フィルター＞＞
前記フィルターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抄紙ワイヤーが好ましい。前記抄紙ワイヤーとは、例えば、紙パルプ技術協会誌（２００５年２月号１６８頁）に記載された、紙を漉く際に最初に紙層形成を担う用具である。
【００１７】
前記フィルターの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエステル、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン等のプラスチック、ステンレス、ブロンズなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記材質は、荷重に対する伸びが少なく、剛性、形状安定性、耐疲労性、耐蝕性などが高い点で、プラスチックワイヤーが好ましい。
【００１８】
前記フィルターの構造は、平織りであってもよく、重織であってもよいが、平織〜４．５重織が好ましく、濾水性の高さの観点から、平織〜２．５重織がより好ましい。
前記フィルターの篩目開きとしても、特に制限はなく、前記フィルターの構造などに応じて適宜選択することができるが、濾水性の高さの観点から、０．３５５ｍｍ（４２メッシュ）〜０．０３８ｍｍ（４００メッシュ）が好ましい。
【００１９】
＜＜紙パルプ層＞＞
前記紙パルプ層は、後述するパルプ懸濁液により好適に形成することができる。
【００２０】
−パルプ懸濁液−
前記パルプ懸濁液は、少なくともパルプを含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００２１】
−−パルプ−−
前記パルプの原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、針葉樹や広葉樹等の木材、サトウキビバガス、草、藁、竹等の非木材などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記パルプを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記パルプ原料から製造する方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００２２】
前記パルプは、その製造方法から、メカニカルパルプ、サーモメカニカルパルプ、化学パルプの３種類に分けることができ、本発明における前記パルプは、これらのうちのいずれであってもよい。また、前記製造方法により得られたパルプに漂白処理を施したものであってもよい。
前記メカニカルパルプとは、物理的な力で前記パルプ原料を叩解することにより得られるパルプである。
前記サーモメカニカルパルプとは、前記パルプ原料を高温及び高圧条件下におき、リグニンを軟化させた状態で叩解することにより得られるパルプである。
前記化学パルプとは、前記パルプ原料に、亜硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等の化学薬品で化学的な処理を施し、リグニン等の不要成分を除去後、叩解することにより得られるパルプである。
また、前記パルプは、前記パルプ原料から製造したバージンパルプであってもよく、古紙等から再生した再生パルプであってもよい。
【００２３】
前記パルプのカナディアンフリーネスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２００ｍＬ〜５００ｍＬが好ましく、２５０ｍＬ〜４５０ｍＬがより好ましい。前記カナディアンフリーネスが２００ｍＬ未満であると、パルプ層自体の脱水不良となることがあり、５００ｍＬを超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００２４】
前記パルプ懸濁液における固形パルプ分の含有量としては、前記紙パルプ層において所望のパルプ含有量に調整することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
−−その他の成分−−
前記パルプ懸濁液における前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、乾燥紙力増強剤、湿潤紙力増強剤、撥水剤、濾水性向上剤、填量などが挙げられる。
前記紙パルプ層における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
−紙パルプ層の形成方法−
前記紙パルプ層を形成する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、抄紙機に前記フィルターを設置し、前記フィルター上に前記パルプ懸濁液を添加して濾過することにより、前記フィルター上に前記パルプ層を堆積させて形成する方法などが挙げられる。
前記抄紙機としては、特に制限はなく、公知の装置の中から適宜選択することができ、例えば、丸型シートマシーン（例えば、熊谷理機工業株式会社製）、ダイナミックシートフォーマー、長網抄紙機、ツインワイヤ抄紙機、円網抄紙機、円網短網コンビネーション抄紙機などが挙げられる。
【００２７】
前記紙パルプ層における固形パルプ分の絶乾質量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｇ／ｍ２〜１５０ｇ／ｍ２が好ましく、１５ｇ／ｍ２〜５０ｇ／ｍ２がより好ましい。前記絶乾質量が、１０ｇ／ｍ２未満であると、単細胞の微細藻類を回収することができないことがあり、１５０ｇ／ｍ２を超えると、微細藻回収効果効率に特段な変化はなくパルプの過剰使用となることがある。
【００２８】
前記パルプ懸濁液におけるパルプの絶乾質量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記紙パルプ層を乾燥させて秤量する方法などが挙げられる。
前記乾燥させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。
【００２９】
前記紙パルプ層における固形パルプの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５質量％〜２０質量％が好ましく、１質量％〜５質量％がより好ましい。前記固形パルプの含有量が、０．５質量％未満であると、前記単細胞の微細藻類を回収することができないことがあり、２０質量％を超えると、パルプ繊維分散性が低下し、微細藻類の回収率が低下することがある。
【００３０】
前記紙パルプ層の水分含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８５質量％〜９９質量％が好ましく、８５質量％〜９５質量％がより好ましい。前記水分含有量が、８５質量％未満であると、パルプ繊維分散性が低下し、微細藻類の回収率が低下することがあり、９５質量％を超えると、微細藻類の回収率が低下することがある。
前記水分含有量は、例えば、紙パルプ層全体を秤量した後、紙パルプ層を乾燥させて絶乾質量を秤量して、その差分を水分とすることで測定することができる。
【００３１】
前記紙パルプ層の水分含有量を調整する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、紙パルプ層の形成時に前記フィルター上に前記パルプ懸濁液を添加して濾過した後、吸引時間及び吸引圧を調整する方法などが挙げられる。
前記吸引時間としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、１分間〜１０分間が好ましく、２分間〜５分間がより好ましい。
前記吸引圧としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、３０ｋＰａ〜５００ｋＰａが好ましく、５０ｋＰａ〜２００ｋＰａがより好ましい。
【００３２】
＜ゼータ電位調整工程＞
前記ゼータ電位調整工程は、少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を調整する工程である。
【００３３】
＜＜微細藻類懸濁液＞＞
前記微細藻類懸濁液は、少なくとも微細藻類を含み、好ましくは、多価カチオン及びアニオン性基を有する高分子化合物を含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。
【００３４】
−微細藻類−
本発明において微細藻類とは、陸上動物と同様に酸素発生を伴う光合成機能を有する単細胞、若しくは、単細胞に近い多細胞の藻類であり、器官として未分化の細胞を有する顕微鏡下の識別を要する小さな個体（１ミクロン〜数十ミクロン）の藻の総称である。前記微細藻類は、クロロフィル、フィコピリン、カロテノイド等の光合成色素を含有していることを特徴としている。
前記微細藻類の分類群としては、例えば、主に淡水に生息する車軸藻、緑藻、珪藻、黄緑藻、真正眼点藻、紅藻、藍藻や、主に海水に存在する緑藻、褐藻、珪藻、ハプト藻などが存在し、いずれも光合成機能を有するため、植物プランクトンとも称される。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記微細藻類細胞内成分の抽出方法は、前記単細胞の藻類であっても効率よく回収できる点で有利である。
【００３５】
以下に、前記微細藻類の具体的な例を挙げる。
藍藻綱（Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、クロオコックス目（Ｃｙｒｏｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）の、シネコキスチス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ダクチロコッコプシス属（Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ）、テトラペジア属（Ｔｅｔｒａｐｅｄｉａ）、クロオコックス属（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロキスチス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、アファノカプサ属（Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ）、グロエオカプサ属（Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ）、アファノテーケ属（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ）、ラブドゲルマ属（Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ）、グロエオケーテ属（Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ）、プソイドホロペジア属（Ｐｓｅｕｄｏｈｏｌｏｐｅｄｉａ）、メリスモペジウム属（Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉｕｍ）、ユウカプシス属（Ｅｕｃａｐｓｉｓ）、ゴンフェスフェリア属（Ｇｏｍｐｈｏｓｐｈａｅｒｉａ）、コエロスフェリウム属（Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ）、アイノゴノメ属（Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ）；カマエシフォン目（Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）の、カマエシフォン属（Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ）；プレウロカプサ目（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）のミクソサルシナ属（Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ）、ヒドロコックス属（Ｈｙｄｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クセノコックス属（Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プレウロカプサ属（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ）；ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）の、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、ホモエオスリックス属（Ｈｏｍｏｅｏｔｈｒｉｘ）、ジコスリックス属（Ｄｉｃｈｏｔｈｒｉｘ）、カロスリックス属（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）、グロエオトリキア属（Ｇｌｏｅｏｔｒｉｃｈｉａ）、ヒゲモ属（Ｒｉｖｕｌａｒｉａ）、イサクチス属（Ｉｓａｃｔｉｓ）、プレクトネマ属（Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ）、トリポスリックス属（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）、スキトネマ属（Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ）、スキトネマトプシス属（Ｓｃｙｔｏｎｅｍａｔｏｐｓｉｓ）、ヒドロコリーネ属（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｙｎｅ）、ミクロケト属（Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅ）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ）、アファニゾメノン属（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アウロシラ属（Ａｕｌｏｓｉｒａ）、ノジュラリア属（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、アナベノプシス属（Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ）、キリンドロスペルマム属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）；ユレモ目（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）の、ボルジア属（Ｂｏｒｚｊａ）、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ユレモ属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）、フォルミジウム属（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）、リングピア属（Ｌｙｎｇｂｙａ）、シンプロカ属（Ｓｙｍｐｌｏｃａ）、ムラサキクダモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｓｉｐｈｏｎ）、ダシグロエア属（Ｄａｓｙｇｌｏｅａ）、シゾスリックス属（Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ）、ミクロコレウス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ）；スチゴネマ目（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）の、フィツシェレラ属（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ）、スチゴネマ属（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ）、タルポフィラ属（Ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌａ）、ハパロシフォン属（Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ）、ウエステレロプシス属（Ｗｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓ）、ノストコプシス属（Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ）、イデユアイミドリ属（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ）などが挙げられる。
【００３６】
灰青藻綱（Ｇｌａｕｃｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、グラウコスフェラ目（Ｇｌａｕｃｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ）のスクヤペルタ属（Ｓｋｕｊａｐｅｌｔａ）などが挙げられる。
【００３７】
紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、チノリモ目（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉａｌｅｓ）の、ポルフィリディウム属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、チノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、イデユコゴメ属（Ｃｙａｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ロドソルス属（Ｒｈｏｄｏｓｏｒｕｓ）、ロデラ属（Ｒｈｏｄｅｌｌａ）、ディクソニエラ属（Ｄｉｘｏｎｉｅｌｌａ）などが挙げられる。
【００３８】
黄色鞭毛藻綱（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、リゾクリシス目（Ｒｈｉｚｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）のラギニオン属（Ｌａｇｙｎｉｏｎ）；ヒカリモ目（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ）の、クリソスフェラ属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、ヒカリモ属（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）、ヘテロクロムリナ属（Ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）、クリソコックス属（Ｃｈｒｙｓｏｃｏｃｃｕｓ）、コドモナス属（Ｃｏｄｏｍｏｎａｓ）、クリソカプサ属（Ｃｈｒｙｓｏｃａｐｓａ）、ミズオ属（Ｈｙｄｒｕｒｕｓ）；オクロモナス目（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、オクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）０、ディディモクリシス属（Ｄｉｄｙｍｏｃｈｒｙｓｉｓ）、シンクリプタ属（Ｓｙｎｃｈｒｙｐｔａ）、ウログレナ属（Ｕｒｏｇｌｅｎａ）、ウログレノプシス属（Ｕｒｏｇｌｅｎｏｐｓｉｓ）、シノブリオン属（Ｄｉｎｏｂｒｙｏｎ）、ヒアロブリオン属（Ｈｙａｂｒｙｏｎ）、マロモナス属（Ｍａｌｌｏｍｏｎａｓ）、シヌラ属（Ｓｙｎｕｒａ）、クリソスフェラ属（Ｃｈｙｓｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、パラフィソモナス属（Ｐａｒａｐｈｙｓｏｍｏｎａｓ）；ディクチオカ目（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａｌｅｓ）のディクチオカ属（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａ）などが挙げられる。
【００３９】
黄緑色藻綱（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、リゾクロリス目（Ｒｈｉｚｏｃｈｌｏｒｉｄａｌｅｓ）のスチピトコックス属（Ｓｔｉｐｉｔｏｃｏｃｃｕｓ）；ミショコックス目（Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃａｌｅｓ）の、ボツリジオプシス属（Ｂｏｔｒｙｄｉｏｐｓｉｓ）、クロロクロステル属（Ｃｈｌｏｒｏｃｌｏｓｔｅｒ）、エリプソイドン属（Ｅ１ｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、モノドス属（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、クロロボツリス属（Ｃｈｉｏｒｏｂｏｔｒｙｓ）、ミショコックス属（Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、カラシオプシス属（Ｃｈａｒａｃｉｏｐｓｉｓ）、オフィオキチウム属（Ｏｐｈｉｏｃｙｔｉｕｍ）などが挙げられる。
【００４０】
渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ギムノジニウム目（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉａｌｅｓ）の、アンフィジニウム属（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ）、ギムノジニウム属（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）、ギロジニウム属（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）；ペリジニウム目（Ｐｅｒｉｄｉｎｉａｌｅｓ）の、へミジニウム属（Ｈｅｍｉｄｉｎｉｕｍ）、グレンジニウム属（Ｇｌｅｎｏｄｉｎｉｕｍ）、ジプロプサリス属（Ｄｉｐｌｏｐｓａｌｉｓ）、ペリジニウム属（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）、ケラチウム属（Ｃｅｒａｔｉｕｍ）、ヘテロカプサ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ）、プロトペリジニウム属（Ｐｒｏｔｏｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）；ジノコックス目（Ｄｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）の、チストジニウム属（Ｃｙｓｔｏｄｉｎｉｕｍ）、テトラジニウム属（Ｔｅｔｒａｄｉｎｉｕｍ）；プロロケントルム目（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｌｅｓ）のプロロケントルム属（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ）；ディノフィシス目（Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉａｌｅｓ）の、ディノフィシス属（Ｄｉｎｏｐｈｙｓｉｓ）、オウニトケルクス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｃｅｒｃｕｓ）などが挙げられる。
【００４１】
褐色鞭毛藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、クリプトモナス目（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、クリプトモナス属（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、キロモナス属（Ｃｈｉｌｏｍｏｎａｓ）、へミセルミス属（Ｈｅｍｉｓｅｌｍｉｓ）、ロドモナス属（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）などが挙げられる。
【００４２】
ラフィド藻綱（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ラフィドモナス目（Ｒａｐｈｉｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、バクオラリア属（Ｖａｃｕｏｌａｒｉａ）、ゴニオストマム属（Ｇｏｎｙｏｓｔｏｍｕｍ）、メロトリキア属（Ｍｅｒｏｔｒｉｃｈｉａ）、シャットネラ属（Ｃｈａｔｔｏｎｅｌｌａ）などが挙げられる。
【００４３】
ミドリムシ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎａｌｅｓ）の、ミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、レポシンクリス属（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ファクス属（Ｐｈａｃｕｓ）アスタシア属（Ａｓｔａｓｉａ）、キクリジオプシス属（Ｃｙｃｌｉｄｉｏｐｓｉｓ）、トラケロモナス属（Ｔｒａｃｈｅｌｏｍｏｎａｓ）、ジスチグマ属（Ｄｉｓｔｉｇｍａ）、ペラネマ属（Ｐｅｒａｎｅｍａ）、アニソネマ属（Ａｎｉｓｏｎｅｍａ）；コラキウム目（Ｃｏｌａｃｉａｌｅｓ）のコラキウム属（Ｃｏｌａｃｉｕｍ）；ユートレプティア目（Ｅｕｔｒｅｐｔｉａｌｅｓ）のユートレプティア属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉａ）などが挙げられる。
【００４４】
緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、オオヒゲマワリ目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）の、へマトコックス属（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カルテリア属（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クロロゴニウム属（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、ロボモナス属（Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、デュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、ゴニウム属（Ｇｏｎｉｕｍ）、プレオドリナ属（Ｐｌｅｏｄｏｒｉｎａ）、オオヒゲマワリ属（Ｖｏｌｖｏｘ）、パンドリナ属（Ｐａｎｄｏｒｉｎａ）、ユウドリナ属（Ｅｕｄｏｒｉｎａ）；ヨツメモ目（Ｔｅｔｒａｓｐｏｒａｌｅｓ）の、アステロコックス属（Ａｓｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パルモジクチオン属（Ｐａｌｍｏｄｉｃｔｙｏｎ）、グロエオキスチス属（Ｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ）、アスケナシエラ属（Ａｓｋｅｎａｓｙｅｌｌａ）、スファエロキスチス属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｙｓｔｉｓ）、ヨツメモ属（Ｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）；ヒビミドロ目（Ｕｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）のスチココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）；クロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）の、デスマトラクツム属（Ｄｅｓｍａｔｒａｃｔｕｍ）、ブラクテアコックス属（Ｂｒａｃｔｅａｃｏｃｃｕｓ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、ゴレンキニア属（Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａ）、キルヒネリエラ属（Ｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）；ホシミドロ目（Ｚｙｇｎｅｍａｔａｌｅｓ）の、ネトリウム属（Ｎｅｔｒｉｕｍ）、ペニウム属（Ｐｅｎｉｕｍ）、ミカヅキモ属（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）、コウガイチリモ属（Ｐｌｅｕｒｏｔａｅｎｉｕｍ）、ツヅミモ属（Ｃｏｓｍａｒｉｕｍ）などが挙げられる。
【００４５】
プラシノ藻綱（Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、マミエラ目（Ｍａｍｉｅｌｌａｌｅｓ）の、プラシノコックス属（Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロモナス属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）；プセウドスコウルフィエルディア目（Ｐｓｅｕｄｏｓｃｏｕｒｆｉｅｌｄｉａｌｅｓ）のネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）；ピラミモナス目（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｄａｌｅｓ）の、プテロスペルマ属（Ｐｔｅｒｏｓｐｅｒｍａ）、ハロスファエラ属（Ｈａｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）；クロロデンドロン目（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）のテトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）などが挙げられる。
【００４６】
珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、円心目（Ｃｅｎｔｒａｌｅｓ）の、キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、デトニューラ属（Ｄｅｔｏｎｕｌａ）、ミニディスクス属（Ｍｉｎｉｄｉｓｃｕｓ）、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、キートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）；羽状目（Ｐｅｎｎａｌｅｓ）のディメレグラムマ属（Ｄｉｍｅｒｅｇｒａｍｍａ）、ナビキュラ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ニッチア属（Ｎｏｔｚｓｃｈｉａ）などが挙げられる。
【００４７】
真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ユースティグマトス目（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔａｌｅｓ）のナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）などが挙げられる。
【００４８】
ハプト藻綱（Ｈａｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、イソクリシス目（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）の、プリュウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｉｓｉｓ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉｎｉａｎｉａ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ゲフィロカプサ属（Ｇｅｐｈｙｒｏｃａｐｓａ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、クリソティラ属（Ｃｈｒｙｓｏｔｙｌａ）、ヒメノモナス属（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、オクロスファエラ属（Ｏｃｈｒｏｓｐｈａｅｒａ）；プリムネシウム目（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｄａｌｅｓ）の、プリムネシウム属（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ）、クリソクロムリナ属（Ｃｈｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）、フェオキィスティス属（Ｐｈａｅｏｃｙｓｔｉｓ）；円石藻目（Ｃｏｃｃｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ）の、カリプトロスファエラ属（Ｃａｌｙｐｔｒｏｓｐｈａｅｒａ）、ブラルードスファエラ属（Ｂｒａａｒｕｄｓｐｈａｅｒａ）、アノプロソレニア属（Ａｎｏｐｌｏｓｏｌｅｎｉａ）、カルキオソレニア属（Ｃａｌｃｉｏｓｏｌｅｎｉａ）、カルキディスクス属（Ｃａｌｃｉｄｉｃｕｓ）、コッコリトゥス属（Ｃｏｃｃｏｌｉｔｈｕｓ）、オオリトトゥス属（Ｏｏｌｉｔｈｏｔｕｓ）、ウンビリコスファエラ属（Ｕｍｂｉｌｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、へリコスファエラ属（Ｈｅｌｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、ポンスファエラ属（Ｐｏｎｔｏｓｐｈａｅｒａ）、アカントイカ属（Ａｃａｎｔｈｏｉｃａ）、アルギロスファエラ属（Ａｌｇｉｒｏｓｐｈａｅｒａ）、ディスコスファエラ属（Ｄｉｓｃｏｓｐｈａｅｒａ）、ラブドスファエラ属（Ｒｈａｂｄｏｓｐｈａｅｒａ）、カネオスファエラ属（Ｃａｎｅｏｓｐｈａｅｒａ）、コロノスファエラ属（Ｃｏｒｏｎｏｓｐｈａｅｒａ）、シラコスファエラ属（Ｓｙｒａｃｏｓｐｈａｅｒａ）、ドイツランディア属（Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄｉａ）、ウンベロスフェラ属（Ｕｍｂｅｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ミカエルサルシア属（Ｍｉｃｈａｅｌｓａｒｓｉａ）、オフィアスター属（Ｏｐｈｉａｓｔｅｒ）；パブロバ目（Ｐａｖｌｏｖａｌｅｓ）のパブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）などが挙げられる。
【００４９】
ユーグレナ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）としては、例えば、ユーグレナ目（Ｅｕｇｌｅｎａｌｅｓ）のユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）などが挙げられる。
【００５０】
前記微細藻類を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などが挙げられる。
【００５１】
前記微細藻類を培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、振盪培養、静置培養などが挙げられる。これらの中でも、前記微細藻類は好気性であることから振盪培養が好ましい。
【００５２】
前記微細藻類の培養に用いる培地としては、藻類を培養できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無機物から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記培地のｐＨとしては、特に制限はなく、微細藻類の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００５３】
前記培養の温度、時間、炭酸ガス濃度、及び照度としても、特に制限はなく、微細藻類の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００５４】
前記微細藻類懸濁液における前記微細藻類の絶乾質量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類懸濁液を乾燥させて秤量する方法などが挙げられる。
前記乾燥させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。これらの中でも、前記乾燥方法は、加熱乾燥法が好ましく、オーブンを用いることがより好ましい。
前記オーブンで乾燥させる場合、その温度及び時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０℃〜１２０℃で２時間〜１２時間乾燥させることが好ましい。
なお、前記絶乾質量を測定する際に、前記微細藻類懸濁液は、予め濾過することが、培養液に溶解した各種塩分などを除去できる点で好ましい。
【００５５】
−多価カチオン−
前記微細藻類懸濁液は、更に多価カチオンを含むことが、前記微細藻類を好適に凝集させることができ、前記微細藻類の回収率が向上する点で好ましい。
前記多価カチオンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋等の金属イオンなどが挙げられる。
前記微細藻類懸濁液において、前記金属イオンを発生させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類懸濁液に、硫酸アルミニウム水溶液、ポリ塩化アルミニウム水溶液、塩化第二鉄水溶液、ポリ硫酸第二鉄水溶液、硫酸第一鉄水溶液等の金属を含む水溶液を添加する方法などが挙げられる。これらの中でも、前記水溶液は、硝酸アルミニウム水溶液が好ましい。また、例えば、ジメチルジアリルアンモニウムクロライド（ＤＭＤＡＡ）、アルキルアミン・エピクロルヒドリン縮合物等の分子内に多数のカチオンを有する高分子電解質を添加する方法なども挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５６】
前記微細藻類懸濁液における、前記金属を含む水溶液又は前記高分子電解質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微細藻類懸濁液中の前記微細藻類の絶乾質量１００部に対して、０．１質量部〜３．５質量部が好ましく、１質量部〜２質量部がより好ましい。前記金属を含む水溶液又は前記高分子電解質の含有量が、０．１質量部未満又は３．５質量部超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００５７】
−アニオン性基を有する高分子化合物−
前記微細藻類懸濁液は、更にアニオン性基を有する高分子化合物を含むことが、前記微細藻類を好適に凝集させることができ、前記微細藻類の回収率が向上する点で好ましい。
前記アニオン性基を有する高分子化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＭＮＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、カルボキシメチルセルロース及びそのナトリウム塩、カルボキシ変性ポリビニルアルコールなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記アニオン性基を有する高分子化合物は、ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＭＮＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）が好ましい。
【００５８】
前記微細藻類懸濁液における、前記アニオン性基を有する高分子化合物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微細藻類懸濁液中の前記微細藻類の絶乾質量１００部に対して、０．０５質量部〜０．５質量部が好ましく、０．０５質量部〜０．１質量部がより好ましい。前記アニオン性基を有する高分子化合物の含有量が、０．０５質量部未満又は０．５質量部を超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００５９】
−その他の成分−
前記微細藻類懸濁液における前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、前記多価カチオン及び前記アニオン性基を有する高分子化合物を除くゼータ電位調整剤などが挙げられる。
前記ゼータ電位調整剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルボキシメチルセルロース及びそのナトリウム塩、カルボキシ変性ポリビニルアルコールなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記微細藻類懸濁液における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６０】
＜＜ゼータ電位の調整＞＞
前記微細藻類懸濁液のゼータ電位は、−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整されるが、−１０ｍＶ〜＋１０ｍＶに調整されることが好ましく、−５ｍＶ〜＋５ｍＶに調整されることがより好ましい。前記ゼータ電位が、−１５ｍＶ未満又は＋１５ｍＶを超えると、前記微細藻類の回収率が低下することがある。
【００６１】
前記ゼータ電位を調整する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記多価カチオンやアニオン性基を有する高分子化合物を前記微細藻類懸濁液に添加し、これらの添加量などによって調整する方法が好ましい。
【００６２】
前記ゼータ電位を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のゼータ電位測定装置を用いて測定する方法などが挙げられる。前記ゼータ電位測定装置の具体的な例としては、ゼータ電位測定装置 ＺＥＥＣＯＭ ＺＣ２０００（株式会社マイクロテック・ニチオン社製）などが挙げられる。
【００６３】
＜回収工程＞
前記回収工程は、前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を所望の値に調整した微細藻類懸濁液を吐出して前記微細藻類を回収する工程である。なお、本発明において、回収とは、前記紙パルプ層に前記微細藻類が捕捉されることをいう。以下、微細藻類を回収した紙パルプ層を、「微細藻類含有紙パルプシート」と称することがある。
【００６４】
前記吐出方法としては、前記フィルター上に形成した前記紙パルプ層に前記微細藻類懸濁液を吐出することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、紙パルプ層上に前記微細藻類懸濁液を添加して濾過した後、吸引する方法などが挙げられる。
前記吸引時間としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、１分間〜１０分間が好ましく、２分間〜５分間がより好ましい。
前記吸引圧としては、特に制限はなく、紙パルプ層の水分含有量などに応じて適宜選択することができるが、３０ｋＰａ〜５００ｋＰａが好ましく、５０ｋＰａ〜２００ｋＰａがより好ましい。
これにより、前記微細藻類懸濁液が濾過され、前記微細藻類懸濁液中の液体成分と、細胞とを好適に分離することができ、前記紙パルプ層に前記微細藻類を回収することができる。
【００６５】
前記回収工程において、前記微細藻類懸濁液を添加する量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記紙パルプ層における固形パルプの含有量１００質量部に対して、前記微細藻類の絶乾質量で、４００質量部以下が好ましく、３００質量部以下がより好ましい。前記添加量が、４００質量部を超えると、前記紙パルプ層に詰まりが生じ、前記微細藻類を効率よく回収できないことがある。
【００６６】
前記微細藻類の回収率は、以下のように算出することができる。
前記回収工程により得られた、微細藻類含有紙パルプシートを乾燥させた後に秤量する（以下、「微細藻類含有紙パルプシート乾燥質量」と称することがある。）。一方、前記微細藻類懸濁液を添加していない紙パルプ層も同様の方法で乾燥後に秤量する（以下、「紙パルプシート乾燥質量」と称することがある。）。これらの値を用いて、次式により算出することができる。
回収率（％）＝［（微細藻類含有紙パルプシート乾燥質量（ｇ））−（紙パルプシート乾燥質量（ｇ））］／［（微細藻類懸濁液添加量（Ｌ）×（微細藻類懸濁液中の細胞濃度（ｇ／Ｌ））］×１００
ここで、「微細藻類懸濁液中の細胞濃度」は、予め秤量したガラス繊維濾紙で、培養懸濁液を濾別後、乾燥させて、乾燥重量を測定し、濾別した培養液全量で除することにより算出することができる。
【００６７】
＜抽出工程＞
前記抽出工程は、前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する工程である。
前記抽出には、前記微細藻類含有紙パルプシートをそのまま用いることが、操作が簡便であり、抽出効率がよい点で好ましいが、前記微細藻類含有紙パルプシートから前記微細藻類を分離してから用いてもよい。
【００６８】
前記抽出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類含有紙パルプシートに抽出溶剤を作用させて抽出する方法などが挙げられる。
前記抽出溶剤としては、特に制限はなく、前記微細藻類の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００６９】
以下に、前記微細藻類が、アスタキサンチンを産生するヘマトコッカス ラキュストリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、及び脂肪酸を産生するナンノクロロプシス オキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ）である場合を例に、前記抽出工程について詳細に説明するが、本発明の前記微細藻類の種類及びその細胞内成分としては、これらに限られるものではない。
【００７０】
−アスタキサンチンの抽出−
例えば、前記微細藻類が、ヘマトコッカス ラキュストリスである場合、その細胞内にはアスタキサンチンが産生されることが知られている。
【００７１】
前記微細藻類からアスタキサンチンを抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類含有紙パルプシートを抽出溶剤と接触させる方法などが挙げられる。
【００７２】
抽出溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセトン、エタノール、イソアミルアルコール、ｎ−ヘキサンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、溶解度の点から抽出効率のよいアセトンあるいはアセトンを含む混合溶剤が好ましく、アセトン−クロロホルム混合溶剤がより好ましい。
【００７３】
前記抽出に用いる前記抽出溶剤の量としては、用いる微細藻類の種類や量などに応じて適宜選択することができるが、微細藻類の絶乾質量１００部に対して、２００質量部〜２,０００質量部が好ましい。
前記抽出温度及び時間としては、特に制限はなく、前記微細藻類の性状、用いる抽出溶剤の種類や量などに応じて適宜選択することができる。
【００７４】
前記アスタキサンチンを含む抽出溶剤から、前記微細藻類など固形物を除去した後、抽出溶剤を除去すると、アスタキサンチンを含むカロテノイド類（色素）を得ることができる。この色素を常法にて精製処理することにより、アスタキサンチンを得ることができる。
抽出溶剤の除去方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、温和な条件下でアスタキサンチンを含む抽出溶剤を加温処理し、抽出溶剤を蒸発する処理法などが挙げられる。
前記精製処理方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７５】
前記微細藻類から抽出されたアスタキサンチンは、食品添加剤、食材用色素、飼料用添加剤などとして有用である。具体的には、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料等として好適に使用可能である。また、アスタキサンチンを精製処理していないカロテノイド類を、上記用途に使用してもよい。更には、アスタキサンチンを細胞内に蓄積した微細藻類の破砕物を上記用途に使用してもよい。
【００７６】
−脂肪酸の抽出−
例えば、前記微細藻類が、ナンノクロロプシス オキュラータである場合、その細胞内には脂肪酸が産生されることが知られている。
【００７７】
前記微細藻類から脂肪酸を抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、前記微細藻類含有紙パルプシートを抽出溶剤と接触させる方法などが挙げられる。
【００７８】
抽出溶剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等の有機溶媒；前記有機溶媒と塩酸との混合溶媒などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、メタノールが好ましく、５質量％塩酸を含むメタノールがより好ましい。
【００７９】
前記抽出に用いる前記抽出溶剤の量としては、用いる微細藻類の種類や量などに応じて適宜選択することができるが、微細藻類の絶乾質量１００部に対して、２００質量部〜２,０００質量部が好ましい。
前記抽出温度及び時間としては、特に制限はなく、前記微細藻類の性状、用いる抽出溶剤の種類や量などに応じて適宜選択することができる。
【００８０】
前記脂肪酸を含む抽出溶剤から、前記微細藻類など固形物を除去した後、抽出溶剤を除去すると、脂肪酸を得ることができる。
抽出溶剤の除去方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。
また、前記脂肪酸をクロマトグラフィー等の公知の方法で分離することにより、エイコサペンタエン酸を精製することもできる。
【００８１】
前記微細藻類から抽出された脂肪酸は、メタノールとのエステル交換反応等の公知の方法でメチルエステル化することで、ディーゼルとして利用可能であり、また前記脂肪酸から分離精製したエイコサペンタエン酸は、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料等として好適に使用可能である。また、脂肪酸を細胞内に蓄積した微細藻類の破砕物を上記用途に使用してもよい。
【００８２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィルター除去工程、プレス工程、乾燥工程、厚みプロファイル調整工程、水分プロファイル調整工程などが挙げられる。
【００８３】
＜＜フィルター除去工程＞＞
前記フィルター除去工程は、前記回収工程により得られた前記微細藻含有紙パルプシートから前記フィルターを取除く工程である。
前記フィルターを取り除く方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００８４】
＜＜プレス工程＞＞
前記プレス工程は、前記微細藻類含有紙パルプシートをプレスして、該微細藻類含有紙パルプシートから搾水させる工程である。
前記プレスする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、毛布などの上に紙パルプシートを乗せて、ローラーの間を圧搾しながら通す方法などが挙げられる。
【００８５】
＜＜乾燥工程＞＞
前記微細藻類含有紙パルプシートを乾燥させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、加熱乾燥法、対流乾燥法などが挙げられる。これらの中でも、前記乾燥方法は、加熱乾燥法が好ましく、オーブンを用いることがより好ましい。
前記オーブンで乾燥させる場合、その温度及び時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０℃〜１２０℃で２時間〜１２時間乾燥させることが好ましい。
【００８６】
＜＜厚みプロファイル調整工程＞＞
前記厚みプロファイル調整工程は、前記微細藻含有紙パルプシートの厚みをプロファイルする工程である。
前記厚みを測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、β線厚さ計、Ｘ線厚さ計等で測定する方法などが挙げられる。
【００８７】
＜＜水分プロファイル調整工程＞＞
前記水分プロファイル調整工程は、前記微細藻含有紙パルプシート、好ましくは、前記乾燥工程により乾燥された微細藻含有紙パルプシートの水分をプロファイルする工程である。
前記水分量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、近赤外線式水分計、マイクロ波式水分計等で測定する方法などが挙げられる。
前記微細藻含有紙パルプシートの水分をプロファイルすることで、例えば、前記乾燥工程における乾燥強度を微細藻含有紙パルプシートの幅方向で変え、微細藻含有紙パルプシートの幅方向の水分含有量を均一にすることができ、これにより前記微細藻含有紙パルプシートを抽出工程に用いるまで好適に搬送、保存でき、前記微細藻類細胞内成分の抽出効率が向上する点で好ましい。
【００８８】
＜用途＞
前記微細藻類細胞内成分の抽出方法は、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく回収でき、更に前記微細藻類を回収した紙パルプシートをそのまま抽出に用いることで、効率よく簡便に前記微細藻類の細胞内に含まれる成分を抽出することができる点で有利である。
なお、前記微細藻類細胞内成分の抽出方法の回収工程で回収された前記微細藻類懸濁液中の細胞、及び該細胞から抽出された細胞内成分も、本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００８９】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００９０】
（実施例１〜８、比較例１〜４）
＜パルプ懸濁液の調製＞
広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）と、針葉樹晒クラフトパルプ（ＮＢＫＰ）との質量比（ＬＢＫＰ／ＮＢＫＰ）が８０／２０からなる木材パルプ（ＬＢＫＰ： Ａｒａｃｒｕｚ社製、ＮＢＫＰ：Ｈａｒｍａｃ Ｐａｓｉｆｉｃ社製）を、ナイアガラビーター（熊谷理機工業株式会社製）で叩解し、カナディアンフリーネスが３００ｍＬのパルプ懸濁液を得た。
前記パルプ懸濁液をガラス繊維濾紙で濾別した後、ドライオーブンにて１１０℃で４時間乾燥させて秤量することにより固形パルプ分の含有量を求めたところ、１５ｇ／Ｌであった。
【００９１】
＜紙パルプ層の形成＞
丸型シートマシーン（熊谷理機工業株式会社製）に、２．５重織プラスチックワイヤー（ＬＬ−４０Ｅ、日本フイルコン株式会社製）を貼付したワイヤーを設置して、パルプ懸濁液を添加し、固形パルプ分の絶乾質量が、表１に示す坪量となるように、吸引時間及び吸引圧を調整することで、紙層水分を調整した。なお、坪量を５ｇ／ｍ２にする場合は、５０ｋＰａにて２分間、１０ｇ／ｍ２にする場合は、５０ｋＰａにて３分間、５０ｇ／ｍ２にする場合は１００ｋＰａにて３分間吸引した。
【００９２】
＜ヘマトコッカス ラキュストリスの培養＞
ヘマトコッカス ラキュストリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｕｓｔｒｉｓ：ＮＩＥＳ−２１６４）を細胞濃度が０．０５ｇになるようにＳｏｒｏｋｉｎ−Ｋｒａｕｓｓ培地 １Ｌに接種し、２Ｌ容のガラス製扁平フラスコに入れ、２５℃、二酸化炭素濃度５％とした空気を通気して振盪培養した。通気量は、１００ｍＬ／分間とした。培養は、植物育成用蛍光燈（株式会社チヨダサイエンス製）を光源として照度を５,０００ルクスに設定し、連続光照射下で行った。細胞濃度が、１．０ｇ／Ｌ以上に達したところで培養を止めた（１４日間）。
前記Ｓｏｒｏｋｉｎ−Ｋｒａｕｓｓ培地は、蒸留水１，０００ｍＬに対して、硝酸カリウム １．２５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物 １．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １．２５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム ８４ｍｇ／Ｌ、及び硫酸鉄七水和物 ５０ｍｇ／Ｌを添加した。次いで、ほう酸 ２．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物 １．８１ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物 ２２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水和物 ７９ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物 ４０ｍｇ／Ｌ、及びモリブデン酸ナトリウム二水和物 ２１ｍｇ／Ｌを含有する微量元素混合溶液１ｍＬを添加した後、ｐＨを６．８に調整した。
本培養後、光源を植物育成用蛍光燈から、ハロゲン光源（林時計工業株式会社製）に代えて、照度を３０，０００ルクスに設定し、３日間、連続照射下で、細胞のシスト化を行った。
【００９３】
＜微細藻類のゼータ電位の調整＞
前記培養後のヘマトコッカス ラキュストリスの培養液を、ガラス繊維濾紙（ＷｈａｔｍａｎグレードＧＦ／Ｄ）用いて濾過した後、ドライオーブンにて１１０℃で４時間乾燥させて秤量することにより、ヘマトコッカス ラキュストリス培養液中のヘマトコッカス ラキュストリスの絶乾質量を測定した。この測定値より、前記培養液中のヘマトコッカス ラキュストリスの細胞濃度を算出したところ、１ｇ／Ｌであった。
ヘマトコッカス ラキュストリスの乾燥質量１００部に対して、表１に示す割合で、硫酸アルミニウム水溶液又はジメチルジアリルアンモニウムクロライド（ＤＭＤＡＡ）を添加し、スターラー２５０ｒｐｍで１分間攪拌した。次いで、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）又はポリアクリル酸ナトリウム（ＰＭＮＡ）を、ヘマトコッカス ラキュストリスの乾燥質量１００部に対して、表１に示す割合で添加し、スターラー２５０ｒｐｍで１分間攪拌し、微細藻類懸濁液を調製した。
【００９４】
＜ゼータ電位の測定＞
微細藻類懸濁液のゼータ電位（Ｚｐ）を、ゼータ電位測定装置（ＺＥＥＣＯＭ ＺＣ２０００、株式会社マイクロテック・ニチオン社製）により、定法に従い測定した。結果を表１に示す。
【００９５】
＜回収方法＞
前記微細藻類懸濁液を、丸型シートマシーンのポンプで送液し、該丸型シートマシーンの吐出箱より吐出させ、前記紙パルプ層に添加し、微細藻類懸濁液を濾過することにより、ヘマトコッカス ラキュストリスを回収したヘマトコッカス ラキュストリス含有紙パルプシートを得た。微細藻類懸濁液の添加量としては、紙パルプ層の固形パルプ分１００質量部に対して、表１に示す割合で添加した。
【００９６】
（実施例９〜１２、比較例５〜６）
実施例１〜８及び比較例１〜４において、ヘマトコッカス ラキュストリスに代えて、下記方法で培養したナンノクロロプシス オキュラータを用いたこと以外は、実施例１〜８及び比較例１〜４と同様の方法で、パルプ懸濁液の調製、紙パルプ層の形成、微細藻類のゼータ電位の調整、ゼータ電位の測定、及び紙パルプ層への微細藻類の回収を行った。
【００９７】
＜ナンノクロロプシス オキュラータの培養＞
ナンノクロロプシス オキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ：ＮＩＥＳ−２１４６）を細胞濃度が０．０５ｇになるようにＧｕｉｌｌａｒｄ Ｆ培地 １Ｌに接種し、２Ｌ容のガラス製扁平フラスコに入れ、２５℃、二酸化炭素濃度５％とした空気を通気して振盪培養した。通気量は、１００ｍＬ／分間とした。培養は、植物育成用蛍光燈（株式会社チヨダサイエンス製）を光源として照度を２,０００ルクスに設定し、連続光照射下で行った。細胞濃度が、１．０ｇ／Ｌ以上に達したところで培養を止めた（８日間）。
前記Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｆ培地は、海水１，０００ｍＬに対して、硝酸ナトリウム ０．１５ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム ０．０１ｇ／Ｌ、珪酸ナトリウム九水和物 ０．０６ｇ／Ｌ、 Ｆｅ−ＥＤＴＡ ０．００９８ｇ／Ｌ、塩化マンガン四水和物 ３６μｇ／Ｌ、硫酸銅五水和物 １９．６μｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物 ４４μｇ／Ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物 ２μｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水和物 １２．６μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２ １．０μｇ／Ｌ、ビオチン １．０μｇ／Ｌ、及びチアミン塩酸塩 ０．２ｍｇ／Ｌを添加した後、ｐＨを８に調整した。
前記培養液中のナンノクロロプシス オキュラータの細胞濃度を、ヘマトコッカス ラキュストリスと同様の方法で測定した結果、１ｇ／Ｌであった。
【００９８】
＜微細藻類回収率の評価＞
実施例１〜１２及び比較例１〜６において、微細藻類懸濁液を濾過した後、得られた微細藻類含有紙パルプシートを、ドライオーブンにて１１０℃で４時間乾燥させ、乾燥後の質量を測定した。また、微細藻類懸濁液を添加していない紙パルプ層を同様の操作で乾燥させ、乾燥後の質量を測定した。これらの値を用いて、次式により回収率を算出し、下記評価基準に基づき評価した。結果を表２に示す。なお、表１及び２において、「ＨＬ」は、ヘマトコッカス ラキュストリス、「ＮＯ」は、ナンノクロロプシス オキュラータを示す。
回収率（％）＝［（微細藻類含有紙パルプシート乾燥質量（ｇ））−（紙パルプシート乾燥質量（ｇ））］／［（微細藻類懸濁液添加量（Ｌ）×（微細藻類懸濁液中の細胞濃度（ｇ／Ｌ））］×１００
［評価基準］
◎ ：回収率が９５％以上
○ ：回収率が８０％超え９５％未満
△ ：回収率が６５％超え８０％以下
× ：回収率が６５％以下
【００９９】
（試験例１：ヘマトコッカス ラキュストリス産生アスタキサンチンの分析）
ヘマトコッカス ラキュストリスが細胞内に産生するアスタキサンチンは、従来、遠心分離後、フィルター濾過を行う２段階の分離工程を経た後、有機溶媒で抽出することにより得られていた（特開２００４−１２９５０４号公報参照）。
そこで、前記実施例１〜８及び比較例１〜４の方法で得られた細胞から抽出したアスタキサンチンの量と、前記従来の方法である遠心分離及び濾過後に抽出して得たアスタキサンチンの量とをそれぞれ測定して比較した。
【０１００】
＜遠心分離により回収した微細藻類からのアスタキサンチンの抽出（従来法）＞
実施例１〜８及び比較例１〜４と同様の方法で、ヘマトコッカス ラキュストリスを培養した。この培養液を１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を取除いて藻体を回収し、ヘマトコッカス ラキュストリス藻乾燥質量１０部当り、１００質量部のアセトンを使用して抽出することにより、アスタキサンチン含有脂質を回収した。
【０１０１】
＜実施例１〜８及び比較例１〜４の方法で回収した微細藻類からのアスタキサンチンの抽出＞
実施例１〜８及び比較例１〜４の、ヘマトコッカス ラキュストリス含有紙パルプシートは、そのまま１０ｍｍ角に裁断した後、ヘマトコッカス ラキュストリス藻乾燥質量１０部当り、１００質量部のアセトンを使用して抽出し、アスタキサンチン含有脂質を回収した。
【０１０２】
＜アスタキサンチン濃度の測定＞
回収したアスタキサンチン含有脂質を含むアセトン溶液上清の吸光度（波長４８０ｎｍ及び７５０ｎｍ）を測定してカロテノイド濃度を求めた（“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｅａ Ｗａｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ” ｐ．１８５−２０６， Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｃｎａｎａｄａ （１９６８））。ヘマトコッカス ラキュストリスのシスト細胞中に蓄積されるカロテノイドの殆どは、アスタキサンチンであることが知られていることから（Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７１（５）：３３５−３３９ （１９９１））、得られたカロテノイド濃度をアスタキサンチン濃度として表した。
実施例１〜８及び比較例１〜４の成分抽出率は、実施例１〜８及び比較例１〜４で得られたアスタキサンチン濃度値を、前記従来の方法（遠心分離）で得られた濃度値で除した百分率で示した。結果を表２に示す。
【０１０３】
（試験例２：ナンノクロロプシス オキュラータ産生エイコサペンタエン酸の分析）
ナンノクロロプシス オキュラータが細胞内に産生する脂肪酸は、従来、遠心分離後、フィルター濾過を行う２段階の分離工程を経た後、有機溶媒で抽出することにより得られていた。
そこで、前記実施例９〜１２及び比較例５〜６の方法で得られた細胞から抽出した脂肪酸から分離したエイコサペンタエン酸の量、及び前記従来の方法である遠心分離及び濾過後に抽出して得た脂肪酸から分離したエイコサペンタエン酸の量をそれぞれ測定して比較した。
【０１０４】
＜遠心分離により回収した微細藻類からの脂肪酸の抽出（従来法）＞
実施例９〜１２及び比較例５〜６と同様の方法で、ナンノクロロプシス オキュラータを培養した。この培養液を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を取除いて藻体を回収し、ナンノクロロプシス オキュラータ藻乾燥質量１部当たり、１０質量部の５質量％塩酸を含むメタノール溶媒を添加し、９５℃で３時間還流して、脂肪酸をエステル交換した後、ヘキサン溶媒で脂肪酸メチルエステルを抽出した。
【０１０５】
＜実施例９〜１２及び比較例５〜６の方法で回収した微細藻類からの脂肪酸の抽出＞
実施例９〜１２及び比較例５〜６の、ナンノクロロプシス オキュラータ含有紙パルプシートは、そのまま１０ｍｍ角に裁断した後、ナンノクロロプシス オキュラータ藻乾燥 １部当たり、１０質量部の５質量％塩酸を含むメタノール溶媒を添加し、９５℃で３時間還流して、脂肪酸をエステル交換した後、ヘキサン溶媒で脂肪酸メチルエステルを抽出した。
【０１０６】
＜エイコサペンタエン酸濃度の測定＞
抽出した脂肪酸メチルエステルに含まれるエイコサペンタエン酸の濃度は、下記ガスクロマトグラフィー分析条件により定量した。
［ガスクロマトグラフィー測定条件］
装置 ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１４Ａ（株式会社島津製作所製）
検出器 ：ＦＩＤ
カラム ：ＤＢ−ＷＡＸ（アジレント・テクノロジー社製）
キャリアーガス：ヘリウム
流速 ：１ｍＬ／分間
カラム温度 ：１７０℃〜２１０℃（１．５℃／分間）
内部標準物質 ：トリコサン酸メチルエステル（ＳＩＧＭＡ社製）
実施例９〜１２及び比較例５〜６の成分抽出率は、実施例９〜１２及び比較例５〜６で得られたエイコサペンタエン酸濃度値を、前記従来の方法（遠心分離）で得られた濃度値で除した百分率で示した。結果を表２に示す。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
表２より、前記実施例の方法で回収された微細藻類から従来法（遠心分離）と同等又はそれ以上の量のアスタキサンチン及びエイコサペンタエン酸を得ることができた。従来の遠心分離の方法では、操作の過程で微細藻類のロスが出ることがあったが、前記実施例の方法では、微細藻類含有紙パルプシートをそのまま抽出に用いるため、紙パルプ層に回収した微細藻類の全てから効率よく細胞内成分を抽出できることがわかった。更に、前記実施例の方法では、従来の方法より少ない工程で簡便であり、かつ省エネルギーで分離できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
前記微細藻類細胞内成分の抽出方法は、微細藻類が単細胞であっても、遠心分離などを行うことなく省エネルギーで、かつ簡便な操作により短時間で効率よく回収でき、更に前記微細藻類を回収した紙パルプシートをそのまま抽出に用いることで、効率よく簡便に前記微細藻類の細胞内に含まれる成分を抽出することができるため、石油資源の代替原料としてのバイオディーゼルの製造や、香粧品や医薬品、健康食品、魚類用飼料、家禽用飼料などに好適に利用可能である。
【符号の説明】
【０１１１】
１ フィルター
２ 紙パルプ層
３ 微細藻類懸濁液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルター上に紙パルプ層を形成する紙パルプ層形成工程と、
少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整するゼータ電位調整工程と、
前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を調整した微細藻類懸濁液を吐出して前記微細藻類を回収する回収工程と、
前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項２】
抽出工程が、微細藻類含有紙パルプシートと、抽出溶剤とを接触させて微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する工程である請求項１に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項３】
紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の絶乾質量が１０ｇ／ｍ２〜１５０ｇ／ｍ２の紙パルプ層を形成する工程である請求項１から２のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項４】
紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の含有量が０．５質量％〜２０質量％の紙パルプ層を形成する工程である請求項１から３のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項５】
ゼータ電位調整工程が、微細藻類懸濁液に多価カチオン及びアニオン性基を有する高分子化合物を添加することにより、前記微細藻類懸濁液のゼータ電位を調整する工程である請求項１から４のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項６】
フィルターが、抄紙ワイヤーである請求項１から５のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項１】
フィルター上に紙パルプ層を形成する紙パルプ層形成工程と、
少なくとも微細藻類を含む微細藻類懸濁液のゼータ電位を−１５ｍＶ〜＋１５ｍＶに調整するゼータ電位調整工程と、
前記紙パルプ層に前記ゼータ電位を調整した微細藻類懸濁液を吐出して前記微細藻類を回収する回収工程と、
前記回収工程により得られた微細藻類含有紙パルプシートから、前記微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項２】
抽出工程が、微細藻類含有紙パルプシートと、抽出溶剤とを接触させて微細藻類の細胞内に産生される成分を抽出する工程である請求項１に記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項３】
紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の絶乾質量が１０ｇ／ｍ２〜１５０ｇ／ｍ２の紙パルプ層を形成する工程である請求項１から２のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項４】
紙パルプ層形成工程が、紙パルプ層における固形パルプ分の含有量が０．５質量％〜２０質量％の紙パルプ層を形成する工程である請求項１から３のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項５】
ゼータ電位調整工程が、微細藻類懸濁液に多価カチオン及びアニオン性基を有する高分子化合物を添加することにより、前記微細藻類懸濁液のゼータ電位を調整する工程である請求項１から４のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【請求項６】
フィルターが、抄紙ワイヤーである請求項１から５のいずれかに記載の微細藻類細胞内成分の抽出方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２０６０１６（Ｐ２０１１−２０６０１６Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７９４２０（Ｐ２０１０−７９４２０）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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