心不全治療薬
【課題】遺伝子操作や遺伝子発現を伴わない心不全治療薬を提供するため、ホスホランバンに結合する物質、および当該物質を含有する心筋細胞内Ｃａ２＋動態の異常を是正する心不全治療薬を提供すること。
【解決手段】ホスホランバンの細胞質ドメインを含む融合蛋白質をターゲットとして、ＳＥＬＥＸ法により取得した特定な配列からなる塩基配列、または特定な配列からなる塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列、あるいは特定な配列からなる塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列、のいずれかであるホスホランバン・アプタマーを含有する心不全治療薬。
【解決手段】ホスホランバンの細胞質ドメインを含む融合蛋白質をターゲットとして、ＳＥＬＥＸ法により取得した特定な配列からなる塩基配列、または特定な配列からなる塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列、あるいは特定な配列からなる塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列、のいずれかであるホスホランバン・アプタマーを含有する心不全治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホランバンに特異的に結合してホスホランバン機能を阻害するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、および該アプタマーを含有する心不全治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓の収縮力制御には、心筋細胞内のＣａ２＋が中心的役割を果たすことが明らかになっている。心筋細胞内Ｃａ２＋は、主として細胞内Ｃａ２＋貯蔵部位である心筋小胞体へのＣａ２＋輸送と、Ｃａ２＋遊離によって制御されている。心筋小胞体へのＣａ２＋輸送により細胞質Ｃａ２＋濃度が低下すると心筋弛緩が起こり、心筋小胞体からのＣａ２＋遊離によって細胞質Ｃａ２＋濃度が上昇すると収縮が起こる。従来、強心薬を主とした心不全治療薬は、動物への投与や取り出した拍動心臓への投与実験による心筋収縮力増強を指標にしたスクリーニング方法が用いられてきた。この方法で得られた強心薬は、交感神経系やレニン・アンギオテンシン系に関係するものであり、細胞外から細胞内へのＣａ２＋流入を増加させる作用を有し、心筋細胞内Ｃａ２＋動態を制御するものではない。このため弛緩時の細胞質Ｃａ２＋濃度が充分に低下せず、充分な弛緩が得られないために、重症心不全をむしろ悪化させる方向に働く。
【０００３】
心筋細胞内Ｃａ２＋動態では、細胞内のＣａ２＋を制御している心筋小胞体のＣａ２＋ポンプＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）蛋白質と、その調節蛋白質のホスホランバンが重要である。ホスホランバンは、心筋小胞体のＣａ２＋輸送を司るＳＥＲＣＡの抑制因子として働き（非特許文献１）、ホスホランバンがＳＥＲＣＡから解離するとＣａ２＋輸送が促進されることが明らかにされ（非特許文献２）、両蛋白質の結合部位も特定された（非特許文献３）。心筋小胞体のＣａ２＋輸送が促進されると、最終的に心筋収縮力が増強される。
【０００４】
このような機序に基づいた心不全治療の安全性と有効性は、遺伝子操作によりホスホランバンを欠損させたマウスの実験（非特許文献４）や、ウイルスを用いて不活性なホスホランバンを大量に発現させたラットの実験（非特許文献５）で示されている。これらの心臓では心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性が著明に促進され、Ｃａ２＋動態の異常が是正されている。しかしながら、これらの遺伝子操作やウイルスによる遺伝子発現を治療方策として臨床で使うには、安全性や技術的な観点から現時点では極めて困難である。
【０００５】
特許文献１では、心筋細胞内でのホスホランバンと筋小胞体ＳＥＲＣＡの相互作用を阻害することにより、不全心臓における収縮能を高める心不全治療薬として、２つのペプチド複合体と、ホスホランバンの変異蛋白質を明らかにしている。また、心不全治療薬のスクリーニング方法として、ホスホランバンとの結合部位を含むＣａ２＋ポンプ遺伝子組み換え蛋白質と、Ｃａ２＋ポンプとの結合部位を含むホスホランバン遺伝子組み換え蛋白質とを用いて、有用物質を選択する方法（特許文献２）が提示されているが、膨大な数の化合物ライブラリーをスクリーニングする必要があり、そのような薬物は未だ見出されていない。
【０００６】
酵素や受容体に結合する短い１本鎖のＤＮＡやＲＮＡであるアプタマーは、医薬品としての可能性のため種々の分野で注目されている。特定の蛋白質に結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いることにより比較的容易に見出すことができる。ＳＥＬＥＸ法により取得したアプタマーの報告として、プリオン蛋白質と特異的に結合するＲＮＡアプタマー（特許文献３）の他、ビトロネクチンアプタマー（特許文献４）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）に特異的に結合するアプタマー（特許文献５）があり、それぞれ、プリオン病の診断薬、抗癌剤、癌転移抑制剤としての用途が明らかにされている。しかしながら、心臓でホスホランバンに作用し心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性を促進するようなアプタマーは知られていない。
【非特許文献１】Ｉｎｕｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１７９４−１８００，１９８６
【非特許文献２】Ｊａｍｅｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９０−９２，１９８９
【非特許文献３】Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６７：１６７４−１６７９，１９９２
【非特許文献４】Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９９：３１２−３２２，１９９９Ｌｕｏ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：４０１−４０９，１９９４
【非特許文献５】Ｉｗａｎａｇａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：７２７−７３６，２００４
【特許文献１】特表２００２−５２８５１２公報
【特許文献２】特開２００２−６２２９６公報
【特許文献３】特開２００６−０４２６４５公報
【特許文献４】特開２００２−５８４９１公報
【特許文献５】特開２００６−１４９３０２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、遺伝子操作や遺伝子発現を伴わない心不全治療薬を提供するため、ホスホランバンに結合する物質、および当該物質を含有する心筋細胞内Ｃａ２＋動態の異常を是正する心不全治療薬を提供することをその主課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、心筋小胞体のＣａ２＋輸送を司るＳＥＲＣＡの抑制因子として働くホスホランバンに結合する物質が、ホスホランバンの作用を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）を提供する。
【００１０】
（１）ホスホランバンの細胞質ドメインを含む融合蛋白質をターゲットとして、ＳＥＬＥＸ法により選択することを特徴とするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【００１１】
（２）融合蛋白質が、ホスホランバンの１番目から２６番目のアミノ酸部分に、標識蛋白質が結合したものである上記（１）に記載のするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【００１２】
（３）上記（１）または（２）に記載のホスホランバン・アプタマーが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する1本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであって、ホスホランバンに特異的な結合性を有するアプタマー。
（ａ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列。
（ｂ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列。
（ｃ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列。
【００１３】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のホスホランバン・アプタマーを含有する心不全治療薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のホスホランバンに特異的な結合性を有する核酸アプタマーは、心不全時の心筋細胞内Ｃａ２＋動態を改善し、心臓の収縮機能を改善するため、重症心不全患者に対し有効な治療剤となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のアプタマーは、心筋小胞体のＳＥＲＣＡに作用するホスホランバンに特異的な結合性を有するものである。ホスホランバンは、心臓の遅筋および平滑筋に存在する低分子蛋白質で、配列番号１に示すように５２個のアミノ酸からなり、細胞質ドメインは、ホスホランバンとＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅとの機能的な結合にとって必須な領域であるとされている。心筋小胞体のＳＥＲＣＡの阻害因子であるホスホランバンは、ＳＥＲＣＡと結合することによりＳＥＲＣＡ活性を抑制し、必要に応じてＳＥＲＣＡから解離することによりＳＥＲＣＡを活性化する。心筋小胞体のＳＥＲＣＡが活性化されると、心筋小胞体へのＣａ２＋輸送が増加し心筋弛緩が促進され、それに引き続く心筋収縮力が増強される。
【００１６】
本発明のアプタマーは、ホスホランバンに特異的な結合性を有し、ＳＥＲＣＡからホスホランバンを解離させ、ＳＥＲＣＡ活性を促進することが出来る物質であり、ＳＥＬＥＸ法により得ることができる。
【００１７】
ＳＥＬＥＸ法とは、蛋白質などのターゲットに特異的に結合する物質を得るための操作法である。本発明で行うＳＥＬＥＸ法は、ランダム配列をもつＤＮＡまたはＲＮＡのプールの中からターゲットに結合する配列をもつものを選択し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法またはＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法での増幅を行い、それをもとにした１本鎖ＤＮＡまたは転写したＲＮＡの中から再び結合する配列を選択する。このサイクルを繰り返すことによって結合する配列を収束させる。それぞれのサイクルにおいて、選択の際に蛋白質とＤＮＡまたはＲＮＡプールの濃度比、競合剤などの結合条件を厳しくすることにより、結合特異性の高い配列を得ることができる。
【００１８】
本発明のＳＥＬＥＸ法で使用するターゲット物質として、ホスホランバンの細胞質ドメインの選択された部分を使用できるが、ＳＥＬＥＸ法での精度を高めるために、該ドメイン選択部分のアミノ酸配列を有する物質に適切な蛋白を結合させた融合蛋白質を用いることが望ましい。ホスホランバンの細胞質ドメインの選択された部分のアミノ酸配列は、配列番号１に示すホスホランバン蛋白質の第1番目のＭ（メチオニン）から第２６番目のＱ（グルタミン）までのアミノ酸からなる配列である。リンカーを介して、該配列へ結合する適切な蛋白は、ＳＥＬＥＸ時に、容易に選別できる標識機能を有するものであればいかなるものでも良く、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ６、ＨＡ、ＧＳＴ、ＦＬＡＧなどの蛋白質をあげることができる。これらの蛋白質は、ホスホランバンの細胞質外部位に結合する適切なリンカーに結合させて、融合蛋白を形成させ、ＳＥＬＥＸ法で使用するターゲット物質として用いることができる。適切なリンカーとは、ホスホランバンの細胞質ドメイン選択部分にも、標識蛋白質にも容易に結合するものであり、融合蛋白質としてＳＤＳ電気泳動で確認ができる程度の分子量を付加することができればいかなるものでも良く、例えば、ＰＤＺドメインを使用することができる。
【００１９】
本発明のＳＥＬＥＸ法で取得するホスホランバン・アプタマーは、例えば、２０塩基〜８０塩基、好ましくは、２０塩基〜６０塩基のＤＮＡまたはＲＮＡのランダム・ライブラリーから選択することができる。該ランダム・ライブラリーは、それぞれ４種類のオリゴヌクレオチドから、ランダムに連続した２０〜８０塩基、好ましくは、２０塩基〜６０塩基を、化学的に合成して得られる。この場合、ＤＮＡ合成用機器を用いることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡの両端にはＰＣＲで増幅するための配列を付加する。ＲＮＡの場合には、さらに、５’端にＲＮＡ合成のための配列を付加する。ＤＮＡアプタマーの場合は１本鎖のＤＮＡライブラーを、ＲＮＡアプタマーの場合はＤＮＡライブラリーから合成したＲＮＡを、ビーズに固相化したホスホランバンの細胞質ドメインを含まない組み換え融合蛋白質（コントロール融合蛋白質）と混合し、非特異的に結合するＤＮＡまたはＲＮＡを除く。コントロール融合蛋白質に結合しなかったＤＮＡまたはＲＮＡをホスホランバンの細胞質ドメインを含む組み換え融合蛋白質を固相化したビーズと混合する。洗浄後、結合したＤＮＡまたはＲＮＡを溶出、回収する。ＤＮＡアプタマーの場合は、回収されたＤＮＡから２本鎖ＤＮＡをＰＣＲで増幅し、さらに１本鎖ＤＮＡにする。ＲＮＡアプタマーの場合は、ＲＴ−ＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡを増幅し、これを鋳型にＲＮＡを合成する。これらの１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡをもとに、前述のコントロール融合蛋白質による非特異的結合の除去、融合蛋白質への結合、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによる増幅のサイクルを繰り返す。増幅サイクルは７〜２０サイクル行うが、好ましくは９〜１５サイクル行う。
【００２０】
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲで増幅した２本鎖ＤＮＡは、クローニング・ベクターに挿入し、アプタマーの配列を決定する。得られた配列から１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを合成しアプタマーを得ることができる。ホスホランバンの細胞質ドメインを含む組み換え融合蛋白質へのアプタマーの結合能は、アプタマーの５’または３’端にビオチンを付加し、酵素標識したアビジンを用いて、結合したビオチン標識アプタマーを定量することにより求めることができる。
【００２１】
さらに、これらのアプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果は、イヌ心臓から調製した心筋小胞体濾胞を用いて測定し、ホスホランバンが存在しないウサギ骨格筋の筋小胞体濾胞へのアプタマーの効果と比較することによって求めることができる。アプタマーは、心筋小胞体濾胞のホスホランバンに結合することにより、ＳＥＲＣＡからホスホランバンを解離させ、ＳＥＲＣＡ活性を促進する。骨格筋の筋小胞体濾胞においては、ＳＥＲＣＡ活性が変化しないことから、両ＳＥＲＣＡ活性の比を求めることにより、アプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果の程度を知ることができる。
【００２２】
ＳＥＬＥＸ法により選抜されたホスホランバンに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの例として、配列番号２〜１２の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。本発明は、これらのＤＮＡに限定されるものではなく、ホスホランバンに特異的に結合するＲＮＡの他、配列番号２〜１２で表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列、または配列番号２〜１２で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列も含まれる。
【００２３】
本発明のアプタマーは、経口投与、非経口投与または局所投与に適した種々の形態に製剤することができる。この場合、製剤化のために通常使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を使用することができる。
【００２４】
本発明の心不全治療薬は、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ錠などの固体形態、あるいは、坐剤、軟膏などの半固体形態、注射剤、乳剤、懸濁液、ローション、スプレーなどの液体形態などの製剤形態として製剤化することができる。これらの製剤形態では、剤形に好ましい、製剤上許容される添加物を用いるが、例えば、乳糖、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル、シロップ、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ワセリン、または硬質油のような脂質成分、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。
【００２５】
本発明の心不全治療薬において、アプタマーの含有量はその剤形に応じて異なるが、一般に固体及び半固体形態の場合には０．０１〜１０重量％の濃度で、液体形態の場合には０．００１〜１重量％の濃度で含有していることが望ましい。投与量は、投与方法、患者の年齢及び体重、患者の容態等に応じて異なるが、経口投与する場合は１日当たり、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重とし、非経口投与する場合の１日当たりの用量は０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。また、投与量は１日１回または数回に分けて投与することができる。
【００２６】
以下、本発明をさらに詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００２７】
＜ＳＥＬＥＸ法によるホスホランバン・アプタマーの選択＞
【００２８】
ホスホランバン・アプタマーの選択は、以下の方法で行った。ＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６または、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６融合蛋白質の調製は、Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１：６６７−６７３，２００２）で行った。ＰＬＮ１−２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６または、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６を結合したＮｉ−ＮＴＡビーズの調製は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸ブッファー溶液）で平衡化した後に、５μｌのビーズにＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６または、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６ １０μｇを含むＰＢＳ−Ｔ ２００μｌを加え、４℃で３０分間振とうした。反応させたビーズは、ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した。１本鎖ＤＮＡライブラリーとしては、４０塩基の混合配列の５’端と３’にそれぞれＰＣＲ用増幅用の配列Ｐ１（配列番号１３）とＰ２（配列番号１４）を付加した８０塩基の１本鎖ＤＮＡを合成した。１ｎｍｏｌの１本鎖ＤＮＡライブラリーをＰＢＳ−Ｔ １００μｌ中９８℃で３分間変性させ、直ちに４℃で冷却した。第１回目の選択では、１本鎖ＤＮＡライブラリーをＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズ ５μｌとＢＳＡ １μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ−Ｔ １０ｍｌへ添加した。室温で３０分間振とうした後、混合物を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清をＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６ 結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズ ５μｌと、室温で３０分間混合した。ビーズは、ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した。蛋白に結合したアプタマーは、０．５ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）５０μｌに溶出した。溶出液は、フェノール−クロロホルム混合液で抽出し、１本鎖ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。７０％のエタノールで洗浄した後、１本鎖ＤＮＡは、１０Ｘ ＰＣＲバッファー １０μｌ、４ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍＭ）８μｌ、１００ｐｍｏｌのＰ１プライマー（配列番号１３）と５’端をビオチン化したＰ２プライマー（配列番号１４）、５％ ＤＭＳＯ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ・バイオ）２．５Ｕを含むＰＣＲ混合液１００μｌに溶解した。ＰＣＲ反応では、９５℃で２分間変性させた。９５℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１５秒間の伸長反応を２０サイクル行い、最終的な伸長反応を７２℃で２分間行った。
【００２９】
ＰＣＲ産物の一部を４％アガロースゲルで電気泳動し、正しい長さの２本鎖ＤＮＡが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ産物 ９０μｌと５Ｍ ＮａＣｌ ２３μｌを、Ｎｅｕｒｏａｖｉｄｉｎ ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）５μｌと室温で１０分間混合した。ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した後、ビオチン化されていない１本鎖ＤＮＡは、０．１Ｎ ＮａＯＨ ５０μｌ中で５分間振とうした後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＮｅｕｒｏａｖｉｄｉｎ ビーズから上清へと回収した。得られた上清のｐＨを調整するために、１Ｍ ＨＣｌ ５μｌを上清に加えた。１本鎖ＤＮＡは、エタノールで沈殿させ、７０％のエタノールで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ １００μｌに溶解した。この１本鎖ＤＮＡを用いて２回目以降のホスホランバン・アプタマーの選択も１回目の選択と同様に行ったが、２回目以降の選択ではＮｉ−ＮＴＡビーズに結合したＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６の量をビーズ５μｌ当たり５μｇとした。
【００３０】
９回目の選択を行った後、得られた１本鎖ＤＮＡは、Ｐ１プライマー（配列番号１３）とビオチン化していないＰ２プライマー（配列番号１４）を使ってＰＣＲで増幅した。ＰＣＲで得られた２本鎖ＤＮＡは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へ挿入、大腸菌（ＴＯＰ １０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ導入して形質転換した。生育した大腸菌のコロニーから任意に４５個のコロニーを選び、大腸菌からプラスミドを精製した。精製したプラスミドからＴ７プロモーターとＭ１３逆転写プライマーを使用して、挿入したＤＮＡ配列を決定し、アプタマーのＤＮＡ配列を決定した。その結果、１１種類のＤＮＡアプタマーが得られた。１１種類の配列は、表１の通りであった。
【００３１】
【表１】
【実施例２】
【００３２】
＜ホスホランバン・アプタマーの心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性への効果＞
【００３３】
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）またはウサギ骨格筋より調製した筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＮ３、０．１ｍＭのＡＴＰ、０．３５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ−ＥＧＴＡ ｂｕｆｆｅｒ：０．５ｍＭのＣａＣｌ２と１．３ｍＭのＥＧＴＡ）を含む反応液５０μｌに懸濁し、合成した１１種類それぞれのホスホランバン・アプタマー（１０μＭ）存在下および非存在下で、３７℃で４分間のＡＴＰａｓｅ活性を測定した。活性測定は、佐々木ら方法（Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６７：１６７４−１６７９，１９９２）を用いた。０．３５μＭ Ｃａ２＋の代わりに２ｍＭのＥＧＴＡを加えたＣａ２＋非存在下でも同様にＡＴＰａｓｅ活性を測定し、両者の差からＣａ２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性（ＳＥＲＣＡ活性）を求めた。アプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果を見るために、アプタマー存在下と非存在下でのＳＥＲＣＡ活性の比を求めた。
【００３４】
心筋小胞体と骨格筋小胞体で、１１種類のホスホランバン・アプタマーの存在下と非存在下でのＳＥＲＣＡ活性の比を求めた結果を図１に示す。縦軸は、アプタマーによるＳＥＲＣＡ活性の促進の程度をあらわす。ホスホランバンの存在しない骨格筋小胞体（黒）では、アプタマーはＳＥＲＣＡ活性にはほとんど影響を与えなかった。これに対し、心筋小胞体（白）ではアプタマーによるＳＥＲＣＡ活性の促進が認められた。１０μＭのアプタマー存在下での骨格筋小胞体と心筋小胞体の比較では、アプタマーＮｏ．５を除く１０種類のアプタマーで心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性が有意に促進されていた。これらの結果は、アプタマーがホスホランバンに作用してＳＥＲＣＡに対する抑制を解除しＳＥＲＣＡ活性を促進していることを示す。データは、３−５回の測定の平均値と標準偏差を示す。骨格筋小胞体と心筋小胞体の比較の統計学的有意差は、Ｔ検定で行った。＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１を示す。
【実施例３】
【００３５】
＜ホスホランバン・アプタマーによる心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性への効果の濃度依存性＞
【００３６】
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に、種々の濃度の合成したアプタマーＮｏ．９（０−４０μＭ）を加え、実施例２と同様の方法でＳＥＲＣＡ活性を測定し、アプタマー非存在下に対する比を求めた。
【００３７】
図２に実験結果の１例を示す。ホスホランバン・アプタマー（アプタマーＮｏ．９）は、心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性を濃度依存的に促進した。この促進効果のＥＤ５０は、１５μＭであった。この結果は、アプタマーが濃度依存性にホスホランバンに作用してＳＥＲＣＡ活性を促進していることを示す。
【実施例４】
【００３８】
＜心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性へのホスホランバン・アプタマーの効果＞
【００３９】
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に、合成したアプタマーＮｏ．９（３０μＭ）を加え、種々のＣａ２＋存在下で（ｆｒｅｅ Ｃａ２＋として０．１１〜１６．３μＭ）、実施例２と同様の方法でＳＥＲＣＡ活性を測定した。ＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性は、最大のＳＥＲＣＡ活性を１００％としたパーセント表示で示した。
【００４０】
図３にホスホランバン・アプタマーＮｏ．９の非存在下（黒丸）、存在下（白丸）でのＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性を示した。アプタマーＮｏ．９は、特に０．１１〜２μＭ／ｍｌのＣａ２＋濃度で心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性を促進し、濃度依存性曲線を左方にシフトさせた。この効果は、ＳＥＲＣＡへのホスホランバンの抑制効果が解除されたことを意味する。各データ点は、３回行った実験の平均値と標準偏差を示す。アプタマーの存在下と非存在下の比較の統計学的有意差は、Ｔ検定で行った。＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１を示す。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のホスホランバン・アプタマーは、治療困難な重症の心不全患者に新たな治療手段を提供するものであり、その産業上の利用価値は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】心筋小胞体と骨格筋小胞体で、１１種類のホスホランバン・アプタマーのＣａ２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性（ＳＥＲＣＡ活性）を比較した結果を示した図である。
【図２】ホスホランバン・アプタマー（アプタマーＮｏ．９）が、心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性を濃度依存的に促進した結果を示した図である。
【図３】ホスホランバン・アプタマー（アプタマーＮｏ．９）が、心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性に及ぼす効果を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホランバンに特異的に結合してホスホランバン機能を阻害するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、および該アプタマーを含有する心不全治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓の収縮力制御には、心筋細胞内のＣａ２＋が中心的役割を果たすことが明らかになっている。心筋細胞内Ｃａ２＋は、主として細胞内Ｃａ２＋貯蔵部位である心筋小胞体へのＣａ２＋輸送と、Ｃａ２＋遊離によって制御されている。心筋小胞体へのＣａ２＋輸送により細胞質Ｃａ２＋濃度が低下すると心筋弛緩が起こり、心筋小胞体からのＣａ２＋遊離によって細胞質Ｃａ２＋濃度が上昇すると収縮が起こる。従来、強心薬を主とした心不全治療薬は、動物への投与や取り出した拍動心臓への投与実験による心筋収縮力増強を指標にしたスクリーニング方法が用いられてきた。この方法で得られた強心薬は、交感神経系やレニン・アンギオテンシン系に関係するものであり、細胞外から細胞内へのＣａ２＋流入を増加させる作用を有し、心筋細胞内Ｃａ２＋動態を制御するものではない。このため弛緩時の細胞質Ｃａ２＋濃度が充分に低下せず、充分な弛緩が得られないために、重症心不全をむしろ悪化させる方向に働く。
【０００３】
心筋細胞内Ｃａ２＋動態では、細胞内のＣａ２＋を制御している心筋小胞体のＣａ２＋ポンプＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）蛋白質と、その調節蛋白質のホスホランバンが重要である。ホスホランバンは、心筋小胞体のＣａ２＋輸送を司るＳＥＲＣＡの抑制因子として働き（非特許文献１）、ホスホランバンがＳＥＲＣＡから解離するとＣａ２＋輸送が促進されることが明らかにされ（非特許文献２）、両蛋白質の結合部位も特定された（非特許文献３）。心筋小胞体のＣａ２＋輸送が促進されると、最終的に心筋収縮力が増強される。
【０００４】
このような機序に基づいた心不全治療の安全性と有効性は、遺伝子操作によりホスホランバンを欠損させたマウスの実験（非特許文献４）や、ウイルスを用いて不活性なホスホランバンを大量に発現させたラットの実験（非特許文献５）で示されている。これらの心臓では心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性が著明に促進され、Ｃａ２＋動態の異常が是正されている。しかしながら、これらの遺伝子操作やウイルスによる遺伝子発現を治療方策として臨床で使うには、安全性や技術的な観点から現時点では極めて困難である。
【０００５】
特許文献１では、心筋細胞内でのホスホランバンと筋小胞体ＳＥＲＣＡの相互作用を阻害することにより、不全心臓における収縮能を高める心不全治療薬として、２つのペプチド複合体と、ホスホランバンの変異蛋白質を明らかにしている。また、心不全治療薬のスクリーニング方法として、ホスホランバンとの結合部位を含むＣａ２＋ポンプ遺伝子組み換え蛋白質と、Ｃａ２＋ポンプとの結合部位を含むホスホランバン遺伝子組み換え蛋白質とを用いて、有用物質を選択する方法（特許文献２）が提示されているが、膨大な数の化合物ライブラリーをスクリーニングする必要があり、そのような薬物は未だ見出されていない。
【０００６】
酵素や受容体に結合する短い１本鎖のＤＮＡやＲＮＡであるアプタマーは、医薬品としての可能性のため種々の分野で注目されている。特定の蛋白質に結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いることにより比較的容易に見出すことができる。ＳＥＬＥＸ法により取得したアプタマーの報告として、プリオン蛋白質と特異的に結合するＲＮＡアプタマー（特許文献３）の他、ビトロネクチンアプタマー（特許文献４）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）に特異的に結合するアプタマー（特許文献５）があり、それぞれ、プリオン病の診断薬、抗癌剤、癌転移抑制剤としての用途が明らかにされている。しかしながら、心臓でホスホランバンに作用し心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性を促進するようなアプタマーは知られていない。
【非特許文献１】Ｉｎｕｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１７９４−１８００，１９８６
【非特許文献２】Ｊａｍｅｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９０−９２，１９８９
【非特許文献３】Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６７：１６７４−１６７９，１９９２
【非特許文献４】Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９９：３１２−３２２，１９９９Ｌｕｏ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：４０１−４０９，１９９４
【非特許文献５】Ｉｗａｎａｇａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：７２７−７３６，２００４
【特許文献１】特表２００２−５２８５１２公報
【特許文献２】特開２００２−６２２９６公報
【特許文献３】特開２００６−０４２６４５公報
【特許文献４】特開２００２−５８４９１公報
【特許文献５】特開２００６−１４９３０２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、遺伝子操作や遺伝子発現を伴わない心不全治療薬を提供するため、ホスホランバンに結合する物質、および当該物質を含有する心筋細胞内Ｃａ２＋動態の異常を是正する心不全治療薬を提供することをその主課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、心筋小胞体のＣａ２＋輸送を司るＳＥＲＣＡの抑制因子として働くホスホランバンに結合する物質が、ホスホランバンの作用を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）を提供する。
【００１０】
（１）ホスホランバンの細胞質ドメインを含む融合蛋白質をターゲットとして、ＳＥＬＥＸ法により選択することを特徴とするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【００１１】
（２）融合蛋白質が、ホスホランバンの１番目から２６番目のアミノ酸部分に、標識蛋白質が結合したものである上記（１）に記載のするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【００１２】
（３）上記（１）または（２）に記載のホスホランバン・アプタマーが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する1本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであって、ホスホランバンに特異的な結合性を有するアプタマー。
（ａ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列。
（ｂ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列。
（ｃ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列。
【００１３】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のホスホランバン・アプタマーを含有する心不全治療薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のホスホランバンに特異的な結合性を有する核酸アプタマーは、心不全時の心筋細胞内Ｃａ２＋動態を改善し、心臓の収縮機能を改善するため、重症心不全患者に対し有効な治療剤となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のアプタマーは、心筋小胞体のＳＥＲＣＡに作用するホスホランバンに特異的な結合性を有するものである。ホスホランバンは、心臓の遅筋および平滑筋に存在する低分子蛋白質で、配列番号１に示すように５２個のアミノ酸からなり、細胞質ドメインは、ホスホランバンとＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅとの機能的な結合にとって必須な領域であるとされている。心筋小胞体のＳＥＲＣＡの阻害因子であるホスホランバンは、ＳＥＲＣＡと結合することによりＳＥＲＣＡ活性を抑制し、必要に応じてＳＥＲＣＡから解離することによりＳＥＲＣＡを活性化する。心筋小胞体のＳＥＲＣＡが活性化されると、心筋小胞体へのＣａ２＋輸送が増加し心筋弛緩が促進され、それに引き続く心筋収縮力が増強される。
【００１６】
本発明のアプタマーは、ホスホランバンに特異的な結合性を有し、ＳＥＲＣＡからホスホランバンを解離させ、ＳＥＲＣＡ活性を促進することが出来る物質であり、ＳＥＬＥＸ法により得ることができる。
【００１７】
ＳＥＬＥＸ法とは、蛋白質などのターゲットに特異的に結合する物質を得るための操作法である。本発明で行うＳＥＬＥＸ法は、ランダム配列をもつＤＮＡまたはＲＮＡのプールの中からターゲットに結合する配列をもつものを選択し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法またはＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法での増幅を行い、それをもとにした１本鎖ＤＮＡまたは転写したＲＮＡの中から再び結合する配列を選択する。このサイクルを繰り返すことによって結合する配列を収束させる。それぞれのサイクルにおいて、選択の際に蛋白質とＤＮＡまたはＲＮＡプールの濃度比、競合剤などの結合条件を厳しくすることにより、結合特異性の高い配列を得ることができる。
【００１８】
本発明のＳＥＬＥＸ法で使用するターゲット物質として、ホスホランバンの細胞質ドメインの選択された部分を使用できるが、ＳＥＬＥＸ法での精度を高めるために、該ドメイン選択部分のアミノ酸配列を有する物質に適切な蛋白を結合させた融合蛋白質を用いることが望ましい。ホスホランバンの細胞質ドメインの選択された部分のアミノ酸配列は、配列番号１に示すホスホランバン蛋白質の第1番目のＭ（メチオニン）から第２６番目のＱ（グルタミン）までのアミノ酸からなる配列である。リンカーを介して、該配列へ結合する適切な蛋白は、ＳＥＬＥＸ時に、容易に選別できる標識機能を有するものであればいかなるものでも良く、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ６、ＨＡ、ＧＳＴ、ＦＬＡＧなどの蛋白質をあげることができる。これらの蛋白質は、ホスホランバンの細胞質外部位に結合する適切なリンカーに結合させて、融合蛋白を形成させ、ＳＥＬＥＸ法で使用するターゲット物質として用いることができる。適切なリンカーとは、ホスホランバンの細胞質ドメイン選択部分にも、標識蛋白質にも容易に結合するものであり、融合蛋白質としてＳＤＳ電気泳動で確認ができる程度の分子量を付加することができればいかなるものでも良く、例えば、ＰＤＺドメインを使用することができる。
【００１９】
本発明のＳＥＬＥＸ法で取得するホスホランバン・アプタマーは、例えば、２０塩基〜８０塩基、好ましくは、２０塩基〜６０塩基のＤＮＡまたはＲＮＡのランダム・ライブラリーから選択することができる。該ランダム・ライブラリーは、それぞれ４種類のオリゴヌクレオチドから、ランダムに連続した２０〜８０塩基、好ましくは、２０塩基〜６０塩基を、化学的に合成して得られる。この場合、ＤＮＡ合成用機器を用いることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡの両端にはＰＣＲで増幅するための配列を付加する。ＲＮＡの場合には、さらに、５’端にＲＮＡ合成のための配列を付加する。ＤＮＡアプタマーの場合は１本鎖のＤＮＡライブラーを、ＲＮＡアプタマーの場合はＤＮＡライブラリーから合成したＲＮＡを、ビーズに固相化したホスホランバンの細胞質ドメインを含まない組み換え融合蛋白質（コントロール融合蛋白質）と混合し、非特異的に結合するＤＮＡまたはＲＮＡを除く。コントロール融合蛋白質に結合しなかったＤＮＡまたはＲＮＡをホスホランバンの細胞質ドメインを含む組み換え融合蛋白質を固相化したビーズと混合する。洗浄後、結合したＤＮＡまたはＲＮＡを溶出、回収する。ＤＮＡアプタマーの場合は、回収されたＤＮＡから２本鎖ＤＮＡをＰＣＲで増幅し、さらに１本鎖ＤＮＡにする。ＲＮＡアプタマーの場合は、ＲＴ−ＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡを増幅し、これを鋳型にＲＮＡを合成する。これらの１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡをもとに、前述のコントロール融合蛋白質による非特異的結合の除去、融合蛋白質への結合、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによる増幅のサイクルを繰り返す。増幅サイクルは７〜２０サイクル行うが、好ましくは９〜１５サイクル行う。
【００２０】
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲで増幅した２本鎖ＤＮＡは、クローニング・ベクターに挿入し、アプタマーの配列を決定する。得られた配列から１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを合成しアプタマーを得ることができる。ホスホランバンの細胞質ドメインを含む組み換え融合蛋白質へのアプタマーの結合能は、アプタマーの５’または３’端にビオチンを付加し、酵素標識したアビジンを用いて、結合したビオチン標識アプタマーを定量することにより求めることができる。
【００２１】
さらに、これらのアプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果は、イヌ心臓から調製した心筋小胞体濾胞を用いて測定し、ホスホランバンが存在しないウサギ骨格筋の筋小胞体濾胞へのアプタマーの効果と比較することによって求めることができる。アプタマーは、心筋小胞体濾胞のホスホランバンに結合することにより、ＳＥＲＣＡからホスホランバンを解離させ、ＳＥＲＣＡ活性を促進する。骨格筋の筋小胞体濾胞においては、ＳＥＲＣＡ活性が変化しないことから、両ＳＥＲＣＡ活性の比を求めることにより、アプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果の程度を知ることができる。
【００２２】
ＳＥＬＥＸ法により選抜されたホスホランバンに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの例として、配列番号２〜１２の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。本発明は、これらのＤＮＡに限定されるものではなく、ホスホランバンに特異的に結合するＲＮＡの他、配列番号２〜１２で表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列、または配列番号２〜１２で表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列も含まれる。
【００２３】
本発明のアプタマーは、経口投与、非経口投与または局所投与に適した種々の形態に製剤することができる。この場合、製剤化のために通常使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を使用することができる。
【００２４】
本発明の心不全治療薬は、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ錠などの固体形態、あるいは、坐剤、軟膏などの半固体形態、注射剤、乳剤、懸濁液、ローション、スプレーなどの液体形態などの製剤形態として製剤化することができる。これらの製剤形態では、剤形に好ましい、製剤上許容される添加物を用いるが、例えば、乳糖、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル、シロップ、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ワセリン、または硬質油のような脂質成分、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。
【００２５】
本発明の心不全治療薬において、アプタマーの含有量はその剤形に応じて異なるが、一般に固体及び半固体形態の場合には０．０１〜１０重量％の濃度で、液体形態の場合には０．００１〜１重量％の濃度で含有していることが望ましい。投与量は、投与方法、患者の年齢及び体重、患者の容態等に応じて異なるが、経口投与する場合は１日当たり、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重とし、非経口投与する場合の１日当たりの用量は０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。また、投与量は１日１回または数回に分けて投与することができる。
【００２６】
以下、本発明をさらに詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００２７】
＜ＳＥＬＥＸ法によるホスホランバン・アプタマーの選択＞
【００２８】
ホスホランバン・アプタマーの選択は、以下の方法で行った。ＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６または、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６融合蛋白質の調製は、Ｋｉｍｕｒａらの方法（Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１：６６７−６７３，２００２）で行った。ＰＬＮ１−２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６または、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６を結合したＮｉ−ＮＴＡビーズの調製は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸ブッファー溶液）で平衡化した後に、５μｌのビーズにＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６または、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６ １０μｇを含むＰＢＳ−Ｔ ２００μｌを加え、４℃で３０分間振とうした。反応させたビーズは、ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した。１本鎖ＤＮＡライブラリーとしては、４０塩基の混合配列の５’端と３’にそれぞれＰＣＲ用増幅用の配列Ｐ１（配列番号１３）とＰ２（配列番号１４）を付加した８０塩基の１本鎖ＤＮＡを合成した。１ｎｍｏｌの１本鎖ＤＮＡライブラリーをＰＢＳ−Ｔ １００μｌ中９８℃で３分間変性させ、直ちに４℃で冷却した。第１回目の選択では、１本鎖ＤＮＡライブラリーをＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズ ５μｌとＢＳＡ １μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ−Ｔ １０ｍｌへ添加した。室温で３０分間振とうした後、混合物を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清をＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６ 結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズ ５μｌと、室温で３０分間混合した。ビーズは、ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した。蛋白に結合したアプタマーは、０．５ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）５０μｌに溶出した。溶出液は、フェノール−クロロホルム混合液で抽出し、１本鎖ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。７０％のエタノールで洗浄した後、１本鎖ＤＮＡは、１０Ｘ ＰＣＲバッファー １０μｌ、４ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍＭ）８μｌ、１００ｐｍｏｌのＰ１プライマー（配列番号１３）と５’端をビオチン化したＰ２プライマー（配列番号１４）、５％ ＤＭＳＯ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ・バイオ）２．５Ｕを含むＰＣＲ混合液１００μｌに溶解した。ＰＣＲ反応では、９５℃で２分間変性させた。９５℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１５秒間の伸長反応を２０サイクル行い、最終的な伸長反応を７２℃で２分間行った。
【００２９】
ＰＣＲ産物の一部を４％アガロースゲルで電気泳動し、正しい長さの２本鎖ＤＮＡが増幅されていることを確認した。ＰＣＲ産物 ９０μｌと５Ｍ ＮａＣｌ ２３μｌを、Ｎｅｕｒｏａｖｉｄｉｎ ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）５μｌと室温で１０分間混合した。ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した後、ビオチン化されていない１本鎖ＤＮＡは、０．１Ｎ ＮａＯＨ ５０μｌ中で５分間振とうした後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＮｅｕｒｏａｖｉｄｉｎ ビーズから上清へと回収した。得られた上清のｐＨを調整するために、１Ｍ ＨＣｌ ５μｌを上清に加えた。１本鎖ＤＮＡは、エタノールで沈殿させ、７０％のエタノールで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ １００μｌに溶解した。この１本鎖ＤＮＡを用いて２回目以降のホスホランバン・アプタマーの選択も１回目の選択と同様に行ったが、２回目以降の選択ではＮｉ−ＮＴＡビーズに結合したＰＬＮ１‐２６−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ６の量をビーズ５μｌ当たり５μｇとした。
【００３０】
９回目の選択を行った後、得られた１本鎖ＤＮＡは、Ｐ１プライマー（配列番号１３）とビオチン化していないＰ２プライマー（配列番号１４）を使ってＰＣＲで増幅した。ＰＣＲで得られた２本鎖ＤＮＡは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へ挿入、大腸菌（ＴＯＰ １０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ導入して形質転換した。生育した大腸菌のコロニーから任意に４５個のコロニーを選び、大腸菌からプラスミドを精製した。精製したプラスミドからＴ７プロモーターとＭ１３逆転写プライマーを使用して、挿入したＤＮＡ配列を決定し、アプタマーのＤＮＡ配列を決定した。その結果、１１種類のＤＮＡアプタマーが得られた。１１種類の配列は、表１の通りであった。
【００３１】
【表１】
【実施例２】
【００３２】
＜ホスホランバン・アプタマーの心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性への効果＞
【００３３】
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）またはウサギ骨格筋より調製した筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＮ３、０．１ｍＭのＡＴＰ、０．３５μＭ Ｃａ２＋（Ｃａ−ＥＧＴＡ ｂｕｆｆｅｒ：０．５ｍＭのＣａＣｌ２と１．３ｍＭのＥＧＴＡ）を含む反応液５０μｌに懸濁し、合成した１１種類それぞれのホスホランバン・アプタマー（１０μＭ）存在下および非存在下で、３７℃で４分間のＡＴＰａｓｅ活性を測定した。活性測定は、佐々木ら方法（Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６７：１６７４−１６７９，１９９２）を用いた。０．３５μＭ Ｃａ２＋の代わりに２ｍＭのＥＧＴＡを加えたＣａ２＋非存在下でも同様にＡＴＰａｓｅ活性を測定し、両者の差からＣａ２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性（ＳＥＲＣＡ活性）を求めた。アプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果を見るために、アプタマー存在下と非存在下でのＳＥＲＣＡ活性の比を求めた。
【００３４】
心筋小胞体と骨格筋小胞体で、１１種類のホスホランバン・アプタマーの存在下と非存在下でのＳＥＲＣＡ活性の比を求めた結果を図１に示す。縦軸は、アプタマーによるＳＥＲＣＡ活性の促進の程度をあらわす。ホスホランバンの存在しない骨格筋小胞体（黒）では、アプタマーはＳＥＲＣＡ活性にはほとんど影響を与えなかった。これに対し、心筋小胞体（白）ではアプタマーによるＳＥＲＣＡ活性の促進が認められた。１０μＭのアプタマー存在下での骨格筋小胞体と心筋小胞体の比較では、アプタマーＮｏ．５を除く１０種類のアプタマーで心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性が有意に促進されていた。これらの結果は、アプタマーがホスホランバンに作用してＳＥＲＣＡに対する抑制を解除しＳＥＲＣＡ活性を促進していることを示す。データは、３−５回の測定の平均値と標準偏差を示す。骨格筋小胞体と心筋小胞体の比較の統計学的有意差は、Ｔ検定で行った。＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１を示す。
【実施例３】
【００３５】
＜ホスホランバン・アプタマーによる心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性への効果の濃度依存性＞
【００３６】
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に、種々の濃度の合成したアプタマーＮｏ．９（０−４０μＭ）を加え、実施例２と同様の方法でＳＥＲＣＡ活性を測定し、アプタマー非存在下に対する比を求めた。
【００３７】
図２に実験結果の１例を示す。ホスホランバン・アプタマー（アプタマーＮｏ．９）は、心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性を濃度依存的に促進した。この促進効果のＥＤ５０は、１５μＭであった。この結果は、アプタマーが濃度依存性にホスホランバンに作用してＳＥＲＣＡ活性を促進していることを示す。
【実施例４】
【００３８】
＜心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性へのホスホランバン・アプタマーの効果＞
【００３９】
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に、合成したアプタマーＮｏ．９（３０μＭ）を加え、種々のＣａ２＋存在下で（ｆｒｅｅ Ｃａ２＋として０．１１〜１６．３μＭ）、実施例２と同様の方法でＳＥＲＣＡ活性を測定した。ＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性は、最大のＳＥＲＣＡ活性を１００％としたパーセント表示で示した。
【００４０】
図３にホスホランバン・アプタマーＮｏ．９の非存在下（黒丸）、存在下（白丸）でのＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性を示した。アプタマーＮｏ．９は、特に０．１１〜２μＭ／ｍｌのＣａ２＋濃度で心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性を促進し、濃度依存性曲線を左方にシフトさせた。この効果は、ＳＥＲＣＡへのホスホランバンの抑制効果が解除されたことを意味する。各データ点は、３回行った実験の平均値と標準偏差を示す。アプタマーの存在下と非存在下の比較の統計学的有意差は、Ｔ検定で行った。＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１を示す。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のホスホランバン・アプタマーは、治療困難な重症の心不全患者に新たな治療手段を提供するものであり、その産業上の利用価値は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】心筋小胞体と骨格筋小胞体で、１１種類のホスホランバン・アプタマーのＣａ２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性（ＳＥＲＣＡ活性）を比較した結果を示した図である。
【図２】ホスホランバン・アプタマー（アプタマーＮｏ．９）が、心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性を濃度依存的に促進した結果を示した図である。
【図３】ホスホランバン・アプタマー（アプタマーＮｏ．９）が、心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性のＣａ２＋濃度依存性に及ぼす効果を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホランバンの細胞質ドメインを含む融合蛋白質をターゲットとして、ＳＥＬＥＸ法により選択することを特徴とするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【請求項２】
融合蛋白質が、ホスホランバンの１番目から２６番目のアミノ酸部分に、標識蛋白質が結合したものである請求項１に記載のするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のホスホランバン・アプタマーが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する1本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであって、ホスホランバンに特異的な結合性を有するアプタマー。
（ａ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列。
（ｂ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列。
（ｃ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のホスホランバン・アプタマーを含有する心不全治療薬。
【請求項１】
ホスホランバンの細胞質ドメインを含む融合蛋白質をターゲットとして、ＳＥＬＥＸ法により選択することを特徴とするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【請求項２】
融合蛋白質が、ホスホランバンの１番目から２６番目のアミノ酸部分に、標識蛋白質が結合したものである請求項１に記載のするホスホランバン・アプタマーの取得方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のホスホランバン・アプタマーが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有する1本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであって、ホスホランバンに特異的な結合性を有するアプタマー。
（ａ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列。
（ｂ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列。
（ｃ）配列番号２〜１２いずれかで表される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のホスホランバン・アプタマーを含有する心不全治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１８９２９２（Ｐ２００９−１８９２９２Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２７４４（Ｐ２００８−３２７４４）
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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